KR960013464B1 - 기능성 dna 블록, 이를 함유한 플라즈미드, 플라즈미드에 의해 형질 전환된 효모, 히루딘의 제조방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

기능성 DNA 블록, 이를 함유한 플라즈미드, 플라즈미드에 의해 형질 전환된 효모, 히루딘의 제조방법 및 용도

제1도는 M13TG897의 구성 및 구조.

제2도는 M13TG897 파지 DNA의 M13TG1827로의 돌연변이 유발.

a) 돌연변이 유발에 대한 올리고뉴클레오티드의 서열.

b) 올리고뉴클레오티드와 혼화되는 M13TG897 DNA의 부분 서열.

c) 돌연변이된 서열.

제3도는 PTG 883의 구성.

제4도는 PTG 892의 구성.

제5도는 M13TG889의 구성.

제6도는 PTG 1828 및 PTG 1833의 구조.

제7도는 다른 플라즈미드에 의해 전달된 서열에 상응하는 히루딘 전구체의 구조[전구체의 NH 말단에 가장 가까운 절단부위(Lys Arg)(a)와 히루딘 HB2(NH₂-Ile-Thr) 등의 성숙서열(b)간의 접합부가 나타나 있다]

제8도는 HV1에 대한 DNA 서열암호의 합성에 사용한 올리고 뉴클레오티드의 서열 및 위치.

제9도 및 10도는 HV1에 대한 DNA 서열암호의 합성에 관한 제한지도, 및 아미노산으로서의 서열의 번역.

본 발명은 개선된 조건하에서 히루딘, 특히 HV1의 생성에 필요한 일을 하는 새로운 벡터에 관한 것이다. 특히 본, 발명은 최소한 다음과 같이 표현되는 서열을 함유하고 있는 것으로서 히루딘을 효모로부터 제조할 수 있는 기능성 DNA 블록에 관한 것이다.

-Str-Lex-Scl-H유전자

여기서, H유전자는 히루딘 또는 그의 변이체중의 하나를 암호화하는 유전자로서, 본 발명에 있어서는, HV1 또는 HV2를 암호화하는 유전자인 것이 바람직하며, 임의적으로는 효모 터미네이터 서열, 예로 PGK유전자의 서열이 뒤따를 수 있으며 ; Str은 효모에 의해 H유전자를 전사하는 신호를 포함하고 있는 DNA서열이고 ; Lex는 유전자 생성물을 얻기 위해 필요한 선도 서열이며 ; Scl은 yscF 단백질 분해 효소에 의한 절단부위를 암호화하는 DNA 서열로서, 이때 절단부위는 하나밖에 없으며, H유전자 바로 상부의 히루딘 전구체내에 유치하며 ; Scl-H유전자는 여러번 반복될 수 있다.

상기 형태의 발현 블록으로부터는 성숙하고 정확한 단일의 단백질을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 프랑스공화국 특허 85/06,672호의 개량에 관한 것으로, 활성 또는 리이치 히루딘(H.medicinalis)을 지닌 단백질의 표현벡터에 관한 것이다.

실제로 상기 특허 85/06,672호에 기술된 구조로서는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)와 같은 효모가 활성형태로 배지내에 분비되는 히루딘을 제조하는 방법에 관한 것이다.

실제로 상기 특허 85/06,672호에 기술된 구조로서는 에스. 세레비지애가 KEX2 유전자(1)의 생성물인 yscF 단백질 분해효소에 대한 2개의 절단부위를 지닌 전구체의 형태로 히루딘을 제조한다. 즉, yscF의 엔도펩티다제 활성은 이러한 히루딘 전구체의 성숙에 필요하다. 그렇지만 이는 전구체의 NH₂말단에서 멀리 떨어져 있는 두번째 부위에서의 절단이 활성 히루딘의 방출을 허용한다. 반대로 절단이 두번째 부위가 아닌 첫번째 부위에서 일어날 경우 NH₂말단에서 아미노산 잔기의 확장으로 인해 히루딘과는 다른 보다 긴 형태가 분비된다. 후자의 경우는 바람직스럽지 못한 것으로 다른 단계의 정제시 성숙한 히루딘을 오염시키게 되며, 따라서, 정제과정이 복잡해지고 순수한 히루딘의 제조시 수율이 떨어지는 원인을 일으킨다.

본 발명에 있어서, 히루딘으로의 성숙이 오직 바람직한 형태의 분비를 유도하도록, 효모는 yscF에 대해 단지 하나만의 절단부위를 지닌 히루딘 전구체를 합성한다.

Lex 서열중에는 특히, 효모의 알파 성 페로몬의 배출을 허용하는 프리프로(prepro) 서열이 언급되어야 한다.

분비 시스템의 예로서는 알파 페로몬의 시스템을 선택하였는데, 위의 서열에 있어서, Lex 서열은 효모의 알파 성 페로몬의 유전자로부터 기원되지만, 다른 시스템을 사용할 수 있다)(예, 킬러 프로테인 시스템)(4).

바람직한 것은, 기능성 블록을 함유하는 플라즈미드에 대한 숙주인 효모는 교배형이거나 선택압력없이 배양될 수 있어야 한다.

이러한 조건하에서 형질전환된 효모는 산업적 수준으로 사용하기에 특히 편리하다.

이러한 목적을 위해서 본 발명은 Str 서열이 MF 알파 1유전자 프로모터 이외의 효모 유전자 프로모터를 함유하고 있는 DNA 발현 블록을 제공한다. 이는 효모의 PGK 유전자 프로모터일 수 있다.

실제로 특허 85/06,672에 기술된 구성에 있어서, 히루딘 전구체용 유전자는 MP 알파 1유전자 프로모터로부터 전사된다. 이러한 프로모터는 교배형 Mat 알파 균주에서 그의 최대힘을 발휘한다. 따라서, 숙주의 선택은 이러한 유형의 균주에 제한되며, 이는 교배형 Mata 뿐 아니라 교배형이 없는 이배체 또는 배수체의 균주를 배제하고 있다.

특히 이는 공업용으로 사용되는 효모를 포함하고 있다. 한편 프로모터를 변경시키므로써 숙주균주의 교배신호에 무관한 히루딘의 발현을 얻는 것이 가능하다.

일반적으로 이러한 DNA 블록은 효모내 복제기점, 즉 2μ플라즈미드의 복제기점을 내포한 플라즈미드에 의해 수반되게 된다.

벡터의 구성을 용이하게 하기 위해서는 상기 플라즈미드는 콜리/효모 셔틀(coli/yeast shuttle)일 수 있으며, 대장균 내에서 그들의 복제를 허용하는 요소들을 함유할 수 있다. 예로는 PBR 322와 같은 복제기점이나 amp R과 같은 선택 마이커를 들 수 있다. 이러한 플라즈미드는 또한 효모에 대한 선택 마커를 함유할 수 있는데, 예를 들면 어느 독성 화학물질의 내성을 암호화하는 유전자나 옥소트로피가 보완되도록 하는 유전자를 들 수 있는데, URA3 유전자도 사용할 수 있다.

프랑스 공화국 특허 86/01,224호에는 형질전환된 균주의 배양에 필요한 배지의 보다 큰 선택성을 허용한 플라즈미드에 의해 ura+로 형질전환된 ura3 균주에 있어 5-FU에 내성을 부여하는 어느 돌연변이체가 기술되어 있다. 특히, 공업을 복합 배지의 사용도 가능한 것으로 되어 있다.

한편, 본 발명은 특히 변이종 HV1의 합성 및 분배에 관한 것이다.

상기 HV1 유전자는 대장균 내에 발현할 목적으로 프랑스공화국 특허 84/13,250호에 이미 그 화학적 합성법이 기술되어 있다.

상기 특허에 사용된 대부분의 합성 올리고뉴클레오티드는, 서열의 상·하에서 융합될 서열과의 여러 집합을 허용하는 것을 제외하고는, HV1의 전구체를 암호화하는 서열의 구성을 유지하고 있다.

분비된 히루딘의 제조시에는 효모내에서 일언나는 정상적인 대사경로에 따른 폴리펩티드의 정확한 성숙 및 분비에 필요한 정보를 지니고 있는 전구체가 존재해야 한다.

프랑스공화국 특허 제85/06,672호에는 히루딘의 변이체 HV2의 분비에 사용될 수 있는 알파인자 전구체의 NH₂-터미날 서열이 나타나 있는 반면, 본 발명은 이러한 시스템을 변이체 HV1의 분비에 적용하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 특히 효모로부터 히루딘을 제조할 수 있는 것으로 다음과 같은 요소들을 함유하고 있는 기능성 DNA 블록에 관한 것이다 :

HV1 유전자 ;

효모에 의해 HV1 유전자의 전사를 제공하는 신호를 포함하고 있는 DNA 서열(Str).

상기의 블록은 플라즈미드 또는 효모의 염색체, 바람직하게는 속 사카로마이세스에 집합되어 있으며, 상기 효모의 전사후에는 활성 형태나 활성에 의해 히루딘을 재생할 수 있는 불활성 전구체의 형태로 히루딘을 표현할 수 있다.

이러한 기능성 블록은 다음과 같은 구조를 포함하는 것이 바람직하다 :

-Str-Lex-Scl-H유전자-

여기서, H유전자는 HV1를 암호화하는 유전자이며, 필요한 경우에는 PGK 유전자의 것과 같은 효모 터미네이터 서열이 뒤따르며 ; Str은 효모에 의한 H유전자의 전사를 제공하는 신호를 함유한 DNA 서열이고 ; Lex는 유전자 생성물을 배출하기 위해서 필요한 선도 서열이다 ;

Scl은 적절한 H유전자의 앞의 3' 말단에서 ATG 코돈 또는 Lys-Arg를 암호화하는 코돈 또는 Ser-Leu-Asp-Lys-Arg을 암호화하는 다섯개의 코돈을 함유한 절단부위를 암호화하는 DNA 서열이다.

한편으로는 요소 Scl-H유전자를 수회 반복할 수 있다.

lex 서열중에서는 효모의 알파 성 페로몬에 대해 언급이 되어야 하며, Str에 대해서 d는 MF 알파 1유전자 프로모터 또는 PGK 유전자 프로모터를 언급해야 하는데 다른 서열도 사용할 수 있다. 특히, 분비 시스템의 예로서 알파 페로몬의 것을 선택한다. 즉, 상기 서열에 있어서, Lex 서열은 효모의 알파 성 페로몬에 대한 유전자로부터 생성되지만 다른 시스템도 사용할 수 있다(킬러 프로틴 시스템)(4).

히루딘의 발현 및 분리르 배지내로 직접하기 위해서는 상기의 기능성 블록 그리고 최소한 하나의 효모내 복재 기점을 포함하는 효모용 벡터 또는 플라즈미내에 상응하는 유전자를 일체화시킬 수 있다.

사이 플라즈미드는 다음과 같은 요소들을 함유함이 바람직하다.

-효모의 2μ플라즈미드의 복제기점 ;

-ure3 유전자 ;

-대장균에 있어서 복제기점 및 항생물질 내성에 대한 마커 ;

-전사 프로모터, 선도서열 및 알파인자 전구체의 프리프로 서열을 함유한 MF 알파 1유전자의 5' 영역 ; 상기 서열은 히루딘 HV1의 암호 서열 위에서 융합될 수 있다.

-히루딘 유전자의 아래에 위치할 수 있는 것으로 효모의 PGK 유전자의 전사 터미네이터.

일반적으로, 본 발명에 따른 발현블록은 효모, 특히는 사카로마이세스(Saccharomyces), 또는 자율적으로 복제하는 플라즈미드나 효모의 염색체에 통합시킬 수 있다.

플라즈미드가 자율적일때 이는 그의 복제력을 제공하는 요소, 즉, 2μ플라즈미드의 것과 같은 복제 기점을 함유하게 된다. 또한, 상기의 플라즈미드는 ura3- 또는 Leu-2 효모의 상보성을 제공하는 URA3 또는 LEU2 유전자와 같은 선택요소를 함유할 수 있다. 이러한 플라즈미드는 셔틀(Suttle) 플라즈미드가 될때 박테리아 내에서 그들의 복제를 제공하는 요소들, 예를들어, PBR 322의 것과 같은 복제기점, Ampγ과 같은 마커 유전자 및/또는 본 분야에서 숙련자된자에게 잘 알려진 다른 요소들도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 플라즈미드에 의해 수반되거나 그의 염색체내에 통합된 본 발명의 발현 블록에 의해 형질전환된 효모에 관한 것으로, 특히 사카로마이세스의 균주, 이중에서도 에스. 세레비지애의 균주, 특히는 교배형 Mata나 교배형이 없는 이배체 또는 배수체, 이중에서도 특히 5-플루오로우라실에 내성을 지닌 본 발명의 플라즈미드에 의해 ure+로 형질전환된 것으로 공업용 배지상에서 배양이 가능한 ura- 효모 균주에 관한 것이다.

프로모터가 알파 페로몬용 유전자의 것일 경우 효모는 교배형 Mat 알파가 될 것이다. 예를들면 유전자형 ura3 또는 Leu2의 균주는 사용되어 적절한 선택압력에 의해 효모내에서 플라즈미드의 유지력을 제공하는 플라즈미드에 의해 보충될 것이다.

또한, 본 발명은 배지상에서 위치에서 기술한 형질전환된 효모를 발효시키고, 이어서 배지내에서 생성된 히루딘을 생체내 또는 시험관내에서 성숙할 수 있는 히루딘의 전구체의 형태나 성숙된 형태로 회수하는 단계로 이루어진, 히루딘 또는 그의 변이체 중 하나를 제조하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 적절한 배지상에서 상기의 형질전환된 균주를 발효시키고, 이어서 세포내에서 히루딘을 축적시켜서 히루딘을 제조하는 것이 가능할지라도, 시험관내에서 가공할 수 있는 전구체의 형태나 성숙된 형태로서 히루딘을 배지내에 부비시키는 것이 바람직하다.

이러한 성숙은 여러단계로 수행될 수 있다.

첫째로, Lex 서열의 번역에서 발생된 어떤 요소들을 절단시키는 것이 필요할 수도 있는데, 이는 Scl에 상응하는 서열상에서 수행할 수 있다. 성숙된 히루딘은 시아노긴 브롬화물로써 선택적으로 절단될 수 있는 메티오닌에 의해 선도될 수 있다. 이러한 방법은 히루딘에 대한 암호 서열이 메티오닌을 함유하고 있지 않기 때문에 유용하다.

또한, N-터미널 말단에서 디텝티드 Lys-Arg를 상상할 수 있는데, 이는 특정한 엔도펩티다재에 의해 COOH로 절단한다. 효소는 분비과정에 있어 활성을 지니고 있기 때문에 배지에서 직접 성숙된 단백질을 얻을 수 있다. 그러나 어떤 경우에 있어서는 특정한 효소를 가하므로써 분비 후에 효소성 절단을 시도하는 것이 바람직하다.

어떤 경우에는, 특히 시아노겐 브롬 화물로 처리한 다음에 디설파이드 브리지를 재형성시켜 단백질을 복원시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 목적을 위해서 구아니디는 염화물로써 단백질을 변성시키고, 이어서는 환원된 글루타티온의 존재하에 복원시킨 다음 혼원시킨다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법으로 제조한 히루딘에 관한 것이다.

여기서 얻은 히루딘은 트롬빈 억제인자로서, 항응집제로서, 응집을 방지하는 실험용으로서 및/또는 진단시약으로서 사용할 수 있다.

특히, HV1은 홀로 또는 다른 활성물질과 함께 약제학적 조성물로서 사용할 수 있다. 후자의 경우 방사성, 형광, 효소와 같은 라벨을 붙여 사용하는 것이 바람직하다.

프랑스 특허 85/06,672호에 기술된 플라즈미드 및 방법은 본 발명에 있어서는 반복되지 않았다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위하여 실시예를 들면 다음과 같다.

[실시예 1]

플라즈미드 PTG 897은 yscF 단백질 분해효소에 대한 절단부위가 단지 하나인 하루딘 전구체용 정보를 수반한다. 그런데 이러한 절단부위에서 성숙하면 불활성 히루딘이 방출된다. 또한 yscF 단백질 분해효소에 의해 절단되면 4개의 잔기 GLn ALa GLu ALa에 의해 NH₂-말단에서 늘어난 히루딘 분자를 방출하게 된다. 이러한 GLn ALa GLu ALa 서열에 대해 암호화나는 DNA 단편을 삭제하게 되면 정확하게 처리된 히루딘 체인이 방출하게 된다.

상기와 같은 삭제는 지시된 시험관내 돌연변이 유발법으로 진행된다. 플라즈미드 PTG 897은 Pst1/BglⅡ 이중분해에 의해 절단되며 ; 히루딘 서열을 함유한 DNA 단편은 단일 -가닥 파지 M13TG131의 복제형태에 클론시켜 파지 M13TG 897을 얻는다(제1도 참조).

서열이 5'-TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC-3' 올리고뉴클레오티드를 상기의 파지 M13TG897의 게놈성 DNA와 혼화시킨다. 이때 올리고뉴클레오티드의 처음 절반(15염기쌍)은 삭제하려는 서열로부터 바로 위에 있는 15염기쌍 서열로 혼화시키며 나머지 반은 바로 아래있는 15염기쌍 서열과 혼화시킨다(제2도 참조). 이러한 올리고뉴클레오티드는 파지 M13TG897 게놈의 상보적인 가닥의 시험관내 합성에 대한 주행역할을 했다. 새로이 형성된 가닥을 공유적으로 붕할 수 있도록 설계된 T4 DNA 리가제의 작용 후에는 리셉터 박테리아(예 JM 103[*(Lac-Pro)SupE Thi EndlA s bcB15 strA rk- mk+/P' TraD36 ProAB+ LacIQ LacZ M15]을 형질감염시키고, 이러한 형질감염에서 유도된 파지는 탐침으로서 공지의 방법에 따라 키나제 처리되어 32p 라벨이 붙은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 DNA-DNA 혼성화에 의해 분석한다. 이러한 올바르게 돌연변이된 파지 DNA는 돌연변이용 올리고뉴클레오티드와 함께 안전성이 높고 절박한 조건에 대한 내성에 의해 확인될 수 있는 혼성화 복합체를 형성한다. 반면에, 돌연변이가 되지 않은 파지 DNA와 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 혼성화 복합체는 단일- 가닥 DNA 루우프의 존재에 의해 불안정화 된다.

[실시예 2]

새로운 발현 벡터 내로 돌연변이된 단편의 전달

PGK 유전자의 전사 터미네이터에 인접한 8glⅡ 부위를 단순히 제거하여, 플라즈미드 PTG 876으로부터 플라즈미드 PTG 883을 유도한다.

이러한 목적을 위해서는 플라즈미드 PTG 876을 BglⅡ로써 부분적으로 분해시키고, 이어서 대장균 DNA 폴리머라제 1의 클레노우 단편을 4 뉴클레오티드의 존재하에 반응시킨다. 다음에는 DNA 분자를 파지 T4 DNA 리가제의 작용으로써 공유적으로 서로 연결시킨다. 이때의 PTG 883은 페로몬 유전자의 프로모터로부터 위쪽에 위치하는 단지 하나만의 BglⅡ 부위를 소유하고 있다(제3도 참조).

플라즈미드 PTG 883(20μg)은 BglⅡ 분해시켜 선형으로한 다음 공지의 방법으로 Be 131 뉴클레아제(1,4 유니트10분 Boehringer Mannheim)를 이용해 조절된 분해를 시킨다. 이러한 방법으로 처리된 DNA를 페놀 및 클로로포름/이소아밀 알코올로써 연속적으로 추출하여 정제하고, 유분(5μg)을 클레노우 폴리머라제로 작용시켜 무딘 말단을 만든다.

이러한 방법으로 처리한 DNA는 공지의 방법으로 수행하여 파지 T4 리가제의 존재하에 포스포틸화가 되지않은 BamHⅠ 링커(5'-CGGATCCCG)에 연결된다.

[Lathe et al(3)]

대장균 1106의 형질전환 및 암피시린의 내성에 대한 선택후에 MF 알파 1유전자와 측면에 접하는 5' 지역에 관해서 삭제된 플라즈미드 PTG 892를 단리하였다(제4도 참조). 한편 BamHⅠ 링커는 다음과 같이 ATG로부터 상류쪽의 한 염기에 위치하고 있다 :

상기에서 얻은 새로운 BamHⅠ-Sall 단편은 파지 M13TG120의 BamHⅠ와 Sall 부위의 사이에 클론시켜 파지 M13TG889를 얻는다(제4도). 페로몬에 대한 모든 암호부를 포함하고 있는 BamHⅠ-BglⅡ 단편을 파지 M13TG889로부터 단리시킨 다음에, 플라즈미드 PTG848의 큰 BglⅡ 단편과 연결시킨다. 이때 연결후에 얻은 플라즈미드 PTG 892h는 PGK 유전자 프로머터의 BglⅡ 후에 삽입된 페로몬에 대한 암호부에 대응하는 BamHⅠ-BglⅡ 단편을 함유하고 있다.

PTG 892b DNA는 단일의 BglⅡ 부위와 단일의 SalⅠ 부위를 포함하고 있는데, 이들 부위들은 PstⅠ를 포함하고 있는 짧은 서열을 둘러싸고 있다.

BglⅡ 및 SalⅠ에 의한 이중절단, 큰 단편의 용출 그리고 합성폴리링커에 의한 연결에 의해 짧은 서열을 합성 폴리링커로 대치시킬 수 있다. 여기서 폴리링커의 서열은 다음과 같다.

상기 서열을 지닌 폴리링커는 BglⅡ에 의해 유리된 단편과 결합력이 있는한 말단 그리고 SalⅠ에 의해 유리된 단편과 결합력이 있는 한 말단을 지닐 뿐 아니라 효소 PvuⅠ, BglⅡ 및 SphⅠ에 대한 인지부를 지니고 있다.

위에서 얻은 새로운 벡터는 PTG-1819라고 언급된다. 이러한 벡터의 DNA를 효소 SphⅠ및 PstⅠ로 이중분해시킨 결과 6.5-kb PstⅠ-PstⅠ, 1.9-kb PstⅠ-SphⅠ 및 다른 0.5-kb SphⅠ-PstⅠ의 3개의 단편을 얻었다.

보다 긴 두 개의 단편을 정제하고난 다음에는 돌연변이된 히루딘에 상응하고 파지 M13TG1827에서 기원된 SphⅠ-PstⅠ 단편과 혼합시켰다 ; 이렇게 해서 새로운 발현벡터, PTG1828을 얻었다(제6도 참조).

[실시예 3]

벡터 PTG 881내로 단편의 전이 : 새로운 플라즈미드 PTG1833

PTG 881 DNA를 Pst 로써 부분적으로 분해시켜 6.1kb 단편을 유리시킨다. 이 단편을 단리시킨 다음 BglⅡ로써 완전히 분해시켜 PstL-PstⅠ 그리고 PstⅠ-BglⅠ 그리고 PstⅠ-BglⅡ 단편들을 유리시킨다. 상기 두 단편을 PTG 1828에서 유도된 0.62-kb PstⅠ-BglⅡ 단편과 연결시킨다. GLa GLu Ala에 대한 암호 서열의 삭제만으로 플라즈미드 PTG 897과는 다른 새로운 벡터 PTG1833을 결과로써 얻었으며 이로써 형성된 전구체의 구조는 제7도에 있다. 이 플라즈미드 PTG 1833은 대장균에 대한 복제기점, 암피시린에 대한 내성을 지닌 유전자, 에스. 세레비지애의 Leu2 유전자, 에스. 세레비지애에서 복제를 허용하는 2μ 플라지미드의 단편, 프리프로를 암호화하는 MF 알파 1유전자 프로모터 및 히루딘 유전자를 지니고 있다(제6도 참조).

실시예 4

플라즈미드 PTG 1828 및 PTG 1833으로써 효모의 형질전환

에스. 세레비지애 균주 TGY lst4(Mat 알파 ura 3-251-373-328 his 3-11-15)를 플라즈미드 PTG 1818, PTG 1828 및 PTG 1833으로써 형질전환시킨다.

이의 결과는 표 1에 나타나 있는데 이로부터 PTG 1818 및 PTG 1833이 히루딘 활성의 수준과 동일한 분비를 유도함을 볼 수 있다. 이와는 대조적으로 TGY lsp4 및 PTG 1828은 다른 두 균주의 절반이 되는 히루딘 활성을 나타낸다. 히루딘에 대한 유전서 정보를 지니지 않은 균주 TGY lsp4 및 PTG 881은 대조용으로서 포함되어 있다. 에스. 세레비지애(Mat a) 균주 TGY 14-1에 의해 분비되고, PTG 1828이나 PTG 1833, 및 TGY 14-2로써 형질전환되며 동일한 플라즈미드로써 형질전환된 히루딘 생성물도 표 2에 비교되어 있다. 한편 균주 TGY 14-2(교배형 Mat 알파)의 경우에 플라즈미드 PTG 1833은 플라즈미드 1828보다 히루딘 분비를 더욱 유도함을 표 2에서 알 수 있다.

이와는 반대로 균주 TGY 14-1(교배형 Mat a)의 경우에 PTG 1833은 히루딘 분비를 유도하지 않고, 반면에 TGY 14-2는 히루딘을 생성한다.

[실시예 5]

플라즈미드 발현형의 손실없이 완전한 배지 내에서 배양될 수 있는 균주의 단리 WO 86/01,224 ura3 내에서 5-FU에 내성을 주는 어떤 변종이 기술되어 있다. 상기에서의 균주는 형질전환된 균주의 배양에 필요한 배지의 선택성이 큰 플라즈미드에 의해 ura+로 형질전환된 것인데 특히 공업용 복합 배지를 사용할 수 있다.

균주 TGY lap4 PTG 1833으로부터 자율적인 돌연변이체를 분리시켰는데, 이는 WO 80/01,224에 기술된 프로토콜에 따른/mg/ml 5-플루오로우라실로 보충한 완전한 배지(YPG)상에서 군락을 형성할 수 있는 것이다. 6변이체를 완전한 배지에서 배양하고 비선택성 조건하에서 20세대 이상성장 후 플라즈미드 효과가 없는 군락을 생성하지 않는 것 하나를 선택한다.

TGY lsp-3인 변이체를 완전한 배지 내에서 히루딘의 제조에 사용한다.

[실시예 6]

HV1를 암호화하는 DNA 서열 합성방법

이 서열은 적절한 비율의 MP 알파 1의 상으로 HV1 서열의 융합을 허용하는 요소, 그리고 분비된 히루딘의 정확한 성숙을 허용하는 신호를 수반하게 되는데, 특히 접합부위는 HV1의 처음 NH2-말단 잔기 바로 위에 한쌍의 Lys-Arg를 함유하게 될 것이다.

본 실시예에서 사용한 방법은 프랑스공화국 특허 84/13,250에 기술된 것과 유사하다.

합성은 그들의 BamHⅠ 결합력 있는 말단의 결과로서 결합된 두 분리된 블록내에서 진행한다.

첫번째 블록은 1-9의 9 뉴클레오티드로 이루어져 있으며 두번째 블록은 10-19의 10 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 이러한 서열 및 위치는 제8도에 나타나 있다.

제한지도 그리고 아미노산으로의 서열의 번역이 제9도 및 제10도에 나타나 있다.

[실시예 7]

합성 유전자의 결합

제1합성 블록

이량체나 중합체의 형성을 피하기 위해 올리고뉴클레오티드 2 내지 8개(제8도)를 그의 5' 말단에서 포스포릴화시켰다. 이어서, 500피코몰의 매 올리고 뉴클레오티드를 최종부피 25μl의 60mM Tris-HCl로 pH7.5, 10mM MgCl 및 8mM 디티오트레이톨을 사용하여 3.3피코몰의[P]-감마-ATP(5,000Ci/nmol)을 함유한 폴리뉴를 레오티드 키나제(2단위)로 처리한다.

37℃에서 15분간 배양한 후 라벨이 없는 5n mol의 ATP를 가한다.

37℃에서 30분간 배양한 후, 다음에 혼합할 단편 1,2 및 3을 제외하고 보충 단편을 쌍으로 혼합한다.

300pmol의 매 올리고뉴클레오티드를 최종 10μl의 66mM 트리스 HCl, pH 7.5, 6mM MgCl, 100mM NaCl, 0.5mM 스페트미딘 및 8mM DTT로 사용한다.

상기 혼합물을 3분간 100℃까지 가열하고 2시간 동안 천천히 37℃까지 냉각한다. 혼합된 올리고뉴클레오티드 1-2-3을 올리고뉴클레오티드 4-5와 혼합시키고 37℃에서 2시간동안 배양한다.

동일한 방법으로 올리고뉴클레오티드 6-7을 8-9와 함께 혼화시킨다.

마지막 단계에서는 전처리된 9 뉴클레오티드를 10μl의 최종부피로 2시간 동안 37℃에서 배양한다.

상기의 혼화된 14피코몰의 뉴클레오티드를 15℃에서 15시간동안 T4 리가제로 처리한다.

M13TG131의 HindⅢ-BamHL 단편 50ng을 겔상에서 정제하고 반응 혼합물에 가열한다. 다음에는 연결 혼합물을 충분한 대장균 JM103 세포의 형질전환에 사용한다.

여기서 얻은 12파지 콜론중에서 단지 하나만이, 필요한 배열 M13TG1888을 지니고 있었다.

제2합성 블록

상기와 동일한 방법으로써 제2블록의 합성을 수행한다(제8도 참조) 제2합성 블록은 파지 M13TG131의 BamⅢ 및 SalⅠ 부위 사이에 콜론시킨다. 12콜론 중 두 개를 선택해 바라는 배열에 상응하는 삽입물의 여부를 실험한다. 이중 하는 M13TG1889라 한다.

합성 유전자의 결합

M13TG1888과 M13TG1889의 이중-스트랜드된 두 DNA를 각각 HindⅢ과 BamHⅠ로 분해시키고, 겔상에서 이미 정제된 PBR322의 큰 HindⅢ-Sall 단편과 혼합시킨다. 연결한 후 대장균 1106의 형질전환에 생성 혼합물을 사용한다.

암피시린의 내성에 대한 선택에 의해 플라즈미드 PTG 1890을 얻었으며, 이는 정확한 합성 배열을 함유하고 있었다.

[실시예 8]

합성된 히루딘의 분비가 가능하게 하는 벡터 PTG 1891의 구성

HV1에 대한 암호배열을 전달하는 PTG 1890의 DNA 단편을 HindⅢ-BgⅢ의 형태(BgⅢ 부위는 상기의 클로닝에 사용한 SaⅡ 부위의 상부에 위치)로 취한 다음, 프랑스 특허 85/06,672에 기술된 플라즈미드 PTG 881의 HindⅢ와 BgⅢ 사이에 끼워 넣는다.

생성된 플라즈미드 PTG 891에 HV1 유전자는 MF 알파 1의 플리프로 배열과 전사 터미네이터 사이에 끼워져 존재하며, 이러한 구조는 히루딘 HV1의 성숙 및 분비를 제공해야 한다.

이는 HV1에 대한 것으로 대치된 것으로서 HV2에 대한 암호 배열을 제외하고 PTG 1818(프랑스 특허 85/06,672)와 동일하기 때문이다.

[실시예 9]

균주 TGY lsp4를 플라즈미드 PTG 1891 DNA로써 형질전환

균주 TGY lsp4(알파-1 rua3-251-373-328, His3-11-15)를 플라즈미드 PTG 1891을 사용해 형질전환시킨다. ura+ 특성에 대해 선택하여 얻은 2콜론을 배양하고 배지에 분비시켜 히루딘의 생성을 관찰한다. 대조용으로서 TGY lsp4 PTG 1818에 의해 분비된 히루딘의 양을 동일한 조건하에서 분석한다. 분석결과 균주 TGY lsp4 ptg 1833의 것보다 TGY lsp4 PTG 1891의 배양 상등액에서 2배의 앤티트롬빈 활성을 지님을 측정했다.

본 발명에 따른 균주의 기탁

기탁기관 및 기탁 균주는 다음과 같다 :

기탁기관

[(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(National Collection of Microorganism Culcures) of the Institut Pasteur, 28 rue de Docteur, Roux, 75724 Paris Cedex 15],

기탁균주

1. 1986년 6월 6일 :

기탁번호 Ⅰ-569

사카로마이세스 세레비지애 TGY lsp4 PTG 1828

기탁번호 Ⅰ-570

사카로마이세스 세레비지에 TGY lsp4, 3PTG 1833

2. 1986년 11월 6일 :

기탁번호 Ⅰ-623

사카로마이세스 세레비지애 TGY lsp4, PTG 1891

Claims (25)

1. 최소한 다음과 같이 표현되는 서열을 함유하는 것으로서, 히루딘을 효모로부터 제조할 수 있는 기능성 DNA 블록 :

   -Str-Lex-Scl-H유전자

   여기서, H유전자는 히루딘 또는 그의 변이체 중의 하나를 암호화하는 유전자이며, Str은 효모에 의해 H유전자를 전사하는 신호를 함유하는 DNA 서열이고, Lex는 유전자 생성물을 배출하기 위해서 필요한 선도 서열이며, Scl은 yscF 단백질 분해효소에 의한 절단부위를 암호화하는 DNA 서열로서, 이때의 절단부위는 하나밖에 없으며, H유전자 바로 상부의 히루딘 전구체내에 존재한다.
2. 제1항에 있어서, Lex 서열이 효모의 알파 성 페로몬의 분비를 허용하는 서열인 기능성 DNA 블록.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Str 서열이 MF 알파 1유전자 프로모터 이외에 효모 유전자의 프로모터를 함유하는 기능성 DNA 블록.
4. 제3항에 있어서, Str 서열이 효모의 PGK 유전자 프로모터를 함유하는 기능성 DNA 블록.
5. 제1항에 있어서, H유전자가 HV1 또는 HV2를 암호화하는 유전자인 기능성 DNA 블록.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 청구된 기능성 DNA 블록과, 효모내에 최소한 하나의 복제기점을 함유하는 플라즈미드로서, 효모내 히루딘의 배출에 필요한 요소를 함유하는 플라즈미드.
7. 제6항에 있어서, 복제기점이 2μ플라즈미드의 것인 플라즈미드.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, URA3 유전자가 함유되는 플라즈미드.
9. 최소한 다음과 같이 표현되는 서열을 함유하는 것으로서 효모로부터 히루딘 HV1을 제조할 수 있는 기능성 DNA 블록 ; -Str-Lex-Scl-H유전자- 여기서, H유전자는 HV1을 암호화하는 유전자이며, Str은 효모에 의해 H유전자를 전사하는 신호를 함유하는 DNA 서열이며, Lex는 유전자 생성물을 배출하기 위해서 필요한 선도 서열이고, Scl은 3' 말단 그리고 H유전자 앞에서 ATG 코돈 또는 Lys-Arg을 암호화하는 두개 코돈 또는 Ser-Leu-Asp-Lys-Arg을 암호화하는 다섯개 코돈을 함유하며 절단부위를 암호화하는 DNA 서열이며, Scl-H 유전자는 수회 반복될 수 있다.
10. 제9항에 있어서, Lex 서열이 효모의 알파 성 페로몬에 대한 것인 기능성 DNA 블록.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, H유전자 뒤에 PGK 유전자의 것과 같은 효모 터미네이터 서열이 뒤따르는 기능성 DNA 블록.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 기능성 DNA 블록과, 효모내에 최소한 하나의 복제기점을 함유하는 것으로서 효모에 의한 히루딘의 배출에 필요한 요소를 함유하는 플라즈미드.
13. 제12항에 있어서, 다음과 같은 것을 함유하는 플라즈미드 : -효모의 2μ플라즈미드의 복제기점, -URA3 유전자, -대정균에서의 복제기점 그리고 항생물질에 대한 내성을 위한 마커, -전사 프로모터, 선도 서열 및 알파인자 전구체의 프리프로 서열로서 히루딘 HV1을 암호화하는 서열로부터 상 아래쪽에서 융합도는 서열을 포함하는, MF알파 1유전자의 5' 영역.
14. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 청구된 플라즈미드에 의해 형질전환된 효모.
15. 제12항 또는 제13항에 청구된 플라즈미드에 의해 형질전환된 효모.
16. 제1항 내지 제5항에 청구된 기능성 DNA 블록에 의해 형질전환된 효모.
17. 제9항 내지 제11항에에 청구된 기능성 DNA 블록에 의해 형지전환된 효모.
18. 제14항 및 제15항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 사카로마이세스인 효모.
19. 제18항에 있어서, 에스. 세레비지애인 효모.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 교배형 Mata의 균주이거나 교배형이 결여된 이배체 또는 배수체인 효모.
21. 제20항에 있어서, 형질전환된 후에 5-플루오로우라실에 대한 내성을 갖는 균주인 효모.
22. 제14항 및 제15항 내지제21항 중 어느 한 항에 청구된 효모를 발효시키고 배지내에서 생성된 히루딘을 생체내 또는 시험관내에서 성숙할 수 있는 전구체 형태나 성숙한 형태로 회수함으로써, 히루딘 또는 그의 변이체 중의 하나를 제조하는 방법.
23. 제22항에 청구된 방법을 수행하여 얻은 히루딘 또는 그의 변이체 중의 하나.
24. 제23항에 청구된 히루딘 HV1
25. 항응집제 또는 트롬빈 억제제로서 사용하기 위한 제23항 또는 제24항에 청구된 히루딘 또는 그의 변이체 중의 하나.

Images