NO864442L - Mutantkodende sekvens. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en E.coli ekspresjons vektor

med en mutant alfa-1-antitrypsin kodesekvens som fører til økede ekspresjonsnivåer av en variant alfa-l-antitrypsin.

Alfa-l-antitrypsin (AAT) er et alfa-l-globulin som foreligger i serum og forskjellige andre kroppsvæsker. Når det syntetiseres i leveren, er ferdig AAT et glykoprotein med en molekylvekt på ca. 50.000 til 55.000 dalton. Proteolytiske enzymer som inhiberes med AAt er trypsin, kymotrypsin, pankreas-elastase, hudkollagenase, renin og urokinase samt proteaser i polymorfonukleære lymfocytter. Genetisk betinget svikt i AAT hos mennesker opptrer i forbindelse med forskjellige pato-logiske tilstander, spesielt emfysema og leversykdommer.

Se f.eks. Morse, IM. Eng. J. Med. 299 (19): 1045-1048 (1978) og

299 (20):1099-1105 (1978); Tobin et al., Arch. Int. Med. 143 (7):1342-1348 (1982); og Carrell et al., Nature 298 (5872: 329-

334 (1982).

Elastase er en proteinase som bryter ned lungevev. Ukontrollert kan dens aktivitet føre til emfysema. Gadek et al., Am. Rev. Respir. Dis. 127:545 (1983) og Glaser et al., Am. Rev. Respir. Dis 127:547-553 (1983), har vist at AAT kan være tera-peutisk anvendelig i behandling av emfysema.

P.g.a sin terapeutiske anvendelighet og på grunn av forholdsvis store mengder som kreves for visse indikasjoner,

så som erstatningsterapi for pasienter med genetisk svikt i AAT, har forskerene søkt teknikker for å produsere AAT i store mengder. Slike konvensjonelle teknikker har bestått i å rense AAT fra blodplasma. Se f.eks. Coan et al., U.S. patent 4.379.087.

Courtney et al., EP-A-114.777 beskriver ekspresjon av

et AAT fusjonsprotein som mangler den N-terminale glutaminsyre rest i AAT i E.coli. Courtney et al. rapporterer at ekspresjon av ikkefusjonert AAT i E. coli er meget lav.

Courtney et al., Nature 313:149 (1985) rapporterer

syntese i E.coli av en variant AAT med en aktiv punktmutasjon.

Bollen et al., Begisk patent 895.961 beskriver kloning

av AAT i E.coli på et plasmid, pULB1523, som omfatter et 1,4

kilobasepar (kb) fragment au cDNA reuerst transkribert fra polyA-RIMA som stammer fra menneskeleverceller klonet i Pst I punktet av/pBR322. Bollen et al. beskriv/er at cDNA-fragmentet omfatter helle AATgenene, inbefattet det opprinnelige trans-lasjonsbegynnelses kodon.

Bollen et al., DNA 2: 255 (1983) beskriv/er pULB 1523

og pKT287, en ekspresjonsvektor som fører til ekspresjon av et beta-laktamase-AAT-fusjonsprotein i E.coli.

Bollen et al., FEB5 Letters 116 (l):67-7D (1984), rapporterer ekspresjon av AAT i E.coli ved bruk av lambde promoteren, PR, og rapporterer at forsøk på å demonstrere biologisk aktivitet i E. coli-avledet AAT har vært uten hell.

Parker et al., Australsk patentsøknad 31801/84 beskriver ekspresjonen av AAT i E.coli.

Munson et al., J. Microbiol. 177:663-683 (1984), rapporterer mutasjoner iE<_>. coli lacZ genet som fører til øket ekspresjon av beta-galactosidase. Myers et al., Science 229:242 (1985) rapporterer en elektroforesemetode for å identifisere mutant DNA-molekyler uten fenotypisk seleksjon.

I et aspekt omfatter oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekylomfattende en mutant AATkodende sekvens hvor mutasjonen består i en forandring av den AATkodende sekvens i kodonene 1-15. forutsatt at mutasjonen er forskjellig fra eller i tillegg til substitusjonen på kodonet ATG for det første kodon av den opprinnelige kodesekvens.

I andre aspekter er oppfinnelsen en E.coli ekspresjonsvektor med DNA-molekylet operativt satt inni seg, og en E.coli transformert med ekspresjonsvektoren i følge oppfinnelsen. Oppfinnelsen er også en femgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid med den biologiske aktiviteten til AAT, d.v.s. anti-trypsin og anti-elastaseaktivitet, som består i å dyrke den transformerte E.coli i følge oppfinnelsen under tillatelige betingelser og isolere det således produserte AAT.

I andre aspekter er oppfinnelsen et variant-AAT-protein med den biologiske aktiviteten til AAT, og med en forandret aminosyresekvens i posisjon 1-15, forutsatt at forandringen er forskjellig fra eller i tillegg til substitusjonen au glutaminsyreresten i den første posisjon au ferdig AAT; en farmasøytisk blanding for inhibering au elastaseaktiuitet i lungene til et dyr, innbefattet et menneske, omfattende uariant-AAT-proteinet og sn farmasøytisk akseptabel barer; og en fremgangsmåte for å inhibere elastaseaktiuitet i lungene til st dyr, innbefattet et menneske, hvor man gir dyret innuendig en anti-elastase uirksom mengde au AAT-uariant proteinet.

I enda et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere en rnutantkodende sekuens for et polypeptid au intresse, som sr transkribert og translatert i større grad enn den opprinnelige kodesekuens, huilken omfatter (i) legering au hele eller en del au den opprinnelige kodesekuens til en kodesekuens for en selekterbar fenotype, transformering au en passende uert med denne, og kuantifisering au ekspresjon au det resulterende translasjons fusjonsprodukt, (ii) muta-genisering au hele eller en del au kodesekuensen for det interessante polypeptid, (iii) måling au zket utbytte au mutanstranslasjonsfusjanen ouer ekspresjonen au den opprinnelige translasjonsfusjonen; (iu) bestemmelse au nukleotidsekuenssn til mutantdelen au kodesekuensen for det interessante polypeptid i fusjoner som uiser øket ekspresjon i (iii) og selektering au sådanne med en mutasjon i kodesekuensen for det intere s-s ante polypeptid, (u) fremstilling au en kodesekuens identisk med den opprinnelige kodesekuens au det interessante produkt, untatt at den inneholder en eller flere au mutasjonene som er identifisert i rnutantkodesekuensen og transformering au en henisktsmessig uert med denne, (ui) selektering au transformanter fra (u) huori rn utantkodesekuensen er trans-skribert og translatert i større mengder enn den opprinnelige kodesekuens.

Det er nå funnet at ekspresjon au aktiu AAT i bakterier kan forbedres signifikant og uuentet ued å forandre kodesekuensen for N-enden au ferdig AAT uten å ødelegge proteinets biologiske aktiuitet, d.u.s. uten å ødelegge proteinase, spesielt elastase, inhibering ued proteinet. Ued å bruke det rekombinante DIMA-moleky 1 i følge oppfinnelsen kan et AAT-uariant protein med anti-trypsin og anti-elastase aktivitet uttrykkes i bakterier i dobbelte eller større mengder enn mengdene for opprinnelige AAT. I foretrukne utførelsesformer av/ oppfinnelsen kan mengdene au v/ariant-AAT som uttrykkes v/ære IDO ganger eller enda større enn opprinnelig AAT. Opprinnelig AAT eller AAT som her brukes betyr ferdig AAT som v/ist i tabell 1, nedenunder, som har Glu-Asp-Pro som N-terminale aminosyrer samt Met-Asp-Pro konstruksjon erholdt v/ed å spalte den opprinnelige kodesekuens ued BamHI-punktet mellom Glu og Asp.

Se eksempel 2 nedenunder. Variant-AAT, slik det her brukes,

har en primær aminosyresekuens forskjellig fra opprinnelig AAT. En mutant AAT kodesekuens er en som adskiller seg fra kodesekuensen for opprinnelig AAT uist i tabell 1 nedenunder. Det rekombinante DNA-molekyl i følge oppfinnelsen er således

en slik mutantkodesekuens, enten isolert eller i et større DNA-molekyl så som f.eks. en klonings eller ekspresjonsvektor'. Det rekombinante DNA-molekyl i følge oppfinnelsen fremstilles ued standard syntese eller genesløydteknikker, eller ued en kombinasjon au begge som forklart nedenunder.

Kodesekuensen som omfattes au rekombinant DNA-molekylet

i denne oppfinnelse har en eller flere substitusjoner au basepar som ikke påuirker aminosyresekuensen, og/eller substitusjon, addisjon eller delesjon au ett eller flere kodoner innenfor de første 15 kodoner. \/ariant-AAT kodesekuensen i eksempler på rekombinante DNA-molekyler i oppfinnelsen,

huis konstruksjon og bruk er eksemplifisert, er illustrert i tabell 1, som følger, samt de første tyue kodoner au opprinnelig AAT til sammenligning. Variant basepar er understreket.

Mengdene au AAT eller uariant-AAT uttrykt i E.coli

ued rekombinante DNA-molekyler i oppfinnelsen uttrykkt som prosent au totalt celleprotein er uist i tabell 2 som følger. Allte de oppførte plasmidekspresjonsuektorer, untatt slike som inneholder betegnelsen "cro", anuender venstre promotor (PL)

av lambda og ell ribosoms bindingspunktet. Cro-vektorene anvender PL og cro robosom bindingspunktet. Plasmidkonstruk-sjonene er beskrevet i eksemplene nedenunder. De rapporterte representative ekspresjonsdata ble oppnådd ved induksjon med naladiksinsyre , eller i tilfelle data i parentes, ved varmeinduksjon. Se Mott et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 82:88

(1985). Tabell 2 viser også betegnelsene som er gitt produktet av hver vektor.

Når v/armeinduksjon anvendes (se f.eks. M.Rosenberg et al., Meth. Emzymol. 101:123-233 (1983), er AAT produksjonen omtrent en tredjedel av det som oppnås med naladiksinsyre induksjon. Ved for eksempel å bruke pQTS al -Bel, var variant AAT ekspresjonen 5-10/5 av totalt cellulært protein; ved å bruke p -AGcro var den 2-A %, og ved å bruke pHJ _7<y>ar den 3-55L

41 <*1

De rekombinante DNA-molekyler som er vist ovenfor

er bare illustrerende. Alternative eller ytterligere substitusjoner av basepar og deles joner av kodoner kan foretas ved velkjente teknikker på området moleylargenetikk. Virkningen av slike mutasjoner på ekspresjonsnivåer i bakterier kan lett bestemmes med velkjente teknikker så som vad ELISA so rn f..eks. beskrevet av Bollen et al., DNA 2_:255 ( 1983) Aktivitet av resulterende proteiner kan lett måles ved velkjente under-søkelser, så som for elastase og trypsin inhibering som beskrevet av Courtney et al., AP-A-114,777; Kauiasaki et al., EP-A-103.409; og Travis, U.S. patent 4.493.891. Andre illustrerende DNA-molekyler i oppfinnelsen er slike molekyler hvor mutantkodesekvensen adskiller seg fra opprinnelige AAT ved substitusjon av en eller flere basepar hvilket bevirker en forandring i aminosyresekvensen til AAT.

Innenfor oppfinnelsen ligger også rekombinante DNA-molekyler hvor AAT-kodesekvensen omfatter mutasjoner i tillegg til mutasjoner i %'-enden av AAT-kodesekvensen. For eksempel kan kodesekvensen være sammensmeltet ved 5'-og/eller 3<1->enden til en kodesekvens for en eller flere ytterligere aminosyre eller polypeptider, så som en N-terminal Met fusjon som i pHJ0^5. 1-2 og -4, eller slike fujsoner som er beskrevet av Courtney et al., EP-A-114-777 eller Bollen et al., DNA 2:255

(1983). Fusjon av en N-terminal del av influensa virus' NS1 kode-sekvensen til autentisk AAT øker ekspresjonen av AAT-hybridet. Kodesekvensen kan også omfatte substitusjoner av basepar eller delesjoner av kodoner i områdene til andre kodesekvenser enn 5'-enden. Utelukket fra oppfinnelsen er selvfølgelig mutasjoner som fører til senkning av ekspresjonsnivåer fremfor slike som oppnås med den opprinnelige kodesekvens, f.eks. ekspresjon i E.coli ved mindre enn ca. 0,3% av totalt cellulært protein, eller tap au biologisk aktivitet hos det resulterende protein så som rammeskift mutasjoner, nonsense mutasjoner eller aktive punkt mutasjoner som påvirker aktiviteten. Eksempler på aktive punkt mutasjoner som er akseptable er et område av metionin aminosyrer ved en posisjon 358 til en valinrest, så som beskrevet av Courtney et al., Nature 313:149 (1985) og av 5. Rosenberg et al., Nature 312:1 (1984).

Variant-AAT i denne oppfinnelse kan også være bundet eller kompleksert med andre molekyler så som f.eks. beskrevet av [litra, U.S. patent 4.496.689.

Som forut angitt kan mutasjoner til 5'-enden av AAT kodesekvensen samt til andre området foretas ved velkjente teknikker. For oversikt av bestemte slike anvendelige teknikker se Botstein et al., Science 229:1193 (1985). Disse er f.eks. delesjon av kodoner ved behandling av kodeskvensen med en restriksjons endonuklease evt. etterfulgt av behandling med en eksonuklease, f.eks. Bal31 eller mung-bønne-nuklease. Etter slik delesjon kan syntetiske sekvenser insettes for å erstatte hele eller en del av det deleterte området. Alternativt kan mutasjoner f .eks. induseres ved behandling av transformanter som har en AAT kodesekvens ved kjemiske mutagener eller be-stråling. Mutanter som er forandret i 5'-området kan selekteres ved ekspresjonen av AAT og nukleotid sekvens bestemmelse•av de første tyve kodoner. Slike mutagenese eksperimenter er lette å utføre ved fusjon av N-terminale AAT kodende sekvenser, f.eks. det 45 basepars BamHi-BclI fragment oppstrøms for genet for en selekterbar fenotype, f.eks. galaktokinase og beta-galaktosidase, og undersøkelse etter up-mutas joner, d.v.s. mutanter som viser økede ekspresjonsnivåer av genet for den selekterbare fenotype.

Således et annet aspekt av denne oppfinnelse er en fremgangsmåte for å identifisere mutanter av en kodesekvens for ethvert interessant polypeptid, hvilke mutanter er transkribert og translatert ved høyere nivåer enn for den opprinnelige kode-sekvens. Denne fremgangsmåte kan utføres ved å ligere hele eller en del av den opprinnelige kodesekvens for det interesante produkt til 5' eller 3' enden av en kodesekvens for en lett selekterbar funksjon. Fortrinnsvis vil delen av den opprinnelige kodesekuens være en del au 5' enden, f.eks. 45 basepar, som er sammensmeltet med 5' enden au kodesekuensen for den selekterbare funksjon.

Den selekterbare funksjon er enhuer funksjon som medfører en selekterbar fenotype og er fortrinnsvis en huis ekspresjon kan kuantifiseres relatiut. For eksempel kan den selekterbare funksjon uære galaktokinaseaktiuitet, for huilken relatiu ekspresjon kan kuantifiseres ued fargeforandring på en indikator plate, f.eks. MacConkey galaktose (Difco). Galaktokinase-translasjonsfuns joner beskrives f.eks. au Heusterspreute et al., DNA 3:377-386 (1984). Andre eksempler er beta-galaktosidase-aktiuitet som relatiut lett kan kuantifiseres ued fargeforandring på en indikator plate omfattende næringsagar inneholdende X-Gal eller DNPG (se f.eks. J.H. Miller, Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972.

Slike translasjonsfus joner mugateniseres deretter som f .eks. ued passasje gjennom en mutator fremkaller eller ued behandling in uitro med et mutagen så som hydroksylamin som beskrevet au flunson et al., J. Microbiol. 177 :663-683 (1984). Se. også J.H. Miller, Experiments in Moelular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Neui York, 1972. Mutant-transformanter eller verter transformert med muterte plasmider klones og undersøkes etter øket. ekspresjon av den selekterbare funkjson. Plasmider fra kloner som viser en slik øket ekspresjon, isoleres og analyseres ved DNA-sekvens bestemmelse av den del som koder for det interessante polypeptid. Noen av disse plasmider muteres i kodesekvensen for det interessante produkt. Mutasjoner i denne delen innsettes så i hele kodesekvensen for det interessante produkt ved standard syntese/rekombinante DNA teknikker. Slike mutantkodesekvenser innsettes i en ekspresjonsvektor og innføres i en vertcelle. Transformantene klones og måles for ekspresjon av det interessante polypeptid. I noen tilfeller vil det finnes at ikke-beslektede mutasjoner i forskjellige plasmider bevirker øket ekspresjon. Slike mutasjoner kan kombineres i en eneste variant kodesekvens som i tilfelle pHJ ,-7. Se eksempel 9 nedenunder,

etl

Ekspresjonsvektoren hvori mutant-AAT-kodesekvensen innsettes for å fremstille vektoren i følge oppfinnelsen, kan være enhver blandt mange bakterie-ekspresjonsvektorer som er kjente og tilgjengelige på området. Regulerbare ekspresjonsvektorer foretrekkes. Med "regulerbar" menes at transkripsjon av den innsatte kodesekvens ikke er konstitutiv men kan induseres så som ved at dyrkningsmediet tilsettes et induseringsmiddel eller ved varme. Eksempler på E.coli ekspresjonsvektorer er blandt andre pCQV2, beskrevet av Bollen et al., FEB5 Lett. 166-67

(1984), og pASl beskrevet av M. Rosenberg et al,, Meth. Enzym. 101:123-138 (1983). pASl bærer pBR322 opprinnelsen for replika-sjon, an ampicillin-resistens-markør og en rekke fragmenter fra lambda som omfatter regulerings området, nemlig den venstre promotor av lambda (PL), N anti-avslutnings funksjons gjen-kjennelses punkter (NutL og NutR), det rho-avhengiige trans-skripsjonsavslutnings-signal (tRl) og ell ribosom bindingspunktet inneholdende ell translasjons begynnelsespunktet, hvis G rest umiddelbart etterfølges av BamHI spaltningspunktet som følger:

5' ..... C ATATG* GATCC 3'

hvor symbolet, * , representerer spaltningspunktet for BamHI.

pASl kan utledes fra pKC3DcII ved delesjon av nukleo-tider fra BamHI punktet ved cII-pBR322 skjøten av pKC3DcII til ell ATG og relegering av molekylet for å gjenskape BamHI

punktet umiddelbart nedstrøms for ATG'et. pKC3GcII konstrueres ved å sette inn et 1,3 kb Haelll fragment fra lambda som bærer ell genene i Hpal punktet av pKC3D. Se Shatzman et al., i "Experimental Manipulation of Gene Expressions, " Edit, av M. Inouye, Academic Pres, Neiu York (1983) og M. Rosenberg et al., sitert ovenfor. pKC30 er beskrevet av Shimtake et al., Nature 292:128 (1981). Det er et pBR322 derivat med et 2,4 kb Hindlll-BamHI fragment av lambda insatt mellom Hindlll og BamHI punktene

i tetR genet av pBR322. Lingnende konstruksjoner til pASl er beskrevet av Courney et al., Nature 313:149 (1985) og Kotewics et al., Gene 3_5:249 (1985). Kodesekvensen er operativ innsatt deri, d.v.s. korrekt orientering og riktig leseramme til reguler-ingselementet ved standard teknikker.

Andre klone- og ekspresjonssystemer er kjente og tilgjengelige for ekspresjon av/ den AAT-mutant kodende sekv/ens i oppfinnelsen i andre bakterier, f .eks. Bacillus, Streptomyces, Corynebacterium og andre.

En kodesekuens for ferdig, opprinnelig AAT, hvorau alle naturlige forekommende polymorfe kan brukes som et utgangs-materiale for utførelsen au denne oppfinnelse, kan erholdes ued standard teknikker ued revers transkripsjon au utplukkede bud-bringer RNA populasjoner fra leverceller så som f.eks. beskrevet au Bollen et al., Belgisk patent nr. 895.961; Bollen et al.,

DNA 3:255 (1983); Courtney et al., EP-A-114.777; Kawasaki et al., "The Molecular Biology of Yeast," August 16-21. 1983, Cold Spring Harbor Laboratory; Long et al., Structure and Organi-zation of Genes I, Abstract No. 25 (1983); Woo et al., "From Gene to Protein: Translation into Biotechnology," edit au

Ahmed et al., Academic Press, New York (1982); Kurachi et al; Proe. Nat' 1. Acad. Sei. U. S. A. 73 : 6826 (l98l); Parker et al., Australsk patentsøknad 31801/84; og Costanzo et al., E M B 0 J.

2:57 (1983).

Variant-AAT produseres i følge fremgangsmåten i følge oppfinnelsen ved å dyrke mikroorganismer eller celler som er blitt transformert med ekspresjonsvektoren i følge oppfinnelsen under passende betingelser. Med "passende betingelser" menes dyrkings-betingelser, f.eks. analyter, metaboliter, andre medium bestand-deler og temperatur, hvorunder ekspresjon av AAT induseres. Typisk dyrkes transformerte E.coli i et næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon og nitrogen med luft-innblåsing og under seleksjonstrykk, inntill logfasevekst (Aecnca. 0,4-0,6) før induksjonen og deretter i ytterligere

b 5 U

1,5 til 5 timer etter induksjonen, inntill en isolerbar mengde av polypeptidet uttrykkes..

Uariant-AAT i oppfinnelsen uttrykt i E.coli eller en annen organisme isoleres fra produksjonskulturen ved standard-iserte proteinisoleringsteknikker. Typisk omfatter rense-skjema l) bryting av celler, 2) klaring av celle-ekstraktet,

3) separasjon av variant-AAT molekylene og 4) sluttrensing for å fjerne resterende kontaminanter inbefattet de resterende polypeptider, karbohydrater, nukleinsyrer og/eller lipopoly-saccarider.

Det første txJ/nn kan utføres så som v/ed tilsetning av/lysozym eller andre lyse- eller gjennomtrengnings-middel eller v/ed mekanisk eller ultraly d-bry ting. Andre midler for eksterna-lisering av/ protein er bruk av/ temperatur-ømfintelige lytiske bakterier så som beskrev/et av/ Auerbach og Rosenberg, europeisk patent søknad nr. 0140864. Hv/is polypeptidet felles i celle-ekstraktet, kan det resolubiliseres v/ed tilsetning av/denatuerings-middel. Slike teknikker er velkjente. Flere av/disse er gjen-gitt av Builder et al., AP-A-114.506 publisert 1. august 1984. AAT-variant-molekylene som her er spesifikt eksemplifisert er løselige i standard E.coli ekstrakter med unntagelse av AATD15.

Variant-AAT molekylet i løsning skilles så ved standard teknikker. Disse er f .eks. selektiv utfelling av variant-AAT

så som ved tilsetning av ammoniumsulfat (60 - B0% av metning) etterfulgt av gjenoppløsning. Den variant-AAT-ho1dige løsning kan så føres gjennom en rekke på ett eller flere kromatografiske trinn, så som ved å bruke DEAE-cellulose, konkanavalin A sefarose, fenylsefarose, disulfid bindende ligander, revers fase HPLC, og affinitets kolonner ved bruk av anti-AAT antistoff, hvis fremstilling er beskrevet av Lathe et al., Nature 234:473-474 (1980). Det rensende variant-AAT kan frysetørkes før gjenoppløsning i

et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel for administrering.

\iariant-AAT molekylet har tendens til å være ustabilt under ca. pH 5,5. Proteinene er stabile i 1-2 dager ved romtemperatur og betydelig lenger ved 4°C. For lagring av renset AAT anvendes typisk natriumfosfat buffer (pH8).

Den foretrukne renseprosess er en substitusjons-kromatografi prosess som består i å kontakte en uren løsning av et variant-AAT-protein i følge oppfinnelsen med Kappa (K)-kjeder forut koblet til en uløselig bærer-matrisse. Se Laurell et al., Eur. J. Biochem. 57:107-113 (1975); Laurell, J. Chromat. 1_59:25-31 (1978); Laurell, J. Chromat. 278:53-61 (1983).

K-kjedene kan stamme fra urinen til en pasient med myelomatofati

og kan være bundet til en passende bærermatrisse ved kjente teknikker. Bærermatrisser er f.eks. agarose, "Affi-gel",

dekstran, cellulose, polysteren, polyakrylamid, siliciumoksyd, nylon, akryliske copolymerer og polyestere.

Variant-AAT'et i oppfinnelsen er anvendelig som en protease inhibitor og kan brukes for behandling av emfysema forårsaket av utilstrekkelig AAT-aktivitet. En slik util-strekkelighet kan forårsakes ved oksydasjon av AAT så som ved tobakksrøyk eller ved genetisk svikt av AAT produksjon. Gadek

■et al., Am. Rev. Respir. Dis. 127:545 (1983) demonstrerte f.eks. anvendeligheten av AAT i peranteral erstatningsterapi av pasienter med homozygotisk AAT svikt. Andre anvendelser for variant-AAT er antistoff produksjon, bruk som et bindemiddel

i kromatografisk rensing av forskjellige proteiner og protease inhibering i protein-innholdige blandinger og løsninger. Enda andre anvendelser er behnandling av pankreatitis og forbrenninger (se Schultze et al., U.S. patent 3.293.235) ag for fremstilling av antibiotika for bruk i diagnose av serum AAT-manglende personer. Slike anvendelser kan utføres ved velkjente teknikker for en fagmann.

Variant-AAT i oppfinnelsen har AAT-aktivitet og er immunologisk nær beslektet med AAT. Det kan derfor brukes på samme måte som AAT. Spesifikt kan variant-AAT formuleres så som ved oppløsning i en farmasøytisk akseptabel bærer, ved standard teknikker for innvendig administrering, typisk intravenøs administrering. Farmasøytiske akseptable bærere velkjente. Slike bærere som er egnet for intravenøse adminstrering er f.eks. løsninger av natriumklorid, acetater, glukose, mannitol og albumin. Variant AAT kan også komplekseres med fysiologisk akseptable eksipienter som beskrevet av Mitra, U.S. patent 4.496.689. Doseringen og adminstreringssekvensen vil variere med type og grad av sykdommen, og med.aktiviteten til det spesielle varantmolekyl som anvendes. I en pasient som lider av homzygotisk AAT mangel, velges dosen og adminstrerings-fre-kvensen slik at serum AAT aktiviteten holdes på nivåer som ca. minst 35% av det normale. DEtte krever typisk i.v. infusjon av 1 - 15 g, fortrinnsvis 2-10 g av variant-AAT med aktivitet sammenlignbar med AAT ukentlig. Variantmolekyler som p.g.a. mutasjoner i andre områder i proteinet, så som in det aktive punkt, v/iser mer stabil aktivitet, kan gis i lavere doser og/ eller med lavere frekvens.

De følgende eksempler er illustrerende og ikke begrensende for oppfinnelsen. Alle restriksjons-endonukleaser fikk man fra kommersielle kilder, og de ble brukt i det vesentlige i følge leverandørens instruksjoner.

EKSEMPLER

Eksempel 1. pOTS ^ Bel

Menneske-AAT-genet ble isolert fra cDNA klonet pULB1523 (erholdt fra A. Bollen, belgisk patent 895.961). Genet erholdtes på et Pstl fragment som omfatter hele cDNA-klonet.

Pstl fragmentet ble innsatt i et eneste Pstl punkt i

pUC9 (en pBR322 vektor erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Meryland inneholdende et fragment fra M13 med multiple enkeltpunkter). Denne nye vektor ble spaltet med endonukleasen Sali, hvilket førte til et enkelt kutt plasert 10 bp nedstrøms for Pstl punktet ved 3'-enden av cDNA-fragmentet. Den lineæriserte vektor ble behandlet med eksonuklease Bal 31

for å fjerne GC halen etter 3'-enden av AAT-genet. Betingelsene var som følger: 0,4 mM CaCl2, 0,4 mM MgCl2>40 mM NaCl, 24 nM Tris pH8, 0,2 mM EDTA og 40 mg av DNA i en total mengde av 200 ml. Reaksjonen ble inkubert ved 30°C i 2 min. og 20 enheter eksonuklease Bal31 (erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersbrug, Maryland) ble tilsatt. 25 ml's alikvoter ble fjernet fra blandingen hvert 15 sek., og reaksjonen ble stoppet ved å tilsette EDTA til en sluttkonsentrasjon på 50 mM. Analyse av DNAet fra et 1 min. tidspunktet viste at GC-halen ble fjernet fra 3'-enden av AAT-genet, og at genet hadde beholdt 40 basepar nedstrøms for stopp-kodonet for AAT. DNA ble fyllt inn ved bruk av Klenow DNA polymerase (Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) hvilket ga et molekyl med rettavskåret ende og an Xhol binder erholdt fra Collaborative Research Laboratories, Lenxington, Massachusetts, ble innsatt (Maniatis et al.) so rn førte til konstruksjon av pUC <V .1., - 2 .

AAT-genet ble isolert fra pUC^^-2 ued spaltning med

Xhol og Bell Belt kapp 45 bp nedstrøms for begynnelseskodonet

ved 5'-enden av AAT-genet. Genet ble innsatt i ekspresjonsvektoren pOTSU som var blitt spaltet med BamHI og Xhol ved bruk av standard ligeringsmetoder (Maniatis et al.). Den resulterende konstruksjon pOTS Bel er en ekspresjonsvektor i følge oppfinnelsen. Den inneholder et variant-AAT-gen som

koder for hele AAT minus de første 15 aminosyrer av/ den ferdige 5'-enden av/ genet.

pOTSV (Dev/are et al., Cell 36:43-49 (1984)) ble utledet

fra pASl v/ed å innsette et 189 bp fragment med en transkripsjons-terminator, DOP-terminatoren i l\lru I - punk tet nedstrøms for BamHI-punktet i pASl og v/ed å sette inn en syntetisk binder (Xbal,

Xhol, Sacl) i Sall-punktet mellom BamHI-punktet og den til-

satte terminator.

En lysogen htpR165 stamme av/ E.coli (Cooper et al.,

Mol. Gen. Genet. 139:167 (1975); Baker et al., Proe. Nati. Acad. 5ci. U. 5. A. 81 : 6779 (1984) og en v/ill-type cl<+>defekt K12 lysogen ble transformert med pOTS<j-^c-'- ued standard metoder (Maniatis et al.). Transformanter ble dyrket til log-fase før v/arme-induksjonen (M.Rosenberg et al., Meth. Enzym. 101123 (1983))

eller naladiksinsyre induksjon (Mott et al., P roe, Nati. Acad.

Sei. U. 5. A.82:88(1985)).

Etter induksjonsperioden ble celler samlet ued sentrifugering og lyset ued tilsetning til en lysozymløsning (l g celler/10 ml løsning) 50 mM tris, pH 8, 0,1 mM etylendiamin-tetraacetat (EDTA), 0,1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1 % deoksycholat (DOC) og 0,5 g/ml lysozym). Suspensjonen ble skjærebehandlet ued ultralyd og deretter rørt i minst 4 timer. Suspensjonen ble så skilt ued langsom (10.000 opm) sentrifugering i 20 minutter. Klumpen ble gjenoppslemmet i tris-bufferen som forut uar blitt tilsatt urea til en sluttkonsentrasjon på 4M. Denne suspensjonen ble ultralydbehandlet og rørt naten ouer ued romtemperatur. Suspensjonen ble så separert ued langsom sentrifugering i 20 min. Supernatanten ble samlet og dialysert mot buffer (50 mM tris,

pH 8, 25 mM NaCl, 1 mM DTT). Løsningen ble så satt på en dietylaminoetyl (DEAE)-trisakryl-kolonne og eluert med 25-500 mM NaCl gradient. Toppfraks joner ble dialysert mot buffer (50 mM tris, pH8, 25 mM NaCl) og målt med hensyn til proteinkonsentrasjon og anti-1ryps in - og anti-elastase-aktiuitet. Fraksjoner oppsamlet ued 150 - 250 mM NaCl inneholdt AATD15 på ca. 90% renhet.

I trypsin og elastase målingene uiste AATD15 10 - 15%

au aktiuiteten til AAT som stammet fra menneske serum (Sigma

Chemicals, St. Louis, Missouri) og AAT (Met-Asp-Pro) som

stammet fra gjær. Denne aktivitets-reduksjonen antas å stamme fra bruk au urea, og i et annet tilfelle, tiocyanat under alkal-iske betingelser. Trypsin målingen ble utført ued fremgangsmåten til Trauis, Meth. Enzym. 80:755-765 (1981). En reaksjons-blanding au 100 ml trypsin (15 mg), 200 ml tris (10 mM, pH 8)

og 200 ml AATD15 (30 mg) i 10 mM natriumfosfat (pH 7,6) ble inkubert 15 minutter ued romtemperatur. Deretter ble 2, ml substrat (p-tosyl-L-arginin metyl ester (1,3 mg/ml) i buffer (10 mM tris, pH 8) tilsatt. Absorbansen ued 253 nm ble plottet huert minutt i et 5 minutters tidstrom.

Elastase-målingen ble også foretatt ued fremgangsmåten til Trauis. En stam-substratløsning (20 mM) ble fremstilt ued å sette 45 mg N-succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) til 5 ml dimetylsulfoksid (DMS0). En enzymløsning ble fremstilt ued tilsetning au 0,3 mg elastase fra su inebukspy11kjerte1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). "50 ml au enzymløsningen i en kyuette ble tilsatt 0,2 ml buffer (200 mM tris-HCl, pH 8). En ekuimolar mengde au AATD15 ble satt til løsningen, og løsningen ble inkubert ued romtemperatur i 1 minutt. Ionefritt uann ble tilsatt til et sluttmolum på 2.950 ml. Så ble 50 ml substratløsning tilsatt og løsningen ble blandet. Absorbans ued 410 nm ble observert i et 5 minutters tidsrom.

Eksempel 2. pHJ^-2

pMG27N (Gross et al,, Mol. Cell. Biol. 5:1015 (1985)) ble utledet fra pOTSV ued deletering au et ExoRI-BasI fragment på ca. 900 bp oppstrøms for PL promoteren, huilket førte til delesjon au 3 au de 4 Ndel punkter i vektoren. Et BamHI-XhoI (ende-fyllt) fragment au AAT-kodesekuensen fra pULB1523 (BamHI kapper kodesekuensen mellom de første og andre kodoner) ble innsatt mellom BamHI og Sali punktene i pMG27l\l. Fremgangsmåtene ble i det uesentlige utført som beskrevet av Maniatis et al., sitert ovenfor. Denne vektoren, pHJ g^-! uttrykte fullstendig,

opprinnelige AAT ( med en Met i stedet for Glu som den første aminosyre) som mindre enn ca. 0,1 - 0,3% av/ totalt cellulært protein. BamHI-punktet nedstrøms for ell ATG bibeholdes.

pHJ^^-1 b]_e spaltet med Ndel og Bcll'for å deletere kodonene to til og med seksten. Dette fragment ble erstattet med en syntetisk oligonukleotid-binder som illustrert i tabell 1

for å fremstille pHJ -2. Fragmentene ble innsatt ued å bruke et plasmid-til-oligonukleotid-forhold på 1:50 og standard ligeringsmetode. AAT-uariant-proteinet, HJ2, ble uttrykt i en mengde ca. to ganger større enn AAT fra pHJ ^^"l» etter uarme eller naladiksinsyreinduksjoner, som ble anslått ued undersøkelse au polyakrylamid geler farget med Coomassie Brilliant Blue.

Eksempel 3 pOTS ^ - 3

Hele AAT genet ble isolert fra pUC#^"2 ued spaltning med BamHI og Xhol. Fragmentet ble ligert til en BamHI og Xhol avskåret pOTSV vektor, huilket førte til pOTS . pOTS ble deponert i American Type Culture Collection, Rockuille, Maryland, U.S.A. under tilgjengelighetsnummer 53282. Denne nye vektoren ble så spaltet med BamHI og Bell som skjærer DNA fragmentet fra den N-terminale enden av AAT som inneholder de første 15 aminosyrer i det ferdige proteinet. DEtte fragment ble erstattet med syntetisk DNA (d.v.s. to overlappende oligonukleotid-bindere) som koder for disse 15 aminosyrer som illustrert i tabell 1, ovenfor. Denne vektoren pOTS^-3 uttrykker AATet i lignende mengder som det variant-AATet som fremstilles av pHJ^-2.

Eksempel 4 pSyn7

Et BamHI - Pstl (endefyllt) f ragment fra det opprinnelige AAT cDNA-klon, pULB1523 ble innsatt i pASl spaltet med BamHI og Sali (endefyllt). Det innsatte AAT-fragment inneholder GC-halen ved sin 3' ende. Et BamHi - Fnu4HI fragment ved 5<1->enden av AAT genet ble erstattet med en syntetisk oligonukleotidbinder hvori 3dje posisjonskodon forandringer ble innført i 3 kodoner. Denne konstruksjonen koder for et AAT med full lengde, hvor

den N-terminale aminosyre-sekvens er met-asp-pro-, som illustrert i tabell 1 ovenfor. Når DNA-sekvensen ble analysert,

ble det funnet at det 7. kodon var deletert under konstruksjonen. Således deleterer denne AAT-konstruksjon aminosyre 7 i tillegg

til 3. posisjons-kodon forandringer.

Syn 7 proteinet ble renset ved ammoniumsulfat-felling. Transformanter ble spesielt samlet ved sentrifugering og lyset

i 30 minutter ved 0°C i en-tiendels volum TES buffer. (50 mM tris, pH 8, 5mM EDTA og 25% sucrose) tilført 0,5 mg/ml lysozym og 10 mg/ml DNAse. Triton X100 ble så tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1%. Suspensjonen ble inkubert ved 0°C i 15 minutter og deretter bragt til 80 mM Mg<++>ved tilsetning av IM MgCl2. Denne suspensjonen ble inkubert i 5 min. ved 25°C. En supernatant ble samlet etter sentrifugering ved 15.000 opm i 10 min. Ammonium-sulf at ble satt til supernatanten og løsningen ble sentrifugert i 10 min. ved 10,000 opm. Syn 7 proteinet ble påvist i 50 - 75 % ammoniumsulfat fraksjonen. Denne felling ble gjenoppløst i buffer (50 mM tris, pH 8, 25 mM NaCl) og dialysert mot den samme buffer. Løsningen ble satt på en DEAE-trisakryl-kolonnen og eluert med en 25 - 500 mM NaCl gradient i buffer (50 mM tris,

pH 8). Fraksjoner ble dialysert mot buffer (10 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl) og proteinkonsentrasjon og anti-trypsin-

og anti-elastase-aktiviteter ble målt hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1 ovenfor. Syn 7 proteinet ble funnet i 150 - 250

mM NaCl fraksjonene i mindre enn 25% renhet. Det hadde samme grad av anti-elastase- og anti-trypsin-aktiviteter som AAT

fra serum og gjær. Syn 7 kontruksjonen ga ca. 7 ganger mer protein enn pHJ^-1.

I et separat eksperiment ble Syn 7 rensent til mer enn 95%, hovedsakelig ved fremgangsmåten til Laurell et al., J. Chromatoq. 278:53-61 (1981). Se også Laurell et al., Eur. J. Biochem. 57: 107-113 (1975) og Laurell, J. Chromatoq. 159: 25-31

(1978), Monomere Kappa-kjeder isolert fra urinen til en pasient med myelomatopati hovedsakelig etter fremgangsmåten til Berggard et al., J. Biol. Chem. 244 4299-4307 (1969) ble koblet til bromcyan sefarose 4B (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) hovedsakelig etter fremgangsmåten til Laurell et al., Eur. J. Biochem. _57:107-113 (1975). En bufret løsning av Syn 7 (50 mM trometamin) delvis renset fra cellelysater med ammoniumsulfat-felling, ble redusert ued tilsetning au beta-mercaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Løsningen ble så satt på en biogel P30 moelkylsikt. Løsningen ble deretter ført gjennom K-kjede/sefarose-kolonnen og eluert med den samme, buffer modifisert ued tilsetting au 1 mg/ml ditiobisnitrobenzosyre, og 0,25 mg/ml ditiotreitol. Eluatet ble redusert ued tilsetting au beta-mercaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 20 mM og dialysert eller satt på en Biogel P150 molekylsikt i natriumfosfatbuffer.

(10 mM, pH 7,5, 0,15 M NaCl).

Eksempel 5. pSyn7R.

pSyn7R ble konstruert som beskrevet i eksempel 4, ovenfor. Det ble bekreftet ued sekuensanalyse at denne konstruksjonen koder for et AAT med full lengde, hvor den N - terminale aminosyresekuens er met-asp-pro-, som illustrert i tabell I, Ekspresjonen au AAT fra pSyn7R var omtrent den samme som for Syn7.

Eksempel 5. pHJ ^ ^ - 5 og pOTS^-5

pHJ al,-1 ble spaltet med Ndel og Bell som deleterte

et fragment bestående au de første 15 aminosyrer au den N-terminale enden av AAT. DEtte fragment ble erstattet med en syntetisk DNA-frekvens som koder for de siste 5 av disse aminosyrer. Sluttkonsentrasjonen kodet for hele AAT minus de første 10 aminosyrer av den ferdige 5<1->enden av genet. Proteinet som her kalles AATD10, ble vesentlig renset som beskrevet i eksempel 4 ovenfor. Det ble vist å være 100% aktivt i trypsin-og elastase-målingene som er beskrevet i eksempel 1, og ble uttrykt i en mengde på ca. 200- til 250-ganger større enn AAT fra pHJ g -1. Et Bglll-Xhol fragment fra denne vektoren ble klonet i pOTS mellom Bglll-Xhol for å konstruere pOTS -5.

Eksempel 7. pHJ^-6

<pHJ>(j-^-B som uttrykker AATD5 ble konstruert og proteinet ble renset fra dette, hovedsakelig som beskrevet i eksempel 6, ovenfor. Mengden av AATD5 var ca. 150-' til 200 ganger mengden som uttrykkes av pHJ^-1. AATD5 ble prøvet i trypsin-målingen

hovedsakelig som beskrevet i eksempel 4 ovenfor og funnet å

være 100 % aktivt. At Bglll-Xhol framgent ble innsatt i pOTS som i eksempel 6 for å konstruere pOTS^.,-6.

Eksempel B. pHJ -4

pHJ a ^-4 vist i tabell 1, ble konstruert hovedsakelig

som beskrevet i eksempel 2, ovenfor og vist å produsere HJ2

som 0,5 - 1% at det totale celle-protein.

Eksempel 9 p ^ - A

pASK er et plasmid som omfatter PL promoteren og et

gen for Evcoli galaktokinase (galK) inneholdende ell ribosom-bindings-punktet. Det ble konstruert ved å plassere ell ribosom-bindingsområdet til pASl inntil et galK-kode-sekvens, hvori en BamHI-binder var blitt innsatt mellom ATG og det andre kodon i galK-kodesekvensen. Transformasjon av E.coli C600 (cl857) førte til transformanter, som når de ble plettert på en indikator plate omfattende MacConkey galaktose, fikk agaren til å bli rød rundt transformantene.

Det 45 basepar BamHI-BclI fragment fra den opprinnelige AAT kodesekvens ble satt inn i BamHI-punktet hvilket førte til

en translasjonsfusjon av AAT's N-endene og galK kodesekvensen. Dette plasmid pAAT galK, fikk ikke indikatorplatene til å bli

rød etter transformering i E.coli C600 (cl857). Western blot analyse bekreftet at slike transformanter produserte hybrid proteinet i mengder lik omtrent 0,3 til 0,5 prosent av mengdene galK uttrykt av celle-transforrnert med pASK.

For å frembringe mutanter ble pAATgalK behandlet med hydroksylamin in vitro, og i et separat eksperiment, ført gjennom en mutator-celle-linje, nemlig: mut T eller mut D

(se Miller, ed.; Experiments in Molecular Genetics.) E.coli C500 (cl857) ble transformert med plasmidet som hadde blitt utsatt for mutagene betingelser og plettert på indikatorplater. Flere røde kolonier ble isolert og analysert ved Western blot analyse etter mengdene av AAT-balK-hybrid-proteinet. En "opp-mutant" produserte ca. 10 til 20 ganger større mengder av hybridet enn de opprinnelige pAATgalK transformanter. Når dette genet

ble sekvensbehandlet, ble det funnet at et enkelt mutasjons-punkt hadde opptrådd i det andre kodon og forandret dette kodon fra GAT (aspartinsyre) til AAT (asparagin).

Plasmid p W,-A ble så konstruert v/ed insetninq av/

<tl ^ syntetisk oligonukleotider (se tabell 1, ov/enfor) i pHJ ax -1 og deretter i pOTS ^, som beskrevet i eksempel 6. E.coli C6QD (cl857 ) transformert med p --,-A produserte ca. 10 ganger mer av variant-AAT enn mengden av AAT fra pHJ^-1.

Eksempel 10, pHJ^-7

Et syntetisk oligonukleotid inneholdende den eneste nukleotid forandringen i p°9de tre forandringene i pSyn7R ble innsatt i pHJ Ekspresjonen av den resulterende variant-AAT HJ7 ble bestemt ved Western blot analyse til å være 5 til 10 ganger større enn Syn 7, og ca. 30 til 50 ganger større enn fra pHJ _ -1.

(Tl

Eksempel 11. pOTS -7

Et BstXI fragment av pHJ^-7 som omfatter områder opp-strøms for variant AAT-kodesekvensen gjennom en del av AAT kodesekvensen nedstrøms for 5'-mutasjonene, ble innsatt i stedet for et BstXI fragment i pOTS Punktene i begge vektorer er på like steder i forhold til AAT genet. Den resulterende konstruksjon, pOTS ble transformert i E.coli stamme AR120. Unduksjon førte til ekspresjon av HJ7 i mengder lik ca. 15% av totalt celleprotein , eller ca. 150 til 200 ganger større enn AAT uttrykt ved pHJ -1.

Eksempel 12. p A X-AG

Et syntetisk oligonukleotid inneholdende den eneste nukleotid forandring osm er tilstede i p - A°Q en C til G forandring i den 3. posisjon i det 3. kodon (prolin) (se tabell l) ble innsatt i pOTS som beskrevet i eksempel 9. E.coli (c600 cl857) transformert med pAl-AG produserte ca.

20 ganger mer av AAT-varianten HJ7 enn den mengde AAT som ble produsert fra pHJ/t,1~1*

Eksempel 13. p ^- A G cro

Ekspresjonsvektoren pRDNS ble konstruert som følger: Vektor pMG27IM (se eksempel 2) ble av/skåret med Av/al og 423 bp Aval-Xhol og 774 bp Xhol-Aval fragmentene fra pOTS ble innsatt. Den resulterende vektor, pMG27IM-S ble kappet med BamHI og

ligert med BamHI-fragmentet fra pASl & EHB01 som inneholder NSl-genet (Young et al., Proe. IMat! I. Acad. Sei. USA 60: 6105-6109 (1983 )). Denne vektoren pMG27N-SIMSl ble kappet ved sitt eneste Ndel-punkt, behandlet med mung bønne-nuklease og religert. Denne vektoren pMG27r\)-SI\]51-MB ble kappet med Sali og Ncol. Mellom disse punkter ble det innsatt et syntetisk oligonukleotid som kodet for et mutant cro-ribosom-bindingssted (rbs). Mutasjonen som er innført i dette rbs (CA i stedet for TG i stillingene -3 og -2 henholdsvis i forhold til ATG) gjorde det

mulig å innføre enestående IMdeI og Sali punkter inntil ATG'et. Shine-Dalgarno sekvensen og avstanden til ATG er identiske med sådanne i villtypens cro rbs. Villtypens AAT-sekvens ble flyttet fra pHJ (f-^-1 til pRDNS for å plassere kodesekvensen under PL kontroll og cro-r ibosom-bindingspunktet. Et BstXI fragment fra plasmidet ble så innsatt meil om BstXI avskaret pOTS ^ som i eksempel 11. Det resulterende plasmid pRDNS uttrykker AAT

i 3 ganger større mengder enn plasmid pOTStfl~l>selvom ingen forandringer ble foretatt i genekodesekvensen.

Variant-AAT kodesekvensen fra p ft^-AG ble innsatt i pRDIMS for å sette kodesekvensen under kontroll av P^og cro-ribosom-bindingspunktet. Et BstXI fragment ble klonet i pOTS som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid var pc^-AGcro. E.coli transformanter som inneholdt dette plasmid, produserer AAT-varianten i 3 ganger større mengder enn transformanter med p _ .. - AG og ca. 60 ganger mer enn mengden AAT fra pHJ ^ , -1.

w 1 * 1

Eksempel 14. p ^- Acro

AAT-varianten som koder sekvensen fra p^^-A ble

innsatt i pRDIMS for sette kodesekvensen under kontroll av PL og cro-ribosom-bindingspunktet. En BstXI fragment-bryter ble igjen utført med pOTS^^. Det resulterende plasmid er p ^^-Acro. E.coli transformanter med dette plasmid produserer HJ7 i ca. 3

ganger større mengder enn transformantene med pcrx"^<«>

Beskriv/eisene ovenfor og eksempelen er fullstendig illustrerende for oppfinnelsen og de foretrukne utførelsesformer av denne. Oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til de nøyaktige konstruksjoner som er beskrevet her, men omfatter alle modifikasjoner av disse innenfor rammen av de følgende krav.

Claims (10)

1. DNA molekyl karakterisert v/ed at det omfatter en alf a-l-antitrypsin (AAT) mutant-kodesekv/ens hv/ori mutasjonen omfatter en forandring av/ AAT-kodesekv/ensen i kodonene 1-15, under den forutsetning at mutasjonen er forskjellig fra eller i tillegg til substitusjonen av/ kodonet ATG for det første kodon i den opprinnelige kodesekuens.

2. DNA molekyl i følge krav/ 1, karakterisert v/ed at det er oHJ al, - 2» pOTSal -3, pHJal -4, pHJal" 5, pHJ^ -6, pOTSa]<Bcl,><pSyn7,> P Syn7R,Pal" A, pHJal -7, pOTS^ -7, pal -Acro, ^ al'^ > <p>al -AGcro, pOT <S>al -5 eller pOTSal -6.

3. DNA molekyl i følgende krav/ 1 eller 2, karakterisert v/ed at det er en bakteriell ekspresjonsvektor med alfa-l-antritrypsin-mutant-kodesekvensen innsatt operativt deri.

4. Variant-AAT-protein karakterisert ved at det har anti-trypsin- og anti-elastase-aktivitet omfattende 1 aminosyresekvens som er forandret i stillingene 1-15, forutsatt at mutasjonen er en annen enn eller i tillegg til substitusjonen av en metioninrest i den første stilling av naturlig AAT.

5. Variant-AAT i følge krav 4, karakterisert ved at det er AATD15, AATD1D, AATD5, HJ2, HJ7 eller SYN7.

6. Bakterie karakterisert ved at^J ^LQ , den er transformert med DNA-molekylet i følge kravene 1, 2 eller3 . jf.ftV

7. Fremgangsmåte ued fremstilling au et polypeptid med anti-trypsin- og anti-elastase-aktiuitetene til AAT, karakterisert ued at man dyrker bakterier i følge krau 6, under slike betingelser at polypeptidet uttrykkes i utuinnbar mengde og isolerer polypeptidet fra kulturen.

8. Fremgangsmåte ued fremstilling au polypeptid med antri-trypsin- og anti-elastase-aktiuiteten til AAT, karakterisert ued at man dyrker bakterien i følge krau 6 under slike betingelser at polypeptidet uttrykkes i utuinnbar mengde og isolerer polypeptidet fra kulturen*

9. Fremgangsmåte i følge krau 8, karakterisert ued at den farmastøytiske blanding for å inhibere elastase-aktiuitet i lungene til et dyr omfatter blanding au uariant-AAT-protein i følge kravene A og 5 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

10. Fremgangsmåte ued identifisering au en mutant-kodende sekuens for et polypeptid au interesse som er transkribert og translatert i en større mengde enn den naturlige kodesekuensen, karakterisert ued at man (i) ligerer hele eller en del au den naturlige kodesekuens til en kodesekuens for en selekterbar fenotype, transformerer en egnet uert med denne og kuantifiserer ekspresjonen au den resulterende translasjons-fusjon, (ii) mutageniserer hele eller delen au kodesekuensen for polypeptidet au interesse, (iii) måler øket ekspresjon au mutant-translasjonsfusjonen utouer ekspresjonen au den opprinnelige translasjonsfusjon; (iu) bestemmer nukleotid-sekuensen til kodesekuensen for polypeptidet au interesse i fusjoner som uiser øket ekspresjon i (iii), og selekterer slike med en mutasjon i kodesekuensen for polypeptidet au interesse, (u) fremstiller en identisk kodesekuens med den naturlige kodesekuens for produktet au interesse, untatt at den inneholder en eller flere au mutasjonene identifisert i mutant-kodesekuensen og transformerer en egnet uert med denne, og (v/i) v/elger ut kloner av/ transf ormanter fra (v/) hv/ori mutant-kode-sekv/ensen er transkribert og translatert i større mengder enn den naturlige kodesekuens.