NO864442L - Mutantkodende sekvens. - Google Patents
Mutantkodende sekvens.Info
- Publication number
- NO864442L NO864442L NO864442A NO864442A NO864442L NO 864442 L NO864442 L NO 864442L NO 864442 A NO864442 A NO 864442A NO 864442 A NO864442 A NO 864442A NO 864442 L NO864442 L NO 864442L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- aat
- coding sequence
- polypeptide
- mutant
- expression
- Prior art date
Links
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 title claims description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 14
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 claims description 11
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 11
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 10
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims description 10
- 101001010513 Homo sapiens Leukocyte elastase inhibitor Proteins 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 101100534544 Mus musculus Stx7 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 101100534540 Dictyostelium discoideum syn7A gene Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 101150037054 aat gene Proteins 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 4
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 4
- DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N Met-Asp-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DNDVVILEHVMWIS-LPEHRKFASA-N 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 108010016828 adenylyl sulfate-ammonia adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000036555 familial 5 febrile seizures Diseases 0.000 description 2
- 208000013090 familial febrile seizures 5 Diseases 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- -1 methionine amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVUGADOWXGKRAE-SRVKXCTJSA-N 4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GVUGADOWXGKRAE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001397104 Dima Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N Glu-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101150030170 Paat gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FKMJXALNHKIDOD-LBPRGKRZSA-N TAMe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OC)NS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 FKMJXALNHKIDOD-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000005275 alloying Methods 0.000 description 1
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Denne oppfinnelse vedrører en E.coli ekspresjons vektor
med en mutant alfa-1-antitrypsin kodesekvens som fører til økede ekspresjonsnivåer av en variant alfa-l-antitrypsin.
Alfa-l-antitrypsin (AAT) er et alfa-l-globulin som foreligger i serum og forskjellige andre kroppsvæsker. Når det syntetiseres i leveren, er ferdig AAT et glykoprotein med en molekylvekt på ca. 50.000 til 55.000 dalton. Proteolytiske enzymer som inhiberes med AAt er trypsin, kymotrypsin, pankreas-elastase, hudkollagenase, renin og urokinase samt proteaser i polymorfonukleære lymfocytter. Genetisk betinget svikt i AAT hos mennesker opptrer i forbindelse med forskjellige pato-logiske tilstander, spesielt emfysema og leversykdommer.
Se f.eks. Morse, IM. Eng. J. Med. 299 (19): 1045-1048 (1978) og
299 (20):1099-1105 (1978); Tobin et al., Arch. Int. Med. 143 (7):1342-1348 (1982); og Carrell et al., Nature 298 (5872: 329-
334 (1982).
Elastase er en proteinase som bryter ned lungevev. Ukontrollert kan dens aktivitet føre til emfysema. Gadek et al., Am. Rev. Respir. Dis. 127:545 (1983) og Glaser et al., Am. Rev. Respir. Dis 127:547-553 (1983), har vist at AAT kan være tera-peutisk anvendelig i behandling av emfysema.
P.g.a sin terapeutiske anvendelighet og på grunn av forholdsvis store mengder som kreves for visse indikasjoner,
så som erstatningsterapi for pasienter med genetisk svikt i AAT, har forskerene søkt teknikker for å produsere AAT i store mengder. Slike konvensjonelle teknikker har bestått i å rense AAT fra blodplasma. Se f.eks. Coan et al., U.S. patent 4.379.087.
Courtney et al., EP-A-114.777 beskriver ekspresjon av
et AAT fusjonsprotein som mangler den N-terminale glutaminsyre rest i AAT i E.coli. Courtney et al. rapporterer at ekspresjon av ikkefusjonert AAT i E. coli er meget lav.
Courtney et al., Nature 313:149 (1985) rapporterer
syntese i E.coli av en variant AAT med en aktiv punktmutasjon.
Bollen et al., Begisk patent 895.961 beskriver kloning
av AAT i E.coli på et plasmid, pULB1523, som omfatter et 1,4
kilobasepar (kb) fragment au cDNA reuerst transkribert fra polyA-RIMA som stammer fra menneskeleverceller klonet i Pst I punktet av/pBR322. Bollen et al. beskriv/er at cDNA-fragmentet omfatter helle AATgenene, inbefattet det opprinnelige trans-lasjonsbegynnelses kodon.
Bollen et al., DNA 2: 255 (1983) beskriv/er pULB 1523
og pKT287, en ekspresjonsvektor som fører til ekspresjon av et beta-laktamase-AAT-fusjonsprotein i E.coli.
Bollen et al., FEB5 Letters 116 (l):67-7D (1984), rapporterer ekspresjon av AAT i E.coli ved bruk av lambde promoteren, PR, og rapporterer at forsøk på å demonstrere biologisk aktivitet i E. coli-avledet AAT har vært uten hell.
Parker et al., Australsk patentsøknad 31801/84 beskriver ekspresjonen av AAT i E.coli.
Munson et al., J. Microbiol. 177:663-683 (1984), rapporterer mutasjoner iE<_>. coli lacZ genet som fører til øket ekspresjon av beta-galactosidase. Myers et al., Science 229:242 (1985) rapporterer en elektroforesemetode for å identifisere mutant DNA-molekyler uten fenotypisk seleksjon.
I et aspekt omfatter oppfinnelsen et rekombinant DNA-molekylomfattende en mutant AATkodende sekvens hvor mutasjonen består i en forandring av den AATkodende sekvens i kodonene 1-15. forutsatt at mutasjonen er forskjellig fra eller i tillegg til substitusjonen på kodonet ATG for det første kodon av den opprinnelige kodesekvens.
I andre aspekter er oppfinnelsen en E.coli ekspresjonsvektor med DNA-molekylet operativt satt inni seg, og en E.coli transformert med ekspresjonsvektoren i følge oppfinnelsen. Oppfinnelsen er også en femgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid med den biologiske aktiviteten til AAT, d.v.s. anti-trypsin og anti-elastaseaktivitet, som består i å dyrke den transformerte E.coli i følge oppfinnelsen under tillatelige betingelser og isolere det således produserte AAT.
I andre aspekter er oppfinnelsen et variant-AAT-protein med den biologiske aktiviteten til AAT, og med en forandret aminosyresekvens i posisjon 1-15, forutsatt at forandringen er forskjellig fra eller i tillegg til substitusjonen au glutaminsyreresten i den første posisjon au ferdig AAT; en farmasøytisk blanding for inhibering au elastaseaktiuitet i lungene til et dyr, innbefattet et menneske, omfattende uariant-AAT-proteinet og sn farmasøytisk akseptabel barer; og en fremgangsmåte for å inhibere elastaseaktiuitet i lungene til st dyr, innbefattet et menneske, hvor man gir dyret innuendig en anti-elastase uirksom mengde au AAT-uariant proteinet.
I enda et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere en rnutantkodende sekuens for et polypeptid au intresse, som sr transkribert og translatert i større grad enn den opprinnelige kodesekuens, huilken omfatter (i) legering au hele eller en del au den opprinnelige kodesekuens til en kodesekuens for en selekterbar fenotype, transformering au en passende uert med denne, og kuantifisering au ekspresjon au det resulterende translasjons fusjonsprodukt, (ii) muta-genisering au hele eller en del au kodesekuensen for det interessante polypeptid, (iii) måling au zket utbytte au mutanstranslasjonsfusjanen ouer ekspresjonen au den opprinnelige translasjonsfusjonen; (iu) bestemmelse au nukleotidsekuenssn til mutantdelen au kodesekuensen for det interessante polypeptid i fusjoner som uiser øket ekspresjon i (iii) og selektering au sådanne med en mutasjon i kodesekuensen for det intere s-s ante polypeptid, (u) fremstilling au en kodesekuens identisk med den opprinnelige kodesekuens au det interessante produkt, untatt at den inneholder en eller flere au mutasjonene som er identifisert i rnutantkodesekuensen og transformering au en henisktsmessig uert med denne, (ui) selektering au transformanter fra (u) huori rn utantkodesekuensen er trans-skribert og translatert i større mengder enn den opprinnelige kodesekuens.
Det er nå funnet at ekspresjon au aktiu AAT i bakterier kan forbedres signifikant og uuentet ued å forandre kodesekuensen for N-enden au ferdig AAT uten å ødelegge proteinets biologiske aktiuitet, d.u.s. uten å ødelegge proteinase, spesielt elastase, inhibering ued proteinet. Ued å bruke det rekombinante DIMA-moleky 1 i følge oppfinnelsen kan et AAT-uariant protein med anti-trypsin og anti-elastase aktivitet uttrykkes i bakterier i dobbelte eller større mengder enn mengdene for opprinnelige AAT. I foretrukne utførelsesformer av/ oppfinnelsen kan mengdene au v/ariant-AAT som uttrykkes v/ære IDO ganger eller enda større enn opprinnelig AAT. Opprinnelig AAT eller AAT som her brukes betyr ferdig AAT som v/ist i tabell 1, nedenunder, som har Glu-Asp-Pro som N-terminale aminosyrer samt Met-Asp-Pro konstruksjon erholdt v/ed å spalte den opprinnelige kodesekuens ued BamHI-punktet mellom Glu og Asp.
Se eksempel 2 nedenunder. Variant-AAT, slik det her brukes,
har en primær aminosyresekuens forskjellig fra opprinnelig AAT. En mutant AAT kodesekuens er en som adskiller seg fra kodesekuensen for opprinnelig AAT uist i tabell 1 nedenunder. Det rekombinante DNA-molekyl i følge oppfinnelsen er således
en slik mutantkodesekuens, enten isolert eller i et større DNA-molekyl så som f.eks. en klonings eller ekspresjonsvektor'. Det rekombinante DNA-molekyl i følge oppfinnelsen fremstilles ued standard syntese eller genesløydteknikker, eller ued en kombinasjon au begge som forklart nedenunder.
Kodesekuensen som omfattes au rekombinant DNA-molekylet
i denne oppfinnelse har en eller flere substitusjoner au basepar som ikke påuirker aminosyresekuensen, og/eller substitusjon, addisjon eller delesjon au ett eller flere kodoner innenfor de første 15 kodoner. \/ariant-AAT kodesekuensen i eksempler på rekombinante DNA-molekyler i oppfinnelsen,
huis konstruksjon og bruk er eksemplifisert, er illustrert i tabell 1, som følger, samt de første tyue kodoner au opprinnelig AAT til sammenligning. Variant basepar er understreket.
Mengdene au AAT eller uariant-AAT uttrykt i E.coli
ued rekombinante DNA-molekyler i oppfinnelsen uttrykkt som prosent au totalt celleprotein er uist i tabell 2 som følger. Allte de oppførte plasmidekspresjonsuektorer, untatt slike som inneholder betegnelsen "cro", anuender venstre promotor (PL)
av lambda og ell ribosoms bindingspunktet. Cro-vektorene anvender PL og cro robosom bindingspunktet. Plasmidkonstruk-sjonene er beskrevet i eksemplene nedenunder. De rapporterte representative ekspresjonsdata ble oppnådd ved induksjon med naladiksinsyre , eller i tilfelle data i parentes, ved varmeinduksjon. Se Mott et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 82:88
(1985). Tabell 2 viser også betegnelsene som er gitt produktet av hver vektor.
Når v/armeinduksjon anvendes (se f.eks. M.Rosenberg et al., Meth. Emzymol. 101:123-233 (1983), er AAT produksjonen omtrent en tredjedel av det som oppnås med naladiksinsyre induksjon. Ved for eksempel å bruke pQTS al -Bel, var variant AAT ekspresjonen 5-10/5 av totalt cellulært protein; ved å bruke p -AGcro var den 2-A %, og ved å bruke pHJ _7<y>ar den 3-55L
41 <*1
De rekombinante DNA-molekyler som er vist ovenfor
er bare illustrerende. Alternative eller ytterligere substitusjoner av basepar og deles joner av kodoner kan foretas ved velkjente teknikker på området moleylargenetikk. Virkningen av slike mutasjoner på ekspresjonsnivåer i bakterier kan lett bestemmes med velkjente teknikker så som vad ELISA so rn f..eks. beskrevet av Bollen et al., DNA 2_:255 ( 1983) Aktivitet av resulterende proteiner kan lett måles ved velkjente under-søkelser, så som for elastase og trypsin inhibering som beskrevet av Courtney et al., AP-A-114,777; Kauiasaki et al., EP-A-103.409; og Travis, U.S. patent 4.493.891. Andre illustrerende DNA-molekyler i oppfinnelsen er slike molekyler hvor mutantkodesekvensen adskiller seg fra opprinnelige AAT ved substitusjon av en eller flere basepar hvilket bevirker en forandring i aminosyresekvensen til AAT.
Innenfor oppfinnelsen ligger også rekombinante DNA-molekyler hvor AAT-kodesekvensen omfatter mutasjoner i tillegg til mutasjoner i %'-enden av AAT-kodesekvensen. For eksempel kan kodesekvensen være sammensmeltet ved 5'-og/eller 3<1->enden til en kodesekvens for en eller flere ytterligere aminosyre eller polypeptider, så som en N-terminal Met fusjon som i pHJ0^5. 1-2 og -4, eller slike fujsoner som er beskrevet av Courtney et al., EP-A-114-777 eller Bollen et al., DNA 2:255
(1983). Fusjon av en N-terminal del av influensa virus' NS1 kode-sekvensen til autentisk AAT øker ekspresjonen av AAT-hybridet. Kodesekvensen kan også omfatte substitusjoner av basepar eller delesjoner av kodoner i områdene til andre kodesekvenser enn 5'-enden. Utelukket fra oppfinnelsen er selvfølgelig mutasjoner som fører til senkning av ekspresjonsnivåer fremfor slike som oppnås med den opprinnelige kodesekvens, f.eks. ekspresjon i E.coli ved mindre enn ca. 0,3% av totalt cellulært protein, eller tap au biologisk aktivitet hos det resulterende protein så som rammeskift mutasjoner, nonsense mutasjoner eller aktive punkt mutasjoner som påvirker aktiviteten. Eksempler på aktive punkt mutasjoner som er akseptable er et område av metionin aminosyrer ved en posisjon 358 til en valinrest, så som beskrevet av Courtney et al., Nature 313:149 (1985) og av 5. Rosenberg et al., Nature 312:1 (1984).
Variant-AAT i denne oppfinnelse kan også være bundet eller kompleksert med andre molekyler så som f.eks. beskrevet av [litra, U.S. patent 4.496.689.
Som forut angitt kan mutasjoner til 5'-enden av AAT kodesekvensen samt til andre området foretas ved velkjente teknikker. For oversikt av bestemte slike anvendelige teknikker se Botstein et al., Science 229:1193 (1985). Disse er f.eks. delesjon av kodoner ved behandling av kodeskvensen med en restriksjons endonuklease evt. etterfulgt av behandling med en eksonuklease, f.eks. Bal31 eller mung-bønne-nuklease. Etter slik delesjon kan syntetiske sekvenser insettes for å erstatte hele eller en del av det deleterte området. Alternativt kan mutasjoner f .eks. induseres ved behandling av transformanter som har en AAT kodesekvens ved kjemiske mutagener eller be-stråling. Mutanter som er forandret i 5'-området kan selekteres ved ekspresjonen av AAT og nukleotid sekvens bestemmelse•av de første tyve kodoner. Slike mutagenese eksperimenter er lette å utføre ved fusjon av N-terminale AAT kodende sekvenser, f.eks. det 45 basepars BamHi-BclI fragment oppstrøms for genet for en selekterbar fenotype, f.eks. galaktokinase og beta-galaktosidase, og undersøkelse etter up-mutas joner, d.v.s. mutanter som viser økede ekspresjonsnivåer av genet for den selekterbare fenotype.
Således et annet aspekt av denne oppfinnelse er en fremgangsmåte for å identifisere mutanter av en kodesekvens for ethvert interessant polypeptid, hvilke mutanter er transkribert og translatert ved høyere nivåer enn for den opprinnelige kode-sekvens. Denne fremgangsmåte kan utføres ved å ligere hele eller en del av den opprinnelige kodesekvens for det interesante produkt til 5' eller 3' enden av en kodesekvens for en lett selekterbar funksjon. Fortrinnsvis vil delen av den opprinnelige kodesekuens være en del au 5' enden, f.eks. 45 basepar, som er sammensmeltet med 5' enden au kodesekuensen for den selekterbare funksjon.
Den selekterbare funksjon er enhuer funksjon som medfører en selekterbar fenotype og er fortrinnsvis en huis ekspresjon kan kuantifiseres relatiut. For eksempel kan den selekterbare funksjon uære galaktokinaseaktiuitet, for huilken relatiu ekspresjon kan kuantifiseres ued fargeforandring på en indikator plate, f.eks. MacConkey galaktose (Difco). Galaktokinase-translasjonsfuns joner beskrives f.eks. au Heusterspreute et al., DNA 3:377-386 (1984). Andre eksempler er beta-galaktosidase-aktiuitet som relatiut lett kan kuantifiseres ued fargeforandring på en indikator plate omfattende næringsagar inneholdende X-Gal eller DNPG (se f.eks. J.H. Miller, Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972.
Slike translasjonsfus joner mugateniseres deretter som f .eks. ued passasje gjennom en mutator fremkaller eller ued behandling in uitro med et mutagen så som hydroksylamin som beskrevet au flunson et al., J. Microbiol. 177 :663-683 (1984). Se. også J.H. Miller, Experiments in Moelular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Neui York, 1972. Mutant-transformanter eller verter transformert med muterte plasmider klones og undersøkes etter øket. ekspresjon av den selekterbare funkjson. Plasmider fra kloner som viser en slik øket ekspresjon, isoleres og analyseres ved DNA-sekvens bestemmelse av den del som koder for det interessante polypeptid. Noen av disse plasmider muteres i kodesekvensen for det interessante produkt. Mutasjoner i denne delen innsettes så i hele kodesekvensen for det interessante produkt ved standard syntese/rekombinante DNA teknikker. Slike mutantkodesekvenser innsettes i en ekspresjonsvektor og innføres i en vertcelle. Transformantene klones og måles for ekspresjon av det interessante polypeptid. I noen tilfeller vil det finnes at ikke-beslektede mutasjoner i forskjellige plasmider bevirker øket ekspresjon. Slike mutasjoner kan kombineres i en eneste variant kodesekvens som i tilfelle pHJ ,-7. Se eksempel 9 nedenunder,
etl
Ekspresjonsvektoren hvori mutant-AAT-kodesekvensen innsettes for å fremstille vektoren i følge oppfinnelsen, kan være enhver blandt mange bakterie-ekspresjonsvektorer som er kjente og tilgjengelige på området. Regulerbare ekspresjonsvektorer foretrekkes. Med "regulerbar" menes at transkripsjon av den innsatte kodesekvens ikke er konstitutiv men kan induseres så som ved at dyrkningsmediet tilsettes et induseringsmiddel eller ved varme. Eksempler på E.coli ekspresjonsvektorer er blandt andre pCQV2, beskrevet av Bollen et al., FEB5 Lett. 166-67
(1984), og pASl beskrevet av M. Rosenberg et al,, Meth. Enzym. 101:123-138 (1983). pASl bærer pBR322 opprinnelsen for replika-sjon, an ampicillin-resistens-markør og en rekke fragmenter fra lambda som omfatter regulerings området, nemlig den venstre promotor av lambda (PL), N anti-avslutnings funksjons gjen-kjennelses punkter (NutL og NutR), det rho-avhengiige trans-skripsjonsavslutnings-signal (tRl) og ell ribosom bindingspunktet inneholdende ell translasjons begynnelsespunktet, hvis G rest umiddelbart etterfølges av BamHI spaltningspunktet som følger:
5' ..... C ATATG* GATCC 3'
hvor symbolet, * , representerer spaltningspunktet for BamHI.
pASl kan utledes fra pKC3DcII ved delesjon av nukleo-tider fra BamHI punktet ved cII-pBR322 skjøten av pKC3DcII til ell ATG og relegering av molekylet for å gjenskape BamHI
punktet umiddelbart nedstrøms for ATG'et. pKC3GcII konstrueres ved å sette inn et 1,3 kb Haelll fragment fra lambda som bærer ell genene i Hpal punktet av pKC3D. Se Shatzman et al., i "Experimental Manipulation of Gene Expressions, " Edit, av M. Inouye, Academic Pres, Neiu York (1983) og M. Rosenberg et al., sitert ovenfor. pKC30 er beskrevet av Shimtake et al., Nature 292:128 (1981). Det er et pBR322 derivat med et 2,4 kb Hindlll-BamHI fragment av lambda insatt mellom Hindlll og BamHI punktene
i tetR genet av pBR322. Lingnende konstruksjoner til pASl er beskrevet av Courney et al., Nature 313:149 (1985) og Kotewics et al., Gene 3_5:249 (1985). Kodesekvensen er operativ innsatt deri, d.v.s. korrekt orientering og riktig leseramme til reguler-ingselementet ved standard teknikker.
Andre klone- og ekspresjonssystemer er kjente og tilgjengelige for ekspresjon av/ den AAT-mutant kodende sekv/ens i oppfinnelsen i andre bakterier, f .eks. Bacillus, Streptomyces, Corynebacterium og andre.
En kodesekuens for ferdig, opprinnelig AAT, hvorau alle naturlige forekommende polymorfe kan brukes som et utgangs-materiale for utførelsen au denne oppfinnelse, kan erholdes ued standard teknikker ued revers transkripsjon au utplukkede bud-bringer RNA populasjoner fra leverceller så som f.eks. beskrevet au Bollen et al., Belgisk patent nr. 895.961; Bollen et al.,
DNA 3:255 (1983); Courtney et al., EP-A-114.777; Kawasaki et al., "The Molecular Biology of Yeast," August 16-21. 1983, Cold Spring Harbor Laboratory; Long et al., Structure and Organi-zation of Genes I, Abstract No. 25 (1983); Woo et al., "From Gene to Protein: Translation into Biotechnology," edit au
Ahmed et al., Academic Press, New York (1982); Kurachi et al; Proe. Nat' 1. Acad. Sei. U. S. A. 73 : 6826 (l98l); Parker et al., Australsk patentsøknad 31801/84; og Costanzo et al., E M B 0 J.
2:57 (1983).
Variant-AAT produseres i følge fremgangsmåten i følge oppfinnelsen ved å dyrke mikroorganismer eller celler som er blitt transformert med ekspresjonsvektoren i følge oppfinnelsen under passende betingelser. Med "passende betingelser" menes dyrkings-betingelser, f.eks. analyter, metaboliter, andre medium bestand-deler og temperatur, hvorunder ekspresjon av AAT induseres. Typisk dyrkes transformerte E.coli i et næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon og nitrogen med luft-innblåsing og under seleksjonstrykk, inntill logfasevekst (Aecnca. 0,4-0,6) før induksjonen og deretter i ytterligere
b 5 U
1,5 til 5 timer etter induksjonen, inntill en isolerbar mengde av polypeptidet uttrykkes..
Uariant-AAT i oppfinnelsen uttrykt i E.coli eller en annen organisme isoleres fra produksjonskulturen ved standard-iserte proteinisoleringsteknikker. Typisk omfatter rense-skjema l) bryting av celler, 2) klaring av celle-ekstraktet,
3) separasjon av variant-AAT molekylene og 4) sluttrensing for å fjerne resterende kontaminanter inbefattet de resterende polypeptider, karbohydrater, nukleinsyrer og/eller lipopoly-saccarider.
Det første txJ/nn kan utføres så som v/ed tilsetning av/lysozym eller andre lyse- eller gjennomtrengnings-middel eller v/ed mekanisk eller ultraly d-bry ting. Andre midler for eksterna-lisering av/ protein er bruk av/ temperatur-ømfintelige lytiske bakterier så som beskrev/et av/ Auerbach og Rosenberg, europeisk patent søknad nr. 0140864. Hv/is polypeptidet felles i celle-ekstraktet, kan det resolubiliseres v/ed tilsetning av/denatuerings-middel. Slike teknikker er velkjente. Flere av/disse er gjen-gitt av Builder et al., AP-A-114.506 publisert 1. august 1984. AAT-variant-molekylene som her er spesifikt eksemplifisert er løselige i standard E.coli ekstrakter med unntagelse av AATD15.
Variant-AAT molekylet i løsning skilles så ved standard teknikker. Disse er f .eks. selektiv utfelling av variant-AAT
så som ved tilsetning av ammoniumsulfat (60 - B0% av metning) etterfulgt av gjenoppløsning. Den variant-AAT-ho1dige løsning kan så føres gjennom en rekke på ett eller flere kromatografiske trinn, så som ved å bruke DEAE-cellulose, konkanavalin A sefarose, fenylsefarose, disulfid bindende ligander, revers fase HPLC, og affinitets kolonner ved bruk av anti-AAT antistoff, hvis fremstilling er beskrevet av Lathe et al., Nature 234:473-474 (1980). Det rensende variant-AAT kan frysetørkes før gjenoppløsning i
et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel for administrering.
\iariant-AAT molekylet har tendens til å være ustabilt under ca. pH 5,5. Proteinene er stabile i 1-2 dager ved romtemperatur og betydelig lenger ved 4°C. For lagring av renset AAT anvendes typisk natriumfosfat buffer (pH8).
Den foretrukne renseprosess er en substitusjons-kromatografi prosess som består i å kontakte en uren løsning av et variant-AAT-protein i følge oppfinnelsen med Kappa (K)-kjeder forut koblet til en uløselig bærer-matrisse. Se Laurell et al., Eur. J. Biochem. 57:107-113 (1975); Laurell, J. Chromat. 1_59:25-31 (1978); Laurell, J. Chromat. 278:53-61 (1983).
K-kjedene kan stamme fra urinen til en pasient med myelomatofati
og kan være bundet til en passende bærermatrisse ved kjente teknikker. Bærermatrisser er f.eks. agarose, "Affi-gel",
dekstran, cellulose, polysteren, polyakrylamid, siliciumoksyd, nylon, akryliske copolymerer og polyestere.
Variant-AAT'et i oppfinnelsen er anvendelig som en protease inhibitor og kan brukes for behandling av emfysema forårsaket av utilstrekkelig AAT-aktivitet. En slik util-strekkelighet kan forårsakes ved oksydasjon av AAT så som ved tobakksrøyk eller ved genetisk svikt av AAT produksjon. Gadek
■et al., Am. Rev. Respir. Dis. 127:545 (1983) demonstrerte f.eks. anvendeligheten av AAT i peranteral erstatningsterapi av pasienter med homozygotisk AAT svikt. Andre anvendelser for variant-AAT er antistoff produksjon, bruk som et bindemiddel
i kromatografisk rensing av forskjellige proteiner og protease inhibering i protein-innholdige blandinger og løsninger. Enda andre anvendelser er behnandling av pankreatitis og forbrenninger (se Schultze et al., U.S. patent 3.293.235) ag for fremstilling av antibiotika for bruk i diagnose av serum AAT-manglende personer. Slike anvendelser kan utføres ved velkjente teknikker for en fagmann.
Variant-AAT i oppfinnelsen har AAT-aktivitet og er immunologisk nær beslektet med AAT. Det kan derfor brukes på samme måte som AAT. Spesifikt kan variant-AAT formuleres så som ved oppløsning i en farmasøytisk akseptabel bærer, ved standard teknikker for innvendig administrering, typisk intravenøs administrering. Farmasøytiske akseptable bærere velkjente. Slike bærere som er egnet for intravenøse adminstrering er f.eks. løsninger av natriumklorid, acetater, glukose, mannitol og albumin. Variant AAT kan også komplekseres med fysiologisk akseptable eksipienter som beskrevet av Mitra, U.S. patent 4.496.689. Doseringen og adminstreringssekvensen vil variere med type og grad av sykdommen, og med.aktiviteten til det spesielle varantmolekyl som anvendes. I en pasient som lider av homzygotisk AAT mangel, velges dosen og adminstrerings-fre-kvensen slik at serum AAT aktiviteten holdes på nivåer som ca. minst 35% av det normale. DEtte krever typisk i.v. infusjon av 1 - 15 g, fortrinnsvis 2-10 g av variant-AAT med aktivitet sammenlignbar med AAT ukentlig. Variantmolekyler som p.g.a. mutasjoner i andre områder i proteinet, så som in det aktive punkt, v/iser mer stabil aktivitet, kan gis i lavere doser og/ eller med lavere frekvens.
De følgende eksempler er illustrerende og ikke begrensende for oppfinnelsen. Alle restriksjons-endonukleaser fikk man fra kommersielle kilder, og de ble brukt i det vesentlige i følge leverandørens instruksjoner.
EKSEMPLER
Eksempel 1. pOTS ^ Bel
Menneske-AAT-genet ble isolert fra cDNA klonet pULB1523 (erholdt fra A. Bollen, belgisk patent 895.961). Genet erholdtes på et Pstl fragment som omfatter hele cDNA-klonet.
Pstl fragmentet ble innsatt i et eneste Pstl punkt i
pUC9 (en pBR322 vektor erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Meryland inneholdende et fragment fra M13 med multiple enkeltpunkter). Denne nye vektor ble spaltet med endonukleasen Sali, hvilket førte til et enkelt kutt plasert 10 bp nedstrøms for Pstl punktet ved 3'-enden av cDNA-fragmentet. Den lineæriserte vektor ble behandlet med eksonuklease Bal 31
for å fjerne GC halen etter 3'-enden av AAT-genet. Betingelsene var som følger: 0,4 mM CaCl2, 0,4 mM MgCl2>40 mM NaCl, 24 nM Tris pH8, 0,2 mM EDTA og 40 mg av DNA i en total mengde av 200 ml. Reaksjonen ble inkubert ved 30°C i 2 min. og 20 enheter eksonuklease Bal31 (erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersbrug, Maryland) ble tilsatt. 25 ml's alikvoter ble fjernet fra blandingen hvert 15 sek., og reaksjonen ble stoppet ved å tilsette EDTA til en sluttkonsentrasjon på 50 mM. Analyse av DNAet fra et 1 min. tidspunktet viste at GC-halen ble fjernet fra 3'-enden av AAT-genet, og at genet hadde beholdt 40 basepar nedstrøms for stopp-kodonet for AAT. DNA ble fyllt inn ved bruk av Klenow DNA polymerase (Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) hvilket ga et molekyl med rettavskåret ende og an Xhol binder erholdt fra Collaborative Research Laboratories, Lenxington, Massachusetts, ble innsatt (Maniatis et al.) so rn førte til konstruksjon av pUC <V .1., - 2 .
AAT-genet ble isolert fra pUC^^-2 ued spaltning med
Xhol og Bell Belt kapp 45 bp nedstrøms for begynnelseskodonet
ved 5'-enden av AAT-genet. Genet ble innsatt i ekspresjonsvektoren pOTSU som var blitt spaltet med BamHI og Xhol ved bruk av standard ligeringsmetoder (Maniatis et al.). Den resulterende konstruksjon pOTS Bel er en ekspresjonsvektor i følge oppfinnelsen. Den inneholder et variant-AAT-gen som
koder for hele AAT minus de første 15 aminosyrer av/ den ferdige 5'-enden av/ genet.
pOTSV (Dev/are et al., Cell 36:43-49 (1984)) ble utledet
fra pASl v/ed å innsette et 189 bp fragment med en transkripsjons-terminator, DOP-terminatoren i l\lru I - punk tet nedstrøms for BamHI-punktet i pASl og v/ed å sette inn en syntetisk binder (Xbal,
Xhol, Sacl) i Sall-punktet mellom BamHI-punktet og den til-
satte terminator.
En lysogen htpR165 stamme av/ E.coli (Cooper et al.,
Mol. Gen. Genet. 139:167 (1975); Baker et al., Proe. Nati. Acad. 5ci. U. 5. A. 81 : 6779 (1984) og en v/ill-type cl<+>defekt K12 lysogen ble transformert med pOTS<j-^c-'- ued standard metoder (Maniatis et al.). Transformanter ble dyrket til log-fase før v/arme-induksjonen (M.Rosenberg et al., Meth. Enzym. 101123 (1983))
eller naladiksinsyre induksjon (Mott et al., P roe, Nati. Acad.
Sei. U. 5. A.82:88(1985)).
Etter induksjonsperioden ble celler samlet ued sentrifugering og lyset ued tilsetning til en lysozymløsning (l g celler/10 ml løsning) 50 mM tris, pH 8, 0,1 mM etylendiamin-tetraacetat (EDTA), 0,1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1 % deoksycholat (DOC) og 0,5 g/ml lysozym). Suspensjonen ble skjærebehandlet ued ultralyd og deretter rørt i minst 4 timer. Suspensjonen ble så skilt ued langsom (10.000 opm) sentrifugering i 20 minutter. Klumpen ble gjenoppslemmet i tris-bufferen som forut uar blitt tilsatt urea til en sluttkonsentrasjon på 4M. Denne suspensjonen ble ultralydbehandlet og rørt naten ouer ued romtemperatur. Suspensjonen ble så separert ued langsom sentrifugering i 20 min. Supernatanten ble samlet og dialysert mot buffer (50 mM tris,
pH 8, 25 mM NaCl, 1 mM DTT). Løsningen ble så satt på en dietylaminoetyl (DEAE)-trisakryl-kolonne og eluert med 25-500 mM NaCl gradient. Toppfraks joner ble dialysert mot buffer (50 mM tris, pH8, 25 mM NaCl) og målt med hensyn til proteinkonsentrasjon og anti-1ryps in - og anti-elastase-aktiuitet. Fraksjoner oppsamlet ued 150 - 250 mM NaCl inneholdt AATD15 på ca. 90% renhet.
I trypsin og elastase målingene uiste AATD15 10 - 15%
au aktiuiteten til AAT som stammet fra menneske serum (Sigma
Chemicals, St. Louis, Missouri) og AAT (Met-Asp-Pro) som
stammet fra gjær. Denne aktivitets-reduksjonen antas å stamme fra bruk au urea, og i et annet tilfelle, tiocyanat under alkal-iske betingelser. Trypsin målingen ble utført ued fremgangsmåten til Trauis, Meth. Enzym. 80:755-765 (1981). En reaksjons-blanding au 100 ml trypsin (15 mg), 200 ml tris (10 mM, pH 8)
og 200 ml AATD15 (30 mg) i 10 mM natriumfosfat (pH 7,6) ble inkubert 15 minutter ued romtemperatur. Deretter ble 2, ml substrat (p-tosyl-L-arginin metyl ester (1,3 mg/ml) i buffer (10 mM tris, pH 8) tilsatt. Absorbansen ued 253 nm ble plottet huert minutt i et 5 minutters tidstrom.
Elastase-målingen ble også foretatt ued fremgangsmåten til Trauis. En stam-substratløsning (20 mM) ble fremstilt ued å sette 45 mg N-succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) til 5 ml dimetylsulfoksid (DMS0). En enzymløsning ble fremstilt ued tilsetning au 0,3 mg elastase fra su inebukspy11kjerte1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). "50 ml au enzymløsningen i en kyuette ble tilsatt 0,2 ml buffer (200 mM tris-HCl, pH 8). En ekuimolar mengde au AATD15 ble satt til løsningen, og løsningen ble inkubert ued romtemperatur i 1 minutt. Ionefritt uann ble tilsatt til et sluttmolum på 2.950 ml. Så ble 50 ml substratløsning tilsatt og løsningen ble blandet. Absorbans ued 410 nm ble observert i et 5 minutters tidsrom.
Eksempel 2. pHJ^-2
pMG27N (Gross et al,, Mol. Cell. Biol. 5:1015 (1985)) ble utledet fra pOTSV ued deletering au et ExoRI-BasI fragment på ca. 900 bp oppstrøms for PL promoteren, huilket førte til delesjon au 3 au de 4 Ndel punkter i vektoren. Et BamHI-XhoI (ende-fyllt) fragment au AAT-kodesekuensen fra pULB1523 (BamHI kapper kodesekuensen mellom de første og andre kodoner) ble innsatt mellom BamHI og Sali punktene i pMG27l\l. Fremgangsmåtene ble i det uesentlige utført som beskrevet av Maniatis et al., sitert ovenfor. Denne vektoren, pHJ g^-! uttrykte fullstendig,
opprinnelige AAT ( med en Met i stedet for Glu som den første aminosyre) som mindre enn ca. 0,1 - 0,3% av/ totalt cellulært protein. BamHI-punktet nedstrøms for ell ATG bibeholdes.
pHJ^^-1 b]_e spaltet med Ndel og Bcll'for å deletere kodonene to til og med seksten. Dette fragment ble erstattet med en syntetisk oligonukleotid-binder som illustrert i tabell 1
for å fremstille pHJ -2. Fragmentene ble innsatt ued å bruke et plasmid-til-oligonukleotid-forhold på 1:50 og standard ligeringsmetode. AAT-uariant-proteinet, HJ2, ble uttrykt i en mengde ca. to ganger større enn AAT fra pHJ ^^"l» etter uarme eller naladiksinsyreinduksjoner, som ble anslått ued undersøkelse au polyakrylamid geler farget med Coomassie Brilliant Blue.
Eksempel 3 pOTS ^ - 3
Hele AAT genet ble isolert fra pUC#^"2 ued spaltning med BamHI og Xhol. Fragmentet ble ligert til en BamHI og Xhol avskåret pOTSV vektor, huilket førte til pOTS . pOTS ble deponert i American Type Culture Collection, Rockuille, Maryland, U.S.A. under tilgjengelighetsnummer 53282. Denne nye vektoren ble så spaltet med BamHI og Bell som skjærer DNA fragmentet fra den N-terminale enden av AAT som inneholder de første 15 aminosyrer i det ferdige proteinet. DEtte fragment ble erstattet med syntetisk DNA (d.v.s. to overlappende oligonukleotid-bindere) som koder for disse 15 aminosyrer som illustrert i tabell 1, ovenfor. Denne vektoren pOTS^-3 uttrykker AATet i lignende mengder som det variant-AATet som fremstilles av pHJ^-2.
Eksempel 4 pSyn7
Et BamHI - Pstl (endefyllt) f ragment fra det opprinnelige AAT cDNA-klon, pULB1523 ble innsatt i pASl spaltet med BamHI og Sali (endefyllt). Det innsatte AAT-fragment inneholder GC-halen ved sin 3' ende. Et BamHi - Fnu4HI fragment ved 5<1->enden av AAT genet ble erstattet med en syntetisk oligonukleotidbinder hvori 3dje posisjonskodon forandringer ble innført i 3 kodoner. Denne konstruksjonen koder for et AAT med full lengde, hvor
den N-terminale aminosyre-sekvens er met-asp-pro-, som illustrert i tabell 1 ovenfor. Når DNA-sekvensen ble analysert,
ble det funnet at det 7. kodon var deletert under konstruksjonen. Således deleterer denne AAT-konstruksjon aminosyre 7 i tillegg
til 3. posisjons-kodon forandringer.
Syn 7 proteinet ble renset ved ammoniumsulfat-felling. Transformanter ble spesielt samlet ved sentrifugering og lyset
i 30 minutter ved 0°C i en-tiendels volum TES buffer. (50 mM tris, pH 8, 5mM EDTA og 25% sucrose) tilført 0,5 mg/ml lysozym og 10 mg/ml DNAse. Triton X100 ble så tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1%. Suspensjonen ble inkubert ved 0°C i 15 minutter og deretter bragt til 80 mM Mg<++>ved tilsetning av IM MgCl2. Denne suspensjonen ble inkubert i 5 min. ved 25°C. En supernatant ble samlet etter sentrifugering ved 15.000 opm i 10 min. Ammonium-sulf at ble satt til supernatanten og løsningen ble sentrifugert i 10 min. ved 10,000 opm. Syn 7 proteinet ble påvist i 50 - 75 % ammoniumsulfat fraksjonen. Denne felling ble gjenoppløst i buffer (50 mM tris, pH 8, 25 mM NaCl) og dialysert mot den samme buffer. Løsningen ble satt på en DEAE-trisakryl-kolonnen og eluert med en 25 - 500 mM NaCl gradient i buffer (50 mM tris,
pH 8). Fraksjoner ble dialysert mot buffer (10 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl) og proteinkonsentrasjon og anti-trypsin-
og anti-elastase-aktiviteter ble målt hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1 ovenfor. Syn 7 proteinet ble funnet i 150 - 250
mM NaCl fraksjonene i mindre enn 25% renhet. Det hadde samme grad av anti-elastase- og anti-trypsin-aktiviteter som AAT
fra serum og gjær. Syn 7 kontruksjonen ga ca. 7 ganger mer protein enn pHJ^-1.
I et separat eksperiment ble Syn 7 rensent til mer enn 95%, hovedsakelig ved fremgangsmåten til Laurell et al., J. Chromatoq. 278:53-61 (1981). Se også Laurell et al., Eur. J. Biochem. 57: 107-113 (1975) og Laurell, J. Chromatoq. 159: 25-31
(1978), Monomere Kappa-kjeder isolert fra urinen til en pasient med myelomatopati hovedsakelig etter fremgangsmåten til Berggard et al., J. Biol. Chem. 244 4299-4307 (1969) ble koblet til bromcyan sefarose 4B (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) hovedsakelig etter fremgangsmåten til Laurell et al., Eur. J. Biochem. _57:107-113 (1975). En bufret løsning av Syn 7 (50 mM trometamin) delvis renset fra cellelysater med ammoniumsulfat-felling, ble redusert ued tilsetning au beta-mercaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Løsningen ble så satt på en biogel P30 moelkylsikt. Løsningen ble deretter ført gjennom K-kjede/sefarose-kolonnen og eluert med den samme, buffer modifisert ued tilsetting au 1 mg/ml ditiobisnitrobenzosyre, og 0,25 mg/ml ditiotreitol. Eluatet ble redusert ued tilsetting au beta-mercaptoetanol til en sluttkonsentrasjon på 20 mM og dialysert eller satt på en Biogel P150 molekylsikt i natriumfosfatbuffer.
(10 mM, pH 7,5, 0,15 M NaCl).
Eksempel 5. pSyn7R.
pSyn7R ble konstruert som beskrevet i eksempel 4, ovenfor. Det ble bekreftet ued sekuensanalyse at denne konstruksjonen koder for et AAT med full lengde, hvor den N - terminale aminosyresekuens er met-asp-pro-, som illustrert i tabell I, Ekspresjonen au AAT fra pSyn7R var omtrent den samme som for Syn7.
Eksempel 5. pHJ ^ ^ - 5 og pOTS^-5
pHJ al,-1 ble spaltet med Ndel og Bell som deleterte
et fragment bestående au de første 15 aminosyrer au den N-terminale enden av AAT. DEtte fragment ble erstattet med en syntetisk DNA-frekvens som koder for de siste 5 av disse aminosyrer. Sluttkonsentrasjonen kodet for hele AAT minus de første 10 aminosyrer av den ferdige 5<1->enden av genet. Proteinet som her kalles AATD10, ble vesentlig renset som beskrevet i eksempel 4 ovenfor. Det ble vist å være 100% aktivt i trypsin-og elastase-målingene som er beskrevet i eksempel 1, og ble uttrykt i en mengde på ca. 200- til 250-ganger større enn AAT fra pHJ g -1. Et Bglll-Xhol fragment fra denne vektoren ble klonet i pOTS mellom Bglll-Xhol for å konstruere pOTS -5.
Eksempel 7. pHJ^-6
<pHJ>(j-^-B som uttrykker AATD5 ble konstruert og proteinet ble renset fra dette, hovedsakelig som beskrevet i eksempel 6, ovenfor. Mengden av AATD5 var ca. 150-' til 200 ganger mengden som uttrykkes av pHJ^-1. AATD5 ble prøvet i trypsin-målingen
hovedsakelig som beskrevet i eksempel 4 ovenfor og funnet å
være 100 % aktivt. At Bglll-Xhol framgent ble innsatt i pOTS som i eksempel 6 for å konstruere pOTS^.,-6.
Eksempel B. pHJ -4
pHJ a ^-4 vist i tabell 1, ble konstruert hovedsakelig
som beskrevet i eksempel 2, ovenfor og vist å produsere HJ2
som 0,5 - 1% at det totale celle-protein.
Eksempel 9 p ^ - A
pASK er et plasmid som omfatter PL promoteren og et
gen for Evcoli galaktokinase (galK) inneholdende ell ribosom-bindings-punktet. Det ble konstruert ved å plassere ell ribosom-bindingsområdet til pASl inntil et galK-kode-sekvens, hvori en BamHI-binder var blitt innsatt mellom ATG og det andre kodon i galK-kodesekvensen. Transformasjon av E.coli C600 (cl857) førte til transformanter, som når de ble plettert på en indikator plate omfattende MacConkey galaktose, fikk agaren til å bli rød rundt transformantene.
Det 45 basepar BamHI-BclI fragment fra den opprinnelige AAT kodesekvens ble satt inn i BamHI-punktet hvilket førte til
en translasjonsfusjon av AAT's N-endene og galK kodesekvensen. Dette plasmid pAAT galK, fikk ikke indikatorplatene til å bli
rød etter transformering i E.coli C600 (cl857). Western blot analyse bekreftet at slike transformanter produserte hybrid proteinet i mengder lik omtrent 0,3 til 0,5 prosent av mengdene galK uttrykt av celle-transforrnert med pASK.
For å frembringe mutanter ble pAATgalK behandlet med hydroksylamin in vitro, og i et separat eksperiment, ført gjennom en mutator-celle-linje, nemlig: mut T eller mut D
(se Miller, ed.; Experiments in Molecular Genetics.) E.coli C500 (cl857) ble transformert med plasmidet som hadde blitt utsatt for mutagene betingelser og plettert på indikatorplater. Flere røde kolonier ble isolert og analysert ved Western blot analyse etter mengdene av AAT-balK-hybrid-proteinet. En "opp-mutant" produserte ca. 10 til 20 ganger større mengder av hybridet enn de opprinnelige pAATgalK transformanter. Når dette genet
ble sekvensbehandlet, ble det funnet at et enkelt mutasjons-punkt hadde opptrådd i det andre kodon og forandret dette kodon fra GAT (aspartinsyre) til AAT (asparagin).
Plasmid p W,-A ble så konstruert v/ed insetninq av/
<tl ^ syntetisk oligonukleotider (se tabell 1, ov/enfor) i pHJ ax -1 og deretter i pOTS ^, som beskrevet i eksempel 6. E.coli C6QD (cl857 ) transformert med p --,-A produserte ca. 10 ganger mer av variant-AAT enn mengden av AAT fra pHJ^-1.
Eksempel 10, pHJ^-7
Et syntetisk oligonukleotid inneholdende den eneste nukleotid forandringen i p°9de tre forandringene i pSyn7R ble innsatt i pHJ Ekspresjonen av den resulterende variant-AAT HJ7 ble bestemt ved Western blot analyse til å være 5 til 10 ganger større enn Syn 7, og ca. 30 til 50 ganger større enn fra pHJ _ -1.
(Tl
Eksempel 11. pOTS -7
Et BstXI fragment av pHJ^-7 som omfatter områder opp-strøms for variant AAT-kodesekvensen gjennom en del av AAT kodesekvensen nedstrøms for 5'-mutasjonene, ble innsatt i stedet for et BstXI fragment i pOTS Punktene i begge vektorer er på like steder i forhold til AAT genet. Den resulterende konstruksjon, pOTS ble transformert i E.coli stamme AR120. Unduksjon førte til ekspresjon av HJ7 i mengder lik ca. 15% av totalt celleprotein , eller ca. 150 til 200 ganger større enn AAT uttrykt ved pHJ -1.
Eksempel 12. p A X-AG
Et syntetisk oligonukleotid inneholdende den eneste nukleotid forandring osm er tilstede i p - A°Q en C til G forandring i den 3. posisjon i det 3. kodon (prolin) (se tabell l) ble innsatt i pOTS som beskrevet i eksempel 9. E.coli (c600 cl857) transformert med pAl-AG produserte ca.
20 ganger mer av AAT-varianten HJ7 enn den mengde AAT som ble produsert fra pHJ/t,1~1*
Eksempel 13. p ^- A G cro
Ekspresjonsvektoren pRDNS ble konstruert som følger: Vektor pMG27IM (se eksempel 2) ble av/skåret med Av/al og 423 bp Aval-Xhol og 774 bp Xhol-Aval fragmentene fra pOTS ble innsatt. Den resulterende vektor, pMG27IM-S ble kappet med BamHI og
ligert med BamHI-fragmentet fra pASl & EHB01 som inneholder NSl-genet (Young et al., Proe. IMat! I. Acad. Sei. USA 60: 6105-6109 (1983 )). Denne vektoren pMG27N-SIMSl ble kappet ved sitt eneste Ndel-punkt, behandlet med mung bønne-nuklease og religert. Denne vektoren pMG27r\)-SI\]51-MB ble kappet med Sali og Ncol. Mellom disse punkter ble det innsatt et syntetisk oligonukleotid som kodet for et mutant cro-ribosom-bindingssted (rbs). Mutasjonen som er innført i dette rbs (CA i stedet for TG i stillingene -3 og -2 henholdsvis i forhold til ATG) gjorde det
mulig å innføre enestående IMdeI og Sali punkter inntil ATG'et. Shine-Dalgarno sekvensen og avstanden til ATG er identiske med sådanne i villtypens cro rbs. Villtypens AAT-sekvens ble flyttet fra pHJ (f-^-1 til pRDNS for å plassere kodesekvensen under PL kontroll og cro-r ibosom-bindingspunktet. Et BstXI fragment fra plasmidet ble så innsatt meil om BstXI avskaret pOTS ^ som i eksempel 11. Det resulterende plasmid pRDNS uttrykker AAT
i 3 ganger større mengder enn plasmid pOTStfl~l>selvom ingen forandringer ble foretatt i genekodesekvensen.
Variant-AAT kodesekvensen fra p ft^-AG ble innsatt i pRDIMS for å sette kodesekvensen under kontroll av P^og cro-ribosom-bindingspunktet. Et BstXI fragment ble klonet i pOTS som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid var pc^-AGcro. E.coli transformanter som inneholdt dette plasmid, produserer AAT-varianten i 3 ganger større mengder enn transformanter med p _ .. - AG og ca. 60 ganger mer enn mengden AAT fra pHJ ^ , -1.
w 1 * 1
Eksempel 14. p ^- Acro
AAT-varianten som koder sekvensen fra p^^-A ble
innsatt i pRDIMS for sette kodesekvensen under kontroll av PL og cro-ribosom-bindingspunktet. En BstXI fragment-bryter ble igjen utført med pOTS^^. Det resulterende plasmid er p ^^-Acro. E.coli transformanter med dette plasmid produserer HJ7 i ca. 3
ganger større mengder enn transformantene med pcrx"^<«>
Beskriv/eisene ovenfor og eksempelen er fullstendig illustrerende for oppfinnelsen og de foretrukne utførelsesformer av denne. Oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til de nøyaktige konstruksjoner som er beskrevet her, men omfatter alle modifikasjoner av disse innenfor rammen av de følgende krav.
Claims (10)
1. DNA molekyl karakterisert v/ed at det omfatter en alf a-l-antitrypsin (AAT) mutant-kodesekv/ens hv/ori mutasjonen omfatter en forandring av/ AAT-kodesekv/ensen i kodonene 1-15, under den forutsetning at mutasjonen er forskjellig fra eller i tillegg til substitusjonen av/ kodonet ATG for det første kodon i den opprinnelige kodesekuens.
2. DNA molekyl i følge krav/ 1,
karakterisert v/ed at det er oHJ al, - 2» pOTSal -3, pHJal -4, pHJal" 5, pHJ^ -6, pOTSa]<Bcl,><pSyn7,>
P Syn7R,Pal" A, pHJal -7, pOTS^ -7, pal -Acro, ^ al'^ >
<p>al -AGcro, pOT <S>al -5 eller pOTSal -6.
3. DNA molekyl i følgende krav/ 1 eller 2,
karakterisert v/ed at det er en bakteriell ekspresjonsvektor med alfa-l-antritrypsin-mutant-kodesekvensen innsatt operativt deri.
4. Variant-AAT-protein karakterisert ved at det har anti-trypsin- og anti-elastase-aktivitet omfattende 1 aminosyresekvens som er forandret i stillingene 1-15, forutsatt at mutasjonen er en annen enn eller i tillegg til substitusjonen av en metioninrest i den første stilling av naturlig AAT.
5. Variant-AAT i følge krav 4, karakterisert ved at det er AATD15, AATD1D, AATD5, HJ2, HJ7 eller SYN7.
6. Bakterie karakterisert ved at^J ^LQ , den er transformert med DNA-molekylet i følge kravene 1, 2 eller3 . jf.ftV
7. Fremgangsmåte ued fremstilling au et polypeptid med anti-trypsin- og anti-elastase-aktiuitetene til AAT, karakterisert ued at man dyrker bakterier i følge krau 6, under slike betingelser at polypeptidet uttrykkes i utuinnbar mengde og isolerer polypeptidet fra kulturen.
8. Fremgangsmåte ued fremstilling au polypeptid med antri-trypsin- og anti-elastase-aktiuiteten til AAT, karakterisert ued at man dyrker bakterien i følge krau 6 under slike betingelser at polypeptidet uttrykkes i utuinnbar mengde og isolerer polypeptidet fra kulturen*
9. Fremgangsmåte i følge krau 8, karakterisert ued at den farmastøytiske blanding for å inhibere elastase-aktiuitet i lungene til et dyr omfatter blanding au uariant-AAT-protein i følge kravene A og 5 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
10. Fremgangsmåte ued identifisering au en mutant-kodende sekuens for et polypeptid au interesse som er transkribert og translatert i en større mengde enn den naturlige kodesekuensen, karakterisert ued at man (i) ligerer hele eller en del au den naturlige kodesekuens til en kodesekuens for en selekterbar fenotype, transformerer en egnet uert med denne og kuantifiserer ekspresjonen au den resulterende translasjons-fusjon, (ii) mutageniserer hele eller delen au kodesekuensen for polypeptidet au interesse, (iii) måler øket ekspresjon au mutant-translasjonsfusjonen utouer ekspresjonen au den opprinnelige translasjonsfusjon;
(iu) bestemmer nukleotid-sekuensen til kodesekuensen for polypeptidet au interesse i fusjoner som uiser øket ekspresjon i (iii), og selekterer slike med en mutasjon i kodesekuensen for polypeptidet au interesse, (u) fremstiller en identisk kodesekuens med den naturlige kodesekuens for produktet au interesse, untatt at den inneholder en eller flere au mutasjonene identifisert i mutant-kodesekuensen og transformerer en egnet uert med denne, og (v/i) v/elger ut kloner av/ transf ormanter fra (v/) hv/ori mutant-kode-sekv/ensen er transkribert og translatert i større mengder enn den naturlige kodesekuens.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US79613385A | 1985-11-08 | 1985-11-08 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO864442D0 NO864442D0 (no) | 1986-11-07 |
NO864442L true NO864442L (no) | 1987-05-11 |
Family
ID=25167384
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO864442A NO864442L (no) | 1985-11-08 | 1986-11-07 | Mutantkodende sekvens. |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0222726A3 (no) |
JP (1) | JPS62158487A (no) |
KR (1) | KR870005090A (no) |
CN (1) | CN86108300A (no) |
AU (1) | AU6469886A (no) |
DK (1) | DK531086A (no) |
FI (1) | FI864518A (no) |
HU (1) | HUT43876A (no) |
IL (1) | IL80477A0 (no) |
NO (1) | NO864442L (no) |
NZ (1) | NZ218148A (no) |
PH (1) | PH24368A (no) |
PT (1) | PT83688B (no) |
ZA (1) | ZA868487B (no) |
ZW (1) | ZW22286A1 (no) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1299120C (en) * | 1984-10-22 | 1992-04-21 | Glenn Kawasaki | Stable dna constructs for expression of alpha-1-antitrypsin |
GB8929110D0 (en) * | 1989-12-22 | 1990-02-28 | 3I Res Expl Ltd | Polypeptides and dna encoding therefor |
GB2318732A (en) | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
CN110092828B (zh) * | 2018-01-31 | 2021-08-24 | 北京大学 | 重组突变体α1-抗胰蛋白酶及其制备和应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
CA1224432A (en) * | 1982-08-17 | 1987-07-21 | Gary N. Buell | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
CA1303530C (en) * | 1983-01-21 | 1992-06-16 | Michael Courtney | EXPRESSION VECTORS AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF A PROTEIN HAVING HUMAN .alpha. -ANTITRYPSIN ACTIVITY |
US4711848A (en) * | 1984-03-14 | 1987-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
EP0169114B1 (fr) * | 1984-06-19 | 1991-01-16 | Transgene S.A. | Dérivés de l'alpha 1-antitrypsine humaine et procédé pour leur préparation |
BE901119A (fr) * | 1984-11-23 | 1985-03-15 | Wallone Region | Procede de preparation de plasmides vecteurs capables de transformer un hote bacterien escherichia coli et d'y promouvoir et controler l'expression d'un adn heterologue. |
US4629567A (en) * | 1986-03-07 | 1986-12-16 | Smithkline-Rit | Alpha-1-antiprotease purification |
US4828988A (en) * | 1986-05-15 | 1989-05-09 | Smith Kline - Rit | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine |
-
1986
- 1986-11-03 NZ NZ218148A patent/NZ218148A/xx unknown
- 1986-11-03 AU AU64698/86A patent/AU6469886A/en not_active Abandoned
- 1986-11-03 IL IL80477A patent/IL80477A0/xx unknown
- 1986-11-05 ZW ZW222/86A patent/ZW22286A1/xx unknown
- 1986-11-05 PH PH34439A patent/PH24368A/en unknown
- 1986-11-05 PT PT83688A patent/PT83688B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-11-06 FI FI864518A patent/FI864518A/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-06 EP EP86870164A patent/EP0222726A3/en not_active Withdrawn
- 1986-11-06 DK DK531086A patent/DK531086A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-11-06 HU HU864625A patent/HUT43876A/hu unknown
- 1986-11-07 JP JP61266503A patent/JPS62158487A/ja active Pending
- 1986-11-07 ZA ZA868487A patent/ZA868487B/xx unknown
- 1986-11-07 CN CN198686108300A patent/CN86108300A/zh active Pending
- 1986-11-07 NO NO864442A patent/NO864442L/no unknown
- 1986-11-08 KR KR860009426A patent/KR870005090A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR870005090A (ko) | 1987-06-04 |
AU6469886A (en) | 1987-05-14 |
NZ218148A (en) | 1989-06-28 |
PT83688B (pt) | 1989-06-30 |
PT83688A (en) | 1986-12-01 |
NO864442D0 (no) | 1986-11-07 |
ZW22286A1 (en) | 1987-06-03 |
FI864518A0 (fi) | 1986-11-06 |
DK531086D0 (da) | 1986-11-06 |
HUT43876A (en) | 1987-12-28 |
FI864518A (fi) | 1987-05-09 |
CN86108300A (zh) | 1987-07-01 |
EP0222726A3 (en) | 1989-02-01 |
JPS62158487A (ja) | 1987-07-14 |
PH24368A (en) | 1990-06-13 |
IL80477A0 (en) | 1987-02-27 |
DK531086A (da) | 1987-05-09 |
EP0222726A2 (en) | 1987-05-20 |
ZA868487B (en) | 1987-11-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU596810B2 (en) | A bacterial methionine n-terminal peptidase | |
JP4243104B2 (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
EP0205475B1 (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and dna sequences useful for same | |
DK174977B1 (da) | Humane t-PA-proteiner, deres fremstilling, DNA, hybridvektor og transformeret eukaryot værtscelle indeholdende en DNA-sekvens, som koder for de humane t-PA-proteiner, og farmaceutisk præparat indeholdende et sådant t-PA-protein | |
US5591640A (en) | Functional DNA block and plasmid coding for hirudin, transformed yeast, method for preparing hirudin, hirudin obtained and its pharmaceutical use | |
IE881597L (en) | Expression of Human Proapolipoprotein A-I | |
US5013662A (en) | Bacterial methionine n-terminal peptidase | |
WO1991018101A1 (fr) | Procede de production d'une proteine | |
DK175483B1 (da) | Enkeltkædehybridplasminogenaktivator, DNA-sekvens, som koder derfor, hybridvektor indeholdende DNA-sekvensen, eukaryotisk værtscelle transformeret med hybridvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af enkeltkædehybridplasminogenaktivatoren,...... | |
CA2025070C (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homgeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
US4870017A (en) | Bacterial methionine N-terminal peptidase | |
EP0329693A1 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same | |
DK175020B1 (da) | Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse | |
NO864442L (no) | Mutantkodende sekvens. | |
CA1300534C (en) | Human pancreatic elastase | |
NO179046B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt human enkelt kjede urokinase-type plasminogenaktivator | |
FI106720B (fi) | Fuusioproteiinien valmistus in vitro | |
JP3005621B2 (ja) | リシントキシン | |
Kumar et al. | Genetic engineering | |
GB2143535A (en) | Improved plasmid vector and use thereof | |
JPH01501037A (ja) | 有機化合物の又はそれに関連する改良 | |
HU217094B (hu) | Eljárás proteázinhibitorok előállítására | |
KR930003913B1 (ko) | 트롬빈 억제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 제조방법 | |
US5501970A (en) | Nucleotide sequences coding for ribosome inactivating proteins |