CN107427562A - 种子中产生的血液凝块溶解蛋白 - Google Patents

种子中产生的血液凝块溶解蛋白 Download PDF

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Abstract

提供其中在植物种子中产生血液凝块溶解蛋白的转基因植物。蛋白的表达由种子特异性或选择性的启动子驱动。以这种方式产生的示例性的血液凝块溶解蛋白包括重组圆形叶口蝠(Desmodus rotundus)唾液纤溶酶原激活物α1(DSPAα1)和重组人组织纤溶酶原激活物(t‑PA)。从种子分离的重组蛋白溶解血液凝块。

Description

种子中产生的血液凝块溶解蛋白
相关申请的交叉引用
本发明要求于2015年1月21日提交的标题为“种子衍生的血液凝块溶解蛋白”的美国临时专利申请号62/106,068的优先权，所述临时专利申请的内容通过引用结合到本文中。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在国立卫生研究院-国立神经障碍和中风研究所授予的基金号R03NS095246(PI)、国立卫生研究院-INBRE研究项目研究员奖授予的基金号P20GM103447 (PI)和国立卫生研究院-INBRE初级研究员奖授予的基金号P20RR016478 (PI)下在政府支持下做出。政府在发明中具有一定的权利。
发明领域
本发明涉及转基因植物种子产生治疗性蛋白的用途。具体地，本发明涉及用于在烟草种子中使用种子特异性启动子产生圆形叶口蝠唾液纤溶酶原激活物DSPAαl和组织纤溶酶原激活物(t-PA)的转基因烟草植物系。
发明背景
当前，重组组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)是唯一的用于治疗急性缺血性中风的FDA批准的药物。其为迄今已经调查的所有脊椎动物物种中存在的丝氨酸蛋白酶(Lijnen和Collen 1987)。该酶催化纤溶酶原转化为活性纤溶酶，后者可降解许多血浆蛋白；最值得注意地是纤维蛋白凝块。t-PA是造成血液凝块分解的主要的酶(Suzuki等人, 2009)。尽管t-PA具有一些限制和副作用，例如短治疗窗(中风发生后3-4.5 h)，增加出血和脑损伤风险(Adams等人, 2007; Hacke等人, 2008; Tsirka等人, 1995)；但其仍是世界范围内用于在血液凝块由于缺氧而诱导组织死亡之前溶解主要的血液凝块的最常使用的药物。
科学家们已经从吸血蝠(圆形叶口蝠)唾液鉴定了纤溶酶原激活物(圆形叶口蝠唾液纤溶酶原激活物，DSPA) (Kratzschmar等人, 1991 , 1992)。DSPAα1和DSPAα2具有比组织纤溶酶原激活物明显更高的对纤维蛋白的特异性(Bringmann等人, 1995)，这允许这些酶局部溶解凝块而不影响整个血液凝固系统。研究已经显示DSPAα1在具有急性缺血性中风的患者中安全，甚至在中风发病多达9小时后给予时。DSPAs不显示伴随组织纤溶酶原激活物(t-PA，作为阿替普酶、瑞替普酶和替奈普酶销售)见到的神经毒性作用。DSPAs因此很有希望作为新的用于中风患者的纤溶酶原激活物(Dafer和Biller 2007; Furlan等人,2006; Grandjean等人, 2004; Lijnen和Collen 2000)。
通常的微生物宿主例如大肠杆菌可产生高产量的重组蛋白，但缺乏翻译后修饰的必要机器(Lilie等人, 1998; Ma等人, 2005)。动物细胞系统可用于产生生物学活性的人药用蛋白。然而，它们非常昂贵。在过去的十年中，植物已经作为方便和经济的替代表达系统出现(Ma等人, 2005)。植物分子农业(PMF)预期会挑战已建立的使用细菌、酵母或培养的哺乳动物细胞的生产技术(Ma等人, 2005; Peterson和Artzen 2004)。
相对于其它原核和真核表达系统，植物表达系统在速度、费用和安全性方面具有主要优势。每湿组织重量的蛋白产量可为使用基于微生物或动物细胞的系统获得的蛋白产量的许多倍。最重要地，植物系统具有潜能成为便宜得多的用于生产药用蛋白的平台(Bock和Warzecha 2010; Spok等人, 2008)。当前，大多数药用蛋白在用于生物质的水性多叶作物中合成。然而，以这种方式合成的蛋白在收获之后经受迅速的蛋白水解性降解(Dorana2006)。
具有可用的用于以商业可行的数量以节省成本的方式稳定生产重组蛋白的替代方法和系统将会很有益处。
发明概述
本公开内容描述通过将蛋白的产生靶向于植物种子而生产重组血液凝块溶解蛋白的方法。以这种方式生产蛋白避免蛋白水解和其它降解，其通常伴随在植物的非种子部分生产蛋白。另外，蛋白的产量一般超过使用其它系统例如哺乳动物和细菌系统产生的产量，并且以更低的成本。因此，使用本文公开的方法，重组蛋白以节省成本的方式大量制造。在种子中生产蛋白还有利地允许未纯化蛋白，例如，在室温储存种子期间的长期稳定性，而纯化后无可检测的蛋白活性损失。在一个示例性的方面，靶向于在植物种子中生产的重组蛋白为血液凝块溶解蛋白DSPA (例如DSPA-αl)和组织纤溶酶原激活物(tPA)。
本发明提供包含溶解血液凝块的蛋白的转基因种子。在一些方面，权利要求1的转基因种子，其中所述转基因种子来自选自烟草、水稻、玉米和大豆的植物类型。在一些方面，所述溶解血液凝块的蛋白为圆形叶口蝠唾液纤溶酶原激活物(DSPA)或人组织纤溶酶原激活物(t-PA)。在其它方面，DSPA为或包含如SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列并且t-PA为或包含如SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列。
本发明进一步提供转基因植物或其子代，包含含有与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码溶解血液凝块的蛋白的核苷酸序列的核酸序列。在一些方面，转基因植物或其子代为选自烟草、水稻、玉米和大豆的植物类型。在一些方面，所述溶解血液凝块的蛋白为圆形叶口蝠唾液纤溶酶原激活物(DSPA)或人组织纤溶酶原激活物(t-PA)。在另外的方面，所述种子特异性或选择性启动子为菜豆蛋白启动子或油菜籽蛋白启动子。
另外，本发明提供制造溶解血液凝块的重组蛋白的方法。所述方法包括步骤i) 遗传工程改造植物细胞或植物外植体以包含和表达与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码溶解血液凝块的蛋白的核苷酸序列；ii) 培养植物细胞或植物外植体以产生转基因植物；iii) 培养转基因植物以产生包含溶解血液凝块的蛋白的种子；iv) 收获种子；和iv) 从种子分离溶解血液凝块的蛋白。
在进一步的方面，本发明提供包含与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码溶解血液凝块的蛋白的核苷酸序列的载体。在一些方面，载体中存在的核酸序列包含如SEQ ID NO 2、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中列出的核苷酸序列。在进一步的方面，编码蛋白的核酸序列编码为或包含如SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列，或为或包含如SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。
本发明进一步的方面提供包含与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码的血液凝块溶解蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列。在一些方面，所编码的血液凝块溶解蛋白为DSPA。在某些方面，编码的DSPA为或包含如SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列。在进一步的方面，DSPA由为或包含如SEQ ID NO: 2中列出的核苷酸序列的核苷酸序列编码。在进一步的方面，血液凝块溶解蛋白为t-PA。在某些方面，t-PA为或包含如SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列。在另外的方面，t-PA由为或包含如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中列出的核苷酸序列的核苷酸序列编码。在一些方面，种子特异性或选择性启动子为或包含如SEQID NO: 10中列出的核苷酸序列。
本发明进一步的方面提供包含如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列的重组蛋白。
附图简述
图1A和1B. 用于A，DSPA和B，t-PA的植物表达载体。种子特异性菜豆蛋白(phas)启动子用于驱动在烟草中表达。使用KDEL肽将每一蛋白靶向至ER。使用下列缩写：phas：豆种子特异性菜豆蛋白(phas)启动子；nosT：胭脂碱合酶的多腺苷酸化信号；RB/LB：植物T-DNA右/左边界；NPTII：新霉素磷酸转移酶(卡那霉素抗性)植物选择标记；Ω：烟草花叶病毒RNA的5'-非翻译序列(Ω增强子)；LPH：植物优化的鼠mAb24重链。6×His用于蛋白纯化目的。
图2A和2B. 纤维蛋白平板测定。A，烟草种子衍生的t-PA的纤维蛋白平板筛选：CK=10单位市售人t-PA；1、2和3：50 uL (各)来自t-PA转基因T1烟草种子的洗出液；B，DSPAα1的纤维蛋白平板测定：t-PA=10单位市售人t-PA；LPH-DSPAα1 = 50 uL来自DSPAα1转基因烟草T3种子的洗出液；wt：50 uL来自非转基因烟草种子的洗出液。
图3A和3B. 血液凝块溶解测定。A，磷酸缓冲盐水中的凝块，无添加剂。B，t-PA：10单位市售人t-PA；LPH-DSPAα1 = 50 uL来自T3种子的洗出液；wt：50 uL来自非转基因种子的洗出液；PBS：50 uL磷酸缓冲盐水。
图4A和4B. DSPPα1. A，成熟DSPPα1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)；B，编码成熟DSPPα1的DNA序列 (SEQ ID NO: 2)。
图5A-5E. t-PA. 全长t-PA的氨基酸序列(翻译后加工之前) (SEQ ID NO: 3)；B，编码全长t-PA的DNA序列(SEQ ID NO: 4)；C，密码子优化的编码全长t-PA的DNA序列(SEQID NO: 5)；D，成熟t-PA的氨基酸序列(翻译后加工之后) (SEQ ID NO: 6)；E，编码成熟t-PA的DNA序列(SEQ ID NO: 7)。
图6A-6E. A，编码LPH：来自鼠单克隆抗体的重链的19个氨基酸的前导肽的核酸序列(SEQ ID NO: 8)，B，LPH：19个氨基酸的前导肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 9)；C，种子特异性菜豆蛋白(phas)启动子的核酸序列(SEQ ID NO: 10)；D，Phas蛋白5'-UTR DNA序列(SEQ ID NO: 1 1)；E, 烟草花叶病毒RNA的5'-非翻译序列(Ω增强子) (SEQ ID NO: 12)。
图7. 整个蛋白的预测的氨基酸序列，如对于t-PA翻译的(任何翻译后修饰之前)("t-PA-6His-KEDL"; SEQ ID NO: 13)。
优选实施方案的详述
本发明提供溶解、降解或分解血液凝块的重组蛋白，其被靶向以在植物种子中产生。如本文所描述的，从其中生产蛋白的重组构建体包含种子特异性启动子，其优先靶向在植物种子中的蛋白生产。该类型的示例性蛋白包括但不限于DSPAαl和t-PA。
蛋白DSPAαl和t-PA二者具有溶解血液凝块的能力并且因此代表在治疗涉及不需要的凝块(血栓和栓子)的疾病和病况中的有价值工具。如本文所描述的，当生产靶向至植物种子时，大量的这些蛋白可以以稳定的形式和以节省成本的方式生产。如本文所述生产的蛋白用于，例如，治疗涉及不需要的血液凝块的各种疾病和病况。
下列定义贯穿本文使用：
tPA (或PLAT)为沿血管排列的内皮细胞上存在的丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.68)。tPA催化纤溶酶原转化为纤溶酶，其是导致凝块分解的主要的酶。tPA用于治疗，例如，栓子和血栓性中风。如本文所使用的，“t-PA”可指该蛋白的人或其它，通常哺乳动物形式，以及编码蛋白的基因。
圆形叶口蝠(吸血蝠)唾液纤溶酶原激活物α1 (DSPAα1或去氨普酶(INN))为具有高纤维蛋白特异性的纤溶酶原激活物。该高纤维蛋白特异性使DSPAα1成为有希望的用于治疗急性缺血性中风的候选。特别地，DSPAα1可用作t-PA的替代、备选，或与t-PA联合使用，t-PA可引起神经毒性作用和不需要的出血，例如颅内出血，并且推荐仅在中风后开始的几小时内使用。
血栓，或血液凝块，是止血中血液凝固步骤的最终产物。血栓有两个组分：形成血小板栓的聚集的血小板，和交联的纤维蛋白网。血栓是对损伤的健康反应，意在防止出血，但当凝块阻塞血液流过健康血管时，在血栓形成中可为有害的。
血栓形成为血管内血液凝块的形成，阻塞血液流过循环系统。当血管损伤时，身体使用血小板(凝血细胞)和纤维蛋白形成血液凝块以防止血液损失。然而，即使当血管未损伤时，在某些条件下血液凝块也可在体内形成，引起否则由血管维护的区域由于缺氧而广泛损伤，例如外周动脉血栓和腿近端深静脉中的血栓。脱离的(栓塞)和移动通过循环系统的凝块可极其危险，并且如果其变得“粘(stuck)”在血管中，则引起栓塞。
栓塞：血管例如动脉阻塞，通常通过已经脱离的并且从其最初形成的位置移动的血液凝块。栓塞可在许多位置发生并且可引起极其严重的病况，例如脑动脉栓塞(大脑栓塞)引起中风，其可为致命的。在肺栓塞中，血流在肺动脉处阻滞。当主肺动脉被阻滞，栓塞可迅速变得致命。超过90%的肺栓子病例为深静脉血栓形成(DVT)的并发症，深静脉血栓形成为在体内，通常腿中一条或多条深静脉中形成的血液凝块。
血栓栓塞为用于描述血栓形成和其主要并发症，栓塞的组合的术语。
中风：由于对脑的血液供应紊乱引起的脑功能的迅速衰退，例如由于缺血、血栓、栓子或出血。
“种子特异性启动子”：仅在种子中驱动蛋白产生。“种子选择性启动子”：在种子中驱动大多数蛋白产生，例如，至少约50、60、70、80或90%或更多的蛋白在种子中产生。
如本文所述的目的蛋白为直接或间接溶解、降解或分解血液凝块，或引起血液凝块溶解、降解或分解的蛋白。编码蛋白的基因在经遗传工程修饰以包含含有至少一个编码蛋白的核酸基因序列和植物种子特异性(或选择性)启动子的载体的植物的种子中转录和翻译。设计载体(即排列载体的元件)以致编码蛋白的序列与特异性/选择性启动子的序列操作性连接，即蛋白的表达受种子特异性/选择性启动子驱动，导致蛋白专门或选择性地在种子中表达。
可用在本发明实践中的示例性的种子特异性/选择性启动子包括但不限于例如拟南芥(Arabodopsis)启动子Pro-at3g03230 (在合点胚乳中表达)、Pro-at4g27530:GUS (在合点胚乳和胚芽中表达)、Pro-at4g31830 (在胚根和原形成层中表达)、Pro- at5gl 0120和Pro-at5gl 6460 (在胚芽中表达)、Pro-at5g53100:GUS (在胚乳中表达)和Pro-at5g54000 (在胚芽和内珠被中表达)、DIRIGENT PROTEIN 1 (DPI)基因启动子(种皮特异性表达)；β-伴大豆球蛋白(conglycinin) α亚基基因的大豆启动子区域的片段BCSP666；美国专利7192774中公开的来自水稻的种子特异性谷蛋白1 (Gt-1)启动子；来自水稻的球蛋白-1 (Gb-1)启动子；美国专利公开20120036595以及美国授权专利5623067、5767363、7371928和8404926中描述的种子特异性启动子；EP-A2- 0255378和EP-A-0255377中描述的来自甘蓝型油菜(B. napus)和白菜型油菜(B. campestris)的油菜籽蛋白启动子；美国专利公开US 7642346 B2中描述的亚麻种子特异性启动子。在本发明优选的实施方案中，使用的种子特异性启动子为豆球蛋白样种子贮藏蛋白启动子或2S贮藏蛋白启动子。
“种子特异性启动子”可对于在整个种子中或在一个或多个部分或类型的种子细胞中的基因表达特异。例如，启动子可对于在种皮、胚芽、胚乳、内种皮、外种皮、种脊、珠被、在栅栏细胞中、在边缘层等中的基因表达特异/具有选择性。其可为来自在种子胚芽或种皮细胞中表达的基因或来自编码种子贮藏蛋白的基因的转录起始区域和核糖体结合位点。其可为来自编码与其它植物细胞相比优先在植物种子细胞中表达的产物的基因的序列，如，例如，美国专利5608152、5420034和EP 255378 B2中所描述的。
可用于携带如本文所述的编码目的蛋白的序列和种子特异性/选择性启动子的载体通常为已经特别设计以促进转基因植物产生的质粒。在一些方面，其为具有在大肠杆菌和例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) (经常用于将重组DNA插入植物中的细菌)二者中复制的能力的双元载体。正因如此，合适的载体通常包含用于在引入植物细胞之前将DNA插入农杆菌的转移DNA (T-DNA)区域。载体还可包含例如至少一种选择基因(例如，用于抗生素抗性或另一种可选择的性状)，以及质粒复制所需的各种其它基因和/或序列，如本领域技术人员所已知的。
然而，也可使用非农杆菌载体，其实例包括但不限于：花椰菜花叶病毒载体、豇豆花叶病毒载体、豆荚斑驳病毒(BPMV)载体、烟草花叶病毒(TMV)载体、马铃薯病毒X (PVX)载体、雀麦草花叶病毒(BMV)载体、豆黄矮病毒载体、双生病毒载体，等。
如上文所指示的，如本文所描述的在植物种子中翻译为蛋白的基因序列，在载体内，与实现基因序列转录的种子特异性/选择性启动子操作性连接或相对于所述启动子操作性放置。在一些方面，在载体中存在编码基因的至少一个拷贝，并且可存在多个拷贝。另外，蛋白生产中涉及的其它序列一般也包含在内。额外的序列可作为蛋白的部分翻译，或可为不翻译的调节序列。例如，载体可在编码序列末端包含合适的非翻译终止信号。合适的终止序列包括但不限于：胭脂碱合酶终止子(nos)和衍生自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S终止子。也可存在其它非翻译序列例如增强子序列、一些转录因子等。
可存在的示例性的翻译序列(并且其作为蛋白的部分翻译)包括但不限于：引导翻译的蛋白在植物内移动的各种信号或靶向序列，例如，信号肽，包括但不限于植物优化的分泌信号mAb24重链(LPH，来自鼠单克隆抗体的重链的前导肽，使蛋白能够转运至质外体)、衍生自豌豆(Pisum sativum)的豆球蛋白A2 (legu-minA2) (GenBank®登录号X17193)并在豌豆种子中将天然豆球蛋白A2靶向至蛋白质体的PbTS前导肽序列(22个氨基酸)、衍生自长春花(Catharanthus roseus)的异胡豆苷合酶基因(GenBank®登录号XI61932)并且包含28个氨基酸(天然序列的C端4个丝氨酸残基省略，因为如CBS SignalP预测服务器所预测的，其将导致不正确的切割，参见位于www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2的网站)的VTS4前导肽序列，等；引导或使蛋白偏向滞留在特定位置和/或植物的特定细胞器中的序列，例如用于将重组蛋白滞留在内质网(ER)中的氨基酸序列KDEL (SEQ ID NO: 14)，或将蛋白分配到中间区室和高尔基复合体的氨基酸序列KKMP，等；帮助蛋白质纯化的序列，例如组氨酸标签，谷胱甘肽S-转移酶(GST)、FLAG标签序列DYKDDDDK (SEQ ID NO: 13)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签，等。
一般地，转化为将代表克隆的基因的DNA引入细胞中，以致其表达基因编码的蛋白。转化过程包括“间接基因转移”，其中外源DNA通过生物载体引入，和“直接基因转移”，其中物理或化学过程导致DNA引入。瞬时表达表示其中载体在植物细胞内复制并且蛋白质直接从载体翻译的情况。稳定转化过程要求两个独立的生物学事件同时发生，其为：转基因稳定插入植物基因组中和发生该稳定插入的那些细胞再生，产生非嵌合的转基因植物。尽管外源蛋白可在植物各处存在，但如果使用种子特异性启动子，转录仅或主要在植物种子中发生。
本发明还提供包含编码基因(其编码如本文所述的蛋白)的序列加对植物种子特异性或选择性的启动子的核苷酸序列。上文描述的其它元件也可存在于核苷酸序列中。所述核苷酸序列可为DNA、cDNA、RNA (例如mRNA)或这些的杂合体。在一些方面，所述核苷酸序列为或包含如SEQ ID NO: 2中列出的序列(其编码DSPAα1蛋白)，和或如SEQ ID NO: 4中所列出的序列(其编码t-PA蛋白)，或如SEQ ID NO: 5中所列出的序列(其使用密码子优化的序列编码t-PA蛋白)。在其它方面，核苷酸序列包含一种或两种SEQ ID NO: 2和/或如SEQID NO: 4中列出的序列和/或如SEQ ID NO: 5中列出的序列，加SEQ ID NO: 10，其为种子特异性的菜豆蛋白(phas)启动子的核酸序列。还包含使用不同密码子编码相同蛋白的序列，和与序列至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源的任何核苷酸序列。
本发明还包括包含如SEQ ID NO: 1 (DSPAal)或SEQ ID NO: 3 (翻译后加工之前的t-PA)，或SEQ ID NO: 6 (翻译后加工之后的t-PA)中列出的氨基酸序列的蛋白或多肽，包括与那些序列同一的蛋白/多肽，或包含那些序列之一的蛋白/多肽，例如包含一种或多种蛋白加其它序列(例如，其它肽/蛋白序列、信号序列、各种定位(例如滞留)序列、帮助多肽/蛋白分离的序列或由于载体编码的序列而存在的外来序列，或帮助或简化编码序列的克隆的序列等)的融合或嵌合蛋白/多肽。在其它方面，本发明包括具有或包含如SEQ IDNO: 12中列出的氨基酸序列(重组t-PA，如从下文实施例部分中所描述的翻译的)的蛋白/多肽。此外，与任何这些序列具有至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列也包括在内，特别是包含保守氨基酸置换的那些。本领域技术人员熟悉“保守置换”的含义，例如其中带正电的氨基酸被另一个带正电的氨基酸替代，带负电的氨基酸被另一个带负电的氨基酸替代，或疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸替代等。任何这样的置换均包括在内，只要所得到的蛋白/多肽保留至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90或95%的亲本分子活性，即保守变体为功能或活性保守变体。
在一些方面，如本文所述用作在种子中转录或翻译t-PA蛋白(丝氨酸蛋白酶)的基础的t-PA基因序列为人t-PA基因。然而，情况并非总是如此。也可使用其它血液-凝块溶解丝氨酸蛋白酶，例如来自蚯蚓的蚓激酶(LK)、人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)等。
载体插入宿主植物中一般使用已知技术完成。例如，可使用根癌农杆菌系统，其中细菌首先用编码目的蛋白的载体转染(例如通过电穿孔)，然后使用根癌农杆菌细菌感染细胞或外植体或目的宿主植物的其它组织。然而，其它用于遗传修饰植物的技术，其实例包括但不限于：基因枪、微纤维、直接电穿孔入植物细胞等。
植物细胞或外植体经遗传修饰后，将其通过本领域技术人员已知的技术培养以产生成熟植物和，为了本发明的目的，产生种子。例如，可在温室或其它受控环境中使用特定的土壤和营养素、特定的生长条件(例如，光周期、无菌条件、受控的水分等)以产生成熟植物，其然后可移植或在允许种子形成的条件下生长。
产生其中可制造本文所述蛋白的种子的植物类型包括但不限于：烟草、玉米、大豆和水稻等。此外，如本文所使用的遗传修饰的或转基因“植物”包括植物的所有部分(例如茎、叶、种子、花、生殖器官、细胞器、个体细胞、外植体等)，以及植物的子代。
重组、遗传工程改造(修饰)的种子通过任何合适的技术从植物收获，包括手工和/或机械。其后，种子可例如在室温无限期储存，直至需要分离目的蛋白。蛋白的分离例通过机械破碎、碾磨或磨碎种子并在合适的溶剂中萃取蛋白进行。合适的溶剂包括缓冲的水性溶剂，通常在中性pH范围(例如，约6.8-约8.8)，例如由50mM NaH2P04、300mM NaCl、10 mM 2-巯基乙醇、1%聚乙烯吡咯烷酮构成的萃取缓冲液，pH 8。其后，蛋白溶液按照需要处理以确保蛋白溶出和准备好进一步纯化，例如通过浓缩、过滤、沉淀等，取决于蛋白的性质。如果“标签”(例如His标签)包含在蛋白序列中以帮助分离，可使用对标签特异性的亲和柱分离蛋白与杂质。否则，或另外，也可使用其它类型的色谱柱，或基于蛋白的天然配体的亲和柱等。可使用任何合适的纯化技术以达到期需的蛋白纯度水平。
来自本文所述的重组种子的蛋白产率通常在约500-约1500 mg/kg种子干重的范围内。
使用本文领域所熟知的技术，纯化的蛋白然后进一步处理以产生适合给予受试者，例如需要血液凝块溶解的患者的组合物。组合物通常包含一种或多种如本文所述的基本上纯化的蛋白和药理学上合适的载体。这种组合物的制备为本领域技术人员所熟知。通常，这样的组合物作为液体溶液或悬浮液制备，然而也考虑固体形式例如片剂、丸剂、粉剂等。也可制备适合在给予前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制备物也可经乳化。液体可为水性的或基于油的悬浮液或溶液。活性成分可与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合，例如药学上可接受的盐。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，或其组合。另外，组合物可包含少量辅助物质，例如湿润或乳化剂、pH缓冲剂等。另外，组合物可包含其它佐剂。如果期需给予口服形式的组合物，可加入不同的增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散辅助剂或粘合剂等。本发明组合物可包含任何这种额外成分以便以适合给予的形式提供组合物。制剂中蛋白的最终量可不同。然而，一般而言，制剂中的量将会为约1-99%。又其它的合适的用于本发明的制剂可在，例如Remington's PharmaceuticalSciences, Philadelphia, Pa., 第19版. (1995)中找到。
可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括，但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如twin 80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡类、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羊毛脂、糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖、淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉、纤维素及其衍生物例如羧甲纤维素钠、乙基纤维素或醋酸纤维素、黄蓍胶粉、麦芽、明胶、滑石、赋形剂例如可可脂和栓剂蜡、油例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油、二醇类例如丙二醇或聚乙二醇、酯类例如油酸乙酯和月桂酸乙酯、琼脂、缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝、海藻酸、无热源水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和磷酸缓冲溶液，和其它非毒性的相容的润滑剂例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包覆剂、甜味剂、调味剂和芳香剂，按照配方设计师的判断，防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
本文所描述的重组蛋白用于在有需要的受试者中预防或治疗不需要的血液凝块引起的各种病况或疾病。蛋白可直接溶解或降解凝块，例如通过攻击凝块的组分例如纤维蛋白，其被DSPAαl酶促降解；或蛋白可通过促进合成凝块破坏途径中另一种蛋白而间接溶解或降解凝块，例如t-PA，其催化纤溶酶原转化为纤溶酶，其是导致凝块分解的主要酶。在一些方面，血液凝块位于如果不存在血液凝块将会健康的组织的血管中。“预防”意指疾病/病况的症状尚未出现但被给予蛋白的受试者处于发展由不需要的血液凝块引起的疾病症状的风险中。将足够(有效)量的目的治疗活性剂，例如本文所描述的重组蛋白，给予受试者以预防或至少延迟或减轻疾病或病况的症状程度。例如，受试者可具有凝块(例如在DVT中发生)，凝块局部化并且尚未脱离或移动，但很容易这样做。另外，受试者可处于发展不需要的血液凝块的风险中，例如由于：即将发生的或最近的手术例如心脏或其它手术；或由于长时间保持静止(例如事故后或疾病期间或之后恢复期间)，或接受人工心脏瓣膜或支架或假体之后等。
“治疗”意指受试者已经诊断患有不需要的血液凝块引起的或以不需要的血液凝块为特征的疾病或病况。将足够(有效)量的目的治疗活性剂，例如本文所描述的重组蛋白，给予受试者以减轻、逆转或至少改善疾病或病况的症状。本领域技术人员将会认识到“预防”和“治疗”可重叠，例如在DVT的情况中：可治疗经诊断的DVT以溶解凝块，从而预防脑栓塞和中风发生。可使用如本文所述产生的蛋白预防或治疗的示例性的病况包括但不限于：DVT、中风、栓塞(例如，动脉和静脉栓塞、肺栓塞、脑栓塞、视网膜栓塞等)等。
实施例
实施例1
材料和方法
植物表达载体：
将原始全长t-PA、密码子优化的全长t-PA、成熟t-PA和成熟DSPAα1和DSPAα1的编码序列分别与C端6×His标签和KDEL ((SEQ ID NO: 14)；ER滞留信号，Nuttall等人，2002)融合并由GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ, USA)合成。为了增加植物细胞区室中的重组蛋白产率，我们用植物优化的鼠mAb24重链(LPH：来自鼠单克隆抗体24的19个氨基酸的前导肽)分泌信号替代t-PA、DSPAαl和DSPAα2信号肽。这些靶向序列使得能够将t-PA和DSPA蛋白转运至质外体。LPH-t-PA、-DSPAαl或-DSPAα2基因序列侧接C端6×His标签用于蛋白纯化，和KDEL (SEQ ID NO: 14)序列用于将重组蛋白滞留在内质网(ER)中。所有基因片段由GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ, USA)合成并插入植物表达构建体，pCambia2300-Phasl470-Nos的种子特异性菜豆蛋白启动子(phas)和胭脂碱合酶终止子(NosT)之间(图1)。
植物转化
上述植物表达载体通过电穿孔系统(Eppendorf, Hamburg, Germany)引入ElectroMAX™根癌农杆菌LBA4404细胞(Life Technologies, USA)中。将转化的反应混合物涂布在含有卡那霉素(50 mg/L)的LB琼脂板上并在28℃孵育。孵育三天后，选择单克隆并使用棉签均匀分散在含有卡那霉素(50 mg/L)的LB琼脂板上，然后在28℃孵育2天。培养物通过无菌勺收集并重悬在MS液体培养基中以获得大约0.4-0.6的OD600。从4-6周龄的无菌烟草(Nicotiana tabacum SRI)幼苗切离外植体(0.5 cm × 0.5 cm)并浸入上述农杆菌悬浮液中30-40 min。然后将外植体印迹在无菌滤纸上并铺板在共培养培养基(MS，6-BA 2.0 mg/L、乙酰丁香酮100 mg/L)上，在黑暗中在25℃持续4天。共培养后，将外植体转移到选择培养基(MS，6-BA 2.0 mg/L、卡那霉素100 mg/L、头孢噻肟250 mg/L和羧苄青霉素250 mg/L)上。将培养物在25℃/23℃ (日/夜温度)以16-hr光周期孵育。每2周将外植体转移至新鲜选择培养基以产生嫩芽。然后将嫩芽转移至生根培养基(MS，蔗糖3.0%，卡那霉素100 mg/L)中以获得根。让生根的植物在Magenta®植物组织箱中生长至5-cm，然后转移至土壤。
纯合转基因烟草系发育
携带表达构建体并且在种子中具有最高水平tPA和DSPA蛋白表达的转基因植物系通过纤维蛋白平板测定鉴定。T1种子通过在用卡那霉素修正的培养基上筛选经受转化的植物，然后将存活植物转移至土壤中用于进一步生长和产生T1种子而获得。T1植物在土壤中生长并自花受精以产生T2种子。T2种子再次在用卡那霉素修正的琼脂培养基上筛选，接着将存活植物转移至土壤，在土壤中其经受自花受精。同源T3种子使用卡那霉素选择培养基从T2植物获得。
带His标签的蛋白提取和纯化
来自干燥成熟种子(T1 t-PA和DSPAα2)和同源T3 (DSPAα1种子，约50 mg)的总可溶性蛋白使用P-PER® Plant Protein Extraction Kit (Thermo Scientific, Waltham,USA)提取。带His标签的蛋白用Ni-NTA通过重力流色谱(Qiagen, Venlo, Netherlands)纯化。将1 ml Ni-NTA浆液(0.5 ml床体积)通过移液器转移至1.7-ml微量离心管中，4℃ 500x g离心5 min。去除上清液，加入1 ml缓冲液A [50mM NaH2P04, 300 mM NaCl, pH8.0]。浆液通过温和翻转混合。在4℃重复500 x g离心步骤5 min，去除上清液。然后浆液准备与分离的总蛋白溶液(上述)混合。将总蛋白提取物加入该平衡的Ni-NTA浆液中，在4℃用振荡器(Boekel Scientific, Feasterville, USA)摇动1小时。1小时后，将蛋白提取物/Ni-NTA混合物转移至用缓冲液B [50mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 5mM咪唑, pH8.0]平衡的聚丙烯柱(Cat. No. 34924, Qiagen)中。柱然后用10个床体积(5-ml)缓冲液B洗涤。结合的带His标签的蛋白然后用200 μl缓冲液C [50mM NaH2P04, 300 mM NaCl, 1M咪唑, pH8.0]洗脱两次至单独的管中。所得的洗出液用于蛋白浓度测量、纤维蛋白板测定和血液凝块溶解检验。
纤维蛋白平板测定
纤溶酶活性通过改进的纤维蛋白平板方法(Li等人2012)检测。将50 mL 0.5%琼脂糖/1×PBS缓冲液在200 mL锥形瓶中煮沸并在40℃水浴中冷却。加入1 mg/mL纤维蛋白原、0.1IU/mL凝血酶和0.1 IU/mL纤溶酶原并涡旋混合。将混合物缓慢倒入培养皿，并让平板保持原状直至琼脂糖凝固。孔(3 mm直径)用无菌打孔器在每一平板上形成。将50 μL洗出液样品(0.5 mg蛋白/mL)装载到每一孔中并将平板在室温孵育过夜。
血液-凝块溶解活性测定
体外人血液凝块溶解活性测定如Li等人(2012)所描述的使用。全血获自SanguineBiosciences, Inc. (Valencia, CA, USA)。大约50 mg血液凝块被分离，用1×PBS漂洗并放置在24孔平板的孔中。将50 μL来自种子的蛋白洗出液混合在450 μL 1×PBS缓冲液中并加入包含凝块的24孔平板(Greiner Bio-One, Monroe, USA)的孔中。将处理的样品在37℃孵育过夜。
结果和结论：
将编码全长野生型t-PA、密码子优化的t-PA和吸血蝠DSPAαl以及DSPAα2蛋白的cDNAs克隆入植物载体系统中。一般地，将全长基因重新设计以优先匹配宿主烟草植物中的密码子频率而不改变蛋白的氨基酸序列。为了增加植物细胞区室中的重组蛋白产率，将天然信号肽用植物优化的mAb24重链(LPH)代替。这些靶向序列使得能够在不同的分泌途径中将蛋白转运至质外体和液泡。所有的基因序列侧接C端6×His标签用于蛋白纯化，并包含KDEL(SEQ ID NO: 14)序列用于将重组蛋白滞留在内质网(ER)中。
将带His标签的蛋白通过镍螯合亲和层析从来自未成熟种子的总可溶性蛋白纯化。功能t-PA和DSPA蛋白通过纤维蛋白降解测定筛选。结果显示来自T1种子的重组t-PA和来自T3同源种子的DSPAα1可降解纤维蛋白，如图2A和B中所示。纯化的t-PA和DSPAαl蛋白在纤维蛋白平板上显示半透明溶解区域，表明纤维蛋白已经降解成可溶性肽。重组蛋白甚至在室温24小时后仍能够降解纤维蛋白，表明从干燥种子分离的蛋白的纤维蛋白降解活性非常稳健。相比之下，来自非转基因野生种子的蛋白洗出液显示无纤维蛋白切割活性。
显著地，检验显示在转基因种子中产生的DSPAαl显著溶解血液凝块(图3)。当用非转基因野生烟草种子处理血液样品时，未观察到凝块溶解证据。用t-PA重组蛋白获得相似的结果(例如参见图3)。这些发现表明植物种子系统是用于产生功能血液凝块溶解蛋白的出色平台。
总之，通过使用种子特异性启动子，已产生转基因烟草植物，其中t-PA、DSPAα1和DSPAα2产生靶向于种子。数据显示以这种方式产生的重组蛋白t-PA、DSPAα1和DSPAα2可降解纤维蛋白，并且DSPAα1显著溶解人血液凝块。因此，转基因植物可用于产生活性、安全和廉价的治疗蛋白。特别地，基于植物种子的平台可用于大规模和低成本生产溶解血液凝块的功能蛋白。
因此，本发明很适合执行上述目标并获得上述结果和优点以及其中固有的那些。尽管目前优选的实施方案已经为了本公开内容的目的进行描述，但许多变化和修饰将会对本领域普通技术人员显而易见。这样的变化和修饰包含在如权利要求所定义的本发明的精神内。
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Claims (21)

1.包含溶解血液凝块的蛋白的转基因种子。
2.权利要求1的转基因种子，其中所述转基因种子来自选自烟草、水稻、玉米和大豆的植物类型。
3. 权利要求1的转基因种子，其中所述溶解血液凝块的蛋白为圆形叶口蝠(Desmodus rotundus)唾液纤溶酶原激活物(DSPA)或人组织纤溶酶原激活物(t-PA)。
4. 权利要求3的转基因种子，其中所述DSPA为或包含如SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列，并且t-PA为或包含如SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列。
5.一种转基因植物或其子代，包含：
含有与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码溶解血液凝块的蛋白的核苷酸序列的核酸序列。
6.权利要求5的转基因植物或其子代，其中所述转基因植物或其子代为选自烟草、水稻、玉米和大豆的植物类型。
7.权利要求5的转基因植物或其子代，其中所述溶解血液凝块的蛋白为圆形叶口蝠唾液纤溶酶原激活物(DSPA)或人组织纤溶酶原激活物(t-PA)。
8.权利要求5的转基因植物或其子代，其中所述种子特异性或选择性启动子为菜豆蛋白启动子或油菜籽蛋白启动子。
9.制造溶解血液凝块的重组蛋白的方法，包括：
遗传工程改造植物细胞或植物外植体以包含和表达与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码溶解血液凝块的蛋白的核苷酸序列；
培养植物细胞或植物外植体以产生转基因植物；
培养转基因植物以产生包含溶解血液凝块的蛋白的种子；
收获种子；和
从种子分离溶解血液凝块的蛋白。
10.包含与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码溶解血液凝块的蛋白的核苷酸序列的载体。
11. 权利要求10的载体，其中所述核酸序列包含如SEQ ID NO 2、SEQ ID NO: 4或SEQID NO: 5中列出的核苷酸序列。
12. 权利要求10的载体，其中编码蛋白的核酸序列编码为或包含如SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列的氨基酸序列，或为或包含如SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。
13.一种核苷酸序列，其包含与种子特异性或选择性启动子操作性连接的编码血液凝块溶解蛋白的核苷酸序列。
14.权利要求13的核苷酸序列，其中所述血液凝块溶解蛋白为DSPA。
15. 权利要求14的核苷酸序列，其中DSPA为或包含如SEQ ID NO: 1中列出的氨基酸序列。
16. 权利要求14的核苷酸序列，其中DSPA由为或包含如SEQ ID NO: 2中列出的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
17.权利要求13的核苷酸序列，其中所述血液凝块溶解蛋白为t-PA。
18. 权利要求17的核苷酸序列，其中t-PA为或包含如SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列。
19. 权利要求17的核苷酸序列，其中t-PA由为或包含如SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中列出的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
20. 权利要求13的核苷酸序列，其中所述种子特异性或选择性启动子为或包含如SEQID NO: 10中列出的核苷酸序列。
21. 包含如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6中列出的氨基酸序列的重组蛋白。
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