DE3855827T2

DE3855827T2 - Bacillus thuringiensis p-2-toxingen, protein und damit in zusammenhang stehende insektizide zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3855827T2
Application number: DE3855827T
Authority: DE
Inventors: William Donovan
Original assignee: Ecogen Inc
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1987-04-16
Filing date: 1988-04-07
Publication date: 1997-11-27
Anticipated expiration: 2008-04-08
Also published as: CA1340600C; JPH0636743B2; AU618532B2; SG43288A1; WO1988008034A1; KR960006582B1; ATE150089T1; IL86065A0; EP0367767A4; ES2009599A6; DE3855827D1; DK513689A; DK513689D0; FI894856A0; GR880100247A; AU1681788A; EP0367767A1; EP0367767B1; IL86065A; KR890700677A

Description

1.0 Einführung

Diese Erfindung betrifft ein kristallines Protein, das als biologisches Insektizid verwendet werden kann und als P-2-Toxin oder P-2-Delta-Endotoxin bezeichnet wird. Es wird durch bestimmte Stämme von Bacillus thuringiensis natürlich produziert. Die Erfmdung betrifft besonders die Clonierung und Expression des das P-2- Delta-Endotoxin codierenden Gens in verschiedenen Mikroorganismen und verwandte neue insektizide Zusammensetzungen, die das P-2-Toxin selbst und mit dem P-2-Gen transformierte Mikroorganismen einschließen.

2.0 Hintergrund der Erfindung

2.1. Im Handel erhältliche Pestizide: Allgemeine Betrachtungen

Jedes Jahr entstehen aufgrund von Insekten und anderen Schädlingsplagen weltweit Verluste von signifikanten Teilen wirtschaftlich wichtiger Agrarerträge. Der durch diese Schädlinge verursachte Schaden betrifft alle wirtschaftlich wichtigen Pflanzen, wobei Nahrungspflanzen, Pflanzen zur Herstellung von Textilien und verschiedene Zimmerpflanzen eingeschlossen sind, und der wirtschaftliche Schaden beläuft sich auf Millionen von Dollar. Daher ist der Schutz der Feldfrüchte vor einem derartigen Schädlingsbefall von überragender Bedeutung.
Üblicherweise werden Pestizide mit einem breiten Wirkungsspektrum zum Schutz von Feldfrüchten verwendet, eine undifferenzierte Verwendung dieser Wirkstoffe kann jedoch zur Zerstörung der natürlichen Abwehrstoffe der Pflanze führen. Aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums können die chemischen Pestizide außerdem Nicht- Zielorganismen, beispielsweise nützliche Insekten und Schädlingsparasiten, vernichten. Sie sind außerdem häufig für Tier und Mensch toxisch und verursachen daher bei ihrer Anwendung Umweltrisiken.
Ferner entwickelten Insekten und andere Organismen nach einer wiederholten Exponierung häufig eine Resistenz gegen diese Pestizide. Neben der geringeren Verwendbarkeit der Pestizide können aufgrund der Reduktion von nützlichen parasitären Organismen resistente Stämme von an sich nicht so bedeutsamen Schädlinoen zu einem Hauptproblem bei der Schädlingsbekämpfung werden.
Dies ist ein Hauptproblem, das bei der Verwendung von Breitbandpestiziden angetroffen wird. Es wird ein ein engeres Wirkungsspektrum aufweisendes biologisch abbaubares Pestizid benötigt, das gleichzeitig über einen längeren Zeitraum wirksam bleiben kann, d. h., gegen das sich eine Resistenz viel langsamer oder überhaupt nicht entwickelt. Biopestizide scheinen in dieser Hinsicht nützlich zu sein.

2.2. Biologische Pestizide

Biopestizide, die auch als "Biorationals" bezeichnet werden, verwenden natürlich vorkommende Pathogene zur Bekämpfung von Insekten-, Pilz- und Unkraut- Befall von Agrarpflanzen. Derartige Substanzen können ein Bakterium umfassen, das mit oder ohne ein bakterielles Wachstumsmedium eine Substanz (beispielsweise ein Toxin) produziert, die für die Schädlinge toxisch ist. Derartige Bakterien können durch Standardverfahren direkt auf die Pflanzen aufgetragen werden und verbleiben üblicherweise über einen längeren Zeitraum auf den Feldfrüchten, wodurch sich die Notwendigkeit für wiederholte Anwendungen verringert.
Die Verwendung von biologischen Verfahren zur Schädlingsbekämpfung wurde zuerst 1895 vorgeschlagen, als eine Pilzerkrahkung bei Seidenraupen festgestellt wurde. Erst 1940 wurden jedoch zum ersten Mal Schädlinge erfolgreich biologisch bekämpft, als Sporen des die "Milky disease" hervorrufenden Bakteriums Bacillus popilliae zur Bekämpfung des Japankäfers verwendet wurden. Ende der 60er Jahre begann mit der Entdeckung eines neuen Bakterienstamms, der ein für Raupen tödliches Toxin sezerniert, die kommerzielle Verwendung von Biopestiziden. Das Bakterium mit der Bezeichnung Bacillus thuringiensis (hier nachstehend auch als "B.t." bezeichnet) ist gegenwärtig das am häufigsten verwendete Biopestizid.

2.3. Bacillus thuringiensis und Delta-Endotoxine

Bacillus thuringiensis ist ein weit verbreiteter, stäbchenförmiger, aerober und sporenbildender Mikroorganismus. Während seines Sporulationszyklus bildet B.t. Proteine, die als Protoxine oder Delta-Endotoxine bekannt sind. Diese Protoxine sind im B.t. als Parasporen, kristalline Einschlüsse oder als Teil der Sporenhülle abgelagert. Die Pathogenität von B.t. für eine Reihe von empfindlichen Insekten, beispielsweise der Ordnungen Lepidoptera und Diptera, wird im wesentlichen von diesen Parasporenkristallen verursacht, die mehr als 20% des Trockengewichts der B. t.-Zelle während der Sporulation ausmachen können.
Das Parasporenkristall ist nur nach seiner Aufnahme mit der Nahrung im Insekt aktiv. Nachdem es beispielsweise von einem Lepidopteren-Insekt mit der Nahrung aufgenommen worden ist, aktivieren der alkalische pH-Wert und proteolytische Enzyme im Mitteldarm das Kristall, wobei die toxischen Bestandteile freigesetzt werden. Diese toxischen Bestandteile vergiften die Zellen des Mitteldarms, wonach das Insekt die Nahrungsaufnahme einstellt und schließlich stirbt. B.t. hat sich tatsächlich als ein wirksames und umweltverträgliches Insektizid zur Bekämpfung von schädlichen Lepidopteren erwiesen.
Es werden verschiedene B.t.-Stämme beschrieben, die serologisch unterschiedliche Parasporenkristalle produzieren. Eine der häufigsten Kristallformen, die von vielen B.t.-Stämmen produziert wird, ist als P-1 bekannt. P-1 hat ein Molekulargewicht von etwa 130 000 D und man nimmt auch an, daß es als Hauptbestandteil der Sporenhülle vorkommt. Die Gene des Parasporenkristalls P-1 und die der meisten anderen Proteinkristalle liegen im B.t. auf einem von zahlreichen verschiedenen Plasmiden mit unterschiedlicher Größe.

2.4 Clonierung des Delta-Endotoxingens

Da B.t.-Toxingene üblicherweise auf Plasmiden liegen und ihre Produkte sich als wirksame Insektizide erwiesen haben, die leicht isoliert werden können, wenn sie als Kristalle vorliegen oder mit der Sporenbildung zusammenhängen, sind sie intensiv wissenschaftlich untersucht worden, besonders im Hinblick auf Verfahren zur Isolierung der Gene und zu ihrer Clonierung.
Das P-1-codierende Gen ist aus dem B.t.-Unterstamm kurstaki HD-1-Dipel isoliert und in E. coli cloniert und exprimiert worden [Schnepf et al., US-Patent 4,467,036]. Es wurde festgestellt, daß das Proteinprodukt P-1 für ein Lepidopteren- Insekt (Larven der Tabak-Schwärmerraupe) toxisch ist. Die Nucleotidsequenz der Promotorregion und eines Teils des codierenden Bereichs des Gens des P-1- Kristallproteins sind ebenfalls ermittelt worden [H. P. Wong et al., The Journal of Biological Chemistry 258 Nr.3 (1983), 1960-1967]. Die gesamte Nucleotidsequenz dieses Gens ist ebenfalls ermittelt worden und das Delta-Endotoxinprotein in einem transformierten E. coli-Stamm exprimiert worden [M. J. Adang et al., Gene 36 (1985), 289- 300, und PCT-Anmeldung PCT/USBS/01665, bezüglich: "B.t. Crystal Protein Gene Toxin Segment" (1985)].
Die Gene für andere Delta-Endotoxinproteine sind ebenfalls in E. coli cloniert und exprimiert worden. Rekombinante Plasmide, die ein Gen für ein Mücken tötendes Delta-Endotoxin von B.t. var. israelensis entffielten, wurden in einen E coli-Vektor insertiert. Ein 26 000 D-Polypeptid wurde durch mit diesem Vektor transformierten E. coli synthetisiert. Es wurde festgestellt, daß dieses Polypeptid für Insekten der Ordnung Diptera (Mosquitos) tödlich war. [E. S. Ward et al., FEBS Bd. 175, Nr. 2 (1984), 377- 382]. Die Nukleotidsequenz des dieses Kristallprotein codierenden Gens wurde zusammen mit der abgeleiteten Proteinsequenz ebenfalls ermittelt [C. Waalwijk et al., Nucleic acids Research Bd. 13, Nr. 22 (1985), 8207-8217]. Ein weiteres Gen von B.t. var. israelensis, das ein 130 kD-Kristallprotein codiert, wurde cloniert und zur Transformation von Bacillus megaterium und Bacillus subtilis verwendet. Sowohl B. megaterium als auch B. subtilis exprimierten während der Sporulation Kristalleinschlüsse, die für die Larven von Aedes aegypti nachweislich toxisch waren [V. Sekar et al., Gene 33 (1985), 151-158].
Ein weiteres kristallines Delta-Endotoxinprotein stammte von dem B.t.- Unterstamm sotto. Das dieses Kristallprotein codierende Gen wurde in einen Vektor cloniert und anschließend in transformiertem E. coli exprimiert. Dieses Gen codiert ein 144 000 D-Peptid (934 Aminosäurereste). Die Nucleotidsequenz des Gens und die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins wurden beschrieben. [Y. Shibano et al., Gene 34 (1985), 243-251].
Es ist außerdem festgestellt worden, daß ein weiteres wichtiges Delta- Endotoxinprotein von mehreren B.t.-Unterarten produziert wird [T. Yamamoto, Biochem. and Biophys. Res. Comm. Bd. 103, Nr.2 (1981), 414-421, und T. Yamamoto et al., Archives of Biochemistry and Biophysics Bd. 227, Nr. 1(1983), 233-241]. Dieses Delta-Endotoxin ist als P-2 identifiziert und aus B.t. var. kurstaki (HD-1) isoliert worden. Dieses Delta-Endotoxin-Protein weist ein Molekulargewicht von etwa 65 000 Dalton auf und ist bekannterweise toxisch für Lepidopteren- und Dipteren-Insekten. P-1 ist im Gegensatz dazu nur gegen Insekten der Ordnung Lepidoptera wirksam. Trotz der Isolierung des P-2-Proteins und seiner Charakterisierung durch seine Aktivität gegen bestimmte Insekten blieben das dieses Protein codierende Gen und die Proteinsequenz selbst bis jetzt unbekannt. Diese Tatsache verhinderte die Bereitstellung eines Verfahrens zur Expression dieses einzigartig wirksamen Delta-Endotoxinproteins in einem anderen Organismus als B.t.. Die Verfügbarkeit eines clonierten P-2-Gens wurde die verbesserte Produktion des P-2-Proteins in B.t. und ferner die P-2-Synthese in einem von anderen Delta-Endotoxinen freien heterologen Organismus ermöglichen.

3.0 Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das von Bacillus thuringiensis produzierte P-2-Delta- Endotoxin, die DNA-Sequenz des dieses Protein codierenden Gens und neue Insektizide, die dieses Protein und/oder mit dem P-2-Gen transformierte Organismen einschließen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Clonierung und Transformation von Mikroorganismen mit dem das P-2-Delta-Endotoxin codierenden Gen. Diese Erfindung ermöglicht insbesondere die Expression des P-2-Delta-Endotoxins in anderen Organismen als B.t. in größeren Mengen als durch einen natives P-2 produzierenden B.t.-Organismus während der Sporulation produziert wird. Die Erfindung kann ferner verwendet werden, um einen nichtsporulierenden Mikroorganismus mit dem das P-2- Toxin codierenden Gen zu transformieren, so daß dieses Delta-Endotoxin praktisch während sämtlicher Stadien des Wachstums des Mikroorganismus produziert werden kann, und daher nicht auf die Produktion während des Sporulationsstadiums beschränkt ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung eines von dem isolierten Gen produzierten homogenen P-2-Proteins. Dieses Protein kann durch Transformation eines sporulierenden oder nicht-sporulierenden Mikroorganismus wie Bacillus megaterium oder E. coli oder einem anderen B.t.-Stamm mit dem clonierten P- 2-Gen produziert werden. Dieses Verfahren ermöglicht aufgrund der Selektion des geeigneten Wirts und Vektors die Produktion des P-2-Delta-Endotoxins in großem Maßstab, so daß ein im wesentlichen homogenes Präparat des P-2-Toxins erhalten werden kann, d. h. ohne jede Verunreinigung durch andere Variationen des Delta- Endotoxins, die üblicherweise zusammen mit oder gleichzeitig mit dem P-2-Toxin im nativen B.t.-Wirt produziert werden. Das P-2-Protein und/oder der transformierte Wirt können in einer Reihe von insektiziden Zusammensetzungen verwendet werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung eines sich vom nativen B.t.-Wirt unterscheidenden Organismus, der mit der das P-2-Delta- Endotoxin codierenden DNA transformiert ist. Dieser transformierte Fremdwirt ermöglicht die Produktion des P-2-Delta-Endotoxins bei wunschenswerteren und/oder selektiveren Kulturbedingungen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung einer DNA-Sonde, die zum Nachweis der Gegenwart des P-2-Gens in verschiedenen Bacillus thuringiensis-Stämmen verwendet werden kann. Diese DNA-Sonde ermöglicht ferner die Durchinusterung von verschiedenen B.t.-Stämmen auf die mögliche Gegenwart von verwandten Genen, die Proteine codieren, denen eine Homologie mit dem P-2-Protein gemeinsam ist, und die Isolierung dieser verwandten Gene. Sämtliche vorstehend beschriebenen erfindungsgemaßen Ausführungsformen sind in der nachstehenden Beschreibung der Erfindung genauer erläutert.

4.0 Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 ist eine Restriktionskarte der rekombinanten Plasmide pEG 201 und pEG 204, die das clonierte P-2-Gen enthalten. Die Lage und Richtung der Transkription des P-2-Gens sind durch den großen Pfeil angezeigt.
Figur 2 zeigt die DNA-Nucleotidsequenz des P-2-Gens und ferner die von der DNA-Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz des P-2-Proteins. Die Nucleotidsequenz enthält einen Fehler.
Figur 3 besteht aus 3A und 3B. 3A ist ein Photo eines mit Ethidiumbromid gefärbten Eckhardt-Gels. Die in verschiedenen B.t.-Stämmen enthaltenen nativen Plasmide sind sichtbar, wodurch angezeigt wird, daß die meisten B.t.-Stämme mehrere native Plasmide enthalten. 3B ist ein Photo eines Autoradiogramms, das durch Hybridisierung des radioaktiv-markierten clonierten P-2-Gens mit den in 3A dargestellten Plasmiden hergestellt wurde. 3B zeigt, daß das clonierte P-2-Gen ausschließlich mit einem Plasmid von 110 MD in drei B.t.-Stämmen, die bekanntermaßen das P-2-Protein (HD1-1, HD263-1 und HD278) produzieren, hybridisierte. Das clonierte P-2-Gen hybridisierte ferner an eine DNA-Bande von 30 MD (3B).
Figur 4 besteht aus 4A, 48 und 4C. 4A ist ein Photo eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels, das HindIII-gespaltene DNA der Stämme HD1- 1, HD263-1, HD267 und HD278 enthält. 4A zeigt, daß die Gesamt-DNA von B.t., die mit HindIII gespalten worden war, in Hunderte von unterschiedlich großen Fragmente aufgelöst werden konnte. 48 ist ein Photo eines Autoradiogramms, das durch Hybridisierung des radioaktiv-markierten clonierten P-2-Gens mit den in 4A dargestellten HindIII-Fragmenten hergestellt wurde. 4C ist ein Photo eines Autoradiogramms, das nach dem erneuten Waschen des Nitrocellulosefilters von 4B bei 80ºC hergestellt wurde.
Figur 5 ist ein Photo eines Sdslpolyacrylamidgels, das zeigt, daß ein das clonierte P-2-Gen enthaltender rekombinanter Wirtsstamm von Bacillus megaterium große Mengen eines Proteins mit einer ähnlichen Größe wie das authentische P-2- Protein synthetisiert.
Figur 6 zeigt den Bereich der Homologie zwischen der Aminosäuresequenz des P-1- und P-2-Toxins.

5.0 Beschreibung der Erfindung

Allgemein gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit, das ein Protein mit insektizider Aktivität gegen Lepidopteren-Insekten codiert und das
(a) das P-2-Toxingen von Bacillus thuringiensis ist, das in dem in Form des rekombinanten Plasmids pEG204 als NRRL B-18203 hinterlegten 2,2 kB HindIII-AccI- Fragment enthalten ist und ein P-2-Toxin mit der N-terminalen Aminosäuresequenz
codiert,
(b) ein Gen ist, das dieselbe Arninosäuresequenz wie die vorstehend in (a) codiert, oder
(c) ein mutierter, rekombinanter oder gentechnisch veränderter Abkömmling der vorstehend in (a) und (b) gekennzeichneten Gene ist.
Das vom clonierten Gen codierte P-2-Toxin hat eine insektizide Aktivität gegen Lepidopteren- und Dipteren-Insekten.
Verfahren zur Herstellung des P-2-Proteins werden von dieser Erfindung ebenfalls bereitgestellt. In diesem Herstellungsverfahren wird das P-2-Delta- Endotoxingen in einen Clonierungsvektor oder ein Plasmid insertiert, wobei das Plasmid anschließend zur Transformation eines ausgewählten Mikroorganismus verwendet wird. Das Gen kann mit seinem nativen Promotor oder mit einem Fremdpromotor verwendet werden.
Die hier beschriebenen Clonierungsvektoren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und im Handel erhältlich. Die Wahl eines bestimmten Plasmids ist dem Fachmann bekannt und eine Frage der persöhnlichen Wahl. Die für eine erfindungsgemäße Verwendung geeigneten Plasmide sind beispielsweise PBR322, von B.t. abgeleitete Plasmide und Plasmide, die von Bacillus-Mikroorganismen abstammen, vorzugsweise Bacillus megaterium. Zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete Mikroorganismen sind sowohl sporulierende als auch nicht-sporulierende Mikroorganismen wie E. coli, B.t. und Bacillus megaterium. Die verwendeten Mikroorganismen sind ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt und allgemein verfügbar. Die Wahl eines bestimmten Mikroorganismus zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung ist ebenfalls eine Frage der individuellen Präferenz. In einer bevorzugten erfindungsgemaßen Ausführungsform ist der Mikroorganismus beispielsweise Bacillus megaterium.
Grundsätzlich kann das P-2-Toxinprotein durch einen transformierten Organismus produziert und anschließend zu einer homogenen Präparation mit einer in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz gereinigt werden. Dieses Protein kann insbesondere durch Transformation eines Mikroorganismus mit dem P-2-Gen, Züchtung des transformierten Mikroorganismus, so daß das vom P-2-Gen codierte Protein im Mikroorganismus exprimiert wird, und Extraktion des Proteins vom Organismus mit Standardproteinreinigungsverfahren hergestellt werden. Es ist ferner im erfindungsgemäßen Schutzbereich, daß das Protein vom transformierten Mikroorganismus nicht getrennt wird, sondern daß dieser das exprimierte P-2-Protein enthaltende Organismus selber als insektizide Zusammensetzung oder als Bestandteil einer solchen verwendet werden kann.
Die Erfindung stellt ferner ein neues Insektizid zur Verwendung gegen Lepidopteren und Dipteren bereit, das ein Gemisch des B.t.-P-2-Toxins und eines geeigneten Trägers enthält. Das P-2-Toxin kann im Organismus oder als Bestandteil in Sporen enthalten sein, oder es kann ein homogenes Proteinpräparat sein oder in einem Gemisch von Sporen mit gezüchteten transformierten Organismen enthalten sein. Das P- 2-Toxin kann ferner in einem nicht-sporulierenden Mikroorganismus oder einem sporulierenden Mikroorganismus wie Bacillus megaterium oder B.t. enthalten sein. Ein geeigneter Träger kann aus einer Reihe von dem Fachmann bekannten Feststoffen oder Flüssigkeiten gewählt werden.
Die Erfindung umfaßt ferner die das P-2-Gen einschließenden rekombinanten Vektoren oder Plasmide und die jeweiligen mit diesem Gen transformierten Mikroorganismen. Die Erfindung stellt ferner Oligonucleotidsonden für das das P-2- Delta-Endotoxin codierende Gen bereit. Alle diese erfindungsgemäßen Gesichtspunkte sind nachstehend genau beschrieben und in den nachstehenden Beispielen erläutert.

5.1 DNA-Rekombinationsverfahren und Genexpression

Grundsätzlich werden in DNA-Rekombinationsverfahren bestinnnte DNA- Sequenzen in ein DNA-Vehikel (Plasmid oder Vektor) insertiert, wobei ein chimäres DNA-Molekül, das in einer Wirtszelle replizieren kann, entsteht. Bei der insertierten DNA-Sequenz handelt es sich meistens um eine für den Empfängerstamm fremde DNA, d. h., die insertierte DNA-Sequenz und der DNA-Vektor stammen von Organismen, die in der Natur keine genetische Information austauschen, oder die insertierte DNA- Sequenz ist gegebenenfalls insgesamt oder teilweise synthetisch hergestellt. In den letzten Jahren sind mehrere allgemeine Verfahren entwickelt worden, die die Konstruktion von rekombinanten DNA-Molekülen ermöglichen. Beispielsweise offenbaren Cohen und Boyer im US-Pat. Nr.4,237,224 die Produktion derartiger rekombinanter Plasmide unter Verwendung von Restriktionsenzymen und üblichen Ligierungsverfahren. Diese rekombinanten Plasmide werden anschließend durch eine Transformation in einzellige Organismen eingeführt und repliziert. Aufgrund der allgemeinen Anwendbarkeit der im US-Pat. Nr.4,237,224 offenbarten Verfahren ist dieses hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung eingeschlossen.
Ungeachtet des zur Konstruktion verwendeten Verfahrens muß das rekombinante DNA-Molekül mit der Wirtszelle verträglich sein, d. h., es muß in der Wirtszelle autonom replizieren können. Das rekombinante DNA-Molekül muß ferner eine Markerfunktion aufweisen, die die Selektion von mit dem rekombinanten DNA- Molekül derart transformierten Wirtszellen ermöglicht. Wenn außerdem sämtliche geeigneten Replikations-, Transkriptions- und Translationssignale auf dem chimären DNA- Molekül korrekt angeordnet sind, wird das Fremdgen in den transformierten Zellen und deren Nachkommen exprimiert.
Diese unterschiedlichen genetischen Signale und Prozessierungssignale regulieren viele Ebenen der Genexpression, d. h., die DNA-Transkription und die Translation der Messenger-RNA. Die Transkription der DNA hängt von der Gegenwart eines Promotors ab, der eine die Bindung der RNA-Polymerase lenkende DNA-Sequenz darstellt, und so die Transkription fördert.
Die Translation der Messenger-RNA (mRNA) in Prokaryonten hängt von der Gegenwart der geeigneten prokaryontischen Signale ab. Eine effiziente Translation der mRNA in Prokaryonten, beispielsweise in B.t., erfordert eine als Shine-Dalgarno (SD)- Sequenz bezeichnete Ribosomenbindungsstelle auf der mRNA. Diese Sequenz ist eine kurze Nucleotidsequenz der mRNA, die vor dem das aminoterminale Methionin im Protein codierenden Startcodon (AUG) liegt. Die SD-Sequenzen sind zum 3'-Ende der 16S-RNA (ribosomale RNA) komplementär und fördern wahrscheinlich die Bindung der mRNA an die Ribosomen durch Duplexbildung mit der mRNA, wodurch eine korrekte Positionierung des Ribosoms ermöglicht wird (Roberts und Lauer, Methods in Enzymology 68 (1979), 473).
Ein zur Clonierung eines bestimmten Gens häufig verwendetes Verfahren ist die Herstellung einer "Bank" von rekombinanten Plasmiden. Jedes rekombinante Plasmid besteht aus einem Plasmidvektor, der üblicherweise eine Antibiotikaresistenz auf die ihn enthaltenden Zellen überträgt, sowie einem DNA-Fragment des das Gen enthaltenden Donor-Organismus. Die Plasmid-Bank wird üblicherweise durch Spaltung sowohl des Plasmidvektors als auch der Gesamt-DNA vom Donor-Organismus mit einem Restriktionsenzym, Inaktivierung des Enzyms und Ligierung des DNA-Gemisches hergestellt. Die ligierte DNA ist eine Plasmid-Bank. Das Schlüsselmerkmal dieser Plasmid-Bank ist, daß sie viele verschiedene rekombinante Plasmide enthält. Es ist sehr wahrscheinlich, daß mindestens eines der rekombinanten Plasmide in der Bank ein das gewünschte Gen enthaltendes DNA-Fragment vom Donor-Organismus enthält. Die Plasmid-Bank wird in Zellen eines Wirtsorganismus, der das Gen nicht enthält, transformiert. Die Wirtszellen werden auf einem selektiven festen Medium verteilt, das üblicherweise ein Antibiotikum enthält, so daß lediglich rekombinante Plasmide tragende transformierte Zellen Kolonien bilden können. Einzelne transformierte Wirtskolonien werden auf den Erwerb des Gens vom Donor-Organismus getestet. In den Wirtskolonien ist das erworbene Gen auf dem rekombinanten Plasmid lokalisiert.
Eines der direktesten Testverfahren auf ein erworbenes Gen ist die Verwendung einer Gen-spezifischen Hybridisierungssonde, einem DNA-Fragment, das zum Gen homolog ist. Ein Kennzeichen von homologen DNA-Fragmenten ist ihre feste Bindung aneinander während der Hybridisierung. Üblicherweise wird während der Hybridisierung eine radioaktiv-markierte DNA-Sonde verwendet, so daß die Bindung der Sonde an das Gen leicht überwacht werden kann.
Ein vor kurzem erreichter Fortschritt in der Molekülarbiologie ist die Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden als Gen-spezifische Sonden. Die Grundlage für die Verwendung der Oligonucleotide ist, daß in sämtlichen biologischen Systemen eine bestimmte Sequenz von Nucleotiden eine festgelegte Sequenz von Aminosäuren codiert. Wenn die Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins bekannt ist, kann daraus umgekehrt die das Protein codierende Nucleotidsequenz, wenn auch ungenau, abgeleitet werden. In der Praxis wird die partielle Aminosäuresequenz eines Proteins, dem Produkt des gewünschten Gens, durch chemische Verfahren bestimmt. Ausgehend von der Aminosäuresequenz des Proteins wird eine Gen-spezifische Oligonucleotid-Sonde synthetisiert, die in unterschiedlichem Ausmaß zum Gen homolog sein kann. Eine exakte Homologie kann nicht garantiert werden, da die Kenntnis der Aminosäuresequenz eines Proteins keine genaue Kenntnis der Nucleotidsequenz des das Protein codierenden Gens liefert. Selbst wenn die Homologie zwischen der Oligonucleotid-Sonde und dem Gen nicht präzise ist, können üblicherweise trotzdem Hybridisierungsbedingungen ermittelt werden, die der Oligonucleotid-Sonde eine spezifische Bindung an das Gen ermöglichen.
Dementsprechend wurde durch Isolierung des P-2-Gens das P-2-Protein aus einem Donor-Stamm von B. thuringiensis var. kürstaki gereinigt und die partielle Aminosäuresequenz des P-2-Proteins ermittelt. Eine P-2-Gen-spezifische Oligonucleotid-Sonde wurde ausgehend von der Aminosäuresequenz des P-2-Proteins synthetisiert. Das Oligonucleotid wurde radioaktiv markiert und verwendet, um in Hybridisierungsexperimenten transformierte Wirtskolonien, die die das P-2-Gen aus dem B.t. -Donorstamm tragenden rekombinanten Plasmide enthielten, zu identifizieren.

5.2 Clonierung des P-2-Toxingens vom Bacillus thuringiensis-Stamm HD263-1

Genauer gesagt wurden zur Clonierung des erfindungsgemäßen P-2-Toxingens Zellen des B.t.-Stamms HD1-1, ein Einzelkolonie-Isolat, das unmittelbar vom parentalen Stamm HD-1 (U.S.D.A., Cotton Insect Research Unit, Brownsville, Texas 78520) abstammte, in C2-Medien (1% Glucose, 0,2% Pepton, 0,5% "NZ-Amine A", 0,2% Hefeextrakt, 15 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 23 mM KH&sub2;PO&sub4;, 27 mM K&sub2;11PO&sub4;, 1 mM MgSO&sub4; x 7H&sub2;0, 600 µm CaCl&sub2;, 17 µM ZnSO&sub4; x 7H&sub2;0, 17 µM CuSO&sub4; x 5H&sub2;0 und 2 µM FeSO&sub4; x 7H&sub2;0) bis zu 72 Stunden bei 30ºC gezüchtet und die Sporen zusammen mit den Kristallen durch Zentrifugation geerntet. Das Sporen/Kristall-Pellet wurde unter melrrfachem Wechsel mit 1 M NaCl und anschließend unter mehrfachem Wechsel mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Toxin-Proteine wurden durch Inkubation des Sporen/Kristall-Präparats in 5 % β-Mercaptoethanol, 2% NaDodeSO&sub4;, 60 mM Tris (pH 6,8) und 10% Glycerin 7 min. bei 70ºC solubilisiert und die Sporen durch Zentrifugation entfernt. Mit dem Überstand wurde zur Trennung der Proteine eine Elektrophorese in NaDodeSO&sub4; enthaltenden Polyacrylamidgelen durchgeführt. Das Gel wurde mit Coomassie-Farbstoff angefärbt, und Gelscheibchen, die das P-2-Protein enthielten, wurden mit einer Rasierklinge ausgeschnitten. Das homogene P-2- Proteinpräparat wurde aus den Gelscheibchen elektroeluiert, nach Aceton-Fällung wurde die NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz des P-2-Proteins durch automatischen Edman- Abbau in einem Gasphasen-Sequenziergerät von Applied Biosystems (Modell 470A) ermittelt und auf einer Dupont-Zorbax-C18-Säule in einem Hewlett-Packard-HPLC-Gerät (Modell 1090) mit einem 1040-Diodenarray-Nachweisgerät analysiert. Die NH&sub2;-terminale Aminosäuresequenz des homogenen P-2-Proteins konnte, wie nachstehend dargestellt, ermittelt werden:

5.3 Oligonucleotid-Sonde für das P-2-Gen

Eine 62-mer Oligonucleotid-Sonde, die die Aminosäuren 4 bis 24 des NH&sub2;- Terminus des P-2-Proteins codiert, wurde auf einem DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems (Modell 380A) synthetisiert. Es wurde erkannt, daß aufgrund der Degeneration der Codons (bestimmte Aminosäuren werden jeweils von mehreren leicht unterschiedlichen Codons codiert) die Sequenz des synthetischen Oligonucleotids sich wahrscheinlich von der tatsächlichen NH&sub2;-terminalen Sequenz des P-2-Gens unterscheiden würde. Die Tatsache, daß das B.t.-Genom 68% A:T umfaßt, und die Kenntnis der Codon-Verwendung für zuvor clonierte und sequenzierte B.t. -Gene wurden jedoch zur Entwicklung einer Oligonucleotid-Sonde verwendet, die mit größter Wahrscheinlichkeit der tatsächlichen Sequenz des P-2-Gens entspricht. Die Oligonucleotid-Sonde wurde so entwickelt, daß sie nur an den NH2-terminalen codierenden Bereich des P-2-Gens bindet. Die Sequenz der P-2-Gen-spezifischen Oligonucleotid-Sonde war:
Diese DNA-Sonde kann nicht nur für die ursprüngliche Isolierung des P-2- Gens verwendet werden, sondern auch für eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform Mit dieser DNA-Sonde kann eine Durchmusterung jedes B.t.-Stamms durchgeführt werden, um festzustellen, ob das P-2-Gen (oder möglicherweise ein verwandtes Gen) natürlich vorhanden ist oder ob ein bestimmter transformierter Organismus das P-2-Gen enthält. So kann ferner auch die insektizide Wirküng dieses B.t.-Stamms ermittelt werden. Es liegt außerdem im erfindungsgemäßen Schutzbereich, daß diese Sonde ein kleineres oder größeres Oligonucleotid umfaßt. Die Sonde kann durch eines von zahlreichen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren (beispielsweise durch radioaktive oder enzymatische Markierung) und, wie nachstehend beschrieben, markiert werden.

5.4 Konstruktion einer Plasmid-Bank. die das P-2-Gen angereichert enthält

Die Oligonucleotid-Sonde wurde verwendet, um die Größe eines Restriktionsfragments der B.t. -DNA, das mindestens den NH2-terminalen codierenden Bereich des P-2-Gens enthielt, zu ermitteln. Für diese Untersuchung wurden der Stamm HD263-1, der ein Einzelkolonle-Isolat ist, das unmittelbar vom parentalen Stamm HD- 263 (U.S.D.A., Cotton Insect Research Unit, Brownsville, Texas 78520) abstammt, und der Stamm HD1-1, der ein Einzelkolonle-Isolat ist, das unmittelbar vom parentalen Stamm HD-1 (U.S.D.A., Brownsville, Texas) abstammt, als DNA-Quelle verwendet. Es war bekannt, daß beide Stämme das P-2-Kristallprotein produzieren. Die B.t.- Stämme EG2158 und HD567, die das P-2-Kristallprotein nicht produzieren, wurden als negative Kontrollen verwendet.
Die DNA wurde aus den verschiedenen Donorstämmen isoliert, nachdem die Zellen bei 30ºC in LB-Medium bis zur mittleren log-Phase gezüchtet worden waren. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM EDTA und 1 mg/ml Lysozym resuspendiert und 60 min bei 37º0 inkubiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von NaDodeSO&sub4; zu einer Endkonzentration von 0,2% lysiert. Die Zellysate wurden zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol und einmal mit einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24/1) extrahiert. Ein zehntel Volumen 3 M Naacetat und 2 Volumina EtOH wurden den Lysaten zugesetzt und die DNA wurde durch Aufwickeln auf einen Glasstab extrahiert. Die aufgewickelte DNA wurde 5 min. in 66% ETOH und 1 min. in Diethylether getaucht ("soaked"). Die aufgewickelte DNA wurde an der Luft getrocknet und in entionisiertem Wasser resuspendiert.
Hybridisierungsexperimente wurden durch Spaltung der Gesamt-DNA von jedem der Donorstämme mit dem HindIII-Restriktionsenzym, einer Elektrophorese der gespaltenen DNA in einem Agarosegel und einem Transfer der DNA vom Agarosegel auf ein Nitrocellulosefilter durch das Southem-Blot-Verfahren (J. Molec. Biol. 98 (1978), 503-517) durchgeführt. Das Nitrocellulosefilter wurde 16 Std. bei 32ºC in einer Lösung von 3 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat), 0,1% NaDodeSO&sub4;, 200 µg/ml Heparin, 10 x Denhardts-Lösung (1 x = 0,02% Rinderserumalbumin/0,02 % Ficoll/0,02 % Polyvinylpyrrolidon), die etwa 1 µg der P-2- Gen-spezifischen, mit radioaktivem Gamma-32P-ATP und T4-Kinase markierten Oligonucleotid-Sonde enthielt, inkübiert. Nach der Hybridisierung wurde das Nitrocellulosefilter mit 3 x SSC und 0,1 % NaDodeSO&sub4; eine Stunde bei 32ºC gewaschen und gegen einen Röntgenfum exponiert. Das erhaltene Autoradiogramm zeigte, daß die Oligonucleotid-Sonde spezifisch mit zwei HindIII-DNA-Fragmenten vom Stamm HD263-1 von etwa 9,0 und 5,0 kb hybridisierte. Die Sonde hybridisierte mit anscheinend identischen 9,0 und 5,0 kb-HindIII-DNA-Fragmenten vom Stamm HD1-1. Die Sonde hybridisierte nicht mit DNA-Restriktionsfragmenten der beiden kein P-2- Kristaliprotein synthetisierenden B.t.-Stämme EG2158 und HD567.
Es mußte ermittelt werden, welches der beiden HindIII-Fragmente, das 9, oder 5,0 kb-Fragment, am stärksten mit der Oligonucleotidsonde hybridisierte, da das am stärksten hybridisierende Fragment am wahrscheinlichsten das P-2-Gen enthielt. Die Stärke der Hybridisierung wird durch die höchste Waschtemperatur, bei der die Sonde an das DNA-Fragment auf dem Nitrocellulosefilter gebunden bleibt, gemessen. Entsprechend wurden mit dem Nitrocellulosefilter wiederholte Waschungen in 3 x SSC und 0,1 % NaDodeSO&sub4; bei sich erhöhenden Temperaturen mit einer Autoradiographie nach jedem Waschen durchgeführt, bis eine Temperatur (50ºC) erreicht war, bei der die radioaktive Sonde nicht länger mit dem 9,0 kb-Fragment, sondern erkennbar ausschließlich mit der 5,0 kb-Bande hybridisierte. Daraus wurde geschlossen, daß mindestens der den NH&sub2;-Terminus codierende Bereich des P-2-Gens auf dem 5,0 kb-HindIII- DNA-Fragment der Stämme HD263-1 und HD1-1 lag.
Eine mit dem P-2-Gen angereicherte Plasmid-Bank wurde durch HindIII- Spaltung der Gesamt-DNA von HD263-1, einer Elektrophorese der gespaltenen DNA in einem Agarosegel und Ausschneiden von Gelscheibchen, die eine Größe von etwa 4, bis 6,0 kb aufweisende HindIII-DNA-Fragmente enthielten, konstruiert. Eine Größe von 4,0 bis 6,0 kb aufweisende HindIII-Fragmente von HD263-1 wurden aus den Agarosegel-Scheibchen elektroeluiert, mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in die HindIII-Stelle von Plasmid pBR322, das mit HindIII gespalten und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert. Die alkalische Phosphatase erhöhte wesentlich die Wahrscheinlichkeit, daß aus pBR322 und einem HindIII-Fragment von HD263-1-DNA bestehende rekombinante Plasmide gebildet wurden. Das erhaltene Ligierungsgemisch bestand aus einer Bank von rekombinanten Plasmiden, die das P-2-Toxingen des Stamms HD263-1 angereichert enthielten.

5.5 Koloniehybridisierung und Isolierung eines das P-2-Gen enthaltenden 5.2 kb- HindIII-Fragments

Die das P-2-Gen angereichert enthaltende Plasmid-Bank wurde durch das CaCl&sub2;-Verfahren in den Ampicillin-empfindlichen Wirtsstamm von E. coli HB101 (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD.) transformiert. Der E. coli-Stannn HB101 synthetisiert kein P2-Protein und enthält daher erwartungsgemäß kein P-2-Gen. E. coli wurde als Wirtsstamm verwendet, da diese Zellen leicht mit rekombinanten Plasmiden transformiert werden. Sämtliche ein rekombinantes Plasmid erhaltende Wirtszellen würden Ampicillin-resistent werden. Nach der Exponierung gegen die rekombinanten Plasmide wurden die E. coli-Wirtszellen auf einem Ampicillin enthaltenden festen Medium verteilt, und die ein rekombinantes Plasmid enthaltenden Zellen konnten Kolonien bilden. Es wurde erwartet, daß jede einzelne Ampicillin-resistente Wirtskolonie viele identische Kopien eines rekombinanten Plasmids enthielt, das pBR322 und ein einziges HindIII-Fragment der Donorstamm HD263-1-DNA enthielt. Das HindIII-Fragment des Donorstamms im rekombinanten Plasmid würde sich jedoch von Kolonie zu Kolonie unterscheiden.
Etwa zweitausend einzelne Ampicillin-resistente Kolonien wurden durch Blotten auf Nitrocellulosefilter transferiert. Replika-Platten der Kolonien wurden zur späteren Verwendung, wie nachstehend beschrieben, aufbewahrt. Die in den Kolonien enthaltenen rekombinanten Plasmide wurden durch Behandlung der Kolonien mit NaOH und NH&sub4;Acetat an die Nitrocellulosefilter gebunden. Die erhaltenen Nitrocellulosefilter enthielten mehrere rekombinante Plasmide, von denen jedes von anderen rekombinanten Plasmiden physikalisch getrennt war. Die Nitrocellulosefilter wurden 16 Stunden bei 50ºC in einer Lösung aus 3 x SSC, 200 µg/ml Heparin, 0,1 % NaDodeSO&sub4;, 10 x Denhardts-Lösung und etwa 1 µg der P-2-Gen-spezifischen, radioaktiv markierten Oligonucleotid-Sonde hybridisiert. Die Filter wurden eine Stunde bei 50ºC in 3 x SSC und 0,1 % NaDodeSO&sub4; gewaschen und gegen einen Röntgenfilm exponiert. Das erhaltene Autoradiogramm zeigte, daß die Oligonucleotid-Sonde mit rekombinanten Plasmiden an vier verschiedenen Stellen auf den Nitrocellulosefiltem hybridisierte.
Durch einen Vergleich des Autoradiogramms mit den Replika-Platten der Kolonien konnten vier Kolonien identifiziert werden, deren rekombinanten Plasmide anscheinend mit der Oligonucleotid-Sonde hybridisierten.
Die rekombinanten Plasmide wurden aus allen vier Kolonien extrahiert. Die Plasmide wurden mit RindIII gespalten und in einem Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt. Drei der vier Plasmide bestanden aus pBR322 sowie einem 5,2 kb-HindIII- Fragment von HD263-1-DNA mit einer anscheinend identischen Größe. Die Plasmide wurden durch das Southem-Blot-Verfahren vom Agarosegel auf einen Nitrocellulosefilter transferiert. Das Nitrocellulosefilter wurde mit der radioaktiv-markierten Oligonucleotid-Sonde hybridisiert und gegen einen Röntgenfilm exponiert. Das erhaltene Autoradiogramm zeigte, daß die Oligonucleotid-Sonde ausschließlich mit dem 5,2 kb-HindIII-Fragment in allen drei rekombinanten Plasmiden hybridisierte. Eines dieser rekombinanten Plasmide mit der Bezeichnung pEG201 wurde für weitere Experimente und eine weitere Analyse ausgewählt. Die ursprüngliche pEG201 enthaltende E. coli-Kolonie erhielt die Bezeichnung EG1304.

5.6 Lage des P-2-Gens auf dem clonierten 5,2 kb-HindIII-Fragment

Es war wahrscheinlich, daß das clonierte 5,2 kb-HindIII-Fragment mindestens den NH&sub2;-terminalen codierenden Bereich des P-2-Gens enthielt. Die Gegenwart des P- 2-Gens auf dem 5,2 kb-Fragment wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft, um nach einem Bereich in dem clonierten 5,2 kb-Fragment zu suchen, der den NH2-Terminus des P-2-Proteins codierte. Da die Sequenzierung eines DNA-Fragments von mehr als zwei kb schwierig ist, mußte ein kleineres DNA-Fragment innerhalb des 5,2 kb- Fragments, das vermutlich das P-2-Gens enthielt, identifiziert werden. Daher wurde das Plasmid pEG201 mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, mit dem gespaltenen Plasmid wurde in einem Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt und Restriktionsfragmente des Plasmids wurden durch Blotten vom Gel auf ein Nitrocellulosefilter transferiert. Eine Hybridisierung des Filters mit der radioaktiv markierten Oligonucleotid-Sonde zeigte, daß die Sonde mit einem 1,3 kb-Sau3a- Restriktionsfragment der DNA spezifisch hybridisierte. Daher wurde angenommen, daß das 1,3 kb-Fragment mindestens den NH2-terminalen codierenden Bereich des P-2-Gens enthielt.
Das 1,3 kb-Fragment wurde von pEG201 in die DNA-Sequenzierungsvektoren mp 18 und mp 19 (Bethesda Research Laboratories Bethesda MD) subcloniert. Eine DNA-Sequenzierung des 1,3 kb-Fragments zeigte, daß es einen DNA- Bereich enthielt, der den NH&sub2;-Terminus des P-2-Proteins codierte. Dieses zeigte schlüssig, daß das clonierte 5,2 kb-HindIII-Fragment vom Donorstanim 11D263-1 das P- 2-Gen enthielt. Eine weitere DNA-Sequenzierung des 1,3 kb-Fragments zeigte, daß eine AccI-Restriktionsstelle 150 Nucleotide stromaufwärts des NH&sub2;-terminalen Methionincodons des P-2-Gens lag. Die Position dieser AccI-Stelle diente als Marker. So konnte die Lage des P-2-Gens im 5,2 kb-Fragment genau bestimmt werden, wie nachstehend beschrieben.
Die Lage und Richtung der Transkription des P-2-Gens auf dem clonierten 5,2 kb-Fragment wurde durch Spaltung des 5,2 kb-Fragments mit Acci in Kombination mit verschiedenen anderen Restriktionsenzymen ermittelt. Die Restriktionsfragmente wurden in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter geblottet. Durch Hybridisierung des Filters mit der radioaktiv-markierten P-2-Gen-spezifischen Oligonucleotidsonde konnte die Lage und Orientierung von verschiedenen Restriktionsfragmenten auf dem größeren 5,2 kb-Fragment ermittelt werden. Dieses Wissen ermöglichte die Ermittlung der genauen Position und Richtung der Transkription des P-2-Gens auf dem 5,2 kb-Fragment, wie durch den Pfeil in Figur 1 angezeigt. Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte von Plasmid pEG201. Die Kästchen zeigen Plasmidvektor-DNA. Der pBR322-Vektor wird durch offene Kästchen angezeigt. Die horizontale Linie zeigt clonierte B.t.-DNA aus dem Stamm HD263-1. Der große Pfeil zeigt den codierenden Bereich des P-2-Gens. Das Plasmid pEG204 wird nachstehend beschrieben. Es wurde angenommen, daß das P-2-Gen auf der Basis der angenommenen Größe (68 kd) des P-2-Proteins etwa 1,9 kb lang ist.

5.7 DNA-Sequenz des clonierten P-2-Gens

Es wurde angenommen, daß das vollständige oder mindestens der größte Teil des P-2-Gens im 2,2 kb-AccI-HindIII-Fragment im clonierten 5,2 kb-Fragment (Fig. 1) liegt. Daher wurde das 2,2 kb-AccI-HindIII-Fragment in die Sequenzierungsvektoren mp18 und mp19 subcloniert und die vollständige Sequenz des 2,2 kb-Fragments durch das Didesoxy-Verfahren von Sanger (Sanger, F., Nicklen, 5., & Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) ermittelt. Das 2,2 kb-Fragment enthielt erwartungsgemäß einen offenen Leserahmen (Protein codierender Bereich), der mit den NH&sub2;-terminalen Codons des P-2-Proteins begann. Die DNA-Sequenz des 2,2 kb- Fragments, das das erfindungsgemäße P-2-Gen einschloß, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des P-2-Proteins sind in Figur 2 dargestellt. Figur 2 zeigt die vollständige DNA-Sequenz des 2,2 kb-AccI-HindIII-Fragments, beginnend mit dem ersten Nucleotid der AccI-Stelle und endend mit dem letzten Nucleotid der HindIII-Stelle. Die AccI-Stelle liegt 150 Nucleotide stromaufwärts des NH2-terminalen Methionincodons des P-2-Gens. Die Größe des P-2-Proteins wurde, wie aus der P-2-Gensequenz abgeleitet, mit 66 547 D bestimmt.

5.8 Verwendung des clonierten P-2-Gens als spezifische Hybridisierungssonde

5.8.1 Identifizierung von P-2-Gene-enthaltenden nativen B.t.-Plasmiden

Ein Vorteil einer clonierten DNA-Sequenz ist, daß sie zur Identifizierung verwandter DNA-Sequenzen in nicht charakterisierten DNA-Proben verwendet werden kann. Beim P-2-Gen kann nun das clonierte Gen zum Nachweis der Gegenwart eines P-2-Gens in einem B.t.-Stamm verwendet werden. Die meisten B.t.-Stämme enthalten zahlreiche native Plasmide zusätzlich zur chromosomalen DNA. Von vielen dieser Stämme ist nicht bekannt, ob das P-2-Gen auf dem Chromosom oder auf einem der Plasmide liegt.
Um festzustellen, ob das clonierte P-2-Gen zum Nachweis der Lage eines P-2-Gens in einem nativen B.t.-Wirtsstamm verwendet werden kann, wurden die B.t.- Stämme HD263- 1, HD1 - 1, HD567 und HD278 wurden gemäß dem Verfahren von Eckhardt (T. Eckhardt, Plasmid 1(1978), 584-588) lysiert, und mit den Lysaten wurde in Agarosegelen eine Elektrophorese durchgefülrrt. Mit diesem Verfahren konnten sämtliche in einem bestünniten Stamm enthaltenen Plasmide nach Größe getrennt werden. Die getrennten Plasmide wurden durch das Southem-Blot-Verfahren vom Agarosegel auf ein Nitrocellulosefilter transferiert. Das Nitrocellulosefilter wurde mit dem radioaktiv markierten 2,2 kb-AccI-HindIII-Fragment (P-2-Gen) hybridisiert. Eine Autoradiographie des Nitrocellulosefilters zeigte, daß das P-2-Gen- Fragment ausschließlich mit einem Plasmid von etwa 110 MD in den P-2-produzierenden Stämmen HD263-1, HD1-1 und HD278 (Figur 3) hybridisierte. Das clonierte P-2-Gen hybridisierte mit keinem Plasmid des P-2-negativen Stamms HD567. Daher zeigte dieses Experiment, daß das clonierte P-2-Gen direkt zur Identifizierung P-2-Gene enthaltender nativer Plasmide in B.t.-Stämmen verwendet werden kann. Eine DNA-Hybridisierung mit dem clonierten P-2-Gen ermöglichte eine direkte Identifizierung eines einzigen, ein P-2-Gen tragenden Plasmids unter vielen solcher in B.t.-Stämmen vorkommenden Plasmide.

5.8.2 Identifizierung von P-2-Gene enthaltenden DNA-Restriktionsfragmenten

Das clonierte P-2-Gen vom B.t.-Stamm HD263-1 lag auf einem 5,2 kb- HindIII-DNA-Fragment. Es wurde durch ein Verfahren ermittelt, ob das clonierte P-2- Gen zur Identifizierung von ähnlichen DNA-Restriktionsfragmenten, die P-2-Gene von anderen B.t.-Stämmen enthielten, verwendet werden kann. Daher wurde die Gesamt- DNA der Teststämme HD1-1, HD278, HD567 und des ursprünglichen Donorstamms HD263-1 mit dem HindIII-Restriktionsenzyrn gespalten, und die gespaltene DNA wurde in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und anschließend vom Gel auf ein Nitrocellulosefilter transferiert. Das Filter wurde bei 55ºC mit dem radioaktiv-markierten 2,2 kb-AccI-HindIII-DNA-(P-2-Gen)-Fragment hybridisiert und nach dem Waschen bei 55ºC gegen einen Röntgenfilm exponiert.
Figur 3 (3A) ist ein Photo eines mit Ethidiumbromid gefärbten Eckhardt- Gels. Die in den verschiedenen B.t.-Stämmen vorhandenen nativen Plasmide sind sichtbar. 3A zeigt, daß die meisten B.t.-Stämme mehrere native Plasmide enthalten. Die Zahlen links von der Figur zeigen die Größe der Plasmide in Megadalton (MD).
Figur 3 (3B) ist ein Photo eines Autoradiogramms, das durch Hybridisierung des radioaktiv-markierten clonierten P-2-Gens mit den in 3A dargestellten Plasmiden hergestellt wurde. 3B zeigt, daß das clonierte P-2-Gen ausschließlich mit einem Plasmid von 110 MD in drei B.t.-Stämmen hybridisierte, die bekanntermaßen das P-2-Protein produzierten (HD-1, HD263-1 und HD278). Das clonierte P-2-Gen hybridisierte ferner mit einer DNA-Bande von 30 MD (Fig. 3 (3B)). Diese DNA-Bande bestand aus DNA- Fragmenten, die durch Spaltung des 110 MD-Plasmids erhalten wurden. Sehr große Plasmide wie das 110 MD-Plasmid werden während der Elektrophorese in Gelen vom Eckhardt-Typ häufig in kleinere Fragmente gespalten. Die spezifische Hybridisierung des clonierten P-2-Gens mit den 110 MD-Plasmiden zeigt, daß bei den Stämmen HDI-1, HD263-1 und HD278 nur die 110 MD-Plasmide das P-2-Gen trugen. Das clonierte P-2-Gen hybridisierte nicht mit einem Plasmid von einem das P-2-Protein (HD567) nicht produzierenden Stamm. Insgesamt zeigt die Figur 3 (3A und 38), daß das clonierte P-2-Gen als spezifische Sonde zur Identifizierung von P-2-Genen auf nativen B.t.- Plasmiden verwendet werden kann.
Figur 4 (4A) ist ein Photo eines mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegels, das HindIII-gespaltene DNA der Stämme HD1-1 (Bahn 2), HD567 (Bahn 3), HD278 (Bahn 4) und HD263-1 (Bahn 5) enthält. Figur 4 (4A) zeigt, daß die mit HindIII gespaltene Gesamt-DNA von B.t. in hunderte von unterschiedlich großen Fragmenten aufgelöst werden konnte. Die mit 1 markierte Bahn enthielt HindIII-gespaltene Lambda-DNA. Diese dient als Größenmarker. Die links dargestellten Zahlen zeigen die Größe der DNA-Fragmente in Kilobasen (kb).
Figur 4 (48) ist ein Photo eines Autoradiogramms, das durch Hybridisierung (bei 55ºC) des radioaktiv-markierten clonierten P-2-Gens mit den in 4A dargestellten HindIII-Fragmenten hergestellt wurde. Insgesamt zeigt die Figur 4 (4A und 4B), daß das clonierte P-2-Gen als spezifische Sonde zur Identifizierung von P-2-Gene-enthaltenden DNA-Restriktionsfragmenten verwendet werden kann.
Die Autoradiographie zeigte, daß das clonierte P-2-Gen erwartungsgemäß mit einem 5,2 kb-HindIII-Fragment vom Stamm HD263-1 hybridisierte (Figur 4, (48) Bahn 5). Das P-2-Gen hybridisierte ferner überraschenderweise mit einem 9,0 kb-HindIII- Fragment von Stamm HD263-1 (Figur 4 (48), Bahn 5). Das P-2-Gen hybridisierte mit 5,2 und 9,0 kb-HindIII-Fragmenten in Stamm HD1-1 (Figur 4 (48), Bahn 2) und mit HindIII-Fragmenten von 5,2 und 4,4 kb in Stamm HD278 (Figur 4 (48), Bahn 4). Das P-2-Gen hybridisierte nicht mit HindIII-Fragmenten des P-2-negativen Stamms HD567 (Figur 4 (48), Bahn 3). Das Nitrocellulosefilter wurde bei 80ºC erneut gewaschen und gegen einen Röntgenfilm exponiert. Das erhaltene Autoradiogramm zeigte, daß nach der höheren Waschtemperatur die markierte P-2-Gensonde signifikant weniger an die 9, und 4,4 kb-Fragmente als an das 5,2 kb-Fragment gebunden war (Figur 4 (4C), Bahnen 2, 4 und 5).
Vorstehend wurden mehrere bevorzugte Verwendungen des clonierten P-2- Gens beschrieben. Zunächst kann das clonierte P-2-Gen des Stamms HD263-1 zur Identifizierung von DNA-Restriktionsfragmenten, die P-2-Gene von anderen B.t.- Stämmen enthalten, verwendet werden. Das clonierte P-2-Gen hybridisierte beispielsweise mit zwei HindIII-Fragmenten des Stamms RD 1-1. Zweitens ermöglicht das clonierte Gen die Ermittlung der Zahl der in einem bestimmten B.t.-Stamm vorhandenen P- 2-Gene. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß der Stamm HD263-1 zwei P-2-Gene enthält, da die P-2-Gensonde mit zwei HindIII-Restriktionsfragmenten des Stamms HD263-1 hybridisierte Es ist signifikant, daß die P-2-Gen-spezifische Oligonucleotidsonde auch mit zwei HindIII-Fragmenten von 9,0 und 5,2 kb des Stamms HD263-1 hybridisierte.
-Die genaue Natur des P-2-Gens auf dem 9,0 kb-Fragment kann erst nach der Isolierung des 9,0 kb-Fragments und der Bestimmung seiner DNA-Sequenz ermittelt werden. Dies führt zu einer dritten bevorzugten Verwendung des clonierten P-2-Gens. Da das P-2-Gen mit einem 9,0 kb-HindIII-Fragment spezifisch hybridisierte, ist das clonierte P-2-Gen (oder Teile oder Derivate davon) daher eine ideale Sonde zur Isolierung dieses Fragments.
Viertens ermöglicht das clonierte P-2-Gen eine schnelle qualitative Einschätzung der Verwandtschaft zwischen P-2-Genen. Es kann beispielsweise abgeschätzt werden, daß das clonierte P-2-Gen mit dem im 5,2 kb-Fragment des Stamms HD1-1 enthaltenen P-2-Gen enger verwandt ist als mit den in den 9,0 oder 4,4 kb- HindIII-Fragmenten enthaltenen P-2-Genen. Dieser Verwandtschaftsgrad wurde dadurch direkt gezeigt, daß bei 80ºC die P-2-Gensonde stärker mit dem 5,2 kb-Fragment als mit dem 9,0 oder 4,4 kb-Fragment hybridisierte.

5.9 Weitere Reinigung des P-2-Toxins

Das P-2-Gen kann in jedes geeignete Plasmid insertiert werden, das anschließend zur Transformation eines geeigneten Mikroorganismus verwendet werden kann. Es ist selbstverständlich im erfindungsgemäßen Schutzbereich, daß andere Mikroorganismen als B.t. durch Aufnahme des P-2-Gens transformiert werden können, d.h., allgemein gesagt, Organismen der Gattungen Bacillus, Escherichia und Cyanobacterium. Bevorzugt zur erfindungsgemäßen Verwendung sind die Organismen Bacillus megaterium und Escherichia coli. Es ist ferner im erfindungsgemäßen Schutzbereich, daß andere B.t.-Stämme ebenfalls durch Aufnahme des P-2-Gens transformiert werden können.
Die so transformierten Mikroorganismen produzieren vorzugsweise P-2 in Mengen, die die in einem natürlichen B.t. -Wirtsstamm produzierte P-2-Menge bei weitem übertreffen. Das von einem transformierten Organismus produzierte P-2 ist vorzugsweise das einzige von diesem Organismus produzierte Delta-Endotoxin. So kann der Organismus selber allein oder als Teil einer insektiziden Zusammensetzung verwendet werden. Da P-2 vorzugsweise das einzige von dem Organismus produzierte Delta-Endotoxin ist, ist die Reinigung des P-2 von anderem zellulärem Material durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren wie Renografin-Dichtegradienten ein einfaches Verfahren.

5.10 Transformation von P-2 in Pflanzen

Es ist ebenfalls im erfindungsgemäßen Schutzbereich, daß das P-2-Gen (Fig. 2) direkt in eine Pflanze insertiert wird, so daß die Pflanze selber das P-2-Toxin produziert.
Eine gentechnische Behandlung von Pflanzen kann durchgeführt werden, indem die das P-2-Gen enthaltende gewünschte DNA in Pflanzengewebe oder Zellen unter Verwendung von DNA-Molekülen unterschiedlicher Form und unterschiedlichen Ursprungs eingeführt wird. Ohne darauf beschränkt zu sein, schließen diese ein: DNA- Moleküle, die von natürlich vorkommenden Pflanzenvektoren, beispielsweise dem Ti- Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, oder Pflanzen-Pathogenen, beispielsweise von DNA-Viren, wie dem Blumenkohlmosaik-Virus (CAMV) oder Geminiviren, RNA-Viren und Viroiden, stammen, DNA-Moleküle, die von instabilen Bestandteilen des Pflanzengenoms wie extrachromosomalen DNA-Elementen in Organellen (z. B. Chloroplasten oder Mitochondrien) oder nudeär codierten Kontrollelementen stammen, und DNA-Moleküle von stabilen Bestandteilen des Pflanzengenoms (z. B. Replikationsursprünge und weitere DNA-Sequenzen, die es der eingeführten DNA ermöglichen, in die Genome der Organellen oder des Kerns zu integrieren und normal zu replizieren, autonom zu replizieren, während der Zellteilung und sexuellen Reproduktion der Pflanze normal zu segregieren und in aufeinanderfolgenden Pflanzengenerationen vererbt zu werden).
Die das P-2-Gen enthaltende DNA kann in Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe durch infektiöse Plasmide, beispielsweise das Ti-Plasmid, Viren oder Mikroorganismen wie A. tumefaciens, unter Verwendung von Liposomen, durch Mikroinjektion durch mechanische Verfahren und als vollständige Chromosomen oder als Chromosomenfragmente direkt übertragen werden.

5.11 Das P-2-Protein enthaltende Produkte und Formulierungen

Das P-2-Delta-Endotoxin ist eine wirksame insektizide Verbindung mit einer Aktivität gegen Lipidopteren- und Dipteren-Insekten. Es ist daher im erfindungsgemäßen Schutzbereich, daß das P-2-Protein-Toxin als Insektizid (Wirkstoff) allein, vorzugsweise in homogener oder reiner Form und mit der Aminosäuresequenz von Fig. 2, oder als Einschluß in oder in Assoziation mit einem transformierten Mikroorganismus, der ein cloniertes P-2-Gen exprimiert, oder in einem Gemisch von B.t. oder anderen transformierten sporulierenden Mikroorganismen, die das P-2 in Sporen oder anders enthalten, verwendet wird. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die mindestens das P-2 enthalten, werden in einer insektizid wirksamen Menge aufgetragen, die in Abhängigkeit von derartigen Faktoren wie beispielsweise den spezifischen zu bekämpfenden Lepidopteren- oder Dipteren-Insekten, der spezifischen zu behandelnden Pflanze und dem Verfahren zur Verwendung der insektizid wirksamen Zusammensetzungen variiert. Die bevorzugten Insektizid-Formulierungen werden hergestellt, indem P-2 allein oder als Einschluß in oder in Assoziation mit einem transformierten Organismus mit dem gewünschten Träger vermischt wird. Die Formulierungen können als Stäubemittel oder als Suspension in (pflanzlichem oder mineralischem) Öl oder Wasser, netzbares Pulver oder in jedem anderen für eine Verwendung in der Landwirtschaft geeigneten Material unter Verwendung der geeigneten Träger-Adjuvanzien verabreicht werden. Geeignete Träger können fest oder flüssig sein und entsprechen den üblicherweise in Formulierungsverfahren verwendeten Substanzen, z. B. natürliche oder regenerierte mineralische Substanzen, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Netzmittel, Klebrigmacher, Bindemittel oder Düngemittel.
Die ein festes oder flüssiges Adjuvans enthaltenden Formulierungen werden in einer üblichen Weise hergestellt, z. B. durch homogenes Vermischen und/oder Zerreiben der Wirkstoffe mit Streckmitteln, z. B. Lösungsmitteln, festen Trägern und gelegentlich grenzflächenaktiven Verbindungen (Surfactanten).
Geeignete flüssige Träger sind pflanzliche Öle, beispielsweise Kokosnuß- oder Soyabohnenöl, Mineralöle oder Wasser. Die verwendeten festen Träger, z. B. für Stäubemittel und dispergierbare Pulver, sind üblicherweise natürliche Mineralfasern, beispielsweise Calcit, Talküm, Kaolin oder Attapulgit. Zur Verbesserung der physikalischen Eigenschaften können außerdem stark dispergierte Kieselsäure oder stark dispergierte absorbierende Polymere zugesetzt werden. Geeignete granulierte absorbierende Träger sind porös, beispielsweise Bims, Ziegelbruch, Sepiolith oder Bentonit. Geeignete nicht-absorbierende Träger sind Materialien wie Silikat oder Sand. Ferner können zahlreiche vorgranulierte Materialien oder anorganische oder organische Gemische verwendet werden, z. B. besonders Dolomit oder pulverisierte Pflanzenreste.
In Abhängigkeit von der Natur der zu formulierenden Wirkstoffe sind geeignete grenzflächenaktive Mittel nicht-ionische, kationische und/oder anionische Surfactanten mit guten emulgierenden, dispergierenden und benetzenden Eigenschaften. Der Begriff "Surfactant" schließt auch Gemische von Surfactanten ein.
Geeignete anionische Surfactanten können sowohl wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische Surfactanten sein.
Geeignete Seifen sind die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder nichtsubstituierte Ammoniumsalze der höheren Fettsäuren (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;), z. B. die Natrium- oder Kaliumsalze der Öl- oder Stearinsäure, oder natürliche Fettsäuregemische, die z. B. aus Kokosnuß oder Talgöl erhalten werden können. Weitere stabile Surfactanten sind außerdem die Fettsäuremethyltaurinsalze, sowie modiftzierte und nicht-modifizierte Phospholipide.
Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Surfactanten verwendet, besonders Fett-Sulfonate, -Sulfate, sulfonierte Benzimidazol-Derivate oder Alkylarylsulfonate.
Die Fett-Sulfonate oder -Sulfate sind üblicherweise Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder unsubstituierte Ammoniumsalze und enthalten üblicherweise einen C&sub6;-C&sub2;&sub2;-Alkylrest, z. B. das Natrium- oder Calciumsalz von Dodecylsulfat oder ein Gemisch von Fett-Alkohol-Sulfaten, die von Fettsäuren erhalten werden. Diese Verbindungen umfassen ferner die Salze der Sulfonsäureester und Sulfonsäuren der Fettalkohol/Ethylenoxid-Addukte. Die sulfonierten Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise 2 Sulfonsäuregruppen und ein Fettsäureradikal, das etwa 8 bis 22 Kohlenstoffatome enthält. Beispiele von Alkylarylsulfonaten sind die Natrium-, Calcium- oder Triethanolaminsalze der Dodecylbenzolsulfonsäure, Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder eines Naphthalinsulfonsäure/Formaldehyd-Kondensationsprodukts. Ebenfalls geeignet sind entsprechende Phosphate, z. B. Salze des Phosphorsäureesters eines Addukts von p-Nonylphenol mit 4 bis 14 Mol Ethylenoxid.
Nichtionische Surfactanten sind vorzugsweise ein Polyglycoletherderivat, ein aliphatischer oder cycloaliphatischer Alkohol oder gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren und Alkylphenole, wobei das Derivat 3 bis 10 Glycolethergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome in der (aliphatischen) Kohlenwasserstoffeinheit und 6 bis 18 Kohlenstoffatome in der Alkyleinheit der Alkylphenole enthält.
Weitere geeignete nichtionische Surfactanten sind die wasserlöslichen Addukte von Polyethylenoxid mit Alkylpropylenglycol, Ethylendiaminpolypropylenglycol und Alkylpolypropylenglycol, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome in der Alkylkette enthalten, wobei die Addukte 20 bis 250 Ethylenglycolethergruppen und 10 bis 100 Propylenglycolethergruppen enthalten.
Repräsentative Beispiele von nichtionischen Surfactanten sind Nonylphenolpolyethoxyethanole, Castoröl, Glycolether, Polypropylen/Polyethylenoxid-Addukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol, Ethylenglycol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester von Polyoxyethylensorbitan, beispielsweise Polyoxyethylensorbitantrioleat, sind ebenfalls geeignete nichtionische Surfactanten.
Kationische Surfactanten sind vorzugsweise quatemäre Ammonlumsalze, die als Substituenten am Stickstoff mindestens ein C&sub8;-C&sub2;&sub2;-Alkylradikal und als weitere Substituenten nichtsubstituierte oder halogenierte Niederalkylbenzylradikale oder hydroxylierte Niederalkylradikale enffialten. Die Salze sind vorzugsweise Halogenide, Methylsulfate oder Ethylsulfate, z. B. Stearyltrimethylammoniumchlorid.

5.12 Consensus-Delta-Endotoxin-Protein-Homologie

Eine Computersuche wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das P-2-Gen zu irgendwelchen anderen Genen, deren Sequenzen veröffentlicht worden waren, homolog war. Es wurde keine DNA-Sequenz-Homologie zwischen dem P-2-Gen und anderen Genen festgestellt. Es wurde jedoch überraschenderweise festgestellt, daß ein gewisses Maß an Aminosäuresequenzhomologie zwischen den P-2- und P-1-Proteinen existierte. Figur 6 zeigt, daß die P-2- und P-1-Proteine einen Homologiebereich von 37% über einen Abschnitt von etwa 100 Aminosäuren aufwiesen.
Konservierte Aminosäuresequenzen, die innerhalb von ansonsten nicht-homologen Proteinen gefunden werden, weisen häufig auf wichtige funktionelle Domänen für die Proteine hin. Es ist vorhersehbar, daß die in Figur 6 dargestellten konservierten Aminosäuren eine "aktive Stelle" sind, die für die lethale Wirküng von P-1- und P-2- Proteinen auf Lepidopteren-Larven verantwortlich ist. Daher können mit diesem Protein ortsspezifische Mutagenese-Experimente durchgeführt werden, um eine Änderung der Aminosäurezusammensetzung zu erreichen, so daß spezifischer eine gewünschte Veränderung der Toxizität erzielt werden kann.
Die Bedeutung dieses 100 Aminosäuren langen Abschnitts kann durch Subclonierung des diese Aminosäuren codierenden 300 bp-DNA-Fragments ermittelt werden. Dies wäre auch ein Mittel zur Herstellung dieses Proteins in B.t., B. megaterium oder E. coli. Die Subclonierung kann unter Verwendung der ortsspezifischen In vitro-Mutagenese erreicht werden, wobei Restriktionsstellen, die an das dieses Protein aus 100 Aminosäuren codierende 300 bp-DNA-Fragment grenzen, erzeugt werden. Diese Restriktionsstellen könnten anschließend zum präzisen Ausschneiden des DNA- Fragments verwendet werden. Das DNA-Fragment könnte anschließend stromabwärts eines Promotors und einer Ribosomenbindungsstelle in einem Bacillus-Vektor oder einem anderen geeigneten Vektor insertiert werden. Der Bacillus-Vektor könnte gentechnisch so behandelt werden, daß er den Promotor und die Ribosomenbindungsstelle des P-2-Gens enthält. Das erhaltene rekombinante Plasmid könnte anschließend in einen geeigneten Bacillus-Stamm (oder einen anderen geeigneten Organismus, wie hier beschrieben) transformiert werden, und die lethale Wirküng des rekombinanten Stamms auf Larven könnte gemessen werden. Der transformierte Organismus würde ferner als Mittel zur Herstellung dieses Proteins dienen. Der transformierte Organismus oder das Protein selber oder ein Gemisch aus beiden kann in einer insektiziden Zusammensetzung so wie das P-2-Toxinprotein verwendet werden.
Es ist möglich, daß das 100 Aminosäuren lange Polypeptid, das vom rekombinanten Plasmid synthetisiert würde, von Proteasen in der Bacillus-Zelle abgebaut würde. Zur Umgehung dieses potentiellen Problems könnte ein Protease-negativer Bacillus-Stamm, wie der von Wong et al. (Wong, S., Kawamura, F., und Doi, R., J. Bacteriol. 168 (1986), 1005-1009) beschriebene, zur Expression verwendet werden.

6.0 Beispiele

Die insektizide Wirküng von transformiertem oder nichttransformiertem Bacillus megaterium und von Escherichia coli wurde ermittelt, indem verschiedene Mengen dieser Mikroorganismen in einer an Insekten verfütterten Testnahrung eingeschlossen wurden. Nach der Fütterung wurde die Sterblichkeit der Insekten gemessen. Insbesondere wurde der Mikroorganismus bis zur stationären Phase auf einem Grundmedium aus festem Agar zwei Tage bei 30ºC gezüchtet. Für Plasmide enthaltendes E. coli wurden 40 µg/ml Ampicillin enthaltende LB-Medien verwendet. Für Plasmide enthaltendes B. megaterium wurden 10 µg/ml Tetracyclin enthaltende DS- Medien verwendet. Die Mikroorganismen wurden durch Abschaben mit einem Spatel von dem festen Medium geerntet. Das Naß-Gewicht der geemteten Bakterien wurde ermittelt, und die bakteriellen Zellen wurden zu einer bekannten Konzentration in entionisiertem Wasser resuspendiert. Verdünnungsreihen der suspendierten Bakterienzellen wurden hergestellt und 200 µl jeder Verdünnung auf 3 ml einer künstlichen Nahrung auf einer Grundlage aus festem Agar in einem Nahrungsbehälter örtlich aufgetragen. Die obere Oberfläche der Nahrung war 600 Quadratmillimeter. Bei Heliothis enthielt die Nahrung Sojamehl und bei Lymantria dispar Weizenkeime. Eine frischgeschliipfte Larve wurde in jeden Nahrungsbehälter gegeben und die Sterblichkeit nach sieben Tagen ermittelt.
Der LCSO-Wert (Gewicht der bakteriellen Zellen, das zum Abtöten von 50% der Larven erforderlich ist) wurde mit einer Probit-Analyse der Insektensterblichkeit berechnet (R. J. Daum., A Revision of Two Computer Programs for Probit Analysis. Bulletin of the Entomological Soc. of America Bd. 16(1), 5. 10-15).

6.1 Beispiel 1 - Biotest des Expressionsprodukts des clonierten P-2-Gens in E. coli

Heliothis virescens-Larven wurden mit einer Standardnahrung gefüttert, der E. coli-Zellen zugesetzt wurden, die verschiedene Plasmide enthielten und von denen bekannt war, daß sie entweder das P-2-Gen enthielten oder nicht enthielten. Nachdem die Larven sieben Tage so gefüttert worden waren, wurden ihr Wachstum und Überleben mit den Ergebnissen, die nachstehend in Tabelle 1 beschrieben sind, ermittelt. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß das clonierte P-2-Gen tatsächlich in E. coli, einem nicht-sporulierenden Bakterium, exprimiert wird und daß das transformierte E. coli durch das Expressionsprodukt dieses clonierten Gens signifikant toxischer für Heliothis virescens-Larven als E. coli ohne das P-2-Gen ist. Tabelle I

6.2 Beispiel 2 - Transformation des P-2-Gens in Bacillus megaterium

Plasmid pEG201 (das das P-2-Gen enthielt) repliziert lediglich in Gram-negativen Stämmen, beispielsweise in E. coli. Das P-2-Gen wurde im E. coli-Stamm EG1304, der pEG201 enthielt, exprimiert, jedoch nur in geringen Mengen (vgl. die Daten des Biotests, Tabelle 1). In diesem Beispiel wurde untersucht, ob das clonierte P- 2-Gen in anderen Bacillusstämmen in größeren Mengen exprimiert wird. Zur Untersuchung der Expression des clonierten P-2-Gens in einem Bacillusstamm war es zunächst erforderlich, ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren, das das P-2-Gen enthielt und in Bacillus replizieren konnte. Ein das P-2-Gen enthaltender Bacillus-E. coli- "Shuttle-Vektor" wurde konstruiert. Der Begriff "Shuttle-Vektor" zeigt, daß das Plasmid sowohl in Bacillus als auch in E. coli replizieren kann. Der E. coli-Bacillus- Shuttle-Vektor wurde durch Spaltung des Bacillus-Plasmids pBC16 (Tetracyclinresistenz) mit Sphl, Ligierung des gespaltenen Plasmids in die Sphl-Stelle von pEG201 (Ampicillinresistenz) und Transformation von E. coli zum Erhalt einer Ampicillin- und Tetracyclinresistenz konstruiert.
Eine tet- und amp-resistente E. coli-Transformante enthielt ein Plasmid (mit der Bezeichnung pEG204), das aus in die Sphl-Stelle von pEG201 insertiertem pBC16 bestand (Figur 1). Figur 1 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pEG204. Die eingerahmten Bereiche zeigen Plasmid-Vektor-DNA. Der nicht schraffierte Bereich ist pBR322-DNA (E. coli-Replikation) und der schraffierte Bereich pBC16-DNA (Bacillus- Replikation). Die horizontale Linie entspricht clonierter DNA vom Stamm HD263-1.
Der große Pfeil zeigt den codierenden Bereich des P-2-Gens. pEG204 wurde in Bacillus megaterium (NRRL-Hinterlegungsnummer B-18203) transformiert und eine pEG204 enthaltende Tetracyclin-resistente Transformante (mit der Stammbezeichnung EG1312) für weitere Untersuchungen ausgewählt.
In diesem Beispiel wurde untersucht, ob das clonierte P-2-Gen im rekombinanten B. megaterium-Stamm EG 1312 (pEG204) exprimiert wurde. Die Genexpression wurde durch eine NaDodeSO&sub4;/Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermittelt. Grundsätzlich umfaßte das Verfahren die Herstellung von Zellysaten, eine Elektrophorese von Zellysaten in einem NaDodeSO&sub4;/Polyacrylamidgel und Anfärbung des Gels zur Sichtbarmachung der Proteine.
Das Verfahren wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt: B. megaterjum-Zellen wurden 48 Std. bei 30ºC auf 10 µg/ml Tetracyclin enthaltenden DS- Platten gezüchtet. B. thuringiensis-Stämme wurden ähnlich wie B. megaterium gezüchtet, ausgenommen daß die DS-Platten kein Tetracyclin enthielten. Danach hatten beinahe sämtliche Zellen die stationäre Wachstumsphase erreicht. Die Zellen wurden mit einem Spatel geerntet und in entionisiertem Wasser resuspendiert. Ein Teil der Zellsuspension wurde 1:2 (Vol. Vol.) mit vorgewärmtem (70ºC) Gelauftragspuffer (5 % ß-Mercaptoethanol, 2 % NaDodeSO&sub4;, 60 mM Tris (pH 6,8) und 10 % Glycerin) vermischt und 7 min bei 70ºC ihkubiert. Die Suspension wurde kürz zentrifugiert, nach der Zentrifugation der Überstand sofort auf ein NaDodeSO&sub4;/Polyacrylamidgel aufgetragen und die Proteine im Überstand gemäß dem Laemmli-Verfahren (J. Mol. Biol. 80 (1973), 575-599) durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Proteine im Gel wurden durch Anfärbung des Gels mit Coomassie-Farbstoff sichtbar gemacht.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse dieser Analyse. Figur 5 ist ein Photo eines NaDodeSO&sub4;/Polyacrylamidgels, das, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde. Die in Fig. 5 als STND markierte Bahn enthielt Protein-Molekülargewichtsstandards. Die Zahlenangaben auf der rechten Gelseite zeigen Proteingrößen in Kilodalton (kD). Die als HD 1 - 1 markierte Bahn enthielt Extrakte dieses B.t.-Stamms. Die Hauptproteinbande, die dem P-2-Protein entspricht, ist durch einen Pfeil angegeben. Die mit P-2 markierte Bahn enthielt einen Teil des gereinigten P-2-Proteins. Das P-2- Protein wurde, wie vorstehend beschrieben, gereinigt.
Die in Fig. 5 als EG1311 und EG1312 markierten Bahnen enthielten Extrakte von denjenigen B. megaterium-Stämmen, die pBC16 bzw. pEG204 (P-2) enthielten. Ein Vergleich der Bahnen von EG131 1 und EG1312 zeigte, daß Extrakte des Stamms EG1312 (pEG204) ein Hauptprotein enthielten, das in der Größe dem des P-2-Proteins entsprach. Dieses Protein war in Extrakten des Stamms EG131 1 (pBC16) nicht vorhanden. Dies zeigt, daß das clonierte P-2-Gen enthaltende B. megaterium große Mengen des P-2-Proteins synthetisierte. Bei einer Betrachtung unter dem Lichtmikroskop enthielten die Zellen von Stamm EG1312 ferner anscheinend phasenhelle Protein- Einschlußkörperchen, die für kristalline Toxine charakteristisch sind.

6.3 Biologischer Test des Expressionsprodukts des clonierten P-2-Gens in B. megate rium

Durchgeführte Standardtoxizitätstests zeigten, daß der Stamm Bacillus megaterium EG1312 einen LD50-Wert (50% getötete Larven) von 1,4 µg Bakterienzellen pro Insektennahrungsgefäß aufwies, wenn er entweder an Heliothis virescens (H. v.)- oder Lymantria dispar (L. d.)-Larven verfüttert wurde. Im Gegensatz dazu tötete der Kontrollstamm von Bacillus megaterium, der den Plasmidvektor pBC16 ohne das P-2- Gen enthielt, weder H. v.- noch L. d.-Larven bei einer Dosis von 10 µg Bakterienzellen pro Nahrungsgefäß.
Der Stamm B. megaterium EG1312 (pEG204-P-2) wurde ebenfalls auf seine Toxizität gegen A. aegypti untersucht. Eine Zellsuspension wurde hergestellt, indem die Stämme EG131 1 (pBC 16-negative Kontrolle) und EG1312 48 Stunden bei 30ºC auf festem, 10 µg/ml Tetracyclin enthaltendem DS-Medium gezüchtet wurden. Die Zellen wurden mit einem Spatel geerntet und in entionisiertem Wasser resuspendiert. Verdünnungsreihen der Zellsuspensionen wurden hergestellt. Zwanzig Larven (dritte oder vierte Erscheinungsform ("instar")) von A. aegypti wurden in 100 ml der Zellsuspensionen gegeben und die Sterblichkeit nach 48 Std. bestimmt. Die Ergebnisse (nachstehend) zeigten, daß der Stamm EG1312(P-2) für Mückenlarven toxisch ist. Im Gegensatz dazu war B. megaterium (Stamm EG131 1), der das Vektorplasmid pBC16 allein enthielt, für Mückenlarven nicht toxisch. Tabelle II

7.0 Hinterlegung von Mikroorganismen

Der Schutzbereich der Erfindung umfaßt sowohl die Transformation zahlreicher sporulierender als auch nichtsporulierender Mikroorganismen mit dem P-2-Gen, wie hier beschrieben. Beispiele für Mikroorganismen, die gentechnisch verändert werden können, wie hier gelehrt, sind die der Gattungen Bacillus, Escherichia und Cyanobacterium. Die Organismen Bacillus megaterium und Escherichia coli werden in dieser Erfindung bevorzugt verwendet. Ferner wurden die nachstehend dargestellten Bacillus thuringiensis-, Bacillus megaterium- und E. coli-Stämme, die in dieser Erfindung ebenfalls bevorzugt verwendet werden und die aufgeführten Plasmide tragen, am 14. April 1987 bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, hinterlegt und erhielten die aufgeführten Hinterlegungsnummern:
Der Schutzbereich der Erfindung ist nicht auf die hinterlegten Mikroorganismen beschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen lediglich einzelne Beispiele eines Gesichtspunkts der Erfmdung darstellen sollen. Verschiedene Modifikationen der Erfindung neben den hier dargestellten und beschriebenen können vom Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung und den angefügten Figuren abgeleitet werden.

Claims

1. Gen, das ein Protein mit insektizider Aktivität gegen Lepidopteren codiert und das

(a) das P-2 Toxingen von Bacillus thuringiensis ist, welches in dem in Form des rekombinanten Plasmids pEG204 als NRRL B-18203 hinterlegten 2,2 kB HindIII- AccI-Fragment enthalten ist und ein P-2 Toxin mit der N-terminalen Aminosäuresequenz

codiert;

(b) ein Gen ist, das dieselbe Aminosäuresequenz wie die vorstehend in (a) codiert; oder

(c) ein mutierter, rekombinanter oder gentechnisch veränderter Abkömmling der vorstehend in (a) und (b) gekennzeichneten Gene ist.

2. Gen nach Anspruch 1, wobei das Protein ferner eine insektizide Aktivität gegen Dipteren aufweist.

3. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Gen nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Rekombinanter Mikroorganismus, der sporuliert oder nicht-sporuliert und dadurch gekennzeichnet ist, daß er das Gen nach Anspruch 1 oder 2 oder den Vektor nach Anspruch 3 enthält.

5. Hybridisierungssonde, die spezifisch für das P-2 Gen ist, abgeleitet aus der DNA-Sequenz des Gens nach Anspruch 1 oder 2.

6. Verfahren zur Herstellung eines Bacillus thuringiensis P-2 Toxins, wobei man

a) das Gen für das P-2 Toxin nach Anspruch 1 oder 2 in ein Plasmid einfügt;

b) einen Mikroorganismus mit dem in Schritt a) erhaltenen Plasmid transformiert; und

c) die in Schritt b) erhaltenen Mikroorganismen vermehrt, wobei das P-2 Toxin in den Mikroorganismen exprimiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das P-2 Toxin durch Lyse des Mikroorganismus aus diesem extrahiert wird.

8. Escherichia coli-Bakterium, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gen nach Anspruch 1 oder 2 enthält und bei der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18204 hinterlegt ist.

9. Bacillus megaterium-Baktenum, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gen nach Anspruch 1 oder 2 enthält und bei der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18203 hinterlegt ist.

10. Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit der DNA-Sequenz des Gens nach Anspruch 1 oder dem Vektor nach Anspruch 3 transformiert ist.

11. Pflanze nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie P-2 Toxin produziert.

12. Protein mit insektizider Aktivität gegen Lepidopteren, das homogen ist und durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 codiert ist.

13. Protein nach Anspruch 12, das ferner insektizide Aktivität gegen Dipteren aufweist.

14. Insektizide Zusammensetzung, enthaltend ein Protein nach Anspruch 12 oder 13 oder einen Mikroorganismus nach Anspruch 4, 8 oder 9.