JPH0636743B2 - バチルス・スリンギエンシスp‐2毒素の遺伝子、タンパク質および関係する殺虫剤組成物 - Google Patents
バチルス・スリンギエンシスp‐2毒素の遺伝子、タンパク質および関係する殺虫剤組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 1.0序論 本発明は、生物学的殺虫剤として有用であり、そしてP
−2毒素、またはP−2デルタ−内毒素として知られて
いる、結晶質タンパク質に関する。それはバチルス・ス
リンギエンシス(Bacillus Thuringiensis)のある種の菌
株により天然に産生される。さらに詳しくは、本発明
は、P−2デルタ−内毒素をコードする遺伝子の種々の
微生物におけるクローニングおよび発現、およびP−2
毒素それ自体組み込んだ関係する新規な殺虫剤組成およ
びP−2遺伝子で形質転換した微生物に関する。
−2毒素、またはP−2デルタ−内毒素として知られて
いる、結晶質タンパク質に関する。それはバチルス・ス
リンギエンシス(Bacillus Thuringiensis)のある種の菌
株により天然に産生される。さらに詳しくは、本発明
は、P−2デルタ−内毒素をコードする遺伝子の種々の
微生物におけるクローニングおよび発現、およびP−2
毒素それ自体組み込んだ関係する新規な殺虫剤組成およ
びP−2遺伝子で形質転換した微生物に関する。
2.0発明の背景 2.1商用農薬:一般的考察 毎年、世界の商業的に重要な農作物は昆虫および他の有
害生物(pest)の蔓延で失われている。これらの有
害生物による損害は、食物、繊維材料、および種々の家
庭の植物を包含する商業的に重要なすべての分野に広が
り、そして経済的損害は数百万ドルになる。こうして、
このような蔓延から作物を保護することは極めて重大な
問題である。
害生物(pest)の蔓延で失われている。これらの有
害生物による損害は、食物、繊維材料、および種々の家
庭の植物を包含する商業的に重要なすべての分野に広が
り、そして経済的損害は数百万ドルになる。こうして、
このような蔓延から作物を保護することは極めて重大な
問題である。
広いスペクトルの農薬(pesticide)は、作物の保護に最
も普通に使用されているが、これらの薬剤の無差別の使
用は植物の自然の防御因子の破壊に導くことがある。さ
らに、それらの広いスペクトルの活性のため、化学的農
薬は非標的有機体、例えば、有益な昆虫および破壊的有
害生物の寄生体を破壊することがある。これらは、ま
た、しばしば動物およびヒトに毒性であり、こうして、
適用するとき、環境的危険を持ち出す。
も普通に使用されているが、これらの薬剤の無差別の使
用は植物の自然の防御因子の破壊に導くことがある。さ
らに、それらの広いスペクトルの活性のため、化学的農
薬は非標的有機体、例えば、有益な昆虫および破壊的有
害生物の寄生体を破壊することがある。これらは、ま
た、しばしば動物およびヒトに毒性であり、こうして、
適用するとき、環境的危険を持ち出す。
さらに、昆虫および他の有機体は、しばしば、これらの
農薬に反復して暴露されるとき、これらに対する抵抗性
を発現する。農薬の実用性を減少することに加えて、す
くない有害生物の抵抗性系統は、有益な寄生体有機体の
減少のために、主要な蔓延の問題となることがある。
農薬に反復して暴露されるとき、これらに対する抵抗性
を発現する。農薬の実用性を減少することに加えて、す
くない有害生物の抵抗性系統は、有益な寄生体有機体の
減少のために、主要な蔓延の問題となることがある。
これは広いスペクトルの農薬を使用するとき直面する主
要な問題である。要求されることは、狭いスペクトルの
活性と、その活性を延長した時間にわたって維持する能
力、すなわち、それに対する抵抗が非常により遅いか、
あるいはまったくない、とを兼備した生物分解性農薬で
ある。生物農薬(biopesticide)はこれに関して有用であ
ると思われる。
要な問題である。要求されることは、狭いスペクトルの
活性と、その活性を延長した時間にわたって維持する能
力、すなわち、それに対する抵抗が非常により遅いか、
あるいはまったくない、とを兼備した生物分解性農薬で
ある。生物農薬(biopesticide)はこれに関して有用であ
ると思われる。
2.2生物学的農薬 生物農薬、またバイオラショナル(biorational)と呼ば
れている、は、農作物の昆虫、菌・かび、および雑草の
蔓延を抑制するために使用される。このような物質は、
バクテリアの成長培地を使用するか、あるいは使用しな
いで、蔓延因子に対して毒性の物質(例えば、毒素)を
産生するバクテリアからなることができる。このような
バクテリアは、標準の適用方法により植物へ直接適用す
ることができ、そして典型的には延長した期間にわたっ
て、作物により耐えられ、反復適用の必要性を減少す
る。
れている、は、農作物の昆虫、菌・かび、および雑草の
蔓延を抑制するために使用される。このような物質は、
バクテリアの成長培地を使用するか、あるいは使用しな
いで、蔓延因子に対して毒性の物質(例えば、毒素)を
産生するバクテリアからなることができる。このような
バクテリアは、標準の適用方法により植物へ直接適用す
ることができ、そして典型的には延長した期間にわたっ
て、作物により耐えられ、反復適用の必要性を減少す
る。
有害生物の抑制の生物学的方法の使用は、最初に、菌・
かびの病気がカイコにおいて発見された1895年にお
いて示唆された。しかしながら、乳化病のバクテリアの
ニホンカブトムシバチルス・ポピリアエ(Bacillus popi
lliae)の胞子を使用してアメコガネ(Japanese beetle)
を抑制するために使用した1940年まで、最初に生物
学的有害生物の抑制は成功しなかった。1960年代後
半において、チョウおよびガの幼虫に対して致死的な毒
素を分泌するバクテリアの新しい菌株の発見は、商業的
生物農薬のための段階を設定した。バチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus Thuringiensis)(以後、「B.
t.」と互換的に呼ぶ)と命名するバクテリアは、現在
最も広く使用されている生物農薬である。
かびの病気がカイコにおいて発見された1895年にお
いて示唆された。しかしながら、乳化病のバクテリアの
ニホンカブトムシバチルス・ポピリアエ(Bacillus popi
lliae)の胞子を使用してアメコガネ(Japanese beetle)
を抑制するために使用した1940年まで、最初に生物
学的有害生物の抑制は成功しなかった。1960年代後
半において、チョウおよびガの幼虫に対して致死的な毒
素を分泌するバクテリアの新しい菌株の発見は、商業的
生物農薬のための段階を設定した。バチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus Thuringiensis)(以後、「B.
t.」と互換的に呼ぶ)と命名するバクテリアは、現在
最も広く使用されている生物農薬である。
2.3バチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thuringi
ensis)およびデルタ−内毒素 バチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thuringiensis)
は、広く分布した、杆状の、好気性の、胞子形成性微生
物である。その胞子形成サイクルの間、B.t.はプロ
トシキン(protxin)またはデルタ−内毒素として知られ
ているタンパク質を形成する。これらのプロトキシン
は、パラ胞子、結晶質封入体としてまたは胞子殻の一部
としてB.t.中に蓄積される。種々の感受性昆虫、例
えば、鱗翅類(Lepdoptera)および双翅類(Diptera)の目
におけるものに対するB.t.の病原性は、本質的にこ
のパラ胞子の結晶のためであり、この結晶は胞子形成の
時においてB.t.細胞の乾燥重量の20%を越えるこ
とがある。
ensis)およびデルタ−内毒素 バチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thuringiensis)
は、広く分布した、杆状の、好気性の、胞子形成性微生
物である。その胞子形成サイクルの間、B.t.はプロ
トシキン(protxin)またはデルタ−内毒素として知られ
ているタンパク質を形成する。これらのプロトキシン
は、パラ胞子、結晶質封入体としてまたは胞子殻の一部
としてB.t.中に蓄積される。種々の感受性昆虫、例
えば、鱗翅類(Lepdoptera)および双翅類(Diptera)の目
におけるものに対するB.t.の病原性は、本質的にこ
のパラ胞子の結晶のためであり、この結晶は胞子形成の
時においてB.t.細胞の乾燥重量の20%を越えるこ
とがある。
パラ胞子の結晶は、摂取後にはじめて昆虫において活性
である。例えば、鱗翅類の昆虫による後、中腸における
アルカリ性pHおよびタンパク質分解酵素は結晶を活性化
して、毒性成分を放出させる。これらの毒性成分は中腸
の細胞を毒し、昆虫の食物摂取を停止させ、究極的に、
昆虫を死亡させる。事実、B.t.は鱗翅類の昆虫を取
り扱うとき、有効なかつ環境的に安全な昆虫であること
が証明された。
である。例えば、鱗翅類の昆虫による後、中腸における
アルカリ性pHおよびタンパク質分解酵素は結晶を活性化
して、毒性成分を放出させる。これらの毒性成分は中腸
の細胞を毒し、昆虫の食物摂取を停止させ、究極的に、
昆虫を死亡させる。事実、B.t.は鱗翅類の昆虫を取
り扱うとき、有効なかつ環境的に安全な昆虫であること
が証明された。
B.t.の異なる系統は血清学的に異なるパラ胞子の結
晶を産生することが、報告された。しかしながら、B.
t.系統の多くにより産生される主要な結晶形態の1つ
はP−1として知られている形態である。P−1は約1
30,000ダルトンの分子量を有し、そして、また、
胞子殻の1つ主要な成分であると考えられる。パラ胞子
の結晶のP−1の遺伝子および他のタンパク質結晶のほ
とんどのそれらは、B.t.中に変化する大きさの多数
の異なるプラスミドの任意の1つ上に存在することが発
見された。
晶を産生することが、報告された。しかしながら、B.
t.系統の多くにより産生される主要な結晶形態の1つ
はP−1として知られている形態である。P−1は約1
30,000ダルトンの分子量を有し、そして、また、
胞子殻の1つ主要な成分であると考えられる。パラ胞子
の結晶のP−1の遺伝子および他のタンパク質結晶のほ
とんどのそれらは、B.t.中に変化する大きさの多数
の異なるプラスミドの任意の1つ上に存在することが発
見された。
2.4デルタ−内毒素のクローニング B.t.毒素の遺伝子は、典型的には、プラスミド上に
存在し、そしてそれらの産生物は有効な殺虫剤であるこ
とが証明され、これらの殺虫剤は、結晶の形態であると
き、あるいは胞子形成に関連するとき、容易に分離され
るので、きわめて多くの科学的研究、とくに遺伝子の分
離およびクローニングの手順に関する研究の主題であっ
た。
存在し、そしてそれらの産生物は有効な殺虫剤であるこ
とが証明され、これらの殺虫剤は、結晶の形態であると
き、あるいは胞子形成に関連するとき、容易に分離され
るので、きわめて多くの科学的研究、とくに遺伝子の分
離およびクローニングの手順に関する研究の主題であっ
た。
P−1の遺伝情報を指定する遺伝子は、B.t.亜種ク
ルスタキ(kurstaki)系統HD−1−Dipelから分離
され、そしてE.coliにおいてクローニングおよび
発現された[Schnefら、米国特許第4,467,
036号]。タンパク質産生物のP−1は、鱗翅類の昆
虫(タバコのイモムシの幼虫)に対して毒性であること
が決定された。P−1の結晶タンパク質の遺伝子のプロ
モーター領域および解読領域の部分のヌクレオチド配列
は、また、決定された[H.P.Wongら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.)Vol.258、No.3、pp.1960−1967
(1983)]。この遺伝子の全体のヌクレオチド配列
は、また、決定され、そしてそのデルター内毒素タンパ
ク質それ自体は形質転換したE.coli系中で発現さ
れた[M.J.Adangら、ジーン(Gene)、Vol.
36、pp.298−300(1985)およびPCT
出願PCT/US85/01665、B.t.の結晶タ
ンパク質毒素のセグメントについて(1985)]。
ルスタキ(kurstaki)系統HD−1−Dipelから分離
され、そしてE.coliにおいてクローニングおよび
発現された[Schnefら、米国特許第4,467,
036号]。タンパク質産生物のP−1は、鱗翅類の昆
虫(タバコのイモムシの幼虫)に対して毒性であること
が決定された。P−1の結晶タンパク質の遺伝子のプロ
モーター領域および解読領域の部分のヌクレオチド配列
は、また、決定された[H.P.Wongら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Che
m.)Vol.258、No.3、pp.1960−1967
(1983)]。この遺伝子の全体のヌクレオチド配列
は、また、決定され、そしてそのデルター内毒素タンパ
ク質それ自体は形質転換したE.coli系中で発現さ
れた[M.J.Adangら、ジーン(Gene)、Vol.
36、pp.298−300(1985)およびPCT
出願PCT/US85/01665、B.t.の結晶タ
ンパク質毒素のセグメントについて(1985)]。
他のデルタ−内毒素の形態の遺伝子は、また、E.co
li中でクローニングおよび発現された。B.t.va
r.イスラエレンシス(israelensis)からのカのデルタ
ー内毒素遺伝子を含有する組み換え体プラスミドは、
E.coliのベクター中に挿入された。26,000
ダルトンのポリペプチドは、このベクターで形質転換し
たE.coliにより合成された。このポリペプチド
は、双翅類(Diptera)目における昆虫(カ)に致死的で
あることが示された。[E.S.Wardら、FEBS
Vol.175、2、pp.377−382、198
4]。この結晶タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子
のヌクレオチド配列は、また、生ずるタンパク質配列と
一緒に決定された[C.Waalwijikら、ヌクレ
イツク アシツズ リサーチ(Nucleic Acids Researc
h)、Vol.13、No.pp.8207−8217、
(1985)]。130KDa結晶タンパク質をエンコ
ードする他のB.t.イスラエレンシス(var.israelens
is)の遺伝子は、クローニングされ、そしてバチルス・
メガテリウム(Bacillus megaterium)およびバチルス・
スブチリス(Bacillus subtilis)を形質転換するために
使用された。バチルス・メガテリウム(Bacillus megate
rium)およびバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)
の両者は、胞子形成の間結晶質封入体を発現し、この封
入体はエデス・エジプチ(Aedes aegypti)の幼虫に対し
て毒性であることが決定された。[V.Sekarら、
ジーン(Gene)、Vol.33、pp.151−158
(1985)]。他のデルタ−内毒素の結晶質タンパク
質は、B.t.亜種ソット(sotto)から誘導された。こ
の結晶質タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子は、ベ
クター中でクローニングされ、次いで形質転換したE.
coli中で発現された。この遺伝子は144,000
ダルトンのペプチド(934アミノ酸残基)の遺伝情報
を指定する。遺伝子のヌクレオチド配列および対応する
タンパク質のアミノ酸配列は、報告された[Y.Shi
banoら、ジーン(Gene)、Vol.34、pp.24
3−251(1985)]。
li中でクローニングおよび発現された。B.t.va
r.イスラエレンシス(israelensis)からのカのデルタ
ー内毒素遺伝子を含有する組み換え体プラスミドは、
E.coliのベクター中に挿入された。26,000
ダルトンのポリペプチドは、このベクターで形質転換し
たE.coliにより合成された。このポリペプチド
は、双翅類(Diptera)目における昆虫(カ)に致死的で
あることが示された。[E.S.Wardら、FEBS
Vol.175、2、pp.377−382、198
4]。この結晶タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子
のヌクレオチド配列は、また、生ずるタンパク質配列と
一緒に決定された[C.Waalwijikら、ヌクレ
イツク アシツズ リサーチ(Nucleic Acids Researc
h)、Vol.13、No.pp.8207−8217、
(1985)]。130KDa結晶タンパク質をエンコ
ードする他のB.t.イスラエレンシス(var.israelens
is)の遺伝子は、クローニングされ、そしてバチルス・
メガテリウム(Bacillus megaterium)およびバチルス・
スブチリス(Bacillus subtilis)を形質転換するために
使用された。バチルス・メガテリウム(Bacillus megate
rium)およびバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)
の両者は、胞子形成の間結晶質封入体を発現し、この封
入体はエデス・エジプチ(Aedes aegypti)の幼虫に対し
て毒性であることが決定された。[V.Sekarら、
ジーン(Gene)、Vol.33、pp.151−158
(1985)]。他のデルタ−内毒素の結晶質タンパク
質は、B.t.亜種ソット(sotto)から誘導された。こ
の結晶質タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子は、ベ
クター中でクローニングされ、次いで形質転換したE.
coli中で発現された。この遺伝子は144,000
ダルトンのペプチド(934アミノ酸残基)の遺伝情報
を指定する。遺伝子のヌクレオチド配列および対応する
タンパク質のアミノ酸配列は、報告された[Y.Shi
banoら、ジーン(Gene)、Vol.34、pp.24
3−251(1985)]。
他の主要なデルタ−内毒素のタンパク質はB.t.のい
くつかの亜種により産生されることが、また、認識され
た[T.Yamamoto、バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Bio
chem.Biophys.Res.Comm.)、Vol.103、No.pp.
414−421(1981);T.Yamamoto
ら、アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド
・バイオフィジックス(Archives of Biochemistry and
Biophysics)、Vol.227、No.1、pp.233−
241(1983)]。このデルタ−内毒素は、P−2
として同定され、そしてB.t.var.クルスタキ(k
urstaki)(HD−1)から分離された。このデルタ−内
毒素タンパク質はほぼ65,000ダルトンの分子量を
有し、そして鱗翅類および双翅類の昆虫に対して毒性で
あることが知られている。対照的に、P−1は鱗翅類目
の昆虫に対して活性である。今日まで、P−2タンパク
質は分離され、そしてある種の昆虫に対するその活性に
より特徴づけられてきたが、このタンパク質の遺伝情報
を指定する遺伝子およびそのタンパク質配列は確認しに
くいままである。この事実のため、B.t.以外の有機
体中でこの独特に活性のデルタ−内毒素タンパク質を発
現するあ手段を得ることは不可能であった。クローニン
グしたP−2遺伝子の利用可能性は、B.t.中のP−
2タンパク質の産生を増大させ、そして、また、他のデ
ルタ−内毒素を含有しない異種の有機体におけるP−2
の合成を可能とする。
くつかの亜種により産生されることが、また、認識され
た[T.Yamamoto、バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション(Bio
chem.Biophys.Res.Comm.)、Vol.103、No.pp.
414−421(1981);T.Yamamoto
ら、アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド
・バイオフィジックス(Archives of Biochemistry and
Biophysics)、Vol.227、No.1、pp.233−
241(1983)]。このデルタ−内毒素は、P−2
として同定され、そしてB.t.var.クルスタキ(k
urstaki)(HD−1)から分離された。このデルタ−内
毒素タンパク質はほぼ65,000ダルトンの分子量を
有し、そして鱗翅類および双翅類の昆虫に対して毒性で
あることが知られている。対照的に、P−1は鱗翅類目
の昆虫に対して活性である。今日まで、P−2タンパク
質は分離され、そしてある種の昆虫に対するその活性に
より特徴づけられてきたが、このタンパク質の遺伝情報
を指定する遺伝子およびそのタンパク質配列は確認しに
くいままである。この事実のため、B.t.以外の有機
体中でこの独特に活性のデルタ−内毒素タンパク質を発
現するあ手段を得ることは不可能であった。クローニン
グしたP−2遺伝子の利用可能性は、B.t.中のP−
2タンパク質の産生を増大させ、そして、また、他のデ
ルタ−内毒素を含有しない異種の有機体におけるP−2
の合成を可能とする。
3.0発明の要約 本発明は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thur
ingiensis)により産生されたP−2デルタ−内毒素、こ
のタンパク質をコードする遺伝子のDNA配列およびこ
のタンパク質組み込んだ新規な殺虫剤および/またはP
−2遺伝子で形質転換した有機体に関する。さらに詳し
くは、本発明は、P−2デルタ−内毒素をコードする遺
伝子で、微生物をクローニングおよび形質転換すること
に関する。本発明は、B.t.以外の有機体において、
胞子形成の間に天然のP−2産生B.t.有機体により
産生されるより大きい量で、P−2デルタ−内毒素の発
現を可能とすることにおいて有用である。さらに、本発
明は、P−2毒素をコードする遺伝子で非胞子形成性微
生物を形質転換するとき有用であり、これによりこのデ
ルタ−内毒素は微生物の増殖の事実上すべての段階の間
産生することができ、これにより胞子形成の段階の間の
みに制限されない。
ingiensis)により産生されたP−2デルタ−内毒素、こ
のタンパク質をコードする遺伝子のDNA配列およびこ
のタンパク質組み込んだ新規な殺虫剤および/またはP
−2遺伝子で形質転換した有機体に関する。さらに詳し
くは、本発明は、P−2デルタ−内毒素をコードする遺
伝子で、微生物をクローニングおよび形質転換すること
に関する。本発明は、B.t.以外の有機体において、
胞子形成の間に天然のP−2産生B.t.有機体により
産生されるより大きい量で、P−2デルタ−内毒素の発
現を可能とすることにおいて有用である。さらに、本発
明は、P−2毒素をコードする遺伝子で非胞子形成性微
生物を形質転換するとき有用であり、これによりこのデ
ルタ−内毒素は微生物の増殖の事実上すべての段階の間
産生することができ、これにより胞子形成の段階の間の
みに制限されない。
本発明の追加の目的は、分離された遺伝子により産生さ
れる均質なP−2タンパク質を提供することである。こ
のタンパク質は、胞子形成するまたは非胞子形成の微生
物、例えば、バチルス・メガテリウム(Bacillus megate
rium)またはE.coliまたはB.t.の異なる系統
を、クローニングしたP−2遺伝子で形質転換する方法
によって産生することができる。この方法は、適当な宿
主およびベクターの選択のおかげで、P−2デルタ−内
毒素の高い収率の産生を可能とし、こうしてP−2毒素
の実質的に均質な、すなわち、天然のB.t.宿主中の
P−2毒素とともにあるいはと同時に典型的に産生され
るデルタ−内毒素の他の変異型による汚染がない。調製
を誘導することが可能である。P−2タンパク質および
/または形質転換した宿主は、種々の殺虫剤組成物にお
いて利用することができる。
れる均質なP−2タンパク質を提供することである。こ
のタンパク質は、胞子形成するまたは非胞子形成の微生
物、例えば、バチルス・メガテリウム(Bacillus megate
rium)またはE.coliまたはB.t.の異なる系統
を、クローニングしたP−2遺伝子で形質転換する方法
によって産生することができる。この方法は、適当な宿
主およびベクターの選択のおかげで、P−2デルタ−内
毒素の高い収率の産生を可能とし、こうしてP−2毒素
の実質的に均質な、すなわち、天然のB.t.宿主中の
P−2毒素とともにあるいはと同時に典型的に産生され
るデルタ−内毒素の他の変異型による汚染がない。調製
を誘導することが可能である。P−2タンパク質および
/または形質転換した宿主は、種々の殺虫剤組成物にお
いて利用することができる。
本発明の他の目的は、P−2デルタ−内毒素をコードす
るDNAで形質転換した、自然B.t.宿主以外の有機
体を提供することである。この外来の形質転換した宿主
は、より望ましいおよび/または選択的培養条件下に、
P−2デルタ−内毒素の産生を可能とする。
るDNAで形質転換した、自然B.t.宿主以外の有機
体を提供することである。この外来の形質転換した宿主
は、より望ましいおよび/または選択的培養条件下に、
P−2デルタ−内毒素の産生を可能とする。
本発明の他の目的は、種々のバチルス・スリンギエンシ
ス(Bacillus Thuringiensis)中のP−2遺伝子の存在の
検出に有用なDNAプローブを提供することである。こ
のDNAは、また、P−2タンパク質と共通の相同性を
共有するタンパク質をコードする関連する遺伝子の可能
な存在について種々の系統のスクリーニング、およびこ
れらの関連する遺伝子の分離を可能とする。本発明の上
の実施態様のすべては、以下の本発明の説明においてよ
り詳しく説明する。
ス(Bacillus Thuringiensis)中のP−2遺伝子の存在の
検出に有用なDNAプローブを提供することである。こ
のDNAは、また、P−2タンパク質と共通の相同性を
共有するタンパク質をコードする関連する遺伝子の可能
な存在について種々の系統のスクリーニング、およびこ
れらの関連する遺伝子の分離を可能とする。本発明の上
の実施態様のすべては、以下の本発明の説明においてよ
り詳しく説明する。
4.0図面の簡単な説明 第1図は、クローニングしたP−2遺伝子を含有する、
組み換え体プラスミドpEG201およびpEG204
の制限地図である。P−2遺伝子の転写の位置および方
向は、大きい矢印で示されている。
組み換え体プラスミドpEG201およびpEG204
の制限地図である。P−2遺伝子の転写の位置および方
向は、大きい矢印で示されている。
第2図は、P−2遺伝子のDNAヌクレオチド配列およ
び、また、このDNAヌクレオチド配列にコードされる
P−2タンパク質のアミノ酸配列を示す。
び、また、このDNAヌクレオチド配列にコードされる
P−2タンパク質のアミノ酸配列を示す。
第3図は、3Aおよび3Bから構成されている。3Aは
臭化エチジウム染色したエクハルト(Eckhardt)ゲルの写
真である。B.t.の種々の系統中に存在する天然プラ
スミドを見ることができ、B.t.のほとんどはいくつ
かは天然プラスミドを含有することを示す。3Bは、3
Aに示すプラスミドで放射線的に標識したクローニング
したP2遺伝子をハイブリダイゼーションすることによ
って作られた、オートラジオグラフイーの写真である。
3Bが示すように、クローニングしたP2遺伝子は、P
2タンパク質を産生することが知られているB.t.の
3つの系統(HD1−1、HD263−1およびHD2
78)において110MDaのプラスミドに広範にハイ
ブリダイゼーションした。クローニングしたP2遺伝子
は、また、30MDaのDNAバンドにハイブリダイゼ
ーションした(3B)。
臭化エチジウム染色したエクハルト(Eckhardt)ゲルの写
真である。B.t.の種々の系統中に存在する天然プラ
スミドを見ることができ、B.t.のほとんどはいくつ
かは天然プラスミドを含有することを示す。3Bは、3
Aに示すプラスミドで放射線的に標識したクローニング
したP2遺伝子をハイブリダイゼーションすることによ
って作られた、オートラジオグラフイーの写真である。
3Bが示すように、クローニングしたP2遺伝子は、P
2タンパク質を産生することが知られているB.t.の
3つの系統(HD1−1、HD263−1およびHD2
78)において110MDaのプラスミドに広範にハイ
ブリダイゼーションした。クローニングしたP2遺伝子
は、また、30MDaのDNAバンドにハイブリダイゼ
ーションした(3B)。
第4図は、4Aおよび4Bから構成されている。4A
は、系統HD1−1からのHindIII消化したDN
Aを含有する、臭化エチジウム染色したアガロースゲル
の写真である。4Aが示すように、HindIIIで消
化した合計のB.t.DNAは、数百の異なる大きさの
断片に分割することができた。4Bは、4Aに示すHi
ndIII消化した断片で放射線的に標識したクローニ
ングしたP2遺伝子をハイブリダイゼーションすること
によって作られた、オートラジオグラフイーの写真であ
る。
は、系統HD1−1からのHindIII消化したDN
Aを含有する、臭化エチジウム染色したアガロースゲル
の写真である。4Aが示すように、HindIIIで消
化した合計のB.t.DNAは、数百の異なる大きさの
断片に分割することができた。4Bは、4Aに示すHi
ndIII消化した断片で放射線的に標識したクローニ
ングしたP2遺伝子をハイブリダイゼーションすること
によって作られた、オートラジオグラフイーの写真であ
る。
4Cには、80℃において4Bのニトロセルロースフィ
ルターを再洗浄後作った、オートラジオグラフイーの写
真である。
ルターを再洗浄後作った、オートラジオグラフイーの写
真である。
第5図は、SDS/ポリアクリルアミドゲルの写真であ
り、クローニングしたP−2遺伝子を収容するバチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium)の組み換え体宿
主遺伝子が、真性のP−2毒素のそれと同様な大きさを
有するタンパク質を大量に合成することを示す。
り、クローニングしたP−2遺伝子を収容するバチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium)の組み換え体宿
主遺伝子が、真性のP−2毒素のそれと同様な大きさを
有するタンパク質を大量に合成することを示す。
第6図は、P−1毒素およびP−2毒素のアミノ酸配列
の間の相同性の領域を示す。
の間の相同性の領域を示す。
5.0発明の説明 一般に述べると、本発明は、バチルス・スリンギエンシ
ス(Bacillus Thuringiensis)のP−2デルタ−内毒素ま
たは毒素をコードし、そして第2図に示すDNAヌクレ
オチド配列からなるクローニングした遺伝子を提供す
る。この遺伝子(これはヌクレオチド鎖がお互いに相補
的な塩基配列を有する、二本鎖DNAからなる)は、ア
ミノ酸配列が第2図に示されている、P−2毒素のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質(または、また、ポリペプ
チドとしてここで等しく使用する)をコードする。クロ
ーニングした遺伝子によりエンコードされるP−2毒素
は、鱗翅類および双翅類の昆虫に対して殺虫活性を有す
る。
ス(Bacillus Thuringiensis)のP−2デルタ−内毒素ま
たは毒素をコードし、そして第2図に示すDNAヌクレ
オチド配列からなるクローニングした遺伝子を提供す
る。この遺伝子(これはヌクレオチド鎖がお互いに相補
的な塩基配列を有する、二本鎖DNAからなる)は、ア
ミノ酸配列が第2図に示されている、P−2毒素のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質(または、また、ポリペプ
チドとしてここで等しく使用する)をコードする。クロ
ーニングした遺伝子によりエンコードされるP−2毒素
は、鱗翅類および双翅類の昆虫に対して殺虫活性を有す
る。
P−2毒素を産生する方法は、また、本発明により提供
される。この産生方法において、P−2デルタ−内毒素
の遺伝子をクローニングし、ベクターまたはプラスミド
中に挿入し、次いでこれを利用して選択した微生物を形
質転換する。
される。この産生方法において、P−2デルタ−内毒素
の遺伝子をクローニングし、ベクターまたはプラスミド
中に挿入し、次いでこれを利用して選択した微生物を形
質転換する。
ここに記載されているクローニングしたベクターは、一
般に、この分野において知られており、そして商業的に
入手可能である。特定のプラスミドは、当業者の技量の
範囲内であり、そしてその人の選択事項である。本発明
において適当なプラスミドは、例えば、pBR322、
B.t.から誘導されたプラスミド、バチルス(Bacillu
s)から誘導された微生物でありそして、好ましくは、バ
チルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)のような
ものである。本発明とともに使用するのに適当な微生物
は、胞子形成性微生物および非胞子形成性微生物の両
者、例えば、E.coli、B.t.およびバチルス・
メガテリウム(Bacillus megaterium)である。利用する
微生物は、また、この分野において知られており、そし
て一般に入手可能である。本発明の実施において使用す
る特定の微生物の選択は、または、個人の好みの事項で
ある。本発明の好ましい実施態様において、微生物はバ
チルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)である。
般に、この分野において知られており、そして商業的に
入手可能である。特定のプラスミドは、当業者の技量の
範囲内であり、そしてその人の選択事項である。本発明
において適当なプラスミドは、例えば、pBR322、
B.t.から誘導されたプラスミド、バチルス(Bacillu
s)から誘導された微生物でありそして、好ましくは、バ
チルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)のような
ものである。本発明とともに使用するのに適当な微生物
は、胞子形成性微生物および非胞子形成性微生物の両
者、例えば、E.coli、B.t.およびバチルス・
メガテリウム(Bacillus megaterium)である。利用する
微生物は、また、この分野において知られており、そし
て一般に入手可能である。本発明の実施において使用す
る特定の微生物の選択は、または、個人の好みの事項で
ある。本発明の好ましい実施態様において、微生物はバ
チルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)である。
一般に述べると、P−2毒素タンパク質は、形質転換し
た有機体により産生され、そして次いで第2図に示すア
ミノ酸配列を有する均質な調製物に精製される。さらに
詳しくは、このタンパク質は、微生物をP−2遺伝子で
形質転換し、形質転換した微生物を増殖させ、これによ
りP−2遺伝子にコードされるタンパク質を微生物中で
発現し、そしてタンパク質を有機体から標準のタンパク
質精製技術により抽出することによって産生することが
できる。また、タンパク質を形質転換した微生物から分
離しないが、この有機体を、発現したP−2毒素を含め
て、殺虫剤組成物として、あるいはその中で利用するこ
とは、本発明の範囲内である。
た有機体により産生され、そして次いで第2図に示すア
ミノ酸配列を有する均質な調製物に精製される。さらに
詳しくは、このタンパク質は、微生物をP−2遺伝子で
形質転換し、形質転換した微生物を増殖させ、これによ
りP−2遺伝子にコードされるタンパク質を微生物中で
発現し、そしてタンパク質を有機体から標準のタンパク
質精製技術により抽出することによって産生することが
できる。また、タンパク質を形質転換した微生物から分
離しないが、この有機体を、発現したP−2毒素を含め
て、殺虫剤組成物として、あるいはその中で利用するこ
とは、本発明の範囲内である。
本発明は、また、B.t.P−2毒素および適当な担体
からなる、鱗翅類および双翅類に対して使用するため
の、新規な殺虫剤(isecticide)を提供する。P−2毒素
は、有機体中に含有されるか、あるいは胞子の一部とし
て、あるいは均質なタンパク質調製物であるか、あるい
は胞子と培養した形質転換した有機体との混合物である
ことができる。P−2毒素は、また、非胞子形成性微生
物または胞子形成性微生物、例えば、バチルス・メガテ
リウム(Bacillus megaterium)またはB.t.中に含有
されることができる。適当な担体は、当業者に知られて
いるある数の固体または液体のいずれの1つであるする
こともできる。
からなる、鱗翅類および双翅類に対して使用するため
の、新規な殺虫剤(isecticide)を提供する。P−2毒素
は、有機体中に含有されるか、あるいは胞子の一部とし
て、あるいは均質なタンパク質調製物であるか、あるい
は胞子と培養した形質転換した有機体との混合物である
ことができる。P−2毒素は、また、非胞子形成性微生
物または胞子形成性微生物、例えば、バチルス・メガテ
リウム(Bacillus megaterium)またはB.t.中に含有
されることができる。適当な担体は、当業者に知られて
いるある数の固体または液体のいずれの1つであるする
こともできる。
本発明は、また、P−2遺伝子を含む組み換え体または
プラスミドおよびこの遺伝子で形質転換した特定の微生
物からなる。さらに、本発明は、また、P−2デルタ−
内毒素をコードする遺伝子のためのオリゴヌクレオチド
プローブを提供する。本発明のこれらの面は、下に詳細
に説明し、そして下の実施例において例示する。
プラスミドおよびこの遺伝子で形質転換した特定の微生
物からなる。さらに、本発明は、また、P−2デルタ−
内毒素をコードする遺伝子のためのオリゴヌクレオチド
プローブを提供する。本発明のこれらの面は、下に詳細
に説明し、そして下の実施例において例示する。
5.1組み換え体および技術および遺伝子の発現 一般に述べると、組み換え体DNA技術は、特定のDN
A配列をDNAベヒクル(プラスミドまたはベクター)
中に挿入して、宿主細胞中で複製することができるキメ
ラDNA分子を形成することを包含する。挿入されるD
NA配列は、典型的には、受容体宿主に対して外来であ
る、すなわち、挿入されるDNA配列およびDNAベク
ターは性質が遺伝情報を交換しない有機体から誘導され
るか、あるいは挿入されるDNA配列は完全にまたは部
分的に合成的につくることができる。近年、組み換え体
DNA分子の構成を可能とするいくつかの一般的方法は
開発された。例えば、米国特許第4,237,224号
(CohenおよびBoyer)は、制限酵素を使用し
そして結合(ligation)として知られている、このような
プラスミドの産生を記載している。次いで、これらの組
み換え体プラスミドを、形質転換により単細胞の有機体
中に導入しそして複製する。その中に記載されている技
術の一般的応用のため、米国特許第4,237,224
号は本発明の明細書中に引用によって加える。
A配列をDNAベヒクル(プラスミドまたはベクター)
中に挿入して、宿主細胞中で複製することができるキメ
ラDNA分子を形成することを包含する。挿入されるD
NA配列は、典型的には、受容体宿主に対して外来であ
る、すなわち、挿入されるDNA配列およびDNAベク
ターは性質が遺伝情報を交換しない有機体から誘導され
るか、あるいは挿入されるDNA配列は完全にまたは部
分的に合成的につくることができる。近年、組み換え体
DNA分子の構成を可能とするいくつかの一般的方法は
開発された。例えば、米国特許第4,237,224号
(CohenおよびBoyer)は、制限酵素を使用し
そして結合(ligation)として知られている、このような
プラスミドの産生を記載している。次いで、これらの組
み換え体プラスミドを、形質転換により単細胞の有機体
中に導入しそして複製する。その中に記載されている技
術の一般的応用のため、米国特許第4,237,224
号は本発明の明細書中に引用によって加える。
構成のために使用される方法に無関係に、組み換え体D
NA分子は、宿主細胞と適合性でなくてはならない、す
なわち、宿主細胞中で自律的に複製することができなく
てはならない。組み換え体DNA分子は、また、そのよ
うに形質転換した宿主細胞の選択を組み換え体DNA分
子により可能とする、マーカー機能を有するべきであ
る。さらに、適切な複製、転写および翻訳のシグナルの
すべてがキメラDNA分子上に正しく配置されている場
合、外来遺伝子は形質転換した細胞およびそれらの子孫
において発現されるであろう。
NA分子は、宿主細胞と適合性でなくてはならない、す
なわち、宿主細胞中で自律的に複製することができなく
てはならない。組み換え体DNA分子は、また、そのよ
うに形質転換した宿主細胞の選択を組み換え体DNA分
子により可能とする、マーカー機能を有するべきであ
る。さらに、適切な複製、転写および翻訳のシグナルの
すべてがキメラDNA分子上に正しく配置されている場
合、外来遺伝子は形質転換した細胞およびそれらの子孫
において発現されるであろう。
これらの異なる遺伝シグナルおよび処理の事象は、遺伝
子の発現の多くのレベル、すなわち、DNAの転写およ
びメッセンジャーRNAの翻訳を制御する。DNAの転
写は、RNAポリメラーゼの結合を命令し、これにより
転写を促進するDNA配列である、プロモーターの存在
に依存する。
子の発現の多くのレベル、すなわち、DNAの転写およ
びメッセンジャーRNAの翻訳を制御する。DNAの転
写は、RNAポリメラーゼの結合を命令し、これにより
転写を促進するDNA配列である、プロモーターの存在
に依存する。
原核細胞中のメッセンジャーRNA(mRNA)の転写
は、適切な原核細胞のシグナルの存在に依存する。原核
細胞、例えば、B.t.中のmRNAの効率よい転写
は、mRNA上のシャイン・ダルガルノ(Shine Dalgrn
o)(SD)配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要と
する。この配列mRNAの短いヌクレオチド配列であ
り、タンパク質のアミノ末端メチオニンをエンコードす
る出発コドンの前に位置する。SD配列は16S RN
A(リボソームのRNA)の3′末端に対して相補的で
あり、そして多分mRNAと二本鎖となることによって
リボソームへのmRNA結合を促進して、リボソームの
正しい位置決め可能とする[RobertsおよびLa
uer、1979、メソッズ・イン・エンジモロジー(M
ethods in Enzymology)、68:473]。
は、適切な原核細胞のシグナルの存在に依存する。原核
細胞、例えば、B.t.中のmRNAの効率よい転写
は、mRNA上のシャイン・ダルガルノ(Shine Dalgrn
o)(SD)配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要と
する。この配列mRNAの短いヌクレオチド配列であ
り、タンパク質のアミノ末端メチオニンをエンコードす
る出発コドンの前に位置する。SD配列は16S RN
A(リボソームのRNA)の3′末端に対して相補的で
あり、そして多分mRNAと二本鎖となることによって
リボソームへのmRNA結合を促進して、リボソームの
正しい位置決め可能とする[RobertsおよびLa
uer、1979、メソッズ・イン・エンジモロジー(M
ethods in Enzymology)、68:473]。
特定の遺伝子のクローニングに広く使用される1つの方
法は、組み換え体プラスミドの「ライブラリー」を調製
することである。組み換え体プラスミドの各々は、通常
それを収容する細胞に対して抗生物質の抵抗性を与え
る、プラスミドベクターと、遺伝子を含有するする有機
体である、供与体有機体からのDNAの断片から構成さ
れている。プラスミドのライブラリーは、プラスミドベ
クターおよび供与体有機体からの合計のDNAの両者
を、制限酵素で消化し、酵素を不活性化し、そしてDN
A混合物を結合することによって調製する。この結合し
たDNAはプラスミドのライブラリーである。ライブラ
リー中の組み換え体プラスミドの少なくとも1つは、問
題の遺伝子がその上に存在する供与体有機体からのDN
Aの断片を含有する、傾向が強い。プラスミドのライブ
ラリーを、遺伝子を含有しない宿主有機体の細胞中に形
質転換する。宿主細胞は選択的培地上に広げ、これは通
常抗生物質を含有し、この抗生物質は組み換え体プラス
ミドを含有する、形質転換した細胞のみをコロニーに増
殖できるようにさせる。個々の形質転換した宿主コロニ
ーは、供与体有機体からの遺伝子の獲得について試験す
る。宿主コロニーにおいて、獲得した遺伝子は組み換え
体プラスミド上に支持される。
法は、組み換え体プラスミドの「ライブラリー」を調製
することである。組み換え体プラスミドの各々は、通常
それを収容する細胞に対して抗生物質の抵抗性を与え
る、プラスミドベクターと、遺伝子を含有するする有機
体である、供与体有機体からのDNAの断片から構成さ
れている。プラスミドのライブラリーは、プラスミドベ
クターおよび供与体有機体からの合計のDNAの両者
を、制限酵素で消化し、酵素を不活性化し、そしてDN
A混合物を結合することによって調製する。この結合し
たDNAはプラスミドのライブラリーである。ライブラ
リー中の組み換え体プラスミドの少なくとも1つは、問
題の遺伝子がその上に存在する供与体有機体からのDN
Aの断片を含有する、傾向が強い。プラスミドのライブ
ラリーを、遺伝子を含有しない宿主有機体の細胞中に形
質転換する。宿主細胞は選択的培地上に広げ、これは通
常抗生物質を含有し、この抗生物質は組み換え体プラス
ミドを含有する、形質転換した細胞のみをコロニーに増
殖できるようにさせる。個々の形質転換した宿主コロニ
ーは、供与体有機体からの遺伝子の獲得について試験す
る。宿主コロニーにおいて、獲得した遺伝子は組み換え
体プラスミド上に支持される。
遺伝子の獲得について試験する最も直接の方法の1つ
は、遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブ、す
なわち、遺伝子に対して相同性であるDNAの断片を使
用することである。相同性DNA断片の特徴は、tye
がハイブリダイゼーションの間にお互いに緊密結合する
ことである。典型的には、放射線標識したDNAプロー
ブをハイブリダイゼーションの間に使用し、こうして遺
伝子へのプローブの結合を容易に監視することができる
ようにする。
は、遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブ、す
なわち、遺伝子に対して相同性であるDNAの断片を使
用することである。相同性DNA断片の特徴は、tye
がハイブリダイゼーションの間にお互いに緊密結合する
ことである。典型的には、放射線標識したDNAプロー
ブをハイブリダイゼーションの間に使用し、こうして遺
伝子へのプローブの結合を容易に監視することができる
ようにする。
分子生物学分野における最近の進歩は、遺伝子特異的プ
ローブとして合成オリゴヌクレオチドを使用することで
ある。オリゴヌクレオチドを使用する基準は、すべての
生物学的系において、ヌクレオチドの特定の配列はアミ
ノ酸の精確な配列をエンコードすることである。逆に、
アミノ酸の配列が特定のタンパク質について知られてい
るとき、そのタンパク質をエンコードするヌクレオチド
配列は、精確にではないが、推定することができる。実
際に、あるタンパク質の部分的アミノ酸配列、すなわち
問題の遺伝子の産生物、は化学的方法により決定するこ
とができる。
ローブとして合成オリゴヌクレオチドを使用することで
ある。オリゴヌクレオチドを使用する基準は、すべての
生物学的系において、ヌクレオチドの特定の配列はアミ
ノ酸の精確な配列をエンコードすることである。逆に、
アミノ酸の配列が特定のタンパク質について知られてい
るとき、そのタンパク質をエンコードするヌクレオチド
配列は、精確にではないが、推定することができる。実
際に、あるタンパク質の部分的アミノ酸配列、すなわち
問題の遺伝子の産生物、は化学的方法により決定するこ
とができる。
タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、遺伝子特異的オ
リゴヌクレオチドプローブが合成され、このプローブ
は、変化する程度に、遺伝子に対して相同性であること
ができる。精確な相同性は保証することができない。な
ぜなら、あるタンパク質のアミノ酸配列の知識は、その
タンパク質をエンコードする遺伝子のヌクレオチド配列
の精確な知識を事実与えるからである。それにもかかわ
らず、オリゴヌクレオチドプローブと遺伝子との間の相
同性が精確でないことがあるが、オリゴヌクレオチドプ
ローブを遺伝子に特異的に結合させる、ハイブリダイゼ
ーションの条件は通常発見することができる。
リゴヌクレオチドプローブが合成され、このプローブ
は、変化する程度に、遺伝子に対して相同性であること
ができる。精確な相同性は保証することができない。な
ぜなら、あるタンパク質のアミノ酸配列の知識は、その
タンパク質をエンコードする遺伝子のヌクレオチド配列
の精確な知識を事実与えるからである。それにもかかわ
らず、オリゴヌクレオチドプローブと遺伝子との間の相
同性が精確でないことがあるが、オリゴヌクレオチドプ
ローブを遺伝子に特異的に結合させる、ハイブリダイゼ
ーションの条件は通常発見することができる。
したがって、P−2遺伝子の分離において、P−2タン
パク質はバチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thurin
giensis)var,kurstakiの供与体系統から精
製し、そしてP−2タンパク質の部分的アミノ酸配列が
決定された。P−2遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを、P−2タンパク質のアミノ酸配列に基づいて
合成した。オリゴヌクレオチドを放射線的に標識し、そ
してハイブリダイゼーションの実験において使用して、
供与体B.t.系統からのP−2遺伝子を有する組み換
え体プラスミドを収容する、形質転換した宿主コロニー
を同定した。
パク質はバチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thurin
giensis)var,kurstakiの供与体系統から精
製し、そしてP−2タンパク質の部分的アミノ酸配列が
決定された。P−2遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブを、P−2タンパク質のアミノ酸配列に基づいて
合成した。オリゴヌクレオチドを放射線的に標識し、そ
してハイブリダイゼーションの実験において使用して、
供与体B.t.系統からのP−2遺伝子を有する組み換
え体プラスミドを収容する、形質転換した宿主コロニー
を同定した。
5.2バチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thuringi
ensis)系統HD263−1からのP−2毒素遺伝子のク
ローニング さらに詳しくは、本発明のP−2毒素遺伝子をクローニ
ングするために、親系統HD1から直接誘導した単一の
コロニー分離物である、系統HD1−1の細胞(U.
S.D.A.、Cotton Insect Rese
arch Unit、テキサス州78520ブラウンス
ビレ)をC2培地(1%のグルコース、0.2%のペプ
トン、0.5%のNZ アミン A、0.2%酵母エキ
ス、15ミリモルの(NH4)2SO4、23ミリモル
のKH2PO4、27ミリモルのK2HPO4、1ミリモルののMgSO
4・7H2O、600μmのCaCl2、17μmのZnSO4・7H
2O、17μmのCuSO4・5H2O、2μmのFeSO4・7H2O)中で30
℃においてt72(時間)まで増殖し、そして胞子およ
び結晶を遠心により収穫した。胞子/結晶の沈澱物を数
回の交換の1モルのNaCIで洗浄し、次いで数回の交
換の水で洗浄した。毒素のタンパク質は、胞子/結晶の
調製物を5%のB−メルカプトエタノール、2%のNa
DodeSO4、60ミリモルのトリスpH6.8、10
%のグリセロール中で70℃において70分間インキュ
ベーションすることによって可溶化し、そして胞子を遠
心により除去した。上澄み液を、NaDodeSO4を含有する
ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。ゲルを
クーマッシー(Coomassie)ブルー染料で染色し、そして
P−2タンパク質を含有するゲルのスライスをカミソリ
の刃で切断した。均質なP−2タンパク質の調製物をゲ
ルのスライスから電気溶離し、そして、アセトンで沈澱
させた後、P−2タンパク質のNH2−末端アミノ酸配列
は、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)
気相配列決定装置(470A型)で実施した自動化エド
マン(Edman)分解により決定し、そして1040ダイオ
ードの列の検出装置をもつヘウレット−パッカード(Hew
lett-Packerd)HPLCにおいてデュポンのゾルバック
ス(Zorbax)C18カラムで分析した。均質なP−2タン
パク質のNH2末端部分のアミノ酸配列は、次のとおり
であると決定された。
ensis)系統HD263−1からのP−2毒素遺伝子のク
ローニング さらに詳しくは、本発明のP−2毒素遺伝子をクローニ
ングするために、親系統HD1から直接誘導した単一の
コロニー分離物である、系統HD1−1の細胞(U.
S.D.A.、Cotton Insect Rese
arch Unit、テキサス州78520ブラウンス
ビレ)をC2培地(1%のグルコース、0.2%のペプ
トン、0.5%のNZ アミン A、0.2%酵母エキ
ス、15ミリモルの(NH4)2SO4、23ミリモル
のKH2PO4、27ミリモルのK2HPO4、1ミリモルののMgSO
4・7H2O、600μmのCaCl2、17μmのZnSO4・7H
2O、17μmのCuSO4・5H2O、2μmのFeSO4・7H2O)中で30
℃においてt72(時間)まで増殖し、そして胞子およ
び結晶を遠心により収穫した。胞子/結晶の沈澱物を数
回の交換の1モルのNaCIで洗浄し、次いで数回の交
換の水で洗浄した。毒素のタンパク質は、胞子/結晶の
調製物を5%のB−メルカプトエタノール、2%のNa
DodeSO4、60ミリモルのトリスpH6.8、10
%のグリセロール中で70℃において70分間インキュ
ベーションすることによって可溶化し、そして胞子を遠
心により除去した。上澄み液を、NaDodeSO4を含有する
ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。ゲルを
クーマッシー(Coomassie)ブルー染料で染色し、そして
P−2タンパク質を含有するゲルのスライスをカミソリ
の刃で切断した。均質なP−2タンパク質の調製物をゲ
ルのスライスから電気溶離し、そして、アセトンで沈澱
させた後、P−2タンパク質のNH2−末端アミノ酸配列
は、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)
気相配列決定装置(470A型)で実施した自動化エド
マン(Edman)分解により決定し、そして1040ダイオ
ードの列の検出装置をもつヘウレット−パッカード(Hew
lett-Packerd)HPLCにおいてデュポンのゾルバック
ス(Zorbax)C18カラムで分析した。均質なP−2タン
パク質のNH2末端部分のアミノ酸配列は、次のとおり
であると決定された。
5.3P−2遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブ P−2タンパク質のNH2−末端のアミノ酸4〜24をエ
ンコードする62マーのオリゴヌクレオチドプローブ
を、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)
DNA配列決定装置(380A型)で合成した。コドンの同義
性(ある種のアミノ酸は各々いくつかのわずかに異なる
コドンによりエンコードされる)ため、合成オリゴヌク
レオチドの配列は多分P−2遺伝子の実際のNH2−末端
配列から異なるであろう。しかしながら、B.t.ゲノ
ムが68%のA:Tであり、そして精確にクローニング
されかつ配列決定されたB.t.遺伝子についてのコド
ン使用の情報を、P−2遺伝子の実際の配列と最高に一
致する可能性を有するであろう、オリゴヌクレオチドプ
ローブの設計において使用した。オリゴヌクレオチドプ
ローブは、P−2遺伝子のNH2−末端の解読領域のみに
結合するように設計した。P−2遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブの配列は、次のとおりであった。: 5′GTA TTA AAT TCA GGA AGA
ACA ACA AAT AAT GAT GCA
TAT AAT GTA GTA GCA CAT G
AT CCA TT−3′。
ンコードする62マーのオリゴヌクレオチドプローブ
を、アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)
DNA配列決定装置(380A型)で合成した。コドンの同義
性(ある種のアミノ酸は各々いくつかのわずかに異なる
コドンによりエンコードされる)ため、合成オリゴヌク
レオチドの配列は多分P−2遺伝子の実際のNH2−末端
配列から異なるであろう。しかしながら、B.t.ゲノ
ムが68%のA:Tであり、そして精確にクローニング
されかつ配列決定されたB.t.遺伝子についてのコド
ン使用の情報を、P−2遺伝子の実際の配列と最高に一
致する可能性を有するであろう、オリゴヌクレオチドプ
ローブの設計において使用した。オリゴヌクレオチドプ
ローブは、P−2遺伝子のNH2−末端の解読領域のみに
結合するように設計した。P−2遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブの配列は、次のとおりであった。: 5′GTA TTA AAT TCA GGA AGA
ACA ACA AAT AAT GAT GCA
TAT AAT GTA GTA GCA CAT G
AT CCA TT−3′。
ここにおけるP−2遺伝子の本来の分離が可能あること
に加えて、このプローブのDNAプローブは本発明の他
の好ましい実施態様からなる。このDNAプローブは、
P−2遺伝子(または可能ならば関連する遺伝子)が天
然に存在するかどうか、あるいは特定の形質転換した有
機体がP−2遺伝子を含むかどうかを決定するための、
B.t.系統のスクリーニングを可能とする。この方式
において、また、B.t.のその系統の殺虫活性を推定
することが可能である。また、本発明の範囲内で、この
プローブはより小さいか、あるいはより大きいプローブ
からなることができる。このプローブは、任意の数のこ
の分野において知られている技術(例えば、放射線また
は酵素で標識した)により、後述するように標識するこ
とができる。
に加えて、このプローブのDNAプローブは本発明の他
の好ましい実施態様からなる。このDNAプローブは、
P−2遺伝子(または可能ならば関連する遺伝子)が天
然に存在するかどうか、あるいは特定の形質転換した有
機体がP−2遺伝子を含むかどうかを決定するための、
B.t.系統のスクリーニングを可能とする。この方式
において、また、B.t.のその系統の殺虫活性を推定
することが可能である。また、本発明の範囲内で、この
プローブはより小さいか、あるいはより大きいプローブ
からなることができる。このプローブは、任意の数のこ
の分野において知られている技術(例えば、放射線また
は酵素で標識した)により、後述するように標識するこ
とができる。
5.4P−2遺伝子について濃縮したプラスミドライブ
ラリーの構成 オリゴヌクレオチドプローブを使用して、P−2遺伝子
の少なくともNH2−末端解読領域を含有するするB.
t.DNAの制限断片の大きさを決定した。この決定の
ために、親系統HD263から直接誘導した単一のクロ
ーンの分離物であるHD263−1(U.S.D.
A.、Cotton Insect Research
Unit、テキサス州78520ブラウンスビレ)お
よび親系統HD−1から直接誘導した単一のコロニー分
離物である、系統HD1−1(U.S.D.A.、Co
tton Insect Research Uni
t、テキサス州78520ブラウンスビレ)を、DNA
源として使用した。これらの系統の両者は、P−2結晶
タンパク質を産生することが知られていた。P−2結晶
タンパク質を産生しないB.t.系統EG2158およ
びHD567を、陰性の対照として使用した。
ラリーの構成 オリゴヌクレオチドプローブを使用して、P−2遺伝子
の少なくともNH2−末端解読領域を含有するするB.
t.DNAの制限断片の大きさを決定した。この決定の
ために、親系統HD263から直接誘導した単一のクロ
ーンの分離物であるHD263−1(U.S.D.
A.、Cotton Insect Research
Unit、テキサス州78520ブラウンスビレ)お
よび親系統HD−1から直接誘導した単一のコロニー分
離物である、系統HD1−1(U.S.D.A.、Co
tton Insect Research Uni
t、テキサス州78520ブラウンスビレ)を、DNA
源として使用した。これらの系統の両者は、P−2結晶
タンパク質を産生することが知られていた。P−2結晶
タンパク質を産生しないB.t.系統EG2158およ
びHD567を、陰性の対照として使用した。
DNAを、LB培地中で30℃において中央一対数期ま
で細胞を増殖した後、種々の供与体系統から分離した。
細胞を収穫により収穫し、50ミリモルのトリスHC1
pH7.8、10ミリモルのEDTA、1mg/mのリゾ
チーム中に再懸濁し、そして37℃において60分間イ
ンキュベーションした。細胞をNaDodeSO4の添
加により0.2%の最終濃度に溶菌した。細胞のリゼイ
ドを2回等しい体積のフェノールで、そして1回等しい
体積のクロロホルム/イソアミルアルコール(24/
1)で抽出した。1/10体積の3モルの酢酸ナトリウ
ムおよび2体積のEtOHをリゼイトに添加し、そして
DNAをガラス棒でスプーリングすることによって抽出
した。スプーリングしたDNAを66%のEtOH中で
5分間、そしてジエチルエーテル中で1分間ソーキング
した。スプーリングしたDNAを空気乾燥し、そして脱
イオン水中に再懸濁した。
で細胞を増殖した後、種々の供与体系統から分離した。
細胞を収穫により収穫し、50ミリモルのトリスHC1
pH7.8、10ミリモルのEDTA、1mg/mのリゾ
チーム中に再懸濁し、そして37℃において60分間イ
ンキュベーションした。細胞をNaDodeSO4の添
加により0.2%の最終濃度に溶菌した。細胞のリゼイ
ドを2回等しい体積のフェノールで、そして1回等しい
体積のクロロホルム/イソアミルアルコール(24/
1)で抽出した。1/10体積の3モルの酢酸ナトリウ
ムおよび2体積のEtOHをリゼイトに添加し、そして
DNAをガラス棒でスプーリングすることによって抽出
した。スプーリングしたDNAを66%のEtOH中で
5分間、そしてジエチルエーテル中で1分間ソーキング
した。スプーリングしたDNAを空気乾燥し、そして脱
イオン水中に再懸濁した。
ハイブリダイゼーション実験は、供与体の各々から合計
のDNAをHindIII制限酵素で消化し、消化した
DNAをアガロースゲル上で電気泳動し、そしてDNA
をアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターヘ
サザンのブロット技術により移すことによって実施した
[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.M
ol.Biol.)、98:503−517、1978]。ニト
リロセルロースのフィルターを32℃において次の溶液中
で16時間インキュベーションした:3×SSC(1×
SSC=0.15モルのNaCl/0.015モルのク
エン酸ナトリウム)、0.1%のNaDodeSO4、2
00μg/mのヘパリン、10×デンハルト溶液(1
×=0.02%のウシ血清アルブミン/0.02%のフ
ィコール(Ficoll)/0.02%のポリビニル−ピロリド
ン)、ガンマ−P32−ATPおよびT4キナーゼで放
射線標識したP−2遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブのほぼ1μgを含有する。ハイブリダイゼーショ
ン後、ニトロセルロースのフィルターを3×SSC、
0.1%のNaDodeSO4で32℃において1時間
洗浄し、そしてフィルターをX線フィルムに露出した。
得られるオートラジオグラムは、オリゴヌクレオチドプ
ローブが系統HD263−1からほぼ9.0および5.
0kbのDNAの2つのHindIII断片に特異的に
ハイブリダイゼーションしたことを示した。プローブは
系統HD1−1からのDNAの明らかに同一の9.0お
よび5.0kbのHindIII断片にハイブリダイゼ
ーションした。プローブは、P−2結晶タンパク質を合
成しないB.t.の2つの系統、EG2158およびH
D567からのDNAの制限断片にハイブリダイゼーシ
ョンすることができなかった。
のDNAをHindIII制限酵素で消化し、消化した
DNAをアガロースゲル上で電気泳動し、そしてDNA
をアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターヘ
サザンのブロット技術により移すことによって実施した
[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.M
ol.Biol.)、98:503−517、1978]。ニト
リロセルロースのフィルターを32℃において次の溶液中
で16時間インキュベーションした:3×SSC(1×
SSC=0.15モルのNaCl/0.015モルのク
エン酸ナトリウム)、0.1%のNaDodeSO4、2
00μg/mのヘパリン、10×デンハルト溶液(1
×=0.02%のウシ血清アルブミン/0.02%のフ
ィコール(Ficoll)/0.02%のポリビニル−ピロリド
ン)、ガンマ−P32−ATPおよびT4キナーゼで放
射線標識したP−2遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプ
ローブのほぼ1μgを含有する。ハイブリダイゼーショ
ン後、ニトロセルロースのフィルターを3×SSC、
0.1%のNaDodeSO4で32℃において1時間
洗浄し、そしてフィルターをX線フィルムに露出した。
得られるオートラジオグラムは、オリゴヌクレオチドプ
ローブが系統HD263−1からほぼ9.0および5.
0kbのDNAの2つのHindIII断片に特異的に
ハイブリダイゼーションしたことを示した。プローブは
系統HD1−1からのDNAの明らかに同一の9.0お
よび5.0kbのHindIII断片にハイブリダイゼ
ーションした。プローブは、P−2結晶タンパク質を合
成しないB.t.の2つの系統、EG2158およびH
D567からのDNAの制限断片にハイブリダイゼーシ
ョンすることができなかった。
2つのHindIII断片、9.0および5.0kbの
うちどれが、オリゴヌクレオチドプローブに最も強くハ
イブリダイゼーションするかを決定することは必要であ
った。なぜなら、最も強くハイブリダイゼーションする
断片はP−2遺伝子を含有する可能性が最も強いであろ
うからである。ハイブリダイゼーションの強度は、プロ
ーブがニトロセルロースのフィルター上でDNA断片に
結合して止まる最高の洗浄温度により測定する。したが
って、ニトロセルロースのフィルターは3×SSC、
0.1%のNaDodeSO4中で漸進的により高い温度で反復
して洗浄し、洗浄の各々はオートラジオグラフィーによ
り追跡し、これは温度が放射線プローブがもはや9.0
kbの断片にハイブリダイゼーションしないが、もっぱ
ら5.0kbのバンドへハイブリダイゼーションするよ
うに見える温度(50℃)に到達するまで実施した。し
たがって、P−2遺伝子の少なくともNH2−末端解読領
域が系統HD263−1およびHD1−1からの5.0
kbのHindIII断片上に存在することを決定し
た。
うちどれが、オリゴヌクレオチドプローブに最も強くハ
イブリダイゼーションするかを決定することは必要であ
った。なぜなら、最も強くハイブリダイゼーションする
断片はP−2遺伝子を含有する可能性が最も強いであろ
うからである。ハイブリダイゼーションの強度は、プロ
ーブがニトロセルロースのフィルター上でDNA断片に
結合して止まる最高の洗浄温度により測定する。したが
って、ニトロセルロースのフィルターは3×SSC、
0.1%のNaDodeSO4中で漸進的により高い温度で反復
して洗浄し、洗浄の各々はオートラジオグラフィーによ
り追跡し、これは温度が放射線プローブがもはや9.0
kbの断片にハイブリダイゼーションしないが、もっぱ
ら5.0kbのバンドへハイブリダイゼーションするよ
うに見える温度(50℃)に到達するまで実施した。し
たがって、P−2遺伝子の少なくともNH2−末端解読領
域が系統HD263−1およびHD1−1からの5.0
kbのHindIII断片上に存在することを決定し
た。
P−2遺伝子が濃縮したプラスミドのライブラリーは、
HD263−1の合計のHindIIIで消化し、消化
したDNAをアガロースゲル上で電気泳動し、そしてほ
ぼ4.0〜6.0kbの大きさの範囲のHindIII
DNA断片を含有するゲルのスライスを切除すること
によって構成した。4.0〜6.0kbの大きさの範囲
HD263−1HindIII断片を、アガロースゲル
のスライスから電気浴離し、フェノール+クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱し、そしてプラスミドpBR
322(HindIIIで消化し、そしてアルカリ性ホ
スファターゼで処理した)のHindIII部位中に結
合した。アルカリ性ホスファターゼは、pBR322+
HD263−1のDNAのHindIII断片から成る
組み換え体プローブが形成する可能性を大きく増加し
た。得られる結合混合物は、撹拌HD263−1からの
P−2毒素遺伝子について濃縮された組み換え体プラス
ミドのライブラリーから成っていた。
HD263−1の合計のHindIIIで消化し、消化
したDNAをアガロースゲル上で電気泳動し、そしてほ
ぼ4.0〜6.0kbの大きさの範囲のHindIII
DNA断片を含有するゲルのスライスを切除すること
によって構成した。4.0〜6.0kbの大きさの範囲
HD263−1HindIII断片を、アガロースゲル
のスライスから電気浴離し、フェノール+クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱し、そしてプラスミドpBR
322(HindIIIで消化し、そしてアルカリ性ホ
スファターゼで処理した)のHindIII部位中に結
合した。アルカリ性ホスファターゼは、pBR322+
HD263−1のDNAのHindIII断片から成る
組み換え体プローブが形成する可能性を大きく増加し
た。得られる結合混合物は、撹拌HD263−1からの
P−2毒素遺伝子について濃縮された組み換え体プラス
ミドのライブラリーから成っていた。
5.5P−2遺伝子を含有する5.2kbのHindI
II断片のコロニーのハイブリダイゼーションおよび分
離 P−2遺伝子が濃縮したプラスミドのライブラリーを、
CaCl2の手順により、E.coli、HB101のアン
ピシリン感受性宿主菌株[ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ(Bethesda Reseach Laboratories)、ミゾリー
州ベセスダ]中に形質転換した。E.coli、HB1
01菌株はP−2タンパク質を合成せず、したがって、
P−2遺伝子を含有することが期待されないであろう。
II断片のコロニーのハイブリダイゼーションおよび分
離 P−2遺伝子が濃縮したプラスミドのライブラリーを、
CaCl2の手順により、E.coli、HB101のアン
ピシリン感受性宿主菌株[ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ(Bethesda Reseach Laboratories)、ミゾリー
州ベセスダ]中に形質転換した。E.coli、HB1
01菌株はP−2タンパク質を合成せず、したがって、
P−2遺伝子を含有することが期待されないであろう。
E.coliは、これらの細胞が組み換え体プラスミド
で容易に形質転換されるので、宿主菌株として使用し
た。組み換え体プラスミドを獲得するすべての宿主細胞
は、アンピシリン耐性となるであろう。組み換え体プラ
スミドへ暴露した後、E.coli宿主細胞をアンピシ
リンを含有する固体培地上へ広げ、そして組み換え体プ
ラスミドを収容する細胞はコロニーに増殖することがで
きた。アンピシリン耐性の宿主コロニーの各々はBR3
22+供与体系統HD263−1のDNAからの独特H
indIII断片から構成された組み換え体プラスミド
の多くのコピーを収容するであろうことが、期待され
た。しかしながら、組み換え体プラスミド中の供与体系
統HindIII断片は、コロニー毎に異なるであろ
う。
で容易に形質転換されるので、宿主菌株として使用し
た。組み換え体プラスミドを獲得するすべての宿主細胞
は、アンピシリン耐性となるであろう。組み換え体プラ
スミドへ暴露した後、E.coli宿主細胞をアンピシ
リンを含有する固体培地上へ広げ、そして組み換え体プ
ラスミドを収容する細胞はコロニーに増殖することがで
きた。アンピシリン耐性の宿主コロニーの各々はBR3
22+供与体系統HD263−1のDNAからの独特H
indIII断片から構成された組み換え体プラスミド
の多くのコピーを収容するであろうことが、期待され
た。しかしながら、組み換え体プラスミド中の供与体系
統HindIII断片は、コロニー毎に異なるであろ
う。
ほぼ2,000の個々のアンピシリン耐性コロニーを、
ニトロセルロースのフィルター上にブロッティングし
た。コロニーの複製を、後述するように後に使用するた
めに取っておいた。コロニー中に含有される組み換え体
プラスミドは、コロニーをNaOHおよびNH4アセテー
トで処理することによってニトロセルロースのフィルタ
ーへ結合させた。得られるニトロセルロースのフィルタ
ーは1列の組み換え体プラスミドを含有し、それらの各
々は他の組み換え体プラスミドから物理学的に分離し
た。ニトロセルロースのフィルターを50℃において1
6時間次の溶液中でハイブリダイゼーションした:3×
SSC、200μg/mのヘパリン、0.1%のNaDo
deSO4、10×デンハルト溶液およびほぼ1μgの放射
線標識したP−2遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブ。フィルターを50℃において1時間3×SSC、
0.1%のNaDodeSO4中で洗浄し、そしてX線フィルム
に露出した。得られるオートラジオグラムは、オリゴヌ
クレオチドプローブが組み換え体プラスミドへニトロセ
ルロースのフィルターの4つの異なる位置にハイブリダ
イゼーションしていることを示した。
ニトロセルロースのフィルター上にブロッティングし
た。コロニーの複製を、後述するように後に使用するた
めに取っておいた。コロニー中に含有される組み換え体
プラスミドは、コロニーをNaOHおよびNH4アセテー
トで処理することによってニトロセルロースのフィルタ
ーへ結合させた。得られるニトロセルロースのフィルタ
ーは1列の組み換え体プラスミドを含有し、それらの各
々は他の組み換え体プラスミドから物理学的に分離し
た。ニトロセルロースのフィルターを50℃において1
6時間次の溶液中でハイブリダイゼーションした:3×
SSC、200μg/mのヘパリン、0.1%のNaDo
deSO4、10×デンハルト溶液およびほぼ1μgの放射
線標識したP−2遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロ
ーブ。フィルターを50℃において1時間3×SSC、
0.1%のNaDodeSO4中で洗浄し、そしてX線フィルム
に露出した。得られるオートラジオグラムは、オリゴヌ
クレオチドプローブが組み換え体プラスミドへニトロセ
ルロースのフィルターの4つの異なる位置にハイブリダ
イゼーションしていることを示した。
オートラジオグラムをコロニーのレプリカと整列させる
ことによって、組み換え体プラスミドがオリゴヌクレオ
チドプローブと明らかにハイブリダイゼーションしてい
る4つのコロニーを同定することができた。
ことによって、組み換え体プラスミドがオリゴヌクレオ
チドプローブと明らかにハイブリダイゼーションしてい
る4つのコロニーを同定することができた。
組み換え体プラスミドを4つのコロニーの各々から抽出
した。プラスミドをHindIIIで消化し、そしてア
ガロースゲル上で電気泳動した。4つのプラスミドの3
つは、pBR322+HD263−1の明らかに同一の
大きさの5.2kbのHindIII断片から成ってい
た。プラスミドをアガロースゲルからニトロセルロース
のフィルターへサザンのブロット技術により移した。ニ
トロセルロースのフィルターを放射線標識したオリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリダイゼーションし、そし
てX線フィルムへ露出した。得られるオートラジオグラ
ムは、オリゴヌクレオチドプローブが3つの組み換え体
プラスミドの各々において5.2kbのHindIII
の断片にもっぱらハイブリダイゼーションしたことを示
した。これらの組み換え体プラスミド1つ、pEG20
1と表示する、をそれ以上の実験および評価のために選
択した。pEG201を収容するもとのE.coliコ
ロニーはEG1304と表示した。
した。プラスミドをHindIIIで消化し、そしてア
ガロースゲル上で電気泳動した。4つのプラスミドの3
つは、pBR322+HD263−1の明らかに同一の
大きさの5.2kbのHindIII断片から成ってい
た。プラスミドをアガロースゲルからニトロセルロース
のフィルターへサザンのブロット技術により移した。ニ
トロセルロースのフィルターを放射線標識したオリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリダイゼーションし、そし
てX線フィルムへ露出した。得られるオートラジオグラ
ムは、オリゴヌクレオチドプローブが3つの組み換え体
プラスミドの各々において5.2kbのHindIII
の断片にもっぱらハイブリダイゼーションしたことを示
した。これらの組み換え体プラスミド1つ、pEG20
1と表示する、をそれ以上の実験および評価のために選
択した。pEG201を収容するもとのE.coliコ
ロニーはEG1304と表示した。
5.6クローニングした5.2kbのHindIII断
片上のP−2遺伝子の位置 クローニングした5.2kbのHindIII断片上の
P−2遺伝子の少なくともNH2−末端解読領域を含有す
るようであった。5.2kbの断片上のP−2遺伝子の
存在は、P−2タンパク質のNH2−末端をエンコードす
るクローニングした5.2kbの断片中のある領域につ
いて探索するためにDNA配列決定を使用して、評価し
た。2kbより長いDNA断片を配列決定することは困
難であるので、P−2遺伝子を含有することが期待され
る5.2kbの断片内のDNAのより小さい断片を同定
することが必要であった。したがって、プラスミドpE
G201を種々の制限酵素で消化し、消化したプラスミ
ドをアガロースゲルを通して電気泳動し、そしてプラス
ミド制限断片をゲルからニトロセルロースのフィルター
へブロッティングした。フィルターと放射線標識したオ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
により、プローブはDNAの1.3kbのSau3A制
限断片へ特異的にハイブリダイゼーションしたことが示
された。したがって、1.3kgの断片はP−2遺伝子の
少なくともNH2−末端解読領域を含有することが期待さ
れた。
片上のP−2遺伝子の位置 クローニングした5.2kbのHindIII断片上の
P−2遺伝子の少なくともNH2−末端解読領域を含有す
るようであった。5.2kbの断片上のP−2遺伝子の
存在は、P−2タンパク質のNH2−末端をエンコードす
るクローニングした5.2kbの断片中のある領域につ
いて探索するためにDNA配列決定を使用して、評価し
た。2kbより長いDNA断片を配列決定することは困
難であるので、P−2遺伝子を含有することが期待され
る5.2kbの断片内のDNAのより小さい断片を同定
することが必要であった。したがって、プラスミドpE
G201を種々の制限酵素で消化し、消化したプラスミ
ドをアガロースゲルを通して電気泳動し、そしてプラス
ミド制限断片をゲルからニトロセルロースのフィルター
へブロッティングした。フィルターと放射線標識したオ
リゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
により、プローブはDNAの1.3kbのSau3A制
限断片へ特異的にハイブリダイゼーションしたことが示
された。したがって、1.3kgの断片はP−2遺伝子の
少なくともNH2−末端解読領域を含有することが期待さ
れた。
1.3kbの断片をpEG201からDNA配列決定c
emp18およびmp19[ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ(Bethesda Reseach Laboratories)、ミゾリ
ー州ベセスダ]中にサブクローニングした。1.3kb
の断片のDNA配列決定により、それはP−2タンパク
質のNH2−末端をエンコードするDNAの領域を含有す
ることを明らかにした。これは結論的に実証するよう
に、供与体系統HD263−1からのクローニングした
5.2kbのHindIII断片はP−2遺伝子を含有
した。1.3kbの追加のDNA配列決定は、AccI
制限部位がP−2遺伝子のNH2−末端のメチオニンのコ
ドンから150ヌクレオチド上流に位置することを示し
た。このAccI部位の位置はマーカーとして働いた。
それにより、5.2kbの断片中P−2遺伝子の位置は
後述するように精確に決定することができた。
emp18およびmp19[ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ(Bethesda Reseach Laboratories)、ミゾリ
ー州ベセスダ]中にサブクローニングした。1.3kb
の断片のDNA配列決定により、それはP−2タンパク
質のNH2−末端をエンコードするDNAの領域を含有す
ることを明らかにした。これは結論的に実証するよう
に、供与体系統HD263−1からのクローニングした
5.2kbのHindIII断片はP−2遺伝子を含有
した。1.3kbの追加のDNA配列決定は、AccI
制限部位がP−2遺伝子のNH2−末端のメチオニンのコ
ドンから150ヌクレオチド上流に位置することを示し
た。このAccI部位の位置はマーカーとして働いた。
それにより、5.2kbの断片中P−2遺伝子の位置は
後述するように精確に決定することができた。
クローニングした5.2kbの断片上のP−2遺伝子の
転写の位置および方向は、5.2kbの断片をAccI
と種々の制限酵素のとの組み合わせで消化することによ
って決定した。制限断片をアガロースゲルを通して電気
泳動し、そしてニトロセルロースのフィルター上にブロ
ッティングした。フィルターを放射線標識したP−2遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイ
ゼーションすることにより、より大きい5.2kbの断
片上の種々の制限断片の位置および方向を決定すること
ができた。この知識から、5.2kbの断片上のP−2
遺伝子の転写の位置および方向は第1図に矢印で示すよ
うに決定された。第1図はpEG201の制限地図を示
す。箱の区域はプラスミドベクターのDNAを意味す
る。pBR322ベクターは開いた箱の区域で示す。水
平の線は系統HD263−1からのクローニングした
B.t.DNAを意味する。大きい矢印は、P−2遺伝
子の解読領域を示す。プラスミドpEG204は下に記
載する。P−2遺伝子の長さは、P−2タンパク質の推
定した大きさ(68KDa)に基づいてほぼ1.9kb
であると推定された。
転写の位置および方向は、5.2kbの断片をAccI
と種々の制限酵素のとの組み合わせで消化することによ
って決定した。制限断片をアガロースゲルを通して電気
泳動し、そしてニトロセルロースのフィルター上にブロ
ッティングした。フィルターを放射線標識したP−2遺
伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイ
ゼーションすることにより、より大きい5.2kbの断
片上の種々の制限断片の位置および方向を決定すること
ができた。この知識から、5.2kbの断片上のP−2
遺伝子の転写の位置および方向は第1図に矢印で示すよ
うに決定された。第1図はpEG201の制限地図を示
す。箱の区域はプラスミドベクターのDNAを意味す
る。pBR322ベクターは開いた箱の区域で示す。水
平の線は系統HD263−1からのクローニングした
B.t.DNAを意味する。大きい矢印は、P−2遺伝
子の解読領域を示す。プラスミドpEG204は下に記
載する。P−2遺伝子の長さは、P−2タンパク質の推
定した大きさ(68KDa)に基づいてほぼ1.9kb
であると推定された。
5.7クローニングしたP−2遺伝子のDNA配列 P−2遺伝子のすべてまたは少なくともほとんどは、ク
ローニングした5.2kbの断片内の2.2kbのAc
cI−HindIII断片中に含有するされると、推定
された(第1図)。したがって、2.2kbのAccI
−HindIII断片は、配列決定ベクターmp18お
よびmp19中にサブクローニングし、そして、2.2
kbの断片の完全な配列をサンガー(Sanger)のジデオキ
シ手順により決定した[Sanger、F.,Nick
len,S.およびCoulson,A.R.(197
7)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)US
A、74:5463−5467]。期待されるように、
2.2kbの断片は、P−2タンパク質のためのNH2−
末端コドンで開始する、オープンリーディングフレーム
(タンパク質解読領域)を含有した。本発明のP−2遺
伝子およびP−2タンパク質の推定のアミノ酸配列を含
む、2.2kbの断片のDNA配列は、第2図に示され
ている。第2図は、AccI部位の最初のヌクレオチド
で開始しそしてHindIII部位の最後のヌクレオチ
ドで終る、2.2kbのAccI−HindIIIの完
全なDNA配列を示す。AccI部位はP−2遺伝子の
NH2−末端メチオニンのコドンから150ヌクレオチド
上流に位置する。P−2遺伝子配列から推定した、P−
2タンパク質の大きさは、66,547ダルトンであっ
た。
ローニングした5.2kbの断片内の2.2kbのAc
cI−HindIII断片中に含有するされると、推定
された(第1図)。したがって、2.2kbのAccI
−HindIII断片は、配列決定ベクターmp18お
よびmp19中にサブクローニングし、そして、2.2
kbの断片の完全な配列をサンガー(Sanger)のジデオキ
シ手順により決定した[Sanger、F.,Nick
len,S.およびCoulson,A.R.(197
7)プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)US
A、74:5463−5467]。期待されるように、
2.2kbの断片は、P−2タンパク質のためのNH2−
末端コドンで開始する、オープンリーディングフレーム
(タンパク質解読領域)を含有した。本発明のP−2遺
伝子およびP−2タンパク質の推定のアミノ酸配列を含
む、2.2kbの断片のDNA配列は、第2図に示され
ている。第2図は、AccI部位の最初のヌクレオチド
で開始しそしてHindIII部位の最後のヌクレオチ
ドで終る、2.2kbのAccI−HindIIIの完
全なDNA配列を示す。AccI部位はP−2遺伝子の
NH2−末端メチオニンのコドンから150ヌクレオチド
上流に位置する。P−2遺伝子配列から推定した、P−
2タンパク質の大きさは、66,547ダルトンであっ
た。
5.8クローニングされたP−2遺伝子の特異的ハイブ
リダイゼーションプローブとしての使用 5.8.1P−2遺伝子を含有する天然のB.t.プラ
スミドの同定 クローニングしたDNA配列の1つの利点は、それを使
用してDNAの特徴づけしない試料中の関連するDNA
配列を同定することができるということである。P−2
遺伝子の場合において、今回、クローニングした遺伝子
を使用して、B.t.の系統中のP−2遺伝子の存在を
検出することが可能である。B.t.のほとんどの系統
は、染色体のDNAに加えて多数の天然プラスミドを含
有する。これらの系統の多くについて、染色体上または
プラスミドの1つ上にP−2遺伝子が存在するかどうか
は知られていない。
リダイゼーションプローブとしての使用 5.8.1P−2遺伝子を含有する天然のB.t.プラ
スミドの同定 クローニングしたDNA配列の1つの利点は、それを使
用してDNAの特徴づけしない試料中の関連するDNA
配列を同定することができるということである。P−2
遺伝子の場合において、今回、クローニングした遺伝子
を使用して、B.t.の系統中のP−2遺伝子の存在を
検出することが可能である。B.t.のほとんどの系統
は、染色体のDNAに加えて多数の天然プラスミドを含
有する。これらの系統の多くについて、染色体上または
プラスミドの1つ上にP−2遺伝子が存在するかどうか
は知られていない。
クローニングしたP−2遺伝子を使用して天然B.t.
宿主系統中のP−2遺伝子の位置を検出することができ
るかどうかを決定するために、B.t.系統HD263
−1、HD1−1、HD567およびHD278をエク
ハルト(Eckhardt)の手順[Eckhardt.T.(1
978)プラスミド(Plasmid)1:584−588]に
より溶菌し、そしてリゼイドをアガロースゲルを通して
電気泳動した。この手順は特定の系統中に含有されるす
べてのプラスミドの大きさにより分離を可能とした。分
離した血漿をアガロースゲルからニトロセルロースのフ
ィルターに、サザンのブロット手順により移した。ニト
ロセルロースのフィルターを放射線標識した2.2kb
のAccI−HindIII(P−2遺伝子)断片とハ
イブリダイゼーションした。ニトロセルロースのフィル
ターのオートラジオグラフィーにより、P−2遺伝子の
断片は、P−2産生性の系統HD263−1、HD1−
1おおびHD278中のほぼ110MDaの1つのプラ
スミドにもっぱらハイブリダイゼーションすることが明
らかにされた(第3図)。クローニングしたP−2遺伝
子はP−2陰性系統HD567中のいずれのプラスミド
へもハイブリダイゼーションしなかった。したがって、
この実験が実証するように、クローニングしたP−2遺
伝子は直接の方法で使用して、B.t.系統中にP−2
遺伝子を含有する天然プラスミドを同定することができ
た。クローニングしたP−2遺伝子とのDNAのハイブ
リダイゼーションは、B.t.中に存在する多くのこの
ようなプラスミドの中からP−2遺伝子を支持する単一
のプラスミドの直接の同定を可能とした。
宿主系統中のP−2遺伝子の位置を検出することができ
るかどうかを決定するために、B.t.系統HD263
−1、HD1−1、HD567およびHD278をエク
ハルト(Eckhardt)の手順[Eckhardt.T.(1
978)プラスミド(Plasmid)1:584−588]に
より溶菌し、そしてリゼイドをアガロースゲルを通して
電気泳動した。この手順は特定の系統中に含有されるす
べてのプラスミドの大きさにより分離を可能とした。分
離した血漿をアガロースゲルからニトロセルロースのフ
ィルターに、サザンのブロット手順により移した。ニト
ロセルロースのフィルターを放射線標識した2.2kb
のAccI−HindIII(P−2遺伝子)断片とハ
イブリダイゼーションした。ニトロセルロースのフィル
ターのオートラジオグラフィーにより、P−2遺伝子の
断片は、P−2産生性の系統HD263−1、HD1−
1おおびHD278中のほぼ110MDaの1つのプラ
スミドにもっぱらハイブリダイゼーションすることが明
らかにされた(第3図)。クローニングしたP−2遺伝
子はP−2陰性系統HD567中のいずれのプラスミド
へもハイブリダイゼーションしなかった。したがって、
この実験が実証するように、クローニングしたP−2遺
伝子は直接の方法で使用して、B.t.系統中にP−2
遺伝子を含有する天然プラスミドを同定することができ
た。クローニングしたP−2遺伝子とのDNAのハイブ
リダイゼーションは、B.t.中に存在する多くのこの
ようなプラスミドの中からP−2遺伝子を支持する単一
のプラスミドの直接の同定を可能とした。
5.8.2 P−2遺伝子を含有するDNA制限断片の
同定 B.t.系統HD263−1からのクローニングしたP
−2遺伝子は、DNAの5.2kbのHindIII断
片上に含有されていた。クローニングしたP−2遺伝子
を使用して、P−2遺伝子を含有する同様なDNAの制
限断片をB.t.の他の系統から同定することができる
かどうかを決定するために、ある方法を実施した。した
がって、試験系統HD1−1、HD278、HD567
およびもとの供与体系統HD263−1からの合計のD
NAをHindIII制限酵素で消化し、消化したDN
Aをアガロースゲルを通して電気泳動し、そして消化し
たDNAをゲルからニトロセルロースのフィルターへ移
した。フィルターを55℃において放射線標識した2.
2kbのAccI−HindIIIのDNA(P−2遺
伝子)断片とハイブリダイゼーションしそして、55℃
において洗浄した後、フィルターをX線フィルムに露出
した。
同定 B.t.系統HD263−1からのクローニングしたP
−2遺伝子は、DNAの5.2kbのHindIII断
片上に含有されていた。クローニングしたP−2遺伝子
を使用して、P−2遺伝子を含有する同様なDNAの制
限断片をB.t.の他の系統から同定することができる
かどうかを決定するために、ある方法を実施した。した
がって、試験系統HD1−1、HD278、HD567
およびもとの供与体系統HD263−1からの合計のD
NAをHindIII制限酵素で消化し、消化したDN
Aをアガロースゲルを通して電気泳動し、そして消化し
たDNAをゲルからニトロセルロースのフィルターへ移
した。フィルターを55℃において放射線標識した2.
2kbのAccI−HindIIIのDNA(P−2遺
伝子)断片とハイブリダイゼーションしそして、55℃
において洗浄した後、フィルターをX線フィルムに露出
した。
第3図(3A)は臭化エチジウム染色したエクハルト(E
ckhardt)ゲルの写真である。B.t.の種々の系統中に
存在する天然プラスミドは見ることができる。3Aが示
すように、B.t.のほとんどの系統はいくつかの天然
プラスミドを含有する。この図面の左の数字は、プラス
ミドのメガダルトン(MDa)の大きさを示す。
ckhardt)ゲルの写真である。B.t.の種々の系統中に
存在する天然プラスミドは見ることができる。3Aが示
すように、B.t.のほとんどの系統はいくつかの天然
プラスミドを含有する。この図面の左の数字は、プラス
ミドのメガダルトン(MDa)の大きさを示す。
第3図(3B)は、放射線標識したクローニングしたP
−2遺伝子を3Aに示すプラスミドとハイブリダイゼー
ションして作った、オートラジオグラムの写真である。
3Bが示すように、クローニングしたP−2遺伝子は、
P−2タンパク質を産生することが知られているB.
t.の3つの系統(HD−1、HD263−1およびH
D278)において110MDaのプラスミドにもっぱ
らハイブリダイゼーションした。クローニングしたP−
2遺伝子は、また、30MDaのDNAのバンドにハイ
ブリダイゼーションした(第3図(3B))。このDN
Aのバンドは、110MDaのプラスミドの破壊から得
られたDNA断片であった。非常に大きいプラスミド、
例えば、110MDaのプラスミドは、エクハルト(Eck
hardt)型ゲルを通す電気泳動の間に、より小さい断片に
しばしば破壊する。110MDaのプラスミドへのクロ
ーニングしたP−2遺伝子の特異的ハイブリダイゼーシ
ョンは、系統HD−1、HD263−1およびHD27
8について、110MDaのプラスミドのみがP−2遺
伝子を有することを示す。クローニングしたP−2遺伝
子は、P−2タンパク質を産生しない系統(HD56
7)からのいずれのプラスミドにもハイブリダイゼーシ
ョンしなかった。全体的に、第3図(3Aおよび3B)
が実証するように、クローニングしたP−2遺伝子は天
然B.t.プラスミド上のP−2遺伝子の同定のための
特異的プローブとして使用することができる。
−2遺伝子を3Aに示すプラスミドとハイブリダイゼー
ションして作った、オートラジオグラムの写真である。
3Bが示すように、クローニングしたP−2遺伝子は、
P−2タンパク質を産生することが知られているB.
t.の3つの系統(HD−1、HD263−1およびH
D278)において110MDaのプラスミドにもっぱ
らハイブリダイゼーションした。クローニングしたP−
2遺伝子は、また、30MDaのDNAのバンドにハイ
ブリダイゼーションした(第3図(3B))。このDN
Aのバンドは、110MDaのプラスミドの破壊から得
られたDNA断片であった。非常に大きいプラスミド、
例えば、110MDaのプラスミドは、エクハルト(Eck
hardt)型ゲルを通す電気泳動の間に、より小さい断片に
しばしば破壊する。110MDaのプラスミドへのクロ
ーニングしたP−2遺伝子の特異的ハイブリダイゼーシ
ョンは、系統HD−1、HD263−1およびHD27
8について、110MDaのプラスミドのみがP−2遺
伝子を有することを示す。クローニングしたP−2遺伝
子は、P−2タンパク質を産生しない系統(HD56
7)からのいずれのプラスミドにもハイブリダイゼーシ
ョンしなかった。全体的に、第3図(3Aおよび3B)
が実証するように、クローニングしたP−2遺伝子は天
然B.t.プラスミド上のP−2遺伝子の同定のための
特異的プローブとして使用することができる。
第4図(4A)は、系統HD1−1(レーン2)、HD
567(レーン3)、HD278(レーン4)およびH
D263−1(レーン5)からHindIII消化した
DNAを含有する、臭化エチジウム染色したアガロース
ゲルの写真である。第4図(4A)が示すように、Hi
ndIIIで消化した合計のB.t.DNAは数百の異
なる大きさの断片に分割された。1としるすレーンは、
HindIIIで消化したラムダDNAを含有した。こ
れは大きさのマーカーとして働く。左の数字は、DNA
断片の大きさをキロ塩基(kb)で示す。
567(レーン3)、HD278(レーン4)およびH
D263−1(レーン5)からHindIII消化した
DNAを含有する、臭化エチジウム染色したアガロース
ゲルの写真である。第4図(4A)が示すように、Hi
ndIIIで消化した合計のB.t.DNAは数百の異
なる大きさの断片に分割された。1としるすレーンは、
HindIIIで消化したラムダDNAを含有した。こ
れは大きさのマーカーとして働く。左の数字は、DNA
断片の大きさをキロ塩基(kb)で示す。
第4図(4B)は、放射線標識したクローニングしたP
−2遺伝子を4Aに示すHindIII断片とハイブリ
ダイゼーションすることによって作った、オートラジオ
グラムの写真である。全体的に、第4図(4Aおよび4
B)が実証するように、クローニングしたP−2遺伝子
はP−2遺伝子を含有するDNA制限断片の同定のため
の特異的プローブとして使用することができる。
−2遺伝子を4Aに示すHindIII断片とハイブリ
ダイゼーションすることによって作った、オートラジオ
グラムの写真である。全体的に、第4図(4Aおよび4
B)が実証するように、クローニングしたP−2遺伝子
はP−2遺伝子を含有するDNA制限断片の同定のため
の特異的プローブとして使用することができる。
オートラジオグラムが示すように、期待したように、ク
ローニングしたP−2遺伝子はHD263−1からの
5.2kbのHindIII断片にハイブリダイゼーシ
ョンした(第4図(4B)レーン5)。驚くべきことに
は、P−2遺伝子は、また、系統HD263−1からの
9.0kbのHindIII断片にハイブリダイゼーシ
ョンした(第4図(4B)、レーン5)。P−2遺伝子
は、系統HD1−1における5.2および9.0kbの
HindIII断片に(第4図(4B)、レーン2)、
および系統HD278における5.2および4.4kb
のHindIII断片に(第4図(4B)、レーン4)
ハイブリダイゼーションした。P−2遺伝子は、P−2
陰性系統HD567からのいずれのHindIII断片
へもハイブリダイゼーションしなかった(第4図(4
B)、レーン3)。ニトロセルロースのフィルターを8
0℃において再洗浄し、そしてX線フィルムに露出し
た。得られるオートラジオグラムが示すように、より高
い洗浄温度後、標識したP−2遺伝子のプローブの有意
により少なくが、5.2kb断片に比較して、9.0お
よび4.4kbの断片に結合した(第4図(4C)、レ
ーン2、4および5)。
ローニングしたP−2遺伝子はHD263−1からの
5.2kbのHindIII断片にハイブリダイゼーシ
ョンした(第4図(4B)レーン5)。驚くべきことに
は、P−2遺伝子は、また、系統HD263−1からの
9.0kbのHindIII断片にハイブリダイゼーシ
ョンした(第4図(4B)、レーン5)。P−2遺伝子
は、系統HD1−1における5.2および9.0kbの
HindIII断片に(第4図(4B)、レーン2)、
および系統HD278における5.2および4.4kb
のHindIII断片に(第4図(4B)、レーン4)
ハイブリダイゼーションした。P−2遺伝子は、P−2
陰性系統HD567からのいずれのHindIII断片
へもハイブリダイゼーションしなかった(第4図(4
B)、レーン3)。ニトロセルロースのフィルターを8
0℃において再洗浄し、そしてX線フィルムに露出し
た。得られるオートラジオグラムが示すように、より高
い洗浄温度後、標識したP−2遺伝子のプローブの有意
により少なくが、5.2kb断片に比較して、9.0お
よび4.4kbの断片に結合した(第4図(4C)、レ
ーン2、4および5)。
上はクローニングしたP−2遺伝子のいくつかの好まし
い使用を実証する。第1に、系統HD263−1からの
クローニングしたP−2遺伝子は他のB.t.系統から
のP−2遺伝子を含有するDNA制限断片を同定するた
めに使用することができる。例えば、クローニングした
P−2遺伝子は系統HD1−1からの2つのHindI
II断片にハイブリダイゼーションした。第2に、クロ
ーニングした遺伝子は、特定のB.t.系統中に存在す
るP−2遺伝子の数の決定を可能とする。例えば、系統
HD263−1は、P−2遺伝子のプローブが系統HD
263−1から2つのHindIII制限断片にハイブ
リダイゼーションしたので、2つのP−2遺伝子を含有
することが分かった。P−2遺伝子特異的オリゴヌクレ
オチドプローブが、また、系統HD263−1からの
9.0および5.2kbの2つのHindIII断片に
ハイブリダイゼーションしたということは、意味がある
ことである。
い使用を実証する。第1に、系統HD263−1からの
クローニングしたP−2遺伝子は他のB.t.系統から
のP−2遺伝子を含有するDNA制限断片を同定するた
めに使用することができる。例えば、クローニングした
P−2遺伝子は系統HD1−1からの2つのHindI
II断片にハイブリダイゼーションした。第2に、クロ
ーニングした遺伝子は、特定のB.t.系統中に存在す
るP−2遺伝子の数の決定を可能とする。例えば、系統
HD263−1は、P−2遺伝子のプローブが系統HD
263−1から2つのHindIII制限断片にハイブ
リダイゼーションしたので、2つのP−2遺伝子を含有
することが分かった。P−2遺伝子特異的オリゴヌクレ
オチドプローブが、また、系統HD263−1からの
9.0および5.2kbの2つのHindIII断片に
ハイブリダイゼーションしたということは、意味がある
ことである。
9.0kbの断片上のP−2遺伝子の精確な性質は、
9.0kbの断片が分離され、そしてそのDNA配列が
決定されるまで、知ることができなかった。これはクロ
ーニングしたP−2遺伝子のための第3の使用に導く。
P−2遺伝子は9.0kbのHindIII断片に特異
的にハイブリダイゼーションしたので、クローニングし
たP−2遺伝子(またはその一部または誘導体)はそれ
ゆえ、この断片の分離のための理想的なプローブであ
る。
9.0kbの断片が分離され、そしてそのDNA配列が
決定されるまで、知ることができなかった。これはクロ
ーニングしたP−2遺伝子のための第3の使用に導く。
P−2遺伝子は9.0kbのHindIII断片に特異
的にハイブリダイゼーションしたので、クローニングし
たP−2遺伝子(またはその一部または誘導体)はそれ
ゆえ、この断片の分離のための理想的なプローブであ
る。
第4に、クローニングしたP−2遺伝子はP−2遺伝子
間の関係の急速な定量的推定を可能とする。例えば、ク
ローニングしたP−2遺伝子は、9.0または4.4k
bのHindIII断片のいずれの上に含有されるP−
2遺伝子へよりも、系統HD1−1の5.2kbの断片
上に含有されるP−2遺伝子へ関係づけらられることが
推定される。この関係は、9.0または4.4kbの断
片のいずれへよりも、5.2kbの断片への80℃にお
けるP−2遺伝子のプローブのより強いハイブリダイゼ
ーションにより直接実証された。
間の関係の急速な定量的推定を可能とする。例えば、ク
ローニングしたP−2遺伝子は、9.0または4.4k
bのHindIII断片のいずれの上に含有されるP−
2遺伝子へよりも、系統HD1−1の5.2kbの断片
上に含有されるP−2遺伝子へ関係づけらられることが
推定される。この関係は、9.0または4.4kbの断
片のいずれへよりも、5.2kbの断片への80℃にお
けるP−2遺伝子のプローブのより強いハイブリダイゼ
ーションにより直接実証された。
5.9 P−2毒素の追加の精製 P−2遺伝子は適当なプラスミド中に挿入し、次いでこ
のプラスミドを利用して適当な微生物を形質転換するこ
とができる。B.t.以外の微生物をP−2遺伝子の組
み込みにより形質転換することができる、すなわち、一
般に述べると、バチルス(Bacillus)、大腸菌(Escherich
ia)、およびシアノバクテリア(Cyanobacteria)属からの
微生物を形質転換することができることは、明らかに本
発明の範囲内である。本発明において、有機体バチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium)および大腸菌(Es
cherichia coli)を使用することが好ましい。また、
B.t.の異なる系統を、また、P−2遺伝子の組み込
みにより形質転換することができることは、本発明の範
囲内である。
のプラスミドを利用して適当な微生物を形質転換するこ
とができる。B.t.以外の微生物をP−2遺伝子の組
み込みにより形質転換することができる、すなわち、一
般に述べると、バチルス(Bacillus)、大腸菌(Escherich
ia)、およびシアノバクテリア(Cyanobacteria)属からの
微生物を形質転換することができることは、明らかに本
発明の範囲内である。本発明において、有機体バチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium)および大腸菌(Es
cherichia coli)を使用することが好ましい。また、
B.t.の異なる系統を、また、P−2遺伝子の組み込
みにより形質転換することができることは、本発明の範
囲内である。
そのように形質転換した微生物は、好ましくは、B.
t.の天然系統において産生されるP−2の量をはるか
に越える量で産生するであろう。形質転換した有機体に
より産生されたP−2は、好ましくは、唯一のその有機
体により産生されたデルタ−内毒素である。このように
して、有機体それ自体は単独であるいは殺虫剤組成の一
部として利用することができる。P−2は好ましくはそ
の有機体により産生される唯一の末端であるので、それ
はこの分野において既知の方法、例えば、レノグラフィ
ン密度勾配により他の細胞物質からP−2を精製するた
めの直接の方法である。
t.の天然系統において産生されるP−2の量をはるか
に越える量で産生するであろう。形質転換した有機体に
より産生されたP−2は、好ましくは、唯一のその有機
体により産生されたデルタ−内毒素である。このように
して、有機体それ自体は単独であるいは殺虫剤組成の一
部として利用することができる。P−2は好ましくはそ
の有機体により産生される唯一の末端であるので、それ
はこの分野において既知の方法、例えば、レノグラフィ
ン密度勾配により他の細胞物質からP−2を精製するた
めの直接の方法である。
5.10 植物中へのP−2の形質転換 また、P−2遺伝子(第2図)を植物中に直接挿入し
て、植物それ自体がP−2毒素を産生するようにするこ
とは、本発明の範囲内である。
て、植物それ自体がP−2毒素を産生するようにするこ
とは、本発明の範囲内である。
植物の遺伝子操作は、P−2遺伝子を含有する所望のD
NAを、種々の形態および由来のDNA分子を使用し
て、植物の組織または細胞中に導入することによって達
成することができる。これらはつぎのものを包含する
が、これらに限定されない:天然に産出する植物のベク
ター、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)からのTiプラスミドま
たは植物の病原体、例えば、DNAウイルス、例えば、
カリフラファーのモザイク病ウイルス(CaMV)またはゲミ
ニウイルス(Geminiviruse)、RNAウイルス、およびビ
ロイド(viroid)から誘導されたDNA分子:不安定な植
物ゲノム成分、例えば、細胞器官における染色体外DN
A要素(例えば、葉緑体またはミトコンドリア)、また
は核的にエンコードされた制御要素から誘導されたDN
A分子;安定なゲノム成分(例えば、DNAを導入し
て、細胞器官または核のゲノム中に組み込み、そして複
製させ、すなわち、自立的に複製させ、細胞分割および
植物の性的再生の間に通常分離させ、そして植物の連続
する世代において遺伝させることができる、複製の起源
および他のDNA配列)からのDNA分子。
NAを、種々の形態および由来のDNA分子を使用し
て、植物の組織または細胞中に導入することによって達
成することができる。これらはつぎのものを包含する
が、これらに限定されない:天然に産出する植物のベク
ター、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)からのTiプラスミドま
たは植物の病原体、例えば、DNAウイルス、例えば、
カリフラファーのモザイク病ウイルス(CaMV)またはゲミ
ニウイルス(Geminiviruse)、RNAウイルス、およびビ
ロイド(viroid)から誘導されたDNA分子:不安定な植
物ゲノム成分、例えば、細胞器官における染色体外DN
A要素(例えば、葉緑体またはミトコンドリア)、また
は核的にエンコードされた制御要素から誘導されたDN
A分子;安定なゲノム成分(例えば、DNAを導入し
て、細胞器官または核のゲノム中に組み込み、そして複
製させ、すなわち、自立的に複製させ、細胞分割および
植物の性的再生の間に通常分離させ、そして植物の連続
する世代において遺伝させることができる、複製の起源
および他のDNA配列)からのDNA分子。
P−2遺伝子を含有するDNAは、植物の細胞または組
織中に、感染性プラスミド、例えば、Ti、ウイルスま
たは微生物、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens)、リポソームの使
用、機械的方法によるマイクロ注入および染色体または
染色体断片の使用により、直接供給することができる。
織中に、感染性プラスミド、例えば、Ti、ウイルスま
たは微生物、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens)、リポソームの使
用、機械的方法によるマイクロ注入および染色体または
染色体断片の使用により、直接供給することができる。
5.11 P−2タンパク質を組み込んだ産生物および
配合物 P−2デルタ−内毒素は、鱗翅類および双翅類の昆虫に
対する活性をもつ、効力のある殺虫剤化合物である。し
たがって、P−2タンパク質の毒素を殺虫剤(活性成
分)として、単独で、好ましくは均質または純粋な形態
で、および第2図のアミノ酸配列を有するものを、ある
いはクローニングしたP−2遺伝子を発現する形質転換
した微生物内にを含めてまたはそれと関連して、あるい
はP−2を胞子または他の方法含有するB.t.または
他の形質転換した胞子形成性微生物の混合物で、利用す
ることは、本発明の範囲内である。P−2を含有する本
発明の組成物は、殺虫剤的に有効量で適用され、この量
は因子、例えば、抑制すべき特定の鱗翅類または双翅類
の昆虫、処置すべき特定の植物、および殺虫剤的に活性
な組成物を適用する方法に依存して変化するであろう。
好ましい殺虫剤配合物は、P−2を単独ではまたは形質
転換した微生物中に組み込むか、あるいはそれと関連さ
せて、所望の担体と混合することによってつくられる。
配合物はダストとして、あるいは油(植物性油または鉱
油)中の懸濁液、湿潤性粉末として、あるいは農業上の
応用に適当な任意の他の物質中で、適当な担体アジュバ
ントを使用して、投与することができる。適当な担体
は、固体または液体であり、そして配合技術において通
常使用する物質、例えば、天然または再生の鉱物物質、
溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料
であることができる。
配合物 P−2デルタ−内毒素は、鱗翅類および双翅類の昆虫に
対する活性をもつ、効力のある殺虫剤化合物である。し
たがって、P−2タンパク質の毒素を殺虫剤(活性成
分)として、単独で、好ましくは均質または純粋な形態
で、および第2図のアミノ酸配列を有するものを、ある
いはクローニングしたP−2遺伝子を発現する形質転換
した微生物内にを含めてまたはそれと関連して、あるい
はP−2を胞子または他の方法含有するB.t.または
他の形質転換した胞子形成性微生物の混合物で、利用す
ることは、本発明の範囲内である。P−2を含有する本
発明の組成物は、殺虫剤的に有効量で適用され、この量
は因子、例えば、抑制すべき特定の鱗翅類または双翅類
の昆虫、処置すべき特定の植物、および殺虫剤的に活性
な組成物を適用する方法に依存して変化するであろう。
好ましい殺虫剤配合物は、P−2を単独ではまたは形質
転換した微生物中に組み込むか、あるいはそれと関連さ
せて、所望の担体と混合することによってつくられる。
配合物はダストとして、あるいは油(植物性油または鉱
油)中の懸濁液、湿潤性粉末として、あるいは農業上の
応用に適当な任意の他の物質中で、適当な担体アジュバ
ントを使用して、投与することができる。適当な担体
は、固体または液体であり、そして配合技術において通
常使用する物質、例えば、天然または再生の鉱物物質、
溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料
であることができる。
固体または液体のアジュバントを含有する配合物は、既
知の方法において、例えば、活性成分を増量剤、例え
ば、溶媒、固体の担体、およびある場合において表面活
性化合物(界面活性剤)と均質に混合および/または粉
砕することによって調製する。
知の方法において、例えば、活性成分を増量剤、例え
ば、溶媒、固体の担体、およびある場合において表面活
性化合物(界面活性剤)と均質に混合および/または粉
砕することによって調製する。
適当な液体担体は、植物性油、例えば、ヤシ油、鉱油ま
たは水である。例えば、ダストおよび分散性粉末のため
に使用する固体の担体は、通常天然の鉱物繊維、例え
ば、方解石、タルク、カオリン、アタパルジャイトであ
る。物理学的性質を改良するために、また、高度に分散
性のケイ酸または高度に吸収性のポリマーを添加するこ
とができる。適当な造粒した吸着性担体は、軽石、破壊
した煉瓦、海泡石、およびベントナイトである。適当な
非収着性担体は、シリケートまたは砂のような物質であ
る。さらに、きわめて多数の予備造粒した物質または無
機または有機の混合物、例えば、ことにドロマイトまた
は粉砕した植物残留物を使用することができる。
たは水である。例えば、ダストおよび分散性粉末のため
に使用する固体の担体は、通常天然の鉱物繊維、例え
ば、方解石、タルク、カオリン、アタパルジャイトであ
る。物理学的性質を改良するために、また、高度に分散
性のケイ酸または高度に吸収性のポリマーを添加するこ
とができる。適当な造粒した吸着性担体は、軽石、破壊
した煉瓦、海泡石、およびベントナイトである。適当な
非収着性担体は、シリケートまたは砂のような物質であ
る。さらに、きわめて多数の予備造粒した物質または無
機または有機の混合物、例えば、ことにドロマイトまた
は粉砕した植物残留物を使用することができる。
適当なアニオン性界面活性剤は、水溶性石鹸および水溶
性合成表面活性剤であることができる。
性合成表面活性剤であることができる。
適当な石鹸は、高級脂肪酸(C10−C11)のアルカ
リ金属塩類、アルカリ土類金属類または非置換アンモニ
ウム塩類、例えば、オレイン酸またはステアリン酸のナ
トリウム塩またはカリウム塩、あるいは天然の脂肪酸混
合物、ヤシ油またはタロウ油から得ることができる混合
物である。さらに適当な界面活性剤は、また、脂肪酸メ
チルタウリン塩ならびに変性したまたは未変性のリン脂
質である。
リ金属塩類、アルカリ土類金属類または非置換アンモニ
ウム塩類、例えば、オレイン酸またはステアリン酸のナ
トリウム塩またはカリウム塩、あるいは天然の脂肪酸混
合物、ヤシ油またはタロウ油から得ることができる混合
物である。さらに適当な界面活性剤は、また、脂肪酸メ
チルタウリン塩ならびに変性したまたは未変性のリン脂
質である。
しかしながら、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、
ことに脂肪族スルホネート、脂肪族サルフェート、スル
ホン化ベンズイミダゾールの誘導体またはアルキルアリ
ールスルホネートを使用する。
ことに脂肪族スルホネート、脂肪族サルフェート、スル
ホン化ベンズイミダゾールの誘導体またはアルキルアリ
ールスルホネートを使用する。
脂肪族スルホネートまたはサルフェートは、通常、アル
カリ金属塩、アルカリ土類塩または非置換アンモニウム
塩の形態であり、そして一般にC6−C22アルキル、例え
ば、脂肪酸から得られた、ドデシルサルフェートのナト
リウムまたはカルシウム塩、あるいは脂肪族アルコール
サルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩
を含有する。これらの化合物は、また、脂肪族アルコー
ル/エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステルおよ
びスルホン酸の塩類からなる。スルホン化ベンズイミダ
ゾール誘導体は、好ましくは、2つのスルホン酸基およ
び約8〜22個の炭素原子を含有する1つの脂肪酸残基
を含有する。アルキルアリールスルホネートの例は、次
のとおりである:ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチ
ルナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸
/ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウ
ムまたはトリエタノールアンの塩類。また、対応するホ
スフェート、例えば、p−ノニルフェノールと4〜14
モルのエチレンオキシドとの付加物のリン酸エステルの
塩類は適当である。
カリ金属塩、アルカリ土類塩または非置換アンモニウム
塩の形態であり、そして一般にC6−C22アルキル、例え
ば、脂肪酸から得られた、ドデシルサルフェートのナト
リウムまたはカルシウム塩、あるいは脂肪族アルコール
サルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩
を含有する。これらの化合物は、また、脂肪族アルコー
ル/エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステルおよ
びスルホン酸の塩類からなる。スルホン化ベンズイミダ
ゾール誘導体は、好ましくは、2つのスルホン酸基およ
び約8〜22個の炭素原子を含有する1つの脂肪酸残基
を含有する。アルキルアリールスルホネートの例は、次
のとおりである:ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチ
ルナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸
/ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウ
ムまたはトリエタノールアンの塩類。また、対応するホ
スフェート、例えば、p−ノニルフェノールと4〜14
モルのエチレンオキシドとの付加物のリン酸エステルの
塩類は適当である。
非イオン性界面活性剤は、好ましくは、次のとおりであ
る:ポリグリコールエーテル誘導体または脂肪族または
シクロ脂肪族のアルコールまたは飽和または不飽和の脂
肪酸およびアルキルフェノール、3〜10個のグリコー
ルエーテル基および(脂肪族)炭化水素部分中に8〜2
0個の炭素原子およびアルキルフェノールのアルキル部
分中に6〜18個の炭素原子を含有する前記誘導体。
る:ポリグリコールエーテル誘導体または脂肪族または
シクロ脂肪族のアルコールまたは飽和または不飽和の脂
肪酸およびアルキルフェノール、3〜10個のグリコー
ルエーテル基および(脂肪族)炭化水素部分中に8〜2
0個の炭素原子およびアルキルフェノールのアルキル部
分中に6〜18個の炭素原子を含有する前記誘導体。
他の非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドと
アルキルプロピレングリコールとの水溶性付加物であ
り、エチレンジアミノポリプロピレングリコールおよび
アルキルプロピレングリコールはアルキル鎖中に1〜1
0個の炭素原子を含有し前記付加物は20〜250のエ
チレングリコールエーテル基および10〜100個のプ
ロピレングルコールエーテル基を含有する。
アルキルプロピレングリコールとの水溶性付加物であ
り、エチレンジアミノポリプロピレングリコールおよび
アルキルプロピレングリコールはアルキル鎖中に1〜1
0個の炭素原子を含有し前記付加物は20〜250のエ
チレングリコールエーテル基および10〜100個のプ
ロピレングルコールエーテル基を含有する。
非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェニルポ
リエトキシエタノール、ヒマシ油、グリコールエーテ
ル、プロピレン/ポリエチレンオキシド付加物、トリブ
チルフェノキシポリエオトキシエタノール、エチレング
リコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ールである。ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エ
ステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオ
レエートは、また、適当な非イオン性界面活性剤であ
る。
リエトキシエタノール、ヒマシ油、グリコールエーテ
ル、プロピレン/ポリエチレンオキシド付加物、トリブ
チルフェノキシポリエオトキシエタノール、エチレング
リコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ールである。ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エ
ステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオ
レエートは、また、適当な非イオン性界面活性剤であ
る。
カチオン性界面活性剤は、好ましくは、第四アンモニウ
ム塩であり、これは、窒素上の置換基として、少なくと
も1つのC8-C22アルキル基および、それ以上の置換基と
して、低級非置換もしくはハロゲン化アルキルベンジ
ル、またはヒドロキシル価低級アルキル基を含有する。
塩は、好ましくは、ハライド、、メチルサルフェーチま
たはエチルサルフェート、例えば、ステアリルトリメチ
ルアンモニウムクロライドの形態である。
ム塩であり、これは、窒素上の置換基として、少なくと
も1つのC8-C22アルキル基および、それ以上の置換基と
して、低級非置換もしくはハロゲン化アルキルベンジ
ル、またはヒドロキシル価低級アルキル基を含有する。
塩は、好ましくは、ハライド、、メチルサルフェーチま
たはエチルサルフェート、例えば、ステアリルトリメチ
ルアンモニウムクロライドの形態である。
5.12 コンセンサスデルタ−内毒素タンパク質の相
同性 コンピューターのサーチを実施して、P−2遺伝子が配
列が発表されている他の遺伝子のいずれかに対して相同
性であるかどうかを決定した。DNA配列の相同性は、
P−2遺伝子および他の遺伝子の間で発見されなかっ
た。しかしながら、驚くべきことに、ある程度の相同性
はP−2およびP−1のタンパク質の間に存在すること
が発見された。第6図は、P−1およびP−2のタンパ
ク質が約100アミノ酸のストレッチにわたって37%
の相同性の領域を共有することを示す。
同性 コンピューターのサーチを実施して、P−2遺伝子が配
列が発表されている他の遺伝子のいずれかに対して相同
性であるかどうかを決定した。DNA配列の相同性は、
P−2遺伝子および他の遺伝子の間で発見されなかっ
た。しかしながら、驚くべきことに、ある程度の相同性
はP−2およびP−1のタンパク質の間に存在すること
が発見された。第6図は、P−1およびP−2のタンパ
ク質が約100アミノ酸のストレッチにわたって37%
の相同性の領域を共有することを示す。
そうでなければ非相同性のタンパク質内に発見される保
存されたアミノ酸の配列は、タンパク質のための重要な
ドメインをしばしばシグナルする。第6図に示された保
存されたアミノ酸は、P−1およびP−2タンパク質の
鱗翅類殺幼虫活性の起因である「活性部位」を構成す
る。したがって、このタンパク質は、アミノ酸の組成に
影響を及ぼすか、あるいはそれを変化させて、毒性の生
ずる変化をより特異的に標的するための、部位特異的突
然変異誘発実験において実用性を有する。
存されたアミノ酸の配列は、タンパク質のための重要な
ドメインをしばしばシグナルする。第6図に示された保
存されたアミノ酸は、P−1およびP−2タンパク質の
鱗翅類殺幼虫活性の起因である「活性部位」を構成す
る。したがって、このタンパク質は、アミノ酸の組成に
影響を及ぼすか、あるいはそれを変化させて、毒性の生
ずる変化をより特異的に標的するための、部位特異的突
然変異誘発実験において実用性を有する。
この100アミノ酸のストレッチの重要性は、これらの
アミノ酸をエンコードするDNAの300bpの断片を
サブクローニングすることによって決定することができ
る。この手順は、また、B.t.、バチルス・メガテリ
ウム(Bacillus megaterium)またはE.coliにおい
てこのタンパク質を産生するための手段を生ずる。サブ
クローニングは、部位特異的生体外突然変異誘発を使用
して、この100アミノ酸タンパク質の遺伝情報を指定
するDNAの300bp断片を収容する制限部位をつく
ることによって達成することができる。次いで、これら
の制限部位を使用して、DNA断片を精確に切断するこ
とができる。次いで、DNA断片を、バチルス(Bacillu
s)または他の適当なベクター上のプロモーターまたはリ
ボソーム結合部位から下流に挿入することができるであ
ろう。バチルス(Bacillus)ベクターは、それがP−2遺
伝子それ自体のプロモーターおよびリボソーム結合部位
を含有するように、遺伝子操作することができるであろ
う。次いで、生ずる組み換え体プラスミドを適当なバチ
ルス(Bacillus)系統(またはことに記載する他の適当な
有機体)中に形質転換することができ、そして組み換え
体系統の殺幼虫活性を測定することができるであろう。
形質転換した有機体は、また、このタンパク質を産生す
る手段硫酸アンモニウム働くであろう。混合物の形質転
換した有機体またはタンパク質それ自体または両者は、
P−2毒素タンパク質と同一の方法で殺虫剤組成物にお
いて利用することができる。
アミノ酸をエンコードするDNAの300bpの断片を
サブクローニングすることによって決定することができ
る。この手順は、また、B.t.、バチルス・メガテリ
ウム(Bacillus megaterium)またはE.coliにおい
てこのタンパク質を産生するための手段を生ずる。サブ
クローニングは、部位特異的生体外突然変異誘発を使用
して、この100アミノ酸タンパク質の遺伝情報を指定
するDNAの300bp断片を収容する制限部位をつく
ることによって達成することができる。次いで、これら
の制限部位を使用して、DNA断片を精確に切断するこ
とができる。次いで、DNA断片を、バチルス(Bacillu
s)または他の適当なベクター上のプロモーターまたはリ
ボソーム結合部位から下流に挿入することができるであ
ろう。バチルス(Bacillus)ベクターは、それがP−2遺
伝子それ自体のプロモーターおよびリボソーム結合部位
を含有するように、遺伝子操作することができるであろ
う。次いで、生ずる組み換え体プラスミドを適当なバチ
ルス(Bacillus)系統(またはことに記載する他の適当な
有機体)中に形質転換することができ、そして組み換え
体系統の殺幼虫活性を測定することができるであろう。
形質転換した有機体は、また、このタンパク質を産生す
る手段硫酸アンモニウム働くであろう。混合物の形質転
換した有機体またはタンパク質それ自体または両者は、
P−2毒素タンパク質と同一の方法で殺虫剤組成物にお
いて利用することができる。
組み換え体プラスミドから合成される100アミノ酸の
ポリペプチドはバチルス(Bacillus)内のプロテアーゼに
より分解することがあり得る。この潜在的問題を回避す
るために、バチルス(Bacillus)のプロテアーゼ陰性系統
は、ウォング(Wong)ら[Wong,S.,Kawamu
ra,F.およびDoi,R.,1986、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー(J.Bactriology)、168:
1005−1009]により記載されているものように
発現に使用することができるであろう。
ポリペプチドはバチルス(Bacillus)内のプロテアーゼに
より分解することがあり得る。この潜在的問題を回避す
るために、バチルス(Bacillus)のプロテアーゼ陰性系統
は、ウォング(Wong)ら[Wong,S.,Kawamu
ra,F.およびDoi,R.,1986、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー(J.Bactriology)、168:
1005−1009]により記載されているものように
発現に使用することができるであろう。
6.0実施例 形質転換したまたは非形質転換のバチルス・メガテリウ
ム(Bacillus megaterium)および大腸菌(Escherichia co
li)の殺虫活性は、昆虫に供給した試験飼料中に種々の
量のこれらの微生物を含めることによって決定した。飼
料供給後、昆虫に死亡率を測定した。詳しくは、これは
微生物を固体の寒天基本培地上で30℃において2日間
定常期まで増殖することを包含した。プラスミドを収容
するE.coliについて、培地は40μg/mのア
ンピシリンを含有するLBであった。プラスミドを収容
するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)に
ついて、培地は10μg/mのテトラサイクリンを含
有するDSであった。微生物を固体媒質からスパチュラ
で引っ掻くことによって収穫した。湿って重量の収穫し
たバクテリアを決定し、そしてバクテリアの細胞を脱イ
オン水中に既知の濃度に再懸濁した。懸濁したバクテリ
ア細胞の系統的稀釈を行い、そして稀釈の各々の200
mを飼料供給カップ中の3mの固定寒天基準人工飼
料に局所的に適用した。飼料の上部の表面積を600mm
2であった。ヘリオチス(Heliothis)の場合において、飼
料は大豆粉末を含有し、そしてリマントリア・ディスパ
ー(Lymantria dispar)について、飼料は麦芽を含有し
た。1匹の新生児の幼虫を飼料カップの各々中に配置
し、そして死亡率のスコアを7日後つけた。
ム(Bacillus megaterium)および大腸菌(Escherichia co
li)の殺虫活性は、昆虫に供給した試験飼料中に種々の
量のこれらの微生物を含めることによって決定した。飼
料供給後、昆虫に死亡率を測定した。詳しくは、これは
微生物を固体の寒天基本培地上で30℃において2日間
定常期まで増殖することを包含した。プラスミドを収容
するE.coliについて、培地は40μg/mのア
ンピシリンを含有するLBであった。プラスミドを収容
するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)に
ついて、培地は10μg/mのテトラサイクリンを含
有するDSであった。微生物を固体媒質からスパチュラ
で引っ掻くことによって収穫した。湿って重量の収穫し
たバクテリアを決定し、そしてバクテリアの細胞を脱イ
オン水中に既知の濃度に再懸濁した。懸濁したバクテリ
ア細胞の系統的稀釈を行い、そして稀釈の各々の200
mを飼料供給カップ中の3mの固定寒天基準人工飼
料に局所的に適用した。飼料の上部の表面積を600mm
2であった。ヘリオチス(Heliothis)の場合において、飼
料は大豆粉末を含有し、そしてリマントリア・ディスパ
ー(Lymantria dispar)について、飼料は麦芽を含有し
た。1匹の新生児の幼虫を飼料カップの各々中に配置
し、そして死亡率のスコアを7日後つけた。
LC50値(幼虫の50%を殺すために要するバクテリ
ア細胞の重量)を、昆虫の死亡率のプロビット分析から
計算した[R.J.Daum.、プロビット分析のため
の2つのコンピュータープログラムの改訂(A Rev
isio of Two Computer Prog
rams for Probit Analysi
s)。Bulletin of the Entomo
logical Soc. of America.V
ol.16(1)、pp.1−15]。
ア細胞の重量)を、昆虫の死亡率のプロビット分析から
計算した[R.J.Daum.、プロビット分析のため
の2つのコンピュータープログラムの改訂(A Rev
isio of Two Computer Prog
rams for Probit Analysi
s)。Bulletin of the Entomo
logical Soc. of America.V
ol.16(1)、pp.1−15]。
6.1 実施例1−E.coliにおけるクローニング
したP−2遺伝子の発現産生物のバイオアッセイ ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)幼虫に
標準の飼料を与え、この飼料は種々のプラスミドを収容
しかつP−2遺伝子を有するか、あるいはもたないこと
が知られているE.coliを添加した。飼料上で7日
後、幼虫を成長および生存能力についてスコアをつけ、
結果を下表Iに報告する。これらの結果から明らかなよ
うに、クローニングしたP−2遺伝子は、事実、E.c
oli、非胞子形成性バクテリアにおいて発現され、そ
してこのクローニングした遺伝子の発現の産生物は、P
−2遺伝子が生存しないE.coliよりも、ヘリオチ
ス・ビレセンス(Heliothis virescens)幼虫に対して、
形質転換したE.coliを有意に毒性とする。
したP−2遺伝子の発現産生物のバイオアッセイ ヘリオチス・ビレセンス(Heliothis virescens)幼虫に
標準の飼料を与え、この飼料は種々のプラスミドを収容
しかつP−2遺伝子を有するか、あるいはもたないこと
が知られているE.coliを添加した。飼料上で7日
後、幼虫を成長および生存能力についてスコアをつけ、
結果を下表Iに報告する。これらの結果から明らかなよ
うに、クローニングしたP−2遺伝子は、事実、E.c
oli、非胞子形成性バクテリアにおいて発現され、そ
してこのクローニングした遺伝子の発現の産生物は、P
−2遺伝子が生存しないE.coliよりも、ヘリオチ
ス・ビレセンス(Heliothis virescens)幼虫に対して、
形質転換したE.coliを有意に毒性とする。
6.2 実施例2−バチルス・メガテリウム(Bacillus
megaterium)中へのP−2遺伝子の形質転換 プラスミドpEG201(P−2遺伝子を含有する)
は、グラム陰性菌株E.coliにおいてのみ複製する
であろう。P−2遺伝子はpEG201を収容するE.
coli菌株EG1304において発現されたが、低い
レベルのみであった(参照、バイオアッセイのデータ、
表I)。この実施例の目的は、クローニングしたP−2
遺伝子が他のバチルス(Bacillus)菌株においてより高い
レベルで発現されるかどうかを決定することであった。
バチルス(Bacillus)株菌におけるクローニングしたP−
2遺伝子の発現について試験するために、まずP−2遺
伝子を含有しかつバチルス(Bacillus)において複製する
ことができる組み換え体プラスミドを構成することが、
必要である。P−2遺伝子を含有するバチルス(Bacillu
s)−E.coli「シャトルベクター」を構成した。用
語「シャトルベクター」は、プラスミドがバチルス(Bac
illus)およびE.coliの両者中で複製することがで
きることを示す。E.coli−バチルス(Bacillus)の
シャトルベクターを、バチルス(Bacillus)プラスミドp
BC16(テトラサイクリン耐性)をSph1で消化
し、消化したプラスミドをpEG201(アンピシリン
耐性)のSph1部位中に結合し、そしてE.coli
をアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に形質転換
することによって構成した。
megaterium)中へのP−2遺伝子の形質転換 プラスミドpEG201(P−2遺伝子を含有する)
は、グラム陰性菌株E.coliにおいてのみ複製する
であろう。P−2遺伝子はpEG201を収容するE.
coli菌株EG1304において発現されたが、低い
レベルのみであった(参照、バイオアッセイのデータ、
表I)。この実施例の目的は、クローニングしたP−2
遺伝子が他のバチルス(Bacillus)菌株においてより高い
レベルで発現されるかどうかを決定することであった。
バチルス(Bacillus)株菌におけるクローニングしたP−
2遺伝子の発現について試験するために、まずP−2遺
伝子を含有しかつバチルス(Bacillus)において複製する
ことができる組み換え体プラスミドを構成することが、
必要である。P−2遺伝子を含有するバチルス(Bacillu
s)−E.coli「シャトルベクター」を構成した。用
語「シャトルベクター」は、プラスミドがバチルス(Bac
illus)およびE.coliの両者中で複製することがで
きることを示す。E.coli−バチルス(Bacillus)の
シャトルベクターを、バチルス(Bacillus)プラスミドp
BC16(テトラサイクリン耐性)をSph1で消化
し、消化したプラスミドをpEG201(アンピシリン
耐性)のSph1部位中に結合し、そしてE.coli
をアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に形質転換
することによって構成した。
1つのtetおよびamp耐性のE.coli形質転換
は、pEG201のSph1部位中に挿入されたpBC
16から構成されたプラスミド(pEG204と表示す
る)を収容した(第1図)。第1図は、プラスミドpE
G204の制限地図を示す。ボックスの領域はプラスミ
ドベクターDNAを意味する。開いたボックスはpBR
322 DNA(E.coliの複製)であり、そして
交差ハッチングしたボックスはpBC16 DNA(バ
チルス(Bacillus)の複製)である。水平線はHD263
−1からのクローニングしたDNAである。大きい矢印
はP−2遺伝子の解読領域を意味する。pEG204を
バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)(AT
CC受託番号VT1660)中に形質転換し、そしてp
EG204を収容する1つのテトラサイクリン耐性形質
転換体(菌株EG1312と表示する)をそれ以上の研
究にために選択した。
は、pEG201のSph1部位中に挿入されたpBC
16から構成されたプラスミド(pEG204と表示す
る)を収容した(第1図)。第1図は、プラスミドpE
G204の制限地図を示す。ボックスの領域はプラスミ
ドベクターDNAを意味する。開いたボックスはpBR
322 DNA(E.coliの複製)であり、そして
交差ハッチングしたボックスはpBC16 DNA(バ
チルス(Bacillus)の複製)である。水平線はHD263
−1からのクローニングしたDNAである。大きい矢印
はP−2遺伝子の解読領域を意味する。pEG204を
バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)(AT
CC受託番号VT1660)中に形質転換し、そしてp
EG204を収容する1つのテトラサイクリン耐性形質
転換体(菌株EG1312と表示する)をそれ以上の研
究にために選択した。
この実施例は、クローニングしたP−2遺伝子が組み換
え体バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)菌
株EG1312(pEG204)中で発現されたどうか
を決定した。遺伝子の発現はNaDodeSO4/ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動の技術により測定した。一般に、
この技術は細胞リゼイトの調製、NaDodeSO4/ポリアク
リルアミドゲルを通す細胞リゼイトの電気泳動およびタ
ンパク質を可視化するための染色を包含した。
え体バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)菌
株EG1312(pEG204)中で発現されたどうか
を決定した。遺伝子の発現はNaDodeSO4/ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動の技術により測定した。一般に、
この技術は細胞リゼイトの調製、NaDodeSO4/ポリアク
リルアミドゲルを通す細胞リゼイトの電気泳動およびタ
ンパク質を可視化するための染色を包含した。
詳しくは、この技術は次のようにして実施した:バチル
ス・メガテリウム(Bacillus megaterium)細胞を10μ
g/mのテトラサイクリンを含有するDS平板上で3
0℃において48時間成長させた。バチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus Thuringiensis)系統は、DS平板が
テトラサイクリンを含有しない以外、バチルス・メガテ
リウム(Bacillus megaterium)と同様に増殖させた。こ
の期間後、ほとんどのすべての細胞は、増殖の定常期に
入った。細胞をスパチュラで収穫し、そして脱イオン水
中に懸濁した。細胞の懸濁の一部を1:2体積:体積で
予備加熱した(70℃)のゲル装入緩衝液(5%のベー
タ−メルカプトエタノール、2%のNaDodeSO4、60ミ
リモルのトリスpH6.8、10%のグリセロール)と混
合し、そして70℃において7分間インキュベーション
した。懸濁液を簡単に遠心し、遠心後、上澄み液を直ち
にNaDodeSO4/ポリアクリルアミドゲル上に装入し、そ
して上澄み液中のタンパク質をラエムリ(Laemmli)[ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.B
iol.)、80:576−599(1973)]に従いゲ
ル電気泳動により分割した。ゲル中のタンパク質をゲル
をクーマッシー(Coomassie)染料で染色することによっ
て可視化した。
ス・メガテリウム(Bacillus megaterium)細胞を10μ
g/mのテトラサイクリンを含有するDS平板上で3
0℃において48時間成長させた。バチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus Thuringiensis)系統は、DS平板が
テトラサイクリンを含有しない以外、バチルス・メガテ
リウム(Bacillus megaterium)と同様に増殖させた。こ
の期間後、ほとんどのすべての細胞は、増殖の定常期に
入った。細胞をスパチュラで収穫し、そして脱イオン水
中に懸濁した。細胞の懸濁の一部を1:2体積:体積で
予備加熱した(70℃)のゲル装入緩衝液(5%のベー
タ−メルカプトエタノール、2%のNaDodeSO4、60ミ
リモルのトリスpH6.8、10%のグリセロール)と混
合し、そして70℃において7分間インキュベーション
した。懸濁液を簡単に遠心し、遠心後、上澄み液を直ち
にNaDodeSO4/ポリアクリルアミドゲル上に装入し、そ
して上澄み液中のタンパク質をラエムリ(Laemmli)[ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.B
iol.)、80:576−599(1973)]に従いゲ
ル電気泳動により分割した。ゲル中のタンパク質をゲル
をクーマッシー(Coomassie)染料で染色することによっ
て可視化した。
第5図はこの分析の結果を示す。第5図は、前述したよ
うに調製したNaDodeSO4/ポリアクリルアミドゲルの写
真である。第5図におけるレーンで標識したSTND
は、タンパク質分子量の標準を含有した。ゲルの右への
数字はタンパク質の大きさをキロダルトン(kDa)で
示す。レーン標識したHD1−1はそのB.t.系統の
抽出物を含有した。P−2タンパク質に相当するタンパ
ク質のバンドは、矢印により示す。レーン標識したP−
2は、精製したP−2タンパク質の一部を含有した。P
−2タンパク質は、前述したように精製した。
うに調製したNaDodeSO4/ポリアクリルアミドゲルの写
真である。第5図におけるレーンで標識したSTND
は、タンパク質分子量の標準を含有した。ゲルの右への
数字はタンパク質の大きさをキロダルトン(kDa)で
示す。レーン標識したHD1−1はそのB.t.系統の
抽出物を含有した。P−2タンパク質に相当するタンパ
ク質のバンドは、矢印により示す。レーン標識したP−
2は、精製したP−2タンパク質の一部を含有した。P
−2タンパク質は、前述したように精製した。
第5図におけるレーン標識したEG1311およびEG
1312は、それぞれ、pBC16およびpEG204
(P2)を収容する、これらのバチルス・メガテリウム
(Bacillus megaterium)系統の抽出物を含有した。レー
ンEG1311およびEG1312を比較すると示され
るように、系統EG1312(pEG204)は、大き
さがP−2タンパク質のそれに相当する主要なタンパク
質を含有した。このタンパク質は系統EG1311(p
BC16)中に存在しなかった。これが実証するよう
に、クローニングしたP−2遺伝子を収容するバチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium)は、高いレベル
のP−2タンパク質を合成した。さらに、光学顕微鏡で
見たとき、系統EG1312の細胞は結晶毒素に特徴的
な相−鮮明なタンパク質の封入体を含有するように思わ
れた。
1312は、それぞれ、pBC16およびpEG204
(P2)を収容する、これらのバチルス・メガテリウム
(Bacillus megaterium)系統の抽出物を含有した。レー
ンEG1311およびEG1312を比較すると示され
るように、系統EG1312(pEG204)は、大き
さがP−2タンパク質のそれに相当する主要なタンパク
質を含有した。このタンパク質は系統EG1311(p
BC16)中に存在しなかった。これが実証するよう
に、クローニングしたP−2遺伝子を収容するバチルス
・メガテリウム(Bacillus megaterium)は、高いレベル
のP−2タンパク質を合成した。さらに、光学顕微鏡で
見たとき、系統EG1312の細胞は結晶毒素に特徴的
な相−鮮明なタンパク質の封入体を含有するように思わ
れた。
6.3バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)
中のクローニングしたP−2遺伝子の発現産生物のバイ
オアッセイ 実施した標準の毒性は、系統バチルス・メガテリウム(B
acillus megaterium)EG1312が、ヘリオチス・ビ
レセンス(Heliothis virescens)(H.v.)の幼虫ま
たはリマントリア・ディスパー(Lymantria dispar)
(L.v.)の幼虫に供給したとき、1.4μgのバク
テリア細胞/昆虫飼料カップのLD50(幼虫の50%
の死亡)を有した。対照的に、P−2遺伝子をもたない
プラスミドベクターpBC16を収容するバチルス・メ
ガテリウム(Bacillus megaterium)の対照系統は、H.
v.またはL.v.の幼虫を10μgのバクテリア細胞
/飼料カップの投与量で殺すことができなかった。
中のクローニングしたP−2遺伝子の発現産生物のバイ
オアッセイ 実施した標準の毒性は、系統バチルス・メガテリウム(B
acillus megaterium)EG1312が、ヘリオチス・ビ
レセンス(Heliothis virescens)(H.v.)の幼虫ま
たはリマントリア・ディスパー(Lymantria dispar)
(L.v.)の幼虫に供給したとき、1.4μgのバク
テリア細胞/昆虫飼料カップのLD50(幼虫の50%
の死亡)を有した。対照的に、P−2遺伝子をもたない
プラスミドベクターpBC16を収容するバチルス・メ
ガテリウム(Bacillus megaterium)の対照系統は、H.
v.またはL.v.の幼虫を10μgのバクテリア細胞
/飼料カップの投与量で殺すことができなかった。
バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)系統E
G1312(pEG204−P−2)を、また、エデス
・エジプチ(Aedesaegypti)に対する毒性について試験し
た。細胞の懸濁液は、系統EG1311(pBC16−
陰性対照)およびEG1312を10μg/mのテト
ラサイクリンを含有する固体のDS培地上で30℃にお
いて48時間増殖することによって調製した。細胞をス
パチュラで収穫し、そして細胞を脱イオン水中に再懸濁
した。細胞懸濁液の系統的希釈を行った。エデス・エジ
プチ(Aedes aegypti)の20匹の幼虫(第三または第四
齢期)を100mの細胞懸濁中に入れ、そして死亡率
のスコアを48時間後につけた。結果(下)が示すよう
に、系統EG1312(P−2)はカの幼虫い対して毒
性である。対照的に、ベクタープラスミドpBC16単
独を含有するバチルス・メガテリウム(Bacillus megate
rium)(系統EG1311)はカの幼虫に対して毒性で
はなかった。
G1312(pEG204−P−2)を、また、エデス
・エジプチ(Aedesaegypti)に対する毒性について試験し
た。細胞の懸濁液は、系統EG1311(pBC16−
陰性対照)およびEG1312を10μg/mのテト
ラサイクリンを含有する固体のDS培地上で30℃にお
いて48時間増殖することによって調製した。細胞をス
パチュラで収穫し、そして細胞を脱イオン水中に再懸濁
した。細胞懸濁液の系統的希釈を行った。エデス・エジ
プチ(Aedes aegypti)の20匹の幼虫(第三または第四
齢期)を100mの細胞懸濁中に入れ、そして死亡率
のスコアを48時間後につけた。結果(下)が示すよう
に、系統EG1312(P−2)はカの幼虫い対して毒
性である。対照的に、ベクタープラスミドpBC16単
独を含有するバチルス・メガテリウム(Bacillus megate
rium)(系統EG1311)はカの幼虫に対して毒性で
はなかった。
7.0 微生物の受託 広範な種類の胞子形成性微生物および非胞子形成性微生
物の両者を前述したようにP−2で形質転換することが
できることは、本発明の範囲内である。ここで教示する
ように操作することができる微生物の礼あ、バチルス(B
acillus)、大腸菌(Escherichi)およびシアノバクテリア
(Cyanobacteria)からのものである。
物の両者を前述したようにP−2で形質転換することが
できることは、本発明の範囲内である。ここで教示する
ように操作することができる微生物の礼あ、バチルス(B
acillus)、大腸菌(Escherichi)およびシアノバクテリア
(Cyanobacteria)からのものである。
巨大菌(Bacillus megaterium)および大腸菌(Escherichi
a coli)は本発明において使用するのに好ましい。さら
に、本発明における使用のまた好ましくかつ列挙したプ
ラスミドを有する次のバチルス・スリンギエンシス(Bac
illus Thuringiensis)、バチルス・メガテリウム(Bacil
lus megaterium)および大腸菌(E.coli)は、農業研究培
養物収集所(Agricultural Research Culture Collectio
n)(NRRL)(イリノイ州ペオリア)に寄託され、そ
して列挙した受け入れ番号を割り当てられた: 本発明は寄託された微生物によりその範囲は限定されな
い。なぜなら、受託された実施態様は本発明の範囲の1
つの面の単一の例示として意図されているからである。
事実、ここに示しつ説明されているものに加えて種々の
変更は、以上の説明および添付図面から当業者とって明
らかとなるであろう。
a coli)は本発明において使用するのに好ましい。さら
に、本発明における使用のまた好ましくかつ列挙したプ
ラスミドを有する次のバチルス・スリンギエンシス(Bac
illus Thuringiensis)、バチルス・メガテリウム(Bacil
lus megaterium)および大腸菌(E.coli)は、農業研究培
養物収集所(Agricultural Research Culture Collectio
n)(NRRL)(イリノイ州ペオリア)に寄託され、そ
して列挙した受け入れ番号を割り当てられた: 本発明は寄託された微生物によりその範囲は限定されな
い。なぜなら、受託された実施態様は本発明の範囲の1
つの面の単一の例示として意図されているからである。
事実、ここに示しつ説明されているものに加えて種々の
変更は、以上の説明および添付図面から当業者とって明
らかとなるであろう。
本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。
1、第2図のDNA配列を有するバチルス・スリンギエ
ンシス(Bacillus Thuringiensis)P−2毒素の精製され
且つ分離された遺伝子。
ンシス(Bacillus Thuringiensis)P−2毒素の精製され
且つ分離された遺伝子。
2、遺伝子は第2図のアミノ酸配列を有するタンパク質
の遺伝子である、第1項記載の遺伝子。
の遺伝子である、第1項記載の遺伝子。
3、前記タンパク質は殺虫活性を有する、第2項記載の
遺伝子。
遺伝子。
4、前記殺虫活性は鱗翅類および双翅類から成る目から
選択される昆虫に対して有効である、第3項記載の遺伝
子。
選択される昆虫に対して有効である、第3項記載の遺伝
子。
5、前記DNA配列は組み換え体プラスミド中に挿入さ
れている、第1項記載の遺伝子。
れている、第1項記載の遺伝子。
6、前記プラスミドは前記DNA配列の挿入後の微生物
の少なくとも2つの異なる種からのDNAから構成され
ている、第5項記載の遺伝子。
の少なくとも2つの異なる種からのDNAから構成され
ている、第5項記載の遺伝子。
7、前記プラスミドは、前記DNA配列の挿入後の微生
物の同一種の少なくとも2つの異なる亜種からのDNA
から構成されている、第5項記載の遺伝子。
物の同一種の少なくとも2つの異なる亜種からのDNA
から構成されている、第5項記載の遺伝子。
8、前記DNA配列はその自然プロモーターDNA配列
中に組み込まれている、第1項記載の遺伝子。
中に組み込まれている、第1項記載の遺伝子。
9、前記DNA配列は外来プロモーターDNA配列中に
組み込まれている、第1項記載の遺伝子。
組み込まれている、第1項記載の遺伝子。
10、工程: a)P−2毒素の遺伝子をプラスミド中に挿入し、前記
遺伝子は第2図のDNA配列を有し、 b)微生物を工程a)のプラスミドで形質転換し、そし
て c)工程b)の形質転換した微生物を増殖させ、これに
より前記P−2毒素を前記微生物において発現させる、 からなるバチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thurin
giensis)P−2毒素を産生する方法。
遺伝子は第2図のDNA配列を有し、 b)微生物を工程a)のプラスミドで形質転換し、そし
て c)工程b)の形質転換した微生物を増殖させ、これに
より前記P−2毒素を前記微生物において発現させる、 からなるバチルス・スリンギエンシス(Bacillus Thurin
giensis)P−2毒素を産生する方法。
11、前記遺伝子は第2図のアミノ酸配列を有するタン
パク質の遺伝情報を指定する、第10項記載の方法。
パク質の遺伝情報を指定する、第10項記載の方法。
12、前記プラスミドは、前記P−2遺伝子の挿入後の
微生物の少なくとも2つの異なる種からのDNAから構
成されている、第10項記載の遺伝子。
微生物の少なくとも2つの異なる種からのDNAから構
成されている、第10項記載の遺伝子。
13、前記プラスミドは、前記P−2遺伝子の挿入後の
微生物の同一種の少なくとも2つの異なる亜種からのD
NAから構成されている、第10項記載の方法。
微生物の同一種の少なくとも2つの異なる亜種からのD
NAから構成されている、第10項記載の方法。
14、前記DNA配列はその自然プロモーターのDNA
配列中に組み込まれている、第10項記載の方法。
配列中に組み込まれている、第10項記載の方法。
15、前記DNA配列は外来プロモーターDNA配列中
に組み込まれている、第10項記載の遺伝子。
に組み込まれている、第10項記載の遺伝子。
16、前記微生物は非胞子形成性微生物である、第10
項記載の遺伝子。
項記載の遺伝子。
17、前記微生物は胞子形成性微生物である、第10項
記載の方法。
記載の方法。
18、P−2毒素は前記微生物の非胞子形成増殖相の間
に発現される、第16項記載の方法。
に発現される、第16項記載の方法。
19、前記P−2毒素は前記微生物の溶菌により微生物
から抽出される、第10項記載のタンパク質。
から抽出される、第10項記載のタンパク質。
20、第1項記載のDNA配列を含有する組み換え体ベ
クター。
クター。
21、第1項記載のDNA配列を含有する非胞子形成性
組み換え体微生物。
組み換え体微生物。
22、前記微生物はE.coliである、第21項記載
の非胞子形成性微生物。
の非胞子形成性微生物。
23、第1項記載のDNA配列を含有する胞子形成性組
み換え体微生物。
み換え体微生物。
24、第1項記載のDNA配列を含有し、バチルス(Bac
illus)、エシェリヒア(Escherichia)およびシアノバク
テリア(Cyanobacteria)から成る群より選択される組み
換え体微生物。
illus)、エシェリヒア(Escherichia)およびシアノバク
テリア(Cyanobacteria)から成る群より選択される組み
換え体微生物。
25、NRRLにより受託されそして受け入れ番号B−
18204を割り当てられた大腸菌(Escherichia coli)
バクテリア、またはその突然変異体、または組み換え
体、または遺伝子操作した誘導体。
18204を割り当てられた大腸菌(Escherichia coli)
バクテリア、またはその突然変異体、または組み換え
体、または遺伝子操作した誘導体。
26、NRRLにより寄託されそして受け入れ番号B−
18203を割り当てられた巨大菌(Bacillus megateri
um)バクテリア、またはその突然変異体、または組み換
え体、または遺伝子操作した誘導体。
18203を割り当てられた巨大菌(Bacillus megateri
um)バクテリア、またはその突然変異体、または組み換
え体、または遺伝子操作した誘導体。
27、前記DNAまたはその部分または誘導体はP−2
ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために
標識されている、第2図のDNA配列。
ハイブリダイゼーションプローブとして使用するために
標識されている、第2図のDNA配列。
28、前記DNAまたはその部分または誘導体は放射性
標識されている、第27項記載のDNA配列。
標識されている、第27項記載のDNA配列。
29、第2図のDNA配列で形質転換された植物。
30、植物はP−2毒素を産生する、第29項記載の植
物。
物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12Q 1/68 A 7823−4B // A01N 63/02 E 9159−4H C07K 13/00 8517−4H (C12N 15/32 C12R 1:07) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:11) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:11) C07K 99:00
Claims (12)
- 【請求項1】バチルス・スリンギエンシス(Bacillus Th
uringiensis)P−2毒素をコードするDNA配列を含ん
でなる精製され且つ分離された遺伝子であって、前記配
列が下記塩基配列のコード領域の塩基配列によって表さ
れる遺伝子。 - 【請求項2】遺伝子が請求の範囲第1項に記載のアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んで
なる、請求の範囲第1項記載の遺伝子。 - 【請求項3】前記タンパク質が殺虫活性を有する、請求
の範囲第2項記載の遺伝子。 - 【請求項4】前記殺虫活性が鱗翅類および双翅類から成
る目から選択される昆虫に対して有効である、請求の範
囲第3項記載の遺伝子。 - 【請求項5】a)請求の範囲第1項記載のP−2毒素を
コードする遺伝子をプラスミド中に挿入する工程、 b)細菌を工程a)で得たプラスミドで形質転換する工
程、次いで c)工程b)の形質転換した細菌を増殖させ、これによ
り前記P−2毒素を前記細菌において発現させる工程、 を含んでなる、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus
Thuringiensis)P−2毒素を産生する方法。 - 【請求項6】前記遺伝子が請求の範囲第1項に記載のア
ミノ酸配列を有するタンパクをコードする遺伝子を含ん
でなる、請求の範囲第5項記載の方法。 - 【請求項7】前記P−2毒素が前記細菌の溶菌により細
菌から抽出される、請求の範囲第5項記載の方法。 - 【請求項8】請求の範囲第1項記載の遺伝子を含有する
組み換え体ベクター。 - 【請求項9】請求の範囲第1項記載の遺伝子を含有する
非胞子形成性または胞子形成性組み換え体細菌。 - 【請求項10】請求の範囲第1項記載の遺伝子を含む、
NRRLにより寄託されそして受託番号B−18204
が割り当てられた大腸菌(Escherichiacoli)。 - 【請求項11】請求の範囲第1項記載の遺伝子を含む、
NRRLにより寄託されそして受託番号B−18203
が割り当てられたバチルス・メガテリウム(Bacillus me
gaterium)。 - 【請求項12】5′-GTA TTA AAT TCA GGA AGA ACA ACA
ATT AAT GAT GCA TAT AAT GTA GTA GCA CAT GAT CCA TT
-3′ で表される塩基配列を有し、そして標識されていること
を特徴とする請求の範囲第1項記載のP−2毒素遺伝子
用のハイブリダイゼーションプローブ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3954287A | 1987-04-16 | 1987-04-16 | |
US039,542 | 1987-04-16 | ||
PCT/US1988/001132 WO1988008034A1 (en) | 1987-04-16 | 1988-04-07 | Bacillus thuringiensis p-2 toxin gene, protein and related insecticide compositions |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02500716A JPH02500716A (ja) | 1990-03-15 |
JPH0636743B2 true JPH0636743B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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---|---|
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TW261517B (ja) * | 1991-11-29 | 1995-11-01 | Mitsubishi Shozi Kk | |
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-
1989
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