KR960006582B1 - 바실러스 튜린지엔시스 p-2 독소유전자와 이를 포함하는 미생물 - Google Patents
바실러스 튜린지엔시스 p-2 독소유전자와 이를 포함하는 미생물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR960006582B1 KR960006582B1 KR1019880701674A KR880701674A KR960006582B1 KR 960006582 B1 KR960006582 B1 KR 960006582B1 KR 1019880701674 A KR1019880701674 A KR 1019880701674A KR 880701674 A KR880701674 A KR 880701674A KR 960006582 B1 KR960006582 B1 KR 960006582B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- dna
- protein
- strain
- cloned
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 35
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims abstract description 11
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 title description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 59
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 32
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 22
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract description 30
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 24
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 abstract description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 abstract description 5
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 95
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 84
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 11
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 11
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 10
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 101100442689 Caenorhabditis elegans hdl-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 5
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 5
- -1 alkali metal salts Chemical class 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 101150103068 P2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N 4-nonylphenol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(O)C=C1 IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000846901 Drosophila melanogaster Fat-body protein 1 Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 3
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000257469 Asterias Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256113 Culicidae Species 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical class N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 2
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 235000015096 spirit Nutrition 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001273 sulfonato group Chemical class [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloroethane Chemical compound CC(Cl)(Cl)Cl UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- WBIQQQGBSDOWNP-UHFFFAOYSA-N 2-dodecylbenzenesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O WBIQQQGBSDOWNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101000914947 Bungarus multicinctus Long neurotoxin homolog TA-bm16 Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000408655 Dispar Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000276457 Gadidae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001177117 Lasioderma serricorne Species 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000254101 Popillia japonica Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004147 Sorbitan trioleate Substances 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001664469 Tibicina haematodes Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 125000006177 alkyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005667 alkyl propylene group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229940060296 dodecylbenzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-M ethyl sulfate Chemical class CCOS([O-])(=O)=O KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 201000003373 familial cold autoinflammatory syndrome 3 Diseases 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009571 larval growth Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical class COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003090 pesticide formulation Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000008262 pumice Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 125000005624 silicic acid group Chemical class 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 229960000391 sorbitan trioleate Drugs 0.000 description 1
- 235000019337 sorbitan trioleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000003459 sulfonic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 235000021195 test diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Virology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 클토우닝된 P-2 유전자를 함유하는 조환형 플라스미드 pEG 201 및 pEG 204의 제한토. P-유전자의 전사위치 및 방향은 큰 화살표로 나타나 있다.
제2도는 DNA 뉴클레오티드 결합서열에 의해 코우딩되는 P-2 단백필의 아미노산 결합서열과 P-2 유전자의 DNA 뉴클레오티드 결합서열.
제3도는 3A 및 3B의 구성도로서 3A는 에티듐 브로마이드로 염색된 에크하르트 겔의 사진이다. 여러가지B.t. 균주에 존재하는 천연 플라스미드는 대부분의 B.t. 균주에 몇가지 천연 플라스이드가 함유되어있음을 나타내고 있을 정도로 육안으로 보인다.3B는 3A에 있는 플라스미드를 사용하여 방사능으도 표시되고 클로우닝된 P2 유전자를 잡종형성(hybddization)지킴으로써 얻는 방사선 사진이다.3B를 보면 클로우닝된 P2 유전자가 세가지 B.t 균주중의 110MDa 플라스미드에 대해서만 잡종형성되고 P2 단백질(HD1-1, HD263-1 및 HD278) 생성시키는 것을 알 수 있다. 클로우닝된 P2 유전자 역시 잡종형성되어 30MDa의DNA 벤드를 생성한다(3B).
제4도는 4A와 4B의 구성도로서 4A는 HD1-1, HD263-1, HD267 및 HD278 등의 균주로부터 HindIn소화 DNA를 함유하는 에티듐 브토마이드로 염색된 마가로우스겔의 사진이다. 4A에서 알 수 있는 것은HindnI으로 소화된 B.T. DNA 전부가 분할되어 수백가지의 상이한 크기의 단편이 된다는 점이다.4B는4A의 HindIII 단편을 사용하여 방사능으토 표지되고 클로우닝된 P2 유전자를 잡종형성시켜 얻은 방사선 사진이다.4C는 801C에서 4B외 니토로셀룰로오스 필터를 재차 세척하여 얻는 방사선 사진이다.
제5도는 SDS/폴리아크릴아미드겔의 사진인데 여기서 알 수 있는 겻은 클로우닝된 P-2 유전자에 있는바실러스 에가테륨의 조환형 숙주균주가 진짜 P-2 단백질의 것과 유사한 크기를 가진 단백질을 다량 합성한다는 점이다.
제6도는 P-1 독소와 P-2 독소의 아미노산 결합서열 사이의 동족계열을 나타낸다.
본 발명은 생물학적 살충제로 사용되고 P-2 독소 또는 P-2 델타 균체내 독소로 알려진 결정질 단백질에 관한 것인데 이것은 어떤 바실러스 튜린지엔시스의 균주들에 의해 자연적으로 생성된다. 특히 본 발명은P-2 델타 균체내 독소를 코우딩(coding) 하는 유전자의 각종 미생물의 클로우닝(cloning)과 발현 및 P-독소 그 자체와 P-2 유전자에 의해 변환된 미생물을 결합한 신규의 살충제 조성물에 관한 것이다.
매년 세계의 상업적으로 중요한 농작물의 상당부분이 곤충과 기타 해충 감염에 의해 상실되고 있다. 이들해충이 주는 손실은 식품, 직물 및 각종 식물을 비롯한 중요한 식물에까지 미치고 있고 경제적인 손실은 수백만 달러에 이르고 있다. 따라서 이러한 감염으로부터 작물을 보호하는 것이 영구한 과제로 되어 있다.
광범위한 농약을 사용하여 작물을 보호하고 있으나 이들을 구별해서 사용하여야만 식물의 자연적인 보호제를 파괴할 수 있는 것이다. 더우기 그 활성이 광범위하기 때문에 화학적인 살충제는 익충 같은 무해한 것들과 해충의 기생충들을 죽일 수가 있다. 이들은 또한 동물과 인간에게 독성이 있기 때문에 사용시에는 환경상해를 주게된다.
더우기 곤충과 기타 생물은 이들 농약에 반복해서 노출될 경우 이들 농약이나 살충제에 대해 내성을 가지게 된다. 살충제의 사용을 줄이는 것 외에도 소수의 해충의 내성을 가진 균주는 유익한 기생체의 감소로 인하여 점차 감염문제가 적어진다 이것이 바로 광범위한 살충제 사용시 겪게되는 주요한 문제이다 필요로하는 것은 좁은 활성범위와 이 활성을 장기간 유지할 수 있는 능력 즉 내성이 훨씬 느리게 나타나거나 전혀나타나지 않도록 하는 능력을 겸비한 생분해 살충제인 것이다. 생물살충제는 이러한 점에서 유용하리라 생각된다.
생물살충제(biorationa1 이라고도 함)는 자연산의 병원균을 이용 하여 곤충, 진균, 능작물의 잡초감염등을 방제한다. 이러한 물질들은 박테리아 생장 매체가 있던지 없던지간에 감염제(예:독소)에 대해 독성이있는 물질을 생성하는 박테리아로 되어 있다, 이러한 박테리아를 표준 사용방법에 따라 식물에 직접 사용하고 장기간에 걸쳐 작물에 작동하므로 반복해서 사용할 필요를 줄여준다.
해충방제에 생물학적인 방법을 사용하도록 먼저 제안된 것은 진균 질환이 누에서 발견된 1895년이다. 그러나 1940년 대에 와서야 유백색의 질환 박테리아인 바실러스 포필리에 홀씨를 사용해서 일본 딱정벌레를방제하여 생물학적 방제를 성공적으로 할 수 있었다 1960년내 후반에 와서 나반목유충에 치명적인 독소를분비하는 새로운 박테리아가 발견되므로서 상업적인 생물 살충제 단계가 시작된 것이다. 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis:이후부터 "B.t."라 한다)라고 불리우는 박테리아는 현재 가장 널리 이용되는생물 살충제이다.
바실러스 튜린지에스는 널리 분포되어 있는 막대모양의 호기성의 홀씨생성 미생물이다. 그 홀씨형성 사이클도중 B. t는 프로톡신(protoxin) 또는 델타-균체내 독소(delta-endotoxin)으로 알려진 단백질을 형성한다. 이들 프로톡신은 기포자(技包子)성 결정질 내포물 또는 홀씨껍질의 일부로서 B.t. 중에 존재한다. 나비목과 파리목에 있는 것들처럼 감수성이 예미한 곤충들에 대한 B.t의 병원성(patogenicity)은 이러한 기포자 결정에 기인하고 있는데 홀씨형성시에는 B t. 세포의 건조중량당 20%이상된다.
기포자 결정은 섭식(ingestion)후에만 곤충에 대해 활성이 있다. 예컨데 나비목 곤충이 섭식하고 나면 중장(mid-gut)에 있는 단백질 분해 효소와 알칼리성 pH에 의해 결정을 활성화 하여 독성성분을 방출하도록한다
이들 독성 성분에 의하여 중장이 독성을 띠므로서 곤충은 급식이 중지되고 결과적으로는 죽게된다. 실제로 B t.는 나비목해충들을 취급하는 살충제로서 효과적이고 환경에도 안전함이 밝혀졌다. 보고된 바와 의하면 B.t.의 상이한 균주에 의하여 혈청학적으로 상이한 기포자성 결정을 생성한다고 한다. 그러나 여러가지 B.t. 균주에 의해 생성된 여러가지 주요한 결정형중 하나는 P-1으로 알려진 것이다. P-1의 분자량은약 130,000 돌턴(dalton)이고 홀씨 껍질의 주요성분으로 알려져 있기도 하다. 기포자성 결정인 P-i의 유전자와 기타 대부분의 단백질 결정의 유전자는 크기가 여러가지인 다수의 상이한 B.t. 의 플라스미드에 존재하는 것임이 확인되었다.
B.t. 독소유전자는 내표적으로 플라스미드에 존재하며 이들의 생성물은 결정형인 경우나 홀씨형성과 관련되었을 경우 쉽사리 분리되는 효과적인 살충제임이 밝혀졌기 때문에 유전자 분리와 클로닝 방법에 대해서는 수많은 과학적인 연구의 주제가 되어 있다.
P-1을 코우드(code) 하는 유전자를 B.t. 아종(亞種) Kurstaki 균주 HD-1-Dipel로부터 분리하여 클로닝시켜 대장균(E. coli)에서 발현시키고 있다[Schnepf et al., 미국특허 제 4,467,036호]. 단백질 생성물인 P-1은 나비목 곤충(담배 박각시나방 유충)에 대해 독성이 있다. 촉진유전자 영역의 뉴클레오티드 결합서열과 P-1의 결정 단백질 유전자의 코우딩 영역의 부분도 확인되어 있다[H.P. Wong et al., TheJournal of Biological Chemistry, Vol 258, No.3, pp.1960-196가1983) ]. 이 유전자의 전체 뉴클레오티드 결합서열이 결정되어 있고 델타-균체내 독소 단백질 자체를 변환된 대장균 균주에서 발현 시키고 있다[M.J. Adand et al., Gene, Vo1,36, pp.298-300(1985) , PCT 출원 PCT/US85/01665:B t. 결정단백질 유전자 독소 세그먼트(1985)].
기타 델타-균체내 독소형의 유전자를 클로닝시켜 대장균에서 발현시키기도 한다. B.t. 변종 israelensis로부터 얻은 모기약의 델다-균체내 독소 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 대장균 벡터(vector)에삽입하였다. 이러한 벡터에 의해 변환된 대장균을 사용하여 26,000 돌턴의 폴리펩티드를 합성하였다 이러한 폴리펩티드는 파리목 곤충(모기)에 대해 치명적임이 밝혀졌다.[E S. Ward et al., FEBS Vo1 175,2, pp.377-382,1984]. 이러한 결정 단백질에 대해 코우딩 하는 유전자의 뉴클레오티드 결합서열도 생성된 단백질 결합서열과 더불어 결정되었다[C. `Vaalwi]k et aI , Nucleic Acids Research, Vol.13, No.22, pp.8207-8217,(1985)].130KDa 결정 단백질을 인코우딩(encoding) 하는 또다른 B.t. 변종israelensis 유전자를 클로닝하고 이것을 사용해서 바실러서 메가테륨 및 바실러스 서브틸리스를 변환시켰다. 홀씨형성도중 바실러스 에카테륨과 바실러스 서브틸리스는 결정질 내포물을 발현하였는네 이들 내포물은 에데스 에집티(Aedes aegypti)의 유충에 대해서 독성이 있었다[V. Sekar et al., Gene, VoI.33, pp151-158, (1985)].
또다른 델타-균체내 독소 단백질 결정을 B.t. 아종 sotto로부더 얻었다 이 결정질 단백질에 대해 코우딩하는 유전자를 벡터내에 클로닝한 다음 변환된 내장균에서 발현시켰다. 이 유전자는 144,000 돌턴의 펩티드(아미노산 잔기 934개)를 코우딩 한다. 유전자의 뉴클레오티드 결합서열과 상응한 단백질의 아미노산 결합 서열에 대해 보고된 바 있다[Y. Shibano et al., Gene, VoI.34, pp.243-(1985)].
몇가지 B.t. 아종에 의해 또다른 주요한 델타-균체내 독소 단백질이 생성된다는 보고가 있다[T.Yamamoto, Biochem. and Biophys. Res. Comm. Vol. 103, No. 2, pp. 414-421(1981) , T,Yamamoto et al. Archives of Biochemistry and Biophysics, V이.227, No 1, pp.233-241(1983) ].이 델타-균체내 독소는 P-2로 확인되어있으며 B.t. 변종 Kurstaik(HD-1)으로부터 분리된 것이다. 이델타-균체내 독소 단백질의 분자량은 약 65,000 돌턴이고 나비목 근충과 파리목 곤충에 대해서만 활성이있다. 이에 반해서 P-1은 나비목 곤충에 대해서만 활성이 있다. 요컨데 P-2 단백질을 분리하여 그 특징이어떤 곤충들에 활성이 있다고 하더라도 이 단백질을 코우딩하는 유전자와 단백질 결합서열 그 자체는 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 이러한 사실로부터 B.t. 이외의 기타 생물체에 이렇게 독특하게 활성을 나타내는 델타-균체내 독소 단백질을 발현시키는 수단을 제공할 수 없는 것이다. 클로닝된 P-2 유전자의 활용가능성에 따라 B.t. 에서 P-2 단백질을 크게 생성시킬 수 있고 델타-균체내 독소가 없는 이종성(heterologous) 생물에서 P-2 합성을 할 수도 있는 것이다.
본 발명은 바실러스 튜린지엔시스에 의해 생성원 P-2 델타-균체내 독소, 이 단백질에 내해 코우드하는유전자의 DNA 결합서열 및 이 단백질 및/또는 P-2 유전자로 변환된 생물을 함유하는 신규의 살충제에관한 것이다. 특히 본 발명은 P-2 델타-균체내 독소에 대해 코우딩하는 유전자를 이용한 미생물의 클로닝 및 변환에 관한 것이다. 본 발명은 특히 홀씨 형성도중 B.t. 생물을 생성하는 천연의 P-2에 의해 생성된 것 보다 훨씬 많은 양으로 B.t. 이외의 기타 생물체에서 P-2 델타-균체내 독소를 발현하는데 유용하다. 더우기 본 발명은 P-2 독소에 대해 코우딩하는 유전자를 이용하여 홀씨형성을 않는 이생물을 변환시켜 실제로 미생물 성장단계에서 델타-균체내 독소를 생성시키고 홀씨형성 단계에서만 생성되게 한정하지않도록 하는데 유용하다. 본 발명의 추가적인 목적은 분리된 유전자에 의해 생성되는 균질한 P-2 단백질을 제공함에 있다. 이 단백질은 미생물을 변환시키고 클로닝된 P-2 유전자를 이용하여 바실러스 메가테륨또는 대장균 또는 B.t. 의 상이한 균주를 홀씨형성시키던지 형성시키지 않게 하는 방법으로 제조한다. 이방법은 적당한 숙주와 벡터를 선택하기 매문에 P-2 델타-균체내 독소의 수득량이 많고 따라서 원래의 B.t. 숙주에 있는 P-2 독소와 동시에 또는 이와 더불어 대표적으로 생성되는 기타 여러가지 델타-균체내독소에 의하여 오염되지 않은 P-2 독소를 균일하게 제조할 수 있다. P-2 단백질 및/또는 변환원 숙주를여러가지 살충제 조성물에 사용할 수 있다.
본 발명의 또한가지 목적은 P-2 델타-균체내 독소에 내해 코우딩 하는 DNA를 이용해서 원래의 B.t.숙주이외의 기타 변환된 생물체를 제공함에 있다. 이렇게 외부 변환된 숙주는 보다 바람직한 선택적인 배양조건하에서 P-2 텔타-균체내 독소를 생성할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 여러가지 바실러스 튜린지엔시스 균주에서 P-2 유전자의 존재를 확인하는데사용되는 DNA 소식자(Probe)를 제공함에 있다. 이 DNA 소식자는 B.t. 의 여러가지 균주를 스크리닝해서 P-2 단백질과 공통의 동족성을 가지는 단백질을 코우딩 하는 관련된 유전자의 존재를 확인하여 이를관련된 유전자를 본리하도록 하는데 유용하다.
일반적으로 말해서 본 발명은 제2도에 있는 DNA 뉴클레오티드 결합서열을 가지며 바실러스 튜린지엔시스 P-2 델타-균체내 독소 또는 독소에 대해 코우딩 하는 클로닝된 유전자를 제공하는 것이다. 이 유전자(이것은 뉴클레오티드 가닥(stranded)이 서로 간에 대해 상호보완적인 염기서열을 가지는 이중 가닥의DNA로 되어 있음)는 제2도에 있는 아미노산 결합서열을 가지는 P-2 독소의 아미노산 결합서열이 있는단백질에 대해 코우딩한다. 클로닝되어 유전자에 의해 인코우드편 P-2 독소는 나비목과 피리목 곤충들에대하여 살충작용이 있다. 또한 본 발명에서는 P-2 단백질을 제조하는 방법을 제공하기도 한다. 그 제조방법으로서는 P-2 델타-균체내 독소 유전자를 클로닝 벡터나 플라스미드내에 삽입한 다음 플라스미드를 이용하여 선택된 미생물을 변환시키는 것이다. 클로닝 벡터는 일반적으로 공지되어 있고 시판되고 있다. 특수한 플라스미드를 선택하는 것은 개인적으로 선택상의 문제이다. 본 발명에서 사용되는 적당한 플라스미드는예컨데 B.t. 로부터 유도된 플라스미드인 pBR322와 바실러스 미생물로부터 유도된 플라스미드가 있는데바람직한 것은 바실러스 메가톄륨 같은 것으로된 플라스미드이다. 본 발명에서 사용하기 적당한 미생물은홀씨형성 미생물과 홀씨형성을 않는 미생물인데 그 예로는 대장균 B.t. 및 바실러스 메가테륨이 있다. 사용되는 미생물은 공지로 되어있고 구하기가 쉽다. 본 발명을 실시함에 있어서 사용되는 특수한 미생물의 선택은 각자가 선호하는데 따라 결정되는데 본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서 미생물은 바실러스 메가테륨을 함유하는 것이다.
일반적으로 말해서 변환된 생물체에 의해 P-2 독소단백질을 제조한 다음 정제하여 제2도에 있는 바와같은 아미노산 결합서열을 가진 균질의 것을 얻는다. 특히 이러한 단백질은 P-2 유전자를 사용하여 미생물을 변환시키고 변환된 미생물을 생장시켜 P-2 유전자에 의해 코우딩되는 단백질을 미생물에서 발현시키고 표준 단백질 정제법으로 생물체로부터 단백질을 추출하는 방식으로 하여 제조한다. 본 발명의 범위내에는 변환된 미생물로부터 본리된 것이 아니고 발현된 P-9 단백질을 포함하는 이러한 생물체에서 분리된 단백질을 살충제 조성물에 사용하는 것도 포함된다.
본 발명에서는 B.t. P-2 독소와 적당한 담체로된 혼합물을 함유하는 나비목 곤충과 파리목 곤충용 신규의 살충제를 제공하기도 한다. P-2 독소를 생물체내에 함유시키거나 홀씨의 일부로해서 함유시키거나 균질의 단백질 제제로 하던지 변환된 생물체의 배양물과 홀씨와의 혼합물 형태로 해도 된다. 바실러스 메가테륨이나 B.t. 같은 홀씨형성 미생물이나 홀씨형성을 않는 이생물중에 P-2 독소를 함유시키기도 한다. 적당한 담체는 공지로 되어있는 여러가지 고체나 액체중의 한가지이면 된다.
또한 본 발명은 P-2 유전자를 포함하는 플라스미드나 재조합 벡터와 이 유전자로 변환된 특수한 미생물을 포함한다. 더우기 본 발명에서는 P-2 델타-균체내 독소에 대해 코우딩하는 유전자용 올리고뉴클레오티드 소식자를 제공하기도 한다. 본 발명을 다음의 실시예에 따라 상세히 실명한다.
1. 재조합 DNA법 및 유전자 발현
일반적으로 말해서 재조합 DNA법이라 하면 DNA 매개체(플라스미드 또는 벡터)속에다 특수한 DNA 결합서열을 삽입해서 숙주 세포내에서 복제(replication)가 가능한 기형태(奇形胎)의 DNA 분자를 생성하는것이다. 삽입된 DNA 결합서열은 수용체인 숙주에 대해서는 이질적인 것인데 즉 삽입된 DNA 결합서일과DNA 벡터가 특질상 유전정보를 교환하지 않는 생물체로부터 유도되거나 삽입된 DNA 결합서열이 전부 또는 일부가 합성적으로 생성되는 것이다. 근래에 와서 재조합 DNA 분자를 구성할 수 있는 몇가지 방법이개발되었는데 그 예로서는 미국특허 제 4,237,224 호에 의하면 제한효소를 이용하는 재조합 플라스미드 제조와 결찰법(ligation)에 대하여 기술하고 있다. 이들 재조합 플라스미드를 도입하여 변환수단에 의해 단일세포 생물체내에서 복제한다. 이 방법은 일반적으로 적용되기 때문에 위의 미국특허도 본 발명에서 참고자료로 인용되어 있다.
구성방법과는 관계없이 재조합 DNA 분자는 숙주세포와 화합성 즉 숙주세포내에서 자동적으로 복제가 될수 있어야 한다. 재조합 DNA 분자는 재조합 DNA 분자에 의해 변환된 숙주세포를 선택할 수 있게 하는표지물 기능도 가져야 한다. 더우기 적당한 복제, 전사 및 전이의 모든 신호가 기형태 DNA 분자에서 정확히 배열된다면 외부 유전자가 변환된 세포와 그들의 후대 개체에서 발현된다.
이들 상이한 유전신호와 치리상황은 여러가지 유전자 발현 즉 DNA 전사와 메신저 RNA 전위를 통제한다. DNA 전사는 RNA 중합효소를 결속하여 전사를 촉진시키는 DNA 결합서열인 촉진유전자의 존재에 따라 좌우된다.
원핵생물에서의 메신지 RNA(mRNA)의 전이는 적당한 원핵 신호의 존재에 따라 좌우된다. B.t. 같은원핵생물에서의 효과적인 mRAN의 전이는 mRNA에 대한 SD(Shine Dalgarno)로 불리우는 리보솜(ribosome) 결합위치를 필요로 한다. 이 결합서열은 단백질의 아미노 말단인 메티오닌을 인코우드 하는 개시코오돈(start codon)인 AUG의 앞에 위치하는 mRNA의 짧은 뉴클레오티드 결합서열이다. SD 결합서열은 16S RNA(리보솜 RNA)의 3' 말단에 대해 보완적인데 mRNA와 합병되어 리보솜에 내한 mRNA의 결합을 촉진시키므로서 리보솜의 위치를 정확히 바로 잡게한다(Roberts and Lauer,1979, Methods inEnzymology, 68:473) .
특정한 유전자를 클로닝하는데 널리 이용되는 한가지 방법은 재조합 플라스미드의 "라이브러리(library)"를 만드는 것이다. 각각의 재조합 플라스미드는 그기에 수용되어 있는 세포에 대해 항생물질의 내성을 부여하는 플라스미드 벡터와 유전자를 가지는 생물체인 공여 생물체로부터 나오는 DNA 단펀으로 구성된다. 플라스미드 라이브러리는 공여 생물체에서 나오는 총 DNA와 플라스미드 벡터를 제한효소로 소화시켜 효소를비활성화한 후 DNA 혼합물을 결찰시켜 제조하는 것이 보통이다. 이 플라스미드 라이브러리의 주요특징은여기에는 여러가지의 상이한 재조합 플라스미드가 많이 함유되어 있다는 점이다. 라이브러리에 있는 재조합플라스미드중 최소한 하나에는 해당 유전자가 존재하는 공여 생물체의 DNA 단편을 함유할 가능성이 극히크다. 플라스미드 라이브러리를 변환시켜 유전자가 함유되지 않은 숙주생물체의 세포로 만든다. 항생물질을대개 함유하는 선택적인 고체매체에 숙주세포를 분산시켜 재조합 플라스미드를 함유하는 변환된 세포만 군체로 생장되게 한다. 각각의 변환된 숙주균체를 사용하여 공여 생물체로부터 유전자를 얻었는지에 대해 시험한다. 숙주군체에 있어서 획득된 유전자를 재조합 플라스미드에 옮긴다.
가장 직접적인 유전자 획득 시험법 한가지는 유전자 특성에 따른 잡종형성 소식자를 사용하는 것인데 즉이것은 유전자에 대해 동족계인 DNA의 단편을 사용하는 것이다. 동족계의 DNA 단편의 특징은 잡종형성도-중 상호간에 대해 견고하에 결합한다는 것이다. 잡종형성도중 방사능으로 표지된 DNA 소식자를 사용하여 유전자에 소식자가 결합했는지를 쉽사리 모니터링 할 수 있다. 분자 생물학에 있어서 최초의 진전은 합성 올리고뉴클레오티드를 유전자 특징적인 소식자로 사용하는 것이다. 올리고뉴클레오티드의 사용 근거는모든 생물학적인 계에 있어서 뉴클레오티드의 특별한 결합서열에 따라 아미노산의 정확한 결합서열을 인코우드 한다는데 있다. 역으로 말하자면 특수한 단백질에 대해 아미노산의 결합서열을 알고 있다면 단백질을인코우드하는 뉴클레오티드 결합서열을 비록 정확하지는 않다하더라도 추정할 수 있다. 실제로 해당 유전자의 생성물인 단백질의 부분적인 아미노산 결합서열을 화학적인 방법으로 결정한다. 단백질 아미노산 결합서열에 입각해서 여러가지 유전자에 동족계인 유전자 특징적인 올리고뉴클레오티드 소식자를 합성한다. 단백질의 아미노산 결합서열에 대한 지식만으로는 단백질을 인코우드 하는 유전자의 뉴클레오티드 결합서열에대한 정확한 지식을 제공하지 않기 때문에 정확한 동족성이 보장되지 않는다.
그럼에도 불구하고 올리뉴클레오티드 소식자와 유전자 사이의 동족성이 정확하지 않다하더라도 올리고뉴클레오티드 소식자가 유전에 대해서만 결합하게 되는 잡종형성 조건을 대개 찾아낼 수 있다. 따라서 P-2유전자를 분리함에 있어서 바실러스 튜린지엔시스 변종 Kurstaki의 공여체 균주로부터 P-2 단백질을 정제하여 P-2 단백질의 부분 아미노산 결합서열을 결정하였다. P-2 단백질의 아미노산 결합서열에 입각해서P-2 유전자 특징적인 올리고뉴클레오티드 소식자를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드를 방사능으로 표지하고 이것을 잡종형성 실험에 사용하여 공여체 B t. 균주로부터 얻는 P-2 유전자를 가지는 재조합 플라스미드를 수용한 변환된 숙주군체를 확인하였다.
2, 바실러서 튜린지엔시스 균주 HD263-1의 P-2 독소 유전자의 클로닝
특히 본 발명의 P-2 독소 유전자를 클로닝하기 위해 모균주 HD-1에서 바로 유도된 단일군체 분리물인B.t. 균주 HDl-1의 세포(U.S.D.A., Cotton Insect Research Unit, Brownsville, Texas 78520)를 C2매체(글루코오스 1%, 펩톤 0.2%, N Z 아민 A 0.5%, 효모추출물 0.2%,(NH4)2 SO4,15mM, KH2PO4 23mM, K2HPO4 27mM, MgSO4·7H2O lmM, CaC12 600μM, ZnSO4·7H2O 17μM, CuSO4·5H2O17μM, FeSO4 7H2O 2μM)중에서 30℃에서 72시간 생장시켜 홀씨와 결정을 원심분리하여 수거했다. 홀씨/결정 젤럿(pellet)을 1M NaCl로 수차 세척한 다음 탈염수로 수차 세척했다.5% B-메토캅토에탄올,2%NaDodeSO4,60mM 트리스 pH 6,8,10% 글리세롤중에서 70℃에서 7분간 홀씨/결정조제물을 항온처리하여 독소단백질을 용해하고 원심분리하여 홀씨를 제거했다. NaDodeSO4를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔속을 상청액을 통과시켜 전기 이동(electrophoresis) 처리해서 단백질을 분리하였다. 쿠우마시이(Coomassie) 염료로 겔을 염색하고 P-2 단백질을 함유하는 겔슬라이스(slice)를 면도칼로 절단하였다. 균질의 P-2 만백질 조제물을 겔슬라이스로부터 전기용리시키고 아세톤 침전시킨 다음 P-2 단백질의 NH2 말단 아미노산결합서열을 측정했는네 이때 사용한 장치는 Applied Biosystems Gas Phase Swquenator(mode1 470A) 및1040 다이오드 어레이 니덱터가 있는 Hewlett-Packard HPLC(model 1090)외 Dupont Zorbax C18 칼럼이었다. 균질의 P-2 단백질의 NH 말단부분의 아이노산 결합서열은 다음과 같이 확인되었다 :
3.P-2 유전자용 올리고뉴클레오티드 소식자
P-2 단백질외 NH2 말단중의 아미노산 4-24 개를 인코우드 하는 62머(mer) 올리고뉴클레오티드 소식자를 DNA 합성장치(Applied Biosystems DNA Synthesizer. mode1 380A)로 합성했다. 코오돈 퇴화(및가지 다소 상이한 코오돈에 의해 어떤 아미노산들이 각기 인코우드됨)로 인하여 합성올리고뉴클레오티드의 결합서열은 P-2 유전자의 실질적인 NH2 말단 결합서열과는 상이할 것으로 인식하고 있었다. 그러나 B.t.게놈(genome)이 68% A·T란 사실과 앞서 클로닝되고 결합서열이 확인된 B.t. 유전자에 대한 코오돈 사용정보를 P-2 유전자의 실제 결합서열을 정합(整合)할 가능성이 가장 큰 올리고뉴클레오티드 소식자를 설계하는데 사용하였다. P-2 유전자의 NHz 말단 코우딩 영역에만 결합시키고자 올리고뉴클레오티드 소식자를 설계하였다. P-2 유전자에 특징적인 을리고뉴클레오티드 소식자의 결합서열은 다음과 같다:
5'-GTA TTA AAT TCA GGA AGA ACA ACA ATT AAT GAT GCATAT AAT GTA GTA GCA CAT GAT CCA TT-3′
여기에 나온 P-2 유전자의 최초의 분리를 가능하게 하는 것외에는 이 DNA 소식자는 본 발명의 또다른바람직한 실시태양으로 이러한 DNA 소식자에 의해 어떠한 B.t. 균주라도 스크리닝하여 P-2 유전자(또는관련된 유전자)가 자연적으로 존재하는데 특수한 변환된 생물체에 P-2유전자가 있는지를 결정짓는 것이다. 이렇게 함으로써 B.t. 균주의 살충활성을 평가할 수도 있다. 본 발명의 범위에는 이러한 소식자를 다소간 올리고뉴클레오티드로 구성한 것도 포함된다. 공지의 방법 또는 아래에 같은 방법으로 소식자를 표지한다.
4. P-2 유전자가 풍부한 플라스미드 라이브러리 구성
올리고뉴클레오티드 소식자를 사용하여 최소한 P-2 유전자의 NH2-말단 코우딩 영역을 함유한 B.t.DNA의 제한단편의 크기를 측정하였다. 이러한 측정을 하고자 미균주 HD-263(U.S.D.A., CottonInsect Research Unit, Brownsville, Texas 78520)에서 즉시 유도된 단일군체 분리물인 균주 HD263-1과모균주 HD-1(U.S.D.A., Brownsville, Texas)로부터 즉시 유도된 단일 군체 분리물인 균주 HDl-1을DNA 공급원으로 사용하였다. 이들 균주 두가지는 P-2 결정단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다. P-2 결정만백질을 생성하지 아니하는 B.t. 균주 EG2158과 HD567을 음성대조물로 사용했다.
세포를 30℃에서 LB 매체중에서 중간 로그 기(mid-1og phase)까지 성장시킨 다음 각종 공여 균주로부터 분리하였다. 세포를 원심분리하여 수거하고 50mM 트리스 HCI
pH 7.8,10mM EDTA,lmg/m1 리소자임 중에 다시 현탁시켜 37℃에서 60분간 항온CJ리했다. NaDodeSO4를 가하여 최종 농도가 0.2% 되게함으로써 세포를 용해(lySe)하였다. 세포용해물을 등체적의 페놀로 이회 추출하고나서 등체적의 클토로포름/이소아밀 알코올(24/1)로 일회 추출했다.3M Na 아세테이트 1/50 체적과 EtOH 2체적을 세포용해물에 가하고 유리막대로 휘저으면서 DNA를 추출했다. 이 DNA를 66% EtOH 중에 5분간 침지하고 디에틸에테르중에서 1분간 침지한 후 DNA를 공기건조시키고 다시 탈염수중에 현탁시켰다.
공여 균주 각각에서 얻는 총 DNA를 HindIII 제한효소로 소화시키고 소화된 DNA를 아가로우스겔에서전기이동시킨 다음 아가로우스겔로부터 니토로셀룰로오스 필터토 DNA를 Southem의 블로트법(blottechnique) [J. Molex. Bio1.98·503-517,1978]으로 옮겨줌으로써 잡종형성 실험을 하였다. 니토로셀룰로오스 필터를 3×SSC(1×SSC-0.15M NaC1/0.015M 시 트르산 나트륨),0.l% NaDodeSO4,20μg/m1 헤파린, 감마-P32-ATP와 T4 키나아제로 방사능 표지된 P2 유전자에 특징적인 올리고뉴클레오티드 소식자약 1μg을 함유하는 10×덴하르트(Denhardt)용액 (1×0.2% 소혈청 알부민/0.02% ficol1/0.02% 폴리비닐-피롤리돈)으로된 용액중에서 32℃에서 16시간 항온처리 하였다. 잡종형성을 시킨 후 니토로셀룰로오스필터를 32℃에서 3×SSC,0.1% NaDodeSO4로 1시간 세척하고나서 필터를 X선 필름에 노출시켰다. 여기서 얻은 방사선 사진에 의하면 균주 263-1에서 얻는 DNA의 약 9.0 및 5.0kb의 두가지 HindIII 단편에 대해 올리고뉴클레오티드 소식자가 특징적으로 잡종형성을 하였는데 소식자는 균주 HDl-1의 DNA의 거의동일한 9.0 및 5 0kb HindIII 단편에 내해 잡종형성을 하였다. P-2 결정단백질인 EG2158과 HD567을 합성하지 않은 B.t. 의 두가지 균주에서 얻은 어뗘한 DNA 제한단편에 대해서도 소식자는 잡종형성을 못하였다.
두가지 HindIII 단편 즉 9.0 또는 5.0kb 중에서 어느것이 올리고뉴클레오티드 소식자에 대해 가장 강력히 잡종형성 하였는지를 결정할 필요가 있는데 그 이유는 가장 강력히 잡종형성을 하는 단편이라면 P-2유전자를 함유할 수 있을 가능성이 크기 때문이다·소식자가 니트로셀룰로우스 필터에 있는 DNA 단편에결합한체로 있는 가장 높은 세척온도에 따라 잡종형성 강도를 측정한다. 따라서 점차 높은 온도에서 3×SSC,0.1% NaDodeSO4 중에서 반복해서 니트로셀룰로오스 필터를 세척한 다음 방사성 소식자가 9.0kb단편에 대해서는 그 이상더 잡종형성을 하지 않으나 5.0kb 밴드에 내해서만 잡종형성을 하는 온도(50t)가될때까지 방사성 사진 촬영을 하었다. 따라서 P-2 유전자의 최소한 NH2 말단 코우딩 영역이 균주HD263-1과 HD1-1에서 얻는 DNA의 5.0kb HindIII 단편에 존재하고 있다는 것을 확인하였다.
P-2 유전자가 풍부한 플라스미드 라이브러리는 HD263-1 충 DNA를 HindIII로 소화시키고 소화된DNA를 아가로우스겔에서 전기이동처리한 다음 HindIII DNA 단편을 함유하는 겔슬라이스를 약 4.0-6.0kb의 크기범위로 절단함으로써 구성하였다. 크기범위가 4.0-6.0kb인 HD263-l HindIII 단편들을 아가로우스겔 슬라이스에서 전기용리하고 페눌과 클로로포름으로 추출한 다음 에탄올로 침전시키고나서 HindIII로소화되고 알칼리성 포스파타아제로 처리된 플라스미드 pBR322의 HindIII 위치속으로 결찰시켰다. 알칼리성포스파타아제는 pBR322와 HD263-l DNA의 HindIII 단편으로된 재조합 플라스미드를 생성시킬 가능성을크게 하였다. 생성된 결찰 혼합물은 균주 HD263-1에서 얻은 P-2 독소유전자가 풍부한 재조합 플라스미드의 라이브러리로 구성된 것이었다.
5. P-2 유전자를 함유하는 5.2kb HindlII 단편의 군체 잡종형성의 및 분리
P-2 유전자가 풍부한 플라스이드 라이브러리를 CaCl2 방법에 따라 변환시켜 대장균 HBl01(BethesdaResearch Laboratories, Bethesda, MD)의 암피실린 강수성 숙주균주를 얻었다. 대장균 균주 HBl01은P-2 단백질을 합성하지 못하기 때문에 P-2 유전자를 가진 것으로 생각되지 않았다. 대장균 세포는 재조합 플라스미드에 의해 쉽사리 변환되기 때문에 대장균을 숙주균주로 사용했다. 재조합 플라스미드를 필요로하는 모든 숙주세포는 점차 암피실린 내성으로 되어갔다. 재조합 플라스미드에 노출시킨 다음 암피실린을함유하는 고체매체 위에다 대장균 숙주세포를 확산시키고 재조합 플라스미드를 수용한 이들 세포를 성장시켜 군체로 만들었다. 각각의 암피실린 내성의 숙주군체에는 공여균주 HD263-l DNA의 독특한 HindlIl 단편과 pBR322로된 재조합 플라스이드의 동일한 복제물을 다수 수용하고 있음을 예측할 수 있었다. 그러나 재조합 플라스미드에 있는 공여균주 HindIII 단편은 한가지 군체와 그다음 군체와는 상이하였다 약 2000개의 각각의 암피실린 내성의 군체를 니트로셀룰로오스 필터에다 를룻팅(blotting)하였다. 이들 군체의 복제물을 다음에 나오는 바와 같이 그 다음의 용도에 사용코자 보관하였다. 군체중에 함유된 재조합 플라스미드를 니트로셀룰로오스 필터에 결합시켰는데 이 경우에 있어서 군체를 NaOH와 NH2 아세데이트로 처리하였다. 여기서 얻은 니토로셀룰로오스 필터에는 재조합 플라스미드의 배열을 가치고 있었고 각각은 기타 재조합 플라스미드로부터 물리적으로 분리하였다. 니트로셀룰로오스 필터를 방사능으로 표지된 P-2 유전자에특징적인 올리고뉴클레오티드 소식자 약 1μ9,10×덴하르트용액,0.1% NaDodeSO4,200μ9/m1 헤파린 및3×SSC 로된 용액중에 50t에서 1시간 세척하고나서 X선 필름에 노출시켰다.
여기서 얻은 방사선 사진에 의하면 니트로셀룰로오스 필터에 4분데 상이한 위치에 있는 재조합 플라스미드에 대하여 올리고뉴클레오티드 소식자가 잡종형성 하였다는 것을 알 수 있었다. 군체 복제물과 방사선 사진을 정돈하여 재조합 플라스미드가 올리고뉴클레오티드소식자와 겉보기에 잡종형성된 4가지 군체를 확인할수 있었다.
재조합 플라스미드를 4가지 군체 각각에서 추출하고 플라스미드를 HindIII로 소화시킨 다음 아가로우스젤에서 전기이동시켰다.4가지 플라스미드중 3가지는 HD263-l DNA윌 겉보기에 동일한 크기같은 5.2kbHindIII 단편과 pBR322로 되어 있었다. Southern의 블랏(blot) 법에 따라 아가로우스겔로부터 니토토셀룰로오스 필터에 플라스미드를 옮기고나서 방사성으로 표지된 올리고뉴클레오티드 소식자로 니트토셀룰토오스필터를 잡종형성한 다음 X-선 필름에 노출시켰다. 여기서 얻은 방사선 사진에 의하면 세가지 재조합 플라스미드 각각에 있는 5.2kb Hindm 단편에 대해서만 올러고뉴클레오티드 소식자가 잡종형성을 하였다는 것을 알 수 있었다. 이들 재조합 플라스미드중 하나(pEG 201)를 선정하여 다시더 실험을 하여 평가했다.pEG 201을 수용하고 있는 최초의 내장균 군체를 EG 1304로 하였다.
6. 클로닝된 5.2kb HindIII 단편에서의 P-2 유전자의 위치
클로닝된 5.2kb HindlII 단편에는 최소한 P-2 유전자의 NH2 말단 코우딩 영역이 있을 수 있다.5.2kb단편에 P-2 유전자가 있다는 것은 DNA 결합서열을 파악해서 P-2 단백질의 NH2 말단을 인코우딩한 클로닝된 5.2kb 단편에 있는 영역을 찾아내면 알 수 있다·두개의 kb 보다 더긴 DNA의 단편의 결합서열을파악하기가 어렵기 매문에 P-2 유전자를 가지고 있다고 생각되는 5.2kb 단편속에 있는 DNA의 조그만 단편을 확인할 필요가 있었다.
따라서 각종 제한효소로 플라스미드 pEG201을 소화하고 소화된 플라스미드를 아가로우스겔을 동과시켜전기이동치리한 후 겔로부터 니트로셀룰로오스 필터로 플라스미드 제한단편을 블랏팅하였다. 방사능으로 표지된 올리고뉴클레오티드 소식자로 필터를 잡종형성한 결과 DNA의 1.3kb Sau3A 제한 단편에 대해 소식자가 특수하게 잡종형성 했음을 알 수 있었다. 따라서 예측할 수 있었던 것은 1.3kb 단편중에는 최소한P-2 유전자의 NH2 말단 코우딩 영역이 있다는 점이다.
1.3kb 단편을 pEG201로부터 서브콜로닝(subcloning)하여 DNA 결합서열 벡터 mp18과 mp19(BethesdaResearch Laboratories, Bethesda MD)를 얻었다.1.3kb 단편의 DNA 결합서열에 의하면 여기에는 P-2단백질의 NH2 말단을 인코우딩 하는 DNA의 영역이 있음을 알 수 있었다 이것은 결론적으로는 공여균주HD263-1에서 얻은 클로닝된 5 2kb HlndIII 단편에는 P-2 유전자가 있다는 것을 밝혀준 것이다 1.3kb단편에 대한 추가적인 DNA 결합 서열 확인결과 P-2 유전자의 NH2 말단 메티오닌 코오돈으로부터 위쪽에 있는 150개의 뉴콜레오티드에 AccI 제한위치가 위치하고 있다는 것을 알 수 있었다 이 AccI위치는표지물로서의 역활을 하였다 이것에 의하여 5 2kb 단편에 있는 P-2 유전자의 위치를 정확하게 측정할 수있었다.
클로닝된 5 2kb 단편에 있는 P-2 유전자의 전사위치와 전사 방향을 여러가지의 기타 제한효소와 더불어AccI을 사용하여 5 2kb 단편을 소화시켜 측정했다. 아가로우스겔을 통과시켜 제한단편들을 전기이동처리하고 니트로셀룰로오스 필터에다 블랏팅하였다. 방사능으로 표지된 P-2 유전에 특징적인 올리고뉴클레오티드 소식자로 필터를 잡종형성함으로써 크기가 큰 5.2kb 단편에 있는 각종 제한 단편의 위치와 방향을 측정했다,
이러한 지식을 활용하여 5.2kb 단편에 있는 P-2 유전자의 정확한 전사위치와 방향을 제1도에 있는 화살표로 나타난 바에 따라 측정하였다. 제1도는 플라스미드 pEG201의 제한도(restriction map)이다, 상자로 표시된 플라스미드 벡터 DNA를 나타낸다 pBR322 벡터는 개방된 상자부분으로 나타나 있다. 수평선은 균주 HD263-1에서 얻은 클로닝된 B.t. DNA를 나다낸다. 큰 화살표는 P-2 유전자의 코우딩 영역을나타내고 플라스미드 pEG204는 밑에 나와 있다· P-2 유전자의 길이를 P-2 단백질의 예측된 크기(68KDa)에 입각해서 추정해본 결과 약 1 9kb었다
7. 클로닝된 P-2 유전자의 DNA 결합서열
P-2 유전자의 전부 또는 최소한 대부분은 클로닝된 5 2kb 단편내의 2 2kb Acc I -HindIII 단편속에 있다는 것을 예측할 수 있었다(제1도). 따라서 2.2kb AccI-HindIII 단편을 결합서열 벡터 mp18과 mp19속으로 서브클로닝하고 2.2kb 단편의 완전한 결합서열을 Sanger의 디데옥시법(Sanger, F., Nicklen, S.& CouIson, A.R.(1977) Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 74.5463-5467)으로 측정하였다. 예측한 바와같이 2.2kb 단편에는 p-2 단백질에 대한 NH2 말단 코오돈으로 시작하는 오픈리딩 프레임(open readingframe:단백질 코우딩 영역)을 가지고 있었다. 본 발명의 P-2 유전자를 포함하는 2.2kb 단편의 DNA 결합서열과 P-2 단백질의 추측된 아미노산 결합서열이 제2도에 나와있다. 제2도를 보면 알 수 있는 것은AccI 위치의 첫번째 뉴콜레오티드로 시작되고 HindIII 위치의 최종 뉴콜레오티드로 끝나는 2.2kb AccI -HindIII 단편의 완전한 DNA 결합서열이다. AccI 위치는 P-2 유전자의 NH2 말단 메티오닌 코오돈으로부터 위쪽에 있는 150개의 뉴콜레오티드이다. P-2 유전자 결합서열로부터 추출되는 바와 같이 P-2단백질의 크기는 66,547 돌턴으로 측정되었다.
8. 클로닝된 P-2 유전자의 특수한 잡종형성 소식자로서의 이용
가. P-2 유전자를 함유한 원래의 B.t. 플라스미드의 확인
클로닝된 DNA 결합서열의 한가지 장점은 이것을 이용하여 특징이 없는 DNA 시료중에 있는 관련된DNA 결합서열을 확인할 수 있다는 것이다. P-2 유전자의 경우에 있어서 클로닝된 유전자를 이용하여 B.t. 균주에 P-2 유전자가 있는지를 검출할 수 있다. 대부분의 B.t. 균주중에는 염색체 DNA 외에 다수의천연 플라스미드가 함유되어 있다. 이들 균주중 많은 들에 있어서 P-2 유전자가 플라스미드 하나 또는 염색체에 존재한다고 알려져 있지 않다.
클로닝된 P-2 유전자를 이용하여 천연 B.t. 숙주 균주에 있는 P-2 유전자의 위치를 파악할 수 있는지의 여부를 결정짖기 위해 B.t. 균주 HD263-1, HD1-1, HD567 및 HD278을 Eckhardt의 방법(Eckhardt, T.(1978) Plasmid l.584-588)에 따라 용해시킨 다음 세포용해물을 아가로우스젤을 통과시켜전기이동처리 하였다. 이 방법에 의하여 특수한 균주속에 함유된 모든 플라스미드를 크기별로 분리할 수 있었다. 분리된 플라스미드를 Southern의 블라드법에 의해 아가로우스겔로부터 니토로셀룰로오스 필터로 옮졌다. 방사능으로 표지된 2.2kb Acci-HindIIl(P-2 유전자) 단편으로 니트로셀루라로오스 필터를 잡종형성하였다. 니트로셀룰로오스 필터의 방사선 사진에 의하면 P2 생성균주인 HD263-1, HDl-1 및 HD278에 있는 약 110MDa의 플라스미드 한가지에 대해서만 P-2 유전자 단편이 잡종형성을 하였음을 알 수 있었다(제3도). 클로닝된 P-2 유전자는 P-2 음성균주 HD567에 있는 어떠한 플라스미드에 대해서도 잡종형성을 하지 않았다. 따라서 이러한 실험에서 알 수 있는 것은 클로닝된 P-2 유전자를 사용하여 B.t. 균주의 P-2 유전자를 가지는 천연 플라스미드를 확인 할 수 있었다는 것이다. 클로닝원 P-2 유전자로 DNA잡종형성을 하면 B.t. 균주에 있는 이러한 많은 플라스미드로부터 P-2 유전자를 가진 단일 플라스미드를직접 확인 할 수 있다.
나. P-2 유전자를 함유한 DNA 제한 단편의 확인
B.t. 균주 HD263-1의 클로닝된 P-2 유전자를 DNA의 5.2kb HindIII 단편에 함유시켰다. 클로닝된P-2 유전자를 이용하여 기타 B.t. 균주의 P-2 유전자를 함유하는 유사한 DNA 제한단편을 확인할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 어떤 방법을 사용하였다. 따라서 시험균주 HD-1, HD278, HD567 및 원래의 공여균주 HD263-1에서 얻은 DNA 전부를 HindIII 제한효소로 소화하고 소화된 DNA를 아가로우스겔을 통과시켜 전기이동시킨 다음 소화된 DNA를 겔로부터 니트로셀룰로오스 필터로 옮겼다· 방사능으로 표지된 2.2kb Acc I -HindIII DNA(P-2 유전자) 단편을 사용해서 필터를 551C에서 잡종형성시키고 55℃에서 세척한 다음 필터를 X선 필름에 노출시켰다.
제3(3A)도는 에티듐 브로마이드로 염색된 에크하르트겔의 사진이다. 각종 B.t. 균주에 존재하는 천연 플라스미드는 눈에 보일정도이다. 제3A도로부터 알 수 있는 것은 내부분의 B.t. 균주에 몇가지의 천연 플라스미드가 있다는 점다. 그림의 왼편에 있는 숫자는 클라스미드의 크기(메가돌턴:MDa)이다.
3(3B)도는 방사능으로 표지된클로닝된P-2 유전자를 제3A도의 플라스미드로 잡종형성하여 만든 방사선 사진이다 제3B도에서 알 수 있는 것은 P-2 단백질을 생성하는 것으로 알려진 세가지 균주(HD-1,HD263-1, 및 HD278)에 있는 110MDa의 플라스미드에 대해서만 클로닝된 P-2 유전자가 잡종형성을 한다는 점이다. 클로닝된 P-2 유전자도 30MDa의 DNA 앤드에 대해 잡종형성을 하였다(제3(3B)도). 이DNA 밴드는 110MDa 플라스미드의 분해에서 생긴 DNA 단편들이었다.110MDa 플라스미드 같은 극히 큰 플라스미드들은 네크하르트형 겔을 동한 전기이동처리시 자주 파괴되어 조그만 단편들로 되었다, 콜로닝된 P-2 유전자의 110MDa 플라스미드에 대한 특수한 잡종형성으로부터 균주 HDl-1, HD263-1 및HD278이 경우에 있어서 1l0MDa의 플라스미드만이 P-2 유전자를 가지고 있다는 것을 알 수 있다. P-2단백질(HD567)을 생성하지 않은 균주로부터 얻은 플라스미드에 대해서는 클로닝된 P-2 유전자가 잡종형성을 하지 않았다. 전반적으로 제3도(3A도 및 3B도)로부터 알 수 있는 겻은 클로닝된 P-2 유전자를 천연 B.t. 플라스미드에 있는 P-2 유전자 확인용의 특수한 소식자로 사용할 수 있다는 점이다.
제4(4A)도는 균주 HDl-1(레인 2), HD56가레인 3), HD278(레인 4) 및 HD263-1(레인 5)에서 나오는HindIII 소화 DNA를 함유하는 에티듐 브로마이드로 염색된 아가로우스겔의 사진이다. 제4(4A)도에서 알수 있는 것은 HindIII토 소화원 B.t. DNA를 분할하여 수백개의 상이한 크기의 단편으로 만들 수 있다는점이다. 레인 1에는 HindIII로 된 람다 DNA가 있었는데 이것은 크기 표지물로 사용된다. 왼쪽에 있는 숫자는 DNA 단편의 크기(kb:kiIobase)를 나타낸다,
제4(4B)도는 방사능으로 표지된 클로닝된 P-2 유전자를 제4A도 HindIII 단편으로 잡종형성(551C에서)해서된 방사선 사진이다. 전반적으로 제4도(4A 및 4B)에서 알 수 있는 것을 클로닝된 P-2 유전자를특수한 소식자로 사용해서 P-2 유전자를 가지는 DNA 제한단편의 확인할 수 있다는 점이다.
방사선 사진에서 알 수 있는 것은 예측한 바와 같이 균주 HD263-1에서 얻는 5.2kb HindIII 단편에 대하여 클로닝된 P-2 유전자가 잡종형성한다는 점이다(제4(4B)도, 레인 5), 놀랍게도 균주 HD263-1에서얻는 9.0kb HindIII 단편에 대해서도 P-2 유전자가 잡종형성을 하였다(제4(4B)토, 레인 5), 균주 HDl-l에 있는 5.2kb 및 9.0kb의 HindIII 단편(제4(4B)도, 레인 2)과 균주 HD278에 있는 5.2kb 및 4.4kb의HindIII 단편(제4(4B)도, 레인 4)에 대하여 P-2 유전자가 잡종형성 하였다. P-2 유전자는 P-2 음성균주 HD567에서 얻은 어떠한 HindIII 단편에 대해서는 잡종형성을 하지 못하였다(제4(4B)도, 레인 3), 니트로셀룰로오스 필더를 80℃에서 세척하고 X선 필름에 노출시켰다. 여기서 얻은 방사선 사진에 의하면 고온에서 세척한 후 표지된 P-2 유전자 소식자는 5.2kb 단편에 대한것 보다9.0kb 및 4.4kb 단편에 대하여거의 결합하지 않았다는 것을 알 수 있었다(제4(4C)도, 레인 2,4 및 5).
위의 내용은 클로닝된 P-2 유전자의 몇가지 바람직한 용도에 관한 것이다. 우선 균주 HD263-1의 클로닝된 P-2 유전자를 이용하여 기타 B.t. 균주의 P-2 유전자를 함유하는 DNA 제한 단편을 확인할 수 있다. 예를 들자면 클로닝된 P-2 유전자는 균주 HD1-1의 두가지 HindIII 단편에 대해 잡종형성을 한 것이다 두번째는 클로닝된 유전자에 의하여 특정한 B.t. 균주에 존재하는 P-유전자의 수를 결정할 수 있다.예컨데 P-2 유전자 소식자가 균주 HD263-1의 두가지 HindIII 제한단편에 대해 잡종형성을 하기 때문에균주 HD263-1에는 두개의 P-2 유전자가 있음이 밝혀진 것이다·P-2 유전자에 특징적인 올리고뉴클레오티드 소식자도 균주 HD263-1의 9.0kb 및 5.2kb의 두가지 HindIII 단편에 대해 잡종형성을 하였다.
9.0kb 단편에 있는 P-2 유전자의 정확한 특성에 내해서는 9.0kb 단편을 분리해서 그 DNA 결합서열을확인할때까지는 알 수 없다. 이렇게 되면 클로닝된 P-2 유전자에 대한 세번째의 바람직한 용도와 관련을가지게 된다. P-2 유전자는 9.0kb HindIII 단편에 대해 특히 잡종형성을 하기 때문에 클로닝된 P-2 유전자(또는 그 일부나 그 유도체)는 이 단편을 분리함에 있어 이상적인 소식자이다.
네번째는 클로닝된 P-2 유전자에 의하여 P-2 유전자를 사이의 관련을 신속히 정성적으로 예측할 수 있다. 예컨데 예측가능한 것으로는 클로닝된 P-2 유전자는 9.0kb HindIII단편 또는 4.4kb HindIII 단편에있는 P-2 유전자에 대한것 보다는 균주 HD1-1의 5.2kb 단편에 있는 P-2 유전자에 더 많은 관련을 가진다는 점이다. 이러한 관련성은 P-2 유전자 소식자가 80℃에서 9.0kb 단편 또는 4.4kb 단편에 대한것보다는 5.2kb 단편에 대하여 강력히 잡종형성을 한다는 것으로부터 직접 증명이 되었다.
9. P-2 독소의 추가 정제
P-2 유전자를 적당한 플라스미드에 삽입해서 이것을 이용하여 적당한 미생물을 변환시킨다. B.t. 이외의 기타 미생물을 P-2 유전자, 일반적으로 말해서 바실러스, 에스테리치아 및 시아노 박테리아등의 속(屬)에 속하는 생물체를 결합시켜 변환시키는 것도 분명히 본 발명의 범위내에 속한다. 또한 P-2 유전자를 결합시켜 상이한 B.t 균주를 변환시키기는 것도 본 발명의 범위내에 속한다.
이렇게 해서 변환시킨 미생물에 의해 B.t. 천연 숙주균주에서 생긴 과잉량의 P-2인 량으로 하여 P-2가생성된다. 변환된 생물체에 의해 변환된 P-2는 이 생물체에 의해 생성된 델타-균체내독소 뿐이다. 이와같이 하여 생물체 자체를 단독으로 이용하던지 살충제 조성물의 일부로 이용한다. P-2는 생물체에 의해생성된 델타-균체내독소일 뿐이므로 레노그라면 일드기울기법(renografin density gradient) 같은 공지방법으로 기타 세포물질로부터 P-2를 정제하는 직접적인 방법인 것이다.
10. P-2의 식물로의 변한
식물에다 P-2 유전자(제2도)를 직접 삽입하여 식물 자체가 P-2 독소를 생성하게 하는 것도 본 발명의범위내에 속한다.
여러가지 형태 및 근원을 가진 DNA 분자를 이용하여 P-2 유전자를 함유하는 소요의 DNA를 식물조직이나 세포속으로 도입하여 식물에 대한 유전공학을 달성할 수 있다 극한된 것은 아니나 여기에는 아그로벡데리움 투메파시엔스에서 얻는 Ti 플라스미드 같은 천연산 식물 벡터나 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV ' Cauliflower Mosaic Virus)나 제미나바이러스등과 같은 DNA 바이러스, RNA 바이러스 및 예방백신 같은 식물의 병원체에서 유도된 DNA 분자, 세포기관에 있는 염색체의 DNA 요소(예:엽록제 또는미토큰드리아) 또는 핵(核)적으로 인코우드된 제어요소동과 같은 불안정한 식물 게놈 성분에서 유도된DNA자, 안정한 식물 게놈 성분에서 유도된 DNA분자(예:도입된 DNA를 세포기관 게놈 또는 핵게놈에결합시켜 식물외 세포분열 및 식물의 유성생식도중 정상적으로 복제하고 자동적으로복제하며 정상적으로분리하여 그 다음의 계속되는 식물세대에 유전되게 하는 기타 DNA 결합서열과 복제원천)이 포함된다.
P-2 유전자를 가진 DNA를 A. 투메파시엔스 같은 미생물이나 바이러스 또는 Ti 같은 감염성 플라스미드에 의하거나 리포솜을 사용하거나 기계적인 방법에 의해 미량주입하거나 전체 염색체 또는 염색체 단편에의해 식물세포나 조직속으로 직접 전달한다.
11. P-2 단백질을 함유하는 제품 및 제제
P-2 델타-균체내독소는 나비목 근충과 파리목 곤충에 대해 활성을 가진 살충성 화합물이다. 따라서P-2 단백질 독소를 살충제(활성성분)로 하여 단독으로 사용하거나 균질 또는 순수형태로 사용하며 제2도의 아미노산 결합서열을 가진 것을 사용하거나 클로닝된 P-2 유전자를 발현하는 변환된 미생물속에 가하거나 이겻과 더불어 사용하던지 B.t. 또는 홀씨 기타 중에 P-2를 함유하는 기타 변환된 홀씨형성 미생물과의 혼합물로해서 사용하는 것등도 본 발명의 범위내에 속한다. P-2를 함유하는 본 발명의 조성룰을 방제대상이 되는 특수한 나비목 근충이나 파리목근충 처리필 특정식물및 살충활성 화합물 사용량등과 같은여러인자들에 따라 살충유효량을 각기 달리해서 사용한다,
바람직한 살충제 제제형은 P-2 단독 또는 변환된 생물체와 더불어 소요의 담체를 가하여 혼합해서 제조한다. 이 제제형을 적당한 담체 보조제를 사용해서 분말, 기를(식물성기름 또는 광물성기름)현탁액 또는 물현탁액, 수화제 또는 농업분야에 적용하기에 적당한 기타 물질과의 혼합물로해서 투여한다. 적당한 담체는고체 또는 액체이거나 제제 가술분야에 통상적으로 사용되는 물질에 상응한것 예컨데 천연 또는 재생 무기울질, 용매, 분산제, 습윤제, 첨착제, 결합제 또는 비료등이다. 고체나 액체 보조제를 함유하는 제제는 공지방법, 예컨데 활성성분과 첨가제, 즉 용매, 고체담체, 및가지 경우에 있어서 표면활성 화합물(계면활성제)동과 함께 균질하게 혼합 및/또는 분쇄하여 제조한다.
적 당한 액체담체는 식물성기름(예·코코넛기름, 콩기름), 광유 또는 물이다. 분말과 분산성 분말용의 고체담체는 모통 천연 무기질(예 . 방해적, 활석, 고령토, 또는 에타펄자이드)섬유이다. 룰리적 성질을 개선하자면 고도로 분산된 규산 또는 고도로 분산된 흡수성 중합체를 첨가할 수도 있다. 적당한 과립상의 흡착성담체는 다공질형, 예컨데 경석(pumice), 벽돌부스러기, 세피일라이드(sep1olite) 또는 벤토나이트(bentonite) 이다. 적당한 비흉착성 담체는 실리케이트나 모래같은 물질이다, 더우기 다수의 예비과립화된물질이나 유기 또는 무기 혼합물 예컨데 특히 돌토마이트나 식물잔재(plant residue)분말 같은 것을 사용할수있다
제제에 첨가되는 활성 첨가성분의 특성에 따른 적당한 계면활성화합물은 유화성, 분산성 및 흡윤성이 양호한 비이온, 양이온 및/또는 음이온 계면활성제이다 "계면활성제"란 혼합물 또는 계면활성제를 함유한 것으로도 이해할 수 있다.
적당한 음이온 계면활성제는 수용성 비누와 수용성 합성 표면활성 화합물이다
적당한 비누는 고급 지방산(C1o-C11)의 알칼리금속염, 알칼리토금속염 또는 비치환 암모늄염인데 그 예로서는 코코넛오일 또는 탤로우오일에서 얻을 수 있는 천연 지방산 혼합물, 을레 또는 스테아르산등의 나트륨염이나 칼륨염이 있다 한층 더 안정한 계면활성제는 지방산 베틸타우린 염, 개질 인지질 및 비개질 인지질이다. 그러나 소위 합성 계면활성제 특히 지방 술포네이트, 지방술페이트, 술포화 벤즈이미다졸 유도체또는 알킬아릴술포네이트를 사용한다
지방 술포네이트 또는 지방 술페이트는 알칼리 금속영, 알칼리 토금속염 또는 비치환 암모늄염 형태의 것이 보통이고 일반적으로 C6-C22 알킬을 함유하는데 그 예로서는 도네실술페이트의 나트륨염 또는 칼슘염또는 지방산에서 얻는 지방알코올술페이트의 혼합물의 나트륨염 또는 칼슘염이 있다 이들 화합물은 지방알코올의 술폰산/에틸렌 옥사이드 첨가 생성물과 술폰산 에스테르의 염으로 되어 있다. 술포화 벤즈이미다졸 유도체에는 술폰산그룹 2개와 탄소원자수가 약 8-22인 지방산 라디칼 1개를 함유하는 것이 좋다. 암킬아릴술프네 이 트의 예로는 도데 실벤젠술폰산, 디 부틸나프탈렌술폰산 또는 나프탈렌술폰산/포름알데 히 드 축합반응 생성물의 나트륩, 칼슘 또는 트리에탄을아민영이다. 기타 적당한 것으로는 상응한 인산염이 있는데 즉p-노닐페놀과 에틸렌 옥사이드 4-14몰의 첨가반응 생성물의 인산 에스테르의 염이다.
비이온 계면활성제로 바람직한 것은 폴리글리클 에테르 유도체 또는 지방족 또는 시클토지방족 알고올 또는 포화 또는 뷸포화 지방산과 알킬페놀인데 위의 유도체에서는 글리클 에테르 그룹이 3-10개 함유되고(지방즉) 탄화수소 성분중에서 탄소원자수는 8-20개이고 알킬페놀의 알킬성분중에서 탄소원자수는 6-18개이다.
기타 적당한 비이온계면활성제는 폴리에틸렌 옥사이드와 알킬 프로필렌 글리콜, 에틸렌디아미노폴리프로필렌 글리클 또는 알킬폴리프로필렌 글리클과의 수용성 첨가생성물인데 알킬사슬의 탄소원자수는 1-10개이고 첨가반응 생성룰에는 에틸렌 글리콜에데르 그룹이 20-250개이며 프로필렌 글리클 에톄르 그룹은 10-100개 이 다.
비 이온 계면활성제의 대표척인 예는 노닐페놀폴러에톡시에탄을, 아주까리기름, 글러클 에테르, 폴리프로필렌/폴리에틸렌옥사이드첨가반응생성물, 트리부틸페녹시폴리에톡시에탄을, 에틸렌글리콜및옥틸페녹시폴리에톡시에탄을이다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르(예:폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리을레에이트)토 적당한 비이온계면활성제이다.
양이온 계면활성제는 질소원자쪽의 치환기로서 최소한 C8-C22 알킬라디칼 하나를 가지고 또다른 치환기로서 저급 비치환 또는 할로겐화 알킬벤질 또는 히드록실화 저급알킬라디칼을 가지는 4차 암모늄염이다. 이염은 할로겐화물, 메틸술페이트 또는 에틸술페이트등의 형태인 것이 바람직한데 그 예로서는 스톄아릴트리메틸암모늄 클로라이드가 있다.
12. 동감성 델타-균체내독소 단백질 동족성
컴퓨터 서어치를 실시하여 P-2 유전자가 결합서열이 공개된 기타 다른 유전자와 동족인가의 여부를 파악하였다·P-2 유전자와 기타 다른 유전자와의 사이에서 DNA 결합서열의 동족성을 발견할 수 없었다.
그러나 놀랍게도 P2 단백질과 P1 단백질사이에는 어느 정도의 아미노산 결합서열의 동족성이 발전되었다.제6도를 보면 P2 단백질과 P1 단백질은 약 100개의 아미노산의 결합에 대해 37%의 동족성의 영역을 함께하고 있음을 알 수 있다.
비동족성 단백질내에서 발견되는 보존된 아미노산의 결합서열은 가끔 단백질의 중요한 기능적인 영역을나타낸다. 제6도의 보존된 아미노산은 P1 단백질과 P2 단백질의 나비목 유충에 내한 살충활성의 원인이되는 "활성위치"를 구성하고 있다. 따라서 이러한 단백질은 아미노산 조성을 변화시켜 독성변화를 하게하는위치에 따른 특수한 돌연변이 유발실험에 사용된다.
아미노산 100개로된 결합의 중요성은 이들 아미노산을 인코우드 하는 DNA의 300bp 단편을 서브클로닝해서 확인한다. 이 방법에서는 B.t. B.메가테륨 또는 대장균에서 이러한 단백질을 생성하는 수만을 얻게된다. 서브콜로닝은 이러한 100개 아미노산 단백질에 대해 코우딩하는 DNA의 300-bp 단편과 인접한 제한위치를 만드는 위치에 특징적인 생체의 돌연변이 유발을 이용하면 된다. 이들 제한위치를 이용하여 DNA단편을 정확하게 절단한 다음 DNA 단편을 바실러스 또는 기타 적당한 벡터에 있는 촉진유젼자와 라보솜을결합하는 위치로부터 아래쪽에다 삽입한다. 바실러스 벡터는 유전학적으로 작용을 해서 P-2 유전자 자체의 촉진유전자와 리보솜을 결합하는 위치를 가지도록 한다. 여기서 생성되는 재조합 플라스미드를 변환시켜적망한 바실러스 균주(또는 기타 적망한 생물체)를 얻고 재조합 균주의 살유충 활성을 측정하였다. 변환된생물체는 이러한 단백질을 생성하는 수단으로 사용된다. 혼합물중의 변환된 생물체 또는 단백질 그 자체를살충제 조성물에 P2 독소단백질과 동일한 방식으로 사용한다.
재조합 플라스미드로부터 합성되는 100개 아미노산 폴리멥티드는 바실러스 세포내에 있는 단백분해 효소에 의해 분해된다 이러한 문제를 피하기 위해 바실러스외 단백분해효소 음성균주를 사용하여 발현시켰다(Wong, S., Kawamura, F., and Doi, r.1986 J. Bacterio1.168:1005-1009).
변환되거나 변환되지 않은 바실러스 메가테륨 및 대장균의 살충활성을 측정함에 있어서 곤충의 시험용 먹이(test diet)에 여러가지 양의 이들 미생물을 첨가해서 측정했다. 먹이를 주고나서 곤충의 사망율을 조사했다. 특히 이러한 방법에서는 고체 한천 배지에서 30℃서 2일간 미생물을 정지기까치 성장시키고 있다. 플라스미드를 수용하는 대장균에 있어서의 배지는 압피실린 40μg/ml을 함유하는 LB 있다. 플라스이드를 수용하는 B. 에가테룸 경우에 있어서의 배지는 톄트라사이클린 10μg/m1을 함유하는 DS였다. 고체배치로부터 미생물을 주걱으로 긁어 모아서 습윤중량을 측정하고 박테리아 세포를 탈염수중에서 공지의 농도가 되게 다시 현탁시켰다. 현탁된 박 테리아 세포를 계일회석시키고 각 회석물 200μI을 먹이컵에 있는 고체 한천배지의 인공먹이 3m1에다 국소적으로 가했다. 먹이의 상부 표면적은 600mm 였다. 헬러오티스(HeIiothis)의 경우에 있어서 먹이중에는 콩가루가 있었고 리만토리아 디스파르(Lymantria dispar)의 경우에는 먹이에밀눈이 함유되어 있었다. 제1형충의 유충 한마리를 각 먹이컵속에 넣고 치사율을 7일후에 조사하였다.
곤충 사망율에 대한 프로빗 분석(Probit analysis)으로부터 LC50 값(유충 50%을 죽이는데 소요원 박테리아 세포의 중량)을 계산 하였다(R.J. Daum., A Revision of Two Computer Programs for ProbitAnalysis. Bu1letin of the Entomological Soc. of America, Vol 16 (1), pp. 1-15) .
(실시예 1)
클로닝된 P-2 유전자의 대장균에서의 발현 생성물의 생물검정
각종 플라스미드를 수용하는 대장균이 첨가되어 있고 P-2 유전자가 존재하거나 하지 않는다는 것이 공지된 표준 먹이(diet)를 헬리오티스 비레셴스(Heliothis virescens) 유충에다 먹이고 7일 경과후 유충의 생장 및 생존율을 조사하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 이들 결과에서 명백히 알 수 있는 것은 실제로 클로닝된P-2 유전자는 홀씨를 형성않는 박테리아인 대장균에서 발현되고 이 클토닝된 유전자외 발현 생성물은 P-2 유전자가 없는 대장균 보다 헬리오티스 비례센스에 내한 독성을 변환된 대장균에 부여하고 있다는 점이다.
[표 1]
H. 비레센스 유충사망 또는
(실시예 2)
P-2 유전자의 바실러스 메가테륨으로의 변환
대장균 같은 그람 음성 균주에서만이 플라스미드 pEG201(P-2 유전자 함유)가 복제된다. pEG201을 약간 정도만을 함물하는 (생뭍검정 데이터, 표 1 참조) 대장균 균주 함유하는(생물검정 데이터, 표 1 참조)대장균 균주 EG1304에서 P-2 유전자를 발현시켰다 본 실시예의 목적은 클로닝된P-2 유전자가 기타 바실러스 균주에서 큰정도로 발현되는가의 여부를 확인하는 것이다, 클로닝된 P-2 유전자의 바실러스 균주에서의 발현시험을 하자면 우선 P-2 유전자를 함유하고 바실러스에서 복제가능한 재조합 플라스미드를 구성할 필요가 있다 따라서 P-2 유전자를 함유한 바실러스-내장균 "셔틀벡터(shuttle vector)를 구성하였다. "셔틀벡터"란 플라스미드가 바실러스와 대장균 양쪽에다 복제가 가능한 것을 뜻하는 말이다. Sphi을 사용하여 바실러스 플라스미드 pBC16(테트라사이클린 내성)을 소화시키고 소화된 플라스미드를 pEG201의 Sphi위치속에다 결찰시킨 다음 대장균을 변환시켜 암피실린과 데트라사이클린 내성으로 만드는 방식에 따라 대장균-바실러스 셔틀벡터를 구성했다.
테트라사이클린과 암피실린 내성의 대장균 변환체 하나에는 pEG201의 Sphi위치속에 삽입된 pBC16로된플라스미드(pEG204)를 가지고 있었다(제 1도). 제 1도는 플라스미드 pEG204의 제한도이다. 상자로로 부분은 플라스미드 벡터 DNA이고 개방된 상자부분은 pBR322 DNA(내장균 복제)이며 사선을 그은 상자부분은pBC16 DNA(바실러스복제)이다. 수평선은 균주 HD263-1의 클로닝된 DNA이다. 큰 화살표는 P-2 유전자의 코우딩영역이다. pEG204는 변형되어 바실러스 베가데륨(ATCC 기탁번호 VT 1660)로 되었고pEG204(지정균주 EG1312)를 수용하는 테트라사이클린 내성의 변환체 하나를 선택하여 다시 더 연구를 하였다.
본 실시예는 클토닝된 P-2 유전자가 재조합 B. 메가테륩 균주 EG1312(pEG204)에서 발현되는가를 알아보기 위한 것이다. NaDodeSO4/폴리아크릴아미드겔 천기이동법으로 유전자 발현을 측정하였다· 일반적으로 이 방법에는 세포용해물 제조 세포 용해물의 NaDodeSO4/폴러아크릴아미드겔을 동과시키는 전기이동치리 및 단백질을 가시화 하기 위한 겔의 염색등이 포함되었다.
특히 이 방법은 다음과 같이 실시하였다:테토라사이클린 10μg/mI을 함유하는 DS 클레이토에서 30℃에서 48시간동안 B. 메가 테륨세포를 생장시켰다. DS 플레이트에 테토라사이클린을 가하지 않고 B. 메가데륨과 유사하게 B. 튜린지엔시스 균주를 생장 시켰다. 생장시키고 나서는 거의 모든 세포는 생장 정지기로 들어갔다, 주걱으로 세포를 긁어모아 탈염수중에 다시 현탁시켰다. 세포현탁물층일부를 겔이 첨가된 예열(70℃) 완충액(5% 베타메르캅토에탄올,2% NaDodeSO4,60mM 트리스 pH 6,8,10% 글러세롤)과 1:2vol:vol 혼합하고 70℃에서 7분간 항온처리하였다. 현탁액을 간단히 원심분리하고나서 상청액을 즉시NaDodeSO4/폴리아크릴아미드 겔에다 가하고 상청액중에 있는 단백질을 Laemmli의 방법[J.of Mol.Bio.,80:576-599(1973)]에 따라 겔 전기이동처리하여 분할하였다. 쿠우마씨 염료로 겔을 염색함으로써겔중의 단백질을 알아 볼수 있게 하였다.
제5도는 이러한 분석의 결과 인데 앞서처럼 제조원 NaDodeSO4/클리아크릴아미드 겔의 사진이다. 제5도에서 STND로 표지된 것에는 단백질 분자량 기준물이 들어있다· 겔의 오른쪽에 있는 숫자는 단백질의크기(KDa:Kilodalton)이다. HD1-1로 나타낸 레인(lane)에는 B.t. 균주의 추출물이 있다, P-2 단백질에 상응하는 주요 단백질을 화살표로 나타낸 부분이다. P2로 나타낸 레인에는 정제된 P-2 단백질의 일부가 들어 있다. P2 단백질을 위에서와 같이 정제하였다.
제5도에서 EG1311 및 EG1312로 나타낸 각 레인에는 pBC16 및 pEG204(P2)를 각각 수용하는 이들 B.에가테륨 균주의 추출물이 들어있다. 레인 EG1311과 레인 EG1312를 비교해 보면 균주 EG1312(pEG204)의추출물에는 P-2 단백질의 것에 상응한 크기의주요단백질을 함유하고 있었다는 것을 알 수 있다. 이 단백질은 균주 EG1311(pBC16)의 추출물에는 존재하지 않았다. 이것을 보면 클로닝된 P-2 유전자를 수용하는 B. 메가데륨은 P-2 단백질을 큰정도로 합성하였음을 알 수 있다. 더우기 광현미강으로 관찰할 경우 균주 EG1312의 세포에는 결정독소에 특징적인 위상에 밝은 단백질 봉입체(inclusion body)를 함유하고 있었다.
(실시예 3)
클로닝된 P-2 유전자의 B. 메가테륨에서의 발현 생성물의 생물검정
표준 독성 시험을 실시한 결과 알수 있었든 것은 헬리오티스 비레센스(H.v.) 또는 리만토리아 디스파르(L.D.) 유충에게 먹었을 경우 균주 바실러스 메가데륨 EG1312는 곤충 먹이컵당 박테리아세포 1.4μg에 대해 LD50(유충사망 50%)을 나타냈다는 점이다.
이에 대하여 P-2 유전자가 없는 플라스미드 벡터 pBX16을 수용하는 바실러스 에가테륨의 대조용 균주는 먹이컵당 박데리아 세포 10μg의 용량에서 H.v. 나 L.d.를 죽이지 못하였다.
B. 메가테륨 균주 EG1312(pEG204-P2)를 A. 에집티에 내한 독성시험에 사용하였다. 테토라사이클린10/'g/m1을 함유하는 고체 DS 배지에서 301C에서 48시간 균주 EG1311(pBC16-음성 대도물) 및 EG1312을생장시켜 세포현탁물을 만들었다. 주걱으로 세포를 긁어모으고 탈염수중에 다시 현탁시켰다. 세포현탁액의계열희석물을 만들었다. 세포현탁액 100m1 중에 A. 에집티 유출 20마리(제3 또는 제4영충(instar)]를 넣고 48시간 후에 사망율을 조사하였다. 아래표 2에서 그 결과를 보면 균주 EG1312(P2)는 모기 유충에 독성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 이에 대하여 벡타 플라스미드 pBC168균주 EG1311)만을 함유하는 B.메카테륨은 모기유충에 대해서는 독성이 없었다.
[표 2]
미생물 기탁
여러가지 종류의 홀씨형성 미생물 및 홀씨형성 않는 미생물을 P-2를 사용하여 변환시키는 것은 본 발명의 범위내에 속한다 여기 나온 바에 따라 이용되는 미생물의 예로서는 바실러스, 에스테리치아 및 시아노박테리아등의 속에 속하는 것들이 있다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 생물체는 바실러스 에가테륨과대장균이다. 더우기 다음에 나오는 바실러스 튜린지엔시스, 바실러스 메가테륨 및 대장균등의 균주들은 본발명에서도 바람직하게 사용되며 목록에 나온 플라스미드를 가지고 있는데 이들 균주는 AgriculturalResearch Culture Co1lectlon(NRRL)(Peoria,IL)에 기탁되어 있는데 다음과 같은 가입번호를 부여 받았다
Claims (6)
- 제2도의 아미노산 서열로된 단백질을 코드하는 DNA를 가지는 것을 특징으로 하는 바실러스 튜린지엔시스 P-2 독소의 유전자.
- 이 유전자가 제2도의 DNA 결합서열인 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제1항에 있어서, 단백질이 나무목 곤충과 파리목곤충에 내하여 살충활성을 가진 유전자.
- 바실러스, 대장균 및 시아노벡티리아중에서 선택되는 제1항에 따른 DNA 결합서열을 가지는 미생물.
- NRRL에 기탁되어 있고 가입번호 B-18024인 것을 특징으로 하는 대장균(Escherichia c이i) 박테리아.
- NRRL에 기록되어 있고 가입번호 B-18203인 것을 특징으로 하는 바실러스 메가테륨박테리아.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3954287A | 1987-04-16 | 1987-04-16 | |
| US039,542 | 1987-04-16 | ||
| US039542 | 1987-04-16 | ||
| PCT/US1988/001132 WO1988008034A1 (en) | 1987-04-16 | 1988-04-07 | Bacillus thuringiensis p-2 toxin gene, protein and related insecticide compositions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR890700677A KR890700677A (ko) | 1989-04-26 |
| KR960006582B1 true KR960006582B1 (ko) | 1996-05-20 |
Family
ID=21906033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019880701674A KR960006582B1 (ko) | 1987-04-16 | 1988-04-07 | 바실러스 튜린지엔시스 p-2 독소유전자와 이를 포함하는 미생물 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0367767B1 (ko) |
| JP (1) | JPH0636743B2 (ko) |
| KR (1) | KR960006582B1 (ko) |
| AT (1) | ATE150089T1 (ko) |
| AU (1) | AU618532B2 (ko) |
| CA (1) | CA1340600C (ko) |
| DE (1) | DE3855827T2 (ko) |
| DK (1) | DK513689A (ko) |
| ES (1) | ES2009599A6 (ko) |
| FI (1) | FI894856A0 (ko) |
| GR (1) | GR1000679B (ko) |
| IL (1) | IL86065A (ko) |
| SG (1) | SG43288A1 (ko) |
| WO (1) | WO1988008034A1 (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR8900881A (pt) * | 1988-02-25 | 1989-10-17 | Sandoz Ag | Processos para a producao de uma proteina endotoxina toxica a insetos e composicao inseticida |
| TW261517B (ko) * | 1991-11-29 | 1995-11-01 | Mitsubishi Shozi Kk | |
| AU7102494A (en) * | 1993-06-10 | 1995-01-03 | Ecogen Inc. | (bacillus thuringiensis) strains capable of producing large amonts of insecticidal crystal proteins |
| US6107278A (en) | 1997-03-13 | 2000-08-22 | Mycogen Corporation | Polynucleotide encoding lepidopteran active toxin PS86I2 derived from Bacillus thuringiensis and methods of using PS86I2 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1982003872A1 (en) * | 1981-04-27 | 1982-11-11 | Washington Univ | B.thuringiensis crystal protein in e.coli |
| US4467036A (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-21 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli |
| US4695455A (en) * | 1985-01-22 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes |
| US5080897A (en) * | 1987-05-08 | 1992-01-14 | Ecogen Inc. | Novel bacillus thuringiensis strains, and related insecticidal compositions |
-
1988
- 1988-04-07 JP JP50375988A patent/JPH0636743B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-07 WO PCT/US1988/001132 patent/WO1988008034A1/en active IP Right Grant
- 1988-04-07 AU AU16817/88A patent/AU618532B2/en not_active Ceased
- 1988-04-07 AT AT88904064T patent/ATE150089T1/de active
- 1988-04-07 SG SG1996007249A patent/SG43288A1/en unknown
- 1988-04-07 DE DE3855827T patent/DE3855827T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-07 EP EP88904064A patent/EP0367767B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-07 KR KR1019880701674A patent/KR960006582B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-04-12 CA CA000563900A patent/CA1340600C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-14 IL IL8606588A patent/IL86065A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 GR GR880100247A patent/GR1000679B/el unknown
- 1988-04-15 ES ES8801170A patent/ES2009599A6/es not_active Expired
-
1989
- 1989-10-13 FI FI894856A patent/FI894856A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-10-16 DK DK513689A patent/DK513689A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0367767B1 (en) | 1997-03-12 |
| IL86065A (en) | 1994-10-07 |
| AU618532B2 (en) | 1992-01-02 |
| AU1681788A (en) | 1988-11-04 |
| DE3855827D1 (de) | 1997-04-17 |
| EP0367767A4 (en) | 1990-05-14 |
| WO1988008034A1 (en) | 1988-10-20 |
| DE3855827T2 (de) | 1997-11-27 |
| CA1340600C (en) | 1999-06-22 |
| KR890700677A (ko) | 1989-04-26 |
| GR1000679B (el) | 1992-10-08 |
| ES2009599A6 (es) | 1989-10-01 |
| JPH0636743B2 (ja) | 1994-05-18 |
| SG43288A1 (en) | 1997-10-17 |
| JPH02500716A (ja) | 1990-03-15 |
| EP0367767A1 (en) | 1990-05-16 |
| DK513689A (da) | 1989-12-14 |
| GR880100247A (en) | 1989-01-31 |
| ATE150089T1 (de) | 1997-03-15 |
| FI894856A0 (fi) | 1989-10-13 |
| DK513689D0 (da) | 1989-10-16 |
| IL86065A0 (en) | 1988-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5024837A (en) | Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use | |
| US5338544A (en) | CryIIB protein, insecticidal compositions and methods of use thereof | |
| EP0522036B1 (en) | BACILLUS THURINGIENSIS cryIIIC GENE AND PROTEIN TOXIC TO COLEOPTERAN INSECTS. | |
| DE60224410T2 (de) | Modifizierte cry3a toxine und die dafür kodierende nukleinsäuren | |
| US5196342A (en) | Bacillus thuringiensis P-2 toxin gene | |
| Asano et al. | A strain of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae containing a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea (Coleoptera: Scarabaeidae) | |
| EP0366668B1 (en) | Novel bacillus thuringiensis strains, method for their isolation and related insecticidal compositions | |
| JP4338057B2 (ja) | 殺虫剤 | |
| CA2117270A1 (en) | Use of bacillus thuringiensis isolates for controlling pests in the family aphididae | |
| US5073632A (en) | CryIIB crystal protein gene from Bacillus thuringiensis | |
| Lazarte et al. | Molecular characterization of a Bacillus thuringiensis strain from Argentina, toxic against Lepidoptera and Coleoptera, based on its whole-genome and Cry protein analysis | |
| JPH07501323A (ja) | 新規な鞘翅類活性バシラスチューリンゲンシス単離体及び鞘翅類活性毒素をコードする遺伝子 | |
| KR960006582B1 (ko) | 바실러스 튜린지엔시스 p-2 독소유전자와 이를 포함하는 미생물 | |
| Samuel et al. | Isolation, identification and evaluation of mosquito entomopathogenic Bacillus species and related genera from randomly selected sites in Kenya | |
| Choi et al. | Isolation and characterization of a strain of Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni PG-14 encoding δ-endotoxin Cry1Ac | |
| JPH10502347A (ja) | ゴキブリに対して有効なバチルス・チューリンギエンシス菌株 | |
| EP0408603A1 (en) | Bacillus thuringiensis var. israelensis cryd toxin gene, protein and related insecticide compositions | |
| KR20000057484A (ko) | 바실루스속 세균 및 살충성 단백질 | |
| EP0238441B1 (de) | Insektizid wirksame proteinartige Substanz | |
| AU617110C (en) | Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use | |
| Shishir | Characterization of cry genes and insecticidal proteins from indigenous bacillus thuringiensis to develop potential biopesticide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| G160 | Decision to publish patent application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20020514 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |