DE69011232T2 - Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein. - Google Patents

Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein.

Info

Publication number
DE69011232T2
DE69011232T2 DE69011232T DE69011232T DE69011232T2 DE 69011232 T2 DE69011232 T2 DE 69011232T2 DE 69011232 T DE69011232 T DE 69011232T DE 69011232 T DE69011232 T DE 69011232T DE 69011232 T2 DE69011232 T2 DE 69011232T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
gene
genes
plant
icp
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69011232T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69011232D1 (de
Inventor
Johan B-9721 Zevergem - De Pinte Botterman
Henk B-9880 Aalter Joos
Herman B-3200 Leuven Van Mellaert
Jeroen B-9900 Eeklo Van Rie
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience NV
Original Assignee
Plant Genetic Systems NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8202955&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69011232(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Plant Genetic Systems NV filed Critical Plant Genetic Systems NV
Publication of DE69011232D1 publication Critical patent/DE69011232D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69011232T2 publication Critical patent/DE69011232T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/12—Asteraceae or Compositae [Aster or Sunflower family], e.g. daisy, pyrethrum, artichoke, lettuce, sunflower, wormwood or tarragon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/38—Solanaceae [Potato family], e.g. nightshade, tomato, tobacco or chilli pepper
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Thermistors And Varistors (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Diese Erfindung beschäftigt sich mit Pflanzenzellen und Pflanzen, deren Genom verändert ist, um wenigstens zwei Gene, von denen jedes ein anderes, ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenes Bacillus turingiensis ("B. turingiensis" oder "Bt") insecticidal crystal protein ("ICP") für eine spezifische Zielinsektenspezies verschlüsselt, die bevorzugt zu den Arten Lepidoptera oder Coleoptera gehört, aufzunehmen. So veränderte Pflanzen haben Vorteile gegenüber Pflanzen, die mit nur einen B. Thuringiensis ICP-Gen verändert sind, besonders im Hinblick auf das Verhindern von Resistenzentwicklung in der Zielinsektenspezies gegen die wenigstens zwei in diesen Pflanzen enthaltenen B. thuringiensis ICP's.
  • Diese Erfindung beschäftigt sich auch init einem Verfahren zur Erzeugung derartiger transgener Pflanzen, wobei die wechselseitigen und nicht wechselseitigen Einflüsse der Bindung der wenigstens zwei B. thuringiensis ICP's in dem Erbgut der Zielinsektenspezies berücksichtigt werden. Die gleichzeitige Entfaltung dieser wenigstens zwei Gene in den Pflanzen, wobei jedes Gen ein anderes, ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenes B. thuringiensis ICP-Gen verschlüsselt, ist besonders nützlich, um die Resistenzentwicklung von Insekten gegen die wenigstens zwei in den Pflanzen enthaltenen B. thuringiensis ICP's zu verhindern oder zu verlangsamen.
  • Diese Erfindung beschäftigt sich auch mit einem verfahren zur Konstruktion neuer Bakterienüberträger oder Vektoren zur Veränderung von Pflanzen und mit den neuen Bakterienüberträgern zur Veränderung von Pflanzen selbst, die die wenigstens zwei B. thuringiensis ICP-Gene enthalten, die ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene B. thuringiensis ICP-Gene verschlüsseln. Diese Bakterienüberträger erlauben die Miteinbeziehung und kontrollierte Entfaltung der wenigstens zwei B. thuringiensis ICP-Gene in Pflanzen.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Seit der Entwicklung und dem umfassenden Einsatz chemischer Insektizide war das Auftreten resistenter Insektenstämme ein wesentliches Problem. Die Entwicklung der Resistenz von Insekten ist ein Phänomen, das von biochemischen, physiologischen, genetischen und ökologischen Mechanismen abhängt. Zur Zeit ist die Resistenz von Insekten gegen alle Hauptklassen von chemischen Insektiziden, die chlorierte Hydocarbone, Organophosphate, Carbamate und Pyrethoide enthalten, bekannt (Brattsten et al., 1986)
  • Im Gegensatz zur schnellen Resistenzentwicklung von Insekten gegen synthetische Insektizide erfolgte nur eine langsame Resistenzentwicklung gegen bakterielle Insektizide wie B. thuringiensis-Sprays trotz langjährigen Einsatzes (Brattsten et al., 1986). Das sporenbildende gramm-positive Bakterium B. thuringiensis erzeugt einen sporenähnlichen Kristall, der aus crystal proteinen (ICP's) besteht, die eine insektizide Wirkung aufweisen. Wichtige Faktoren, die die Wahrscheinlichkeit des Auftretens resistenter Insektenstämme im Feldversuch gegen B. thuringiensis-Sprays verringern, sind: zuerst die kurze Halbwertszeit von B. thuringiensis-Sprays nach dem Auftragen auf die Blätter: zum zweiten die Tatsache, daß im Handel erhältliche B. thuringiensis-Sprays häufig aus einer Mischung von verschiedenen insektiziden Bestandteilen zusammengesetzt sind, wobei Sporen, ICP's und zuletzt Beta-Exotoxine enthalten sind (Shields, 1987); und drittens die vorübergehende Natur von Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Schädling. Viele erfolgreiche Feldversuche haben gezeigt, daß handelsübliche Zubereitungen von einem B. thuringiensis mit seinem Sporen- Kristall-Komplex das Auftreten von Lepidoptera-Schädlingen in Ackerbau und Forstwirtschaft wirksam unter Kontrolle bringen (Krieg und Langenbruch, 1981). B. thuringiensis ist zur Zeit das am weitesten verbreitete Pathogen zur Mikroben-Eindämmung von Insektenplagen.
  • Verschiedene Laborstudien, bei denen die Selektion gegen B. thuringiensis über mehrere Generationen von Insekten durchgeführt wurde, haben bestätigt, daß Resistenz gegen B. thuringiensis nur selten auftritt. Trotzdem soll betont werden, daß die Laborbedingungen eher Bedingungen für niedrigen Selektionsdruck aufweisen.
  • Goldman et al. (1986) haben z.B. eine Selektion mit B. thuringiensis israelensis über 14 Generationen von Aedes aegyptii durchgeführt und nur eine marginale Abnahme der Empfindlichkeit festgestellt. Das Fehlen jedes beobachtbaren Trends in den ausgewählten Stämmen kann eine Folge des geringen Selektionsdrucks (LC50) sein, der über eine begrenzte Anzahl von Generationen angewendet wurde. Es soll jedoch darauf hingewiesen werden, daß Georghiou et al. (in: "Insecticide Resistance in Mosquitoes: Research on new chemicals and techniques for management", Mosquito Control Research, Annual Report 1983, University of California) mit Culex guiguefasciatus eine elffache Erhöhung der Resistenz gegenüber B. thuringiensis israelensis nach 32 Generationen mit einem Selektionsdruck von LC95 festgestellt haben.
  • McGaughey (1985) hat berichtet, daß Plodia interpunctella, ein Schädling für gelagertes Korn, Resistenz gegen den Sporen- Kristall-Komplex von B. thuringiensis entwickelt hat; nach 15 Monaten Selektion mit der indischen Mehlmotte wurde bei Plodia intertunctella von einer 100-fache Zunahme der Resistenz bei Verwendung eines üblichen B. thuringiensis HD-1 Präparats ("Dipel", Appot Laboratories, North Chicago, Illinois 60064, USA) berichtet. Jede der untersuchten Kulturen wurde über mehrere Generationen mit einer Diät von konstanter B. thuringiensis-Dosis behandelt, die eine Sterblichkeit von 70 - 90% im Larvenstadium hervorrufen sollte. Unter diesen hohen Bedingungen für den Selektionsdruck nahm die Resistenz der Insekten schnell zu. Vor kürzerer Zeit wurde die Entwicklung von Resistenz gegen B. thuringiensis auch für die Mandelmotte, Cadra cautella (McGaughey und Beeman, 1988) gemeldet. Die Resistenz war stabil, wenn die Selektion unterbrochen wurde und wurde als rezessive Information vererbt (McGaughey und Beeman, 1988). Der Mechanismus der Resistenzentwicklung der Insekten Plodia interpunctella und Cadra cautella wurde nicht aufgeklärt.
  • Der Hauptgrund für die Resistenzentwicklung gegen B. thuringiensis in beiden berichteten Fällen, wobei es um Kornlagerung ging, waren die während der Kornlagerung vorliegenden Umweltbedingungen. Der Abbau von B. thuringiensis erfolgte wegen der stabilen Umweltbedingungen in beiden Fällen langsam und erlaubte es nachfolgenden Generationen von schädlingen in der ständigen Gegenwart des eines Mikroben- Insektizids zu brüten. Die Geschwindigkeit, in der Plodia Resistenz gegen B. thuringiensis in einer Studie entwickelte, legt nahe, daß Plodia hierzu in nur einer Lagersaison in den Kammern von behandelten Korn in der Lage war.
  • Obwohl die Entwicklung von Insektenresistenz gegen B. thuringiensis überwiegend in Laboratorien und Pilotstudien betrachtet worden ist, ist vor ganz kurzer Zeit über B. thuringiensis-Resistenzen in Plutella xylostella - Populationen in (Kohl-) Feldern berichtet worden (Kirsch und Schmutterer, 1988). Eine Anzahl von Faktoren hat zu einem kontinuierlichen Aussetzen von P. xylostella unter B. thuringiensis in einem ziemlich kleinen geographischen Bereich geführt. Dies und die kurze Generationenfolge von P. xylostella haben zu einem enormen Selektionsdruck geführt, der zu einer verminderten Empfindlichkeit und erhöhten Resistenz gegenüber B. thuringiensis geführt hat.
  • Ein Verfahren zur Ausbildung eines B. thuringiensis-Gens in Pflanzen, um diese resistent gegen Insekten zu machen (EP 0 193 259, Vaeck et al., 1987; Barton et al., 1987; Fischhoff et al., 1987), stellt einen völlig neuen Ansatz zur Insektenkontrolle im Ackerbau dar, der zur gleichen Zeit sicher, umweltschonend und kosteneffektiv ist. Ein wichtiger Einflußfaktor für den Erfolg dieses Ansatzes wird sein, ob die Insekten fähig sein werden, eine Resistenz gegen B. thuringiensis ICP's, die in transgenen Pflanzen ausgedrückt sind, entwicklen werden können (Vaeck et al., 1987; Barton et al., 1987; Fischhoff et al., 1987). Im Gegensatz zum Auftragen auf Blätter, nach dem B. thuringiensis ICP's schnell abgebaut werden, werden die transgenen Pflanzen einen kontinuierlichen Selektionsdruck ausüben. Aus den im Labor durchgeführten Selektionsexperimenten ist klar, daß ein kontinuierlicher Selektionsdruck zur Anpassung verschiedener Insektenspezies an B. thuringiensis und seine Bestandteile geführt hat. In diesem Zusammenhang sollte darauf hingewiesen werden, daß die Laborbedingungen, die zur Resistenzentwicklung von Insekten gegen B. thuringiensis geführt haben, der Situation bei transgenen Pflanzen sehr ähnlich sind, die B. thuringiensis ICP's erzeugen und einen kontinuierlichen selektionsdruck auf Insektenpopulationen ausüben, die sich von der Pflanze ernähren. Mathematische Modelle des Selektionsdrucks sagen voraus, daß, wenn insektenresistente Pflanzen zu einem dauerhaften Bestandteil der Umgebung von Insekten werden, deren Resistenzentwicklung schnell fortschreiten wird (Gould, 1988). So können die Aussichten für eine Resistenzentwicklung von Insekten gegen B. thuringiensis in transgenen Pflanzen beträchtlich gegenüber der Anwendung von B. thuringiensis-Sprays im Feldversuch erhöht sein. Es wurde von einem Heliothis virescens Stamm berichtet, der 20-fache Resistenz gegen B. thuringiensis HD-1 ICP, erzeugt von transgener Pseudomonas fluorescens, und 6-fache Resistenz gegenüber dem reinen ICP aufweist (Stone et al., 1989). Darüber hianus sind die finanziellen und menschlichen Kosten der Resistenz schwer zu ermitteln, aber ein Verlust der Wirksamkeit von insektiziden führt in jedem Fall zu erhöhten Anwendungsfrequenzen und Dosierungen und letztendlich zu teureren Ersatzstoffen, da es schwieriger wird, neue pestizide zu entdecken und zu entwicklen.
  • Es wäre daher wünschenswert, Mittel zum Verlangsamen oder Verhindern der Entwicklung von Resistenz gegen B. thuringiensis zu entwicklen. B. thuringiensis Stämme, die aktiv gegen Lepidoptera (Dulmage et al., 1981), Diptera (Goldberg und Margalit, 1977) und Coleoptera (Krieg et al., 1983) wirken, sind beschrieben worden. Es ist klar geworden, daß es wesentliche Unterschiede zwischen den ICP's verschiedener Stade gibt, die gegen Lepidoptera wirken, genau wie bei gegen Coleoptera wirkenden ICP's (Höfte und whiteley, 1989). Ein Überblick über die verschiedenen B. thuringiensis ICP-Gene, die charakterisiert worden sind, wird in Tabelle 2 gegeben (Nach den aufgeführten Beispielen).
  • Die meisten der anti-Lepidoptera B. thuringiensis (z.B. Bt3, Bt2, Bt73, Bt14, Bt15, Bt4, Bt18) ICP-Gene verschlüseln 130 - 140 kDa Protoxine, die sich in der alkalischen Umgebung des Erbguts eines Insekts auflösen und proteolytisch zu einem wirksamen Toxin von 60 - 65 kDa aktiviert werde. Diese ICP's sind verwandt und können aufgrund von übereinstimmenden Sequenzen als Mitglieder derselben Familie erkannt werden. Die Unterschiede in den Sequenzen sind dennoch beträchtlich, und das insektentötende Spektrum in der Spezies Lepidoptera kann wesentlich unterschiedlich sein (Höfte et al., 1988).
  • Das P2 Toxin-Gen und das Übertragungsgen B2 unterscheiden sich von den oben angeführten Genen dadurch, daß sie keine Protoxine mit hohem Molekülgewicht verschlüsseln, sondern vielmehr Toxine im Bereich von 70 kDa (Donovan et al., 1988, bzw. Widner und Whiteley, 1989).
  • Vor kurzer Zeit ist klar geworden, daß Unterschiede auch in der anti-Coleoptera Toxin-Genfamilie bestehen. Während verschiedene vorher bekannte Toxin Gensequenzen von unterschiedlichen B. thuringiensis Isolaten mit anti-Coleoptera Aktivität identisch waren (EP 0 149 162 und EP 0 202 739), sind die Sequenz und die Struktur von bt21 und bt22 wesentlich voneinander verschieden (EP-Anmeldung 89 400 428.2).
  • Obwohl die insektiziden Wirkungsbereiche von B. thuringiensis ICP's unterschiedlich sind, wird angenommen, daß der Hauptweg ihrer Toxizität derselbe ist. Alle B. thuringiensis ICP'S, deren Wirkungsweise detailliert untersucht worden ist, gegen eine Wechselwirkung mit dem Epithel-Erbgut von empfindlichen Spezien ein und führen zu einer Lysis der Epithel-Zellen (Knowles und Ellas, 1986) aufgrund der Tatsache, daß die Permeabilitätsfaktoren der Borstengrenzmembran und das osmotische Gleichgewicht an dieser Membran gestört werden.Der Hauptweg der toxischen Wirkung, die Bindung des Toxins an die Rezeptoren der Borstengrenzenmembran dieser Zellen, ist ein wichtiges Merkmal (Hofmann et al., 1988b). Die Bindungsstellen des Toxins im Erbgut können als ICP-Rezeptor betrachtet werden, da das Toxin auf gesättigte Weise und mit hoher Affinität gebunden wird (Hofmann et al., 1988a).
  • Obwohl dieser Umriss der Wirkung von B. thuringiensis ICP's im allgemeinen akzeptiert ist, bleibt die Frage, was die wesentliche(n) Ursache(n) für die unterschiede im insektiziden Wirkungsbereich ist oder sind. Haider et al. (1986) betonen die Wichtigkeit von bestimmten Proteasen im Erbgut der Insekten. Hofmann et al. (1988b) deuten an, daß die Rezeptorbindung eine Vorstufe der toxischen Wirkung ist und beschreiben, daß Pieris brassicae zwei unterschiedliche Rezeptortypen für zwei Toxine aufweist. Andere Autoren haben vorgeschlagen, daß Unterschiede in der Umgebung des Erbguts (z.B. der pH-wert des Erbguts) ausschlaggebend sein können.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • In Übereinstimmung mit dieser Erfindung wird ein Pflanze bereitgestellt, die, stabil in ihr Genom eingesetzt, wenigstens zwei B. thuringiensis ICP-Gene aufweist, die zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebunden insektizide B. thuringiensis ICP's verschlüsseln, bevorzugt deren aktive Toxine, und zwar gegen eine bestimmte Zielinsektenpezies, besonders gegen Lepidoptera oder Coleoptera. Eine derartige Pflanze ist gekennzeichnet durch die gleichzeitige Ausbildung von wenigstens zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene B. thuringiensis ICP's.
  • In weiterer Übereinstimmung mit der Erfindung werden wenigstens zwei ICP-Gene, besonders zwei Gene oder Teile davon, die zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene anti-Lepidoptera oder anti.Coleoptera B. thuringiensis ICP's verschlüsseln, in einen Bakterienüberträger zur Ausbildung in Pflanzen geklont. Mit diesem Bakterienüberträger veränderte Pflanzenzellen sind gekennzeichnet durch die gleichzeitige Ausbildung der wenigstens zwei B. thuringiensis ICP-Gene. Die entstandene veränderte Pflanzenzelle kann benutzt werden, um eine veränderte Pflanze zu erzeugen, in der die Pflanzenzellen 1. die wenigstens zwei stabil in das Genom der Pflanze eingebundene B. thuringiensis ICP-Gene oder Teile davon enthalten, die wenigstens zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene anti-Lepidoptera oder anti- Coleoptera B. thuringiensis ICP's verschlüseln, und 2. die Gene gleichzeitig ausbilden, wodurch auf die Pflanze eine erhöhte Resistenz gegen wenigstens eine Zielinsektenspezies übertragen wird, um auf diese Weise die Entwicklung von Resistenz gegenüber B. thuringiensis der wenigstens eine Zielinsektenspezies, die sich von der veränderten Pflanze ernährt, zu verlangsamen oder zu verhindern.
  • Weiter in Übereinstimmung mit der Erfindung werden Bakterienüberträger oder Vektoren zur Ausbildung von Pflanzen bereitgestellt, die das Einfügen und die gleichzeitige Ausbildung von wenigstens zwei B. thuringiensis ICP-Genen in einer Pflanzenzelle erlauben und die eines oder mehrere Chimären-Gene umfassen,von denen jedes in derselben Transcriptase-Einheit aufweist:
  • einen Promoter, der in der Pflanzenzelle tätig wird, um die Synthese von mRNA, verschlüsselt durch eines der ICP-Gene, zu steuern;
  • eines oder mehrere verschiedene ICP-Gene, von denen jedes ein ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenes B. thuringiensis ICP verschlüsselt;
  • bevorzugt ein Markierungsgen;
  • eine 3' nichtübersetzte DNA-Sequenz, die in der Pflanzenzelle tätig wird zur Ausbildung von 3'-Enden und dem Hinzufügen von polyadenyliten Nucleotiden zu dem 3'-Ende der mRNA; und eventuell eine DNA-Sequenz, die ein proteaseempfindliches Protein zwischen zwei beliebigen ICP-Genen verschlüsselt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung Definitionen
  • Ein "B. thuringiensis ICP" oder "ICP" wie es hier benutzt wird, sollte als intaktes Protein oder ein Teil davon verstanden werden, das insektizide Wirkung hat und in der Natur von B. thuringiensis erzeugt werden kann. Ein ICP kann sowohl ein Protoxin als auch ein aktives Toxin oder ein ein anderer insektizider, abgeschnittener Teil eines Protoxins sein, der nicht kristallin oder ein natürlich vorkommendes Protein sein muß. Unter diesem Gesichtspunkt kann ein ICP ein Chimären-Toxin sein, das durch die Kombination zweier unterschiedlicher Bereiche von zwei verschiedenen ICP-Genen verschlüsselt wird, wie in der EP 0 228 838 offenbart.
  • Unter einem "Protoxin" wird ein erstes Übersetzungsprodukt eines vollständigen Gens verstanden, das ein ICP verschlüsselt.
  • Unter einem "Toxin", "toxischen Kern" oder einem "aktiven Toxin" wird ein Teil eines Protoxins verstanden, der durch Proteaseentschlüsselung (z.B. mit Trypsin) erhalten werden kann und insektizide Wirkung aufweist.
  • Unter einem "Gen" wird eine vollständige DNA-Sequenz verstanden, die ein Protein verschlüsselt, und auch ein abgeschnittenes Fragment davon, das wenigstens den aktiven Teil (z.B. das Toxin) des Proteins verschlüsselt, das von der vollständigen DNA-Sequenz verschlüsselt wird, insbesondere, ein Fragment, das nur den aktiven Teil des von der vollständigen DNA-Sequenz verschlüsselten Proteins verschlüsselt. Ein Gen kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein.
  • Unter einem "abgeschnittenen B. thuringiensis Gen" wird ein Fragment eines vollständigen B. thuringiensis Gens verstanden, das wenigstens den toxischen Teil des B. thuringiensis ICP verschlüsselt, bevorzugt das Toxin.
  • Unter einem "Markierungsgen" wird ein Gen verstanden, das einen auswählbaren Markierer (z.B. Resistenz gegen Antibiotika)oder einen erkennbaren Markierer (z.B. ein Genprodukt, das die quantitative Analyse transgener Pflanzen erlaubt), verschlüsselt.
  • Zwei ICP's werden als "mit wechselseitiger Beeinflussung eingebundene ICP's" für eine Zielinsektenspezies bezeichnet, wenn ein ICP für alle ICP-Rezeptoren des anderen ICP passend ist, wobei diese Rezeptoren in der Borstengrenzmembran des Erbguts der Zielinsektenpezies vorhanden sind.
  • Zwei ICP's werden als "nicht mit wechselseitiger Beeinflussung eingebundene ICP's " bezeichnet, wenn für wenigstens eine Zielinsektenspezies das erste ICP wenigsten einen Rezeptor aufweist, der nicht zum zweiten ICP paßt und das zweite ICP wenigstens einen Rezeptor aufweist, der nicht zum ersten ICP paßt, wobei die Rezeptoren in der Borstengrenzmembran des Erbguts der Zielinsektengruppe vorhanden sind.
  • Unter einem "Rezeptor" wird ein Molekül verstanden, an das sich ein Binder (in diesem Fall ein B. thuringiensis ICP, besonders ein Toxin) mit hoher Affinität (typischerweise mit einer Dissoziationskonstante (Kd) zwischen 10E-11 und 10E-6 M) und Sättigung binden kann. Die Bestimmung, ob zwei ICP's mit oder ohne wechselseitige Beeinflussung eingebunden sind, kann wie folgt getroffen werden:
  • 1. ein erstes ICP paßt für alle Rezeptdren eines zweiten ICP, wenn alle Bindestellen des zweiten ICP mit einer Affinität im Bereich zwischen 10E-11 und 10E-6 M mit dem ersten ICP gesättigt werden können, wobei die Konzentration des ersten ICP etwa 10E-5 M oder geringer ist (z.B. bis hinunter zu 10E-11 M); und
  • 2. das zweite ICP paßt für alle Rezeptoren des ersten ICP, wenn alle Bindestellen des ersten ICP mit einer Affinität im Bereich von 10E-11 bis 10E-6 M mit dem zweiten ICP gesättigt werden können, wobei die Konzentration des zweiten ICP etwa 10E-5 M oder geringer ist.
    • Allgemeines Vorgehen
  • Dieser Abschnitt beschreibt in Grundzügen die allgemeinen Verfahren zur Bewertung und Nutzung von wenigsten zwei B. thuringiensis ICP-Genen zur Verhinderung von Resistenzentwicklung einer Zielinsektenspezies gegen die B. thuringiensis ICP's, die in erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen ausgeprägt sind. Eine nicht umfassend vollständige Liste von aufeinanderfolgenden Schritten des allgemeinen Verfahrens folgt, nach der Einzelbeispiele beschrieben werden, die auf dieser Vorgehensweise beruhen und die Erfindung erläutern.
  • In Übereinstimung mit der Erfindung können bestimmte B. thuringiensis ICP's in üblicher Weise aus den jeweiligen Stämmen, die in Tabelle 2 (die den Beispielen folgt) aufgelistet sind, isoliert werden. Die ICP's können verwendet werden, um monoclonale oder polyclonale Antikörper für diese ICP's in üblicher Weise herzustellen (Höfte et al., 1988).
  • Die ICP Gene können aus ihren zugehörigen Stämmen in herkömmlicher Weise isoliert werden. Die ICP Gene werden bevorzugt identifiziert durch:
  • Verarbeitung der vollständigen DNA der jeweiligen Stämme mit passenden Enzymen; Trennen der auf diese Weise erzeugten DNA Fragmente nach Größe in DNA Fragmente von 5 - 10 Kb; Binden dieser Fragmente an geeignete Bakterienüberträger zum Klonen (z.B. pEcoR251, hinterlegt in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen "DSM", Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, unter der Zugangsnummer 4711 am 13. Juli 1988); Verändern von E. coli mit den Bakterienüberträgern zum Klonen; und Screenen der Klone mit einer geeigneten DNA Sonde. Die DNA Sonde kann aus einem hochkonservierten Bereich gewonnen werden, der im allgemeinen in B. thuringiensis Genen auftritt, die crystal Protoxine gegen Coleoptera oder Lepidoptera verschlüsseln, wie z.B. auf der Basis einer N.terminierten Aminosäuresequenz, die durch eine Gasphasen- Sequenzierung der gereinigten Proteine bestimmt ist (EP- Anmeldung 88 402 115.5).
  • Alternativ können die gewünschten Fragmente, erzeugt aus der vollständigen DNA der jeweiligen Stämme, in geeignete Bakterienüberträger gebunden werden (z.B. ein pUC Bakterienüberträger (Yanisch-Perron et al., 1985) mit dem Einfügen unter der Kontrolle des LacPromoters) und in E. coli verändert werden, wobei die Klone dann mit üblichen Immunprobeverfahren gescreent werden können (French et al., 1986) für die Ausbildung der Toxine mit monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, die gegen die von den Stämmen erzeugten Toxine gebildet werden..
  • Die isolierten B. thuringiensis ICP Gene können dann in üblicher Weise unter Verwendung gut bekannter Verfahren (z.B. Maxam und Gilbert, 1980) sequenziert werden.
  • Zur Zeit sind einige ICP Gene von verschiedenen Unterarten von B. thuringiensis (Tabelle 2) geklont worden. Über die Nucleotidsequenzen einiger dieser B. thuringiensis ICP Gene ist berichtet worden. Während einige Sequenzen identisch oder beinahe identisch sind und dasselbe Gen oder nahe Varianten desselben Gens darstellen, zeigen einige Sequenzen wesentliche Unterschiedlichkeit und die Existenz verschiedener B. thuringiensis ICP Genklassen. Verschiedene Beweisführungen deuten darauf hin, daß alle diese Gene eine Familie verwandter insecticidal proteine darstellen. Eine Analyse der Verteilung von B. thuringiensis ICP's in verschiedenen B. thuringiensis Stämmen über eine Bestimmung der Proteinzusammensetzung ihrer Kristalle, über eine Immundetektion unter Verwendung polyclonaler Antiseren oder Monoclonalen gegenüber gereinigten proteinen, oder durch die Verwendung genspezifischer Testkörper, zeigt, daß Unterarten von B. thuringiensis bis zu drei verwandte B. thuringiensis ICP Gene aufweisen können, die zu unterschiedlichen Klassen gehören (Kronstad et al., 1983).
  • Der bevorzugte Organismus zum Ausdrücken der isolierten und charakterisierten Gene in einem heterologen Wirt für die Reinigung und Charakterisierung des rekombinierten Proteins ist Escherichia coli. Eine Anzahl von Bakterienüberträgern zur besseren Ausbildung heterologer Gene in E. coli ist beschrieben worden (z.B. Remaut et al., 1981). In der Regel ist das Gen unter der Kontrolle eines stark regulierbaren Promoters geklont, wie dem Lambda pL oder pR Promoter (z.B. Botterman und Zabeau, 1987), dem Lac-Promoter (z.B. Fuller, 1982), oder dem Tac-Promoter (z.B. De Boer et al., 1983), und mit geeigneten Anfangsstellen für die Übersetzung versehen (z.B. Stanssens et al., 1985 und 1987). Genkassetten von B. thuringiensis ICP Genen können durch seitengerichtete Mutagenese erzeugt werden, beispielsweise nach dem von Stanssens et al. vorgestellten Verfahren (1985 und 1987). So können Kassetten hergestellt werden, die z.B. ein verkürztes ICP Cenfragment enthalten, das den toxischen Kern (also das Toxin) eines ICP verschlüsselt, oder ein Hybridgen, das den toxischen Kern verschlüsselt und einen auswählbaren Markierer in Übereinstimmung mit den in der EP Anmeldung 88 402 241.9 beschriebenen Verfahren.
  • Die Zellen einer E. coli Kultur, die zum Erzeugen eines rekombinierten ICP angeregt ist, werden abgeerntet. Das Verfahren zum Anregen der Zellen, um das rekombinierte ICP zu erzeugen, hängt von der Wahl des promoters ab. Der Lac-promoter (Fuller, 1982) wird beispielsweise durch Isopropyl-B-D Thiogalacto-Pyranoside ("IPTG") angeregt; der Pl Promoter wird durch einen Temperaturschock (Bernard et al., 1979) angeregt. Das rekombinierte ICP ist in der Regel in den Zellen in Form von unlöslichen Einschlüssen gelagert (Hsuing und Becker, 1988). Die Zellen werden in Lyse gegeben, um die Einschlüsse freizulegen. Der Knäuel von E. coli Proteinen wird in aufeinanderfolgenden Waschvorgängen entfernt. Es wird ein halbreines Protoxin-Pellet erhalten, aus dem das Protoxin mittels alkalischer Puffer (z.B. Na&sub2;CO&sub3;, pH 10) gelöst wird. Das Vorgehen für das ICP Bt2, das auch für andere rekombinierende Toxine anwendbar ist, wurde von Höfte et al., 1986 beschrieben.
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung wurde das Binden verschiedener ICP oder ICP Rezeptoren an der Borstengrenzmembran von Epithelzellen im Erbgut verschiedener Insektenspezies untersucht. Die Borstengrenzmembran ist das erste Ziel jedes ICP, und Membranvesikel, bevorzugt der Borstengrenzmembran, können nach Wolfersberger et al., 1987, erhalten werden.
  • Das Binden an ICP Rezeptoren eines oder mehrerer ICP's (z.B. ICP A, ICP B, etc.) kann durch folgende Schritte gekennzeichnet werden (Hofmann et al., 1988b):
  • 1. ICP A wird mit einem passenden Markierer versehen (in der Regel ein radioaktives Isotop wie I 125)
  • 2. Die Borstengrenzmembranen werden mit einer geringen Menge (bevorzugt weniger als 10E-10 M) von ICP A zusammen mit unterschiedlichen Konzentrationen von unmarkiertem ICP A (bevorzugt weniger als 10E-11 bis 10E-5 M) behandelt
  • 3. Für alle verwendeten Konzentrationen wird die Menge von markiertem ICP A, das an die Borstengrenzmembran gebunden ist, gemessen
  • 4. Eine mathematische Analyse dieser Daten erlaubt die Berechnung verschiedener Charakteristiken des ICP Rezeptors wie z.B. die Anzahl der Bindestellen (Scatchard, 1949)
  • 5. Die Wechselwirkung mit anderen Toxinen (z.B. ICP B) wird bevorzugt studiert, indem dieselbe Menge von markiertem ICP A auf die Borstengrenzmembranen zusammen mit verschiedenen Menge von ICP B aufgebracht wird (bevorzugt von 10E-11 bis 10E-6 M); danach werden die Schritte 3 und 4 wiederholt
  • Durch diese Vorgehensweise wurde z.B. festgestellt, daß Bt3 Toxin, Bt2 Toxin und Bt73 Toxin unter wechselseitiger Beeinflussung anti-Lepidoptera ICP's für Manduca sexta und Heliothis virescens (vgl. Beispiel 6) binden.Verschiedene andere Kombinationen von Toxinen wurden gefunden, die ohne wechselseitige Beeinflussung anti-Lepidoptera oder anti- Coleoptera Toxine binden (Beispiel 6).
  • Obwohl der Ansatz von wechselseitiger Beeinflussung gegenüber nicht-wechselseitiger Beeinflussung der ICP Bindung für sich allein keine praktische Bedeutung hat, kann die Beobachtung der nicht wechselseitigen Beeinflussung von zwei B. thuringiensis ICP's, die gegen dieselbe Zielinsektenspezies wirken, zu einem hohen praktischen Nutzen führen. Dies liegt daran, daß eine Kombination von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen B. thuringiensis ICP's benutzt werden kann, um die Entwicklung von Resistenz der Zielinsektenspezies gegen derartige B. thuringiensis ICP's zu verhindern.
  • Ein Selektionsexperiment mit M.sexta, bei dem Bt2 Toxin, Bt18 Toxin und eine Mischung aus Bt2 und Bt18 Toxinen verwendet wurde, hat gezeigt, daß Bt2 und Bt18 zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene anti-Lepidoptera Toxine sind. Nach 20 Generationen wurde ein deutlicher Rückgang in der Empfindlichkeit gegenüber ICP bei den Experimenten nur mit Bt2 oder Bt18 beobachtet (größer 100). Der Rückgang in der Empfindlichkeit im Selektionsexperiment mit der Bt2-Bt18 Mischung war nur marginal (ca. 3). Dies zeigt den unerwarteten praktischen Nutzen der gleichzeitigen Verwendung von zwei ohne gegenseitige Beeinflussung eingebundenen ICP's in einer Situation, die den hohen Selektionsdruck modelliert, der bei der Verwendung transgener Pflanzen mit ICP Genen auftritt. In diesem Zusammenhang zeigten die zwei resistenten Stamme einen deutlichen Schwund an Bindestellen entweder für Bt2 oder Bt18 Toxin. In jedem Fall waren die Bindestellen für das Toxin, das nicht zur Selektion verwendet wurde, nicht betroffen, oder ihre Konzentration hat sogar zugenommen. So behielt der unter Bt2 selektierte Stamm seine Bt18 Rezeptoren, und der Bt18 selektierte Stamm bildete eine erhöhte Anzahl von Bt2 Rezeptoren.. Der Bt18 selektierte Stamm zeigte in der Tat eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Bt2 zusammen mit seiner erhöhten Bt2 Rezeptorkonzentration. In den Stämmen, die gegen die kombinierten Toxine resistent waren, wurden keine wesentlichen Veränderungen an den Rezeptoren festgestellt. Diese Feststellungen werden detailliert im noch folgenden Beispiel 7 beschrieben.
  • Ein ähnlicher Resistenzmechanismus gegenüber Bt wurde an einem Stamm der Diamantrückenmotte, Plutella xylostella, beobachtet.
  • Dieser Stamm hatte im Feld Resistenz gegen Dipel entwicklet, was eine handelsübliche Zusammensetzung des Bt HD-1 Stammes ist. Kristalle von Dipel umfassen eine Mischung von verschiedenen Bt ICP's, ähnlich zu den Bt2, Bt3 und Bt73 Proteinen, die sich wechselseitig beeinflussende ICP's sind. Wie sowohl durch Insekten-Bioasseys als auch durch wechselseitige Einbindestudien mit Bt 2 und Bt15 gezeigt wurde, ist der Dipel-resistente Diamantrückenmottenstamm resistent gegen das Bt2 Protoxin und Toxin, behält aber die volle Empfindlichkeit gegenüber Bt15 Protoxin und Toxin. Diese Erkenntnis ist wichtig für andere Kombinationen von ohne wechselseitige Wirkung eingebundene Zusammenstellungen von anti-Lepidoptera oder anti-Coleoptera ICP's, von denen derselbe günstige Effekt gegenüber den gemeinsamen Zielinsekten erwartet wird.
  • Ein Kombination von ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen ICP's, wenn sie direkt in einer transgenen Pflanze ausgedrückt werden, bietet also den wesentlichen Vorteil, daß die Wahrscheinlichkeit der Resistenzentwicklung der Insekten gegen die in der Pflanze enthaltenen ICP's verringert werden kann. Es kann zu weiteren Vorteilen kommen, da das gemeinsame Spektrum der zwei Toxine weiter sein kann als das eines einzelnen in der Pflanze enthaltenen ICP (vgl. die folgenden Beispiele 8 - 10).
  • Wenn bei zwei mit wechselseitiger Beeinflussungen eingebundenen ICP's eines eine größere Anzahl von Bindestellen als das andere gegen ein vorgegebenes Zielinsekt hat, ist es äußerst vorteilhaft, das ICP mit der größeren Anzahl von Bindestellen zusammen mit dem am besten geeigneten, ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen B. thuringiensis ICP zu verwenden, um die Zielplage zu kontrollieren. Es wird z.B., wie in Beispiel 6 dargestellt, vorgezogen, gegen Heliothis virescens Bt73 und nicht Bt2 oder Bt3 zu verwenden, und es wird vorgezogen, gegen Manduca sexta Bt3 und nicht Bt2 oder Bt73 zu verwenden. Das gewählte Gen kann dann mit dem am besten geeigneten, ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen ICP kombiniert werden.
  • Bisher haben die Veränderungen von Pflanzen das Einführen eines Markierungsgens zusammen mit einem ICP Gen innerhalb desselben Plasmids in das Genom der Pflanze umfaßt (z.B. Vaeck et al., 1987; Fischoff et al., 1987). Diese Chimären-ICP Gene umfaßten in der Regel entweder das ganze oder einen Teil eines ICP Gens, bevorzugt ein verstümmeltes ICP Genfragment, das den toxischen Kern verschlüsselt, gebunden an ein wählbares Markierungsgen, wie das neo-Gen, das Neomycin-Phosphortransferse verschlüsselt. Das Chimären-ICP Gen wurde zwischen den T-DNA Wiederholgrenzen für Agrobacterium Triplasmid mittels Transformation plaziert (EP 0 193 259).
  • Diese Erfindung schließt die Verwendung von zwei oder sogar mehr B. thuringiensis ICP Genen in transgenen Pflanzen ein. Die insektizid wirkenden B. thuringiensis ICP Gene, die zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene ICP's für eine Zielinsektenspezies und bevorzugt die zugehörigen abgeschnittenen ICP Gene verschlüsseln, werden in das Genom einer Pflanzenzelle eingeschleust, so daß die eingeschleusten Gene unterhalb und unter der Kontrolle eines Promoters stehen, der die Ausbildung der Gene in der Pflanzenzelle steuern kann. Diese wird bevorzugt durch Einschleusen eines oder mehrerer Chimären-Gene in das Genom der Pflanzenzelle erreicht, wobei jedes davon in derselben Transcriptase-Einheit umfaßt:
  • wenigstens ein ICP Gen;
  • bevorzugt ein Markierungsgen; und
  • wahlweise eine DNA-Sequenz, die einen protease- (z.B. Trypsin) empfindlichen oder proteasegebundenen Proteinteil enthält, der in den Rahmen zwischen zwei beliebigen ICP Genen im Chimären- Gen eingeschoben ist. Jedes Chimären-Gen enthält darüber hinaus wenigstens einen Promoter, der die Entfaltung der ICP Gene der Pflanzen in der Pflanzenzelle steuert.
  • Die Auswahl geeigneter promoter für die erfindungsgemäßen Chimären-Gene ist unkritisch. Bevorzugte Promoter für derartige Chimären-Gene umfassen:
  • den stark konstitutiven 35S Promoter gewonnen aus dem cauliflower mosaic Virus, Isolierte CM 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) und CabbB-JI (Hull and Howell, 1987); den Promoter des Nopalin-Synthetik-Gens ("PNOS") von Ti-Plasmid (Herrera-Esrella, 1983); den Promoter des Octopine-Synthase-Gens ("POCS", De Greve et al., 1982); and den durch eine Verletzung einführbaren TR1' Promoter und den TR2' Promoter, die die Ausbildung der 1' und 2''Gene beziehungsweise der T-DNA (Velten et al., 1984) antreiben.
  • Alternativ kann ein promoter verwendet werden, der für eines oder mehrere Gewebe oder Organe der Pflanze spezifisch ist, wobei die eingefügten Gene ihre Wirkung nur in Zellen des/der spezifischen Gewebe oder Organe entfalten. Beispiele für derartige Promoter sind ein stammspezifischer Promoter wie der AdoMet-Synthetase Promoter (Peleman et al, 1989), ein knollenspezifischer Promoter (Rocha-Sosa et al., 1989), und ein samenspezifische Promoter wie der 28 Promoter (Krebbers et al., 1988). Die ICP Gene könnten auch gewählt in den Blättern einer Pflanze (z.B. bei Kartoffeln) entfaltet werden, indem die Gene unter die Kontrolle eines lichtempfindlichen Promoters gestellt werden wie dem Promoter der Untereinheit des Ribulose-1,5- Biphosphat Carboxylase-Gens der Pflanze selbst oder einer anderen Pflanze wie einer Erbse, wie in der EP 0 193 259 dargelegt wird. Eine andere Alternative ist es, einen Promoter zu verwenden, dessen Ausbildung z.B. durch Temperatur oder chemische Faktoren ausgelöst wird.
  • En weiterer Teil jedes derartigen Chimären-Gens ist eine nicht übersetzte 3'DNA Sequenz, die in Pflanzenzellen die 3' Endbildung und die Polyadenylation des 3' Endes der mRNA Sequenz herbeiführt, wobei die mRNA Sequenz durch das wenigstens eine in der Pflanzenzelle enthaltene ICP Gen verschlüsselt wird. Die Auswahl einer geeigneten, nichtübersetzten 3' DNA Sequenz ist unkritisch. Beispiele sind das unübersetzte 3' Ende des Octopin-Synthase-Gens, das Nopalin-Synthase-Gen oder das T-DNA Gen 7 (Velten und schell, 1985).
  • Auch die Auswahl der Markierungsgene für die erfindungsgemäßen Chimären-Gene ist unkritisch, und es kann jede übliche DNA Sequenz verwendet werde, die ein Protein oder Polypeptid verschlüsselt, das Pflanzenzellen, die die DNA Sequenz aufweisen, gut unterscheidbar machen von Pflanzenzellen, die diese DNA Sequenz nicht aufweisen (EP 0 344 029). Das Markierungsgen kann einem eigenen Promoter unterstehen und seine eigene, nicht übersetzte 3' DNA Sequenz wie oben beschrieben aufweisen, vorausgesetzt, das Markierungsgen befindet sich an derselben genetischen Stelle wie das oder die ICP Gene, die es markiert. Das Markierungsgen kann beispielsweise sein: ein herbizidresistentes Gen wie die sfr oder sfrv Gene (EP Anmeldung 87 400 141); ein Gen, das ein verändertes Zielenzym für ein Herbizid mit geringerer Empfindlichkeit gegenüber diesem Herbizid verschlüsselt als das natürliche Enzym, wie ein verändertes 5-EPSP als Ziel für Glyphosat (US 4 535 060, EP 0 218 571) oder eine veränderte Glutamin-Synthetase als Ziel für einen GS-Hemmer (EP 0 240 972);oder ein gegen Antibiotika resistentes Gen wie ein Neo-Gen (WO 84/02913, EP 0 193 259).
  • Durch Verwendung der A. tumefaciens Ti Bakterienüberträgergeleiteten Methode zur Pflanzenveränderung können alle erfindungsgemäßen Chimären-Gene in das Genom von Pflanzenzellen eingeschleust werden, nachdem die Chimären-Gene zwischen die T- DNA Wiederholgrenzen geeigneter unschädlicher Ti.Plasmid Bakterienüberträger gesetzt worden sind (Deblaere et al., 1988). Diese Veränderung kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z.B. wie in der EP 0 116 718, der WO 84(02913 und der EP Anmeldung 87 400 544.0 beschrieben. Die Chimären-Gene können sich auch in unspezifischen plasmiden Bakterienüberträgern befinden, die für die direkte Genübertragung verwendet werden können (z.B. beschrieben bei Pazkowski et al., 1984; De La Pena et al., 1986). Es kann verschiedenen üblichen Verfahren gefolgt werden, um eine gemeinsame Ausbildung von zwei B. thuringiensis ICP Genen in transgenen Pflanzen wie unten zusammengefaßt zu erreichen.
    • I Konstruktion von Chimären-Genen, wobei zwei oder mehr ICP Gene und ein Markierungsgen als einziges Stück von DNA in das Genom der Pflanze eingefügt werden und zum Einfügen an nur einer genetischen Stelle im Genom führen Ia Die Gene können in unterschiedlichen Transcriptaseeinheiten unter der Kontrolle verschiedener Promoter zusammengestellt werden
  • Um eines oder mehrere ICP Gene und ein Markierungsgen as getrennte Transcriptaseeinheiten auszudrücken, können mehrere Fragmente von Promotern, die die Entfaltung in Pflanzenzellen steuern, wie oben beschrieben verwendet werden. Es sind alle Kombinationen der oben in der Konstruktion von Chimären beschriebenen Promoter für ein ICP Gen möglich. Beispiele für derartige Chimären-Konstruktionen für das bt2 Gen sind in der EP 0 193 259 gegeben, für das bt13 Gen in der EP Anmeldung 88 402 115.5 und für das bt18 Gen in der EP Anmeldung 88 402 241.9. Das ICP Gen in jedem erfindungsgemäßen Chimären-Gen kann das intakte ICP Gen sein oder bevorzugt ein insektizidwirksamer Teil des intakten ICP Gens, besonders ein verstümmeltes Genfragment, das den toxischen Kern des ICP verschlüsselt. Die individuellen Chimären-Gene sind in denselben Plasmid-Bakterienüberträger in Übereinstimmung mit den üblichen Verfahren geklont (z.B. EP 0 139 258).
    • Ib Zwei Gene (z.B. entweder ein ICP Gen und ein Markierungsgen oder zwei ICP Genen oder mehr können in derselben Transcriptaseeinheit kombiniert sein
  • Um zwei oder mehr ICP Gene in derselben Transcriptaseeinheit auszudrücken, können die folgenden Fälle unterschieden werden:
  • In einem ersten Fall können hybride Gene, in denen der verschlüsselte Bereich eines Gens im Rahmen mit dem verschlüsselten Bereich eines anderen Gens verbunden ist, der Kontrolle eines einzelnen Promoters unterstellt werden. Verbindungen können hergestellt werden entweder zwischen einem ICP Gen und einem Markierungsgen oder zwischen zwei ICP Genen. Ein Beispiel für eine Verbindung zwischen einem ICP Gen und einem Markierungsgen ist in der EP 0 193 259 beschrieben worden (z.B. ein verstümmeltes hybrides bt2-neo Gen, das ein Bt2 toxin-NPTII Verbindungsprotein verschlüsselt).
  • Eine andere Möglichkeit ist die Verbindung von zwei ICP Genen. Zwischen jedes Gen, das ein noch insectizid aktives ICP verschlüsselt (z.B. einen toxischen Teil des Protoxins), soll ein Genfragment, das ein protease-empfindliches Protein (z.B. Trypsin) verschlüsselt, eingeschoben werden, wie ein Genfragment, das einen Teil der N-Abschluß oder C-Abschluß-Aminosäureequenz oder eines der beiden ICP's verschlüsselt, das mit der Ausführung beginnt oder endet, ausgelöst durch die Erbgutenzyme der Zielinsektenspezies.
  • In einem zweiten Fall können die kodierten Bereiche der zwei ICP Gene in distinctronischen Einheiten unter der Kontrolle eines Promoters zusammengefaßt sein. Die kodierten Bereiche der beiden ICP Gene werden hintereinander plaziert mit einer zwischengenetischen Sequenz bestimmter Länge. Es wird ein einzelnes Boten RNA-Molekül erzeugt, das zur Übersetzung in zwei verschiedene Genprodukte führt. Das Konzept des Wiederbeginns der Übersetzung ist akzeptiert worden auf Grundlage eines abgewandelten Scan-Models (Kozak, 1987), vorausgesetzt, daß ein Endcode zusammen mit einem stromaufwärts liegenden ATG einem Rahmen bildet und dem stromabwärts liegenden ATG vorausgeht. Versuchsergebnisse haben auch gezeigt, daß die Pflanzenübersetzungsmaschinerie einige Polypeptide aus einer polycistronischen mRNA synthetisieren kann (Angenon et al., 1989).
    • II Chimären-Konstruktionen mit einem oder mehreren ICP Genen, die in das Genom einer bereits mit einem oder mehreren ICP Genen veränderten Pflanze übertragen werden
  • Mehrere Gene können in eine Pflanzenzelle während aufeinanderfolgender Transformationsschritte übertragen werden (Rücktransformation), vorausgesetzt, daß ein alternatives System zur Auswahl der Transformaten für die zweite Abfolge der Transformationsschritte zur Verfügung steht. Diese Rücktransformation führt zur gemeinsamen Ausbildung von ICP Genen, die an verschiedenen genetischen Orten in des Genom eingebracht sind. Bevorzugt werden zwei getrennte Markierungsgene in den zwei aufeinanderfolgenden Transformationsschritten verwendet. Der erste Markierer wird verwendet, um die im ersten Schritt veränderten Zellen auswählen zu können, während der zweite Markierer für die im zweiten Schritt veränderten verwendet wird. Es sind aufeinanderfolgende Transformationsschritte unter Verwendung von Kanomycin und Hygromycin beschrieben worden, z.B. durch Sandler et al. (1988) und Delauney et al. (1988).
    • III Chimären-Konstruktionen mit einem oder mehreren ICP Genen, die getrennt in das nukleare Genom verschiedener Pflanzen in unabhängigen Transformationsschritten eingebracht werden und danach im Genom einer Pflanzen durch Kreuzen kombiniert werden
  • Die erste Pflanze sollte eine Pflanze sein, die mit einem ersten ICP Gen verändert worden ist oder eine daraus mittels Selbstbefruchtung hervorgegangene F1 Pflanze (bevorzugt eine F1 Pflanze, die bezüglich des ICP Gens homozygotisch ist). Die zweite Pflanze sollte eine Pflanze sein, die mit einem zweiten ICP Gen verändert worden ist oder eine daraus mittels Selbstbefruchtung hervorgegangene F1 Pflanze (bevorzugt eine F1 Pflanze, die bezüglich des ICP Gens homozygotisch ist). Auf die aus dieser Kreuzung hervorgegangenen Pflanzen können Selektionsverfahren angewandt werden, um die Pflanzen zu wählen, die in ihrem Genom beide ICP Gene aufweisen (z.B. Southern blotting) und die beiden ICP's ausbilden (z.B. getrennter ELISA-Nachweis der immunologisch unterschiedlichen ICP's). Dies ist eine nützliche Vorgehensweise, sowohl um hybride Variationen aus zwei Linien zu erzeugen, von denen jede mit einem anderen ICP Gen verändert worden ist, als auch um Inzucht-Linien zu erzeugen, die zwei verschiedene ICP Gene enthalten durch Kreuzen zweier unabhängig transformierter Pflanzen (oder deren selbstbefruchteten F1 Abkömmlingen) aus derselben Inzucht-Linie.
    • IV Chimären-Konstruktionen mit einem oder mehreren ICP Genen, die getrennt in das Genom einer einzigen Pflanze überführt worden sind in demselben Transformationsexperiment und zum Einfügen der jeweiligen Chimären-Gene an unterschiedlichen aenetischen Stellen führen
  • Kotransformation führt zur gleichzeitigen Veränderung einer Pflanze mit zwei unterschiedlichen Bakterienüberträgern, von den der erste ein erstes ICP Gen enthält und der zweite ein zweites ICP Gen. Mit jedem ICP Gen kann ein unterschiedliches Markierungsgen verwendet werden, und die Unterscheidung kann mit den beiden Markierungen gleichzeitig durchgeführt werden. Alternativ kann ein einziger Markierer verwendet werden, und eine genügend große Anzahl ausgewählter Pflanzen kann untersucht werden, um die Pflanzen zu finden, die beide ICP Gene aufweisen (z.B. Southern blotting) und die beiden Proteine ausbilde (z.B. mittels ELISA). Die Kotransformation mit mehr als einer T-DNA kann durchgeführt werden, indem gleichzeitig zwei verschiedene Stämme von Agrobacterium, jeder mit einem anderen Ti-Plasmid (Depicker et al., 1985) verwendet werden oder mit einem Stamm von Agrobacterium, der zwei T-DNA's auf getrennten Plasmiden enthält (de Framond et al., 1986). Der direkte Gentransfer unter Verwendung einer Mischung von zwei Plasmiden kann auch zur Kotransformation von Pflanzenzellen mit einem wählbaren und einem nicht-wählbaren Gen verwendet werden (Schocher et al.., 1986).
  • Die erhaltene transgene Pflanze kann in weiteren Zuchtschemata verwendet werden. Die veränderte Pflanze kann selbstbefruchtet werden, um eine homozygotische Pflanze bezüglich der eingefügten Gene zu erhalten. Wenn die Pflanze aus einer Inzuchtlinie stammt, kann die homozygotische Pflanze verwendet werden, um direkt oder als väterliche Linie für Hybrid- Variationen Samen zu erzeugen. Das Gen kann auch in offene Populationen oder andere Inzuchtlinien derselben Pflanze eingekreuzt werden, wobei die üblichen Ansätze zur Pflanzenzucht verwendet werden.
  • Selbstverständlich können auch andere Verfahren zur Veränderung der Pflanzen benutzt werden, die auch von der Erfindung umfaßt werden, solange sie zu einer Pflanze führen, die zwei oder mehr ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene ICP's aufweist.
  • In diesem Zusammenhang ist die Erfindung nicht auf die Verwendung von Agrobacteriuin Ti-Plasmiden zur Veränderung von Pflanzenzellen mittels Genen, die ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene ICP's verschlüseln, beschränkt. Andere bekannte Verfahren zur Veränderung von Pflanzenzellen wie die Elektroporation oder die Verwendung eines Vektorsystems auf der Basis von Pflanzenviren oder Pollen können zur Veränderung monocotylediner und dicotylediner Pflanzen verwendet werden, um Pflanzen zu erhalten, die zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene ICP's verschlüsseln. Außerdem können DNA Sequenzen, die andere als die hier offenbarten ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen ICP's verschlüsseln, zur Veränderung von Pflanzen verwendet werden. Darüber hinaus kann jedes der hier beschriebenen ICP Gene durch eine entsprechende DNA Sequenz verschlüsselt werden, wenn der Verfall der Erbinformation berücksichtigt wird. Außerdem können äquivalente ICP's mit nur geringen Aminosäureänderungen, die durch Mutationen im ICP Gen erreicht werden könnten, verwendet werden, vorausgesetzt, sie verschlüsseln ein Protein mit im wesentlichen denselben Eigenschaften (d.h. mit insektizider Wirkung und Rezeptorbindung).
  • Die folgende Beispiele erläutern die Erfindung. Ein Fachmann wird aber erkennen, daß auch andere Kombinationen von zwei oder mehr ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene B. thuringiensis ICP Gene verwendet werden können, um Pflanzen in Übereinstimmung mit der Erfindung zur Verhinderung der Resistenzentwicklung in einem Zielinsekt gegenüber den in den veränderten Pflanzen ausgedrückten ICP Gene zu verändern. Wenn nichts anderes angegeben wird, werden die Verfahren zur Herstellung und Manipulation der DNA nach den Standardverfahren ausgeführt, die von Maniatis et al. in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 beschrieben worden sind.
    • BEISPIEL 1: Sammeln der Gene
  • Die Sammlung von anti-Lepidoptera und anti-Coleoptera Bt Genen, die ICP's verschlüseln, die Teil der Erfindung sind, ist in Tabelle 2 (nach den Beispielen) aufgeführt. Literaturverweise für die jeweiligen Gene finden sich ebenfalls in Tabelle 2. Die Herkunft, die Isolierung und Charakterisierung von unveröffentlichten Bt Genen sind unten beschrieben. Bt Stämme, wie die Stämme HD-1, HD-68, HD-110 und HD-73 sind allgemein erhältlich bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, U.S. Dept. of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, USA.
    • bt3:
  • Gen: Das ICP von B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 wurde geklont. Die Charakterisierung dieses Gens zeigte einen offenen Leserahmen von 3528 bp, der ein Protoxin von 133 kDa verschlüsselt. Dieses Gen war identisch zu dem vom Schnepf et al. beschriebenen (1985).
    • bt73:
  • Gen: Aus B. thuringiensis var HD-73. Das ICP Gen wurde geklont wie von Adang et l. (1985) beschrieben.
    • bt4:
  • Gen: Aus der vollständigen DNA des Stammes B. thuringiensis aizawai HD-68 wurde eine Genbibliothek erstellt. Unter Verwendung des 1.1 kb internen HindIII Fragments des bt2 Gens als Probe, wurde ein als bt4 bezeichnetes Gen isoliert. Die Charakteristik dieses Gens zeigte einen offenen Leserahmen von 3495 bp, der ein Protoxin von 132 kDa und ein durch Trypsin aktiviertes Fragment von 60 kDa verschlüsselt. Diese (insektenkontrollierende Protein) Gen unterscheidet sich von bisher identifizierten Genen und wurde auch in einigen anderen Stämmen der Unterart aizawai und entomocidus, die HD-110 enthalten, gefunden. Fig. 13 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäurensequenz des offenen Leserahmens ("ORF") des bt4 Gens, ausgehend vom Nucleotid 264 bis zum Nucleotid 3761.
    • bt14 und bt15:
  • Gene: Es wurde eine Genbibliothek aus der vollständigen DNA des Stammes B. thuringiensis var. entomocidus HD-110 durch teilweise Sau3A Behandlung der vollständigen DNA und Klonen mit den Vektor pEcoR251 (hinterlegt beim DSM unter der Nummer 4711) erstellt. Unter Verwendung monoclonaler Antikörper (Höfte et al., 1988) wurden wenigstens drei unterschiedlich strukturierte ICP's in den Kristallen von B. thuringiensis entomocidus HD-110 identifiziert. Diese monoclonalen Antikörper wurden verwendet, um die drei verschiedenen ICP Gene dieses B. thuringiensis Stammes zu klonen. Eines dieser Gene ist das oben beschriebene bt4.
  • Das zweite Gen wurde "bt15" genannt. Fig. 14 zeigt die die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäurensequenz des ORF des bt15 Gens, isoliert aus HD-110, ausgehend vom Nucleotid 234 bis zum Nucleotid 3803. Die Shine und Dalgarno Sequenz, die dem Anfangscodon vorausgeht, ist unterstrichen. Dieses Gen weist einen ORF von 3567 bp auf, der ein Protoxin von 135 kDa und ein Toxinfragment von 63 kDa verschlüsselt. Ein ähnliches Gen wurde von Honee et al., 1988 beschrieben, das isoliert wurde von B. thuringiensis entomocidus 60.5. Das bt15 Gen unterscheidet sich von der veröffentlichten Sequenz an drei Stellen: ein Ala Codon (GCA) statt eines Arg Codon (CGA) an Position 925 und eine Folge von Thr-His Codon (ACGCAT) anstelle von Thr-Asp Codon (ACCGAT) an Position 1400 (Die Positionsnummern sind entsprechend Honee et al., 1988 gewählt.). Ein anderes ähnliches Gen wurde in der EP 0 295 156 beschrieben, isoliert aus B. thuringiensis aizawai 7-29 und entomocidus 6-01. Das bt15 Gen unterscheidet sich von dieser veröffentlichten Nucleotidsequenz an drei unterschiedlichen stellen: 1.) ein Glu Codon (GAA) anstatt eines Ala Codon (GCA) an Position 700; 2.) die Sequenz TGG, CCA, GCG, CAA anstelle von TGC, CAG, CGC, CAC, CAT an Position 1456 und 3.) ein Arg Codon (CGT) statt eines Ala codon (GCG) an Position 2654 (Die Positionsnummern sind entsprechend der EP 0 295 156 gewählt).
  • Das dritte isolierte Gen wurde "bt14" genannt. Es weist einen ORF von 3621 bp auf, der ein 137kFa Protoxin und ein aktiviertes Toxinfragment von 66 kDa verschlüsselt.Ein ähnliches Gen wurde aus B. thuringiensis HD-2 geklont (Brizzard und Whiteley, 1988). Das bt14 Gen unterscheidet sich von der veröffentlichten Nucleotidfolge durch zwei Nukleotidvertauschungen: ein T anstelle von C an Position 126 und ein C anstelle von T an Position 448 (Die Positionsnummern sind entsprechend Brizzard und Whiteley, 1988 gewählt).Im ersten Fall bleibt des Ile Codon (ATT oder ATC) erhalten, während im zweiten Fall das Tyr Codon (TAT) zu einem His Codon (CAC) verändert wird.
    • bt2
  • Gen: Das bt2 Gen wurde wie in der EP 0 193 259 beschrieben geklont.
    • bt18
  • Gen: Das bt18 Gen wurde wie in der EP Anmeldung 88 402 241.9 beschrieben geklont.
    • bt13
  • Gen: Das bt13 Gen wurde wie in der EP Anmeldung 88 402 115.5 beschrieben geklont.
    • bt21 und bt22
  • Gene: Diese Gene, die Coleoptera-aktive ICP's verschlüsseln, wurden wie in der EP Anmeldung 89 400 428.2 beschrieben geklont.
    • BEISPIEL 2: Konstruktion von Genkassetten und Ausbilduna von BT Genen in E. Coli
  • 1.) bt2, bt18; Die Konstruktion von bt2 und bt18 Genkassetten ist in den EP Anmeldungen 86 300 291,1 bzw. 88 402 241.9 beschrieben worden. Diese umfassen, einfach gesagt, ein verstümmeltes Gen, das den toxischen Kern verschlüsselt, und ein hybrides Gen, das das verstümmelte Gen in Verbindung mit einem Rahmen zum N-Terminus des Neo-Gens enthält.Die Genkassetten werden benutzt, um E. coli zu verändern, um die Bt2 und Bt18 ICP Toxine auszubilden.
  • 2.) bt14, bt15: wie in der EP Anmeldung 88 402 241.9 beschrieben, wurden Genkassetten konstruiert, um die Gene in E. coli und Pflanzen auszubilden.
  • Zuerst wurde eine NcoI Stelle in den N-Terminus der Gene durch seitengesteuerte Mutagenese eingeführt.
  • Bei dem bt15 Gen führte die Umwandlung der TT Nucleotiden unmittelbar vor dem ATG Codon zu CC zu einer Überlappung der NcoI Stelle mit dem ATG Anfangscodon. Diese Stelle wurde eingeführt unter Verwendung der pMa/c Vektoren für die seitengesteuerte Mutagenese(Stanssens et al., 1987) und unter Verwendung eines 28-er Oligonucleotids mit der folgenden Sequenz:
  • 5'- CGG AGG TAT TCC ATG GAG GAA AAT AAT C - 3'
  • Dies verband das Plasmid pVE29, das das N-Terminus Fragment des bt15 Gens trägt, mit einer NcoI Stelle am ATG Anfangscodon. In Übereinstimmung mit Brizzard und Whiteley (1988) ist das Anfangscodon des bt14 Gens ein TTG Codon. So wurde eine NcoI Stelle in ähnlicher Weise an diesem Codon für die seitengesteuerte Mutagenese unter Verwendung eines 34-er Oligonucleotids mit folgender Sequenz geschaffen:
  • 5'- CTT ATT TGA AGC CAT GGT AAC TCC TCC TTT TAT G - 3'
  • In diesem Fall wurde die Sequenz des Anfangscodons von ATATTGA zu ACCATTG verändert. Dies band das Plasrnid pHW44, das das N- Terminus Fragment des bt14 Gens trägt, mit einer NcoI Stelle am Anfangscodon.
  • In einem zweiten Schritt wurden die Gene rekonstruiert, indem die N-Terminus Genfragmente mit einem geeigneten C-Terminus Genfragment gebunden worden sind, wobei ein bt14 und bt15 Gen mit einer NcoI Stelle an des ATG Anfangscodon gebunden wurden.
  • Zur Ausbildung der bt14 und bt15 Gene, die das Protoxin in E. coli verschlüsseln, wurden folgende Konstruktionen durchgeführt:pOH50, das das bt15 Gen unter der Kontrolle des Lac-Promoters enthält; und pHW67, das das bt14 Gen unter der Kontrolle des Tac-Promoters enthält. Einführen einer Kultur des E.coli Stamms WK6, der die zugehörigen Plasmide mit IPTG trägt, führte zu einem überproduzierten Protein (Fuller, 1982).
  • Die aktiven toxischen Fragmente der Bt15 und Bt 14 Protoxine umfassen 63 beziehungsweise 60 kDa Trypsinabbauprodukte. Anstatt das vollständige bt15 oder bt14 Gen auszudrücken, ist es auch möglich, ein ein Toxin verschlüsselndes Genfragment oder Derivat davon in Pflanzen auszudrücken.Mit diesem Ziel wurden verstümmelte bt14 und bt15 Genfragmente konstruiert. Um fähig zu sein, transgene Pflanzen zu wählen, die die ICP Genprodukte erzeugen, wurden hybride Gene der verstümmelten Genfragmente auch mit den neo Gen, das einen wählbaren Markierer, beschrieben in der EP 0 193 259, enthält, hergestellt.
  • Durch einen Vergleich der Nucleotidsequenzen der bt4, bt14 bzw. bt15 Gene mit den bt2 bzw. bt18 Genen konnte die Bc1I Stelle als günstige Stelle unterhalb der Codesequenz für das verschlüsselte toxische Genfragment identifiziert werden. Zur Herstellung eines verstümmelten Genfragments und eines hybriden Gens des verstümmelten Genfragments mit dem neo Gen wurde die gefüllte Bc1l Stelle mit der gefüllten EcoRI Stelle von pLKM91 (Höfte et al., 1986) bzw, der gefüllten HindIII Stelle von pLK94 (Botterman und Zabeau, 1987) gebunden. pLKM91 trägt eine verstümmeltes 5' neo Genfragment, das ein enzymatisch aktives C-Terminus Genfragment des neo Gens verschlüsselt, und pLK94 enthält übersetzungsanhaltende Codone in drei Leserahmen. Dies band die folgenden Plasmide, die dann zur Veränderung von E. coli benutzt wurden, um die ICP Gene auszudrücken: pHW71 trägt ein verstümmeltes bt14-neo-hybrid-Gen; pHW72 trägt ein verstümmeltes bt14 Gen; pVE34 trägt ein verstümmeltes bt15-neo- hybrid-Gen; und pVE35 trägt ein verstümmeltes bt15 Gen.
  • In ähnlicher Weise wie für die bt14 und bt15 Gene beschrieben erfolgt auch die Konstruktion von Genkassetten für die bt3 und bt4 Gene, die dann in E. coli ausgedrückt werden.
    • BEISPIEL 3: Reinigung rekombinierender ICP's
  • Die nach Beispiel 2 in E, coli ausgedrückten ICP's werden durch das von Höfte et al., 1986 vorgestellte Verfahren (beschrieben für rekombinierende Bt2 Protoxin) gereinigt.
    • BEISPIEL 4: Reinigung der Toxine
  • In Lösung befindliche Protoxine von Bt2, Bt3, Bt73, Bt4, Bt14, Bt15, Bt18, Bt13, Bt21 und Bt22 (in Na2Co3 50mM, DTT 10 mM pH = 10) werden dialysiert gegen 0,5% (NH4)2CO3 bei pH 8 und mit Trypsin (Trypsin/Protoxin = 1/20 Gewichtsanteile) während zwei Stunden bei 37ºC behandelt. Das aktivierte Toxin wird chromatographisch gereinigt (Mono-Q Reihe bei FPLC) wie von Hofmann et al. 1988b beschrieben.
    • BEISPIEL 5. Festlegen des insektiziden Wirkungsbereichs
  • Die ICP Protoxine und die Toxine der Beispiele 3, 4 werden auf ihre insektizide Wirksamkeit geprüft. Jedes Protoxin wird in einem alkalischen Puffer gelöst, der ein Reduzierlnittel (Na2CO3 50 mM, DTT 10 mM pH = 10) enthält, und jedes Toxin wird als lösliches Protein direkt von FPLC benutzt. Die Proteinkonzentrationen werden bestimmt. Danach werden Verdünnungen der entstandenen Lösung der Protoxine oder Toxine in einem PBS Puffer pH = 7,4, der 0,15 M NaCl und 0,1% bovine serum albumin ("BSA") enthält, angefertigt.
  • Das künstliche Medium für Insektenkulturen, beschrieben durch Bell und Joachim (1976) für Manduca sexta wird in geeignete Aufnahmen gegeben und kann sich setzen. Danach wird diesem Medium eine bestimmte Menge der Protoxin- bzw. Toxin-Lösung zugesetzt, und das Wasser wird unter laminarem Fluß verdampft. Dies führt zu einem Medium mit einer gewissen Menge von festgeklebtem Toxin (im Bereich von 0,1 - 10,0000 ng/cm2) auf der Oberfläche. Typische Verdünnungen für das Bt2 Toxin für den Toxizitätstest von Manduca sexta sind beispielsweise 1, 5, 25, 125 und 625 ng/cm2. Zuerst wird Manduca sexta im Larvenstadium auf das beschichtete Medium gegeben, und Wachstum und Sterblichkeit nach sechs Tagen festgestellt. Die Sterblichkeit nimmt mit der Dosis zu. Die der jeweiligen Dosis entsprechenden Daten werden einer Probenanalyse unterzogen (Finney, 1962), und die Daten werden am besten zusammengefaßt bei einem LD50 wert, was die Menge des Toxins ist, die 50% der Insekten abtötet. Der LD50 Wert von Bt2 Toxin bei Manduca sexta liegt bei etwa 20 ng/cm2.
  • Ähnliche Versuche werden für andere Insektenarten bei Verwendung einer passenden Ernährung durchgeführt oder durch Auftragen der ICP'S auf Blätter für Insekten, für die keine künstliche Ernährung nötig ist.
    • BEISPIEL 6. Bindestrukturen
  • Alle Protoxine und ihre toxischen Fragmente wurden in Übereinstimmung zu den von Höfte et al., 1986 und in dem EP 0 193 259 beschriebenen Verfahren für Bt2 Protoxin und Toxin gereinigt. Die aktivierten und gereinigten Protoxine werden im weiteren Verlauf als die Bt2, Bt3, Bt73, Bt4, Bt 14, Bt15, Bt18, Bt13, Bt21 und Bt22 Toxine bezeichnet.
  • Am Beispiel des Bt73 Toxins wurde gezeigt, daß B. thuringiensis var. kurstaki HD73 ein Protein von 133 kDa, verschlüsselt durch eine 6,6 kb Typgen, erzeugt. Eine Kultur dieses Stamms wurde wie von Mahillon und Delcour 1984 beschrieben angesetzt. Die autolysische Kultur wurde zentrifugiert (20 Minuten bei 4.500 U/min in einem HB4-Rotor) und mit einer Pufferlösung ausgewaschen, die 20 mM Tris, 100 mM NaCl und 0,05% Triton X.- 100 bei pH 8 enthält. Das Endpellet wurde in diesem Puffer wieder in Suspension gegeben (4 ml Puffer auf 100 ml Kultur). Diese Lösung wurde auf einen linearen Urograffingradienten (60 - 70%) aufgebracht, der in einem SW 28 Rotor 90 Minuten lang bei 18.000 U/min zentrifugiert wurde. Die Kristalle wurden gesammelt und bei - 20ºC zur weiteren Verwendung gelagert. Die Aktivierung erfolgte analog zu Höfte et al., 1986. Das gereinigte Toxin wird im weiteren Verlauf als Bt73 Toxin bezeichnet.
    • Iodieren der ICP
  • Das Iodieren der Bt2, Bt3 und Bt73 Toxine wurde unter Verwendung der Chloramin-T-Methode (Hunter und Greenwood, 1962) durchgeführt. Dabei wurden zu 50 ug des gereinigten Toxins 1 mCi 125I.NaI und 20 - 37,5 ug Chloramin-T in NaCl/Pi hinzugefügt. Nach leichtem Schütteln von 60 Sekunden Dauer wurde die Reaktion durch Zugabe von 53 ug Kaliummetabisulfit in H2O gestoppt. Die gesamte Mischung wurde auf eine PD 10 Sephadex G-25M Gelfiltrationssäule aufgebracht, um das freie Iod zu entfernen. Ein weiterer Durchlauf wurde auf einer Biogel P-60 Säule durchgeführt, um die Reinheit zu erhöhen.
  • Alternativ wurde die Toxine unter Verwendung der Iodogen- Methode markiert. Iodogen (Pierce) wurde in Chloroform mit 0,1 mg/ml gelöst. 100 ul dieser Lösung wurden mit einer Pipette in ein Reagenzglas gegeben und unter einem Strom von Nitrogengas getrocknet, Das Glas war mit Tris-Puffer (20mM Tris, pH 8,65 mit 0,15 M NaCl) benetzt. 50 ug des Toxins (in Tris-Puffer) wurde mit 1 mCi 125I-NaI im Schlauch 10 Minuten bebrütet. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 M NaI (ein Viertel des Probevolumens) gestoppt. Die Probe wurde sofort auf eine PD10 sephadex G-25M Säule und danach auf eine Biogel P-60 Säule gebracht, um freies Iod und mögliche Abbauprodukte zu entfernen
  • Andere Toxine wurde unter Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren iodiert.
    • Bestimmen der spezifischen Aktivität der iodierten Toxine
  • Die spezifische Aktivität der iodierten Bt2, Bt3 und Bt73 Toxinproben wurde unter Verwendung einer "Sandwich" ELISA- Technik nach Voller, Bidwel und Barlett (1976) bestimmt. Erster Antikörper war ein polyclonales Antiserum gegen Bt2 Toxine und sekundärer Antikörper ein monoclonaler 4D6-Antikörper.
  • Das verwendete Konjugat war Alkali-Phosphatase, gekoppelt mit Anti-Maus IgG. Die Reaktionsintensität der Standard- Verdünnungen der unmarkierten Toxine und der iodierten Toxinprobe (in NaCl/Pi - 0,1 % BSA) wurde gemessen. Lineare Regressionsrechnungen stellten den Proteingehalt der radioaktiven Toxinprobe fest. Die Proben mit der höchsten spezifischen Aktivität wurden in den Einbindungsversuchen verwendet. Die spezifischen Aktivitaten betrugen 59.400, 33.000 und 19.800 Ci/mol (bezüglich Referenzdatum), für Bt73 Toxin (markiert nach dem Iodogen-Verfahren) bzw. Bt2 Toxin (Chloramin-T Verfahren) und Bt3 Toxin (Iodogen-Verfahren). Die spezifische Aktivität anderer Toxin wurde unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes bestimmt. Ausgewählte mono- und polyclonale Antikörper für jedes dieser Toxine wurden gebildet und in ELISA angewandt.
    • Vorbereiten der Vesikel der Borstengrenzmembran
  • Die Vesikel der Borstengrenzmembranen ("BBMV") von Manduca sexta, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Phtorimea operculella, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Plodia interpunctella, Mamestra brassicae, Pieris brassicae und Leptinotarsa decemlineata wurden nach dem Verfahren von Wolfersberg et al., 1987 vorbereitet. Dies ist ein Verfahren der differentiellen Zentrifugation, das die höhere Dichte von negativen elektrostatischen Ladungen auf luminalen gegenüber basolateralen Membranen ausnutzt, um diese Teile zu trennen.
    • Prüfung der Einbindung
  • Duplikatproben des 125I-markierten Toxins, entweder allein oder zusammen mit unterschiedlichen Mengen von unmarkiertem Toxin, wurden bei der richtigen Temperatur zusammen mit Vesikel der Borstengrenzmembranen in einem Gesamtvolumen von 100 ul Tris- Puffer (Tris 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4) bebrütet. Alle Puffer enthielten 0,1 % BSA. Die Temperatur des Inkubators betrug 20ºC. Zur Trennung von freien und gebundenen Toxinen wurde eine Ultrafiltration durch Whatman GF/F Glasfiberfilter vorgenommen. Jeder Filter wurde rasch mit 5 ml eiskalten Puffers gewaschen (NaCl/Pi - 0,1 % BSA). Die Radioaktivität der Filter wurde in einem Gammazähler gemessen (1.275 Minigama, LKB). Die Einbindungsdaten wurden unter Verwendung eines LIGAND Computerprogramms analysiert. Dieses Programm berechnet die gebundenen Konzentration des Liganden, ausgehend von der Affinität (Ka oder deren Kehrwert Kd = 1/Ka, der Dissziationskonstante) und der Gesamtkonzentration der Rezeptoren oder Bindestellen (Rt).
    • Bestimmen der Proteinkonzentration
  • Die Proteinkonzentration der gereinigten Bt2, Bt3, Bt73 und Bt15 Toxine wurde aus dem OD bei 280 nm berechnet (gemessen mit einem Ucikon 810 P, Kontron Instruments Spectrofotometer). Der Proteingehalt der Lösungen anderer Toxine und der Vesikel der Borstengrenzmembranen ("BBMV") wurde nach Bradford (1976) gemessen.
    • Einbinden von Bt2, Bt3 und Bt73 Toxinen an BBMV von Manduca sexta und Heliothis virescens: ein Beispiel von 3 unter wechselseitiger Beeinflussung eingebundenen Lepidopteran ICP's
  • Bt2, Bt3 und Bt73 Toxine sind toxisch für Manduca sexta und Heliothis virescens: Die LC50-Werte für Manduca sexta sind 17,70, 20,20 bzw. 9,00 ng/cm2; für Heliothis virescens 7,16, 90,00 bzw.1,60 ng/cm2.
  • Markiertes Toxin, entweder Bt3 (0,8 nM), Bt2 (1,05 nM) oder Bt73 (1,05 nM) wurde mit BBMV bebrütet in einem Volumen von 0,1 ml. Die BBMV Protein-Konzentrationen betrugen 100 ug /l für M. sexta und für Bt2-H. virescens, fürBt3-H. virescens 150 und für Bt73-H. virescens 50 ug /l. Das markierte Toxin wurde mit verschiedenen Mengen unmarkierten Toxins als Wettbewerber kombiniert. Nach einer Brutzeit von 30 Minuten wurde die gebundenen und freien Toxine durch Filtration getrennt.
  • Fig. 1 - 3 zeigen die Prozentwerte der Einbindung der markierten Toxine Bt2, bt3, Bt73 in Abhängigkeit von der Konzentration des Wettbewerbers für Manduca sexta. Fig. 4 - 6 geben diese Daten für Heliothis virescens wieder.Die gebundene Menge ohne Wettbewerber wurde als 100 % Einbindung angenommen. Fig. 1 - 6 zeigen die Einbindung von 125I-markierten Toxinen an die Vesikel der Borstengrenzmembranen von M. sexta (Fig. 1 - 3) und H. virescens (Fig. 4 -6). Die Vesikel wurde mit markiertem Toxin bebrütet (in Fig. 1, 4: 125I-Bt2-Toxin (1,05 nM); in Fig. 2, 5: 125I-Bt3-Toxin (0,8 nM); Fig. 3, 6: 125I.-Bt73-Toxin (1,05 nM)) in der Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen von Bt2 Toxin (*), Bt3 Toxin ( ) oder Bt73 Toxin ( ). Die Einbindung ist ausgedrückt als Prozentwert der gebundenen Menge bezilglich des Bebrütens nur mit markiertem Toxin. Bei M. sexta Vesikeln waren diese Mengen 1.820, 601 und 2383 cpm, bei vesikeln von H. virescens 1.775, 427 und 6.608 cpm für 125I- Bt2, Bt3, bzw. Bt73 Toxin. Unspezifische Einbindungen wurden nicht subtrahiert. Die Daten wurden mit dem LIGAND Computerprogramm analysiert. Jeder Punkt gibt eine Duplikatprobe wieder.
  • Fig. 1: zeigt die Einbindung von 125I-Bt2-Toxin an M. sexta BBMV
  • Fig. 2: zeigt die Einbindung von 125I-Bt3-Toxin an M. sexta BBMV
  • Fig. 3: zeigt die Einbindung von 1251-Bt73-Toxin an M. sexta BBMV
  • Fig. 4: zeigt die Einbindung von 125I-Bt2-Toxin an H. virescens BBMV
  • Fig. 5: zeigt die Einbindung von 125I-Bt3-Toxin an H. virescens BBMV
  • Fig. 6: zeigt die Einbindung von 125I-Bt73-Toxin an H. virescens BBMV
  • Die Folgerungen aus Fig. 1 - 6 sind, daß Bt2 und Bt3, Bt3 und Bt73, Bt2 und Bt73 unter wechselseitiger Beeinflussung eingebundene ICP für Manduca sexta und Heliothis virescens sind. Tatsächlich betrifft Bt3 den gesamten Bestand an Bindestellen für Bt2 in Manduca sexta (Fig. 1): die Prozentanteile an markiertem Bt2, eingebunden in Gegenwart von 100 nM Bt3 entsprechen den Prozentanteilen eingebundenen Bt2 in Gegenwart von 100 nM Bt2 selbst. Das Gegenteil trifft nicht zu: in Gegenwart von 100 nM Bt2 werden die Prozentanteile von eingebundenen Bt3 nicht auf denselben Wert reduziert wie in Gegenwart von 100 nM Bt3 selbst (Fig. 2).
  • Einer ähnlichen Argumentation wird bei der Beobachtung der Beeinflussung der anderen Toxinkombinationen gefolgt: Bt3 betrifft den gesamten Bestand an Bindestellen für Bt 73 (Fig. 3) bei M. sexta; das Gegenteil trifft nicht zu (Fig. 2); Bt2 und Bt73 betreffen den gesamten gegenseitigen Bestand an Bindestellen in M. sexta (Fig. 1, 3).
  • Bei Heliothis virescens: Bt2 betrifft den gesamten Bestand an Bindestellen für Bt3 (Fig. 5); Bt73 betrifft den gesamten Bestand an Bindestellen für Bt3 (Fig. 5); Bt73 betrifft den gesamten Bestand an Bindestellen für Bt2 (Fig. 4); aber die gegenteiligen Aussagen treffen nicht zu (Fig. 4 -6).
  • Dieselben Daten können in einer mathematischen Analyse (z.B. Scatchard-Analyse nach Scatchard, 1949; Analyse mit dem LIGAND Computerprogramm nach Munson und Rodband, 1980) verwendet werden, um die Dissoziationskonstante (Kd) des Toxin-Rezeptor- Komplexes und die Konzentration der Bindestellen (Rt) zu errechnen; die Ergebnisse dieser Berechnungen unter Verwendung des LIGAND Computerprograinins waren die folgenden:
  • Bt2-M. sexta : Kd = 0,4 nM Rt = 3,4 pmol/mg Vesikel- Protein
  • Bt3-M. sexta : Kd = 1,5 nM Rt = 9,8 pmol/mg Vesikel- Protein
  • Bt2-M. sexta : Kd = 0,4 nM Rt = 4,0 pmol/mg Vesikel- Protein
  • Bt2-H. Virescens: Kd = 0,6 nM Rt = 9,7 pmol/mg Vesikel -Protein
  • Bt2-H. Virescens: Kd = 1,2 nM Rt = 3,7 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt2-H. Virescens: Kd = 0,8 nM Rt = 19,5 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Diese Daten zeigen die hohe Affinität der Rezeptorbindung der Toxine (Kd im Bereich von 10E-10 bis 10E-9 M).
    • Einbinden von Bt2 und Bt14 Toxinen an BBMV von P. brassicae, Pultella xylostella und Phtorimaea operculella: ein Beispiel von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen Lepidopteran ICP's
  • B2 und Bt14 Toxine sind toxisch für P. brassicae (pb), P. xylostella (px) und P. operculella (po), wie aus untenstehender Tabelle hervorgeht: LC50 der Toxine
  • Die LC50-Werte von gelösten, gereinigten Bt2 und Bt14 Toxinen für px sind als ng Protein je cm2 der künstlichen Ernährung ausgedrückt. Die LC50-Werte von pb sind als ug 2 Toxin je ml Lösung, in die Laubstücke getaucht worden sind, mit den erste Instar-pb-Larven gefüttert worden sind. Die LC50-Werte von po sind in ug /ml ausgedrückt, in die Kartoffelscheiben vor dem Füttern getaucht worden sind.
  • Markiertes Bt2 Toxin (1,05 nM) oder Bt14 Toxin (1,4 nM) wurde mit BBMV von P. brassicae (100 ug Protein/ml) in einem Volumen von 0,1 ml in Kombination mit verschiedenen Mengen von unmarkiertem Bt2 oder Bt14 bebrütet. Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei 22ºC wurde die gebundenen und freien Toxine getrennt.
  • Fig. 7, 8 zeigen das Einbinden von 125I-markierten Toxinen an die Vesikel der Borstengrenzmembranen von P. brassicae. Die Vesikel wurden mit markiertem Toxin (Fig. 7: 125I-Bt2-Toxin (1,05 nM); Fig. 8: 125I-Bt14-Toxin (1,4 nM)) in Gegenwart zunehmender Konzentrationen von Bt2 Toxin (o) oder Bt14 Toxin ( ) bebrütet. Die Einbindung ist ausgedrückt als Prozentwert der gebundenen Menge bezüglich des Bebrütens nur mit markiertem Toxin. Unspezifische Einbindungen wurden nicht subtrahiert. Die Daten wurden mit dem LIGAND Computerprogramm analysiert. Jeder Punkt gibt eine Duplikatprobe wieder. Fig. 7 zeigt die Einbindung von markierten Bt2 Toxin an BBMV von P. brassicae, und Fig. 8 zeigt die Einbindung von markierten Bt14 Toxin an BBMV von P. brassicae,
  • Die Vergleichsdaten zeigen, daß sowohl eine hohe Affinität der Rezeptorbindung für Bt2 und Bt14 vorliegt als auch praktisch keine gegenseitige Beeinflussung des Bt14 zum Bt2 und des Bt2 zum Bt14 bezüglich der Bindestellen vorliegt. Dies zeigt, daß Bt2 und Bt14 ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene Toxine sind. Sie sind daher nützlich, um die Entwicklung von Resistenz von Pieris brassicae gegen B. thuringiensis ICP's zu verhindern, die in Brassica sp. ausgebildet sind.
  • Die aus diesem Experimenten berechneten Werte für Kd und Rt waren:
  • Bt2: Kd = 2,8 nM, Rt = 12,9 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt14: Kd = 8,4 nM, Rt = 21,4 pmol/mg Vesikel-Protein
    • Einbinden von Bt2 und Bt15 Toxinen an BBMV von M.sexta, M. brassicae, P. xylostella und P. interpunctella: ein Beispiel von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eigebundenen Lepidopteran ICP's
  • Bt2 und Bt15 Toxine sind toxisch für M. sexta (LC50 von 20 bzw. 111 ng/cm2). Sie zeigen auch Wirkung gegen M. brassicae, P. xylostella und P. interpunctella.
  • Markiertes Bt2 Toxin (1,05 nM) oder Bt15 Toxin (0,7 nM) wurde mit BBMV von M. sexta (100 ug protein/ml) in einem Volumen von 0,1 ml in Kombination mit verschiedenen Mengen von unmarkiertem Bt2 oder Bt15 bebrütet. Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei 22ºC wurden die gebundenen und freien Toxine getrennt.
  • Fig. 9, 10 zeigen das Einbinden von 125I-markierten Toxinen an die Vesikel der Borstengrenzmembranen von M. sexta . Die Vesikel wurden mit markiertem Toxin (Fig. 9: 125I-Bt2-Toxin (1,05 nM); Fig. 10: 125I-Bt15-Toxin (0,7 nM)) in Gegenwart zunehmender Konzentrationen von Bt2 Toxin (o) oder Bt15 Toxin ( ) bebrütet. Die Einbindung ist ausgedrückt als Prozentwert der gebundenen Menge bezüglich des Bebrütens nur mit markiertem Toxin. Unspezifische Einbindungen wurden nicht subtrahiert. Die Daten wurden mit dem LIGAND Computerprogramm analysiert. Jeder Punkt gibt eine Duplikatprobe wieder. Fig. 9 zeigt die Einbindung von markierten Bt2 Toxin an BBMV von M. sexta und Fig. 10 zeigt die Einbindung von markierten Bt15 Toxin an BBMV von M. sexta,
  • Die Vergleichsdaten zeigen, daß sowohl eine hohe Affinität der Rezeptorbindung für Bt2 und Bt15 vorliegt als auch praktisch keine gegenseitige Beeinflussung des Bt15 zum Bt2 und des Bt2 zum Bt15 bezüglich der Bindestellen vorliegt. Dies zeigt, daß Bt2 und Bt15 ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene Toxine sind. Sie sind daher nützlich, um die Entwicklung von Resistenz von M. sexta gegen B. thuringiensis ICP's zu verhindern, die in Tabak oder anderen Körnern ausgebildet sind und bei den Manduca sp. eine Plage sind.
  • Die berechneten Werte für Kd und Rt waren:
  • Bt2: Kd = 0,4 nM,Rt = 3,4 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt15: Kd 1= 0,3 nM, Rt 1 = 5,9 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt15: Kd 2= 2,9 nM, Rt 2 = 6,7 pmol/mg Vesikel-Protein
  • (Es gibt zwei hohe Affinitäten der Rezeptorbindung)
  • Ähnliche studien wurden für M. brassicae, S. littoralis und P. interpunctella durchgeführt.Obwohl sich die LC50-Werte, die Kd und Rt-Werte deutlich unterscheiden, ist die wesentliche Beobachtung, daß Bt2 und Bt15 Toxine toxische und ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene Toxine für diese drei lnsektenarten sind, bestätigt worden. Dies ist daher auch eine nützliche Kombination von Toxinen, um die Resistenzentwicklung von M. brassicae gegen ICP'S oder von Spodoptera Spezien gegen ICP's zu verhindern, die in einer der Kornpflanzen auftreten, bei den Spodoptera eine Plage ist.
    • Einbinden von Bt2 und Bt4 Toxinen an BBMV von M. sexta: ein Beispiel von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eigebundenen Lepidopteran ICP's
  • Sowohl Bt2 als auch Bt14 Toxine sind toxisch für Manduca sexta. Die LC50-Werte sind 20 bzw 5,4 ng/cm2. Es trat keine chselseitige Beeinflussung von Bt2 und markiertem Bt4 und umgekehrt auf, was zeigt, daß Bt2 und Bt14 ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene Toxine sind.
    • Einbinden von Bt15 und Bt18 Toxinen an BBMV von S. littoralis ein Beispiel von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eigebundenen Lepidopteran ICP'S
  • Sowohl Bt15 als auch Bt18 Toxine sind toxisch für S. littoralis. Die LC50-Werte sind 93 bzw 88 ng Toxin /cm2. Markiertes Bt15 (0,7 nM) oder Bt18 (0,9 nM) wurde mit 100 ug Vesikel-Proteln von S. littoralis.in Kombination mit verschiedenen Mengen von unmarkiertem Bt15 oder Bt18 bebrütet. Nach einer Brutzeit von 45 Minuten wurden die gebundenen und freien Toxine getrennt. Die Bindungsdaten zeigen, daß eine hohe Affinität der Rezeptorbindung für Bt2 und Bt15 zu BBMV von S. littoralis vorliegt. Wie aus den Fig. 11, 12 hervorgeht, konnte der Gesamtbestand von Bindestellen für Bt15 nicht mit Bt18 gesättigt werden, noch der Gesamtbestand von Bindestellen für Bt18 mit Bt15.
    • Einbinden von Bt13 und Bt22 Toxinen an BBMV von L. decemlineata: ein Beispiel von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eigebundenen Coleopteran ICP's
  • Sowohl Bt13 als auch Bt33 Toxine sind toxisch für L. decemlineata. Die LC50-Werte sind 0,8 bzw 1,1 ug Toxin /ml. Markiertes Bt13 (1 nM) oder Bt22 (0,7 nM) wurde mit 100 ug von Vesikel.Protein von L. decemlineata.in Kombination mit verschiedenen Mengen von unmarkiertem Bt13 oder Bt33 bebrütet. Nach einer Brutzeit von 45 Minuten wurden die gebundenen und freien Toxine getrennt. Die Bindungsdaten zeigen, daß eine hohe Affinität der Rezeptorbindung für Bt13 und Bt22 zu BBMV von L. decemlineata vorliegt. Der Gesamtbestand von Bindestellen für Bt13 konnte nicht mit Bt22 gesättigt werden, noch der Gesamtbestand von Bindestellen für Bt22 mit Bt13.
    • Einbinden von Bt2 und Bt18 Toxinen an BBMV von M. sexta: ein Beispiel von zwei ohne wechselseitige Beeinflussung eigebundenen Coleopteran ICP's
  • Sowohl Bt2 als auch Bt18 Toxine sind toxisch für M. sexta. Die LC50-Werte sind 20 bzw 73 ng Toxin /cm2 Markiertes Bt2 (1,05 nM) oder Bt18 (0,7 nM) wurde mit 100 ug von Vesikel.Protein von M. sexta..in Kombination mit verschiedenen Mengen von unmarkiertem Bt2 oder Bt18 bebrütet. Nach einer Brutzeit von 45 Minuten wurden die gebundenen und freien Toxine getrennt. Die Bindungsdaten (Fig. 11, 12) zeigen, daß eine hohe Affinität der Rezeptorbindung für Bt2 und Bt18 zu BBMV von M. sexta vorliegt. Der Gesamtbestand von Bindestellen für Bt2 konnte nicht mit Bt18 gesättigt werden, noch der Gesamtbestand von Bindestellen für Bt18 mit Bt2.
  • Berechnete Kd und Rt-Werte sind:
  • Bt2: Kd = 0,4 nM, Rt = 3,4 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt18: Kd 1= 0,04 nM, Rt 1 = 2,2 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt18: Kd 2= 168 nM, Rt 2 = 194 pmol/mg Vesikel-Protein
  • (Es gibt zwei hohe Affinitäten der Rezeptorbindung)
  • In der untenstehenden Liste sind die ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenen anti-Lepidoptera ICP-Kombinationen und anti-Coleoptera ICP-Kombinationen zusammen mit den gemeinsamen Zielinsektenspezien aufgeführt, bei denen die wechselseitige Beeinflussung nachweislich nicht stattfindet:
  • Bt2 - Bt15: Manduca sexta, Plutella xylostella, Pieris brassicae, Mamestra brassicae, Plodia interpunctella
  • Bt2 - Bt18: Manduca sexta, Spodoptera littoralis
  • Bt2 - Bt18: Pieris brassicae, Plutella xylostella, Phtorimaea operculella
  • Bt2 - Bt4: Manduca sexta
  • Bt15 - Bt18: Manduca sexta, Spodoptera littoralis
  • Bt14 - Bt15: Pieris brassicae
  • Bt 15 - Bt4: Manduca sexta, Spodoptera exigua
  • Bt18 - Bt4: Manduca sexta Spodoptera littoralis
  • Bt18 - Bt14: Pieris brassicae
  • Bt18 - Bt4: Manduca sexta,
  • Bt13 - Bt21: Leptinotarsa decemlineata
  • Bt13 - Bt22: Leptinotarsa decemlineata
  • Bt21 - Bt22: Leptinotarsa decemlineata
  • Selbstverständlich ist diese Aufzählung bestimmter ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundener ICP-Kombinationen nicht vollständig, und es wird angenommen, daß weitere derartige ICP-Kombinationen gefunden werden werden, darunter auch Kombinationen für bisher unbekannte ICP'S, die einen ähnlichen Ansatz für beliebige Zielinsektenspezien erlauben. Daher ist die obenstehende Aufzählung der Zielinsektenspezien ebenfalls nicht vollständig, und es wird angenommen, daß andere Zielinsektenplagen (ebenso wie Pflanzen, die verändert werden müssen, um dem Angriff derartige Plagen vorzubeugen) unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes gefunden werden werden, gegen die eine bestimmte Kombinationen von ICP's eingesetzt werden kann (z.B. die Kombination von Bt2 und Bt14 ICP's in Brassica, um die Resistenzentwicklung von Pieris brassicae gegen die in der Pflanze ausgebildeten ICP's zu verhindern.
    • BEISPIEL 7: Resistenz-Selektion bei Manduca sexta (Tabak Hornwurm)
  • Ein Selektionsexperiment beinhaltet das Aussetzen einer großen Anzahl von Larven einer Konzentration eines Toxins bei einer Ernährung, die z.B. 50 - 70 % der Larven tötet. Die überlebenden Larven werden wieder Toxinkonzentrationen ausgesetzt, die einen ähnlichen Anteil der Larven töten, und dieses Verfahren wird mehrere Generationen lang fortgesetzt. Die Empfindlichkeit der Larven gegenüber dem Toxin wird alle vier Selektionsgenerationen gemessen.
  • Selektionen für 20 Generationen von M. sexta wurde allein mit Bt2 und Bt18 Toxin und einer 1 zu 4 Gewichtsmischung von Bt2/Bt18 durchgeführt. Die LC50-Werte des Referenzstammes waren 20, 73 bzw. 62 ng/cm2 der Ernährung.
  • Die Selektion wurde mit Konzentrationen begonnen, die etwa 75% der Larven töteten. Nach vier Selektionsgenerationen stieg die Überlebensrate bei der Verwendung von reinem Bt2 oder Bt18 auf ca. 70% an, während keine derartige Zunahme bei der Kombination von Bt2 und Bt18 beobachtet wurde. Die Dosierung wurde wieder auf die berechneten LC75-Werte angehoben. Dies wurde alle vier Generationen durchgeführt. Der Selektionsprozess wurde so bis zur 20. Generation fortgesetzt. Die Endresultate waren die folgenden (LCSO-Werte der 20. Generation):
  • Bt2-Selektion: LC50-Wert von 6.400 ug /g (Sensitivitätsabnahme um Faktor 320)
  • Bt18-Selektion: LC50-Wert von 15.100 ug /g (Sensitivitätsabnahme um Faktor 207)
  • Bt2/Bt18-Selektion: LC50-Wert von 181 ug /g (Sensitivitätsabnahme um Faktor 3)
  • Die Abnahme der sensitivität im kombinierten Selektionsexperiment war etwa um den Faktor 100 geringer.
  • Es wurde die Rezeptorbindung in den drei ausgewählten M. sexta Stämmen mit Bt2 und Bt18 untersucht und mit den Referenzstamm von M. sexta verglichen (kein ausgewählter Stamm). Die Bindungscharakteristiken des Referenzstamms für die Bt2 und Bt18 Toxine waren:
  • Bt2: Kd = 0,4 nM, Rt = 3,4 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt18: Kd 1 = 0,04 nM, Rt 1 = 2,2 pmol/mg Vesikel-Protein
  • Bt18: Kd 2 = 168 nM, Rt 2 = 194 pmol/mg Vesikel-Protein
  • (Es gibt zwei hohe Affinitäten der Rezeptorbindung für Bt18)
  • Fig. 11, 12 zeigen die Einbindung von 125I-markierten Toxinen an die Vesikel der Grenzmembranen von M. sexta. Die Vesikel wurden mit dem markierten Toxin (Fig. 11: 125I-Bt2-Toxin (1,05 nM); Fig. 12: 125I-Bt18-Toxin (0,7 nM))in Gegenwart zunehmender Konzentrationen von Bt2 Toxin (o) oder Bt18 Toxin () bebrütet.Die Einbindung ist ausgedrückt als Prozentwert der gebundenen Menge bezüglich des Bebrütens nur mit markiertem Toxin. Unspezifische Einbindungen wurden nicht subtrahiert. Die Daten wurden mit dem LIGAND Computerprogramm analysiert. Jeder Punkt gibt eine Duplikatprobe wieder.
  • Der Bt2 selektierte Stamm zeigt keine auffindbare hohe Bindungsaffinität von Bt2, während die Bt18 Bindungscharakteristiken in der Nähe von denen des Referenzstammes lagen (Bt18: Kd1 = 0,03 nM, Rt1 = 2,8 pmol/mg Vesikel-Protein und Kd2 = 199 nM, Rt2 = 109 pmol/mg Vesikel- Protein. Es gibt immer noch zwei hohe Affinitäten der ezeptorbindung für Bt18).
  • Der Bt18 selektierte Stamm verlor die hohe Bindungsaffinität für Bt18. Die geringere Affinität für Bt18 war noch in geringerer Konzentration als im Referenzstamm (Kd 169 nM, Rt = 43 nM) vorhanden. Die Konzentration der Bt2 Bindestellen nahm deutlich gegenüber dem Referenzstamm zu.(Kd = 0,4nM, Rt = 20,8 pmol/mg Vesikel-Protein). Dieser Stamm wies eine Bt2 Empfindlichkeit von LC50 = 4 ng/cm2 auf. Damit hat seine Empfindlichkeit gegenüber dem Referenzstamm zugenommen (LC50 = 20 ng/cm2).
  • Der Bt2/Bt18 selektierte Stamm zeigte eine geringe, aber statistisch nicht aussagekräftige Abnahme der Konzentration der Bt18 Bindestellen. (Bt2: Kd = 0,4 nM, Rt = 3,4 pmol/mg Vesikel- Protein, Bt18: Kd 1=0,04 nM, Rt 1 = 1,0 pmol/mg Vesikel- Protein, Kd 2= 168 nM, Rt 2 = 194 pmol/mg Vesikel-Protein; es gibt zwei hohe Affinitäten der Rezeptorbindung für Bt18). Diese Daten zeigen, daß, wenn in den zwei Selektionslinien Resistenz auftrat, dieser Mechanismus in der Rezeptorenebene stattfand. Veränderungen auf Rezeptorebene scheinen, wie gezeigt, der wahrscheinlichste Mechanismus der Resistenz gegen B. thuringiensis ICP'S zu sein.
    • BEISPIEL 8: Resistenzmechanismus der Diamantrückenmotte zu dem mikroben-insektiziden Bacillus thuringiensis
  • Der Mechanismus der Resistenzentwicklung von Insekten gegen ICP's wurde in einem P. xylostella Stamm ("PxR") untersucht. Dieser Insektenstamm hat im Feldversuch eine hohe Resistenz gegen Dipel entwickelt. Kristalle von Dipelpräparaten enthalten eine Mischung von ICP's wie Bt3, Bt2 und Bt73 ICP's; in Beispiel 6 wurde gezeigt, daß dies Toxine mit mit wechselseitiger Beeinflussung eingebufldenen ICP's sind.
  • Die Resistenz gegen Dipel wurde durch Toxizitätsdaten für den empfindlichen Stamm ("PxS") und für den Dipel-resistenten Stamm ("PxR") bestätigt. Hohe Resistenzlevel wurden auch gegen das Bt2 Protoxin und Toxin festgestellt, wie in der folgenden Tabelle gezeigt wird: LC50 der Stämme
  • Die LCSO-Werte sind in ng Protein je cm2 der künstlichen Ernährung angegeben.
  • Die toxischen Daten der Insekten zeigen allerdings, daß keine Resistenz gegen Bt15 Protoxin und Toxin vorliegt; dieses ICP ist in Dipel nicht enthalten. Um zu erforschen, ob eine Änderung in der Bindung zwischen Toxin und Membran für die Resistenz verantwortlich ist, wurden Rezeptor-Einbindestudien mit markiertem 125I-Bt2 und 125I-Bt15 Toxin mit as dem Erbgut von Larven von PxS und PxR entnommenen BBMV durchgeführt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1: Bindungscharakteristiken von Bt2 und Bt15 Toxinen und die Vesikel der Borstengrenzmembranen von empfindlicher und resistenter P. xylostella: Bt2 Toxin Bt15 Toxin Stamm keine Einbindung erfaßbar Rt (pmol/mg Protein)
  • Tabelle 1 zeigt, daß eine gesättigte Bindung mit hoher Affinität des Bt2 Toxins an die Membranen des Erbguts des PxS- Stammes aufgetreten ist, der PxR-Stamm aber keine meßbare Menge der Einbindung von Bt2 Toxin aufweist. Beim Bt15 Toxin traten deutliche Einbindungen bei PxR und PxS-Stämmen auf, und die Werte für beide Stämme unterscheiden sich nicht wesentlich.
  • Diese Daten zeigen, daß die Resistenz von P. xylostella auf einer Änderung in der Toxin-Membran-Bindung beruht. Die Resistenz gegen das Bt2 Toxin die Empfindlichkeit gegenüber dem Bt15 Toxin des PxR-Stammes spiegeln sich in den in Tabelle 1 gezeigten Bindungscharakteristiken.
  • Wenn also verschiedene ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundene ICP's (z.B. Bt2 und Bt15) mit Aktivität gegen dieselbe Insektenspezies (z.B. P. xylostella) vorhanden sind, impliziert die Resistenz gegen ein ICP (Bt2) nicht die Resistenz gegen andere ICP's (wie Bt15). Daher können ICP's mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften im Kombination benutzt werden, um die Entwicklung der Resistenz von Insekten gegen ICP'S zu verlangsamen.
    • BEISPIEL 9: Separater Transfer von zwei ICP Genen innerhalb individueller Transcriptaseeinheiten in das Genom von Pflanzenzellen
  • Es werden zwei Verfahren zur kombinierten Ausbildung von zwei ICP Genen wie das bt2 und bt15 Gen in transgenen Pflanzen wie Tomaten ins Auge gefaßt. Diese Verfahren beruhen auf dem Transfer von zwei ICP Chimären-Genen, die nicht innerhalb desselben DNA-Fragment verbunden sind, in das Genom einer Pflanze von Interesse.
  • Ein erstes Verfahren beruht auf einer schrittweisen Transformation, bei der eine Pflanze, die bereits durch ein erstes ICP Gen transformiert ist, zurücktransformiert wird, um ein zweites ICP Gen einzuführen. Die schrittweise Transformation verwendet zwei verschiedene wählbare Markierungsgene, wie die Resistenzgene gegen Kanamycin ("km") und Phospinotricin-Acetyl-Tansferase ("PPT"), das Resistenz gegen Phospinotricin bewirkt. Der Einsatz beider auswählbarer Markierer wurde von De Block et al., 1987 beschrieben.
  • Das zweite Verfahren beruht auf der Kotransformation von zwei ICP Chimären-Genen auf unterschiedlichen Plasmiden in einem einzigen Schritt. Die Integration beider ICP Gene kann durch Verwendung der beiden Markierer, die Resistenz gegen Km und PPT bewirken und mit dem jeweiligen ICP Gen verbunden sind, ausgesucht werden.
  • Für jedes Verfahren wird ein Ti-Plasmid-Vektor für Agrobacterium-gesteuerte Transformation jedes ICP Chimären-Gens in die Pflanzenzellen verwendet.
  • Plasmid pGSH163, beschrieben in der EP 0 193 259, enthält die folgenden Chimären-Gene zwischen den T-DNA Wiederholgrenzen: ein Genfragment, das den toxischen Teil des bt2 Gens unter der Kontrolle des TR2' Promoters verschlüsselt und ein neo Gen unter der Kontrolle eines TR1' Promoters. Die 3' Enden des T- DNA Gens 7 bzw. der octopin-Synthase enthalten Information für die 3' Endbildung der Transcripte.
  • Ein bt15 Chiniären-Gen, das ein Genfragment enthält, das das Toxin des Bt15 ICP unter der Kontrolle eines TR2' Promoters verschlüsselt, wurde wie folgt konstruiert (Fig. 15). pOH50 besteht aus pUC18, wobei das gesamte bt15 Gen der Kontrolle des Lac Promoters untersteht. Ein HindIII-BglII Fragment wurde in pMa5-8 unter Einbeziehen von pJB3 geklont. Durch seitengesteuerte Mutagenese wurde am Anfangscodon zum Einbeziehen von pVE29 eine NcoI stelle gebildet. Ein Fragment, das das verstümmelte Genfragment des bt15 Gens mit einem übersetzenden stopcodon enthält, wurde durch Isolation von BclI-ClaI aus pOH50 und Klonen in pLK91 unter Einbeziehen von pHW38 gewonnen. Das gesamte Fragment des Toxingens wurde unter der Kontrolle des Tac Promoters rekonstruiert, wobei pVE35 einbezogen wurde durch Einbinden eines ClaI-PstI Fragments von pHW38, eines NcoI-ClaI Fragments von pVE29 und eines NcoI-PstI Fragments von pOH48. Ein verstümmeltes bt15 Genfragment mit einer NcoI Stelle am Anfangscodon wurde aus pVE 35 als ein 1980 NcoI-BamHI Fragment gewonnen und in pGSJ141 geklont und mit ClaI und BamHI gesättigt. PGSJ141 wurde in der EP Anmeldung 88 402 115.5 beschrieben. Die Bindung der gefüllten ClaI stelle an die gefüllte NcoI Stelle band eine chimärisches TR'- verstümmeltes bt15 - 3'g7 Konstruktion (pTVE47). Aus Markierer in diesem Plasmid wurde das Bar - Gen, das Phospinotricin-Acetyl- Tansferase verschlüsselt und Resistenz gegen PPT vermittelt, verwendet. Ein Chimären-Bargen, das das Bargen unter der Kontrolle des 355 Promoters enthält und vom 3' Ende der Octopin Synthase gefolgt ist, wurde in pTVE47 eingeführt. Aus pDE110, wurde ein 35S-Bar-3'ocs Fragment als StuI-HindIII Fragment erhalten und in mit PstI und HindIII gesättigtem pTVE47 geklont. Dies verband das Plasmid pTHW88 (Fig. 15), das das verstümmelte bt15 Gen unter der Kontrolle des TR2' Promoters enthält, und das Stangengen unter der Kontrolle des 355 Promoters zwischen den T-DNA Wiederholgrenzen. Plasmid pGSH163 ist ein Ti-Plasmid Vektor der Cointegrationsart, während pTHW88 ein in der EP 0 193 259 beschriebener Binärtyp Ti-Plasmid Vektor ist.
  • Beide plasmide wurden im A. tumefaciens Stamm C58C1Rif (pGV2260) nach Deblaere et al., 1988) mobilisiert. In dem schrittweisen Transformationsverfahren, wurden Tomaten nach De Block et al., 1987 verändert, wobei der A. tumefaciens Stamm C58C1Rif pGS1163 trugt, das aus der Kointegration von pGSH163 und pGV2260 stammt. Individuelle Transformanten wurden für die Kanamycin Resistenz gewählt, und die regenerierten Pflanzen wurden durch Ausbildung des verstümmelten bt2 Gens nach Vaeck et al., 1987 gekennzeichnet. Ein repräsentativer Transformant wurde danach rücktransformiert mit dem A. tumefaciens Stamm C58C1Rif (pGV2260 und pTHW88, und die Transformanten wurden auf PPT-Resistenz getestet. Unter Verwendung dieses Kotransformationsverfahrens wurden die jeweiligen Agrobakterium-Stämme, die den kointegrierten Vektor pGS1163 und den binären Vektor pTHW88 tragen, zur Veränderung von Tomaten verwendet. Einzelne Pflanzen wurden auf Resistenz gegen Km und PPT getestet.
  • Fig. 15 zeigt schematisch:
  • a) die Konstruktion von pVE29: ein bt15 N-terminal Genfragment mit einer NcoI Stelle wurde bei einem ATG Anfangscodon eingeschleust
  • b) die Konstruktion von pVE35: ein bt15 C-terminal verstümmeltes Genfragment unter der Kontrolle des Tac Promoters
  • c) die Konstruktion von pTHW88: ein binärer T-DNA Vektor mit einem bt15 Chimären-Gen und einen Chimären-Stangengen innerhalb der Wiederholgrenzen der T-DNA
  • In beiden Fällen wurde die gemeinsame Ausbildung der beiden ICP Gene in den einzelnen Transformaten durch Toxizitätstests an Insekten wie in der EP 0 193 259 und mit biochemischen Mitteln untersucht. Spezifische RNA Proben erlaubten die quantitative Analyse der Transcriptebene; monoclonaler Antikörper, die mit den jeweiligen Genprodukten reagieren, erlaubten die quantitative Analyse der jeweiligen Genprodukte in ELISA Tests (EP 0 193 259); und spezifische DNA Proben erlaubten eine Charakterisierung des Einfügungen der bt2 und bt15 Gene im Genom der Transformanten. Es wurde festgestellt, daß die veränderten Tomatenpflanzen gleichzeitig das bt2 Gen (8,1 ng/mg) und das bt15 Gen (7,6 ng/mg) wie von ELISA gemessen ausbilden, was die Resistenzentwicklung von M. sexta gegen die insektiziden Effekte der ausgebildeten Bt2 und Bt15 Toxine verhindern oder verlangsamen würde.
  • Diese Verfahren könnten auch angewandt werden, wenn eines oder beide ICP Gen Teil eines Hybridgens sind. Es könnte beispielsweise der oben beschrieben Strategie mit den Plasmid- Vektoren pGSH152, der ein verstümmeltes bt2 - neo Chimären- Hybird-Gen unter Kontrolle des TR2' Promoters trägt, und pTHW88 in geeigneten Agrobacterium-Stämmen gefolgt werden.
    • BEISPIEL 10: Getrennter Transfer von zwei ICP Genen in das nukleare Genom verschiedener Pflanzen in unabhängigen Transformationsschritten und anschließende Kombination in einer einzigen Pflanze durch Kreuzen
  • Tabakpflanzen wurden entweder mit dem bt18 Gen oder dem bt15 Gen verändert, wobei dieselben Klonverfahren angewendet worden sind, die in der EP 0 358 557 bzw. der EP0 193 259 beschrieben worden sind. Für beide Gene wurden die Pflanzen mit Vektoren zur Ausbildung der Pflanzen verändert, die entweder ein verstümmeltes bt15 Gen oder bt18 Gen, die nur das BT15 oder Bt18 Toxin verschlüsseln, enthielten.
  • Die Sterblichkeitsrate von Spodoptera littoralis Larven, die mit den veränderten Pflanzen gefüttert wurden, ist deutlich höher als von mit unveränderten Pflanzen gefütterten Larven.
  • Die bt18 veränderte Pflanze, die bezüglich des bt18 Gens homozygotisch ist, wird dann mit der bt15 veränderten Pflanze gekreuzt, die homozygotisch bezüglich des bt15 Gens ist. Nach der Selbstbefruchtung ist eine Pflanze erreicht, die homozygotisch für beide Gene ist.
  • Die entstandenen Tabakpflanzen, die sowohl das bt15 als auch das bt15 Gen ausbilden, verlangsamen deutlich die Entwicklung von Resistenz von S. littoralis gegen das von den Pflanzen ausgebildete Bt15 oder BT1 Toxin.
    • BEISPIEL 11: Transfer zweier ICP Chimären-Gene, die in dieselbe DNA eingebunden sind, in das Genom von Pflanzenzellen
  • Die verwendete Strategie beruht auf der Organisation von zwei unabhängigen ICP Chimären-Gene zwischen den T-DNA Wiederholgrenzen eines einzigen Vektors. Einbindestudien zeigen, daß die Bt2 und Bt14 Toxine zwei ohne wechelseitige Beeinflussung eingebundene ICP's mit insektizider Wirkung gegen Pieris brassicae sind. Zur Ausbildung in Pflanzen können die beiden bt2 und bt14 Gene gemeinsam ausgebildet werden, um die Resistenzentwicklung der Insekten zu verhindern.
  • Zum Aufbau eines Plasmid-Vektors, wobei jedes ICP der Kontrolle eines eigenen Promoters untersteht, können zwei Möglichkeiten ins Auge gefaßt werden:
  • 1) drei Chimären-Konstruktionen, die die verstümmelten bt2 und bt14 Gene sowie eine wählbaren Markierer enthalten; oder
  • 2) es können ein Hybrid eines verstümmelten Genfragments (bt2 oder bt14) und das neo Gen zusammen mit einem verstümmelten bt2 oder bt14 Gen verwendet werden.
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Vektors pTHW94 zur Veränderung vn Pflanzen, der die folgenden ICP Chimären- Gene zwischen den T-DNA Wiederholgrenzen trägt: ein verstümmeltes bt2 Genfragment unter der Kontrolle des TR2' Promoters und ein hybrides, verstümmeltes bt14 - neo Gen unter der Kontrolle des TR1' Promoters. Das 3'- Ende des T-DNA Gens 7 bzw der Octopin-Synthase geben Information für eine saubere 3' Endbildung. pTHW94 ist beim DSM unter der Nummer 55114 am "8. August 1989 hinterlegt worden.
  • Schematisch in Fig. 16 werden gezeigt:
  • a) die Konstruktion von pHW44: ein bt14 N-terminal Genfragment mit einer NcoI Stelle wird bei einem ATG Anfangscodon eingefügt
  • b) die Konstruktion von pHW67; Rekonstruktion des bt14 Gens unter der Kontrolle des Tac Promoters
  • c) die Konstruktion von pHW71: Konstruktion eins hybriden, verstümmelten bt14 - neo Gens unter der Kontrolle des Tac Promoters
  • d) die Konstruktion von pTW94: ein binärer T-DNA Vektor mit einem bt14 Chimären-Gen und einem bt2 Chimären-Gen zwischen den T-DNA Wiederholgrenzen
  • Der pTHW94 Vektor ist in dem Acrobacterium Stamm C58C1Rif (pM90) mobilisiert, der Benutzt wird, um Brassica napus nach dem von De Block et al., 1989 beschriebenen Verfahren zu verändern. Die Transformanten werden nach dem Km-Wert ausgewählt und es wurde in Toxizitätstests an Insekten und biochemischen Tests festgestellt, daß die regenerierten Pflanzen beide ICP Genprodukte ausdrücken.
    • BEISPIEL 12: Ausdrücken von zwei ICP Genen in einer hybriden Konstruktion
  • Um eine gemeinsame und gleichzeitige Ausbildung von zwei ICP Genen zu erhalten, können die verstümmelten Genfragmente, die die toxischen Teile der zwei unterschiedlichen ICP's verschlüsseln, in einem Leserahmen verbunden und als Hybridgen unter der Kontrolle desselben in eine Chimarien-Gen- Konstruktion eingesetzt werden.Die toxischen Kerne bestimmter ICP'S können durch Protease-Aktivierung am N- und/oder C- terminal Ende von ihren Protoxinen befreit werden. So können hybride Gene mit einem oder mehreren Bereichen geschaffen werden, die Stellen zum Spalten von Protease an dem oder den Verbindungspunkten von zwei oder mehr ICP's verschlüsseln.
  • Die gleichzeitige und gemeinsame Ausbildung der bt2 und bt14 Gene wird durch die Konstruktion eines hybriden Gens erreicht, das sich zusammensetzt aus einem verstümmelten bt14 Genfragment, verbunden mit einem verstümmelten bt2 Genfragment. In Fig. 17 wird schematisch die Konstruktion eines derartigen bt2 - bt14 Hybridgens mit einem C-terminal bt2 Genfragment gezeigt, das den toxischen Kern des Bt2 Protoxins verschlüsselt im Rahmen mit einem verstümmelten C-terminal bt14 Genfragment, das den toxischen Kern des Bt14 Protoxins verschlüsselt. Die BclI Stelle im bt2 Gen unterhalb der Trypsin-Trennstelle ist im Rahmen mit der NcoI stelle verbunden, die am N-termial Ende des verstümmelten bt14 Genfragments eingefügt ist. An diesem Ende werden die Plasmide pLBKm860 (EP 0 193 259) und pHW67 benutzt. pLBKm860 enthält ein hybrides bt2 - neo Gen unter der Kontrolle des lambda Pl Promoters. Das bt2 Gen im hybriden Gen ist ein verstümmeltes C-terminal bt2 Genfragment, das in Fig. 17 mit bt860 bezeichnet ist (vgl. auch Vaeck et al., 1987). Die Konstruktion von pHW67 ist in Fig. 16 dargestellt. pHW67 enthält ein verstümmeltes C-terminal bt14 Genfragment (bt14tox) mit einer NcoI Stelle am ATG Anfangscodon, ein Übersetzungsstopcodon an der BcI stelle des intakten bt14 Gens und eine BamHi stelle unterhalb des ganzen Genfragments. Um beide Genfragmente im richtigen Leserahmen zu verbinden, werden die BclI und NcoI Enden der jeweiligen plasmide mit Klenow DNA Polymerase und S1 Nuclease wie in Fig, 16 dargestellt behandelt. Das entstehende Plasmid pJB100 enthält die hybriden bt860 - bt14tox Gene unter Kontrolle des lambda PL promoters und steuert die Ausbildung eines Fusionsproteins in E. coli mit der erwarteten Beweglichkeit auf SDS-PAGE.
  • Rohe Extrakte des E. coli Stamms zeigen die Toxizität des Fusionsproteins, ausgebildet durch den Stamm, gegen P. brassicae. Darüber hinaus ist durch die Analyse der N-terminal Aminosäuresequenzen des Fusionsproteins, das vom E. coli Stamm produziert wurde, bestätigt worden, daß die N-terminal Aminosäuren des Bt14 Protoxins durch Aktivierung erzeugt werden. Das hybride bt2 - bt14 Gen hat also zwei potentielle Protease-Spalt-Stellen.
  • Danach wird dieses hybride Gen in einen Vektor zu veränderung von Pflanzen eingebracht, der Kontrolle eines geeigneten Promoters unterstellt und in das Genom von brassica (EP 0 193 259) verbracht, wo sowohl das bt2 als auch das bt14 Gen in Toxizitätstest an Insekten ausgebildet werden. Tabelle 2 Gen Bt-Stamm Wirkungsbereich verschlüsselte Aminosäuren vorhergesagter MW (kDa) der verschl. Aminosäuren Offenlegung der Nukleotidsequenz Cry B2 HD-1 kurstaki berliner 1175 entomocidus HD-110 HD-68 aizawai darmstadiensis HD-146 Schnepf et al., 1985 Höfte et al., Adang et al., Brizzard und Whiteley 1988 EP-Anmeld. Donovan et al., Widner und Whiteley, 1989
    • REFERENCES
  • - Adang M., Staver M., Rocheleau T., Leighton J., Barker R. and Thompson D. (1985), Gene 36, 289-300.
  • - Angenon et al (1989), Molecular and Cellular Biology 9, 5676-5684.
  • - Barton K., Whiteley H. and Yang N.-S. (1987), Plant Physiol. 85, 1103-1109.
  • - Bernard H., Remaut E., Hersfield H., Das H., Helinski D., Yanofski C. and Franklin N. (1979), Gene 5, 59-76.
  • - Bell R. and Joachim F. (1976), Ann. Entomol. Soc. Am. 69, 365-373.
  • - Botterman J. and Zabeau H. (1987), DNA 6, 583-591.
  • - Bradford M. (1976), Anal. Biochem. 72, 248-254.
  • - Brattsten L., Holyoke C., Leeper J. and Raffa K. (1986), Science 231, 1255-1260.
  • - Brizzard B. and Whiteley H. (1988), Nucleic Acids Research 16, 4168-4169.
  • - Deblaere R., Reynaerts A., Höfte H., Hernalsteens J-P, Leemans J. and Van Montagu H. (1988), Methods in Enzymol. 153, 277-292.
  • - De Block M., Botterman J., Vandewiele M., Dockx J., Thoen, Gosselé V., Rao Movva, Thompson C., Van Montagu M. and Leemans J. (1987), EMBO J. 6, 2513-2518.
  • - De Block et al (1989), Plant Physiology 91, 694-701.
  • - De Boer H., Comstock L. and Vasser M. (1983), Proc. Natl. Acad. sci. USA 80, 21-25.
  • - de Framond A., Back E., Chilton w., Kayes L. and Chilton H-D (1986), Mol. Gen. Genet. 202, 125-131.
  • - De Greve et al (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511.
  • - De La Pena and Schell (1986), Nature 325, 274-276.
  • - Delauney A., Tabaeizadeh Z. and Verma D. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4300-4304.
  • - Depicker A., Herman L., Jacobs A.,Schell J. and Van Montagu M. (1985), Mol. Gen. Genet. 201, 477-484.
  • - Donovan W., Dankoscik C. and Gilbert W. (1988), J. Bacteriol. 170, 4732-4738.
  • - Dulmage H.T and cooperators (1981), In : Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980 (Ed. H.D. Burges), Academic Press, 193-222.
  • - Finney D. (1962), Probit Analysis (University Press, Camridge), pp. 50-80.
  • - Fischhoff D., Bowdish K., Perlak F., Marrone P., McCormick S., Niedermeyer J., Dean D., Kuzano-Kretzmer K., Mayer E., Rochester D., Rogers S. and Fraley R. (1987), Bio/Technalogy 5, 807-812.
  • - Franck, Guilley, Jonard, Richards and Hirth (1980), Cell 21, 285-294.
  • - French B., Maul H. and Maul G. (1986), Anal. Biochem. 156, 417-423.
  • - Fuller F. (1982), Gene 19, 43-54.
  • - Gardner, Howarth, Hahn, Brown-Luedi, Shepard and Messing, Nucl. Acids Res. 9, 2871-2887.
  • - Goldberg L. and Margalit J. (1977), Mosq. News 37, 355-358.
  • - Goldman I., Arnold J. and Carlton B. (1986), J. Invert. Pathol. 47, 317-324.
  • - Gould F. (1988), Bioscience 38, 26-33.
  • - Haider H., Knowles B. and Ellar D. (1986), Eur. J. Biochem. 156, 531-540.
  • - Herrera-Estrella (1983) Nature 303, 209-213.
  • - Hofmann C., Lüthy P., Hütter R. and Pliska V. (1988a), Eur. J. Biochem. 173, 85-91.
  • - Hofmann C., Vanderbruggen H., Höfte H., Van Rie J., Jansens s. and Van Mellaert H. (1988b), Proc. Natl. Acad. sci. USA 85, 7344-7848.
  • - Höfte H., Van Rie J., Jansens S., Van Houtven A., Verbruggen H. and Vaeck H. (1988), Appl. Environ. Microbiol. 54, 2010-2017.
  • - Höfte H., De Greve H., Seurinck J., Jansens S., Mahillon J., Ampe C., Vanderkerkhove J., Vanderbruggen H., Van Montagu M., Zabeau M. and Vaeck H. (1987), Eur. J. Biochem. 161, 273-280.
  • - Höfte H. and Whiteley H.R. (1989), Microbiological Reviews 53, 242-255.
  • - Hsiung H. and Becker G. (1988), Biotech. and Genetic Engin. Rev. 6, 43-65.
  • - Hull and Howell (1987), Virology 86, 482-493.
  • - Hunter W. and Greenwood F. (1962), Nature 194, 495-496.
  • - Kozak M. (1987), Mol. Cell. Biol. 7, 3438-3445.
  • - Krebbers E., Herdies L., D. Clercq A., Seurinck J., Leemans J., Van Damme J., Segura M.,Gheysen G., Van Montagu M. and Vandekerckhove J. (1988), Plant Physiol. 87, 859-866.
  • - Knowles B. and Ellar D. (1986), J. Cell. Sci 83, 89-101.
  • - Krieg A., Huger A., Langenbruch G. and Schnetter W. (1983), Z. Ang. Ent. 96, 500-508.
  • - Krieg A. and Langenbruch G. (1981), In : Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980 (Ed. H.D. Burges), Academic Press, 837-986.
  • - Kirsch K. and Schmutterer H. (1988), J. Appl. Ent. 105, 249-255.
  • - Kronstad J., Schnepf H. and Whiteley H. (1983), J. Bacteriol. 154, 419-428.
  • - Mahillon J. and Delcour J. (1984), J. Microbiol. Methods 3, 69-73.
  • - Maxam A. and Gilbert W. (1980), Methods in Enzymol. 65, 499-560.
  • - McGaughey W. (1985), Science 229, 193-195.
  • - McGaughey W. and Beeman R. (1988), J. Econ. Entomol. 81, 28-33.
  • - Munson P. and Rodbard D. (1980), Anal. Biochem. 107, 220-239.
  • - Pazkowski and cooperators (1984), EMBO J 3, 2717-2722.
  • - Peleman J., Boerjan W., Engler G., Seurinck J., Botterman J., Alliote T., Van Montagu M. and Inzé D. (1989), The Plant Cell 1, 81-93.
  • - Remaut E., Stanssen P. and Fiers W. (1981), Gene 15, 81-93.
  • - Rocha-Sosa et al (1989) EMBO J. 8, 23-29.
  • - Sandler S., Stayton H., Townsend J., Ralstan M., Bedbrook J. and Dunsmuir P. (1988), Plant Hol. Biol. 11, 301-310.
  • - Scatchard G. (1949), Ann. N.Y. Acad. sci. 51, 660-672.
  • - Schocher R., Shillito R., Saul M.,Pazkowski J. and Potrykus I. (1986) Bio/technology 4, 1093-1096.
  • - Shields (1987), Nature 328, 12-13.
  • - Schnepf H., Wong H. and Whiteley H. (1985), J. Biol. chem. 260, 6264-6272.
  • - Stanssens P., Remaut E. and Fiers W. (1985), Gene 36, 211-223.
  • - Stanssens P., McKeown Y., Friedrich K. and Fritz H. (1987) : "Oligo-nucleotide directed construction of mutations by the gapped duplex DNA Method using the pMa/c plasmid vectors", published in the Collection of Experimental Procedures distributed at the EMBO course entitled "Directed mutagenesis and protein engineering" in July 1987 at the Max Planck Institut für Biochemie, Martinsried, FRG.
  • - Stone T., Sims S. and Marrone P. (1989), J. Invert. Pathol. 53, 228-234.
  • - Vaeck M., Reynaerts A., Höfte H., Jansens S., De Beukeleer M., Dean C. Zabeau M., Van Montagu M. and Leemans J. (1987), Nature 327, 33-37.
  • - Voller, Bidwell and Barlett (1976), In: Manual of Clinical Immunology (Eds. Rose and Friedman), pp. 506-512, American Society of Microbiology, Washington
  • - Velten J., Velten L., Hain R. and Schell J. (1984), EMBO J. 3, 2723-2730.
  • - Velten J. and Schell J. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 6981-6998.
  • - Widner W. and Whiteley H. (1989), J. Bacteriol. 171, 965-974.
  • - Wolfersberger M., Lüthy P., Maurer A., Parenti P., Sacchi V., Giordana B. and Hanozet G. (1987), Comp. Biochem. Physiol. 86, 301-308.
  • - Yanish-Perron C., Veiera J. and Messing J. (1985), Gene 33, 103-119.

Claims (20)

1. Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei B. thuringiensis insecticidal crystal protein - Gene stabil in das Genom dieser Pflanze eingesetzt sind, diese Gene der Kontrolle desselben oder eines jeweils bestimmten Promoters unterliegen und jedes dieser Gene ein anderes, ohne wechselseitige Beeinflussung eingebundenes insecticidal crystal protein verschlüsselt, wobei die wenigstens zwei insecticidal crystal proteine in Zellen dieser Pflanzen erzeugt werden können.
2. Zellen nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Markierungsgen, das ein Protein oder Polypeptid verschlüsselt, das diese Zellen leicht von den Zellen unterscheiden läßt, die dieses Protein oder Polypeptid nicht enthalten, sich an derselben genetischen Stelle befindet wie wenigstens eines dieser insecticidal crystal protein - Gene.
3. Zellen nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes dieser insecticidal crystal protein - Gene der Kontrolle eines anderen Promoters unterliegt, der die Umsetzung der Gene in diesen Zellen steuern kann und mit einem getrennten Signal für 3' - Endbildung innerhalb derselben Transcriptase-Einheit versehen ist.
4. Zellen nach Anspruch 2 oder 3, wobei jedes der Markierungsgene der Kontrolle eines anderen Promoters unterliegt, der die Umsetzung der Gene in diesen Zellen steuern kann und mit einem getrennten Signal für 3' - Endbildung innerhalb derselben Transcriptase-Einheit versehen ist.
5. Zellen nach Anspruch 1 oder 2, wobei diese insecticidal crystal protein sich in derselben Transcriptase-Einheit befinden und einem Promoter unterliegen.
6. Zellen nach Anspruch 5,wobei das Markierungsgen mit wenigstens einem der insecticidal crystal protein - Gene verbunden ist, sich in derselben Transcriptaseeinheit befindet und der Kontrolle desselben Promoters unterliegt.
7. Zellen nach Anspruch 5 oder 6, wobei ein DNA-Bruckstück, das eine protease-empfindliche oder protease-gebundene Aminosäuresequenz verschlüsselt, sich in derselben Transcriptase-Einheit wie die insecticidal crystal protein - Gene befindet und in den Rahmen zwischen den insecticidal crystal protein - Genen eingeschoben ist.
8. Zellen nach Anspruch 5 oder 6, wobei diese insecticidal crystal protein - Gene in einer dicistronischer Einheit zusammengefaßt sind, die eine zwischengenetische DNA- Sequenz umfaßt, die einen erneuten Beginn der Übersetzung erlaubt und sich in derselben Transcriptase-Einheit wie die insecticidal crystal protein - Gene befindet und zwischen diese insecticidal crystal protein - Gene eingeschoben ist.
9. Zellen nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei die insecticidal crystal protein - Gene insecticidal Proteine verschlüsseln, die Aktivität gegen Lepidoptera-Spezien entfalten und besonders die folgenden Gene sind: bt2 und/oder bt73 und/oder bt4 und/oder bt14 und/oder bt15 und/oder bt18.
10. Zellen nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei die insecticidal crystal protein - Gene insecticidal Proteine verschlüsseln, die Aktivität gegen eine Coleoptera-Spezies entfalten und besonders die folgenden Gene sind: bt13 und/oder bt21 und/oder bt22.
11. Zellen nach einem der Ansprüche 2 - 10, wobei das Markierungsgen ein berbizidresistentes Gen ist, insbesondere ein sfr oder sfrv Gen, oder ein Gen ist, das ein verändertes Zielenzym für ein Herbizid mit geringerer Empfindlichkeit gegenüber diesem Herbizid verschlüsselt, insbesondere ein verändertes 5-EPSP als Ziel für Glyphosat oder eine veränderte Glutamin-Synthetase als Ziel für einen GS-Hemmer, oder ein gegen Antibiotika resistentes Gen ist, insbesondere NPTII.
12. Zellen nach einem der Ansprüche 1 - 11, wobei jeder beliebige dieser gleichen oder jeweils bestimmten Promoter dieser insecticidal crystal proteine aus einer Gruppe ausgewählt ist, die sich zusammensetzt aus einem angeborenen Promoter, insbesondere einem 35S oder 35S3 Promoter, einem PNOS Promoter, einem durch Verletzung einführbaren Promoter, insbesondere einem TR1' oder TR2' Promoter, einem Promoter, der die Entfaltung der Gene gesteuert in Pflanzengewebe mit photosynthetischer Aktivität richtet, insbesondere einem SSU Promoter, oder einem gewebe- oder organspezifischen Promoter, insbesondere einem knollenspezifischen Promoter, einem stengel- oder samenspezifischen Promoter, oder einem einführbaren Promoter, insbesondere einem Promoter, der durch chemische Faktoren oder Temperatur oder Kombinationen davon einführbar ist.
13. Ein Bakterienüberträger geeignet zur Veränderung von Pflanzenzellen, insbesondere einer Pflanze, die mit Agrobakterium infiziert werden kann, der die insecticidal crystal protein - Gene nach einem der Ansprüche 1 - 12 enthält.
14. Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze, die eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Insekten besitzt und stabil in das Kerngenom ihrer Zellen eingesetzte insecticidal crystal protein - Genkombinationen nach einem der Ansprüche 1 - 12 aufweist, gekennzeichnet durch die nichtbiologischen Schritte der Veränderung einer Pflanzenzelle durch Einführen der insecticidal crystal protein - Genkombination nach einem der Ansprüche 1 - 12 in das Kerngenom dieser Zelle und das Wiederherstellen dieser Pflanze und des Vermehrungsmaterials ausgehend von dieser Zelle.
15. Eine Pflanzenzellenkultur, bestehend aus Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 - 12.
16. Eine Pflanze, bestehend aus Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 - 12.
17. Kohl, Tomaten, Kartoffeln, Tabakpflanzen, Wollpflanzen oder Salat, bestehend aus den Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 - 12, wobei die insecticidal crystal protein - Gene eines der folgenden Genpaare umfassen:
bt2 und bt18 oder bt73 und bt15 oder bt2 und bt18 oder bt2 und bt14 oder bt2 und bt4 oder bt15 und bt18 oder bt14 und bt15oder bt4 und bt15 oder bt13 und bt21 oder bt21 und bt22 oder bt13 und bt22 .
18. Verfahren zur Resistenzerzeugung einer Pflanze gegen eine Insektenspezies durch Veränderung der Pflanze mit den insecticidal crystal protein - Genen nach einem der Ansprüche 1 - 12.
19. Pflanze, gekennzeichnet durch wenigstens zwei stabil in das Genom dieser Pflanze eingefügte B. thuringiensis insecticidal crystal protein - Gene, wobei diese Gene der Kontrolle desselben oder eines jeweils bestimmten Promoters unterliegen und jedes dieser Gene ein anderes, ohne Beeinflussung eingebundes insecticidal crystal protein für dieselbe Insektenspezies verschlüsselt, wobei wenigstens zwei verschiedene insecticidal crystal proteine in den Zellen dieser Pflanze erzeugt werden können.
20. Pflanzenzellen nach Anspruch 1, wobei die B. thuringiensis insecticidal crystal protein - Gene natürlich vorkommende oder synthetische Kernfolgen aufweisen.
DE69011232T 1989-05-31 1990-05-29 Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein. Expired - Lifetime DE69011232T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP89401499A EP0400246A1 (de) 1989-05-31 1989-05-31 Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bt

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69011232D1 DE69011232D1 (de) 1994-09-08
DE69011232T2 true DE69011232T2 (de) 1994-12-08

Family

ID=8202955

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69011232T Expired - Lifetime DE69011232T2 (de) 1989-05-31 1990-05-29 Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein.

Country Status (12)

Country Link
US (3) US5866784A (de)
EP (2) EP0400246A1 (de)
JP (1) JP3325564B2 (de)
AT (1) ATE109511T1 (de)
AU (1) AU623530B2 (de)
CA (1) CA2032481C (de)
CL (1) CL2004001479A1 (de)
DE (1) DE69011232T2 (de)
DK (1) DK0408403T3 (de)
ES (1) ES2060975T3 (de)
HK (1) HK1008050A1 (de)
WO (1) WO1990015139A1 (de)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9007159A (pt) * 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
EP0400246A1 (de) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bt
US6855873B1 (en) * 1989-05-31 2005-02-15 Bayer Bioscience, N.V. Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
ATE133264T1 (de) * 1991-07-25 1996-02-15 Ciba Geigy Ag Immunologisches nachweisverfahren
UA48104C2 (uk) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
TW261517B (de) * 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
EP0589110A1 (de) * 1992-08-19 1994-03-30 Plant Genetic Systems N.V. Bekämpfung von Ostrinia
US5861543A (en) * 1993-04-09 1999-01-19 Plant Genetic Systems N.V. Bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6677148B1 (en) * 1996-04-19 2004-01-13 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6110668A (en) * 1996-10-07 2000-08-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Gene synthesis method
US5942664A (en) * 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US6121521A (en) * 1998-04-01 2000-09-19 Novartis Ag Chimeric insecticidal protein and DNA coding therefor
DE19825333A1 (de) 1998-06-05 1999-12-09 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Kontrolle von Schadorganismen in Nutzpflanzen
BR0016851A (pt) 1999-12-28 2002-10-08 Bayer Crospscience N V Proteìnas inseticidas do bacillus thuringiensis
WO2002013609A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 The Regents Of The University Of California METHODS FOR BLOCKING RESISTANCE TO Bt TOXINS IN INSECTS AND NEMATODES
US9816104B2 (en) 2000-10-06 2017-11-14 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for deploying a transgenic refuge as a seed blend
EP1988099B1 (de) 2001-01-09 2012-11-14 Bayer CropScience NV Insektizide Proteine von Bacillus thuringiensis
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
CN100497378C (zh) 2002-03-22 2009-06-10 拜尔生物科学公司 新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质
US20030208789A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Wound-inducible expression in plants
AU2003247650A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 Dow Agrosciences Llc Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from paenibacillus species
US7355099B2 (en) 2003-02-20 2008-04-08 Athenix Corporation AXMI-004, a delta-endotoxin gene and methods for its use
GB2400035A (en) * 2003-04-04 2004-10-06 Syngenta Ltd Method to reduce the incidences of insect resistance to insecticidal plants
US20070011773A1 (en) * 2003-04-04 2007-01-11 Syngenta Limited Method of resistance management for transgenic crops
AR048747A1 (es) * 2004-03-05 2006-05-24 Agrigenetics Inc Combinaciones de cry1ab y cry1fa como una herramienta para el control de la resistencia de los insectos
CA2562022C (en) 2004-04-09 2016-01-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for control of insect infestations in plants
US8173871B2 (en) 2005-07-08 2012-05-08 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Bacterial proteins with pesticidal activity
EP3508582B1 (de) 2005-09-16 2021-01-13 Monsanto Technology LLC Verfahren zur genetischen kontrolle von insektenbefall bei pflanzen und zusammensetzungen
WO2007107302A2 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 Bayer Bioscience N.V. Novel genes encoding insecticidal proteins
US10036036B1 (en) * 2007-03-15 2018-07-31 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for deploying a transgenic refuge as a seed blend
CN101688216B (zh) 2007-06-01 2014-03-26 拜尔作物科学公司 编码杀虫蛋白质的新基因
AR068433A1 (es) * 2007-09-14 2009-11-18 Athenix Corp Genes sinteticos de delta-endotoxina axmi-004 y metodos de uso de los mismos
CN102388143A (zh) * 2008-12-23 2012-03-21 阿森尼克斯公司 AXMI-150 δ-内毒素基因及其使用方法
RU2613778C2 (ru) * 2009-10-02 2017-03-21 Зингента Партисипейшнс Аг Инсектицидные белки
RU2596406C2 (ru) * 2009-12-16 2016-09-10 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи КОМБИНИРОВАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКОВ CRY1Ca И CRY1Ab ДЛЯ КОНТРОЛЯ УСТОЙЧИВОСТИ НАСЕКОМЫХ
AU2010330916B2 (en) * 2009-12-16 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc Combined use of Cry1Da and Cry1Fa proteins for insect resistance management
AR079503A1 (es) * 2009-12-16 2012-02-01 Dow Agrosciences Llc Manejo de la resistencia de insectos con combinaciones de proteinas cry1be y cry1f
BR112012014801B1 (pt) 2009-12-16 2024-03-05 Dow Agrosciences Llc Métodos para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um bacillus thuringiensis, e para o controle de pragas de lepidópteros, bem como composição para o controle de pragas de lepidópteros
BR112012014681B1 (pt) * 2009-12-16 2024-03-05 Dow Agrosciences Llc Métodos de gerenciamento do desenvolvimento de resistência a plantas transformadas por proteínas cry por uma praga de lepidópteros e de controle de um inseto lagarta-do-cartucho
RS56508B1 (sr) * 2009-12-16 2018-02-28 Dow Agrosciences Llc Primena vip3ab u kombinaciji sa cry1 za upravljanje otpornim insektima
JP5969921B2 (ja) * 2009-12-16 2016-08-17 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 抵抗性昆虫の対応のためのＣｒｙ１Ｂｅと組み合わせたＣｒｙ１Ｄａの使用
NL2007088A (en) * 2010-07-19 2012-01-23 Asml Netherlands Bv Method and apparatus for determining an overlay error.
US8648230B2 (en) 2011-03-18 2014-02-11 Ms Technologies, Llc Regulatory regions preferentially expressing in non-pollen plant tissue
WO2012131619A1 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Metahelix Life Sciences Limited A nucleotide sequence, expression cassette, transgenic events, cells and methods thereof
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
US9567381B2 (en) 2012-03-09 2017-02-14 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
CA2886787A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Dow Agrosciences Llc Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects
US9365863B2 (en) 2013-05-08 2016-06-14 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for deploying a transgenic refuge seed blend
AR099800A1 (es) 2014-03-21 2016-08-17 Agrigenetics Inc Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz
CN105367636B (zh) * 2014-08-28 2018-11-30 四川农业大学 一种Bt蛋白Cry1Dd1、其编码基因及应用
CN105367635B (zh) * 2014-08-28 2018-11-30 四川农业大学 一种Bt蛋白Cry1Hc1、其编码基因及应用
EP3207126A4 (de) 2014-10-16 2018-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insektizide polypeptide mit breitem wirkungsspektrum und verwendungen davon
UA123036C2 (uk) * 2014-10-16 2021-02-03 Монсанто Текнолоджі Ллс Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих
KR20190085514A (ko) 2016-10-21 2019-07-18 베스타론 코포레이션 절단성 펩타이드 및 이를 포함하는 살충 및 살선충 단백질
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR8600161A (pt) * 1985-01-18 1986-09-23 Plant Genetic Systems Nv Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio
EP0192319B1 (de) * 1985-01-22 1992-07-15 Mycogen Corporation Zellulare Einkapselung biologischer Pestizide
GB8526774D0 (en) * 1985-10-30 1985-12-04 Sandoz Ltd Bacillus thuringiensis hybrids
CA1341092C (en) * 1985-12-12 2000-09-05 David L. Edwards Process for altering the host range of bacillus thuringiensis toxins, and novel toxins produced thereby
JPS63137684A (ja) * 1986-11-27 1988-06-09 Sumitomo Chem Co Ltd バチラス・チユリンゲンシスのキメラ殺虫性蛋白
US5024837A (en) * 1987-05-06 1991-06-18 Donovan William P Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use
US4787964A (en) * 1987-05-11 1988-11-29 Caterpillar Industrial Inc. Gas diffusion electrodes, electrochemical cells and methods exhibiting improved voltage performance
US6686149B1 (en) * 1987-06-10 2004-02-03 Institut Pasteur Methods for obtaining nucleotide sequences coding for polypeptides specifically active for larvae of S. littoralis
FR2616444B1 (fr) 1987-06-10 1990-03-02 Pasteur Institut Sequences nucleotidiques codant pour des polypeptides dotes d'une activite larvicide vis-a-vis de lepidopteres
US6110734A (en) * 1987-06-10 2000-08-29 Institut Pasteur Nucleotide sequences coding for polypeptides endowed with a larvicidal activity towards lepidoptera
JPH01104177A (ja) * 1987-07-08 1989-04-21 Sumitomo Chem Co Ltd ２種の殺虫蛋白の同時発現
JPH02500566A (ja) * 1987-08-17 1990-03-01 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ バチルス・スリンギエンシスからのｄｎａ配列で形質転換された植物
US5244802A (en) * 1987-11-18 1993-09-14 Phytogen Regeneration of cotton
BR9007159A (pt) * 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
US6855873B1 (en) * 1989-05-31 2005-02-15 Bayer Bioscience, N.V. Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
EP0400246A1 (de) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bt
US5908970A (en) * 1989-05-31 1999-06-01 Plant Genetic Systems N.V. Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal crystal proteins
US5126133A (en) * 1989-06-27 1992-06-30 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5246852A (en) * 1989-06-27 1993-09-21 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins

Also Published As

Publication number Publication date
US5866784A (en) 1999-02-02
US20070150983A1 (en) 2007-06-28
CA2032481A1 (en) 1990-12-01
WO1990015139A1 (en) 1990-12-13
US7501559B2 (en) 2009-03-10
ES2060975T3 (es) 1994-12-01
CA2032481C (en) 2000-01-11
CL2004001479A1 (es) 2005-06-03
DK0408403T3 (da) 1994-11-28
AU623530B2 (en) 1992-05-14
DE69011232D1 (de) 1994-09-08
AU5724590A (en) 1991-01-07
JP3325564B2 (ja) 2002-09-17
ATE109511T1 (de) 1994-08-15
EP0408403A1 (de) 1991-01-16
US6172281B1 (en) 2001-01-09
EP0400246A1 (de) 1990-12-05
EP0408403B1 (de) 1994-08-03
HK1008050A1 (en) 1999-04-30
JPH04500161A (ja) 1992-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69011232T2 (de) Verhinderung von Resistenzentwicklung gegen Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein.
DE3854787T2 (de) Gegen lepidoptera und coleoptera aktive mikroorganismen, verwandte insektizidzusammensetzungen und verfahren für ihre herstellung und verwendung
DE69333893T2 (de) Bacillus thuringiensis und dessen insektizide proteine
DE60224410T2 (de) Modifizierte cry3a toxine und die dafür kodierende nukleinsäuren
DE69532333T3 (de) Pestizid-proteine und stämme
DE69937459T2 (de) Verbesserte expression von insektizid-protein cry3b in pflanzen
DE69735305T2 (de) ZUSAMMENSETZUNGEN VON BACILLUS THURINGIENSIS CryET29 DIE FÜR KÄFER UND CTENOCEPHALIDES SPP. TOXISCH SIND
DE69111600T2 (de) Bacillus thuringiensis-cryiiic-gen und für coleoptera-insekten toxisches protein.
DE69735776T2 (de) Bacillus thuringiensis cryet33 und cryet34 enthaltende zusammensetzungen und derren verwendungen
CA2160131C (en) New bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins
DE68923215T2 (de) Hybrid-Pestizide.
EP0374753A2 (de) Insektizide Toxine, Gene, die diese Toxine kodieren, Antikörper, die sie binden, sowie transgene Pflanzenzellen und transgene Pflanzen, die diese Toxine exprimieren
DE69006015T2 (de) Pflanzen, transformiert zur herstellung von insektiziden toxinen von bacillus thuringiensis.
DE69634258T2 (de) Identifizierung und verwendungen von nematizide bacillus thuringiensis gene, toxine und isolate
DE68908242T2 (de) Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit von Insektentoxinen.
JPH05507194A (ja) 新規のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子
US5628995A (en) Control of Ostrinia
DE60037407T2 (de) Fusionsproteine mit pestizidwirkung
DE60222027T2 (de) Chimäre delta-endotoxingen protein cry1ea und cry1ca
US6855873B1 (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
EP0342633A2 (de) Bacillus thuringiensis Transformation
EP0317511A2 (de) Insektizide Baumwollpflanzenzellen
US5908970A (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal crystal proteins
US5530197A (en) Control of ostrinia
DE60129554T2 (de) Bakterielle insektizidproteine

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: BAYER BIOSCIENCE N.V., GENT, BE