DE69735776T2

DE69735776T2 - Bacillus thuringiensis cryet33 und cryet34 enthaltende zusammensetzungen und derren verwendungen

Info

Publication number: DE69735776T2
Application number: DE69735776T
Authority: DE
Inventors: P. William Levittown DONOVAN; C. Judith Levittown DONOVAN; C. Annette Hamilton Square SLANEY
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1996-09-24
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: BR9713219B1; AU741704B2; KR20000048593A; CO4650229A1; DE69735776D1; US20060051822A1; US7504229B2; ATE324447T1; MXPA99002819A; AR054156A2; US7385107B2; IL129160A0; US6326351B1; US6063756A; CA2267665C; EP1015592A1; PL332414A1; WO1998013498A1; US20020128192A1; EP1015592B1

Description

1. Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung ist eine Teilweiterbehandlung auf der Basis der US-Patentanmeldung Serial No. 08/718,905, eingereicht am 24. September 1996, auf deren gesamten Inhalt hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
1.1 Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Gebiete der Molekularbiologie. Insbesondere betreffen bestimmte Ausführungsformen Verfahren und Zusammensetzungen, die DNA-Segmente umfassen, und Proteine, die von Bakterienspezies abgeleitet sind. Insbesondere betrifft sie neue cryET33- und cryET34-Gene von Bacillus thuringiensis, die gegenüber Coleoptera toxische Kristallproteine codieren. Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser DNA-Segmente, DNA-Segmente, die synthetisch modifizierte Cry-Proteine codieren, sowie native und synthetische Kristallproteine werden offenbart, wie zum Beispiel die Verwendung von DNA-Segmenten als diagnostische Sonden und Matrizen für die Proteinproduktion sowie die Verwendung von Proteinen, Fusionsproteinträgern und Peptiden in verschiedenen immunologischen und diagnostischen Anwendungen. Ebenfalls offenbart werden Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Nucleinsäuresegmenten bei der Entwick-lung von transgenen Pflanzenzellen, die die hier offenbarten DNA-Segmente enthalten.
1.2 Beschreibung des Standes der Technik
1.2.1 Bacillus-thuringiensis-Kristallproteine
Eines der einzigartigen Merkmale von B. thuringiensis ist seine Produktion von Kristallproteinen während der Sporenbildung, die spezifisch toxisch gegenüber bestimmten Ordnungen und Spezies von Insekten sind. Es hat sich gezeigt, dass viele verschiedene Stämme von B. thuringiensis insektizide Kristallproteine erzeugen. Zusammensetzungen, die B.-thuringiensis-Stämme beinhalten, welche Proteine mit insektizider Wirkung gegen Lepidoptera- und Diptera-Insekten erzeugen, sind kommerziell erhältlich und werden als umweltverträgliche Insektizide verwendet, da sie gegenüber dem spezifischen Zielinsekt sehr toxisch, aber gegenüber Pflanzen und anderen Nicht-Ziel-Organismen harmlos sind.
Der Mechanismus der insektiziden Wirkung der B.-thuringiensis-Kristallproteine wurde im letzten Jahrzehnt ausführlich untersucht. Es hat sich gezeigt, dass die Kristallproteine erst nach Aufnahme des Proteins durch das Insekt toxisch sind. Der alkalische pH-Wert und proteolytische Enzyme im Mitteldarm des Insekts lösen die Proteine auf und ermöglichen dadurch die Freisetzung von Komponenten, die für das Insekt toxisch sind. Diese toxischen Komponenten zerstören die Zellen des Mitteldarms, bewirken, dass das Insekt keine Nahrung mehr aufnimmt, und führen schließlich zum Tod des Insekts. Aus diesem Grund hat sich B. thuringiensis beim Umgang mit verschiedenen Schadinsekten als wirksames und umweltverträgliches Insektizid erwiesen.
Wie Höfte et al. (1989) bemerkten, ist die Mehrzahl der insektiziden B.-thuringiensis-Stämme aktiv gegen Insekten der Ordnung Lepidoptera, d.h. Raupeninsekten. Andere B.-thuringiensis-Stämme sind insektizid aktiv gegen Insekten der Ordnung Diptera, d.h. Fliegen und Mücken, oder sowohl gegen Lepidoptera- als auch gegen Diptera-Insekten. In den letzten Jahren wurde nur von einigen B.-thuringiensis-Stämmen berichtet, die Kristallproteine erzeugen, welche toxisch gegen Insekten der Ordnung Coleoptera, d.h. Käfer, sind (Krieg et al., 1983; Sick et al., 1990; Lambent et al., 1992).
1.2.2 Genetik von Kristallproteinen
Mehrere Gene, die Kristallproteine codieren, wurden von mehreren Stämmen von B. thuringiensis kloniert. Eine Übersicht von Höfte et al. (1989) diskutiert die Gene und Proteine, die vor 1990 in B. thuringiensis identifiziert wurden, und legen das Nomenklatur- und Klassifikationsschema dar, das traditionell auf B.-thuringiensis-Gene und -Proteine angewendet wird. Die cryI-Gene codieren CryI-Proteine, die toxisch gegen Lepidoptera sind. Die cryII-Gene codieren CryII-Proteine, die toxisch sowohl gegen Lepidoptera als auch gegen Diptera sind. Die cryIII-Gene codieren CryIII-Proteine, die toxisch gegen Coleoptera sind, während cryIV-Gene CryIV-Proteine codieren, die toxisch gegen Diptera sind.
Vor kurzem wurde eine neue Nomenklatur vorgeschlagen, die die Cry-Proteine systematisch auf der Grundlage der DNA-Sequenzhomologie und nicht der Insektenzielspezifitäten klassifiziert. Dieses Klassifikationsschema ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Revidierte Nomenklatur der B.-thuringiensis-δ-Endotoxine^A

^a nach: http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html

1.2.3 Identifizierung von Kristallproteinen, die toxisch gegenüber Coleoptera-Insekten sind
Die Nützlichkeit von bakteriellen Kristallproteinen als Insektizide wurde ausgedehnt, als die erste Isolierung eines gegenüber Coleoptera toxischen B.-thuringiensis-Stamms beschrieben wurde (Kreig et al., 1983; 1984). Von diesem Stamm (im US-Patent Nr. 4,766,203 beschrieben), der als B. thuringiensis var. tenebrionis bezeichnet wurde, wird berichtet, dass er toxisch gegenüber Larven der Coleoptera-Insekten Agelastica alni (Blauer Erlenblattkäfer) und Leptinotarsa decemlineata (Kartoffelkäfer) ist.
Das US-Patent Nr. 4,766,203 bezieht sich auf ein insektizides Kristallprotein von 65–70 Kilodalton (kDa), das in B. thuringiensis tenebrionis identifiziert wurde (siehe auch Bernhard, 1986). Sekar et al. (1987) berichten über die Klonierung und Charakterisierung eines Gens für ein gegenüber Coleoptera toxisches Kristallprotein von B. thuringiensis tenebrionis. Die vorhergesagte Größe des Polypeptids (abgeleitet aus der Gensequenz) beträgt 73 kDa, doch das isolierte Protein besteht primär aus einer 65-kDa-Komponente. Höfte et al. (1987) berichtet auch über die DNA-Sequenz für das klonierte Gen aus B. thuringiensis tenebrionis, wobei die Sequenz des Gens mit der von Sekar et al. (1987) berichteten identisch ist.
McPherson et al. (1988) offenbaren eine DNA-Sequenz für das klonierte Insektenbekämpfungs-Gen aus B. thuringiensis tenebrionis; die Sequenz war mit der von Sekar et al. (1987) berichteten identisch. E.-coli-Zellen und Pseudomonas fluorescens-Zellen, die das klonierte Gen beherbergen, erwiesen sich als toxisch gegenüber Larven des Kartoffelkäfers.
Die Internationale Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 91/07481 vom 30. Mal 1991 beschreibt B.-thuringiensis-Mutanten, die hohe Ausbeuten derselben insektiziden Proteine produzieren, die ursprünglich von den Mutterstämmen in geringeren Ausbeuten hergestellt wurden. Mutanten des gegenüber Coleoptera toxischen B.-thuringiensis-tenebrionis-Stamms sind offenbart.
Über einen gegenüber Coleoptera toxischen Stamm, der als B. thuringiensis var. san diego bezeichnet wird, wurde von Hernstadt et al. (1986) berichtet, dass er ein 64-kDa-Kristallprotein produziert, das gegenüber einigen Coleoptera toxisch ist, einschließlich Pyrrhalta luteola (Ulmenblattkäfer), Anthonomus grandis (Baumwollkapselkäfer), Leptinotarsa decemlineata (Kartoffelkäfer), Otiorhynchus sulcatus (Gefurchter Dickmaulrüssler), Tenebrio molitor (Mehlkäfer), Haltica zombacina und Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata (Gepunkteter Gurkenkäfer).
Die DNA-Sequenz eines Coleoptera-Toxin-Gens aus B. thuringiensis san diego wurde von Herrnstadt et al. (1987) beschrieben und im US-Patent Nr. 4,771,131 offenbart. Die Sequenz des Toxin-Gens von B. thuringiensis san diego ist mit derjenigen identisch, die Sekar et al. (1987) für das klonierte Coleoptera-Toxin-Gen von B. thuringiensis tenebrionis berichteten. Krieg et al. (1987) bewiesen auf der Basis verschiedener diagnostischer Tests, dass B. thuringiensis san diego mit B. thuringiensis tenebrionis identisch ist.
Ein weiterer B.-thuringiensis-Stamm, EG2158, wurde von Donovan et al. (1988) und im US-Patent Nr. 5,024,837 beschrieben. EG2158 produziert ein 73-kDa-CryC-Kristallprotein, das insektizid gegenüber Coleoptera-Insekten ist. Seine DNA-Sequenz war mit derjenigen identisch, die von Sekar et al. (1987) für das klonierte B.-thuringiensis-tenebrionis-Toxin-Gen berichtet wurde. Dieses Coleoptera-Toxin-Gen wird von Höfte et al. (1989) als cryIIIA-Gen bezeichnet. Zwei untergeordnete Proteine von 30 bzw. 29 kDa wurden ebenfalls in diesem Stamm beobachtet, aber nicht näher charakterisiert (Donovan et al., 1988).
Das US-Patent Nr. 5,024,837 beschreibt auch hybride B.-thuringiensis-var.-kurstaki-Stämme, die Aktivität sowohl gegenüber Lepidoptera- als auch gegenüber Coleoptera-Insekten zeigten. Das US-Patent Nr. 4,797,279 (das der EP 0 221 024 entspricht) offenbart ein hybrides B. thuringiensis, das mit einem Plasmid von B. thuringiensis var. kurstaki, welches ein Gen enthält, das ein gegenüber Lepidoptera toxisches Kristallprotein codiert, und mit einem Plasmid von B. thuringiensis tenebrionis, welches ein Gen enthält, das ein gegenüber Coleoptera toxisches Kristallprotein codiert, transformiert ist. Der hybride B.-thuringiensis-Stamm produziert Kristallproteine, die charakteristisch für solche sind, die sowohl von B. thuringiensis kurstaki als auch von B. thuringiensis tenebrionis hergestellt werden. Das US-Patent 4,910,016 (das der EP 0 303 379 entspricht) offenbart ein B.-thuringiensis-Isolat, das als B. thuringiensis MT 104 identifiziert wurde und das insektizide Aktivität gegen Coleoptera und Lepidoptera aufweist.
Die Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0 318 143 offenbart ein intaktes, partiell modifiziertes Gen von B. thuringiensis tenebrionis und rekombinante Vektoren, die dieses umfassen und die Expression eines Proteins mit Toxizität gegenüber Coleoptera-Insekten steuern können, und die Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0 324 254 offenbart B. thuringiensis A30, einen Stamm, der insektizide Aktivität gegen Coleoptera-Insekten einschließlich Larven des Kartoffelkäfers, Larven des Malswurzelbohrers und Baumwollkapselkäfer aufweist.
Das US-Patent Nr. 4,999,192 (das der EP 0 328 383 entspricht) offenbart B. thuringiensis PS40D1, das insektizide Aktivität gegen Larven des Kartoffelkäfers aufweist. Der Stamm wurde auch durch Serotyp-Bestimmung als Serovariante 8a8b, morrisoni, identifiziert. Das US-Patent Nr. 5,006,336 (das der EP 0 346 114 entspricht) beschreibt ein B.-thuringiensis-Isolat, das als PS122D3 bezeichnet wird und dessen Serotyp als Serovariante 8a8b, morrisoni, identifi ziert wurde und das insektizide Aktivität gegen Larven des Kartoffelkäfers zeigte. Das US-Patent Nr. 4,966,765 (das der EP 0 330 342 entspricht) offenbart einen B.-thuringiensis-Stamm, PS86B1 (identifiziert durch Serotyp-Bestimmung als Serovariante tolworthi), der insektizide Aktivität gegen den Kartoffelkäfer aufweist.
Die Nucleotidsequenz eines cryIIIB-Gens und das davon codierte, gegenüber Coleoptera toxische Protein werden von Sick et al. (1990) berichtet, aber der B.-thuringiensis-Quellstamm wird nur über eine Serotypbestimmung als Subspezies tolworthi identifiziert. Das US-Patent Nr. 4,966,155, erteilt am 26. Februar 1991 an Sick et al. (entspricht der EP 0 337 604 ), offenbart ein B.-thuringiensis-Toxin-Gen, das aus dem gegen Coleoptera aktiven B. thuringiensis 43F erhalten wurde, und die Gensequenz scheint mit der des cryIIIe-Gens identisch zu sein. Es wird berichtet, dass B. thuringiensis 43F aktiv gegen den Kartoffelkäfer und Leptinotarsa texana ist.
Die Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0 382 990 offenbart zwei B.-thuringiensis-Stämme, btPGS1208 und btPGS1245, die Kristallproteine von 74 bzw. 129 kDa produzieren und die eine insektizide Aktivität gegen Larven des Kartoffelkäfers aufweisen. Die DNA-Sequenz, die für das Toxin-Gen, das das 74-kDa-Protein produziert, angegeben wird, scheint mit der des cryIIIB-Gens von Sick et al. (1990) verwandt zu sein.
Die internationale PCT-Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 90/13651 offenbart B.-thuringiensis-Stämme, die ein Toxin-Gen enthalten, das ein 81-kDa-Protein codiert, von dem es heißt, es sei toxisch sowohl gegen Lepidopteraals auch gegen Coleoptera-Insekten. Das US-Patent Nr. 5,055,293 offenbart die Verwendung von B. laterosporus zur Insektenbekämpfung von Malswurzelbohrer (Diabrotica).
2. Kurzbeschreibung der Erfindung
Im scharfen Kontrast zum Stand der Technik stellen die neuen, gegen Coleoptera aktiven CryET33- und CryET34-Kristallproteine der vorliegenden Erfindung und die neuen DNA-Sequenzen, die diese codieren, eine neue Klasse von B.-thuringiensis-Kristallproteinen dar, die keine Sequenzhomologie mit einem der in der oben genannten Literatur beschriebenen Stämmen aufweisen. Das hier offenbarte und beanspruchte B.-thuringiensis-Isolat stellt den ersten B.-thuringiensis-kurstaki-Stamm dar, von dem gezeigt wurde, dass er toxisch gegenüber Coleoptera ist. Die B.-thuringiensis-Stämme der vorliegenden Erfindung umfassen neue cry-Gene, die Proteintoxine exprimieren, welche insektizide Aktivität gegen Coleoptera, wie Insekten der Gattungen Popillia und Tribolium, aufweisen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf neue Nucleinsäuresegmente, die zwei Coleoptera-Toxin-δ-Endotoxin-Gene umfassen, die Nucleotidbasensequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen aufweisen, wie sie in 1A, 1B und 1C gezeigt sind. Im Folgenden werden diese Gene als cryET33 (SEQ ID Nr. 1) und cryET34 (SEQ ID Nr. 2) bezeichnet. Das cryET33-Gen hat einen codierenden Bereich, der sich von den Nucleotidbasen 136 bis 936 erstreckt, die in 1A, 1B und 1C gezeigt sind, und das cryET34-Gen hat einen codierenden Bereich, der sich von den Nucleotidbasen 969 bis 1346 erstreckt, die in 1A, 1B und 1C gezeigt sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Insektiziden Proteine, die von den neuen cryET33- und cryET34-Genen codiert werden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET33-Proteins (SEQ ID Nr. 3), die vom cryET33-Gen von den Nucleotidbasen 136 bis 936 codiert wird, ist in 1A, 1B und 1C gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET34-Proteins (SEQ ID Nr. 4), die vom cryET34-Gen von den Nucleotidbasen 969 bis 1346 codiert wird, ist ebenfalls in 1A, 1B und 1C gezeigt. Die Proteine weisen insektizide Aktivität gegen Insekten der Ordnung Coleoptera auf, insbesondere gegen den Baumwollkapselkäfer, den Rotbraunen Reismehlkäfer und den Japankäfer.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine biologisch reine Kultur eines natürlich vorkommenden Wildtyp-B.-thuringiensis-Bakteriums, Stamm EG10327, das am 14. Dezember 1994 bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), hinterlegt wurde und die Zugriffs-Nr. NRRL B-21365 erhielt. B. thuringiensis EG10327 wird unten in den Abschnitten 5.1–5.3 beschrieben. B. thuringiensis EG10327 ist ein natürlich vorkommender B.-thuringiensis-Stamm, der Gene enthält, die mit den cryET33- und cryET34-Genen der vorliegenden Erfindung verwandt oder identisch sind. EG10327 produziert Insektizide Proteine von 29 kDa und 14 kDa, die mit den hier offenbarten CryET33- und CryET34-Proteinen verwandt oder identisch sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen rekombinanten Vektor, der eines der neuen cryET33- und cryET34-Gene oder beide umfasst, eine rekombinante Wirtszelle, die mit einem solchen rekombinanten Vektor transformiert ist, und eine biologisch reine Kultur des so transformierten rekombinanten Bakteriums. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Bakterium vorzugsweise um B. thuringiensis, wie den rekombinanten Stamm EG11402 (hinterlegt am 14. Dezember 1994 beim NRRL mit der Zugriffs-Nr. B-21366), der in Beispiel 8 beschrieben ist, und den rekombinanten Stamm EG11403 (hinterlegt am 14. Dezember 1994 beim NRRL mit der Zugriffs-Nr. B-21367), der in Beispiel 7 beschrieben ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Bakterium vorzugsweise um E. coli, wie den rekombinanten Stamm EG11460 (hinterlegt am 14. Dezember 1994 beim NRRL mit der Zugriffs-Nr. B-21364). Alle beim NRRL hinterlegten Stämme wurden in der Patent Culture Collection unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens hinterlegt, und es wurden Angaben zur Lebensfähigkeit gemäß dem internationalen Empfangsformular BP/4 erhalten.
2.1 cryET33- und cryET34-DNA-Segmente
Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Segmente, die von praktisch jeder Quelle isoliert werden können, die frei von genomischer Gesamt-DNA sind und die die hier offenbarten neuen Peptide codieren. Es kann sich erweisen, dass DNA-Segmente, die diese Peptidspezies codieren, auch Proteine, Polypeptide, Untereinheiten, funktionelle Domänen und dergleichen von mit Kristallproteinen verwandten oder anderen, nicht verwandten Genprodukten codieren. Außerdem können diese DNA-Segmente ganz in vitro synthetisiert werden, wobei man dem Fachmann wohlbekannte Verfahren verwendet.
Das cryET33-Gen hat eine Nucleotidbasensequenz, die in 1A, 1B und 1C gezeigt ist. Das cryET33-Gen (SEQ ID Nr. 1) codiert das 29-kDa-CryET33-Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in 1A, 1B und 1C gezeigt ist (SEQ ID Nr. 3). Das cryET34-Gen (SEQ ID Nr. 2) codiert das 14-kDa-CryET34-Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in 1A, 1B und 1C gezeigt ist (SEQ ID Nr. 4).
Der hier verwendete Ausdruck "DNA-Segment" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das frei von der genomischen Gesamt-DNA einer bestimmten Spezies isoliert wurde. Daher bezieht sich "ein DNA-Segment, das ein Kristallprotein oder -Peptid codiert", auf ein DNA-Segment, das Kristallprotein codierende Sequenzen umfasst und dennoch aus der genomischen Gesamt-DNA der Spezies, aus der das DNA-Segment erhalten wird, isoliert oder durch Reinigen davon befreit wurde, was im vorliegenden Fall das Genom der Gram-positiven Bakteriengattung Bacillus und insbesondere der als B. thuringiensis bekannten Bacillus-Spezies ist. Der Ausdruck "DNA-Segment" umfasst auch DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente und auch rekombinante Vektoren einschließlich zum Beispiel Plasmiden, Cosmiden, Phagemiden, Phagen, Viren und dergleichen.
Ähnlich bezieht sich ein "DNA-Segment, das ein isoliertes oder gereinigtes Kristallprotein-codierendes Gen umfasst," auf ein DNA-Segment, das außer den peptidcodierenden Sequenzen noch bestimmte andere Elemente enthalten kann, wie regulatorische Sequenzen, die im Wesentlichen weg von anderen natürlich vorkommenden Genen oder proteincodierenden Sequenzen isoliert sind. In dieser Hinsicht wird der Ausdruck "Gen" der Einfachheit halber verwendet, um eine funktionelle protein-, polypeptid- oder peptidcodierende Einheit zu bezeichnen. Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass dieser funktionelle Ausdruck sowohl genomische Sequenzen, Operonsequenzen als auch kleinere, gentechnisch erzeugte Gensegmente umfasst, die Proteine, Polypeptide oder Peptide exprimieren oder so angepasst werden können, dass sie welche exprimieren.
"Im Wesentlichen weg von anderen codierenden Sequenzen isoliert" bedeutet, dass das interessierende Gen, in diesem Fall ein Gen, das ein bakterielles Kristallprotein codiert, den maßgeblichen Teil des codierenden Bereichs des DNA-Segments bildet und dass das DNA-Segment keine großen Teile von natürlich vorkommender codierender DNA, wie große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder operoncodierende Bereiche, enthält. Selbstverständlich bezieht sich dies auf das DNA-Segment in der Form, wie es ursprünglich isoliert wurde, und schließt keine Gene, rekombinanten Gene, synthetischen Linker oder codierenden Bereiche aus, die später von Menschenhand zu dem Segment hinzugefügt wurden.
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die DNA-Sequenzen umfassen, welche eine Cry-Peptidspezies codieren, die innerhalb ihrer Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz umfassen, die im Wesentlichen SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 entspricht.
Der Ausdruck "eine Sequenz im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 dargelegt" bedeutet, dass die Sequenz im Wesentlichen einem Teil der Sequenz von entweder SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 entspricht und relativ wenige Aminosäuren aufweist, die mit den Aminosäuren einer dieser Sequenzen nicht identisch oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon sind. Der Ausdruck "biologisch funktionelles Äquivalent" wird in der Technik wohlverstanden und wird hier ausführlich näher definiert (siehe z.B. den Abschnitt "Beispielhafte Ausführungsformen"). Dementsprechend sind Sequenzen, die zwischen etwa 70% und etwa 80% oder vorzugsweise zwischen etwa 81% und etwa 90% oder besonders bevorzugt zwischen etwa 91% und etwa 99% Aminosäure-Sequenzidentität oder funktionelle Äquivalenz mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 aufweisen, Sequenzen, die "im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 dargelegt" sind.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen auch zusätzliche Reste enthalten können, wie zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5'- oder 3'-Sequenzen, und dennoch immer noch im Wesentlichen wie in einer der hier offenbarten Sequenzen dargelegt sind, solange die Sequenz die oben dargelegten Kriterien erfüllt, einschließlich der Beibehaltung der biologischen Proteinaktivität, soweit die Proteinexpression betroffen ist. Das Hinzufügen von terminalen Sequenzen gilt insbesondere für Nucleinsäuresequenzen, die zum Beispiel verschiedene nichtcodierende Sequenzen enthalten können, die entweder den 5'- oder den 3'-Teil des codierenden Bereichs flankieren, oder verschiedene interne Sequenzen enthalten können, d.h. Introns, die bekanntermaßen innerhalb von Genen vorkommen.
Die Nucleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung können unabhängig von der Länge der codierenden Sequenz selbst mit anderen DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymstellen, multiplen Klonierungsstellen, anderen codierenden Segmenten und dergleichen, kombiniert werden, so dass ihre Gesamtlänge beträchtlich variieren kann. Es wird daher in Betracht gezogen, dass ein Nucleinsäurefragment von fast beliebiger Länge eingesetzt werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Leichtigkeit der Herstellung und Verwendung in der vorgesehenen Vorschrift für rekombinante DNA eingeschränkt ist. Zum Beispiel können Nucleinsäurefragmente hergestellt werden, die ein kurzes zusammenhängendes Stück enthalten, das die gesamte oder einen Teil der in SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 offenbarten Peptidsequenz codiert, oder die mit DNA-Sequenzen, die eines der in SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 offenbarten Peptide codieren, und insbesondere solchen DNA-Segmenten, die in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 offenbart sind, identisch oder dazu komplementär sind. Zum Beispiel gelten DNA-Sequenzen wie etwa 18 Nucleotide mit einer Länge von bis zu etwa 10 000, etwa 5000, etwa 3000, etwa 2000, etwa 1000, etwa 500, etwa 200, etwa 100, etwa 50 und etwa 14 Basenpaaren (einschließlich aller dazwischenliegenden Längen) ebenfalls als geeignet.
Man wird ohne weiteres verstehen, dass "dazwischenliegende Längen" in diesem Zusammenhang eine beliebige Länge zwischen den angegebenen Bereichen bedeutet, wie 18, 19, 20, 21, 22, 23 usw.; 30, 31, 32 usw.; 50, 51, 52, 53 usw.; 100, 101, 102, 103 usw.; 150, 151, 152, 153 usw.; einschließlich aller ganzen Zahlen in den Bereichen von 200–500; 500–1000; 1000–2000; 2000–3000; 3000–5000 und bis zu einschließlich Sequenzen von etwa 5200 Nucleotiden und dergleichen.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen Nucleinsäuresequenzen beschränkt ist, die Peptide der vorliegenden Erfindung codieren oder die die Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 codieren, einschließlich solcher DNA-Sequenzen, die in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 besonders offenbart sind. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können daher verschiedentlich die peptidcodierenden Bereiche selbst, codierende Bereiche, die ausgewählte Veränderungen oder Modifikationen im grundlegenden codierenden Bereich tragen, beinhalten, oder sie können größere Polypeptide codieren, die dennoch diese peptidcodierenden Bereiche enthalten, oder sie können biologisch funktionelle äquivalente Proteine oder Peptide codieren, die abweichende Aminosäuresequenzen haben.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen biologisch funktionelle äquivalente Peptide. Solche Sequenzen können als Folge einer Codon-Degeneriertheit und einer funktionellen Äquivalenz entstehen, von denen bekannt ist, dass sie natürlicherweise innerhalb von Nucleinsäuresequenzen und den so codierten Proteinen auftreten. Alternativ dazu können funktionell äquivalente Proteine oder Peptide auch durch Anwendung von DNA-Rekombinationstechnik geschaffen werden, wobei Änderungen der Proteinstruktur eingeführt werden können, und zwar auf der Grundlage von Betrachtungen der Eigenschaften der ausgetauschten Aminosäuren. Vom Menschen gestaltete Änderungen können durch die Anwendung von Techniken der ortsspezifischen Mutagenese eingeführt werden, z.B, zur Einführung von Verbesserungen der Antigenität des Proteins oder zum Testen von Mutanten, um deren Aktivität auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Falls gewünscht, kann man auch Fusionsproteine und -peptide herstellen, z.B. wenn die peptidcodierenden Bereiche innerhalb derselben Expressionseinheit mit anderen Proteinen oder Peptiden, die gewünschte Funktionen aufweisen, ausgerichtet sind, wie etwa für Reinigungs- oder Immunnachweiszwecke (z.B. Proteine, die durch Affinitätschromatographie gereinigt werden können, bzw. Enzymmarker codierende Bereiche).
Rekombinante Vektoren bilden weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung. Als besonders gut geeignete Vektoren gelten diejenigen Vektoren, bei denen der codierende Teil des DNA-Segments, ob er ein Protein voller Länge oder ein kleineres Peptid codiert, unter der Kontrolle eines Promotors positioniert ist. Der Promotor kann in Form des Promotors vorliegen, der natürlicherweise mit einem Gen vergesellschaftet ist, das Peptide der vorliegenden Erfindung codiert, wie man ihn erhalten kann, indem man die 5'-nichtcodierenden Sequenzen isoliert, die sich stromaufwärts des codierenden Segments oder Exons befinden, wobei man zum Beispiel rekombinantes Klonen und/oder PCR^TM-Technik in Verbindung mit den hier offenbarten Zusammensetzungen verwendet.
2.2 cryET33- und cryET34-DNA-Segmente als Hybridisierungssonden und Primer
Außer ihrer Verwendung zur Anleitung der Expression von Kristallproteinen oder Peptiden der vorliegenden Erfindung haben die hier beschriebenen Nucleinsäuresequenzen auch eine Vielzahl von anderen Verwendungen. Zum Beispiel sind sie auch nützlich als Sonden oder Primer bei Ausführungsformen der Nucleinsäure hybridisierung. Dabei wird in Betracht gezogen, dass Nucleinsäuresegmente, die einen Sequenzbereich umfassen, der aus wenigstens einer 14 Nucleotiden langen zusammenhängenden Sequenz besteht, die dieselbe Sequenz hat wie ein 14 Nucleotide langes zusammenhängendes DNA-Segment von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 oder dazu komplementär ist, von besonderem Nutzen sind. Längere zusammenhängende identische oder komplementäre Sequenzen, z.B. solche von etwa 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 usw. bp (einschließlich aller dazwischenliegenden Längen und bis zu einschließlich der vollen Länge der Sequenzen von 5200 Basenpaaren), werden in bestimmten Ausführungsformen ebenfalls von Nutzen sein.
Aufgrund der Fähigkeit solcher Nucleinsäuresonden, spezifisch mit Kristallprotein-codierenden Sequenzen zu hybridisieren, sind sie beim Nachweis der Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe von Nutzen. Es werden jedoch auch andere Verwendungen ins Auge gefasst, einschließlich der Verwendung der Sequenzinformation für die Herstellung von Primern einer mutanten Spezies oder Primern zur Verwendung bei der Herstellung anderer genetischer Konstrukte.
Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzbereichen, die aus zusammenhängenden Nucleotidstücken von 10–14, 15–20, 30, 50 oder sogar 100–200 oder mehr Nucleotiden bestehen, welche mit den DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 identisch oder dazu komplementär sind, werden insbesondere als Hybridisierungssonden zur Verwendung z.B. im Southern- und Northern-Blotting in Betracht gezogen. Kleinere Fragmente werden im Allgemeinen Verwendung in Hybridisierungsausführungsformen finden, wobei die Länge des zusammenhängenden komplementären Bereichs variiert werden kann, wie zwischen etwa 10–14 und etwa 100 oder 200 Nucleotiden, aber je nach der Länge der komplementären Sequenzen, die man nachweisen möchte, können auch größere zusammenhängende komplementäre Bereiche verwendet werden.
Selbstverständlich können Fragmente auch mit anderen Techniken erhalten werden, wie z.B. durch mechanische Scherkräfte oder durch Abbau mit Restrikti onsenzymen. Kleine Nucleinsäuresegmente oder -fragmente können leicht hergestellt werden, zum Beispiel durch direktes Synthetisieren des Fragments mit chemischen Mitteln, wie es bei Verwendung eines automatischen Oligonucleotid-Synthesizers üblicherweise praktiziert wird. Außerdem können auch durch Anwendung von Nucleinsäure-Reproduktionstechnik, wie der PCR^TM-Technik der US-Patente 4,683,195 und 4,683,202, indem man ausgewählte Sequenzen in rekombinante Vektoren für die rekombinante Produktion einführt, und durch andere DNA-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannt sind, Fragmente erhalten werden.
Dementsprechend können die Nucleotidsequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Stücken von DNA-Fragmenten zu bilden. Je nach der beabsichtigten Anwendung möchte man unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen verwenden, um verschiedene Grade der Selektivität der Sonde gegenüber der Zielsequenz zu erreichen. Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, möchte man für die Bildung der Hybride typischerweise relativ stringente Bedingungen einsetzen. Zum Beispiel wird man Bedingungen mit relativ niedrigem Salzgehalt und/oder hoher Temperatur auswählen, wie etwa 0,02 M bis etwa 0,15 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50 °C bis etwa 70 °C. Solche selektiven Bedingungen tolerieren wenn überhaupt nur wenig Fehlpaarungen zwischen der Sonde und dem Matrizen- oder Zielstrang und wären insbesondere für die Isolierung von DNA-Segmenten, die Kristallprotein codieren, geeignet. Der Nachweis von DNA-Segmenten über Hybridisierung ist dem Fachmann wohlbekannt, und die Lehren der US-Patente 4,965,188 und 5,176,995 sind beispielhaft für die Verfahren der Hybridisierungsanalyse. Lehren, wie man sie in den Texten von Maloy et al., 1993, Segal, 1976, Prokop, 1991 und Kuby, 1991, findet, sind besonders relevant.
Bei manchen Anwendungen, zum Beispiel wenn man Mutanten herstellen möchte, indem man einen mutanten Primerstrang einsetzt, der mit einer zugrundeliegenden Matrize hybridisiert ist, oder wenn man Kristallproteincodierende Sequenzen von verwandten Spezies, funktionelle Äquivalente oder dergleichen isolieren möchte, werden selbstverständlich weniger stringente Hybridisierungsbedingungen benötigt, um die Bildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Umständen möchte man vielleicht Bedingungen einsetzen wie solche, bei denen etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 °C bis etwa 55 °C eingesetzt wird. Dadurch können kreuzhybridisierende Spezies leicht als positiv hybridisierende Signale in Bezug auf Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. In jedem Fall ist man sich allgemein darüber im Klaren, dass Bedingungen durch die Zugabe steigender Mengen an Formamid, das dazu dient, den Hybridduplex in derselben Weise wie eine erhöhte Temperatur zu destabilisieren, stringenter gemacht werden können. Die Hybridisierungsbedingungen können also leicht manipuliert werden, und die Methode der Wahl wird also im Allgemeinen von den gewünschten Ergebnissen abhängen.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie einem Marker, zur Bestimmung der Hybridisierung einzusetzen. Eine Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind in der Technik bekannt, einschließlich fluoreszierender, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie Avidin/Biotin, die ein nachweisbares Signal erzeugen können. In bevorzugten Ausführungsformen möchte man wahrscheinlich einen Fluoreszenzmarker oder Enzymmarker, wie Urease, Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstelle von radioaktiven oder anderen umweltunverträglichen Reagentien einsetzen. Im Falle von Enzymmarkern sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die eingesetzt werden können, um ein Mittel zu erhalten, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um die spezifische Hybridisierung mit Proben, die komplementäre Nucleinsäuren enthalten, zu identifizieren.
Im Allgemeinen wird in Betracht gezogen, dass die hier beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagentien in der Lösungshybridisierung als auch in Ausführungsformen, bei denen eine feste Phase eingesetzt wird, geeignet sein werden. Bei Ausführungsformen, die eine feste Phase beinhalten, wird die Test-DNA (oder RNA) auf einer ausgewählten Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder in sonstiger Weise fixiert. Diese fixierte, einzelsträngige Nucleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen hängen von den besonderen Umständen auf der Grundlage der besonderen erforderlichen Kriterien ab (die zum Beispiel vom Gehalt an G + C, der Art der Zielnucleinsäure, der Nucleinsäurequelle oder der Größe der Hybridisierungssonde etc. abhängen). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um unspezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mittels eines Markers nachgewiesen oder sogar quantifiziert.
2.3 Rekombinante Vektoren und Kristallproteinexpression
In anderen Ausführungsformen wird in Betracht gezogen, dass bestimmte Vorteile gewonnen werden, indem man das codierende DNA-Segment unter die Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors stellt. Der hier verwendete Ausdruck "rekombinanter oder heterologer Promotor" soll sich auf einen Promotor beziehen, der in seiner natürlichen Umgebung normalerweise nicht mit einem DNA-Segment vergesellschaftet ist, das ein Kristallprotein oder -peptid codiert. Solche Promotoren können Promotoren, die normalerweise mit anderen Genen vergesellschaftet sind, und/oder Promotoren, die aus irgendeiner Bakterienzelle, einem Virus, einer Eukaryonten- oder Pflanzenzelle isoliert wurden, umfassen. Natürlich ist es wichtig, einen Promotor einzusetzen, der die Expression des DNA-Segments in dem für die Expression gewählten Zelltyp, Organismus oder sogar Tier effektiv anleitet. Die Verwendung von Kombinationen aus Promotor und Zelltyp für die Proteinexpression ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannt, siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989. Die eingesetzten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein, und sie können unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um eine Expression des eingeführten DNA-Segments auf hohem Niveau anzuleiten, wie es bei der Produktion von rekombinanten Proteinen oder Peptiden in großem Maßstab vorteilhaft ist. Zu den geeigneten Promotorsystemen, die für die Verwendung bei der Expression auf hohem Niveau in Frage kommen, gehört unter anderem das Pichia-Expressionsvektorsystem (Pharmacia LKB Biotechnology).
In Verbindung mit Expressionsausführungsformen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen und Peptiden wird in Betracht gezogen, dass längere DNA-Segmente am häufigsten verwendet werden, wobei DNA-Segmente, die die gesamte Peptidsequenz codieren, am meisten bevorzugt sind. Man wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass die Verwendung von kürzeren DNA-Segmenten zur Anleitung der Expression von Kristallpeptiden oder epitopischen Kernbereichen, wie sie zur Erzeugung von Anti-Kristallprotein-Antikörpern verwendet werden können, ebenfalls in den Umfang der Erfindung fällt. DNA-Segmente, die Peptidantigene mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 50 Aminosäuren oder vorzugsweise mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 30 Aminosäuren oder besonders bevorzugt mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren codieren, gelten als besonders gut geeignet. Solche Peptidepitope können Aminosäuresequenzen sein, die eine zusammenhängende Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfassen.
2.4 Kristallprotein-Transgene und transgene Pflanzen
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, die ein Nucleinsäuresegment exprimiert, das das neue Kristallprotein der vorliegenden Erfindung codiert. Das Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen ist in der Technik wohlbekannt. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren das Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNA-Segment, das einen Promotor enthält, der funktionell mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, der ein B.-thuringiensis-CryET33- oder -CryET34-Kristallprotein codiert. Ein solcher codierender Bereich ist im Allgemeinen funktionell mit einem Transcriptionsterminationsbereich verknüpft, wodurch der Promotor in der Lage ist, die Transcription des codierenden Bereichs in der Zelle anzutreiben und somit der Zelle die Fähigkeit zu geben, das rekombinante Protein in vivo zu produzieren. Alternativ dazu sorgt die Erfindung in Fällen, bei denen es wünschenswert ist, die Menge eines bestimm ten rekombinanten Kristallproteins, das in einer bestimmten transgenen Zelle exprimiert wird, zu steuern, zu regulieren oder zu senken, auch für die Expression von Kristallprotein-Antisense-mRNA. Die Verwendung von Antisense-mRNA als Mittel zur Steuerung oder Senkung der Menge eines gegebenen interessierenden Proteins in einer Zelle ist in der Technik wohlbekannt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst transgene Pflanzen, die ein Gen oder Gensegment exprimieren, das eine oder mehrere der neuen hier offenbarten Polypeptidzusammensetzungen codiert. Der hier verwendete Ausdruck "transgene Pflanze" soll eine Pflanze bezeichnen, in die DNA-Sequenzen eingebaut sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gene, die vielleicht normalerweise nicht vorhanden sind, DNA-Sequenzen, die normalerweise nicht zu RNA transcribiert oder zu einem Protein translatiert ("exprimiert") werden, oder irgendwelche anderen Gene oder DNA-Sequenzen, die man in die nichttransformierte Pflanze einführen möchte, wie Gene, die normalerweise in der nichttransformierten Pflanze vorhanden sein können, die man aber entweder gentechnisch verändern oder mit einer geänderten Expression versehen möchte.
Es wird in Betracht gezogen, dass das Genom einer transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung in manchen Fällen durch die stabile Einführung eines oder mehrerer der cryET33- oder cryET34-Transgene, entweder nativ, synthetisch modifiziert oder mutiert, erweitert wird. In manchen Fällen wird mehr als ein Transgen in das Genom der transformierten Wirtspflanzenzelle eingebaut. Dies ist dann der Fall, wenn mehr als ein Kristallprotein-codierendes DNA-Segment in das Genom einer solchen Pflanze eingebaut wird. In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, dass ein, zwei, drei, vier oder noch mehr B.-thuringiensis-Kristallproteine (entweder nativ oder rekombinant verändert) in die transformierte transgene Pflanze eingebaut und stabil exprimiert werden.
Ein bevorzugtes Gen, das eingeführt werden kann, umfasst zum Beispiel eine Kristallprotein-codierende DNA-Sequenz bakteriellen Ursprungs und insbesondere eine oder mehrere der hier beschriebenen, die von Bacillus spp. erhalten werden. In hohem Maße bevorzugte Nucleinsäuresequenzen sind solche, die von B. thuringiensis erhalten werden, oder eine der Sequenzen, die genetisch so verändert wurden, dass die insektizide Aktivität des Kristallproteins in einer solchen transformierten Wirtszelle abnimmt oder zunimmt.
Mittel zum Transformieren einer Pflanzenzelle und zur Herstellung einer transgenen Zelllinie sind in der Technik wohlbekannt und werden hier diskutiert. Vektoren, Plasmide, Cosmide, YACs (künstliche Hefechromosomen) und DNA-Segmente zur Verwendung bei der Transformation solcher Zellen umfassen natürlich im Allgemeinen entweder die Operons, Gene oder von Genen abgeleitete Sequenzen der vorliegenden Erfindung, entweder nativ oder synthetisch abgeleitet, und insbesondere solche, die die offenbarten Kristallproteine codieren. Diese DNA-Konstrukte können weiterhin Strukturen wie Promotoren, Enhancer, Polylinker oder auch Gensequenzen, die nach Wunsch eine positiv oder negativ regulierende Wirkung auf die besonderen interessierenden Gene haben, beinhalten. Das DNA-Segment oder Gen kann entweder ein natives oder modifiziertes Kristallprotein codieren, das in den resultierenden rekombinanten Zellen exprimiert wird und/oder das der regenerierten Pflanze einen verbesserten Phänotyp verleiht.
Solche transgenen Pflanzen können wünschenswert sein, um die insektizide Resistenz einer Einkeimblättrigen oder Zweikeimblättrigen Pflanze zu erhöhen, indem man in eine solche Pflanze ein transgenes DNA-Segment einbaut, das ein oder mehrere CryET33- und/oder CryET34-Kristallproteine codiert, die für Coleoptera-Insekten toxisch sind. Zu den besonders bevorzugten Pflanzen gehören Rasengräser, Weizen, Gemüse, Zierpflanzen, Obstbäume und dergleichen.
In einem verwandten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Samen, der von der transformierten Pflanze erzeugt wurde, die Nachkommenschaft eines solchen Samens sowie einen Samen, der von der Nachkommenschaft der ursprünglichen, nach dem obigen Verfahren hergestellten transgenen Pflanze erzeugt wurde. Diese Nachkommenschaft und die Samen weisen ein Kristallprotein-codierendes Transgen auf, das stabil in ihr Genom eingebaut ist, und diese Nachkommenpflanzen erben die Eigenschaften, die durch die Einführung eines stabilen Transgens erzielt wurden, in Mendelscher Weise. Alle solchen transgenen Pflanzen, in deren Genom transgene DNA-Segmente eingebaut sind, die ein oder mehrere CryET33- und/oder CryET34-Kristallproteine oder -Polypeptide codieren, sind Aspekte dieser Erfindung.
2.5 Ortsspezifische Mutagenese
Die ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, die für die Herstellung von individuellen Peptiden oder biologisch funktionellen äquivalenten Proteinen oder Peptiden durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA geeignet ist. Die Technik liefert weiterhin eine gute Möglichkeit, um Sequenzvarianten unter Einbezug von einer oder mehreren der obigen Überlegungen herzustellen und zu testen, indem man eine oder mehrere Änderungen der Nucleotidsequenz in die DNA einführt. Die ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von Mutanten durch die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie eine ausreichende Anzahl von benachbarten Nucleotiden codieren, so dass man eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität erhält, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der überquerten Deletionsverknüpfung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 13 oder etwa 14 oder etwa 16 oder etwa 17 bis zu einschließlich etwa 18 oder etwa 19 oder etwa 20 oder etwa 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder sogar etwa 30, 40 oder etwa 50 oder so bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verknüpfung der Sequenz verändert sind.
Im Allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese in der Technik wohlbekannt, wie durch verschiedene Publikationen beispielhaft belegt wird. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass bei dieser Technik typischerweise ein Phagenvektor eingesetzt wird, der sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form existiert. Zu den typischen Vektoren, die für die ortsspezifische Mutagenese geeignet sind, gehören Vektoren wie der M13-Phage. Diese Phagen sind kommerziell leicht erhältlich, und ihre Verwendung ist dem Fachmann im allgemeinen wohlbekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenfalls routinemäßig bei der ortsspezifischen Mutagenese eingesetzt, wodurch der Schritt der Übertragung des interessierenden Gens von einem Plasmiden auf einen Phagen weggelassen werden kann.
Im Allgemeinen wird die im Einklang damit erfolgende ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, indem man zuerst einen einzelsträngigen Vektor erhält oder zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die das gewünschte Peptid codiert, auseinanderschmilzt. Ein Oligonucleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, im Allgemeinen synthetisch. Dann wird dieser Primer mit dem einzelsträngigen Vektor assoziiert und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie dem Klenow-Fragment der E.-coli-Polymerase I, ausgesetzt, um die Synthese des mutationstragenden Strangs zu beenden. So entsteht ein Heteroduplex, wobei ein Strang die ursprüngliche unmutierte Sequenz codiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dann wird dieser Heteroduplexvektor verwendet, um geeignete Zellen, wie E.-coli-Zellen, zu transformieren, und Klone, die rekombinante Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen, werden ausgewählt.
Die Herstellung von Sequenzvarianten der ausgewählten peptidcodierenden DNA-Segmente unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese wird als Mittel zur Herstellung von potentiell nützlichen Spezies angegeben und ist nicht als Einschränkung gemeint, da es auch andere Methoden gibt, mit denen Sequenzvarianten von Peptiden und den diese codierenden DNA-Sequenzen erhalten werden können. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren, die die gewünschte Peptidsequenz codieren, mit mutagenen Mitteln, wie Hydroxylamin, behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten.
2.6 CryET33- und CryET34-Antikörperzusammensetzungen und Herstellungsverfahren
In besonderen Ausführungsformen ziehen die Erfinder die Verwendung von Antikörpern, entweder monoklonal oder polyklonal, die an die hier offenbarten Kristallproteine binden, in Betracht. Mittel zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind in der Technik wohlbekannt (siehe z.B. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Die Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) beginnen im Allgemeinen im Wesentlichen genauso wie die zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Kurz gesagt, ein polyklonaler Antikörper wird hergestellt, indem man ein Tier mit einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung immunisiert und Antiseren von dem immunisierten Tier sammelt. Ein weiter Bereich von Tierspezies kann für die Herstellung von Antiseren verwendet werden. Typischerweise ist das für die Produktion von Anti-Antiseren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Wegen des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen ist ein Kaninchen die bevorzugte Wahl für die Produktion von polyklonalen Antikörpern.
Wie in der Technik wohlbekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren. Es ist daher häufig notwendig, das Wirtsimmunsystem anzukurbeln, was durch Kopplung eines Peptid- oder Polypeptid-Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere albumine, wie Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin, können ebenfalls als Träger verwendet werden. Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids mit einem Trägerprotein sind in der Technik wohlbekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bisbiazotiertes Benzidin.
Wie in der Technik ebenfalls wohlbekannt ist, kann die Immunogenität einer bestimmten Immunogenzusammensetzung durch die Verwendung von unspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, die als Adjuvantien bekannt sind, verstärkt werden. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien sind Freunds vollständiges Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält), Freunds unvollständige Adjuvantien und aluminiumhydroxid-Adjuvans.
Die bei der Produktion von polyklonalen Antikörpern verwendete Menge der Immunogenzusammensetzung variiert je nach der Natur des Immunogens sowie des für die Immunisierung verwendeten Tiers. Eine Vielzahl von Wegen kann verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion von polyklonalen Antikörpern kann überwacht werden, indem man zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung Blutproben von dem immunisierten Tier entnimmt. Eine zweite Injektion zum Auffrischen kann ebenfalls gegeben werden. Der Vorgang des Auffrischens und Titrierens wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Wenn ein gewünschtes Maß der Immunogenität erhalten wurde, kann das immunisierte Tier ausbluten gelassen und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann verwendet werden, um mAbs zu erzeugen.
mAbs können leicht unter Verwendung von wohlbekannten Techniken hergestellt werden, wie solche, die beispielhaft im US-Patent 4,196,265 genannt sind. Typischerweise beinhaltet diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tiers mit einer ausgewählten Immunogenzusammensetzung, z.B. einem gereinigten oder partiell gereinigten Kristallprotein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird so verabreicht, dass eine Stimulation von antikörperproduzierenden Zellen bewirkt wird. Nagetiere, wie Mäuse und Ratten, sind bevorzugte Tiere, doch ist die Verwendung von Kaninchen-, Schaf- oder Froschzellen ebenfalls möglich. Die Verwendung von Ratten kann gewisse Vorteile bringen (Goding, 1986, S. 60–61), aber Mäuse sind bevorzugt, wobei die BALB/c-Maus am meisten bevorzugt ist, da diese am meisten routinemäßig verwendet wird und im allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen ergibt.
Nach der Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zur Produktion von Antikörpern, insbesondere B-Lymphocyten (B-Zellen), zur Verwendung in der Vorschrift zur mAb-Erzeugung ausgewählt. Diese Zellen können aus biopsierten Milzen, Mandeln oder Lymphknoten oder aus einer Probe peripheren Bluts erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt, erstere, weil sie eine reiche Quelle für antikörperproduzierende Zellen sind, die sich im teilenden Plasmablastenstadium befinden, und letztere, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist. Häufig wird eine Gruppe von Tieren immunisiert, und die Milz des Tiers mit dem höchsten Antikörpertiter wird entnommen, und die Milzlymphocyten werden durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze erhalten. Typischerweise enthält eine Milz aus einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphocyten.
Dann werden die antikörperproduzierenden B-Lymphocyten aus dem immunisierten Tier mit Zellen einer unsterblichen Myelomzelle fusioniert, die im Allgemeinen von derselben Spezies stammt wie das Tier, das immunisiert wurde. Myelomzelllinien, die zur Verwendung in hybridomerzeugenden Fusionsverfahren geeignet sind, sind vorzugsweise nichtantikörperproduzierend, haben eine hohe Fusionseffizienz und weisen Enzymmängel auf, aufgrund derer sie nicht in bestimmten selektiven Medien wachsen können, die nur das Wachstum der gewünschten fusionierten Zellen (Hybridome) unterstützen.
Es können beliebige von mehreren Myelomzellen verwendet werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind (Goding, 5. 65–66, 1986; Campbell, S. 75–83, 1984). Wenn das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man zum Beispiel P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 sowie UC729-6 sind alle in Verbindung mit Humanzellfusionen geeignet.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1-Myelomzelllinie (auch P3-NS-1-Ag4-1 genannt), die vom NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository leicht erhältlich ist, indem man die Zelllinien-Hinterlegungsnummer GM3573 anfordert. Eine andere Maus-Myelomzelllinie, die verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente nichtantikörperproduzierende Maus-Myelom-SP2/0-Zelllinie.
Verfahren zur Erzeugung von Hybriden von antikörperproduzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen gewöhnlich das Mischen von somatischen Zellen mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 2:1, obwohl das Verhältnis von etwa 20:1 bis etwa 1:1 variieren kann, in Gegenwart eines oder mehrerer Mittel (chemisch oder elektrisch), die die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendal-Virus wurden beschrieben (Kohler und Milstein, 1975; 1976), wie auch solche unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG), wie 37 Vol.-% PEG (Gefter et al., 1977). Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist ebenfalls geeignet (Goding, 1986, 5. 71–74).
Fusionsverfahren erzeugen gewöhnlich lebensfähige Hybride in geringen Häufigkeiten, etwa 1 × 10^-6 bis 1 × 10^-8. Dies stellt jedoch kein Problem dar, da die lebensfähigen fusionierten Hybride durch Kultivieren in einem selektiven Medium von den nicht fusionierten Stammzellen (insbesondere den unfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unbegrenzt weiterteilen würden) unterschieden werden können. Das selektive Medium ist im Allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, welches die de-novo-Synthese von Nucleotiden in den Gewebekulturmedien blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de-novo-Synthese sowohl von Purinen als auch von Pyrimidinen, während Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wenn Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als Quelle für Nucleotide ergänzt (HAT-Medium). Wenn Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die Nucleotid-Wiederverwendungswege beschreiten können, können in HAT-Medium überleben. Den Myelomzellen fehlen entscheidende Enzyme des Wiederverwendungswegs, z.B. Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT), und daher können sie nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Stoffwechselweg beschreiten, aber sie haben in Kultur nur eine begrenzte Lebensdauer und sterben im Allgemeinen innerhalb von etwa zwei Wochen. Daher sind die einzigen Zellen, die in den selektiven Medien überleben können, die Hybride, die aus Myelom- und B-Zellen gebildet wurden.
Diese Kultur ergibt eine Population von Hybridomen, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Typischerweise erfolgt die Auswahl von Hybridomen durch Kultivieren der Zellen durch Einzelklonverdünnung in Mikrotiterplatten, wobei man die einzelnen Klonüberstände anschließend (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität testet. Der Assay sollte empfindlich, einfach und schnell sein, wie Radioimmunassays, Enzymimmunassays, Cytotoxizitätsassays, Plaqueassays, Dot-Immunbindungsassays und dergleichen.
Dann würde man mit den ausgewählten Hybridomen eine Verdünnungsreihe herstellen und sie in einzelnen antikörperproduzierenden Zelllinien klonieren, wobei die Klone dann unbegrenzt vermehrt werden können, um mAbs zu erhalten. Die Zelllinien können mit zwei grundlegenden Methoden in Bezug auf die mAb-Produktion ausgebeutet werden. Eine Probe des Hybridoms kann in ein histokompatibles Tier des Typs, der verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion zu erhalten, injiziert werden (häufig in die Bauchfellhöhle). Das Tier, das die Injektion erhielt, entwickelt Tumoren, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren, der vom fusionierten Zellhybrid produziert wird. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie Serum oder Ascitesflüssigkeit, können dann angezapft werden, um mAbs in hoher Konzentration zu erhalten. Die einzelnen Zelllinien könnten auch in vitro kultiviert werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem sie leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können. Nach beiden Methoden produzierte mAbs können, falls gewünscht, weiter gereinigt werden, wobei man Filtration, Zentrifugation und verschiedene chromatographische Verfahren, wie HPLC oder Affinitätschromatographie, verwendet.
2.7 ELISAs und Immunfällung
ELISAs können in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden. In einem ELISA-Assay werden Proteine oder Peptide, in die Kristallprotein-Antigensequenzen eingebaut sind, auf einer ausgewählten Oberfläche immobilisiert, vorzugsweise einer Oberfläche, die Proteinaffinität aufweist, wie die Näpfe einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach dem Waschen zum Entfernen von unvollständig adsorbier tem Material ist es wünschenswert, die Näpfe der Assayplatte mit einem unspezifischen Protein zu binden oder zu beschichten, das bekanntermaßen antigenneutral in Bezug auf die Testantiseren ist, wie Rinderserumalbumin (BSA), Casein oder Lösungen von Milchpulver. Dies ermöglicht eine Blockierung von unspezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und reduziert so den Hintergrund, der durch unspezifische Bindung von Antiseren auf der Oberfläche verursacht wird.
Nach der Bindung von antigenem Material an den Napf, dem Beschichten mit einem unreaktiven Material zum Reduzieren des Hintergrunds und dem Waschen zur Entfernung von ungebundenem Material wird die immobilisierende Oberfläche mit den Antiseren oder dem zu testenden klinischen oder biologischen Extrakt in einer Weise in Kontakt gebracht, die zur Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) führt. Solche Bedingungen beinhalten vorzugsweise das Verdünnen der Antiseren mit Verdünnungsmitteln, wie BSA, Rinder-Gammaglobulin (BGG) und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween^®. Diese hinzugefügten Agentien unterstützen auch häufig die Reduktion des unspezifischen Hintergrunds. Dann werden die geschichteten Antiseren etwa 2 bis etwa 4 h lang bei Temperaturen vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 25 °C bis etwa 27 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die mit Antiseren in Kontakt gebrachte Oberfläche gewaschen, um nichtimmunkomplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren umfasst das Waschen mit einer Lösung wie PBS/Tween^® oder Boratpuffer.
Nach der Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antigen und dem anschließenden Waschen kann das Auftreten und sogar die Menge der Immunkomplexbildung bestimmt werden, indem man einen zweiten Antikörper hinzufügt, der Spezifität für den ersten aufweist. Um ein Nachweismittel zu erhalten, weist der zweite Antikörper vorzugsweise ein assoziiertes Enzym auf, das beim Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat eine Farbentwicklung erzeugt. So möchte man zum Beispiel die antiserengebundene Oberfläche während einer Zeit und unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Immunkomplexbildung begünstigen (z.B. 2 h Inkubation bei Raumtemperatur in einer PBS-haltigen Lösung, wie PBS/Tween^®), mit einem Urease- oder Peroxidase-konjugierten Anti-Human-IgG in Kontakt bringen und inkubieren.
Nach der Inkubation mit dem zweiten enzymmarkierten Antikörper und nach dem Waschen zur Entfernung des ungebundenen Materials wird die Menge des Markers durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat, wie Harnstoff und Bromkresolpurpur oder 2,2'-Azinodi(3-ethyl-benzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und H₂O₂ im Falle von Peroxidase als Enzymmarker, quantifiziert. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Grades der Farbbildung erreicht, z.B. mit Hilfe eines Spektrophotometers für Spektren im Sichtbaren.
Die Anti-Kristallprotein-Antikörper der vorliegenden Erfindung sind besonders gut für die Isolierung anderer Kristallprotein-Antigene durch Immunfällung geeignet. Immunfällung beinhaltet die Abtrennung der Zielantigenkomponente aus einem komplexen Gemisch und wird verwendet, um kleinste Proteinmengen zu diskriminieren oder zu isolieren. Für die Isolierung von Membranproteinen müssen Zellen zu Detergensmicellen solubilisiert werden. Nichtionische Salze werden bevorzugt, da andere Mittel, wie Gallensalze, bei saurem pH-Wert oder in Gegenwart von zweiwertigen Kationen ausfallen.
In einer alternativen Ausführungsform sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung für die enge Nebeneinanderstellung von zwei Antigenen geeignet. Dies ist besonders nützlich zur Erhöhung der lokalisierten Konzentration von Antigenen, z.B. Enzym-Substrat-Paaren.
2.8 Western Blots
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden in hohem Maße Verwendung in der Immunblot- oder Western-Blot-Analyse. Die Anti-Peptid-Antikörper können als hochaffine primäre Reagentien für die Identifizierung von Proteinen verwendet werden, die auf einer festen Trägermatrix, wie Nitrocellulose, Nylon oder Kombinationen davon, immobilisiert sind. In Verbindung mit der Immunfällung und anschließenden Gel-Elektrophorese können diese als einstufiges Reagens zur Verwendung beim Nachweis von Antigenen verwendet werden, gegen welche sekundäre Reagentien, die beim Nachweis des Antigens verwendet werden, einen nachteiligen Hintergrund verursachen. Dies ist besonders nützlich, wenn die untersuchten Antigene Immunglobuline sind (was die Verwendung von Immunglobulinen, die Komponenten von Bakterienzellwänden binden, ausschließt), die untersuchten Antigene mit dem Nachweismittel kreuzreagieren oder mit demselben relativen Molekulargewicht wandern wie ein Kreuzreaktionssignal.
Nachweisverfahren auf immunologischer Basis zur Verwendung in Verbindung mit Western Blotting beinhalten enzymatisch, radioaktiv oder fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper gegen die Toxin-Struktureinheit und gelten in dieser Hinsicht als besonders gut geeignet.
2.9 Kristallprotein-Screening- und -Nachweiskits
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und Kits zum Durchmustern von Proben, von denen man annimmt, dass sie Kristallproteinpolypeptide oder mit Kristallprotein verwandte Polypeptide enthalten könnten, oder von Zellen, die solche Polypeptide produzieren, bereit. Ein Kit kann einen oder mehrere Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Der Kit kann auch Reagentien zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einer Probe und einem Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Das oder die bereitgestellten Reagentien können radioaktiv, fluoreszenz- oder enzymmarkiert sein. Der Kit kann ein oder mehrere bekannte radioaktiv markierte Reagentien enthalten, die zur Bindung oder Wechselwirkung mit einer Nucleinsäure oder einem Antikörper der vorliegenden Erfindung befähigt ist.
Das oder die Reagentien des Kits können als flüssige Lösung, an einen festen Träger gebunden oder als getrocknetes Pulver bereitgestellt werden. Wenn das oder die Reagentien in einer flüssigen Lösung bereitgestellt werden, ist die flüssige Lösung vorzugsweise eine wässrige Lösung. Wenn das bereitgestellte Reagenz an einen festen Träger gebunden ist, kann es sich bei dem festen Träger vorzugsweise um ein chromatographisches Medium, eine Testplatte mit einer Mehrzahl von Näpfen oder einen Objektträger handeln. Wenn das bereitgestellte Reagenz ein trockenes Pulver ist, kann das Pulver durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, das ebenfalls bereitgestellt sein kann, rekonstituiert werden.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immunnachweisverfahren und entsprechende Kits. Es wird vorgeschlagen, dass die Kristallproteine oder -peptide der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, um Antikörper nachzuweisen, die eine Reaktivität gegenüber diesen aufweisen, oder alternativ dazu können Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, eingesetzt werden, um Kristallproteine oder Peptide, die mit Kristallprotein zusammenhängende Epitope enthalten, nachzuweisen. Im Allgemeinen beinhalten diese Verfahren zuerst das Gewinnen einer Probe, von der man annimmt, dass sie ein solches Protein, Peptid oder einen solchen Antikörper enthalten könnte, das In-Kontakt-Bringen der Probe je nachdem mit einem Antikörper oder Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Bildung eines Immunkomplexes ermöglichen, und dann das Nachweisen der Anwesenheit des Immunkomplexes.
Im Allgemeinen ist der Nachweis einer Immunkomplexbildung in der Technik sehr gut bekannt und kann durch Anwendung zahlreicher Ansätze erreicht werden. Zum Beispiel kommt bei der vorliegenden Erfindung die Anwendung von ELISA, RIA, Immunblotting (z.B. Dot Blot) oder indirekten Immunfluoreszenztechniken usw. in Frage. Im Allgemeinen wird die Immunkomplexbildung durch die Verwendung eines Markers, wie eines radioaktiven Markers oder eines Enzymmarkers (wie Alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase) oder ähnliches nachgewiesen. Selbstverständlich kann man durch die Verwendung eines sekundären Bindungsliganden, wie eines zweiten Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Ligandbindungsanordnung, zusätzliche Vorteile finden, wie in der Technik bekannt ist.
Für Assayzwecke wird vorgeschlagen, dass praktisch jede Probe eingesetzt werden kann, von der man annimmt, dass sie je nachdem entweder ein Kristallprotein oder -peptid oder ein mit Kristallprotein verwandtes Peptid oder einen Antikörper, den man nachweisen möchte, umfassen könnte. Eine mögliche Anwendung solcher Ausführungsformen bei der Titration von Antigen- oder Antikörperproben bei der Auswahl von Hybridomen usw. wird in Betracht gezogen. In verwandten Ausführungsformen zieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Kits in Betracht, die eingesetzt werden können, um die Anwesenheit von Kristallproteinen oder verwandten Peptiden und/oder Antikörpern in einer Probe nachzuweisen. Proben können Zellen, Zellüberstände, Zellsuspensionen, Zellextrakte, Enzymfraktionen, Proteinextrakte oder andere zellfreie Zusammensetzungen, von denen man annimmt, dass sie Kristallproteine oder -peptide enthalten könnten, enthalten. Allgemein gesagt enthalten Kits gemäß der vorliegenden Erfindung ein geeignetes Kristallprotein, -peptid oder einen Antikörper, der gegen ein solches Protein oder Peptid gerichtet ist, zusammen mit einem Immunnachweisreagens und einer Einrichtung, die den Antikörper oder das Antigen und das Reagens enthält. Das Immunnachweisreagens umfasst typischerweise einen Marker, der mit dem Antikörper oder Antigen oder mit einem sekundären Bindungsliganden assoziiert ist. Beispielhafte Liganden könnten einen sekundären Antikörper, der gegen den ersten Antikörper oder das Antigen gerichtet ist, oder einen Biotin- oder Avidin-(oder Streptavidin-)Liganden mit einem assoziierten Marker umfassen. Wie oben erwähnt, sind in der Technik selbstverständlich mehrere beispielhafte Marker bekannt, und alle solchen Marker können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Der Behälter beinhaltet im Allgemeinen ein Vial, in das der Antikörper, das Antigen oder Nachweisreagens gegeben und vorzugsweise in geeigneter Weise aliquotiert werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung enthalten typischerweise auch eine Einrichtung, die die Antikörper-, Antigen- und Reagensbehälter in engem Zusammenhang für den kommerziellen Vertrieb enthält. Solche Behälter können spritzgegossene oder blasgeformte Kunststoffbehälter umfassen, in die die gewünschten Vials eingebracht werden.
2.10 Epitopische Kernsequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Protein- oder Peptidzusammensetzungen, die frei von Gesamtzellen und anderen Peptiden sind und die ein gereinigtes Protein oder Peptid umfassen, das ein Epitop beinhaltet, welches immunologisch kreuzreaktiv gegenüber einem oder mehreren Anti-Kristallprotein-Antikörpern ist. Insbesondere betrifft die Erfindung epitopische Kernsequenzen, die von Cry-Proteinen oder -Peptiden abgeleitet sind.
Der hier verwendete Ausdruck "ein Epitop beinhalten, welches immunologisch kreuzreaktiv gegenüber einem oder mehreren Anti-Kristallprotein-Antikörpern ist" soll sich auf ein Peptid- oder Proteinantigen beziehen, das eine Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur umfasst, die einem Epitop ähnelt, das sich innerhalb eines Kristallproteins oder Polypeptids befindet. Der Grad der Ähnlichkeit wird im Allgemeinen so groß sein, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen das Kristallprotein oder Polypeptid gerichtet sind, auch an das kreuzreaktive Peptid- oder Proteinantigen binden, mit diesem reagieren oder es in sonstiger Weise erkennen. In Verbindung mit solchen Antikörpern können verschiedene Immunassayverfahren eingesetzt werden, wie zum Beispiel Western Blotting, ELISA, RIA usw., die dem Fachmann alle bekannt sind.
Die Identifizierung von immundominanten Cry-Epitopen und/oder ihren funktionellen Äquivalenten, die für die Verwendung in Impfstoffen geeignet sind, ist eine relativ geradlinige Sache. Zum Beispiel kann man die Verfahren von Hopp einsetzen, wie es im US-Patent 4,554,101 gelehrt wird, das die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Die in mehreren anderen Artikeln beschriebenen Verfahren und darauf beruhende Softwareprogramme können auch verwendet werden, um epitopische Kernsequenzen zu identifizieren (siehe zum Beispiel Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; US-Patent 4,554,101). Die Aminosäuresequenz dieser "epitopischen Kernsequenzen" kann dann leicht in Peptide eingebaut werden, entweder durch die Anwendung von Peptidsynthese oder durch Rekombinationstechnik.
Bevorzugte Peptide zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung haben im Allgemeinen eine Länge in der Größenordnung von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren und besonders bevorzugt etwa 8 bis etwa 15 Aminosäuren. Es wird vorgeschlagen, dass kürzere antigene, von Kristallprotein abgeleitete Peptide unter gewissen Umständen Vorteile ergeben, zum Beispiel bei der Herstellung von immunologischen Nachweisassays. Beispielhafte Vorteile sind die Leichtigkeit der Herstellung und Reinigung, die relativ geringen Kosten und die verbesserte Reproduzierbarkeit der Produktion sowie die vorteilhafte Bioverteilung.
Es wird vorgeschlagen, dass besondere Vorteile der vorliegenden Erfindung durch die Herstellung von synthetischen Peptiden realisiert werden können, die modifizierte und/oder verlängerte epitopische/immunogene Kernsequenzen enthalten, welche zu einem "universalen" epitopischen Peptid führen, das gegen Kristallproteine und insbesondere Cry und verwandte Sequenzen gerichtet ist. Diese epitopischen Kernsequenzen werden hier in besonderen Aspekten als hydrophile Bereiche des besonderen Polypeptidantigens identifiziert. Es wird vorgeschlagen, dass diese Bereiche diejenigen repräsentieren, die am wahrscheinlichsten die T-Zell- oder B-Zell-Stimulation fördern und somit die Produktion spezifischer Antikörper hervorrufen.
Eine epitopische Kernsequenz, wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist ein relativ kurzes Stück von Aminosäuren, das "komplementär" zu antigenbindenden Stellen auf den hier offenbarten, gegen Kristallprotein gerichteten Antikörpern ist und daher an diese bindet. Außerdem oder alternativ dazu ist eine epitopische Kernsequenz eine Sequenz, die Antikörper hervorruft, welche kreuzreaktiv gegenüber Antikörpern sind, die gegen die Peptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass sich der Ausdruck "komplementär" im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung auf Aminosäuren oder Peptide bezieht, die eine anziehende Kraft aufeinander ausüben. Bestimmte Epitopkernsequenzen der vorliegenden Erfindung können also funktionell anhand ihrer Fähigkeit definiert werden, mit dem gewünschten Proteinantigen zu konkurrieren oder dieses womöglich bei der Bindung mit den entsprechenden, gegen das Protein gerichteten Antiseren zu verdrängen.
Im Allgemeinen ist die Größe des Polypeptidantigens vermutlich nicht besonders entscheidend, solange es wenigstens groß genug ist, um die identifizierten Kernsequenzen oder Sequenzen zu tragen. Die kleinste geeignete Kernsequenz, die in der vorliegenden Offenbarung erwartet wird, hätte im Allgemeinen eine Länge in der Größenordnung von etwa 8 Aminosäuren, wobei Sequenzen in der Größenordnung von 10 bis 20 besonders bevorzugt sind. Diese Größe entspricht also im Allgemeinen den kleinsten Peptidantigenen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden. Die Größe des Antigens kann jedoch gegebenenfalls auch größer sein, solange es eine grundlegende epitopische Kernsequenz enthält.
Die Identifizierung von epitopischen Kernsequenzen ist dem Fachmann bekannt, zum Beispiel gemäß der Beschreibung im US-Patent 4,554,101, das die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Überdies stehen zahlreiche Computerprogramme zur Verfügung, um antigene Teile von Proteinen vorherzusagen (siehe z.B. Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Computerisierte Peptidsequenz-Analyseprogramme (z.B. DNAStar^®-Software, DNAStar, Inc., Madison, WI) können ebenfalls geeignet sein, um synthetische Peptide gemäß der vorliegenden Offenbarung zu entwerfen.
Synthesen von epitopischen Sequenzen oder Peptiden, die ein antigenes Epitop innerhalb ihrer Sequenz enthalten, werden leicht mit Hilfe von herkömmlichen Synthesetechniken, wie dem Festphasenverfahren, erreicht (z.B. durch die Verwendung eines kommerziell erhältlichen Peptidsynthesizers, wie ein Peptide Synthesizer Modell 430A von Applied Biosystems). Auf diese Weise synthetisierte Peptidantigene können dann in vorbestimmten Mengen allquotiert und bis zur Verwendung in herkömmlicher Weise, wie in wässrigen Lösungen oder ganz besonders bevorzugt in einem Pulver- oder lyophilisierten Zustand, gelagert werden.
Aufgrund der relativen Stabilität von Peptiden können sie gewünschtenfalls im Allgemeinen leicht während recht langer Zeiträume, z.B. bis zu sechs Monaten oder mehr, in wässrigen Lösungen, und zwar in praktisch jeder wässrigen Lösung, ohne nennenswerte Zersetzung oder Verlust der antigenen Aktivität aufbewahrt werden. Wenn eine längere Lagerung in wässriger Lösung in Betracht gezogen wird, ist es jedoch im Allgemeinen wünschenswert, Mittel einschließlich Puffern, wie Tris- oder Phosphatpuffer, mitzuverwenden, um einen pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 7,5 aufrechtzuerhalten. Außerdem kann es wünschenswert sein, Mittel mitzuverwenden, die das Mikrobenwachstum hemmen, wie Natriumazid oder Merthiolat. Für eine längere Lagerung im wässrigen Zustand ist es wünschenswert, die Lösungen bei etwa 4 °C oder besonders bevorzugt im gefrorenen Zustand zu lagern. Wenn die Peptide im lyophilisierten oder pulverisierten Zustand gelagert werden, können sie selbstverständlich praktisch unendlich lange gelagert werden, z.B. in dosierten Aliquoten, die vor der Verwendung mit einer vorbestimmten Menge Wasser (vorzugsweise destilliert) oder Puffer rehydratisiert werden können.
2.11 Biologisch funktionelle Äquivalente
In der Struktur der Peptide der vorliegenden Erfindung und der DNA-Segmente, die sie codieren, können Modifikationen und Änderungen vorgenommen werden, wobei man dennoch ein funktionelles Molekül erhält, das ein Protein oder Peptid mit wünschenswerten Eigenschaften codiert. Folgendes ist eine Diskussion auf der Basis einer Veränderung der Aminosäuren eines Proteins unter Schaffung eines äquivalenten oder sogar verbesserten Moleküls der zweiten Generation. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung gelten mutierte Kristallproteine als geeignet, um die insektizide Aktivität des Proteins zu erhöhen und folglich die insektizide Aktivität und/oder Expression des rekombinanten Transgens in einer Pflanzenzelle zu erhöhen. Die Aminosäureänderungen können erreicht werden, indem man die Codons der DNA-Sequenz gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Codons ändert. Tabelle 2
Zum Beispiel können bestimmte Aminosäuren anstelle von anderen Aminosäuren in einer Proteinstruktur verwendet werden, ohne dass ein nennenswerter Verlust der wechselwirkenden Bindungskapazität mit Strukturen wie zum Beispiel antigenbindenden Bereichen von Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen erfolgt. Da es die Wechselwirkungsfähigkeit und Natur eines Proteins ist, die die biologisch funktionelle Aktivität dieses Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenzsubstitutionen in einer Proteinsequenz und selbstverständlich auch in der zugrundeliegenden codierenden DNA-Sequenz vorgenommen und dennoch ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten werden. Die Erfinder gehen also davon aus, dass verschiedene Veränderungen in den Peptidsequenzen der offenbarten Zusammensetzungen oder entsprechenden DNA-Sequenzen, die die Peptide codieren, ohne nennenswerten Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität vorgenommen werden können.
Wenn solche Änderungen vorgenommen werden, kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindex bei der Übertragung einer wechselwirkenden biologischen Funktion auf ein Protein ist in der Technik allgemein bekannt (Kyte und Doolittle, 1982). Es wird anerkannt, dass der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zur Sekundärstruktur des resultierenden Proteins beiträgt, die wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen, zum Beispiel Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen, definiert.
Jeder Aminosäure ist ein hydropathischer Index auf der Basis ihrer Hydrophobie und Ladungsmerkmale zugeordnet (Kyte und Doolittle, 1982); dies sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5), Methionin (+1,9); alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Es ist in der Technik bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit einem ähnlichen hydropathischen Index oder Score ersetzt werden können, was immer noch ein Protein mit ähnlicher biologischer Aktivität ergibt, d.h., wobei man immer noch ein biologisch funktionell äquivalentes Protein erhält. Wenn solche Änderungen vorgenommen werden, ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indices innerhalb von ±2 gleich sind, bevorzugt, solche, die innerhalb von ±1 gleich sind, sind besonders bevorzugt, und solche, die innerhalb von ±0,5 gleich sind, sind ganz besonders bevorzugt.
In der Technik wird auch davon ausgegangen, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis der Hydrophilie vorgenommen werden kann. In US-Patent 4,554,101 heißt es, dass die größte lokale mittlere Hydrophilie eines Proteins, die von der Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren beherrscht wird, mit der biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie im US-Patent 4,554,101 ausgeführt ist, wurden den Aminosäureresten die folgenden Hydrophiliewerte zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
Es wird davon ausgegangen, dass eine Aminosäure anstelle einer anderen mit einem ähnlichen Hydrophiliewert verwendet werden kann, wobei man dennoch ein biologisch äquivalentes und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Protein erhalten wird. Bei solchen Änderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophiliewerte innerhalb von ±2 gleich sind, bevorzugt, solche, die innerhalb von ±1 gleich sind, sind besonders bevorzugt, und solche, die innerhalb von ±0,5 gleich sind, sind ganz besonders bevorzugt.
Wie oben skizziert wurde, beruhen Aminosäuresubstitutionen daher im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure-Seitenkettensubstituenten, zum Beispiel ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung und Größe und dergleichen. Beispielhafte Substitutionen, bei denen verschiedene der obigen Merkmale berücksichtigt werden, sind dem Fachmann wohlbekannt; dazu gehören: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; sowie Valin, Leucin und Isoleucin.
2.12 Kristallproteinzusammensetzungen als Insektizide und Verfahren zu ihrer Verwendung
Die Erfinder ziehen in Betracht, dass die hier offenbarten Kristallproteinzusammensetzungen besondere Verwendung als Insektizide für die topische und/oder systemische Anwendung auf Feldfrüchte, Gräser, Obst und Gemüse sowie Zierpflanzen finden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung eine fließfähige Ölsuspension von Bakterienzellen, die ein hier offenbartes neues Kristallprotein exprimieren. Vorzugsweise sind die Zellen B.-thuringiensis-EG10327-Zellen, doch gilt jede solche bakterielle Wirtszelle als geeignet, die die hier offenbarten neuen Nucleinsäuresegmente exprimiert und ein Kristallprotein produziert, wie B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli oder Pseudomonas spp.
In einer anderen wichtigen Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung ein wasserdispergierbares Granulat. Dieses Granulat umfasst Bakterienzellen, die ein hier offenbartes neues Kristallprotein exprimieren. Bevorzugte Bakterienzellen sind B.-thuringiensis-EG10327-Zellen, doch gelten auch Bakterienzellen wie B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli oder Pseudomonas spp., die mit einem hier offenbarten DNA-Segment transformiert sind und das Kristallprotein exprimieren, als geeignet.
In einer dritten wichtigen Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung ein benetzbares Pulver, einen Staub, ein Granulat oder ein kolloidales Konzentrat. Dieses Pulver umfasst Bakterienzellen, die ein hier offenbartes neues Kristallprotein exprimieren. Bevorzugte Bakterienzellen sind B.-thuringiensis-EG10327-Zellen, doch gelten auch Bakterienzellen wie B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli oder Pseudomonas spp., die mit einem hier offenbarten DNA-Segment transformiert sind und das Kristallprotein exprimieren, als geeignet. Solche trockenen Formen der insektiziden Zusammensetzungen können so zubereitet werden, dass sie sich sofort nach der Benetzung auflösen oder sich alternativ dazu mit gesteuerter Freisetzung, nachhaltiger Freisetzung oder in anderer Weise zeitabhängig auflösen.
In einer vierten wichtigen Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung eine wässrige Suspension von Bakterienzellen, wie die oben beschriebenen, die das Kristallprotein exprimieren. Solche wässrigen Suspensionen können als konzentrierte Stammlösung, die vor der Anwendung verdünnt wird, oder alternativ dazu als gebrauchsfertige verdünnte Lösung bereitgestellt werden.
Für diese Verfahren, die die Anwendung von Bakterienzellen beinhalten, kann der zelluläre Wirt, der das bzw. die Kristallprotein-Gene enthält, in jedem zweckmäßigen Nährmedium gezüchtet werden, wo das DNA-Konstrukt einen selektiven Vorteil verschafft, was ein selektives Medium ergibt, so dass im Wesentlichen alle oder alle Zellen das B.-thuringiensis-Gen enthalten. Diese Zelten können dann mit herkömmlichen Methoden geerntet werden. Alternativ dazu können die Zellen auch vor der Ernte behandelt werden.
Wenn die insektiziden Zusammensetzungen intakte B.-thuringiensis-Zellen, die das interessierende Protein exprimieren, umfassen, können solche Bakterien auf vielerlei Weise zubereitet werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulate oder Stäube oder durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, wie anorganischen Mineralien (Phyllosilicaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dergleichen) oder botanischen Materialien (pulverisierten Malskolben, Reisspelzen, Walnussschalen und dergleichen), eingesetzt werden. Die Zubereitungen können Spreader-Sticker-Hilfsstoffe, Stabilisatoren, andere pestizide Additive oder Tenside umfassen. Flüssige Zubereitungen können auf wässriger oder nichtwässriger Basis sein und als Schäume, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dergleichen eingesetzt werden. Die Bestandteile können rheologische Mittel, Tenside, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere umfassen.
Alternativ dazu können die neuen CryET33- und/oder CryET34-Proteine auch durch native oder rekombinante bakterielle Expressionssysteme in vitro hergestellt und für die anschließende Feldanwendung isoliert werden. Ein solches Protein kann entweder in Rohzelllysaten, Suspensionen, Kolloiden usw. vorliegen, oder es kann alternativ dazu gereinigt, verfeinert, gepuffert und/oder weiterverarbeitet werden, bevor man es zu einer aktiven bioziden Zubereitung verarbeitet. Ebenso kann es unter gewissen Umständen wünschenswert sein, Kristalle und/oder Sporen aus Bakterienkulturen, die das Kristallprotein exprimieren, zu isolieren und Lösungen, Suspensionen oder kolloidale Präparate solcher Kristalle und/oder Sporen als aktive bioinsektizide Zusammensetzung anzuwenden.
Unabhängig vom Verfahren der Anwendung wird die Menge der aktiven Komponente(n) in einer insektizid wirksamen Menge angewendet, die in Abhängigkeit von Faktoren variiert wie zum Beispiel den speziellen zu bekämpfenden Coleoptera-Insekten, der speziellen zu behandelnden Pflanze oder Feldfrucht, den Umgebungsbedingungen sowie dem Verfahren, der Auftragungsdichte und der Auftragungsmenge der insektizid wirksamen Zusammensetzung.
Die beschriebenen Insektizidzusammensetzungen können hergestellt werden, indem man entweder die Bakterienzell-, Kristall- und/oder Sporensuspension oder die isolierte Proteinkomponente mit dem gewünschten landwirtschaftlich annehmbaren Träger zubereitet. Die Zusammensetzungen können vor der Verabreichung in einem geeigneten Mittel zubereitet werden, zum Beispiel lyophilisiert, gefriergetrocknet, getrocknet oder in einem wässrigen Träger, Medium oder geeigneten Verdünnungsmittel, wie Kochsalzlösung oder einem anderen Puffer. Die zubereiteten Zusammensetzungen können in Form eines Staubs oder Granulats oder einer Suspension in Öl (Pflanzen- oder Mineralöl) oder Wasser oder Öl/Wasser-Emulsionen oder als benetzbares Pulver oder in Kombination mit irgendeinem anderen Trägermaterial, das für die landwirtschaftliche Anwendung geeignet ist, vorliegen. Geeignete landwirtschaftliche Träger können fest oder flüssig sein und sind in der Technik wohlbekannt. Der Ausdruck "landwirtschaftlich annehmbarer Träger" umfasst alle Hilfsstoffe, z.B. inerte Komponenten, Dispergiermittel, Tenside, Klebrigmacher, Bindemittel usw., die gewöhnlich in der Insektizidzubereitungstechnik verwendet werden; diese sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Insektizidzubereitung wohlbekannt. Die Zubereitungen können mit einem oder mehreren festen oder flüssigen Hilfsmittels gemischt und mit verschiedenen Methoden präpariert werden, z.B. durch homogenes Mischen, physikalisches Mischen und/oder Vermahlen der Insektizidzusammensetzung mit geeigneten Hilfsstoffen unter Verwendung von herkömmlichen Zubereitungstechniken.
Die insektiziden Zusammensetzungen dieser Erfindung werden mit herkömmlichen Verfahren, vorzugsweise durch Sprühen, auf die Umgebung des Ziel-Coleoptera-Insekts, typischerweise auf das Laub der zu schützenden Pflanze oder Feldfrucht, aufgetragen. Die Stärke und Dauer der Insektizidanwendung wird im Hinblick auf die Bedingungen, die spezifisch für die besonderen Schädlinge und zu behandelnden Kulturpflanzen sind, und die besonderen Umgebungsbedingungen eingestellt. Das proportionale Verhältnis von Wirkstoff zu Träger hängt natürlich von der chemischen Natur, Löslichkeit und Stabilität der insektiziden Zusammensetzung sowie der besonderen, in Betracht gezogenen Zubereitung ab.
Weitere Auftragungstechniken, zum Beispiel Verstäuben, Versprühen, Imprägnierung, Bodeninjektion, Samenbeschichtung, Sämlingsbeschichtung, Besprühung, Belüftung, Verneblung, Zerstäubung und dergleichen sind ebenfalls möglich und können unter bestimmten Umständen, wie z.B. Insekten, die einen Wurzel- oder Stängelbefall verursachen, oder bei Auftragung auf empfindliche Pflanzen oder Zierpflanzen, erforderlich sein. Diese Auftragungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt.
Die insektizide Zusammensetzung der Erfindung kann bei dem Verfahren der Erfindung einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindungen einschließlich anderer Pestizide, aber nicht auf diese beschränkt, eingesetzt werden. Das Verfahren der Erfindung kann auch in Verbindung mit anderen Behandlungen, wie Tensiden, Detergentien, Polymeren oder Zubereitungen für die zeitlich gesteuerte Freisetzung, verwendet werden. Die insektiziden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können entweder für systemische oder für topische Verwendung zubereitet werden.
Die Konzentration der insektiziden Zusammensetzung, die für die Umgebungs-, systemische oder foliäre Auftragung verwendet wird, variiert stark in Abhängigkeit von der Natur der besonderen Zubereitung, der Auftragungsmethode, den Umgebungsbedingungen und dem Grad der bioziden Aktivität. Typischerweise ist die bioinsektizide Zusammensetzung in der aufgetragenen Zubereitung in einer Konzentration von wenigstens etwa 1 Gew.-% vorhanden und kann in einer Konzentration von bis zu einschließlich etwa 99 Gew.-% vorhanden sein. Trockene Zubereitungen der Zusammensetzungen können etwa 1 bis etwa 99 oder mehr Gew.-% der Zusammensetzung enthalten, während flüssige Zubereitungen im Allgemeinen etwa 1 bis etwa 99 oder mehr Gew.-% des Wirkstoffs enthalten können. Zubereitungen, die intakte Bakterienzellen umfassen, enthalten im Allgemeinen etwa 10⁴ bis etwa 10⁷ Zellen/mg.
Die insektizide Zubereitung kann nach Bedarf in einer oder mehreren Anwendungen auf eine besondere Pflanze oder Zielfläche aufgetragen werden, wobei eine typische Feldauftragungsdichte pro Hektar in der Größenordnung von etwa 50 g bis etwa 500 g des Wirkstoffs oder etwa 500 g bis etwa 1000 g oder etwa 1000 g bis etwa 5000 g oder mehr des Wirkstoffs liegt.
3. Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Zeichnungen bilden einen Bestandteil der vorliegenden Patentschrift und werden mit aufgenommen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung näher zu veranschaulichen. Die Erfindung ist durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung von speziellen Ausführungsformen, die hier präsentiert werden, besser verständlich.
1A, 1B und 1C zeigen die Nucleotidbasensequenz des cry-ET33-Gens (SEQ ID Nr. 1) und des cryET34-Gens (SEQ ID Nr. 2) und die abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET33-Proteins (SEQ ID Nr. 3) und des CryET34-Proteins (SEQ ID Nr. 4).
2 zeigt eine Restriktionskarte von pEG246. Die Orte und Orientierungen des cryET33-Gens (SEQ ID Nr. 1) und des cryET34-Gens (SEQ ID Nr. 2) sind durch Pfeile angezeigt. pEG246 funktioniert in E. coli, da es von pBR322 abgeleitet ist, und ist ampicillinresistent (Amp^R). Die Abkürzungen für die Restriktionsendonuclease-Spaltstellen sind wie folgt: R = EcoRI, B = BamHI. Ebenfalls in 2 gezeigt ist ein Ein-Kilobase(1 kb)-Größenmarker.
3, die mit 2 ausgerichtet ist und auf demselben Maßstab beruht, zeigt eine Restriktionskarte von pEG1246. Die Orte und Orientierungen des cryET33-Gens (SEQ ID Nr. 1) und des cryET34-Gens (SEQ ID Nr. 2) sind durch Pfeile angezeigt. pEG1246 ist vom Plasmid pEG246 (2) abgeleitet und enthält das Bacillus-spp.-Plasmid pNN101 (das sowohl Chloramphenicol-Resistenz [Cam^R] als auch Tetracyclin-Resistenz [Tet^R] exprimiert), das in die BamHI-Stelle von pEG246 eingesetzt ist. pEG1246 funktioniert sowohl in E. coli als auch in B. thuringiensis. Die Abkürzungen sind dieselben wie für 2.
4. Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen
4.1 Einige Vorteile der Erfindung
B. thuringiensis EG10327 ist ein natürlich vorkommender Stamm, der insektizide Aktivität gegen Coleoptera-Insekten einschließlich Baumwollkapselkäfer, Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers (Tribolium castaneum) und Larven des Japankäfers (Popillia japonica) aufweist. B. thuringiensis EG2158 enthält gegenüber Coleoptera toxische Kristallprotein-Gene, die den Kristallprotein-Genen von EG10327 ähnlich oder damit identisch sind. Zwei neue Kristalltoxin-Gene, die als cryET33 und cryET34 bezeichnet werden, wurden aus EG2158 kloniert. Das cryET33-Gen codiert das 29-kDa-CryET33-Kristallprotein, und das cryET34-Gen codiert das 14-kDa-CryET34-Kristallprotein. Die CryET33- und CryET34-Kristallproteine sind gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers, Larven des Baumwollkapselkäfers und Larven des Japankäfers toxisch.
4.2 Definitionen
Die folgenden Wörter und Ausdrücke haben die unten dargelegten Bedeutungen.

Expression: Die Kombination von intrazellulären Vorgängen einschließlich der Transcription und Translation, die ein codierendes DNA-Molekül, wie ein Struktur-Gen, erfährt, so dass ein Polypeptid entsteht.
Promotor: Eine Erkennungsstelle auf einer DNA-Sequenz oder Gruppe von DNA-Sequenzen, die ein Expressionssteuerungselement für ein Struktur-Gen liefert und an die RNA-Polymerase spezifisch bindet und die RNA-Synthese (Transcription) dieses Gens einleitet.
Regeneration: Der Vorgang des Wachsenlassens einer Pflanze aus einer Pflanzenzelle (z.B. Pflanzenprotoplast oder Explantat).
Struktur-Gen: Ein Gen, das exprimiert wird, so dass ein Polypeptid entsteht.
Transformation: Vorgang der Einführung einer exogenen DNA-Sequenz (z.B. eines Vektors, eines rekombinanten DNA-Moleküls) in eine Zelle oder einen Protoplasten, wo diese exogene DNA in ein Chromosom eingebaut wird oder zur autonomen Replikation befähigt ist.
Transformierte Zelle: Eine Zelle, deren DNA durch die Einführung eines exogenen DNA-Moleküls in diese Zelle verändert wurde.
Transgene Zelle: Jede Zelle, die von einer transformierten Zelle abgeleitet ist oder regeneriert wurde oder von einer transgenen Zelle abgeleitet ist. Beispielhafte transgene Zellen sind Pflanzenkalli, die von einer transformierten Pflanzenzelle abgeleitet sind, sowie besondere Zellen, wie Blatt-, Wurzel-, Stängelzellen, z.B. somatische Zellen oder reproduktive Zellen (Keimzellen), die von einer transgenen Pflanze erhalten werden.
Transgene Pflanze: Eine Pflanze oder deren Nachkommenschaft, die von einer transformierten Pflanzenzelle oder einem transformierten Protoplasten abgeleitet sind, wobei die Pflanzen-DNA ein eingeführtes Fremd-DNA-Molekül enthält, das in einer nativen, nichttransgenen Pflanze desselben Stammes ursprünglich nicht vorhanden ist. Die Ausdrücke "transgene Pflanze" und "transformierte Pflanze" werden in der Technik zuweilen als synonyme Ausdrücke verwendet, um eine Pflanze zu definieren, deren DNA ein exogenes DNA-Molekül enthält. Wir halten es jedoch für wissenschaftlich korrekter, eine regenerierte Pflanze oder einen regenerierten Kalius, die bzw. der aus einer transformierten Pflanzenzelle oder einem transformierten Protoplasten erhalten wurde, als transgene Pflanze zu bezeichnen, und diese Verwendung wird hier befolgt.
Vektor: Ein DNA-Molekül, das zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und/oder mit dem ein anderes DNA-Segment funktionell verknüpft werden kann, so dass es zu einer Replikation des daran befestigten Segments kommt. Ein Plasmid ist ein Beispiel für einen Vektor.

4.3 Sonden und Primer
In einem anderen Aspekt ermöglicht DNA-Sequenzinformation, die durch die Erfindung bereitgestellt wird, die Herstellung von relativ kurzen DNA-Sequenzen (oder RNA-Sequenzen) mit der Fähigkeit, spezifisch mit Gensequenzen der hier offenbarten ausgewählten Polynucleotide zu hybridisieren. In diesen Aspekten werden Nucleinsäuresonden geeigneter Länge auf der Basis einer Betrachtung einer ausgewählten Kristallprotein-Gensequenz hergestellt, zum Beispiel einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist. Aufgrund der Fähigkeit solcher Nucleinsäuresonden, spezifisch mit einer Kristallproteincodierenden Gensequenz zu hybridisieren, sind sie für eine Vielzahl von Ausführungsformen besonders gut geeignet. Was am wichtigsten ist, die Sonden können in einer Vielzahl von Assays verwendet werden, um die Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe nachzuweisen.
In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, Oligonucleotidprimer zu verwenden. Die Sequenz solcher Primer wird unter Verwendung eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung zur Verwendung beim Nachweisen, Amplifizieren oder Mutieren eines definierten Segments eines Kristallprotein-Gens von B. thuringiensis mit Hilfe von PCR^TM-Technik entworfen. Segmente von verwandten Kristallprotein-Genen von anderen Spezies können ebenfalls durch PCR^TM unter Verwendung solcher Primer amplifiziert werden.
Um bestimmte der Vorteile gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten, umfasst eine bevorzugte Nucleinsäuresequenz, die für Hybridisierungsstudien oder -assays eingesetzt wird, Sequenzen, die zu wenigstens einem ungefähr 14 bis 30 bp langen Nucleotidstück einer Kristallprotein-codierenden Sequenz, wie der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 gezeigten, komplementär sind. Eine Größe von wenigstens 14 Nucleotiden hilft zu gewährleisten, dass die Fragmente eine ausreichende Länge haben, um ein Duplexmolekül zu bilden, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Bereiche mit einer Länge von mehr als 14 Basen umfassen, werden jedoch im Allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und den Grad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Man bevorzugt im Allgemeinen die Gestaltung von Nucleinsäuremolekülen mit genkomplementären Abschnitten von 14 bis 20 Nucleotiden oder noch länger, wenn man dies wünscht. Solche Fragmente können leicht hergestellt werden, zum Beispiel durch direktes Synthetisieren des Fragments mit chemischen Mitteln, durch Anwendung von Nucleinsäure-Reproduktionstechnik, wie der PCR^TM-Technik der US-Patente 4,683,195 und 4,683,202, oder durch Ausschneiden ausgewählter DNA-Fragmente aus rekombinanten Plasmiden, die geeignete Inserts und geeignete Restriktionsstellen enthalten.
4.4 Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung zieht einen Expressionsvektor in Betracht, der ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. In einer Ausführungsform ist ein Expressionsvektor also ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, welcher ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wobei der codierende Bereich funktionell mit einem Transcriptionsterminationsbereich verknüpft ist, in dem der Promotor die Transcription des codierenden Bereichs antreibt.
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verknüpft" bedeutet, dass ein Promotor so mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, dass die Transcription dieses codierenden Bereichs von diesem Promotor gesteuert und reguliert wird. Mittel, um einen Promotor funktionell mit einem codierenden Bereich zu verknüpfen, sind in der Technik wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die rekombinante Expression von DNAs, die die Kristallproteine der vorliegenden Erfindung codieren, vorzugsweise in einer Bacillus-Wirtszelle. Zu den bevorzugten Wirtszellen gehören B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis und verwandte Bacillus-Spezies, wobei B.-thuringiensis-Wirtszellen in hohem Maße bevorzugt sind. Promotoren, die in Bakterien funktionieren, sind in der Technik wohlbekannt. Ein beispielhafter und bevorzugter Promotor für die Bacillus-Kristallproteine umfasst alle bekannten Kristallprotein-Gen-Promotoren einschließlich der cryET33- und cryET34-Gen-Promotoren. alternativ dazu können auch mutagenisierte oder rekombinante Promotoren von Kristallprotein-codierenden Genen von Menschenhand gestaltet und zur Förderung der Expression der hier offenbarten neuen Gensegmente verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird die rekombinante Expression von DNAs, die die Kristallproteine der vorliegenden Erfindung codieren, unter Verwendung eines transformierten Gram-negativen Bakteriums, wie einer E.-coli- oder Pseudomonas-spp.-Wirtszelle, durchgeführt. Promotoren, die für die Expression von Ziel-Polypeptiden in E. coli und anderen Gram-negativen Wirtszellen auf hohem Niveau geeignet sind, sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt.
Wenn ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, um eine Pflanze zu transformieren, wird ein Promotor ausgewählt, der die Fähigkeit hat, die Expression in Pflanzen anzutreiben. Promotoren, die in Pflanzen funktionieren, sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt. Für die Expression des Polypeptids in Pflanzen geeignet sind Promotoren, die induzierbar, viral, synthetisch, konstitutiv, wie es beschrieben ist (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985), und zeitlich reguliert, räumlich reguliert und raumzeitlich reguliert sind (Chau et al., 1989).
Ein Promotor wird auch aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, die Transcriptionsaktivität der transformierten Pflanzenzelle oder der transgenen Pflanze auf den codierenden Bereich zu lenken. Struktur-Gene können durch eine Vielzahl von Promotoren in Pflanzengeweben angetrieben werden. Promotoren können fast konstitutiv sein, wie der CaMV-35S-Promotor, oder es können gewebespezifische oder entwicklungsspezifische Promotoren sein, die Zweikeimblättrige oder Einkeimblättrige beeinflussen.
Wenn der Promotor ein fast konstitutiver Promotor ist, wie CaMV 35S, findet man bei einer Vielzahl von transformierten Pflanzengeweben (z.B. Kallus, Blatt, Samen und Wurzel) Erhöhungen der Polypeptidexpression. Alternativ dazu können die Wirkungen der Transformation auf spezifische Pflanzengewebe gerichtet werden, indem man Vektoren verwendet, die sich in das Pflanzengenom integrieren und einen gewebespezifischen Promotor enthalten.
Ein beispielhafter gewebespezifischer Promotor ist der Lectin-Promotor, der spezifisch für Samengewebe ist. Das Lectin-Protein in Sojabohnensamen wird von einem einzigen Gen (Lel) codiert, das nur während der Samenreifung exprimiert wird und etwa 2 bis etwa 5% der Gesamt-mRNA des Samens ausmacht. Das Lectin-Gen und der samenspezifische Promotor sind vollständig charakterisiert worden und werden verwendet, um in transgenen Tabakpflanzen eine samenspezifische Expression zu dirigieren (Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al., 1990).
Ein Expressionsvektor, der einen codierenden Bereich enthält, der ein interessierendes Polypeptid codiert, wird so gestaltet, dass er unter der Kontrolle des Lectin-Promotors ist, und dieser Vektor wird in Pflanzen eingeführt, wobei man zum Beispiel ein Protoplasten-Transformationsverfahren verwendet (Dhir et al., 1991). Die Expression des Polypeptids ist spezifisch auf die Samen der transgenen Pflanze gerichtet.
Eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, die aus einer Pflanzenzelle erzeugt wird, die mit einem gewebespezifischen Promotor transformiert ist, kann mit einer zweiten transgenen Pflanze gekreuzt werden, die sich aus einer Pflanzenzelle entwickelt hat, die mit einem anderen gewebespezifischen Promotor transformiert ist, wobei eine transgene Hybridpflanze entsteht, die die Wirkungen der Transformation in mehr als einem spezifischen Gewebe zeigt.
Beispielhafte gewebespezifische Promotoren sind die Promotoren von Mals-Sucrose-Synthase 1 (Yang et al., 1990), Mals-alkohol-Dehydrogenase 1 (Vogel et al., 1989), Mals-Lichtsammelkomplex (Simpson, 1986), Mals-Hitzeschockprotein (Odell et al., 1985), der kleinen Untereinheit der RuBP-Carboxylase (Rubisco) der Erbse (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), der Mannopin-Synthase des Ti-Plasmids (Langridge et al., 1989), der Nopalin-Synthase des Ti-Plasmids (Langridge et al., 1989), der Petunien-Chalcon-Isomerase (van Tunen et al., 1988), des glycinreichen Proteins 1 der Bohne (Keller et al., 1989), des CaMV-35S-Transcripts (Odell et al., 1985) und von Kartoffel-Patatin (Wenzler et al., 1989). Bevorzugte Promotoren sind der Blumenkohlmosalkvirus(CaMV)-35S-Promotor und der Promotor der kleinen S-E9-Untereinheit der RuBP-Carboxylase.
Die Wahl des Expressionsvektors und letztlich des Promotors, mit dem ein Polypeptid-codierender Bereich funktionell verknüpft wird, hängt direkt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, z.B. dem Ort und der Zeit der Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle. Dies sind wohlbekannte Einschränkungen, die dem Gebiet der Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle inhärent sind. Ein Vektor, der für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist jedoch in der Lage, die Expression des Polypeptidcodierenden Bereichs, mit dem er funktionell verknüpft ist, zu dirigieren.
Typische Vektoren, die für die Expression von Genen in höheren Pflanzen geeignet sind, sind in der Technik wohlbekannt; dazu gehören die beschriebenen Vektoren, die vom tumorinduzierenden (Ti) Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind (Rogers et al., 1987). Es ist jedoch von mehreren anderen sich in Pflanzen integrierenden Vektorsystemen bekannt, dass sie in Pflanzen funktionieren, einschließlich des beschriebenen pCaMVCN-Transfer-Kontrollvektors (Fromm et al., 1985). pCaMVCN (erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ) enthält den Blumenkohlmosalkvirus-CaMV-35S-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der zum Exprimieren des Polypeptids verwendete Vektor einen Selektionsmarker, der in einer Pflanzenzelle wirksam ist, vorzugsweise ein Wirkstoffresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Wirkstoffresistenzmarker ist das Gen, dessen Expression zu Kanamycin-Resistenz führt, d.h., das chimärische Gen, das den Nopalin-Synthase-Promotor, Tn5-Neomycin-Phosphotransferase II (nptII) und den 3'-nichttranslatierten Bereich der Nopalin-Synthase enthält (Rogers et al., 1988).
RNA-Polymerase transcribiert eine codierende DNA-Sequenz über eine Stelle hinweg, wo Polyadenylierung erfolgt. Typischerweise dienen DNA-Sequenzen, die sich wenige hundert Basenpaare stromabwärts der Polyadenylierungsstelle befinden, zum Abbruch der Transcription. Diese DNA-Sequenzen werden hier als Transcriptionsterminationsbereiche bezeichnet. Diese Bereiche sind für eine effiziente Polyadenylierung von transcribierter Messenger-RNA (mRNA) erforderlich.
Mittel zur Herstellung von Expressionsvektoren sind in der Technik wohlbekannt. Expressionsvektoren (Transformationsvektoren), die zum Transformieren von Pflanzen verwendet werden, und Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren sind in den US-Patenten Nr. 4,971,908, 4,940,835, 4,769,061 und 4,757,011 beschrieben. Diese Vektoren können so modifiziert werden, dass sie eine codierende Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten.
Eine Vielzahl von Verfahren wurde entwickelt, um ein DNA-Segment über komplementäre klebrige Enden oder glatte Enden funktionell in einen Vektor einzufügen.
Zum Beispiel können komplementäre Homopolymer-Ketten zu dem DNA-Segment, das eingesetzt werden soll, und zur Vektor-DNA hinzugefügt werden. Dann werden der Vektor und das DNA-Segment durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen miteinander verknüpft, wobei rekombinante DNA-Moleküle entstehen.
Ein codierender Bereich, der ein Polypeptid codiert, das die Fähigkeit hat, einer Zelle insektizide Aktivität zu verleihen, ist vorzugsweise ein Gen, das das B.-thuringiensis-Kristallprotein CryET33 oder CryET34 codiert. In bevorzugten Ausführungsformen hat ein solches Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 oder eines funktionellen Äquivalents dieser Sequenzen. Gemäß solchen Ausführungsformen wird auch ein codierender Bereich bevorzugt, der die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
4.5 Merkmale der neuen Kristallproteine
Die vorliegende Erfindung stellt neue Polypeptide bereit, das das ganze oder einen Teil eines B.-thuringiensis-CryET33- oder -CryET34-Kristallproteins definieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform offenbart und beansprucht die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes CryET33-Protein. Das CryET33-Protein umfasst eine Sequenz von 267 Aminosäuren und hat eine berechnete Molekülmasse von 29 216 Da. CryET33 hat eine berechnete isoelektrische Konstante (pI) von 4,78. Die Aminosäurezusammensetzung des CryET33-Proteins ist in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Aminosäurezusammensetzung von CryET33
In einer anderen Ausführungsform offenbart und beansprucht die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes CryET34-Protein. Das CryET34-Protein umfasst eine Sequenz von 126 Aminosäuren und hat eine berechnete Molekülmasse von 14182 Da. Der berechnete isoelektrische Punkt (pI) von CryET34 beträgt 4,26. Die Aminosäurezusammensetzung des CryET34-Proteins ist in Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Aminosäurezusammensetzung von CryET34
4.6 Nomenklatur der neuen Proteine
Die Erfinder haben den neuen Proteinen der Erfindung willkürlich die Bezeichnungen CryET33 und CryET34 zugeordnet. Ebenso wurde den neuen Nucleinsäuresequenzen, die diese Polypeptide codieren, die willkürlichen Bezeichnungen cryET33 und cryET34 zugeordnet. Die formale Zuordnung der Gen- und Proteinbezeichnungen auf der Basis der überarbeiteten Nomenklatur der Kristallprotein-Endotoxine (Tabelle 1) wird durch ein Komitee für die Nomenklatur von B. thuringiensis erfolgen, das gebildet wurde, um B.-thuringiensis-Kristallproteine systematisch zu klassifizieren. Die Erfinder gehen davon aus, dass die willkürlich zugeordneten Bezeichnungen der vorliegenden Erfindung durch die offizielle Nomenklatur, die diesen Sequenzen zugeordnet wird, ersetzt wird.
4.7 Transformierte Wirtszellen und transgene Pflanzen
Verfahren und Zusammensetzungen zum Transformieren eines Bakteriums, einer Hefezelle, einer Pflanzenzelle oder einer ganzen Pflanze mit einem oder mehreren Expressionsvektoren, die ein Kristallprotein-codierendes Gensegment umfassen, sind weitere Aspekte dieser Offenbarung. Ein transgenes Bakterium, eine transgene Hefezelle, Pflanzenzelle oder Pflanze, die aus einem solchen Transformationsvorgang abgeleitet sind, oder die Nachkommen und Samen einer solchen transgenen Pflanze, sind ebenfalls weitere Ausführungsformen der Erfindung.
Mittel zum Transformieren von Bakterien und Hefezellen sind in der Technik wohlbekannt. Typischerweise sind die Mittel zur Transformation ähnlich den wohlbekannten Mitteln, die zum Transformieren anderer Bakterien oder Hefen, wie E. coli oder Saccharomyces cerevisiae, verwendet werden. Zu den Verfahren für die DNA-Transformation von Pflanzenzellen gehören die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation, Protoplastentransformation, Genübertragung in Pollen, Injektion in Reproduktionsorgane, Injektion in unreife Embryos und Teilchenbombardierung. Jedes dieser Verfahren hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Ein bestimmtes Verfahren zum Einführen von Genen in einen bestimmten Pflanzenstamm ist also vielleicht nicht notwendigerweise für einen anderen Pflanzenstamm am effektivsten, aber es ist wohlbekannt, welche Verfahren für einen bestimmten Pflanzenstamm geeignet sind.
Es gibt zwar viele Verfahren zur Einführung von transformierenden DNA-Segmenten in Zellen, aber nicht alle haben sich als geeignet erwiesen, um DNA an Pflanzenzellen abzugeben. Zu den geeigneten Verfahren gehört jedoch vermutlich praktisch jedes Verfahren, mit dem DNA in eine Zelle eingeführt werden kann, wie durch Agrobacterium-Infektion, direkte Abgabe von DNA, wie zum Beispiel durch PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten (Omirulleh et al., 1993), durch Dehydrierung/Hemmung vermittelte DNA-Aufnahme, durch Elektroporation, durch Rühren mit Siliciumcarbidfasern, durch Beschleunigung von DNA-beschichteten Teilchen usw.. In bestimmten Ausführungsformen werden Beschleunigungsverfah ren bevorzugt und umfassen zum Beispiel die Mikroprojektil-Bombardierung und dergleichen.
Die Technologie zur Einführung von DNA in Zellen ist dem Fachmann wohlbekannt. Vier allgemeine Verfahren zur Abgabe eines Gens in Zellen wurden beschrieben: (1) chemische Verfahren (Graham und van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) physikalische Verfahren, wie Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Wong und Neumann, 1982; Fromm et al., 1985; US-Patent 5,384,253) und die Genkanone (Johnston und Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis und Anderson, 1988a; 1988b); und (4) Rezeptor-vermittelte Mechanismen (Curie) et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).
4.7.1 Elektroporation
Die Anwendung von kurzen elektrischen Hochspannungsimpulsen auf eine Vielzahl von Tier- und Pflanzenzellen führt zur Bildung von nanometergroßen Poren in der Plasmamembran. DNA wird direkt in das Cytoplasma aufgenommen, entweder durch diese Poren oder als Folge der Umverteilung von Membrankomponenten, die mit dem Schließen der Poren einhergeht. Elektroporation kann äußerst effizient sein und kann sowohl für die transiente Expression von klonierten Genen als auch zur Etablierung von Zelllinien, die integrierte Kopien des interessierenden Gens tragen, verwendet werden. Elektroporation führt im Gegensatz zur Calciumphosphat-vermittelten Transfektion und Protoplastenfusion häufig zu Zelllinien, die eine oder höchstens ein paar integrierte Kopien der Fremd-DNA tragen.
Die Einführung von DNA mittels Elektroporation ist dem Fachmann wohlbekannt. Bei diesem Verfahren werden bestimmte zellwandzersetzende Enzyme, wie pektinabbauende Enzyme, eingesetzt, um die gewünschten Empfängerzeilen anfälliger für eine Transformation durch Elektroporation zu machen als unbehandelte Zellen. Alternativ dazu werden die Empfängerzellen durch eine mechanische Verwundung anfälliger für eine Transformation gemacht. Um eine Transformation durch Elektroporation zu bewirken, kann man entweder zerreibbare Gewebe, wie eine Suspensionskultur von Zellen oder embryogenen Kallus, einsetzen, oder alternativ dazu kann man unreife Embryos oder andere organisierte Gewebe direkt transformieren. Man würde die Zellwände der gewählten Zellen partiell abbauen, indem man sie pektinabbauenden Enzymen (Pektolyasen) aussetzt oder in kontrollierter Weise mechanisch verwundet. Solche Zellen würden dann empfänglich für eine DNA-Übertragung durch Elektroporation, die in diesem Stadium durchgeführt werden kann, und dann könnten transformierte Zellen je nach der Natur der neu eingebauten DNA durch eine geeignete Selektions- oder Screening-Anweisung identifiziert werden.
4.7.2 Mikroprojektil-Bombardierung
Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zur Abgabe von transformierenden DNA-Segmenten an Pflanzenzellen ist die Mikroprojektil-Bombardierung. Bei diesem Verfahren können Teilchen mit Nucleinsäuren beschichtet und durch eine vorwärtstreibende Kraft an Zellen abgegeben werden. Beispielhafte Teilchen sind solche, die aus Wolfram, Gold und Platin und dergleichen bestehen.
Ein Vorteil der Mikroprojektil-Bombardierung außer der Tatsache, dass sie ein wirksames Mittel ist, um Einkeimblättrige reproduzierbar und stabil zu transformieren, besteht darin, dass weder die Isolierung von Protoplasten (Cristou et al., 1988) noch die Anfälligkeit für eine Agrobacterium-Infektion erforderlich sind. Eine beispielhafte Ausführungsform eines Verfahrens zur Abgabe von DNA an Malszellen durch Beschleunigung ist ein Biolistics Particle Delivery System, das verwendet werden kann, um mit DNA beschichtete Teilchen oder Zellen durch ein Sieb, wie ein Edelstahl- oder Nytex-Sieb, auf eine Filteroberfläche zu treiben, die mit in Suspension kultivierten Malszellen bedeckt ist. Das Sieb dispergiert die Teilchen, so dass sie nicht in großen Aggregaten an die Empfängerzellen abgegeben werden. Vermutlich reduziert ein Sieb zwischen der Projektilapparatur und den zu bombardierenden Zellen die Größe der Projektilaggregate und kann zu einer größeren Transformationshäufigkeit beitragen, indem es Schäden reduziert, die bei den Empfängerzellen durch zu große Projektile entstehen.
Für die Bombardierung werden Zellen in Suspension vorzugsweise auf Filtern oder festem Kulturmedium konzentriert. Alternativ dazu können auch unreife Embryos oder andere Zielzellen auf festem Kulturmedium angeordnet sein. Die zu bombardierenden Zellen befinden sich in einem geeigneten Abstand unterhalb der Makroprojektil-Abfangplatte. Falls gewünscht, befinden sich auch ein oder mehrere Siebe zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu bombardierenden Zellen. Durch die Verwendung der hier dargelegten Techniken kann man bis zu 1000 oder mehr Herde von Zellen erhalten, die ein Marker-Gen transient exprimieren. Die Zahl der Zellen in einem Herd, die das exogene Genprodukt exprimieren, liegt 48 h nach der Bombardierung häufig in einem Bereich von 1 bis 10 und im Durchschnitt 1 bis 3.
Bei der Transformation durch Bombardierung kann man die Kulturbedingungen vor der Bombardierung und die Bombardierungsparameter so optimieren, dass man die maximale Anzahl an stabilen Transformanten erhält. Sowohl die physikalischen als auch die biologischen Parameter für die Bombardierung sind bei dieser Technik wichtig. Physikalische Faktoren sind solche, die die Manipulation des DNA/Mikroprojektil-Niederschlags beinhalten, oder solche, die den Flug und die Geschwindigkeit entweder der Makro- oder der Mikroprojektile beeinflussen. Zu den biologischen Faktoren gehören alle Schritte, die an der Manipulation von Zellen vor und unmittelbar nach der Bombardierung beteiligt sind, die osmotische Einstellung von Zielzellen, um die Linderung des mit der Bombardierung einhergehenden Traumas zu unterstützen, und auch die Natur der transformierenden DNA, wie linearisierte DNA oder intakte superspiralisierte Plasmide. Vermutlich sind die vor der Bombardierung erfolgenden Manipulationen für eine erfolgreiche Transformation von unreifen Embryos besonders wichtig.
Dementsprechend wird in Betracht gezogen, dass man vielleicht verschiedene der Bombardierungsparameter in Studien im kleinen Maßstab anpassen möchte, um die Bedingungen vollständig zu optimieren. Man möchte vielleicht insbesondere physikalische Parameter, wie Lückenabstand, Flugabstand, Gewebeabstand und Heliumdruck, einstellen. Man kann auch die Traumareduktionsfaktoren (TRF) durch modifizierende Bedingungen minimieren, die den physiologischen Zustand der Empfängerzellen beeinflussen und die daher auch die Transformations- und Integrationseffizienz beeinflussen können. Zum Beispiel können für eine optimale Transformation der osmotische Zustand, die Gewebehydratisierung und das Subkulturstadium oder der Zellzyklus der Empfängerzellen eingestellt werden. Die Ausführung von anderen Routineeinstellungen wird dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
4.7.3 Agrobacterium-vermittelte Übertragung
Die Agrobacterium-vermittelte Übertragung ist ein breit anwendbares System für die Einführung von Genen in Pflanzenzellen, da die DNA in ganze Pflanzengewebe eingeführt werden kann, wodurch man die Notwendigkeit der Regeneration einer intakten Pflanze aus einem Protoplasten umgeht. Die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Pflanzenintegrationsvektoren für die Einführung von DNA in Pflanzenzellen ist in der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel die beschriebenen Verfahren (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). Weiterhin ist die Integration der Ti-DNA ein relativ genaues Verfahren, das nur zu wenigen Umordnungen führt. Der zu übertragende DNA-Bereich wird durch die Bordersequenzen definiert, und dazwischenliegende DNA wird üblicherweise in das Pflanzengenom eingefügt, wie es beschrieben ist (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).
Moderne Agrobacterium-Transformationsvektoren sind zur Replikation in E. coli sowie Agrobacterium befähigt, was bequeme Manipulationen ermöglicht, wie es beschrieben ist (Klee et al., 1985). Außerdem haben jüngere technologische Fortschritte in Vektoren für die Agrobacterium-vermittelte Gen-Übertragung die Anordnung von Genen und Restriktionsstellen in den Vektoren verbessert, so dass die Konstruktion von Vektoren, die zum Exprimieren verschiedener Polypeptidcodierender Gene befähigt sind, erleichtert wird. Die beschriebenen Vektoren (Rogers et al., 1987) haben zweckmäßige Multilinkerbereiche, die von einem Promotor und einer Polyadenylierungsstelle flankiert werden, für die direkte Expression von eingefügten Polypeptid-codierenden Genen und sind für die vorliegenden Zwecke geeignet. Außerdem kann sowohl Agrobacterium, das funktionelle Ti-Gene enthält, als auch eines, das unschädlich gemachte Ti-Gene enthält, für die Transformationen verwendet werden. In solchen Pflanzenstämmen, bei denen die Agrobacterium-vermittelte Transformation effizient ist, ist sie wegen der leichten und definierten Genübertragung das Verfahren der Wahl.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Blattscheiben und anderen Geweben, wie Keimblättern und Hypokotylen, scheint auf Pflanzen beschränkt zu sein, die natürlicherweise von Agrobacterium infiziert werden. Die Agrobacteriumvermittelte Transformation ist bei Zweikeimblättrigen Pflanzen am effizientesten. Nur wenige Einkeimblättrige scheinen natürliche Wirte für Agrobacterium zu sein, doch wurden bei Spargel mit Hilfe von Agrobacterium-Vektoren transgene Pflanzen erzeugt, wie beschrieben (Bytebier et al., 1987). Daher müssen kommerziell wichtige Getreide, wie Reis, Mals und Weizen, gewöhnlich mit alternativen Verfahren transformiert werden. Wie oben erwähnt, kann jedoch auch die Transformation von Spargel mit Hilfe von Agrobacterium erreicht werden (siehe zum Beispiel Bytebier et al., 1987).
Eine transgene Pflanze, die mit Hilfe von Agrobacterium-Transformationsverfahren gebildet wurde, enthält typischerweise ein einzelnes Gen auf einem einzigen Chromosom. Solche transgenen Pflanzen können als heterozygot in Bezug auf das hinzugefügte Gen bezeichnet werden. Da die Verwendung des Wortes "heterozygot" jedoch gewöhnlich die Anwesenheit eines komplementären Gens auf demselben Locus des zweiten Chromosoms eines Chromosomenpaars impliziert und es kein solches Gen in einer Pflanze gibt, die wie hier nur ein einziges hinzugefügtes Gen enthält, ist ein vermutlich treffenderer Name für eine solche Pflanze eine "unabhängige segregierende", da das hinzugefügte, exogene Gen während der Mitose und Meiose unabhängig segregiert.
Besonders bevorzugt ist eine transgene Pflanze, die homozygot in Bezug auf das hinzugefügte Struktur-Gen ist, d.h., eine transgene Pflanze, die zwei hinzugefügte Gene enthält, jeweils ein Gen auf demselben Locus auf jedem Chromosom eines Chromosomenpaars. Eine homozygote transgene Pflanze kann erhalten werden, indem man eine unabhängig segregierende transgene Pflanze, die ein einzelnes hinzugefügtes Gen enthält, geschlechtlich mit sich selbst paart (Selbstbestäubung), einige der erzeugten Samen keimen lässt und die resultierenden Pflanzen auf eine verstärkte Carboxylase-Aktivität relativ zu einer Kontrolle (nativ, nichttransgen) oder einer unabhängig segregierenden transgenen Pflanze hin analysiert.
Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass auch zwei verschiedene transgene Pflanzen miteinander gepaart werden können, wobei Nachkommen entstehen, die zwei unabhängig segregierende hinzugefügte exogene Gene enthalten. Durch Selbstbestäubung von geeigneten Nachkommen können Pflanzen entstehen, die in Bezug auf beide hinzugefügten exogenen Gene, die ein interessierendes Polypeptid codieren, homozygot sind. Die Rückkreuzung mit einer Elternpflanze und die Kreuzung mit einer nicht verwandten, nichttransgenen Pflanze werden ebenfalls in Betracht gezogen.
4.7.4 Weitere Transformationsverfahren
Die Transformation von Pflanzenprotoplasten kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf Calciumphosphat-Fällung, Polyethylenglycol-Behandlung, Elektroporation und Kombinationen dieser Behandlungen beruhen (siehe z.B. Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1986; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).
Die Anwendung dieser Systeme auf verschiedene Pflanzenstämme hängt von der Möglichkeit ab, diesen besonderen Pflanzenstamm aus Protoplasten zu regenerieren. Beispielhafte Verfahren zur Regeneration von Getreiden aus Protoplasten sind beschrieben (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).
Um Pflanzenstämme zu transformieren, die aus Protoplasten nicht erfolgreich regeneriert werden können, können andere Methoden zur Einführung von DNA in intakte Zellen oder Gewebe verwendet werden. Zum Beispiel kann die Regeneration von Getreiden aus unreifen Embryos oder Explantaten bewirkt werden, wie es beschrieben ist (Vasil, 1988). Außerdem kann auch "Teilchenkanonen-" oder Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektiltechnik verwendet werden (Vasil, 1992).
Bei Verwendung der letzteren Technik wird DNA auf der Oberfläche von kleinen Metallteilchen durch die Zellwand und in das Cytoplasma getragen, wie es beschrieben ist (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988). Die Metallteilchen dringen durch mehrere Schichten von Zellen und ermöglichen so die Transformation von Zellen innerhalb von Gewebeexplantaten.
4.8 Verfahren zur Herstellung von insektenresistenten transgenen Pflanzen
Durch Transformieren einer geeigneten Wirtszelle, wie einer Pflanzenzelle, mit einem rekombinanten, ein cryET33- und/oder cryET34-Gen enthaltenden Segment kann die Expression des codierten Kristallproteins (d.h. eines bakteriellen Kristallproteins oder -polypeptids mit insektizider Aktivität gegen Coleoptera) zur Bildung von insektenresistenten Pflanzen führen.
Zum Beispiel kann man einen Expressionsvektor, der einen codierenden Bereich für ein B.-thuringiensis-Kristallprotein und einen geeigneten Selektionsmarker enthält, verwenden, um eine Suspension von embryonalen Pflanzenzellen, wie Weizen- oder Malszellen, zu transformieren, wobei man ein Verfahren wie Teilchenbombardierung (Maddock et al., 1991; Vasil et al., 1992) verwendet, um die DNA, mit der Mikroprojektile beschichtet sind, an die Empfängerzellen abzugeben. Dann werden transgene Pflanzen aus transformierten embryonalen Kalli, die die Insektiziden Proteine exprimieren, regeneriert.
Die Bildung von transgenen Pflanzen kann auch mit Hilfe von anderen Verfahren der Zelltransformation erreicht werden, die in der Technik bekannt sind, wie Agrobacterium-vermittelte DNA-Übertragung (Fraley et al., 1983). Alternativ dazu kann die DNA auch durch direkte DNA-Übertragung in Pollen (Zhou et al., 1983; Hess, 1987; Luo et al., 1988), durch Injektion der DNA in Reproduktionsorgane einer Pflanze (Pena et al., 1987) oder durch direkte Injektion von DNA in die Zellen von unreifen Embryos mit anschließender Rehydratisierung der dehydrierten Embryos (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986) in Pflanzen eingeführt werden.
Die Regeneration, Entwicklung und Kultivierung von Pflanzen aus einzelnen Pflanzenprotoplasten-Transformanten oder aus verschiedenen transformierten Explantaten ist in der Technik wohlbekannt (Weissbach und Weissbach, 1988). Dieser Regenerations- und Wachstumsvorgang beinhaltet typischerweise die Schritte der Selektion von transformierten Zellen, das Kultivieren dieser individualisierten Zellen durch die üblichen Stadien der Embryonalentwicklung hindurch und durch das Stadium des bewurzelten Pflänzchens hindurch. Transgene Embryos und Samen werden ähnlich regeneriert. Die resultierenden transgenen bewurzelten Schösslinge werden danach in ein geeignetes Pflanzenwachstumsmedium, wie Erde, gepflanzt.
Die Entwicklung oder Regeneration von Pflanzen, die das exogene Gen (Fremd-Gen) enthalten, welches ein interessierendes Polypeptid codiert und das durch Agrobacterium aus Blattexplantaten eingeführt wurde, kann durch Verfahren erreicht werden, die in der Technik wohlbekannt sind, wie es beschrieben ist (Horsch et al., 1985). Bei diesem Verfahren werden Transformanten in Gegenwart eines Selektionsmittels und in einem Medium, das die Regeneration von Schösslingen in dem transformierten Pflanzenstamm induziert, kultiviert, wie es beschrieben ist (Fraley et al., 1983).
Dieses Verfahren ergibt typischerweise innerhalb von zwei bis vier Monaten Schösslinge, und diese Schösslinge werden dann auf ein geeignetes wurzelinduzierendes Medium übertragen, das das Selektionsmittel und ein Antibiotikum, um Bakterienwachstum zu verhindern, enthält. Dann werden Schösslinge, die in Gegenwart des Selektionsmittels unter Bildung von Pflänzchen Wurzeln ausbildeten, in Erde oder ein anderes Medium umgepflanzt, um die Erzeugung von Wurzeln zu ermöglichen. Diese Verfahren variieren in Abhängigkeit von dem besonderen eingesetzten Pflanzenstamm, wobei solche Variationen in der Technik wohlbekannt sind.
Vorzugsweise werden die regenerierten Pflanzen einer Selbstbestäubung unterzogen, um homozygote transgene Pflanzen zu erhalten, wie es bereits diskutiert wurde. Ansonsten wird Pollen, der von den regenerierten Pflanzen erhalten wird, mit aus Samen aufgezogenen Pflanzen von agronomisch wichtigen, vorzugsweise ingezüchteten Linien gekreuzt. Umgekehrt wird Pollen von Pflanzen dieser wichtigen Linien verwendet, um regenerierte Pflanzen zu bestäuben. Eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, die ein gewünschtes Polypeptid enthält, wird mit Hilfe von Verfahren kultiviert, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Eine transgene Pflanze dieser Erfindung weist also eine erhöhte Menge eines codierenden Bereichs (z.B. ein cry-Gen) auf, der das interessierende Cry-Polypeptid codiert. Eine bevorzugte transgene Pflanze ist eine unabhängig segregierende und kann das Gen und seine Aktivität an seine Nachkommenschaft weitergeben. Eine besonders bevorzugte transgene Pflanze ist homozygot in Bezug auf dieses Gen und gibt das Gen bei geschlechtlicher Paarung an alle ihre Nachkommen weiter. Samen von einer transgenen Pflanze kann auf dem Feld oder im Gewächshaus ausgesät werden, und die resultierenden geschlechtsreifen Pflanzen werden einer Selbstbestäubung unterzogen, um echte Zuchtpflanzen zu erzeugen. Die Nachkommenschaft dieser Pflanzen wird zu echten Zuchtlinien, die zum Beispiel in Bezug auf erhöhte insektizide Kapazität gegen Coleoptera-Insekten, vorzugsweise auf dem Feld, unter einer Reihe von Umgebungsbedingungen bewertet werden. Die Erfinder gehen davon aus, dass die vorliegende Erfindung besonderen Nutzen bei der Schaffung von transgenen Pflanzen von kommerziellem Interesse finden wird, einschließlich verschiedener Rasengräser, Weizen, Mals, Reis, Gerste, Hafer, eine Vielzahl von Zierpflanzen und Gemüsen sowie einer Reihe von nuss- und obsttragenden Bäumen und Pflanzen.
5. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind mit aufgenommen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung aufzuzeigen. Der Fachmann sollte sich darüber im Klaren sein, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Ansätze darstellen, von denen die Erfinder herausgefunden haben, dass sie bei der praktischen Ausführung der Erfindung gut funktionieren, und diese können daher als bevorzugte praktische Ausführungsweisen derselben gelten. Der Fachmann sollte sich jedoch im Lichte der vorliegenden Offenbarung darüber im Klaren sein, dass in den speziellen offenbarten Ausführungsformen viele Änderungen vorgenommen werden können und man trotzdem ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhält, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.
5.1 Beispiel 1 – Isolierung von B. thuringiensis EG10327
Getreidestaubproben wurden aus verschiedenen Quellen in den gesamten USA und im Ausland, typischerweise Kornspeichereinrichtungen, erhalten. Die Getreidestaubproben wurden behandelt und auf Agarplatten ausgebreitet, um individuelle Kolonien des Bacillus-Typs zu isolieren, wie es im US-Patent 5,264,364 beschrieben ist.
Das klonierte cryIIIA-Gen, das früher als cryC-Gen des bei Donovan et al. (1988) beschriebenen B.-thuringiensis-Stamms EG2158 bekannt war, und das klonierte cryIIIB2-Gen, das früher als cryIIIC-Gen des bei Donovan et al. (1992) beschriebenen B.-thuringiensis-Stamms EG4961 bekannt war, wurden als Sonden in Koloniehybridisierungsverfahren verwendet. Die cryIIIA-Gen-Sonde bestand aus einem radioaktiv markierten 2,0-kb-HindIII-Xbal-DNA-Restriktionsfragment, wie es bei Donovan et al. (1988) beschrieben ist. Die cryIII82-Gen-Sonde bestand aus einem radioaktiv markierten 2,4-kb-SspI-DNA-Restriktionsfragment, wie es bei Donovan et al. (1992) beschrieben ist. Die Koloniehybridisierungsverfahren wurden so durchgeführt, wie es im US-Patent 5,264,364 beschrieben ist.
Ungefähr 43 000 Kolonien des Bacillus-Typs aus 54 Getreidestaubproben von verschiedenen Stellen wurden mit den radioaktiv markierten cryIIIA- und cryIIIB2-Sonden sondiert. Eine Getreidestaubprobe aus Griechenland enthielt ungefähr 100 natürlich vorkommende Kolonien des Bacillus-Typs, die mit der cryIIIA- und der cryIIIB2-Sonde hybridisierten. Die Analyse von mehreren dieser natürlich vorkommenden Wildtypkolonien wies darauf hin, dass es sich um identische B.-thuringiensis-Kolonien handelte, und eine Kolonie, die als EG10327 bezeichnet wurde, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Der B.-thuringiensis-Stamm EG10327 wurde am 14. Dezember 1994 unter den Be stimmungen des Budapester Abkommens beim NRRL mit der Zugriffs-Nr. NRRL B-21365 hinterlegt.
Anschließend wurden ungefähr 84 000 Kolonien des Bacillus-Typs aus 105 Getreidestaubproben von verschiedenen Stellen ebenfalls mit den radioaktiv markierten cryIIIA- und cryIIIB2-Sonden durchmustert, aber es gelang nicht, andere Stämme zu identifizieren, die neue Gene des cryIII-Typs enthielten.
Der B.-thuringiensis-Stamm EG10327 erwies sich als insektizid aktiv gegen die Larven von Coleoptera-Insekten, insbesondere des Rotbraunen Reismehlkäfers, des Baumwollkapselkäfers und des Japankäfers. Der Stamm EG10327 hatte unter den verwendeten Testbedingungen keine messbare insektizide Aktivität gegen den Südlichen Malswurzelbohrer oder den Kartoffelkäfer. Ein als "cryIIIA-truncated" bezeichnetes Gen wurde aus dem Stamm EG10327 isoliert, und seine Nucleotidbasensequenz wurde bestimmt. Das cryIIIA-truncated-Gen erwies sich als identisch mit den ersten zwei Dritteln des cryIIIA-Gens (bei Donovan et al., 1988, als cryC-Gen beschrieben), enthielt aber nicht das letzte Drittel des cryIIIA-Gens. Das cryIIIA-truncated-Gen des Stamms EG10327 produzierte, wenn überhaupt, nur sehr wenig Kristallprotein und wurde nicht näher charakterisiert.
5.2 Beispiel 2 – Bewertung des begeißelten Serotyps von EG10327
Um den Stamm EG10327 zu charakterisieren, wurden mehrere Studien durchgeführt. Eine Studie wurde durchgeführt, um den begeißelten Serotypen zu charakterisieren. Diese Daten sind unten angegeben.
Der begeißelte Serotyp des Stamms EG10327 wurde im Labor von Dr. M.-M. Lecadet am Institut Pasteur in Paris, Frankreich, bestimmt. Der Serotyp von EG10327 wurde nach den Verfahren bestimmt, die von H. de Barjac (1981) beschrieben wurden, und erwies sich als Bacillus thuringiensis kurstaki (H3a, 3b, 3c). Die zuvor beschriebenen B.-thuringiensis-Stämme, die mit cryIII verwandte Gene enthielten, erwiesen sich als Serotyp morrisoni (Stamm EG2158, der cryIIIA enthält), Serotyp tolworthi (Stamm EG2838, der cryIIIB enthält) und Serotyp kumamotoensis (Stamm EG4961, der cryIII82 enthält) (Rupar et al., 1991). EG10327 stellt den ersten B.-thuringiensis-kurstaki-Stamm dar, von dem gezeigt wurde, dass er toxisch gegenüber Coleoptera ist.
5.3 Beispiel 3 – Bewertung der Kristallproteine von EG10327
Der Stamm EG10327 wurde weiterhin bewertet, indem die Kristallproteine, die er produziert, charakterisiert wurden. Diese Studien wurden durchgeführt, indem man EG10327 in DSG-Sporenbildungsmedium [0,8% (w/v) Difco-Nährbouillon, 0,5% (w/v) Glucose, 10 mM K₂HPO₄, 10 mM KH₂PO₄, 1 mM Ca(NO₃)₂, 0,5 mM MgSO₄, 10 μM MnCl₂, 10 μM FSO₄] züchtete. Dann wurde die Kultur, die Sporen gebildet hatte und sowohl Sporen als auch Kristallproteine enthielt, durch Zentrifugation geerntet und in entionisiertem Wasser suspendiert. Aus der Suspension der EG10327-Sporen und -Kristalle wurden Kristallproteine in Lösung gebracht, indem man die Suspension 5 min lang bei 100 °C in Solubilisierungspuffer [0,14 M Tris, pH 8,0, 2% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% (v/v) 2-Mercaptoethanol, 10% (v/v) Glycerin und 0,1% (w/v) Bromphenolblau] inkubiert.
Die in Lösung gebrachten Kristallproteine wurden durch Elektrophorese über ein Acrylamid-Gel (SDS-PAGE-Analyse) nach Größe aufgetrennt. Nach der Auftrennung nach Größe wurden die Proteine durch Anfärben mit Coomassie-Farbstoff sichtbar gemacht. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass ein vorwiegendes Kristallprotein von ungefähr 29 kDa, das im Folgenden als CryET33-Protein bezeichnet wird, und ein vorwiegendes Kristallprotein von ungefähr 14 kDa, das im Folgenden als CryET34-Protein bezeichnet wird, aus der EG10327-Kultur, die Sporen gebildet hatte, in Lösung gebracht wurde.
Das 29-kDa-CryET33-Protein und das 14-kDa-CryET34-Protein von EG10327 wurden durch Bestimmung ihrer NH₂-terminalen Aminosäuresequenzen wie folgt näher charakterisiert. Die EG10327-Kultur, die Sporen gebildet hatte, wurde mit Solubilisierungspuffer inkubiert, und solubilisierte Kristallproteine wurden einer Auftrennung nach Größe über ein Acrylamid-Gel durch SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Die Proteine wurden durch Standard-Elektroblotting-Techniken vom Gel auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Das CryET33-Protein und das Cry-ET34-Protein, die durch Elektroblotting auf den Filter übertragen worden waren, wurden durch Anfärben des Filters mit Coomassie-Farbstoff sichtbar gemacht. Teile des Filters, die das CryET33-Protein und das CryET34-Protein enthielten, wurden mit einer Rasierklinge herausgeschnitten. Auf diese Weise wurden das CryET33-Protein und das CryET34-Protein in reiner Form als Proteine, die auf getrennte Stücke des Nitrocellulosefilters übertragen worden waren, erhalten.
Die gereinigten CryET33- und CryET34-Proteine, die auf Nitrocellulosefilterstücken enthalten waren, wurden einem automatisierten Standard-Edman-Abbauverfahren unterzogen, um die NH₂-terminate Aminosäuresequenz jedes Proteins zu bestimmen.
Als NH₂-terminate Sequenz des CryET33-Proteins von EG10327 wurde gefunden:
Als NH₂-terminale Sequenz des CryET34-Proteins von EG10327 wurde gefunden:
Die in Klammern unter der Sequenz des CryET34-Proteins aufgeführten Aminosäurereste stellen potentielle alternative Aminosäuren dar, die im CryET34-Protein auf der angegebenen Position vorhanden sein können. Alternative Aminosäuren sind aufgrund der Ungewissheit möglich, die der Verwendung des automatisierten Edman-Abbauverfahrens zur Bestimmung von Aminosäuresequenzen von Proteinen inhärent ist.
Computer-Algorithmen (Korn und Queen, 1984) wurden verwendet, um die N-terminale Sequenz des CryET33- und des CryET34-Proteins mit Aminosäuresequenzen aller B.-thuringiensis-Kristallproteine, von denen die Erfinder wissen, einschließlich der Sequenzen aller B.-thuringiensis-Kristallproteine, die in der wissenschaftlichen Literatur, in internationalen Patentanmeldungen oder erteilten Patenten veröffentlicht sind, zu vergleichen. Eine Liste der Kristallproteine, deren Sequenzen veröffentlicht wurden, zusammen mit der Publikationsquelle ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 In der Literatur beschriebene B.-thuringiensis-Kristallproteine
Tabelle 5 (Fortsetzung
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Es zeigte sich, dass die N-terminale Sequenz des CryET34-Proteins von EG10327 zu keinem der in Tabelle 5 identifizierten bekannten B.-thuringiensis-Kristallproteine homolog ist.
5.4 Beispiel 4 – Charakterisierung des CryET33-Kristallproteins von EG2159
Es wurde schon früher bestimmt, dass das 68-kDa-CryIIA-Protein von EG2159 (bei Donovan et al., 1988, als CryC-Protein bezeichnet) gegenüber dem Kartoffelkäfer toxisch ist, aber es wurde in dem Stamm kein Protein identifiziert, das Aktivität gegen Lepidoptera oder Diptera aufwies.
Der Stamm EG2159 wurde aus dem B.-thuringiensis-Stamm EG2158 abgeleitet, indem man aus EG2158 ein 150-MDa-Plasmid entfernte (beschrieben bei Donovan et al., 1988). EG2159 ist mit EG2158 identisch, außer dass EG2159 ein 150-MDa-Plasmid fehlt, das in EG2158 vorhanden ist. Eines der beiden von EG2159 produzierten Kristallproteine, das 68-kDa-CryIIIA-Protein, wurde isoliert, und das Gen, das es codiert, wurde kloniert und sequenziert. Diese Ergebnisse sind schon früher von den Erfindern beschrieben worden (Donovan et al., 1988). Eine in kleineren Mengen vorhandene Proteinspezies, ein 29-kDa-Protein von EG2159, wurde nicht näher charakterisiert.
Dieses Beispiel beschreibt die Charakterisierung dieses 29-kDa-CryET33-Kristallproteins aus B. thuringiensis EG2159.
5.4.1 – Isolierung von Kristallproteinen aus EG2159
Die Kristallproteine von EG2159 wurden in Lösung gebracht, indem man eine Kultur von EG2159, die Sporen gebildet hatte und sowohl Sporen als auch Kristallproteine enthielt, 3 min lang bei 80 °C in Proteinsolubilisierungspuffer suspendierte. Die in Lösung gebrachten Kristallproteine wurden durch SDS-PAGE nach Größe aufgetrennt, und Proteine im SDS-PAGE-Gel wurden durch Anfärben mit Coomassie-Farbstoff sichtbar gemacht. Gelscheiben, die das 29-kDa-Protein enthielten, wurden mit einer Rasierklinge aus dem SDS-PAGE-Gel ausgeschnit ten, und das Protein wurde durch Standard-Elektroelutionsverfahren aus den Gelscheiben abgetrennt. Diese Studien führten zu einem gereinigten Präparat des CryET33-Proteins aus dem B.-thuringiensis-Stamm EG2159.
5.4.2 NH₂-terminale Sequenzierung des 29-kDa-Proteins
Die NH₂-terminate Aminosäuresequenz des gereinigten CryET33-Proteins wurde durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die Aminosäuresequenz des NH₂-terminalen Teils des 29-kDa-Proteins wurde bestimmt zu:
Striche (---) auf Position 12 zeigen an, dass dieser Aminosäurerest für das CryET33-Protein von EG2159 nicht bestimmt werden konnte.
5.4.3 Ergebnisse
Ein Vergleich der Sequenz des CryET33-Proteins von EG10327 (SEQ ID Nr. 5) mit der NH₂-terminalen Sequenz des zuvor noch nicht charakterisierten 29-kDa-Proteins (Donovan et al., 1988), das in EG2159 beobachtet wurde (SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8) ließ vermuten, dass das NH₂-terminale Ende des 29-kDa-Proteins von EG2159 mit dem CryET33-Protein von EG10327 identisch ist, mit Ausnahme eines Methionin(Met)-Startrestes, der im CryET33-Protein von EG2159 vorhanden ist.
5.5 Beispiel 5 – Isolierung eines DNA-Fragments, das cryET33- und cryET34-Gene umfasst, aus EG2158
Wie oben beschrieben ist, wurde Stamm EG2159 von Stamm EG2158 abgeleitet. Daher enthält EG2158 dasselbe Gen für das CryET33-Protein, das im Folgenden als cryET33-Gen bezeichnet wird, wie der Stamm EG2159. Um das cryET33-Gen zu klonieren, wurde umgekehrte Genetik verwendet. Eine 33mer-Oligonucleotid-Sonde (als WD68 bezeichnet), die die Aminosäuren 1 bis 11 des NH₂-Terminus des CryET33-Proteins codierte, wurde synthetisiert. Die Sequenz von WD68 ist:
5'-ATGGGAATTATTAATATTCAAGATGAAATTAAT-3' (SEQ ID NO:9)
WD68 wurde als Sonde in Southern-Hybridisierungsstudien, wie sie unten beschrieben sind, verwendet, in einem Versuch, ein DNA-Fragment aus EG2158 zu identifizieren, das das cryET33-Gen für das 29-kDa-CryET33-Protein enthält. Gesamt-DNA wurde nach einem Standard-Lysozym/Phenol-Verfahren aus EG2158 extrahiert. Die extrahierte DNA wurde mit den DNA-Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI verdaut, und die verdaute DNA wurde durch Elektrophorese über ein Agarose-Gel der Größe nach aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden vom Gel auf ein Nitrocellulosefilter übertragen, wobei man früher beschriebene Verfahren verwendete (Southern, 1975), und der Filter wurde mit Oligonucleotid WD68 inkubiert, das mit T4-Kinase und [γ-³²P]ATP radioaktiv markiert worden war. Ein einzelnes DNA-Restriktionsfragment aus EG2158, an das die WD68-Sonde spezifisch hybridisierte, wurde nicht gefunden.
Dann wurde ein anderer Ansatz verwendet, um ein DNA-Restriktionsfragment zu identifizieren, das das cryET33-Gen enthielt. Eine 56mer-Oligonucleotidsonde (als WD73 bezeichnet), die die Aminosäuren 1 bis 19 des NH₂-Terminus des CryET33-Proteins codierte, wurde synthetisiert. Die Sequenz von WD73 ist:
wobei die drei Ns, die der Aminosäure 12 von WD73 entsprechen, drei Inosinnucleotide darstellen. Inosinreste wurden auf dieser Position verwendet, um die entsprechende unbekannte Aminosäure auf Position 12 in der NH₂-terminalen Sequenz des CryET33-Proteins zu codieren. Inosin gilt als neutrales Nucleotid, das die Bindung von DNA-Strängen weder fördert noch behindert. WD73 wurde mit T4-Kinase und [γ-³²P]ATP radioaktiv markiert und verwendet, um einen Nitrocellulosefilter zu sondieren, der nach der Größe aufgetrennte HindIII- und EcoRI-Restriktionsfragmente von EG2158-Gesamt-DNA enthielt. WD73 hybridisierte spezifisch mit einem HindIII-Fragment von ungefähr 7,9 kb und mit einem EcoRI-Fragment von ungefähr 5,2 kb von EG2158-DNA.
5.6 Beispiel 6 – Klonierung der cryET33- und cryET34-Gene von EG2158
Um das im vorigen Beispiel beschriebene 5,2-kb-EcoRI-Fragment zu isolieren, wurde eine Plasmidbibliothek des Stamms EG2158 aufgebaut, indem man nach Größe ausgewählte DNA-EcoRI-Restriktionsfragmente aus dem Stamm EG2158 in den E.-coli-Vektor pBR322 ligierte. Dieses Verfahren beinhaltete zuerst die Gewinnung von Gesamt-DNA aus dem Stamm EG2158 durch Zelllyse, dann eine Phenolextraktion der DNA, dass das Verdauen der Gesamt-DNA mit EcoRI-Restriktionsenzym, das Durchführen einer Elektrophorese mit der verdauten DNA durch ein Agarose-Gel, das Ausschneiden einer Gelscheibe, die EcoRI-DNA-Fragmente mit Größen im Bereich von ungefähr 4,0 bis 6,0 kb enthielt, und das Herauslösen der nach Größe ausgewählten EcoRI-Restriktionsfragmente aus der Agarose-Gelscheibe durch Elektroelution. Diese Fragmente wurden mit dem E.-coli-Plasmidvektor pBR322 gemischt, der ebenfalls mit EcoRI verdaut worden war. Der pBR322-Vektor trägt das Gen für Amp^R und die Vektorreplikate in E. coli. T4-DNA-Lipase und ATP wurden zu dem Gemisch von nach Größe ausgewählten Restriktionsfragmenten von DNA aus dem Stamm EG2158 und des verdauten pBR322-Vektors gegeben, so dass der pBR322-Vektor mit den Restriktionsfragmenten des Stammes EG2158 ligiert werden konnte.
Dann wurde die Plasmid-Bibliothek wie folgt in E.-coli-Zellen transformiert, einen Wirtsorganismus, dem die cryET33- und cryET34-Gene fehlen. Nach der Ligierung wurde das DNA-Gemisch mit dem Amp^s-E.-coli-Wirtsstamm HB101, der mit Hilfe von Standard-CaCl₂-Verfahren kompetent gemacht worden war, inkubiert. E. coli HB101 wurde als Wirtsstamm verwendet, da sich diese Zellen leicht mit rekombinanten Plasmiden transformieren lassen und da HB101 natürlicherweise keine Gene für B.-thuringiensis-Kristallproteine enthält. Da pBR322 Amp^R exprimiert, waren alle Wirtszellen, die ein rekombinantes Plasmid aufgenommen haben, ampicillinresistent. Nach dem Transformieren der Wirtszellen mit den rekombinanten Plasmiden wurden die Zellen auf Agarmedium, das Amp enthielt, ausgebreitet. Nach Inkubation über Nacht bei einer Temperatur von 37 °C wuchsen mehrere tausend E.-coli-Kolonien auf dem Amp-haltigen Agar, und diese Kolonien wurden dann zum anschließenden Sondieren auf Nitrocellulosefilter übertragen.
Dann wurde das radioaktiv markierte Oligonucleotid WD73 als DNA-Sonde verwendet, und zwar unter Bedingungen, die es der Sonde ermöglichten, spezifisch diejenigen transformierten Wirtskolonien zu binden, die das 5,2-kb-EcoRI-DNA-Fragment aus dem Stamm EG2158 enthielten. Mehrere E.-coli-Kolonien hybridisierten spezifisch mit der WD73-Sonde. Eine mit WD73 hybridisierende Kolonie, die als E. coli EG11460 bezeichnet wurde, wurde näher untersucht. E. coli EG11460 enthielt ein rekombinantes Plasmid, das als pEG246 bezeichnet wurde und das aus pBR322 plus dem eingesetzten EcoRI-Restriktions-DNA-Fragment aus dem Stamm EG2158 von ungefähr 5,2 kb bestand. Eine Restriktionskarte von pEG246 ist in 2 gezeigt. Der E.-coli-Stamm EG11460, der pEG246 enthält, wurde unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), mit der Zugriffs-Nr. NRRL B-21364 hinterlegt.
Die Nucleotidbasensequenz von ungefähr einem Drittel des klonierten 5,2-kb-EcoRI-Fragments von pEG246 wurde unter Verwendung des Standard-Didesoxyverfahrens nach Sanger bestimmt. Die Sequenzierung zeigte, dass das 5,2-kb-Fragment zwei benachbarte offene Leseraster enthielt, die Proteine und insbesondere zwei neue Kristalltoxin-Gene codierten. Das stromaufwärts gelegene offene Leseraster, das als cryET33 bezeichnet wird, codierte ein Protein, dessen NH₂-terminale Sequenz mit der NH₂-terminalen Sequenz des 29-kDa-CryET33-Proteins der Stämme EG2159 und EG10327 übereinstimmte. Das stromabwärts gelegene Gen, das als cryET34 bezeichnet wird, codierte ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der NH₂-terminalen Aminosäuresequenz übereinstimmte, die für das 14-kDa-CryET34-Protein von EG10327 bestimmt wurde. Die DNA-Sequenzen dieser neuen Gene sind von den Sequenzen der in Tabelle 5 aufgeführten bekannten Kristalltoxin-Gene von B. thuringiensis erheblich verschieden.
Die DNA-Sequenz des cryET33-Gens (SEQ ID Nr. 1) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET33-Proteins (SEQ ID Nr. 3), die vom cryET33-Gen codiert wird, sind in 1A, 1B und 1C gezeigt. Der proteincodierende Teil des cryET33-Gens (SEQ ID Nr. 1) ist durch die Nucleotide definiert, die auf Position 136 beginnen und auf Position 936 enden. Die Größe des CryET33-Proteins (SEQ ID Nr. 3), wie es vom cryET33-Gen (SEQ ID Nr. 1) abgeleitet ist, beträgt 29 216 Da (267 Aminosäuren). In 1A, 1B und 1C ebenfalls gezeigt sind die DNA-Sequenz des cryET34-Gens (SEQ ID Nr. 2) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET34-Proteins (SEQ ID Nr. 4), die vom cryET34-Gen codiert wird. Der proteincodierende Teil des cryET34-Gens (SEQ ID Nr. 2) ist durch die Nucleotide definiert, die auf Position 969 beginnen und auf Position 1346 enden. Die Größe des CryET34-Proteins (SEQ ID Nr. 4), wie es vom cryET34-Gen (SEQ ID Nr. 2) abgeleitet ist, beträgt 14 182 Da (126 Aminosäuren).
Computer-algorithmen (Korn und Queen, 1984; Altschul et al., 1990) wurden verwendet, um die DNA-Sequenzen des cryET33- und des cryET34-Gens und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen des CryET33- und des CryET34-Proteins mit den Sequenzen aller B.-thuringiensis-cry-Gene und Kristallproteine, von denen die Erfinder wissen (und die in Abschnitt 5.3, Beispiel 3, beschrieben und in Tabelle 5 aufgeführt sind), und mit den Sequenzen aller Gene und Proteine, die in der Genome Sequence Data Base (National Center for Genome Resources, Santa Fe, NM) enthalten sind, zu vergleichen. Es zeigte sich, dass die Sequenz des cryET34-Gens (SEQ ID Nr. 2) und die davon abgeleitete Sequenz des CryET34-Proteins (SEQ ID Nr. 4) nicht mit irgendwelchen bekannten Genen bzw. Proteinen verwandt sind. Es zeigte sich, dass die Sequenz des cryET33-Gens (SEQ ID Nr. 1) Sequenzidentität mit nur einem bekannten Gen aufweist und dass die Sequenzidentität sehr gering war. Die Sequenz des cryET33-Gens (801 Nucleotide) war zu 38% mit der Sequenz eines von Brown und Whiteley (1992) beschriebenen B.-thuringiensis-subsp.-thompsoni-Gens (1020 Nucleotide) identisch. Es zeigte sich, dass die davon abgeleitete Sequenz des CryET33-Proteins (SEQ ID Nr. 3) Sequenzidentität mit nur einem bekannten Protein aufweist und dass die Identität sehr gering war. Die vollständige Aminosäuresequenz des CryET33-Proteins (267 Aminosäuren) erwies sich als zu 27% identisch mit der vollständigen Aminosäuresequenz eines von Brown und Whiteley (1992) für ein gegenüber Raupen toxisches Protein beschriebenen B.-thuringiensissubsp.-thompsoni-Kristallproteins (340 Aminosäuren).
Die DNA-Sequenz unmittelbar stromaufwärts des cryET33-Gens (1A, 1B und 1C, Nucleotide 1 bis 135) wurde einer Recherche auf Homologien mit allen bekannten stromaufwärts gelegenen DNA-Sequenzen von Kristallprotein-Genen und mit den DNA-Sequenzen aller bekannten Gene in der Genome Sequence Database (Tabelle 5) unterzogen. DNA-Sequenzen unmittelbar stromaufwärts von codierenden Bereichen von Genen enthalten häufig Promotoren für die Expression der entsprechenden Gene. Diese Recherche hatte das Ergebnis, dass keine Homologien gefunden wurden.
5.7 Beispiel 7 – Expression der rekombinanten cryET33- und cryET34-Gene
Die Erfahrung hat gezeigt, dass klonierte B.-thuringiensis-Kristalltoxin-Gene in E. coli schlecht exprimiert werden, aber in rekombinanten B.-thuringiensis-Stämmen häufig stark exprimiert werden. pEG246, das die cryET33- und cryET34-Gene enthält (2), kann in E. coli, aber nicht in B. thuringiensis exprimiert werden. Um ein Plasmid zu erhalten, das die cryET33- und cryET34-Gene enthält und in B. thuringiensis repliziert werden kann, wurde ein Bacillusspp.-Plasmid in pEG246 eingesetzt, wie es unten beschrieben ist.
Das Bacillus-spp.-Plasmid pNN101 (Norton et al., 1985), das in B. thuringiensis repliziert werden kann und Chloramphenicol-Resistenz (Cam^R) sowie Tetracyclin-Resistenz (Tet^R) verleiht, wurde mit BamHI verdaut, und das verdaute Plasmid wurde mit dem Plasmid pEG246, das mit BamHI verdaut worden war, gemischt.
Die beiden Plasmide wurden mit T4-Ligase plus ATP miteinander ligiert. Dann wurde das Ligierungsgemisch verwendet, um kompetente E.-coli-DH5a-Zellen zu transformieren. Nach Inkubation mit dem Plasmidgemisch wurden die Zellen auf Agarplatten, die Tet enthielten, ausgestrichen. Es wurde erwartet, dass Zellen, die ein Plasmid aufgenommen hatten, das aus mit pEG246 ligiertem pNN101 bestand, tetracyclinresistent sein würden. Nach ungefähr 20 h Inkubation wuchsen mehrere Tet^R-E.-coli-Kolonien auf den Tet enthaltenden Agarplatten.
Aus einer Tet^R-Kolonie wurde Plasmid-DNA isoliert. Das Plasmid wurde mit BamHI verdaut und einer Elektrophorese über ein Agarose-Gel unterzogen. Das Plasmid, das als pEG1246 bezeichnet wurde, bestand aus zwei BamHI-DNA-Fragmenten von 5,8 kb und 9,6 kb, die den Plasmiden pNN101 bzw. pEG246 entsprachen. Eine Restriktionskarte von pEG1246 ist in 3 gezeigt.
Dann wurde der B.-thuringiensis-Stamm EG10368 durch Elektroporation mit pEG1246 transformiert, wobei schon früher beschriebene Verfahren verwendet werden (Macaluso und Mettus, 1991). Untransformierte Wirtszellen von EG10368 sind kristallnegativ (Cry) und Cam^s. Nach der Elektroporation wurde das Transformationsgemisch auf einem Cam enthaltenden Agarmedium ausgebreitet und ungefähr 16 h lang bei 30 °C inkubiert. Mit pEG1246 transformierte Zellen wären Cam^R. Eine Cam-resistente Kolonie, die als B. thuringiensis Stamm EG11403 bezeichnet wurde, enthielt ein Plasmid, dessen Restriktionsmuster mit dem von pEG1246 identisch war.
Zellen des Stammes EG11403 wurden bei 22 °C bis 25 °C in DSG-Sporulationsmedium gezüchtet, das Cam enthielt, bis Sporenbildung und Zelllyse erfolgt waren (4–5 Tage). Die mikroskopische Untersuchung ergab, dass die Kultur des Stammes EG11403, die Sporen gebildet hatte, Sporen und kleine schwimmende spindelförmige und unregelmäßig geformte Kristalle enthielt. Die Kristalle ähnelten denjenigen, die mit einer Kultur des Stammes EG10327, die Sporen gebildet hatte, beobachtet wurden.
Sporen, Kristalle und Zelltrümmer aus der Kultur des Stammes EG11403, die Sporen gebildet hatte, wurden durch Zentrifugation geerntet. Das Zentrifugensediment wurde einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen, und das Sediment wurde in entionisiertem Wasser suspendiert.
Kristallproteine in der EG11403-Suspension wurden durch Solubilisierung und SDS-PAGE-Analyse charakterisiert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass der Stamm EG11403 zwei vorherrschende Proteine von 29 kDa und 14 kDa produzierte. Wie erwartet, hatten das 29-kDa-Protein und das 14-kDa-Protein des Stammes EG11403 dieselbe Größe wie das 29-kDa-CryET33-Protein bzw. das 14-kDa-CryET34-Protein, die vom Stamm EG10327 produziert werden. Der Stamm EG11403 wurde am 14. Dezember 1994 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), mit der Zugriffs-Nr. NRRL B-21367 hinterlegt.
Das Gen, das das 29-kDa-CryET33-Protein von EG11403 codiert, ist das cryET33-Gen, und das Gen, das das 14-kDa-CryET34-Protein von EG11403 codiert, ist das cryET34-Gen. Die B.-thuringiensis-Stämme EG11403 und EG10327 produzierten ungefähr gleiche Mengen an CryET33-Protein. Dagegen produzierte der B.-thuringiensis-Stamm EG2158 ungefähr 1/10 der Menge des CryET33-Proteins wie entweder der Stamm EG11403 oder der Stamm EG10327.
5.8 Beispiel 8 – B. thuringiensis EG11402, das CryIIIB3, CryET33 und CryET34 enthält
Es wurde bereits gezeigt, dass das als CryIIIB3 bezeichnete B.-thuringiensis-Kristallprotein gegenüber Larven des Japankäfers toxisch ist (US-Patent Nr. 5,264,364). Im folgenden Beispiel erwiesen sich die Proteine CryET33 und CryET34 als toxisch gegenüber Larven des Baumwollkapselkäfers und des Japankäfers. Das CryB3-Protein weist keine Aminosäuresequenzhomologie mit dem CryET33-Protein oder dem CryET34-Protein auf. In einem Versuch, einen Stamm mit verstärkter Toxizität gegenüber Japankäfer zu produzieren, wurden das cry3B3-Gen, das cryET33-Gen und das cryET34-Gen wie folgt in einem einzigen Stamm miteinander kombiniert.
Der Stamm EG10364 ist ein Wildtyp-B.-thuringiensis-Stamm, der das cryIIIB3-Gen enthält. EG10364 produziert das gegenüber Larven des Japankäfers toxische Cry3B3-Protein. pEG1246 (3), das die Gene cryET33 und cryET34 enthält, wurde verwendet, um EG10364 durch Elektroporation zu transformieren, was den Stamm EG11402 ergab. EG11402 ist mit EG10364 identisch, außer dass EG11402 außerdem pEG1246 enthält (das die klonierten cryET33- und cryET34-Gene trägt) und folglich Cam-resistent ist.
Der Stamm EG11402 wurde bei Raumtemperatur in DSG-Sporulationsmedium plus Cam gezüchtet, bis Sporenbildung und Zelllyse erfolgt waren (4–5 Tage). Kristallproteine wurden aus der EG11402-Kultur, die Sporen gebildet hatte, solubilisiert, und die solubilisierten Proteine wurden durch SDS-PAGE nach Größe aufgetrennt. Diese Analyse ergab, dass der Stamm EG11402 drei Kristallproteine produzierte: ein 70-kDa-Kristallprotein, das dem CryIIIB3-Protein entsprach, ein 29-kDa-Kristallprotein, das dem CryET33-Protein entsprach, und ein 14-kDa-Kristallprotein, das dem CryET34-Protein entsprach. Eine SDS-PAGE-Analyse zeigte, dass der Stamm EG10364, der auf identische Weise wie EG11402, nur ohne Chloramphenicol gezüchtet worden war, das 70-kDa-CryIIIB3-Protein in ähnlichen Mengen produzierte wie EG11402. Der Stamm EG11402 wurde am 14. Dezember 1994 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), mit der Zugriffs-Nr. NRRL B-21366 hinterlegt.
5.9 Beispiel 9 – Toxizität von CryET33 und CryET34 gegenüber Larven des Japankäfers
Die Toxizität gegenüber Larven des Japankäfers (Popillia japonica) wurde für drei B.-thuringiensis-Stämme bestimmt: (1) den Stamm EG10327, der die Kristallproteine CryET33 und CryET34 produziert; (2) den Stamm EG10364, der das Kristallprotein Cry3B3 produziert; und (3) den Stamm EG11402, der die Kristallproteine CryET33, CryET34 und Cry3B3 produziert.
Die Stämme EG10327, EG10364 und EG11402 wurden bei Raumtemperatur (20 bis 23 °C) in DSG-Sporulationsmedium gezüchtet, bis Sporenbildung und Zelllyse erfolgt waren (4–5 Tage). Bei EG11402 enthielt das Medium 5 μg/ml Cam. Die Fermentationsbrühe wurde durch Zentrifugation konzentriert, und die Sedimente, die Sporen, Kristallproteine und Zelltrümmer enthielten, wurden entweder unter Bildung von Pulvern gefriergetrocknet oder in entionisiertem Wasser resuspendiert, was wässrige Suspensionen ergab. Die Mengen der Kristallproteine Cry3B3 und CryET33 in den gefriergetrockneten Pulvern und in den Suspensionen wurden mit Hilfe von SDS-PAGE-Techniken und Densitometer-Nachverfolgung von mit Coomassie angefärbten SDS-PAGE-Gelen mit gereinigtem und quantifiziertem Cry3A-Protein als Standard quantifiziert. Die Menge des CryET34-Proteins wurde durch visuelle Inspektion von mit Coomassie angefärbten SDS-PAGE-Gelen abgeschätzt. Diese Inspektion zeigte an, dass die Menge des CryET34-Proteins im Wesentlichen äquivalent zur Menge des CryET34-Proteins in den Stämmen EG10327 und EG11402 war.
Das Bioassayverfahren für die Larven des Japankäfers wurde wie folgt durchgeführt. Gefriergetrocknete Pulver von jedem zu testenden Stamm wurden in einem Verdünnungsmittel (einer wässrigen Lösung, die 0,005% Triton X-100^® enthielt) suspendiert und in 100 ml heiße (50–60 °C) flüssige künstliche Nahrung auf der Basis der schon früher beschriebenen (Ladd, 1986) Insektennahrung eingearbeitet. Man ließ die Gemische in Petri-Schalen fest werden, und dann wurden Pfropfen der fest gewordenen Nahrung mit einem Durchmesser von 19 mm in 5/8-Ounce-Kunststoffbecher gegeben. Eine Japankäferlarve wurde pro Becher eingeführt, die Becher wurden mit einem Deckel abgedeckt und vierzehn Tage lang auf 25 °C gehalten, bevor die Mortalität der Larven bewertet wurde. Zwei Parallelansätze mit jeweils sechszehn Larven wurden in dieser Studie durchgeführt.
Die Ergebnisse dieses Toxizitätstests sind unten in Tabelle 6 gezeigt, wo die Insektizide Aktivität als Prozentsatz von toten Larven angegeben ist, wobei die prozentuale Mortalität in Bezug auf die Kontrollmortalität korrigiert wurde, wobei es sich bei der Kontrolle nur um Verdünnungsmittel handelte, das in den Nahrungspfropfen eingearbeitet wurde. Tabelle 6 Aktivität von CryET33, CryET34 und Cry3B3 gegenüber Larven des Japankäfers

^a NB, nicht bestimmt.

Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse beweisen, dass die Proteine CryET33 und CryET34 eine signifikante Toxizität gegenüber Larven des Japankäfers haben. EG10327, das die Proteine CryET33 und CryET34 produziert, ist toxisch gegenüber Larven des Japankäfers. EG10364, das das Protein Cry3B3 produziert, ist ebenfalls toxisch gegenüber Larven des Japankäfers. Wenn die Gene cryET33 und cryET34 zu EG10364 hinzugefügt werden, was zu EG11402 führt, das neben dem Protein Cry3B3 die Proteine CryET33 und CryET34 produziert, wurde eine verstärkte Toxizität gegenüber Larven des Japankäfers beobachtet.
5.10 Beispiel 10 – Toxizität von CryET33 und CryET34 gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers
Die Toxizität gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers (Trobolium castaneum) wurde für vier B.-thuringiensis-Stämme bestimmt: (1) EG10327, der die Kristallproteine CryET33 und CryET34 produziert; (2) EG10364, der das Kristallprotein Cry3B3 produziert; (3) EG11403, der die Kristallproteine CryET33 und CryET34 produziert; und (4) EG11402, der die Kristallproteine Cry3B3, CryET33 und CryET34 produziert. Die vier Stämme wurden in DSG-Medium gezüchtet, bis Sporenbildung und Zelllyse erfolgt waren, und wässrige Suspensionen oder gefriergetrocknete Pulver wurden so hergestellt, wie es in Beispiel 9 beschrieben ist. Die Toxizität jedes Stamms gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers wurde bestimmt, indem man eine bekannte Menge jedes Stammpräparats auf eine künstliche Nahrung auftrug und die Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers mit der Nahrung fütterte.
Die Ergebnisse dieses Toxizitätstests sind unten in Tabelle 7 gezeigt, wo die insektizide Aktivität als Prozentsatz von toten Larven angegeben ist, wobei die prozentuale Mortalität in Bezug auf die Kontrollmortalität korrigiert wurde, wobei es sich bei der Kontrolle nur um Verdünnungsmittel handelte, das in den Nahrungspfropfen eingearbeitet wurde. Tabelle 7 Toxizität der Proteine CryET33, CryET34 und Cry3B3 gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers

^a NB, nicht bestimmt.

Die in Tabelle 7 gezeigten Ergebnisse beweisen, dass die Proteine CryET33 und CryET34 eine signifikante Toxizität gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers haben. Der natürlich vorkommende Stamm EG10327, der die Proteine CryET33 und CryET34 produziert, ist in hohem Maße toxisch gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers. EG10364, das das Protein Cry3B3 produziert, ist toxisch gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers. EG11403, das die Proteine CryET33 und CryET34 produziert, ist toxisch gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers. Wenn die Gene cryET33 und cryET34 zu EG10364 hinzugefügt werden, wird in dem resultierenden Stamm, der die Proteine CryET33, CryET34 und Cry3B3 produziert, eine verstärkte Toxizität gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers beobachtet.
5.11 Beispiel 11 – Toxizität von CryET33 und CryET34 gegenüber Larven des Baumwollkapselkäfers
EG11403, das die Proteine CryET33 und CryET34 produziert, wurde so gezüchtet, wie es beschrieben ist. Die Proteinkristalle wurden gewaschen, in Carbonatpuffer in Lösung gebracht, dialysiert und durch eine 0,2-U-Acrodisc filtriert. Dann wurde die Toxizität der in Lösung gebrachten Proteine bestimmt, indem man eine bekannte Menge der Proteine zu künstlicher Nahrung gab und Larven des Baumwollkapselkäfers mit der Nahrung fütterte. Die Ergebnisse dieses Toxizitätstests sind unten gezeigt, wo die Insektizide Aktivität angegeben ist entweder als (1) prozentuale Mortalität, wobei die Mortalität in Bezug auf die Kontrollmortalität unter Verwendung einer Pufferkontrolle korrigiert wurde, oder (2) als prozentuale Mortalität plus der Prozentsatz der Larven, die sich nicht über das erste Häutungsstadium hinaus entwickelten, wobei die Mortalität wiederum in Bezug auf die Kontrollmortalität unter Verwendung einer Pufferkontrolle korrigiert wurde.
Die Ergebnisse in Tabelle 8 und Tabelle 9 beweisen, dass die Proteine CryET33 und CryET34 einen erheblichen Grad der Toxizität gegenüber Larven des Baumwollkapselkäfers aufweisen. Tabelle 8 (1) Prozentuale Mortalität des Baumwollkagselkäfers
Tabelle 9 (2) Prozentuale Mortalität + erstes Häutungsstadium
6. Literatur
Die folgenden Literaturstellen liefern beispielhafte verfahrensmäßige oder andere Einzelheiten, die die hier dargelegten ergänzen.

US-Patent Nr. 4,196,265, erteilt am 1. Apr. 1980.
US-Patent Nr. 4,554,101, erteilt am 19. Nov. 1985.
US-Patent Nr. 4,683,195, erteilt am 28. Juli 1987.
US-Patent Nr. 4,683,202, erteilt am 28. Juli 1987.
US-Patent Nr. 4,757,011, erteilt am 12. Juli 1988.
US-Patent Nr. 4,766,203, erteilt am 23. Aug. 1988.
US-Patent Nr. 4,769,061, erteilt am 6. Sep. 1988.
US-Patent Nr. 4,771,131, erteilt am 13. Sep. 1988.
US-Patent Nr. 4,797,279, erteilt am 10. Jan. 1989.
US-Patent Nr. 4,910,016, erteilt am 20. März 1990.
US-Patent Nr. 4,940,835, erteilt am 23. Feb. 1990.
US-Patent Nr. 4,965,188, erteilt am 23. Okt. 1990.
US-Patent Nr. 4,966,765, erteilt am 30. Okt. 1990.
US-Patent Nr. 4,971,908, erteilt am 20. Nov. 1990.
US-Patent Nr. 4,996,155, erteilt am 26. Feb. 1991.
US-Patent Nr. 4,999,192, erteilt am 12. März 1991.
US-Patent Nr. 5,006,336, erteilt am 9. Apr. 1991.
US-Patent Nr. 5,024,837 erteilt am 18. Juni 1991.
US-Patent Nr. 5,055,293, erteilt am 8. Okt. 1991.
US-Patent Nr. 5,055,294, erteilt am 8. Okt. 1991.
US-Patent Nr. 5,128,130, erteilt am 15. Okt. 1991.
US-Patent Nr. 5,176,995, erteilt am 15. Okt. 1991.
US-Patent Nr. 5,187,091, erteilt am 15. Okt. 1991.
US-Patent Nr. 5,264,364, erteilt am 23. Nov. 1993.
US-Patent Nr. 5,286,486, erteilt am 15. Feb. 1994.
US-Patent Nr. 5,384,253, erteilt am 24. Jan. 1995.
US-Patent Nr. 5,441,884, erteilt am 15. Aug. 1995.
Eur. Patent Nr. 0308199, veröffentlicht am 22. März 1989.
Eur. Patent Nr. 0318143, veröffentlicht am 31. Mal 1989.
Eur. Patent Nr. 0324254, veröffentlicht am 19. Juli 1989.
Eur. Patent Nr. 0382990, veröffentlicht am 22. Aug. 1990.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 90/13651, veröffentlicht am 15. Nov. 1990.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 91/07481, veröffentlicht am 30. Mal 1991.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 91/10725, veröffentlicht am 25. Juli 1991.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 91/16433, veröffentlicht am 31. Okt. 1991.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 93/03154, veröffentlicht am 18. Feb. 1993.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 94/13785, veröffentlicht am 23. Juni 1994.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 94/16079, veröffentlicht am 21. Juli 1994.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 95/02693, veröffentlicht am 26. Jan. 1995.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 95/06730, veröffentlicht am 9. März 1995.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 95/30752, veröffentlicht am 16. Nov. 1995.
Intl. Pat. Appl. Publ. Nr. WO 95/30753, veröffentlicht am 16. Nov. 1995.
Abdullah et al., Biotechnology, 4:1087, 1986.
Adelman et al., DNA, 2/3:183-193, 1983.
Allen and Choun, "Large unilamellar liposomes with low uptake into the reticuloendothelial system," FEBS Lett., 223:42-46, 1987.
Altschul, Stephen F. et al., "Basic local alignment search tool," 1. Mol. Biol., 215:403-410, 1990.
Arvidson et al., Mol. Biol., 3:1533-1534, 1989.
Baum et al., Appl. Environ. Microbiol., 56:3420-3428, 1990.
Benbrook et al., In: Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27–54, 1986.
Berhnard, FEMS Microbiol. Lett., 33:261–265, 1986. Bolivar et al., Gene, 2:95, 1977.
Brown and Whiteley, J. Bacteriol., 174:549–557, 1992. Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345, 1987. Callis et al., Genes and Development, 1:1183, 1987.
Campbell, "Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp. 75–83, Elsevier, Amsterdam, 1984.
Campbell, "Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp. 75–83, Elsevier, Amsterdam, 1984.
Capecchi, M. R., "High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells," Cell 22(2):479–488, 1980.
Cashmore et al., Gen. Eng. of Plants, Plenum Press, New York, 29–38, 1983.
Chambers et al., J. Bacteriol., 173:3966–3976, 1991. Chang et al., Nature, 375:615, 1978.
Chau et al., Science, 244:174–181, 1989.
Clapp, D. W., "Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Current status and future implications," Clin. Perinatol. 20(1):155–168, 1993.
Couvreur et al., "Nanocapsules, a new lysosomotropic carrier," FEBS Lett., 84:323–326, 1977.
Couvreur, "Polyalkyleyanoacrylates as colloidal drug carriers," Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 5:1–20, 1988.
Crickmore et al., Abstr. 28th Annu. Meet. Soc. Invert. Pathol., Cornell University, Ithaca, N.Y., 1995.
Cristou et al., Plant Physiol, 87:671–674, 1988.
Curiel, D. T., Agarwal, S., Wagner, E., and Cotten, M., "Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(19):8850–8854, 1991.
Curiel, D. T., Wagner, E., and Cotten, M., Birnstiel, M. L., Agarwal, S., Li, C. M., Loechel, S., and Hu, P. C. high-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes," Hum. Gen. Ther. 3(2):147–154, 1992. de Barjac, In: Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H. D. Bunges, ed., Academic Press, London, 36–43, 1981.
Donovan et al., Appl. Environ. Microbiol., 58:3921–3927, 1992. Donovan et al., In: Mol. Gen. Genet., 214:365–372, 1988. Donovan et al., Mol. Gen. Genet., 214:365–372, 1988.
Eglitis, M. A., and Anderson, W. F., "Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells," Biotechniques 6(7):608–614, 1988.
Eglitis, M. A., Kantoff, P. W., Kohn, D. B., Karson, E., Moen, R. C., Lothrop, C. D., Blaese, R. M., and Anderson, W. F., "Retroviral-mediated gene transfer into hemopoietic cells," Avd. Exp. Med. Biol. 241:19–27, 1988.
Eichenlaub, R., J. Bacteriol., 138(2):559–566, 1979.
Fiers et al., Nature, 273:113, 1978.
Fraley et al., Biotechnology, 3:629, 1985.
Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803, 1983.
Fromm, M., Taylor, L. P., and Walbot, V., "Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824–5828, 1985.
Fromm, M., Taylor, L. P., and Walbot, V., "Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824–5828, 1985.
Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2:74, 1985.
Fynan, E. F., Webster, R. G., Fuller, D. H., Haynes,). R., Santoro,). C., and Robinson, H. L., "DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene gun inoculations," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24):11478–11482, 1993.
Gawron-Burke and Baum, Genet. Engineer., 13:237–263, 1991. Gefter et al., Somat. Cell Genet., 3:231–236, 1977.
Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3:231–236, 1977.
Gill et al., J. Biol. Chem., 270:27277–27282, 1995.
Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 60–74. 2nd Edition, Academic Press, Orlando, Fla., 1986.
Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 60–74. 2nd Edition,
Academic Press, Orlando, Fla., 1986.
Goeddel et al., Nature, 281:544, 1979.
Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8:4057, 1980.
Graham, F. L., and van der Eb, A. J., "Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5," Virology 54(2):536–539, 1973.
Green, Nucl. Acids Res. 16(1):369. 1988.
Grochulski et al., J. Mol. Biol., 254:447–464, 1995.
Harlow, E. and Lane, D. "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988.
Henry-Michelland et al., "Attachment of antibiotics to nanoparticles; Preparation, drug-release and antimicrobial activity in vitro, Int. J. Pharm., 35:121–127, 1987.
Herrnstadt et al., Bio/Technology, 4:305–308, 1986. Herrnstadt et al., Gene, 57:37–46, 1987.
Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149, 1968.
Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367, 1987.
Hilber, U. W., Bodmer, M., Smith, F. D., and Koller, W., "Biolistic transformation of conidia of Botryotinia fuckeliana," Curr. Genet. 25(2):124–127, 1994.
Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980.
Hofte and Whiteley, Microbiol. Rev., 53:242–255, 1989. Höfte et al. Nucl. Acids Res., 15:7183, 1987.
Hofte et al., Microbiol. Rev., 53:242–255, 1989.
Höfte et al., Microbiol. Rev., 53:242–255, 1989.
Holland et al., Biochemistry, 17:4900, 1978.
Honee et al., Mol. Microbiol., 5:2799–2806, 1991.
Hoover et al., (Eds.), "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15th Edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975.
Horton et al., Gene, 77:61–68, 1989.
Itakura et al., Science, 198:1056, 1977.
Jameson and Wolf, "The Antigenic Index: A Novel algorithm for Predicting Antigenic Determinants," Compu. Appl. Biosci., 4(1):181–6, 1988.
Johnston, S. A., and Tang, D. C., "Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization," Methods Cell. Biol. 43(A):353–365, 1994.
Jones, Genetics, 85:12 1977.
Jorgensen et al., Mol. Gen. Genet., 207:471, 1987. Keller et al., EMBO J., 8:1309–14, 1989.
Kingsman et al., Gene, 7:141, 1979.
Klein et al., Nature, 327:70, 1987.
Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8502–8505, 1988.
Knight et al., J. Biol. Chem., 270:17765–17770, 1995.
Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511–519, 1976.
Kohler and Milstein, Nature 256:495–497, 1975.
Korn and Queen, DNA, 3:421–436, 1984.
Kreig et al., AnzSchaed. lingskde, Pflanzenschutz, Umwelrschulz, 57:145–150, 1984.
Kreig et al., In: Zangew Ent., 96:500–508, 1983.
Krieg et al., J. Appl. Ent., 104:417–424, 1987.
Kuby, J., "Immunology" 2nd Edition. W. H. Freeman & Company, New York, 1994.
Kuby, J., Immunology 2nd Edition, W. H. Freeman & Company, NY, 1994 Kyte, J., and Doolittle, R. F., A simple method for displaying the hydnopathic character of a protein," J. Mol. Biol. 157(1):105–132, 1982.
Ladd, Jr., J Econ. Entomol., 79:00668–671, 1986.
Lambert et al., Appl. Envinon. Micnobiol., 58:2536–2642, 1992b. Lambert et al., Gene, 110:131–132, 1992a.
Langridge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3219–3223, 1989.
Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 216:306–312, 1995.
Lindstrom et al., Developmental Genetics, 11:160, 1990.
Lonz et al., Mol. Gen. Genet., 199:178, 1985.
Lu, L., Xiao, M., Clapp, D. W., Li, Z. H., and Bnoxmeyer, H. E., "High efficiency retrovinal mediated gene transduction into single isolated immature and neplatable CD34(3+) hematopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood," J. Exp. Med. 178(6):2089–2096, 1993.
Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165, 1988.
Macaluso and Mettus, J. Bacteriol., 173:1353–1356, 1991.
Maddock et al., Third International Congress of Plant Molecular Biology, Abstract 372, 1991.
Maloy et al., "Microbial Genetics" 2nd Edition. Jones and Barlett Publishers, Boston, Mass., 1994.
Maloy, S. R., "Experimental Techniques in Bacterial Genetics" Jones and Bantlett Prokop, A., and Bajpal, R. K. "Recombinant DNA Technology I" Ann. N. Y. Acad. Sci. vol. 646, 1991.
Maniatis et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982.
Mancotte et al., Nature, 335:454, 1988.
Masson et al., J. Biol. Chem., 270:20309–20315, 1995.
McCabe et al., Biotechnology, 6:923, 1988.
McPhenson et al., Bio/Technology, 6:61–66, 1988.
Mettus and Macaluso, Appl. Environ. Micnobiol., 56:1128–1134, 1990. Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75:30, 1987.
Norton et al., Plasmid, 13:211–214, 1985.
Odell et al., Nature, 313:810, 1985.
Omirulleh et al., Plant Molecular Biology, 21:415–428, 1993.
Pena et al., Nature, 325:274, 1987.
Poszkowski et al., EMBO J., 3:2719, 1989.
Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183, 1985.
Poulsen et al.,Mol. Gen. Genet., 205:193–200, 1986.
Prokop, A., Bajpal, R. K., Ann. N.Y. Acad. Sci. 646, 1991
Rogers et al., In: Methods For Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. 1988.
Rogers et al., Meth. in Enzymol., 153:253–277, 1987.
Rupar et al., AppT. Environ. Microbiol., 57:3337–3344, 1991.
Sambrook et al., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, N.Y., 1989.
Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
Segal, I. H., "Biochemical Calculations" 2nd Edition. John Wiley & Sons, New York, 1976.
Sekar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7036–7040, 1987. Sick et al., Nucl. Acids Res., 18:1305, 1990.
Simpson, Science, 233:34, 1986.
Southern, J. Mol. Biol., 98:503–517, 1975.
Spielmann et al., Mol. Gen. Genet., 205:34, 1986.
Toriyama et al., Theor Appl. Genet., 73:16, 1986.
Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet., 204:204, 1986.
Van Tunen et al., EMBO J., 7:1257, 1988.
Vasil et al., "Herbicide-resistant fertile transgenic wheat plants obtalned by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus," Biotechnology, 10:667–674, 1992.
Vasil, Biotechnology, 6:397, 1988.
Vodkin et al., Cell, 34:1023, 1983.
Wagner et al., "Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (13):6099–6103, 1992.
Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1988.
Wenzler et al., Plant Mol. Biol,., 12:41–50, 1989. Wolf et al., Compu. Appl. Biosci., 4(1): 187–91 1988.
Wong, T. E., and Neumann, E., "Electric field mediated gene transfer," Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584–587, 1982.
Yamada et al., Plant Cell Rep., 4:85, 1986.
Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4144–48, 1990.
Zatloukal, L., Wagner, E., Cotten, M., Phillips, S., Plank, C., Steinlein, P., Curiel, D. T., and Birnstiel, M. L., "Transferrinfection: a highly efficient way to express gene constructs in eukaryotic cells," Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:136–153, 1992. Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433, 1983.

Alle hier offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können im Lichte der vorliegenden Offenbarung ohne unzumutbare Experimente hergestellt bzw. durchgeführt werden. Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurden, wird der Fachmann sich darüber im Klaren sein, dass Variationen auf die Zusammensetzung, das Verfahren und die Schritte oder Abfolge von Schritten des hier beschriebenen Verfahrens angewendet werden können, ohne vom Konzept, Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen. Insbesondere wird man sich darüber im Klaren sein, dass bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, anstelle der hier beschriebenen Mittel verwendet werden können, wobei man dieselben oder ähnliche Ergebnisse erzielen würde. Dementsprechend beruht das Patentbegehren auf der Beschreibung in den folgenden Ansprüchen.

Claims

Isoliertes und gereinigtes Bacillus-thuringiensis-Kristallprotein, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Isoliertes und gereinigtes Kristallprotein, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst und eine insektizide Wirkung gegen den Baumwollkapselkäfer, den Japankäfer (Popillia japonica) oder den Rotbraunen Reismehlkäfer (Tribolium castaneum) hat.
Protein gemäß Anspruch 2, wobei das Polypeptid aus Bacillus thuringiensis EG10327 (NRRL B-21365), EG11402 (NRRL B-21366) oder EG11403 (NRRL B-21367) isoliert ist.
Protein gemäß Anspruch 3, wobei das durch SDS-PAGE bestimmte Molekulargewicht des Proteins etwa 29 kDa oder etwa 14 kDa beträgt.
Gereinigtes Nucleinsäuresegment, das ein Kristallprotein mit der SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 codiert.
Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5, das die Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5, das weiterhin so definiert ist, dass es die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder deren Komplement oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, umfasst und ein Protein codiert, das insektizide Wirkung hat, oder die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder deren Komplement oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 2 hybridisiert, umfasst und ein Protein codiert, das insektizide Wirkung hat.
Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5, das weiterhin als RNA-Segment definiert ist.
Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5, das ein Kristallprotein mit einer Länge von etwa 267 Aminosäuren codiert oder das ein Kristallprotein mit einer Länge von etwa 126 Aminosäuren codiert.
Rekombinanter Vektor, der das Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5 umfasst.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 10, der weiterhin pEG246, wie man es in der Wirtszelle NRRL B-21364 findet, oder pEG1246, wie man es in der Wirtszelle NRRL B-21367 findet, umfasst.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 10, wobei das Nucleinsäuresegment funktionell mit einem Promotor verknüpft ist.
Rekombinante Wirtszelle, die das Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5 oder den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 10 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 13, die weiterhin als prokaryontische Zelle definiert ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 14, die weiterhin als Bakterienzelle definiert ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 15, wobei die Bakterienzelle eine Zelle von E. coli, B. thuringiensis, B. subtilis, B. megaterium oder Pseudomonas sp. ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei der Bakterienzelle um E. coli NRRL B-21364, B. thuringiensis NRRL B-21365, B. thuringiensis NRRL B-21366 oder B. thuringiensis NRRL B-21367 handelt.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 13, die weiterhin als eukaryontische Zelle definiert ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 18, die weiterhin als Pflanzenzelle definiert ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 19, wobei die Pflanzenzelle eine Pflanzenzelle von Mals, Weizen, Rasengras, Gemüse, Obstbaum oder Zierpflanze ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei das Nucleinsäuresegment mittels eines rekombinanten Vektors in die Zelle eingeführt ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei die Wirtszelle das Nucleinsäuresegment so exprimiert, dass ein Polypeptid entsteht, das SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Verfahren zur Verwendung eines Nucleinsäuresegments, das ein Kristallprotein gemäß SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 codiert, die folgenden Schritte umfassend: (a) Herstellen eines rekombinanten Vektors, in dem sich das Nucleinsäuresegment unter der Kontrolle eines Promotors befindet; (b) Einführen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle; (c) Kultivieren der Wirtszelle, so dass das Protein exprimiert wird; und (d) Isolieren des exprimierten Kristallproteins.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei es sich bei dem rekombinanten Vektor um pEG246, wie man es in der Wirtszelle NRRL B-21364 findet, oder um pEG1246, wie man es in der Wirtszelle NRRL B-21367 findet, handelt.
Isoliertes Nucleinsäuresegment, das als Nucleinsäuresegment, welches einen Sequenzbereich umfasst, der aus wenigstens 18 aufeinanderfolgenden Nucleotiden von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 besteht, oder dessen Komplement gekennzeichnet ist.
Verfahren zum Nachweisen einer Nucleinsäuresequenz, die ein Kristallprotein codiert, wobei das Protein die Sequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, die folgenden Schritte umfassend: (a) Gewinnen von Probenucleinsäuren, von denen angenommen wird, dass sie ein Kristallprotein mit der SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 codieren könnten; (b) In-Kontakt-Bringen der Probenucleinsäuren mit einem isolierten Nucleinsäuresegment, das das Kristallprotein codiert, unter stringenten Bedingungen, die eine Hybridisierung von Nucleinsäuren ermöglichen; und (c) Nachweisen der so gebildeten hybridisierten Nucleinsäuren.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das isolierte Nucleinsäuresegment, das das Protein codiert, einen nachweisbaren Marker umfasst.
Nucleinsäure-Nachweiskit, der in geeigneten Behältereinrichtungen ein Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 5 oder dessen Komplement sowie ein Nachweisreagens umfasst.
Nucleinsäure-Nachweiskit gemäß Anspruch 28, wobei das Nucleinsäuresegment SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2 oder deren Komplement umfasst.
Nucleinsäure-Nachweiskit gemäß Anspruch 28, wobei das Nucleinsäuresegment weiterhin einen nachweisbaren Marker umfasst.
Gereinigter Antikörper, der erzeugt wird, indem man ein Kristallprotein, das SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, als Immunogen verwendet.
Verfahren zum Nachweisen eines Kristallproteins in einer biologischen Probe, die folgenden Schritte umfassend: (a) Gewinnen einer biologischen Probe, von der angenommen wird, dass sie ein Kristallprotein enthalten könnte; (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 31; und (c) Nachweisen der so gebildeten Immunkomplexe.
Immunnachweiskit, der in geeigneten Behältereinrichtungen einen Antikörper gemäß Anspruch 31 sowie ein Immunnachweisreagens umfasst.
Transgene Pflanze, in deren Genom ein Transgen eingebaut ist, das ein Kristallprotein codiert, das die Sequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Nachkommenschaft der Pflanze gemäß Anspruch 34, wobei das Transgen, wie es in Anspruch 34 definiert ist, in das Genom der Nachkommenschaft eingebaut ist.
Samen von der Pflanze gemäß Anspruch 34, wobei das Transgen, wie es in Anspruch 34 definiert ist, in das Genom des Samens eingebaut ist.
Bacillus-thuringiensis-Zelle, die ein Kristallprotein erzeugt, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Bacillus-thuringiensis-Zelle gemäß Anspruch 37, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer NRRL-B-21365-Zelle, einer NRRL-B-21366-Zelle und einer NRRL-B-21367-Zelle besteht.
Bacillus-thuringiensis-Zelle mit der NRRL-Zugriffsnummer B21365.
Bacillus-thuringiensis-Zelle mit der NRRL-Zugriffsnummer B21366.
Bacillus-thuringiensis-Zelle mit der NRRL-Zugriffsnummer B21367.
Zusammensetzung, die etwa 1 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% eines Kristallproteins umfasst, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst.
Zusammensetzung, die ein Kristallprotein umfasst, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst, und nach einem Verfahren hergestellt ist, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer Bacillus-thuringiensis-NRRL-B-21365-, -NRRL-B-21366- oder -NRRL-B-21367-Zelle, so dass sie ein Kristallprotein erzeugt, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst; und (b) Isolieren des Kristallproteins aus der Zelle.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 43, wobei Schritt (b) weiterhin das Isolieren des Kristallproteins in einer Menge zwischen etwa 1 Gew.-% und etwa 50 Gew.-% umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Kristallproteins, umfassend: (a) Kultivieren einer Bacillus-thuringiensis-NRRL-B-21365-, -NRRL-B-21366- oder -NRRL-B-21367-Zelle, so dass sie ein Kristallprotein erzeugt, das die Sequenz SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 umfasst; und (b) Isolieren des Kristallproteins aus der Zelle.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 42, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 45 hergestellt ist.
Zusammensetzung, die etwa 1 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% der Kristallproteine umfasst, die die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 umfassen.
Insektizide Zusammensetzung, die die Kristallproteine mit der SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 umfasst und eine insektizide Wirkung gegen den Baumwollkapselkäfer, den Japankäfer (Popillia japonica) oder den Rotbraunen Reismehlkäfer (Tribolium castaneum) hat.