DE69730730T2

DE69730730T2 - Delta-endotoxine mit breitem spektrum

Info

Publication number: DE69730730T2
Application number: DE69730730T
Authority: DE
Inventors: Thomas Malvar; Jelen Amy GILMER
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1996-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: US6951922B2; OA11257A; ES2229395T3; IL129988A; WO1998022595A1; US6538109B2; US6281016B1; AU5362898A; JP2001502555A; CN1268180A; JP4389075B2; US20060014936A1; US20040171120A1; US20030182682A1; CA2272843C; US6242241B1; US20030017571A1; CN1210402C; PT942985E; DE69730730D1

Description

1.0 Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung ist eine Fortsetzungsanmeldung der US-Patentanmeldung mit der Anmeldungsnummer 08/922,505, eingereicht am 3. September 1997, welche eine Fortsetzungsanmeldung ist der US-Patentanmeldung mit der Anmeldungsnummer 08/754,490, eingereicht am 20. November 1996, wobei der gesamte Inhalt davon hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen ist.
1.1 Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Gene bereit, welche Bacillus thuringiensis-Kristallproteine codieren, die gegenüber Coleoptera-, Diptera- und Lepidoptera-Insekten toxisch sind. Bereitgestellt werden auch Proteinzusammensetzungen, welche chimäre Kristallproteine mit einer erhöhten Insektizidaktivität und einer verbesserten Insektizidspezifität umfassen.
1.2 Beschreibung des verwandten Fachgebiets
1.2.1 B. thuringiensis-Kristallproteine
Das Gram-positive Bodenbakterium B. thuringiensis ist für seine Produktion von proteinähnlichen parasporalen Kristallen oder δ-Endotoxinen bekannt, welche gegenüber einer Vielzahl von Lepidoptera-, Coleoptera- und Diptera-Larven toxisch sind. B. thuringiensis produziert während der Sporenbildung Kristallproteine, die gegenüber bestimmten Insektenarten besonders toxisch sind. Es ist gezeigt worden, daß viele verschiedene Stämme von B. thuringiensis insektizide Kristallproteine produzieren. Zusammensetzungen, umfassend B. thuringiensis-Stämme, die Proteine mit einer Insektizidaktivität produzieren, sind wegen ihrer Toxizität gegenüber dem spezifischen Zielinsekt und der Nichttoxizität gegenüber Pflanzen und anderen Organismen, die nicht zur Zielgruppe gehören, kommerziell als umweltverträgliche Insektizide verwendet worden.
Kommerzielle Formulierungen von natürlich vorkommenden B. thuringiensis-Isolaten sind seit langem zur biologischen Bekämpfung von landwirtschaftlichen Schadinsekten verwendet worden. Bei der kommerziellen Herstellung werden die aus dem Fermentationsprozeß erhaltenen Sporen und Kristalle konzentriert und zum Blattauftrag gemäß herkömmlichen landwirtschaftlichen Anwendungen formuliert.
1.2.2 Nomenklatur von Kristallproteinen
Eine Übersicht von Höfte et al. (1989) beschreibt den allgemeinen Stand der Technik im Hinblick auf die Mehrzahl der insektiziden B. thuringiensis-Stämme, die identifiziert worden sind und gegenüber Insekten der Gattung Lepidoptera, d. h. Raupen, aktiv sind. Diese Abhandlung beschreibt auch B. thuringiensis-Stämme mit einer Insektizidaktivität gegenüber Insekten der Gattung Diptera (d. h. Fliegen und Moskitos) und Coleoptera (d. h. Käfer). Eine Reihe von Genen, welche Kristallproteine codieren, sind aus mehreren Stämmen von B. thuringiensis cloniert worden. Hörte et al. (1989) besprechen die Gene und Proteine, welche in B. thuringiensis vor 1990 identifiziert wurden, und legen das Nomenklatur- und Klassifikationsschema dar, welches traditionell auf Gene und Proteine von B. thuringiensis angewendet worden ist. cry1-Gene codieren Cry1-Proteine, die gegenüber Lepidoptera toxische sind. cry2-Gene codieren Cry2-Proteine, die für sowohl Lepidoptera als auch Diptera toxisch sind. cry3-Gene codieren Cry3-Proteine, welche gegenüber Coleoptera toxisch sind, während cry4-Gene Cry4-Proteine codieren, die gegenüber Diptera toxisch sind, etc.
Vor kurzem ist eine neue Nomenklatur vorgeschlagen worden, welche die Cry-Proteine auf der Basis der Aminosäuresequenz-Homologie anstatt den Zielinsekt-Spezifitäten systematisch klassifiziert. Dieses Klassifikationsschema ist in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1 Überarbeitete B. thuringiensis-δ-Endotoxin-Nomenklatur^â
1.2.3 Art der Kristallprotein-Toxizität
Alle δ-Endotoxin-Kristalle sind gegenüber Insektenlarven durch Aufnahme toxisch. Die Solubilisierung des Kristalls im Mitteldarm des Insekts setzt die Protoxinform des δ-Endotoxins frei, welche in den meisten Fällen anschließend durch die Mitteldarmprotease in ein aktives Toxin umgewandelt wird. Die aktivierten Toxine erkennen und binden an den Bürstensaum des Insektenmitteldarmepithels über Rezeptorproteine. Mehrere mutmaßliche Kristallprotein-Rezeptoren sind aus bestimmten Insektenlarven isoliert worden (Knight et al., 1995; Gill et al., 1995; Masson et al., 1995. Auf die Bindung der aktiven Toxine folgt die Einlagerung und Aggregation von Toxinmolekülen unter Bildung von Poren in dem Mitteldarmepithel. Dieser Prozeß hat ein osmotisches Ungleichgewicht, eine Anschwellung, eine Lyse der Zellen, die das Mitteldarmepithel auskleiden, und schließlich die Mortalität der Larven zur Folge.
1.2.4 Molekularbiologie von δ-Endotoxinen
Mit dem Aufkommen der molekulargenetischen Techniken sind verschiedene δ-Endotoxin-Gene isoliert und die DNA-Sequenzen hiervon bestimmt worden. Diese Gene sind verwendet worden, um bestimmte gentechnisch veränderte B. thuringiensis-Produkte zu konstruieren, welche für die kommerzielle Verwendung zugelassen worden sind. Jüngste Entwicklungen haben neue δ-Endotoxin-Übertragungssysteme hervorgebracht, einschließlich Pflanzen, die gentechnisch veränderte δ-Endotoxin-Gene enthalten und exprimieren.
Die Clonierung und Sequenzierung einer Reihe von δ-Endotoxin-Genen aus einer Vielzahl von Bacillus thuringiensis-Stämmen ist durch Höfte und Whiteley, 1989, beschrieben und zusammengefaßt worden. Plasmid-"Shuttle"-Vektoren, welche für die Clonierung und Expression von δ-Endotoxin-Genen in E. coli oder B. thuringiensis konstruiert wurden, sind bei Gawron-Burke und Baum (1991) beschrieben. US-Patent Nr. 5,441,884 offenbart ein ortsspezifisches Rekombinationssystem für die Konstruktion von rekombinanten B. thuringiensis-Stämmen, enthaltend δ-Endotoxin-Gene, welche frei an DNA-Sequenzen sind, welche für B. thuringiensis nicht natürlich sind.
Die Cry1-Familie der Kristallproteine, welche überwiegend gegenüber Lepidoptera-Schädlingen aktiv sind, ist die am besten untersuchte Klassen von δ-Endotoxinen. Die Protoxinform von Cry1-δ-Endotoxinen besteht aus zwei etwa gleich großen Segmenten. Der Carboxylanteil oder das Protoxinsegment ist nicht toxisch, und es wird angenommen, daß es für die Kristallbildung wichtig ist (Arvidson et al., 1989). Der Aminoanteil des Protoxins umfaßt das aktive Toxinsegment des Cry1-Moleküls und kann weiterhin in drei strukturelle Domänen unterteilt werden, wie durch die jüngst beschriebene kristallographische Struktur für das aktive Toxinsegment des Cry1Aa-δ-Endotoxins bestimmt wurde (Grochulski et al., 1995). Die Domäne 1 nimmt das erste Drittel des aktiven Toxins ein und ist für die Kanalbildung wesentlich (Thompson et al., 1995). Domäne 2 und Domäne 3 machen das mittlere bzw. letzte Drittel des aktiven Toxins aus. Die Domänen 2 und 3 sind beide mit der Rezeptorbindung und der Insektenspezifität, abhängig von dem Insekt und dem δ-Endotoxin, welche untersucht wurden, in Verbindung gebracht worden (Thompson et al., 1995).
1.2.5 Chimäre Kristallproteine
In den letzten Jahren konzentrierten die Forscher ihre Bemühungen auf die Konstruktion von Hybrid-δ-Endotoxinen, in der Hoffnung, Proteine herzustellen, die eine erhöhte Aktivität oder bessere Eigenschaften besitzen. Die Fortschritte auf dem Gebiet der Molekulargenetik in den letzten Jahrzehnten haben einen logischen und geordneten Ansatz für die Konstruktion von Proteinen mit besseren Eigenschaften erleichtert. Ortsspezifische und statistische Mutageneseverfahren, das Aufkommen von Polymerasekettenreaktion (PCR^TM)-Methodiken und die Entwicklung von Rekombinationsverfahren zur Erzeugung von Genfusionen und zur Konstruktion von chimären Proteinen haben eine Reihe von Verfahren zur Veränderung der Aminosäuresequenzen von Proteinen, zur Verbindung von Teilen aus zwei oder mehreren Proteinen miteinander in einem einzigen rekombinanten Protein und zur Veränderung von Gensequenzen, welche kommerziell interessante Proteine codieren, ermöglicht.
Unglücklicherweise sind diese Techniken nur in begrenzter Weise für Kristallproteine nutzbar gemacht worden. Die Wahrscheinlichkeit, zufällig ein chimäres Protein mit besseren Eigenschaften aus Teilen der zahlreichen nativen Proteine, die identifiziert worden sind, zu erzeugen, ist aufgrund der komplexen Natur der Proteinstruktur, Faltung, Oligomerisierung, Aktivierung und richtigen Prozessierung des chimären Protoxins zu einer aktiven Einheit sehr gering. Nur durch die sorgfältige Auswahl von spezifischen Zielregionen innerhalb jedes Proteins und eine anschließende Proteinkonstruktion können Toxine synthetisiert werden, welche eine verbesserte Insektizidaktivität besitzen.
Über einige Erfolge auf diesem Gebiet ist in der Literatur berichtet worden. Zum Beispiel wird über die. Konstruktion von einigen Hybrid-δ-Endotoxinen in dem folgenden verwandten Fachgebiet berichtet: die Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 95/30753 offenbart die Konstruktion von hybriden B. thuringiensis-δ-Endotoxinen zur Herstellung in Pseudomonas fluorescens, worin das nichttoxische Protoxinfragment von Cry1F durch das nichttoxische Protoxinfragment aus Cry1Ac/Cry1Ab, welches in US-Patent 5,128,130 offenbart ist, ersetzt worden ist.
US-Patent 5,128,130 offenbart die Konstruktion von hybriden B. thuringiensis-δ-Endotoxinen zur Herstellung in P. fluorescens, worin ein Teil des nichttoxischen Protoxinsegments von Cry1Ac durch das entsprechende nichttoxische Protoxinfragment von Cry1Ab ersetzt ist. US-Patent 5,055,294 offenbart die Konstruktion eines spezifischen Hybrid-δ-Endotoxins zwischen Cry1Ac (Aminosäurereste 1–466) und Cry1Ab (Aminosäurereste 466–1155) zur Herstellung in P. fluorescens. Obwohl das oben erwähnte Patent die Konstruktion eines hybriden Toxins innerhalb des aktiven Toxinsegments offenbart, werden keine Einzelheiten im Hinblick die Insektizidaktivität des hybriden Toxins angegeben. Die Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 95/30752 offenbart die Konstruktion von hybriden B. thuringiensis-δ-Endotoxinen zur Herstellung in P. fluorescens, worin das nichttoxische Protoxinsegment von Cry1C durch das nichttoxische Protoxinsegment aus Cry1Ab ersetzt ist. Die oben erwähnte Anmeldung offenbart ferner, daß die Aktivität gegen Spodoptera exigua für das Hybrid-δ-Endotoxin gegenüber der Aktivität des aktiven Stamm-Toxins, Cry1C, verbessert ist.
Die Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 95/06730 offenbart die Konstruktion eines hybriden B. thuringiensis-δ-Endotoxins, das aus den Domänen 1 und 2 von Cry1E, gekoppelt an Domäne 3, und dem nichttoxischen Protoxinsegment von Cry1C besteht. Insekten-Bioassays, durchgeführt gegen Manduca sexta (empfindlich gegen Cry1C und Cry1E), Spodoptera exigua (empfindlich gegen Cry1C) und Mamestra brassicae (empfindlich gegen Cry1C), zeigen, daß das hybride Cry1E/Cry1C-Hybrid-Toxin gegenüber M. sexta, S. exigua und M. brussicae aktiv ist. Die Bioassay-Ergebnisse wurden als EC₅₀-Werte (Toxinkonzentration, welche eine Vermehrungsreduktion von 50% ergibt) anstatt als LC₅₀-Werte (Toxinkonzentration, welche eine Mortalität von 50% ergibt) ausgedrückt. Obwohl die für den Bioassay verwendeten δ-Endotoxine in B. thuringiensis hergestellt wurden, wurden nur künstlich erzeugte aktive Segmente der δ-Endotoxine verwendet, nicht die natürlicherweise produzierten Kristalle, welche typischerweise durch B. thuringiensis hergestellt werden und in kommerziellen B. thuringiensis-Formulierungen vorhanden sind. Die Bioassay-Ergebnisse zeigten, daß die LC₅₀-Werte für den hybriden Cry1E/Cry1C-Kristall gegenüber S frugiperda um das 1,5- bis 1,7fache niedriger (aktiver) als für natives Cry1C sind. Diese Fachliteratur offenbart auch die Konstruktion eines hybriden B. thuringiensis-δ-Endotoxins zwischen Cry1Ab (Domänen 1 und 2) und Cry1C (Domäne 3 und das nichttoxische Protoxinsegment), obwohl keine Daten im Hinblick auf die Aktivität oder Nützlichkeit des hybriden Toxins angegeben werden.
Lee et al. (1995) berichten über die Konstruktion von hybriden B. thuringiensis-δ-Endotoxinen zwischen Cry1Ac und Cry1Aa innerhalb des aktiven Toxinsegments. Künstlich erzeugte aktive Segmente der hybriden Toxine wurden verwendet, um die Proteinwechselwirkungen in empfindlichen Bürstensaum-Membranvesikeln (BBMV) von Insekten zu untersuchen. Über die Bioaktivität der hybriden Toxine wurde nicht berichtet.
Honee et al. (1991) berichten über die Konstruktion von Hybrid-δ-Endotoxinen zwischen Cry1C (Domäne 1) und Cry1 Ab (Domänen 2 und 3) und des reziproken Hybrids zwischen Cry1Ab (Domäne 1) und Cry1C (Domänen 2 und 3). Diese Hybride zeigten keine wesentliche Erhöhung der Aktivität gegenüber empfindlichen Insekten. Außerdem wurde festgestellt, daß das hybride Cry1C (Domäne 1)/Cry1Ab (Domänen 2 und 3)-Toxin gegen einen Proteaseabbau hypersensibel ist. Ein Bericht von Schnepf et al. (1990) offenbart die Konstruktion eines hybriden Cry1Ac-Toxins, worin ein kleiner Teil von Domäne 2 durch die entsprechende Region von Cry1Aa ersetzt wurde, obwohl keine wesentliche Erhöhung der Aktivität gegenüber empfindlichen Insektenlarven beobachtet wurde.
1.3 Mängel gemäß dem Stand der Technik
Die begrenzten Erfolge bei der Herstellung von chimären Kristallproteinen, welche eine verbesserte Aktivität besitzen, haben das Fachgebiet dahin gehend negativ beeinflußt, daß Bemühungen unterbunden wurden, ein rekombinant verändertes Kristallprotein für die kommerzielle Erschließung herzustellen und die toxischen Eigenschaften und Wirtsspezifitäten der bekannten Endotoxine auszuweiten. Gemäß dem Stand der Technik fehlen daher zuverlässige Verfahren und Zusammensetzungen, umfassend rekombinant veränderte Kristallproteine, welche eine verbesserte Insektizidaktivität und eine Wirtsspezifität mit breitem Spektrum aufweisen und welche für die kommerzielle Herstellung in B. thuringiensis geeignet sind.
2.0 Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung überwindet diese und andere Begrenzungen gemäß dem Stand der Technik durch die Bereitstellung von neuen chimären δ-Endotoxinen, welche verbesserte insektizide Eigenschaften und Spezifitäten mit einem breiten Spektrum besitzen.
Offenbart werden Verfahren zur Konstruktion von B. thuringiensis-Hybrid-δ-Endotoxinen, welche Aminosäuresequenzen aus nativen Cry1Ac- und Cry1F-Kristallproteinen umfassen. Diese Hybridproteine, worin die gesamte oder ein Teil der Cry1Ac-Domäne 2, die gesamte oder ein Teil der Cry1Ac-Domäne 3 und das gesamte oder ein Teil des Cry1Ac-Protoxinsegments durch die entsprechenden Teile von Cry1F ersetzt sind, besitzen nicht nur die insektiziden Eigenschaften der Stamm-δ-Endotoxine, sondern weisen auch die unerwarteten und bemerkenswerten Eigenschaften einer verbesserten Spezifität mit einem breiten Spektrum auf, die keines der nativen δ-Endotoxine, aus welchen die chimären Proteine konstruiert wurden, hinreichend zeigt.
Genauer offenbart und beansprucht die vorliegende Erfindung gentechnisch hergestellte Hybrid-δ-Endotoxine, welche einen Teil eines Cry1Ac-Kristallproteins, verbunden mit einem Teil eines Cry1F-Kristallproteins, umfassen. Diese chimären Endotoxine weisen eine Spezifität mit einem breiten Spektrum gegenüber den hierin beschriebenen Schadinsekten auf.
In einer weiteren Ausführungsform offenbart und beansprucht die vorliegende Erfindung auch rekombinante B. thuringiensis-Hybrid-δ-Endotoxine, umfassend einen Teil von Cry1Ab, Cry1F und Cry1Ac, worin die gesamte oder ein Teil der Cry1Ab-Domäne 2 oder die gesamte oder ein Teil der Cry1Ab-Domäne 3 durch die entsprechenden Teile von Cry1F ersetzt ist, und das gesamte oder ein Teil des Cry1Ab-Protoxinsegments durch die entsprechenden Teile von Cry1Ac ersetzt ist. Beispielhafte Hybrid-δ-Endotoxine zwischen Cry1Ab und Cry1F sind in SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14 identifiziert.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung veranschaulicht das unerwartete Ergebnis, daß bestimmte Hybrid-δ-Endotoxine, abgeleitet aus Cry1Ac- und Cry1F-Proteinen, nicht nur die insektiziden Eigenschaften der Stamm-δ-Endotoxine zeigen, sondern auch eine Insektizidaktivität besitzen, die durch keines der Stamm-δ-Endotoxine hinreichend gezeigt wird.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung veranschaulicht ferner das unerwartete Ergebnis, daß bestimmte chimäre Cry1Ab/Cry1F-Proteine nicht nur die insektiziden Eigenschaften der Stamm-δ-Endotoxine beibehalten, sondern auch eine Insek tizidaktivität besitzen, die durch keines der nativen Cry1Ab- oder Cry1F-Endotoxine hinreichend gezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Cry1Ac/Cry1F- und Cry1Ab/Cry1F-Hybrid-δ-Endotoxine, welche die gewünschten Eigenschaften beibehalten, die für die kommerzielle Herstellung in B. thuringiensis erforderlich sind. Genauer können die in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 34 identifizierten Hybrid-δ-Endotoxine wirksam proteinähnliche parasporale Einschlüsse in B. thuringiensis bilden und weisen die vorteilhaften Eigenschaften einer Löslichkeit, Proteaseempfindlichkeit und Insektizidaktivität der Stamm-δ-Endotoxine auf.
Der Anstoß für die Konstruktion dieser und anderer Hybrid-δ-Endotoxine ist, neue Toxine mit einer verbesserten Insektizidaktivität, größeren Wirtsbereichsspezifität und verbesserten Produktionseigenschaften zu erzeugen. Die in Tabelle 8 aufgeführten DNA-Sequenzen definieren die Austauschstellen für die Hybrid-δ-Endotoxine, welche für die vorliegende Erfindung relevant sind und als Oligonucleotidprimer verwendet werden können, um solche oder ähnliche Hybrid-δ-Endotoxine durch Southern-Blot- oder Kolonie-Hybridisierungsverfahren unter Bedingungen einer mäßigen bis hohen Stringenz zu identifizieren. Erfahrene Forscher erkennen die Wichtigkeit der gewählten Austauschstelle zwischen zwei oder mehreren δ-Endotoxinen, wobei der Austausch durch eine Reihe von in vivo- oder in vitro-Techniken der Molekulargenetik erreicht werden kann. Kleine Variationen in der Austauschregion zwischen zwei oder mehreren δ-Endotoxinen können ähnliche Ergebnisse ergeben oder, wie für EG11062 und EG11063 gezeigt, gewünschte Merkmale ungünstig beeinflussen. In ähnlicher Weise können große Variationen in der Austauschregion zwischen zwei oder mehreren δ-Endotoxinen keinen Einfluß auf gewünschte Merkmale haben, wie durch EG11063 und EG11074 gezeigt, oder können gewünschte Merkmale ungünstig beeinflussen, wie durch EG11060 und EG11063 gezeigt wird.
Vorteilhafte Merkmale im Hinblick auf eine verbesserte Insektizidaktivität, einen größeren Wirtsbereich und verbesserte Produktionseigenschaften können durch andere solche Hybrid-δ-Endotoxine, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die cry1-, cry2-, cry3-, cry4-, cry5-, cry6-, cry7-, cry8-, cry9-, cry10-, cry11-, cry12-, cry13-, cry14-, cry15-Klasse von δ-Endotoxin-Genen und die cytolytischen B. thuringiensis-cyt1- und -cyt2-Gene, erhalten werden. Vertreter dieser Klassen von B. thuringiensis-Insektizidproteinen schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ad, Cry1Ae, Cry1Ba, Cry1Bb, Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, Cry1Db, Cry1Ea, Cry1Eb, Cry1Fa, Cry1Fb, Cry1Ga, Cry1Ha, Cry2a, Cry2b, Cry1Ja, Cry1Ka, Cry11Aa, Cry11Ab, Cry12Aa, Cry3Ba, Cry3Bb, Cry3C, Cry4a, Cry4Ba, Cry5a, Cry5Ab, Cry6Aa, Cry6Ba, Cry7Aa, Cry7Ab, Cry8Aa, Cry8Ba, Cry8Ca, Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Ca, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry12Aa, Cry13Aa, Cry14Aa, Cry15Aa, Cyt1Aa und Cyt2Aa ein. Verwandte Hybrid-δ-Endotoxine würden aus dem Aminoanteil eines der oben erwähnten δ-Endotoxine, einschließlich der gesamten oder einem Teil der Domäne 1 oder Domäne 2, verbunden mit der gesamten oder einem Teil der Domäne 3 aus einem anderen der oben erwähnten δ-Endotoxine, bestehen. Das nichtaktive Protoxinfragment solcher Hybrid-δ-Endotoxine kann aus dem Protoxinfragment irgendeines der oben erwähnten δ-Endotoxine bestehen, welches dazu dienen kann, das Hybrid-δ-Endotoxin zu stabilisieren, wie durch EG11087 und EG11091 (vgl. z. B. Tabelle 5) gezeigt wird. Hybrid-δ-Endotoxine, welche ähnliche Merkmale wie die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen besitzen, können durch konservative oder "ähnliche" Austäusche von Aminosäuren innerhalb der Hybrid-δ-Endotoxine konstruiert werden. Solche Substitutionen würden die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der nativen Aminosäure an irgendeiner Position in dem Protein nachahmen. Aminosäuren, welche als ähnlich angesehen werden, schließen zum Beispiel, aber sind nicht darauf begrenzt, die folgenden ein:
Ala, Ser und Thr;
Asp und Glu;
Asn und Gln;
Lys und Arg;
Ile, Leu, Met und Val; und
Phe, Tyr und Trp.
Erfahrene Forscher erkennen, daß die verbesserte Insektizidaktivität, der größere Wirtsbereich und die verbesserten Produktionseigenschaften, welche auf Hybrid-δ-Endotoxine übertragen werden, weiter verbessert werden können, indem der genetische Code für eine oder mehrere Aminosäurepositionen in dem Hybrid-δ-Endotoxin verändert wird, so daß die Position oder die Positionen durch irgendeine andere Aminosäure ersetzt wird bzw. werden. Dies kann dadurch erreicht werden, daß eine Region oder mehrere Regionen des Proteins durch irgendeine Technik einer Reihe von eingeführten Mutagenesetechniken, einschließlich der für die vorliegende Erfindung relevanten Verfahren, zielgerecht angegangen werden, um eine Mutagenese herbeizuführen. Solche Techniken schließen die ortsspezifische Mutagenese (Kunkel, 1985; Kunkel et al., 1987), die DNA-Umordnung ("DNA-Shuffling") (Stemmer, 1994) und eine überlappende PCR^TM-Verlängerungsreaktion (Horton et al., 1989) ein. Da Aminosäuren, welche auf oder nahe der Oberfläche eines Proteins vorliegen, wahrscheinlich für die Wechselwirkung hiervon mit anderen proteinähnlichen oder nicht-proteinähnlichen Einheiten verantwortlich sind, können sie als "Ziel"-Regionen für eine Mutagenese dienen. Solche oberflächenexponierten Regionen können, aber sind nicht darauf begrenzt, aus oberflächenexponierten Aminosäureresten innerhalb des aktiven Toxinfragments des Proteins bestehen und schließen die Inter-α-Helix- oder Inter-β-Strang-"Schleifen"-Regionen von δ-Endotoxinen, welche α-Helices innerhalb von Domäne 1 und β-Stränge innerhalb von Domäne 2 und Domäne 3 trennen, ein. Solche Verfahren können die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften des Proteins oder seine Wirkungsweise günstig verändern, wie in Abschnitt 1 dargelegt ist. Diese Eigenschaften schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die folgenden ein: 1) eine verbesserte Kristallbildung, 2) eine verbesserte Proteinstabilität oder einen verminderten Proteaseabbau, 3) eine verbesserte Insekten-Membranrezeptor-Erkennung und -Bindung, 4) eine verbesserte Oligomerisierung oder Kanalbildung im Insekten-Mitteldarmepithel, und 5) eine verbesserte Insektizidaktivität oder Insektizidspezifität aufgrund irgendeines oder allen der oben angegebenen Gründe.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuresegment bereit, das ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34, codiert. Vorzugsweise codiert das Nucleinsäuresegment ein Polypeptid mit einer Insektizidaktivität gegenüber Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea oder Ostrinia nubilalis. Solche Nucleinsäuresegmente sind isolierbar aus Zellen von Bacillus thuringiensis NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 bzw. NRRL B-21781.
In bevorzugten Ausführungsformen hybridisieren diese Nucleinsäuresegmente spezifisch mit einem Nucleinsäuresegment mit der Sequenz von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 oder einem Komplementärstrang hiervon, und in besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassend diese Nucleinsäuresegmente die Nucleinsäuresequenzen, welche in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 bzw. SEQ ID NO: 33 offenbart sind.
Ein solches Nucleinsäuresegment kann funktionell verbunden sein mit einem Promotor, um das Nucleinsäuresegment in einer Wirtszelle zu exprimieren. In solchen Ausführungsformen kann das Nucleinsäuresegment innerhalb eines rekombinanten Vektors wie einem Plasmid, Cosmid, Phagen, Phagemid, Virus, Baculovirus, bakteriellen künstlichen Chromosom oder künstlichen Hefe-Chromosom umfaßt sein. Beispielhafte Plasmidvektoren schließen die Vektoren pEG1068, pEG1077, pEG1093, pEG365, pEG378 und pEG381 ein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet die Verwendung der hierin beschriebenen Nucleinsäuresegmente bei der Herstellung von rekombinanten Polypeptidzusammensetzungen, bei der Erzeugung eines Vektors zur Verwendung bei der Herstellung einer transformierten Wirtszelle und bei der Erzeugung einer insektenresistenten transgenen Pflanze.
Wirtszellen stellen auch einen wichtigen Aspekt der Erfindung dar. Solche Wirtszellen umfassen im allgemeinen eines oder mehrere der Nucleinsäuresegmente, wie oben beschrieben. Bevorzugte Wirtszellen schließen Bakterienzellen wie E. coli-, B. thuringiensis-, B. subtilis-, B. megaterium- und Pseudomonas sp.-Zellen ein, wobei Zellen von B. thuringiensis EG11060, EG11062, EG11063, EG11071, EG11073, EG11074, EG11090, EG11092, EG11735, EG11751, EG11768, NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 und NRRL B-21781 besonders bevorzugt werden. Bevorzugte Wirtszellen können auch eukaryontische Zellen, wie pflanzliche und tierische Zellen, einschließen. Bevorzugte pflanzliche Zellen schließen Zellen von Getreidepflanzen, Bäumen, Gemüse, Früchten, Beeren, Nüssen, Gräsern, Kakteen, Sukkulenten und Zierpflanzen ein. wobei kommerzielle Nutzpflanzen wie Mais, Reis, Tabak, Kartoffel, Tomate, Flachs, Canola, Sonnenblume, Baumwolle, Weizen, Hafer, Gerste und Roggen besonders bevorzugt werden.
In einer Ausführungsform kann die Wirtszelle innerhalb einer transgenen Pflanze umfaßt sein oder kann bei der Herstellung einer transgenen Pflanze oder bei der Erzeugung von pluripotenten Pflanzenzellen verwendet werden. Alternativ kann die Wirtszelle bei der rekombinanten Expression eines Kristallproteins oder bei der Herstellung einer insektiziden Polypeptidformulierung, umfassend eines oder mehrere der hierin offenbarten Toxine, verwendet werden. Eine solche Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise ein oder mehrere isolierte Polypeptide mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34. Eine solche Zusammensetzung findet besondere Anwendung bei der Abtötung einer Insektenzelle, bei der Herstellung einer insektiziden Formulierung und bei der Formulierung eines Pflanzenschutzsprays.
Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung eines B. thuringiensis-Kristallproteins vor. Ein solches Verfahren beinhaltet im allgemeinen das Züchten einer Zelle von B. thuringiensis NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636, NRRL B-21781, EG11768, EG11090, EG11063, EG11074, EG11735 oder EG11751 unter Bedingungen, welche wirksam sind, um ein B. thuringiensis-Kristallprotein herzustellen, und anschließen das Gewinnen des B. thuringiensis-Kristallproteins aus der Zelle. Solche Verfahren sind bei der rekombinanten Herstellung der hierin offenbarten Kristallproteine sehr nützlich.
Die Erfindung offenbart und beansprucht auch ein Verfahren zur Abtötung einer Insektenzelle. Das Verfahren beinhaltet im allgemeinen das Bereitstellen einer insektizid wirksamen Menge einer oder mehrerer der hierin offenbarten Insektizidzusammensetzungen in einer Insektenzelle. Solche Zellen können isolierte Zellen sein, oder können alternativ innerhalb eines Insekts selbst umfaßt sein. Typischerweise wird die Zusammensetzung entweder durch direktes Besprühen der Insekten oder alternativ durch Aufnahme der Zusammensetzung durch das Insekt, entweder direkt oder durch Aufnahme einer Pflanze, welche mit der Zusammensetzung bedeckt worden ist, oder alternativ durch Aufnahme eines Teils einer transgenen Pflanze, welche eine oder mehrere der Insektizidzusammensetzungen exprimiert, in dem Insekt bereitgestellt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein gereinigter Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid bindet, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 umfaßt.
Solche Antikörper können mit einem nachweisbaren Marker, welcher in einem Immunnachweis-Kit bereitgestellt wird. funktionell verbunden werden oder in einem Verfahren zum Nachweis eines insektiziden Polypeptids in einer biologischen Probe durch das Inkontaktbringen einer biologischen Probe, welche im Verdacht steht, das insektizide Polypeptid zu enthalten, mit einem solchen Antikörper unter Bedingungen. welche wirksam sind, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen, und das anschließende Nachweisen der gebildeten Immunkomplexe verwendet werden.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft eine transgene Pflanze, welche ein Transgen, codierend ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 umfaßt, in ihr Genom eingebaut hat. Vorzugsweise umfassen solche transgenen Pflanzen eine oder mehrere der Nucleinsäuresequenzen, welche in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 33 offenbart sind. Nachkommen und Samen solcher transgenen Pflanzen und deren Nachkommenschaft oder Abkömmlinge sind ebenfalls wichtige Aspekte der Erfindung, welche hierin später ausführlich beschrieben werden.
2.1 Kristallprotein-Transgene und transgene Pflanzen
Gemäß einem noch anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, welche ein Nucleinsäuresegment exprimiert, das die neuen chimären Kristallproteine der vorliegenden Erfindung codiert. Das Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen ist auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Im allgemeinen umfaßt das Verfahren die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNA-Segment, enthaltend einen Promotor, der funktionell verbunden ist mit einer codierenden Region, die ein chimäres B. thuringiensis-Cry1Ac-1F- oder Cry1Ab-1F-, Cry1Ac-1C- oder ein Cry1Ab-1Ac-1F-Kristallprotein codiert. Eine solche codierende Region ist im allgemeinen funktionell verbunden mit einer Transkriptionsterminationsregion, wodurch der Promotor fähig ist, die Transkription der codierenden Region in der Zelle zu steuern und daher die Zelle in die Lage versetzt, das rekombinante Protein in vivo herzustellen. In Fällen, wo es wünschenswert ist, die Menge eines bestimmten rekombinanten Kristallproteins, das in einer bestimmten transgenen Pflanze exprimiert wird, zu kontrollieren, zu regulieren oder zu verringern, sorgt die Erfindung alternativ für die Expression einer Kristallprotein-Antisense-mRNA. Die Verwendung einer Antisense-mRNA als ein Mittel zur Kontrolle oder Verringerung der Menge eines bestimmten Proteins von Interesse in einer Zelle ist auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung umfaßt eine transgene Pflanze, welche ein Gen oder ein Gensegment exprimiert, das eine oder mehrere der hierin offenbarten neuen Polypeptidzusammensetzungen codiert. So wie hierin verwendet, soll der Begriff "transgene Pflanze" auf eine Pflanze verweisen, die DNA-Sequenzen eingebaut hat, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Gene, welche vielleicht normalerweise nicht anwesend sind; DNA-Sequenzen, die normalerweise nicht in RNA transkribiert oder in ein Protein translatiert ("exprimiert") werden; oder irgendwelche anderen Gene oder DNA-Sequenzen, welche in die nichttransformierte Pflanze eingeschleust werden sollen, wie Gene, die normalerweise in der nichttransformierten Pflanze anwesend sein können, aber welche entweder gentechnisch oder derart. daß sie eine verändert Expression aufweisen, verändert werden sollen. Die Konstruktion und Expression von synthetischen B. thuringiensis-Genen in Pflanzen ist in den US-Patenten 5,00,365 und 5,380,831 ausführlich beschrieben worden.
Es wird erwartet, daß in einigen Fällen das Genom einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanze durch den stabilen Einbau von einem oder mehreren cry1Ac-1F-, cry1Ab-1F-, cry1Ac-1C- oder cry1Ab-1Ac-1F-Transgenen, entweder nativ, synthetisch modifiziert oder weiter durch Mutagenese verändert, vergrößert worden ist. In einigen Fällen wird mehr als ein Transgen in das Genom der transformierten Wirtspflanzenzelle eingebaut. Dies ist der Fall, wenn mehr als ein DNA-Segment, welches ein Kristallprotein codiert, in das Genom einer solchen Pflanze eingebaut wird. In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, daß ein, zwei, drei, vier oder auch mehr B. thuringiensis-Kristallproteine (entweder nativ oder rekombinant verändert) in die transformierte transgene Pflanze eingebaut und stabil exprimiert wird.
Bevorzugte Gene, wie die in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 33 offenbarten, welche eingebaut werden können, schließen zum Beispiel eine bakterielle DNA-Sequenz, welche ein Kristallprotein codiert, und insbesondere eine oder mehrere der hierin beschriebenen DNA-Sequenzen, welche aus Bacillus sp. erhalten werden, ein. Besonders bevorzugte Nucleinsäuresequenzen sind solche, welche aus B. thuringiensis erhalten werden, oder irgendwelche derjenigen Sequenzen, welche gentechnisch verändert worden sind, um die Insektizidaktivität des Kristallproteins in einer solchen transformierten Wirtszelle zu verringern oder zu erhöhen.
Mittel zur Transformation einer Pflanzenzelle und die Herstellung einer transgenen Zelllinie sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und werden hierin besprochen. Vektoren, Plasmide, Cosmide, künstliche Hefe-Chromosomen (YACs) und Nucleinsäuresegmente zur Verwendung bei der Transformation solcher Zellen umfassen natürlich im allgemeinen entweder die Operons, Gene oder die aus einem Gen abgeleiteten Sequenzen der vorliegenden Erfindung, welche entweder nativ oder synthetisch abgeleitet sind, und insbesondere solche, welche die offenbarten Kristallproteine codieren. Diese DNA-Konstrukte können ferner Strukturen wie Promotoren, Enhancer, Polylinker oder auch Gensequenzen, welche die Aktivität bei den einzelnen Genen von Interesse positiv oder negativ regulieren, falls gewünscht, einschließen. Das DNA-Segment oder das Gen kann entweder ein natives oder ein modifiziertes Kristallprotein codieren, das in den erhaltenen rekombinanten Zellen exprimiert wird und/oder das einen verbesserten Phänotyp auf die regenerierte Pflanze überträgt. Nucleinsäuresequenzen, welche zur Expression in Pflanzen optimiert wurden, sind in der Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 93/07278 offenbart worden.
Solche transgenen Pflanzen können zur Erhöhung der Insektizidresistenz einer einkeimblättrigen oder zweikeimblättrigen Pflanze durch den Einbau eines transgenen DNA-Segments, codierend ein oder mehrere Cry1Ac-1F- und/oder Cry1Ab-1F- und/oder Cry1Ab-1Ac-1F-Kristallproteine, welche eine Spezifität mit breitem Spektrum gegenüber Insekten besitzen, wünschenswert sein. Besonders bevorzugte Pflanzen sind Getreidepflanzen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Korn, Weizen, Hafer, Reis, Mais und Gerste; Baumwolle; Sojabohnen und andere Leguminosen; Bäume, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Zierpflanzen, Sträucher, Früchte und Nüsse; Gemüse; Gräser von Rasen und Weiden; Beeren; Zitrusfrüchte; und andere Nutzpflanzen von kommerziellem Interesse, wie Gartennutzpflanzen und/oder Zimmerpflanzen, Sukkulenten, Kakteen und Blütenpflanzen.
Gemäß einem damit verbundenen Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung auch einen Samen, der durch die transformierte Pflanze produziert wird, einen Nachkommen aus einem solchen Samen und einen Samen, der durch den Nachkommen der ursprünglichen transgenen Pflanze, welche gemäß dem obigen Verfahren erzeugt wurde, produziert wird. Solche Nachkommen und Samen weisen ein stabiles Kristallprotein-Transgen auf, das stabil in das Genom hiervon eingebaut ist, und solche Nachkommenpflanzen erben die Merkmale, welche durch den Einbau eines stabilen Transgens übertragen werden, gemäß den Mendelschen Regeln. Alle solche transgenen Pflanzen, die transgene DNA-Segmente, codierend ein oder mehrere chimäre Kristallproteine oder Polypeptide, in ihr Genom eingebaut haben, sind Aspekte dieser Erfindung.
2.2 Kristallprotein-Screening und Immunnachweis-Kits
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren und Kits für das Screening von Proben, welche im Verdacht stehen, Kristallprotein-Polypeptide oder mit dem Kristallprotein verwandte Polypeptide oder solche Polypeptide herstellende Zellen zu enthalten. Beispielhafte Proteine schließen die in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 34 offenbarten ein. Der Kit kann ein Nucleinsäuresegment oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Der Kit kann Reagenzien zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einer Probe und einer Nucleinsäure oder einem Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Das bereitgestellte Reagens kann radioaktiv, fluoreszenz- oder enzymmarkiert sein. Der Kit kann ein bekanntes radioaktiv markiertes Mittel enthalten, welches in der Lage ist, an eine Nucleinsäure oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu binden oder damit in Wechselwirkung zu treten.
Das Reagens des Kits kann als eine flüssige Lösung, gebunden an einen festen Träger oder als ein getrocknetes Pulver bereitgestellt werden. Vorzugsweise, wenn das Reagens in einer flüssigen Lösung bereitgestellt wird, ist die flüssige Lösung eine wäßrige Lösung. Vorzugsweise, wenn das Reagens gebunden an einen festen Träger bereitgestellt wird, kann der feste Träger ein chromatographisches Medium, eine Testplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder ein Objektträger sein. Wenn das Reagens als ein trocknes Pulver bereitgestellt wird, kann das Pulver durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, das bereitgestellt werden kann, zubereitet werden.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immunnachweisverfahren und damit verbundene Kits. Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäßen Kristallproteine oder Peptide zum Nachweis von Antikörpern, welche eine Reaktivität damit zeigen, verwendet werden können, oder alternativ können erfindungsgemäß hergestellte Antikörper verwendet werden, um Kristallproteine oder Peptide, enthaltend ein Kristallprotein-Epitop, nachzuweisen. Im allgemeinen schließen diese Verfahren zuerst den Erhalt einer Probe, welche im Verdacht steht, ein(en) solches(n) Protein, Peptid oder Antikörper zu enthalten, das Inkontaktbringen der Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper oder Peptid, je nach Sachlage, unter Bedingungen, welche wirksam sind, um die Bildung eines Immunkomplexes zu ermöglichen, und anschließend das Nachweisen der Anwesenheit des Immunkomplexes ein.
Im allgemeinen ist der Nachweis einer Immunkomplexbildung auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und kann durch die Anwendung von zahlreichen Ansätzen erreicht werden. Zum Beispiel schließt die vorliegende Erfindung die Anwendung von ELISA-, RIA-, Immunoblot (z. B. Dot-Blot)- oder indirekten Immunfluoreszenz-Techniken und dergleichen ein. Im allgemeinen wird die Immunkomplexbildung durch die Verwendung eines Markers, wie eines radioaktiv markierten Stoffes oder eines Enzymmarkers (wie alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase und dergleichen), nachgewiesen. Natürlich können durch die Verwendung eines zweiten Bindungsliganden wie eines zweiten Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Liganden-Bindungsanordnung, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, weitere Vorteile erhalten werden.
Für Testzwecke wird vorgeschlagen, daß praktisch jede Probe, welche im Verdacht steht, entweder ein Kristallprotein oder Peptid oder ein mit dem Kristallprotein verwandtes Peptid oder einen Antikörper zu enthalten, welches (welcher) nachgewiesen werden soll, je nach Sachlage, verwendet werden kann. Es wird erwartet, daß solche Ausführungsformen bei der Titration von Antigen- oder Antikörperproben, bei der Selektion von Hybridomen und dergleichen Anwendung finden können. In damit verbundenen Ausführungsformen schließt die vorliegende Erfindung die Herstellung von Kits ein, welche verwendet werden können, um die Anwesenheit von Kristallproteinen oder verwandten Peptiden und/oder Antikörpern in einer Probe nachzuweisen. Die Proben können Zellen, Zellüberstände, Zellsuspensionen, Zellextrakte, Enzymfraktionen, Proteinextrakte oder andere zellfreie Zusammensetzungen, welche im Verdacht stehen, Kristallproteine oder Peptide zu enthalten, einschließen. Im allgemeinen enthalten die erfindungsgemäßen Kits ein geeignetes Kristallprotein, Peptid oder einen Antikörper, welcher gegen ein solches Protein oder Peptid gerichtet ist, zusammen mit einem Immunnachweisreagens und einen Behälter für den Antikörper oder das Antigen oder das Reagens. Das Immunnachweisreagens umfaßt typischerweise einen Marker in Assoziation mit dem Antikörper oder dem Antigen oder in Assoziation mit einem zweiten Bindungsliganden. Beispielhafte Liganden können einen sekundären Antikörper, welcher gegen den ersten Antikörper oder ein Antigen gerichtet ist, oder einen Biotin- oder Avidin (oder Streptavidin)-Liganden mit einem assoziierten Marker einschließen. Natürlich, wie oben angemerkt, ist eine Reihe von beispielhaften Markern auf dem Fachgebiet bekannt, und alle solche Marker können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Behälter schließt im allgemeinen ein Fläschchen ein, in das der Antikörper, das Antigen oder das Nachweisreagens eingebracht und vorzugsweise geeignet aliquotiert werden kann. Die erfindungsgemäßen Kits schließen auch typischerweise ein Mittel zur Aufnahme der Antikörper-, Antigen- und Reagens-Behälter auf engem Raum für den Verkauf über den Handel ein. Solche Behälter können Injektions- oder blasgeformte Kunststoffbehälter, in denen die gewünschten Fläschchen festgehalten werden, einschließen.
2.3 ELISAs und Immunpräzipitation
ELISAs können in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden. In einem ELISA-Assay werden Proteine oder Peptide, welche Kristallprotein-Antigensequenzen einschließen, auf einer ausgewählten Oberfläche, vorzugsweise einer Oberfläche, welche eine Proteinaffinität zeigt, wie die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte, immobilisiert. Nach dem Waschen, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen, ist es wünschenswert, die Vertiefungen der Testplatte mit einem unspezifischen Protein, das bekanntermaßen im Hinblick auf das Test-Antiserum, wie Rinderserumalbumin (BSA), Casein oder Lösungen von Milchpulver, antigen-neutral ist, zu beschichten bzw. dieses daran zu binden. Dies ermöglicht die Blockierung unspezifischer Adsorptionsstellen auf der Immobilisierungsoberfläche und verringert auf diese Weise den Hintergrund, der durch eine unspezifische Bindung des Antiserums an die Oberfläche verursacht wird.
Nach der Bindung eines antigenen Materials an die Vertiefung, der Beschichtung mit einem reaktionsunfähigen Material zur Verringerung des Hintergrunds und dem Waschen, um das ungebundene Material zu entfernen, wird die Immobilisierungsoberfläche mit dem Antiserum oder dem klinischen oder biologischen Extrakt, welches(r) getestet werden soll, in einer Weise, welche die Immunkomplex (Antigen/Antikörper)-Bildung begünstigt, in Kontakt gebracht. Solche Bedingungen schließen vorzugsweise das Verdünnen des Antiserums mit Verdünnungsmitteln wie BSA, Rindergammaglobulin (BGG) und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)/Tween^® ein. Diese zugesetzten Mittel neigen auch dazu, die Verringerung des unspezifischen Hintergrunds zu begünstigen. Das überschichtete Antiserum läßt man dann für etwa 2 bis etwa 4 Stunden bei Temperaturen vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 25°C bis etwa 27°C inkubieren. Nach der Inkubation wird die mit dem Antiserum in Kontakt gebrachte Oberfläche gewaschen, um das nicht in einem Immunkomplex gebundene Material zu entfernen. Eine bevorzugte Waschprozedur schließt das Waschen mit einer Lösung wie PBS/Tween^® oder Boratpuffer ein.
Nach Bildung der spezifischen Immunkomplexe zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antigen und dem anschließenden Waschen kann das Vorhandensein und auch die Menge einer Immunkomplexbildung bestimmt werden. indem die Immunkomplexe einem zweiten Antikörper mit einer Spezifität für den ersten Antikörper ausgesetzt werden. Um ein Nachweismittel bereitzustellen, weist der zweite Antikörper vorzugsweise ein assoziiertes Enzym auf, das bei der Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat eine Farbentwicklung hervorruft. So kann es zum Beispiel wünschenswert sein, die Oberfläche, an welche das Antiserum gebunden ist, mit einem Urease- oder Peroxidase-konjugierten anti-Mensch-IgG für einen Zeitraum und unter Bedingungen, welche die Entwicklung einer Immunkomplexbildung begünstigen (z. B. eine Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS enthaltenden Lösung, wie PBS/Tween^®), in Kontakt zu bringen und zu inkubieren.
Nach der Inkubation mit dem zweiten enzymmarkierten Antikörper und einem darauffolgenden Waschschritt zur Entfernung des ungebundenen Materials wird die Menge des Markers durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat wie Harnstoff und Bromcresolpurpur oder 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und H₂O₂, im Falle von Peroxidase als Enzymmarker, quantitativ bestimmt. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Grads der Farbentwicklung, z. B. unter Verwendung eines Spektrophotometers im sichtbaren Spektrum, erreicht.
Die anti-Kristallprotein-Antikörper der vorliegenden Erfindung sind für die Isolierung von anderen Kristallprotein-Antigenen mittels Immunpräzipitation besonders nützlich. Die Immunpräzipitation beinhaltet die Abtrennung der Zielantigenkomponente aus einer komplexen Mischung, und wird verwendet, um kleinste Proteinmengen zu isolieren oder zu unterscheiden. Für die Isolierung von Membranproteinen müssen die Zellen in Detergensmizellen solubilisiert werden. Nichtionische Salze werden bevorzugt, da andere Mittel wie Gallensalze bei einem sauren pH oder in Gegenwart von zweiwertigen Kationen ausfallen.
In einer anderen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Antikörper nützlich, um zwei Antigene in enge Nachbarschaft zueinander zu bringen. Dies ist besonders nützlich, um die örtliche Konzentration von Antigenen, z. B. Enzym-Substrat-Paaren, zu erhöhen.
2.4 Western-Blots
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen finden weitreichende Anwendung bei der Immunoblot- oder Western-Blot-Analyse. Die anti-Peptid-Antikörper können als primäre Reagenzien mit einer hohen Affinität zur Identifizierung von Proteinen, immobilisiert an eine feste Trägermatrix, wie Nitrocellulose, Nylon oder Kombinationen hiervon, verwendet werden. In Verbindung mit einer Immunpräzipitation, gefolgt durch eine Gelelektrophorese, können sie als ein Einzelreaktionsschritt-Reagens zur Verwendung beim Nachweis von Antigenen, wobei sekundäre Reagenzien, die beim Nachweis des Antigens verwendet werden, einen unerwünschten Hintergrund verursachen, verwendet werden. Dies ist besonders nützlich, wenn die untersuchten Antigene Immunglobuline sind (ausgenommen bei der Verwendung von bakteriellen Zellwandkomponenten, welche Immunglobuline binden), die untersuchten Antigene mit dem Nachweismittel kreuzreaktiv sind oder diese bei dem gleichen relativen Molekulargewicht wie ein kreuzreaktives Signal wandern.
Immunologische Nachweisverfahren zur Verwendung in Verbindung mit einem Western-Blot-Verfahren, einschließlich enzym-, radioaktiv oder fluoreszenzmarkierte, sekundäre Antikörper gegen die Toxineinheit, werden in dieser Hinsicht als besonders nützlich angesehen.
2.5 Epitop-Kernsequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Protein- oder Peptidzusammensetzungen, welche frei an ganzen Zellen und anderen Peptiden sind und ein gereinigtes Protein oder Peptid umfassend, das ein Epitop einschließt, welches mit einem oder mehreren anti-Kristallprotein-Antikörpern immunologisch kreuzreaktiv ist. Die Erfindung betrifft insbesondere Epitop-Kernsequenzen, welche aus Cry-Proteinen oder -Peptiden abgeleitet sind.
So wie hierin verwendet. soll der Begriff "ein oder mehrere Epitope einschließend, welche mit einem oder mehreren anti-Kristallprotein-Antikörpern immunologisch kreuzreaktiv sind" auf ein Peptid- oder Protein-Antigen verweisen, das eine Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur besitzt, die Ähnlichkeit hat mit einem Epitop, das innerhalb eines Kristallproteins oder Polypeptids lokalisiert ist. Der Grad der Ähnlichkeit ist im allgemeinen derart, daß monoclonale oder polyclonale Antikörper, welche gegen das Kristallprotein oder Polypeptid gerichtet sind, auch an das kreuzreaktive Peptid- oder Protein-Antigen binden, damit reagieren oder es in anderer Weise erkennen. Verschiedene Immunoassay-Methoden können in Verbindung mit solchen Antikörpern angewendet werden, wie zum Beispiel Western-Blot-, ELISA- oder RIA-Verfahren und dergleichen, welche den Fachleuten alle bekannt sind.
Die Identifizierung von Cry-immundominanten Epitopen und/oder deren funktionellen Gegenstücken, welche zur Verwendung in Impfstoffen geeignet sind, ist eine relativ einfache Angelegenheit. Zum Beispiel kann man die Verfahren von Hopp anwenden, so wie gelehrt in US-Patent 4,554,101, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, welches die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Die in mehreren anderen Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren und darauf basierende Software-Programme können auch angewendet werden, um Epitop-Kernsequenzen zu identifizieren (vgl. zum Beispiel Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; US-Patent 4,554,101). Die Aminosäuresequenz dieser "Epitop-Kernsequenzen" kann dann ohne weiteres, entweder durch die Anwendung der Peptidsynthese- oder der Rekombinationstechnik, in Peptide eingeschlossen werden.
Bevorzugte Peptide zur Verwendung im Einklang mit der vorliegenden Erfindung besitzen im allgemeinen eine Länge in der Größenordnung von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren, und mehr bevorzugt eine Länge von etwa 8 bis etwa 15 Aminosäuren. Es wird angenommen, daß kürzere antigene Peptide, welche aus Kristallproteinen abgeleitet sind, unter bestimmten Umständen, zum Beispiel bei der Herstellung von immunologischen Nachweistests, Vorteile vorsehen. Beispielhafte Vorteile schließen die Einfachheit der Herstellung und Reinigung, die relativ geringen Kosten und die verbesserte Reproduzierbarkeit der Produktion und eine vorteilhafte Bioverteilung ein.
Man nimmt an, daß die besonderen Vorteile der vorliegenden Erfindung durch die Herstellung von synthetischen Peptiden, welche modifizierte und/oder verlängerte epitopische/immunogene Kernsequenzen einschließen, wobei ein "universelles" Epitoppeptid erhalten wird, das gegen Kristallproteine und insbesondere Cry- und mit Cry verwandte Sequenzen gerichtet ist, verwirklicht werden können. Diese Epitop-Kernsequenzen werden unter bestimmten Aspekten hierin als hydrophile Regionen des bestimmten Polypeptid-Antigens identifiziert. Man nimmt an, daß diese Regionen denjenigen entsprechen, welche höchstwahrscheinlich die T-Zell- oder B-Zellstimulierung fördern und daher eine spezifische Antikörperproduktion hervorrufen.
Eine Epitop-Kernsequenz, so wie hierin verwendet, ist ein relativ kurzer Bereich von Aminosäuren, der zu Antigen-Bindungsstellen auf den hierin offenbarten Antikörpern, die gegen ein Kristallprotein gerichtet sind, "komplementär" ist und daher daran bindet. Zusätzlich oder alternativ ist eine Epitop-Kernsequenz eine Sequenz, welche Antikörper hervorruft, die mit Antikörpern kreuzreaktiv sind, welche gegen die erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzungen gerichtet sind. Es ist selbstverständlich, daß in Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung der Begriff "komplementär" auf Aminosäuren oder Peptide verweist, welche eine Anziehungskraft aufeinander ausüben. Folglich können bestimmte erfindungsgemäße Epitop-Kernsequenzen im Hinblick auf ihre Fähigkeit, um die Bindung des gewünschten Protein-Antigens mit dem entsprechenden, gegen das Protein gerichtete Antiserum zu konkurrieren oder es vielleicht zu verdrängen, funktionell definiert werden.
Man nimmt im allgemeinen an, daß die Größe des Polypeptid-Antigens nicht besonders wichtig ist, so lange es mindestens groß genug ist, um die identifizierte(n) Kernsequenz oder -sequenzen zu tragen. Die kleinste nützliche Kernsequenz, welche durch die vorliegende Offenbarung angenommen wird, würde im allgemeinen eine Länge in der Größenordnung von etwa 8 Aminosäuren besitzen, wobei Sequenzen in der Größenordnung von 10 bis 20 Aminosäuren mehr bevorzugt werden. Folglich entspricht die Größe im allgemeinen den kleinsten Peptid-Antigenen, welche im Einklang mit der Erfindung hergestellt werden. Jedoch kann die Größe des Antigens größer sein, falls gewünscht, so lange es eine wesentliche Epitop-Kernsequenz enthält.
Die Identifizierung von Epitop-Kernsequenzen ist den Fachleuten bekannt, zum Beispiel wie in US-Patent 4,554,101 beschrieben, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, welches die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis einer Hydrophilie lehrt. Außerdem sind zahlreiche Computerprogramme zur Verwendung bei der Vorhersage von antigenen Teilen von Proteinen verfügbar (vgl. z. B. Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Computergestützte Peptidsequenzanalysenprogramme (z. B. DNAStar^® Software, DNAStar, Inc., Madison, WI) können bei der Konstruktion von synthetischen Peptiden im Einklang mit der vorliegenden Offenbarung auch nützlich sein.
Synthesen von Epitopsequenzen oder Peptiden, welche ein antigenes Epitop in ihrer Sequenz einschließen, werden ohne weiteres mittels herkömmlicher Synthesetechniken wie dem Festphasenverfahren durchgeführt (z. B. unter Verwendung von handelsüblichen Peptid-Synthesegeräten, wie einem Applied Biosystems Modell 430A Peptid-Synthesegerät). Die auf diese Weise synthetisierten Peptid-Antigene können dann in vorbestimmten Mengen aliquotiert und in herkömmlicher Art und Weise, wie in wäßrigen Lösungen oder auch mehr bevorzugt in einem pulverförmigen oder gefriergetrockneten Zustand, bis zur Verwendung gelagert werden.
Im allgemeinen können Peptide aufgrund ihrer relativen Stabilität in wäßrigen Lösungen ohne weiteres für sehr lange Zeiträume, falls gewünscht, z. B. bis zu sechs Monate oder mehr, in praktisch jeder wäßrigen Lösung ohne einen nennenswerten Abbau oder Verlust der antigenen Aktivität gelagert werden. Falls jedoch eine längere Lagerung in einem wäßrigen Zustand erwogen wird, ist es im allgemeinen wünschenswert, Mittel einzuschließen, einschließlich Puffer wie Tris- oder Phosphatpuffer, um einen pH von etwa 7,0 bis etwa 7,5 aufrechtzuerhalten. Ferner kann es wünschenswert sein, Mittel einzuschließen, welche das Wachstum von Mikroorganismen hemmen, wie Natriumazid oder Merthiolat. Für eine längere Lagerung in einem wäßrigen Zustand es wünschenswert, die Lösungen bei etwa 4°C oder mehr bevorzugt eingefroren zu lagern. Falls die Peptide in einem gefriergetrockneten oder pulverförmigen Zustand aufbewahrt werden, können sie natürlich praktisch unbegrenzt gelagert werden, z. B. in abgemessenen Aliquots, welche mit einer vorbestimmten Menge an Wasser (vorzugsweise destilliert) oder Puffer vor der Verwendung rehydratisiert werden können.
2.6 Nucleinsäuresegmente, codierend Kristallprotein-Chimäre
Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Segmente, sowohl native, synthetische als auch durch Mutagenese veränderte, die aus praktisch irgendeiner Quelle, welche frei an genomischer Gesamt-DNA ist und welche die hierin offenbarten neuen chimären Peptide codiert, synthetisiert oder isoliert werden können. DNA-Segmente, welche diese Peptidspezies codieren, können nachweislich Proteine, Polypeptide. Untereinheiten, funktionelle Domänen und dergleichen von mit Kristallproteinen verwandten oder anderen nicht verwandten Genprodukten codieren. Zusätzlich können diese DNA-Segmente unter Anwendung von Verfahren, welche den Fachleuten hinreichend bekannt sind, vollständig in vitro synthetisiert werden.
So wie hierin verwendet, verweist der Begriff "DNA-Segment" auf ein DNA-Molekül, das aus der genomischen Gesamt-DNA einer bestimmten Spezies isoliert worden ist. Daher verweist ein DNA-Segment, codierend ein Kristallprotein oder Peptid, auf ein DNA-Segment, das Sequenzen enthält, welche ein Kristallprotein codieren, welches aber isoliert ist von oder herauspräpariert ist aus der genomischen Gesamt-DNA der Spezies, aus welcher das DNA-Segment erhalten wird, was im vorliegenden Falle das Genom der Gram-positiven Bakteriengattung Bacillus und insbesondere die als B. thuringiensis bekannte Bacillus-Spezies ist. Im Begriff "DNA-Segment" eingeschlossen sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente und auch rekombinante Vektoren, einschließlich zum Beispiel Plasmide, Cosmide, Phagemide, Phagen, Viren und dergleichen.
In ähnlicher Weise verweist ein DNA-Segment, umfassend ein isoliertes oder gereinigtes Gen, das ein Kristallprotein codiert, auf ein DNA-Segment, welches zusätzlich zu den Sequenzen, welche das Peptid codieren, bestimmte andere Elemente, wie regulatorische Sequenzen, welche im wesentlichen von anderen in der Natur vorkommenden Genen oder Sequenzen, welche ein Protein codieren, isoliert sind, einschließen kann. In dieser Hinsicht wird der Begriff "Gene" der Einfachheit halber verwendet, um auf eine funktionelle Einheit zu verweisen, welche ein Protein, Polypeptid oder Peptid codiert. Wie den Fachleuten bekannt ist, schließt dieser funktionelle Begriff sowohl genomische Sequenzen, Operon-Sequenzen als auch kleinere, konstruierte Gensegmente, die Proteine, Polypeptide oder Peptide exprimieren oder zur Expression hiervon angepaßt sein können, ein.
"Im wesentlichen isoliert von anderen codierenden Sequenzen" bedeutet, daß das Gen von Interesse, in diesem Fall ein Gen, das ein bakterielles Kristallprotein codiert, den wesentlichen Teil der codierenden Region des DNA-Segments bildet, und daß das DNA-Segment keine großen Teile einer in der Natur vorkommenden codierenden DNA, wie große Chromosomenfragmente oder andere funktionelle Gene oder ein Operon codierende Regionen, enthält. Natürlich bezieht sich dies auf das DNA-Segment, so wie es ursprünglich isoliert wurde, und schließt keine Gene, rekombinanten Gene, synthetischen Linker oder codierenden Regionen ein, welche später durch die Hand des Menschen an das Segment angehängt werden.
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, welche DNA-Sequenzen einschließen, die eine Cry-Peptidspezies codieren, welche innerhalb ihrer Aminosäuresequenz eine Aminosäure sequenz einschließt, wie sie im wesentlichen in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 dargestellt ist.
Der Begriff "eine Sequenz, im wesentlichen wie in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 dargestellt" bedeutet, daß die Sequenz im wesentlichen einem Teil der Sequenz von entweder SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 entspricht, und relativ wenige Aminosäuren aufweist, welche nicht identisch sind zu den Aminosäuren irgendeiner dieser Sequenzen oder ein biologisch funktionelles Gegenstück hiervon sind. Der Begriff "biologisch funktionelles Gegenstück" ist auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und wird hierin weiterhin ausführlich definiert (vgl. z. B. 'Veranschaulichende Ausführungsformen'). Demgemäß sind Sequenzen, welche zwischen etwa 70 und etwa 80% oder mehr bevorzugt zwischen etwa 81 und etwa 90% oder noch mehr bevorzugt zwischen etwa 91 und etwa 99% Aminosäuresequenzübereinstimmung oder funktionelle Äquivalenz zu den Aminosäuren von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 aufweisen, Sequenzen, welche "im wesentlichen wie in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 dargestellt sind".
Es ist auch selbstverständlich, daß Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen zusätzliche Reste, wie zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5'- oder 3'-Sequenzen, einschließen können und immer noch im wesentlichen sind, wie in einer der hierin offenbarten Sequenzen dargestellt, so lange die Sequenz die oben dargelegten Kriterien, einschließlich der Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität des Proteins, wenn die Expression des Proteins von Interesse ist, erfüllt. Die Addition von terminalen Sequenzen tritt besonders für Nucleinsäuresequenzen zu, welche zum Beispiel verschiedene nichtcodierende Sequenzen einschließen können, welche entweder die 5'- oder 3'-Teile der codierenden Region umgeben, oder welche verschiedene interne Sequenzen. d. h. Introns, einschließen können, die bekanntermaßen in Genen vorkommen.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresegmente können unabhängig von der Länge der codierenden Sequenz selbst mit anderen DNA-Sequenzen wie Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymstellen, multiplen Clonierungsstellen, anderen codierenden Segmenten und dergleichen kombiniert werden, so daß ihre Gesamtlänge erheblich variieren kann. Es wird daher erwartet, daß ein Nucleinsäurefragment von praktisch jeder Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Einfachheit der Herstellung und die Verwendung in dem beabsichtigten DNA-Rekombinationsprotokoll begrenzt wird. Zum Beispiel können Nucleinsäurefragmente hergestellt werden, die einen kurzen zusammenhängenden Bereich einschließen, welcher eine der in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 offenbarten Peptidsequenzen codiert, oder die identisch sind mit oder komplementär sind zu DNA-Sequenzen, welche irgendeines der in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 offenbarten Peptide codieren, und besonders solche DNA-Segmente, welche in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 offenbart sind. Zum Beispiel werden DNA-Sequenzen mit einer Länge von zum Beispiel etwa 14 Nucleotiden und solche mit einer Länge von bis zu etwa 10.000, etwa 5.000, etwa 3.000, etwa 2.000, etwa 1.000, etwa 500, etwa 200, etwa 100, etwa 50 und etwa 14 Basenpaaren (einschließlich alle dazwischenliegenden Längen) ebenfalls als nützlich angesehen.
Es ist ohne weiteres verständlich, daß "dazwischenliegende Längen" in diesem Zusammenhang irgendeine Länge zwischen den angegebenen Bereichen bedeutet, wie 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; einschließlich aller ganzen Zahlen im Bereich von 200–500; 500–1.000; 1.000–2.000; 2.000–3.000; 3.000–5.000; und bis zu und einschließlich Sequenzen von etwa 10.000 Nucleotiden, und dergleichen.
Es ist auch selbstverständlich, daß diese Erfindung nicht auf die einzelnen Nucleinsäuresequenzen, welche die erfindungsgemäßen Peptide codieren oder welche die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 codieren, einschließlich solche DNA-Sequenzen, welche insbesondere in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 offenbart sind, begrenzt ist. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können daher alternativ die das Peptid codierenden Regionen selbst oder codierende Regionen, welche ausgewählte Veränderungen oder Modifikationen in der wesentlichen codierenden Region tragen, einschließen, oder sie können größere Polypeptide codieren, welche dennoch die das Peptid codierenden Regionen einschließen, oder sie können biologisch funktionell äquivalente Proteine oder Peptide codieren, welche variante Aminosäuresequenzen aufweisen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Segmente umfassen biologisch funktionell äquivalente Peptide. Solche Sequenzen können als Folge einer Codon-Redundanz und funktionellen Äquivalenz, welche bekanntermaßen natürlicherweise in Nucleinsäuresequenzen und den so codierten Proteinen auftreten, entstehen. Alternativ können funktionell äquivalente Proteine oder Peptide unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik erzeugt werden, wobei Veränderungen in der Proteinstruktur unter Berücksichtigung der Eigenschaften der ausgetauschten Aminosäuren eingeführt werden können. Austäusche, welche durch den Menschen beabsichtigt werden, können durch die Anwendung von Techniken der ortsspezifischen Mutagenese eingeführt werden, z. B. um Verbesserungen der Antigenität des Proteins herbeizuführen oder um Mutanten zu testen, um die Aktivität auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Falls gewünscht, kann man auch Fusionsproteine und -peptide herstellen, worin z. B. die das Peptid codierenden Regionen innerhalb derselben Expressionseinheit mit anderen Proteinen oder Peptiden mit gewünschten Funktionen gruppiert sind, wie für Reinigungs- oder Immunnachweiszwecke (z. B. Proteine, welche durch Affinitätschromatographie gereinigt werden können, bzw. enzymmarkierte codierende Regionen).
Rekombinante Vektoren stellen weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung dar. Besonders nützliche Vektoren schließen solche Vektoren ein, worin der codierende Teil des DNA-Segments, ob er ein Protein vollständiger Länge oder ein kleineres Peptid codiert, sich unter der Kontrolle eines Promotors befindet. Der Promotor kann in Form des Promotors vorliegen, welcher natürlicherweise mit einem Gen assoziiert ist, das die erfindungsgemäßen Peptide codiert, so wie er durch Isolierung der 5'-nichtcodierenden Sequenzen, welche stromaufwärts des codierenden Segments oder Exons angeordnet sind, zum Beispiel unter Anwendung der rekombinanten Clonierungs- und/oder PCR^TM-Technik in Verbindung mit den hierin offenbarten Zusammensetzungen erhalten werden kann.
2.7 Rekombinante Vektoren und Proteinexpression
In anderen Ausführungsformen wird erwartet, daß bestimmte Vorteile dadurch erhalten werden, daß das codierende DNA-Segment unter die Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors gebracht wird. So wie hierin verwendet, soll ein rekombinanter oder heterologer Promotor auf einen Promotor verweisen, welcher normalerweise nicht mit einem DNA-Segment, das ein Kristallprotein oder Peptid codiert, in der natürlichen Umgebung hiervon assoziiert ist. Solche Promotoren können Promotoren, welche normalerweise mit anderen Genen assoziiert sind, und/oder Promotoren, welche aus einer bakteriellen, viralen, eukaryontischen oder pflanzlichen Zelle isoliert sind, einschließen. Natürlich ist es wichtig, einen Promotor zu verwenden, welcher die Expression des DNA-Segments in dem für die Expression ausgewählten Zelltyp, Organismus oder auch Tier wirksam steuert. Die Verwendung von Promotor- und Zelltyp-Kombinationen zur Proteinexpression ist den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie im allgemeinen bekannt; vgl. Sambrook et al., 1989. Die verwendeten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein und können unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um eine hohe Expressionsrate des eingeschleusten DNA-Segments hervorzurufen, was bei der großtechnischen Herstellung von rekombinanten Proteinen oder Peptiden vorteilhaft ist. Geeignete Promotorsysteme, die zur Verwendung bei einer hohen Expressionsrate in Betracht gezogen werden, schließen, aber sind nicht begrenzt auf, das Pichia-Expressionsvektorsystem (Pharmacia LKB Biotechnology) ein.
In Verbindung mit Expressions-Ausführungsformen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen und Peptiden wird erwartet, daß überwiegend längere DNA-Segmente verwendet werden, wobei DNA-Segmente, welche die gesamte Peptidsequenz codieren, am meisten bevorzugt werden. Jedoch ist erkennbar, daß die Verwendung von kürzeren DNA-Segmenten, um die Expression von Kristallpeptiden oder Epitop-Kernregionen zu steuern, so wie sie bei der Erzeugung von anti-Kristallprotein-Antikörpern verwendet werden können, auch zum Schutzumfang der Erfindung gehört. DNA-Segmente, welche Peptid-Antigene mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 50 Aminosäuren oder mehr bevorzugt mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 30 Aminosäuren oder noch mehr bevorzugt mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren codieren, werden als besonders nützlich angesehen. Solche Peptid-Epitope können Aminosäuresequenzen sein, welche zusammenhängende Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 umfassen; oder irgendein Peptid-Epitop, welches durch die Nucleinsäuresequenzen von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 codiert wird.
Verfahren zur rekombinanten Expression von Kristallproteinen und Vektoren, welche bei der Expression von DNA-Konstrukten, die Kristallproteine codieren, nützlich sind, sind in der Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 95/02058 offenbart.
2.8 Rekombinante Wirtszellen
Die rekombinanten Wirtszellen der vorliegenden Erfindung, welche gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden sind, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2 Bei der NRRL gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegte Stämme
2.9 DNA-Segmente als Hybridisierungssonden und Primer
Zusätzlich zu ihrer Verwendung bei der Steuerung der Expression von Kristallproteinen oder Peptiden der vorliegenden Erfindung weisen die hierin eingeschlossenen Nucleinsäuresequenzen auch eine Vielzahl von anderen Verwendungen auf. Zum Beispiel sind sie auch als Sonden oder Primer in Nucleinsäurehybridisierungs-Ausführungsformen von Nutzen. Daher wird erwartet, daß Nucleinsäuresegmente, umfassend eine Sequenzregion, die aus einer langen zusammenhängenden Sequenz mit einer Länge von mindestens 14 Nucleotiden besteht, welche die gleiche Sequenz aufweist wie oder komplementär ist zu ein(em) langes(n) zusammenhängendes(n) DNA-Segment von 14 Nucleotiden von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33, besonders nützlich sind. Nucleinsäuresegmente, welche eine zusammenhängende Sequenz von mindestens 6 Aminosäuren von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 codieren, werden ebenfalls bevorzugt. Längere zusammenhängende, identische oder komplementäre Sequenzen, z. B. solche von etwa 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000 etc. (einschließlich aller dazwischenliegenden Längen und bis zu und einschließlich Sequenzen von vollständiger Länge), werden in bestimmten Ausführungsformen ebenfalls verwendet.
Die Fähigkeit solcher Nucleinsäuresonden, mit Sequenzen, welche ein Kristallprotein codieren, spezifisch zu hybridisieren, ermöglicht deren Verwendung beim Nachweis der Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer bestimmten Probe. Andere Verwendungen werden auch für möglich gehalten, einschließlich die Verwendung der Sequenzinformation zur Herstellung von mutanten Primerspezies oder von Primern zur Verwendung bei der Herstellung von anderen genetischen Konstruktionen.
Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzregionen, bestehend aus zusammenhängenden Nucleotidbereichen von 10–14, 15–30, 30, 50 oder auch 100–200 Nucleotiden usw., welche identisch sind mit oder komplementär sind zu DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33, werden insbesondere als Hybridisierungssonden zur Verwendung in z. B. Southern- oder Northern-Blot-Verfahren in Betracht gezogen. Kleinere Fragmente finden im allgemeinen Verwendung in Hybridisierungs-Ausführungsformen, wobei die Länge der zusammenhängenden komplementären Region variiert werden kann, z. B. zwischen etwa 10–14 und etwa 100 oder 200 Nucleotiden, jedoch können längere zusammenhängende komplementäre Bereiche verwendet werden, je nach Länge der komplementären Sequenzen, welche nachgewiesen werden sollen.
Natürlich können Fragmente auch durch andere Techniken, wie z. B. durch mechanische Scherung oder durch Restriktionsenzymverdau, erhalten werden. Kleine Nucleinsäuresegmente oder -fragmente können ohne weiteres hergestellt werden, zum Beispiel durch direkte Synthese des Fragments durch chemische Mittel, so wie sie im allgemeinen unter Verwendung eines automatischen Oligonucleotid-Synthesegeräts durchgeführt wird. Fragmente können auch durch Anwendung von Nucleinsäurereproduktionstechniken, wie der PCR^TM-Technologie von US-Patent 4,683,195 und 4,683,202, durch das Einschleusen von ausgewählten Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion und durch andere DNA-Rekombinationstechniken, welche den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie im allgemeinen bekannt sind, erhalten werden.
Entsprechend können die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen wegen ihrer Fähigkeit, selektiv Doppelstrangmoleküle mit komplementären Bereichen von DNA-Fragmenten zu bilden, verwendet werden. In Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung kann es wünschenswert sein, unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen zu verwenden, um verschiedene Selektivitätsgrade einer Sonde gegenüber der Zielsequenz zu erzielen. Für Anwendungen, welche eine hohe Selektivität erfordern, kann es typischerweise wünschenswert sein, relativ stringente Bedingungen zu verwendet werden, um die Hybride zu bilden, z. B. wird man Bedingungen mit einer relativ geringen Salzkonzentration und/oder einer hohen Temperatur wählen, so wie sie durch etwa 0,02 M bis etwa 0,15 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 70°C vorgesehen werden. Solche selektiven Bedingungen tolerieren wenige, wenn überhaupt, Fehlpaarungen zwischen der Sonde und dem Matrizen- oder Zielstrang, und wären für die Isolierung von DNA-Segmenten, welche ein Kristallprotein codieren, besonders geeignet. Der Nachweis von DNA-Segmenten mittels einer Hybridisierung ist den Fachleuten hinreichend bekannt, und die Lehren von US-Patent 4,965,188 und 5,176,995 sind für die Methoden der Hybridisierungsanalysen beispielhaft. Lehren, wie die in den Texten von Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop, 1991; und Kuby, 1994, zu findenden, sind besonders relevant.
Natürlich sind für einige Anwendungen, zum Beispiel, wobei die Herstellung von Mutanten unter Verwendung eines mutierten Primerstrangs, hybridisiert an eine zugrundeliegende Matrize, erwünscht ist, oder wobei man versucht, Sequenzen, welche ein Kristallprotein codieren, funktionelle Gegenstücke oder dergleichen aus verwandten Spezies zu isolieren, typischerweise weniger stringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich, um die Bildung des Heteroduplexes zu ermöglichen. Unter diesen Verhältnissen kann es wünschenswert sein, Bedingungen wie etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20°C bis etwa 55°C zu verwenden. Kreuzhybridisierende Spezies können dadurch ohne weiteres als positive Hybridisierungssignale im Hinblick auf Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. In jedem Fall ist allgemein erkennbar, daß die Bedingungen durch die Zugabe von ansteigenden Mengen an Formamid, welches dazu dient, den Hybriddoppelstrang in der gleichen Art und Weise wie eine erhöhte Temperatur zu destabilisieren, stringenter gemacht werden können. Folglich können die Hybridisierungsbedingungen ohne weiteres manipuliert werden, und diese Vorgehensweise ist im allgemeinen, abhängig von den gewünschten Ergebnissen, das Verfahren der Wahl.
In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenzen in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie einem Marker, zum Nachweis der Hybridisierung zu verwenden. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatoren ist auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich fluoreszierende, radioaktive, enzymatische oder andere Liganden, wie Avidin/Biotin, welche fähig sind, ein nachweisbares Signal hervorzurufen. In bevorzugten Ausführungsformen ist es wahrscheinlich wünschenswert, einen Fluoreszenzmarker oder einen Enzymmarker, wie Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstelle von radioaktiven oder anderen umweltunverträglichen Reagenzien zu verwenden. Im Falle von Enzymmarkern sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um ein Mittel vorzusehen, welches für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um die spezifische Hybridisierung mit komplementäre Nucleinsäuren enthaltenden Proben zu identifizieren.
Im allgemeinen wird es für möglich gehalten. daß die hierin beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagenzien bei einer Hybridisierung in Lösung als auch in Ausführungsformen unter Verwendung einer festen Phase nützlich sind. In Ausführungsformen unter Beteiligung einer festen Phase wird die zu testende DNA (oder RNA) an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder anderweitig gebunden. Diese gebundene einzelsträngige Nucleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die gewählten Bedingungen hängen von den besonderen Verhältnissen ab, welche auf den einzelnen erforderlichen Kriterien basieren (abhängig zum Beispiel von dem G + C-Gehalt, der Art der Ziel-Nucleinsäure, der Nucleinsäurequelle, der Größe der Hybridisierungssonde, etc.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um unspezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mit Hilfe des Markers nachgewiesen oder auch quantitativ bestimmt.
2.10 Biologisch funktionelle Gegenstücke
In die Struktur der erfindungsgemäßen Peptide und der sie codierenden DNA-Segmente können Modifikationen und Veränderungen eingeführt werden, wobei immer noch ein funktionelles Molekül erhalten wird, das ein Protein oder Peptid mit wünschenswerten Eigenschaften codiert. Das Folgende ist eine Besprechung unter der Zugrundelegung eines Austausches der Aminosäuren eines Proteins, um ein äquivalentes oder auch ein verbessertes Molekül der zweiten Generation zu erzeugen. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung wird erwartet, daß mutierte Kristallproteine zur Erhöhung der Insektizidaktivität des Proteins und folglich zur Erhöhung der Insektizidaktivität und/oder der Expression des rekombinanten Transgens in einer Pflanzenzelle nützlich sind. Die Aminosäureaustäusche können durch Veränderung der Codons der DNA-Sequenz gemäß den in Tabelle 3 angegebenen Codons erreicht werden.
Tabelle 3
Zum Beispiel können bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur ohne einen erkennbaren Verlust der interaktiven Bindungskapazität mit Strukturen wie zum Beispiel Antigen-Bindungsregionen oder Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen ersetzt werden. Da es die interaktive Kapazität und die Natur eines Proteins ist, welche die biologisch funktionelle Aktivität des Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenz-Substitutionen in eine Proteinsequenz und natür lich in die zugrundeliegende codierende DNA-Sequenz hiervon eingeführt werden, wobei trotzdem ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten wird. Es wird folglich durch die Erfinder in Betracht gezogen, daß verschiedene Austäusche in die Peptidsequenzen der offenbarten Zusammensetzungen oder entsprechenden DNA-Sequenzen, welche die Peptide codieren, ohne einen erkennbaren Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität eingeführt werden können.
Bei der Einführung solcher Austäusche kann der Hydropathie-Index von Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Wichtigkeit des hydropathischen Aminosäure-Indexes bei der Übertragung einer interaktiven biologischen Funktion auf ein Protein ist auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (Kyte und Doolittle, 1982, hierin unter Bezugnahme eingeschlossen). Es ist bekannt, daß der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zu der Sekundärstruktur des erhaltenen Proteins beiträgt, welche wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen, zum Beispiel Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen, definiert.
Jeder Aminosäure ist basierend auf ihren Hydrophilie- und Ladungseigenschaf ten ein Hydropathie-Index zugewiesen worden (Kyte und Doolittle, 1982), diese sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9); und Arginin (–4,5).
Auf dem Fachgebiet ist bekannt, daß bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit einem ähnlichen Hydropathie-Index oder -Ergebnis ersetzt werden können, wobei immer noch ein Protein mit einer ähnlichen biologischen Aktivität, d. h. ein biologisch funktionell äquivalentes Protein, erhalten wird. Bei der Einführung solcher Austäusche wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydropathie-Indices innerhalb ±2 liegen, bevorzugt, wobei solche innerhalb von ±1 besonders bevorzugt werden, und solche innerhalb von ±0,5 noch mehr bevorzugt werden.
Auf dem Fachgebiet ist auch selbstverständlich, daß die Substitution von ähnlichen Aminosäuren wirksam basierend auf der Hydrophilie durchgeführt werden kann. US-Patent 4,554,101 gibt an, daß die größte lokale, durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie durch die Hydrophilie der benachbarten Aminosäuren hiervon bestimmt wurde, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie in US-Patent 4,554,101 ausführlich beschrieben, sind den Aminosäureresten die folgenden Hydrophilie-Werte zugewiesen worden: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
Es ist selbstverständlich, daß eine Aminosäure durch eine andere mit einem Hydrophilie-Wert ersetzt werden kann, wobei noch immer ein biologisch äquivalentes und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Protein erhalten wird. Bei solchen Austäuschen wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Werte innerhalb ±2 liegen, bevorzugt, wobei solche innerhalb von ±1 besonders bevorzugt werden, und solche innerhalb von ±0,5 noch mehr bevorzugt werden.
Wie oben dargelegt, basieren Aminosäure-Substitutionen daher im allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäureseitenketten-Substituenten, zum Beispiel ihrer Hydrophobizität, Hydrophilie, Ladung, Größe und dergleichen. Beispielhafte Substitutionen, welche verschiedene der vorstehenden Eigenschaften berücksichtigen, sind den Fachleuten hinreichend bekannt und schließen ein: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin.
2.11 Ortsspezifische Mutagenese
Die ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, welche bei der Herstellung von einzelnen Peptiden oder biologisch funktionell äquivalenten Proteinen oder Peptiden durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA nützlich ist. Die Technik sieht ferner eine geeignete Möglichkeit vor, um Sequenzvarianten durch das Einführen eines oder mehrerer Nucleotidsequenzaustäusche in die DNA, zum Beispiel unter Berücksichtigung einer oder mehrerer der obigen Überlegungen, herzustellen und zu testen. Die ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Mutanten durch die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsequenzen, welche die DNA-Sequenz mit der gewünschten Mutation sowie eine ausreichende Anzahl an benachbarten Nucleotiden codieren, um eine Primersequenz von ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, damit ein stabiler Doppelstrang auf beiden Seiten der überbrückten Deletionsverbindungsstelle gebildet wird. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 17 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz verändert werden.
Im allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt, wie durch zahlreiche Veröffentlichungen veranschaulicht wird. Bekanntermaßen gebraucht die Technik typischerweise einen Phagenvektor, welcher in sowohl einer einzelsträngigen als auch in einer doppelsträngigen Form vorliegt. Typische Vektoren, welche bei der ortsspezifischen Mutagenese nützlich sind, schließen Vektoren wie den M13-Phagen ein. Diese Phagen sind ohne weiteres im Handel erhältlich, und deren Verwendung ist den Fachleuten im allgemeinen hinreichend bekannt. Doppelsträngige Plasmide werden auch üblicherweise bei der ortsspezifischen Mutagenese verwendet, wodurch der Schritt des Transfers des Gens von Interesse aus einem Plasmid in einen Phagen entfällt.
Im allgemeinen wird die ortsspezifische Mutagenese demgemäß durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird oder zwei Stränge eines doppel strängigen Vektors, welcher innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz einschließt, die das gewünschte Peptid codiert, aufgeschmolzen werden. Ein Oligonucleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, im allgemeinen synthetisch. Dieser Primer wird dann an den einzelsträngigen Vektor angelagert und DNA-Polymeraseenzymen wie dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase I ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs abzuschließen. Auf diese Weise wird ein Heteroduplex gebildet, worin ein Strang die ursprüngliche nicht mutierte Sequenz codiert, und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie E. coli-Zellen zu transformieren, und Clone, welche rekombinante Vektoren einschließen, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen, werden ausgewählt.
Die Herstellung von Sequenzvarianten der ausgewählten ein Peptid codierenden DNA-Segmente mittels der ortsspezifischen Mutagenese wird als ein Mittel für die Herstellung von potentiell nützlichen Spezies bereitgestellt und soll keine Begrenzung darstellen, da es andere Wege gibt, durch welche Sequenzvarianten von Peptiden und der sie codierenden DNA-Sequenzen erhalten werden können. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren, welche die gewünschte Peptidsequenz codieren, mit mutagenen Mitteln wie Hydroxylamin behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten.
2.12 Kristallprotein-Zusammensetzungen als Insektizide und Anwendungsverfahren
Die Erfinder erwarten, daß die hierin offenbarten chimären Kristallprotein-Zusammensetzungen besondere Verwendung als Insektizide für die topische und/oder systemische Anwendung bei Feldfrüchten, Gräsern, Früchten und Gemüse sowie Zierpflanzen finden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Bioinsektizidzusammensetzung eine ölige, fließfähige Suspension von Bakterienzellen, die ein hierin offenbartes neues Kristallprotein exprimieren. Vorzugsweise sind die Zellen B. thuringiensis-Zellen, jedoch wird erwartet, daß jede solche bakterielle Wirtszelle, welche die hierin offenbarten neuen Nucleinsäuresegmente exprimiert und ein Kristallprotein herstellt, nützlich ist, z. B. B. megaterium, B. subtilis, E. coli oder Pseudomonas sp.
In einer anderen wichtigen Ausführungsform umfaßt die Bioinsektizidzusammensetzung ein in Wasser dispergierbares Granulat. Dieses Granulat umfaßt Bakterienzellen, welche ein hierin offenbartes neues Kristallprotein exprimieren. Bevorzugte Bakterienzellen sind B. thuringiensis-Zellen, jedoch werden Bakterien wie B. megaterium-, B. subtilis-, E. coli- oder Pseudomonas sp.-Zellen, welche mit einem hierin offenbarten DNA-Segment transformiert sind und das Kristallprotein exprimieren, auch als nützlich angesehen.
In einer dritten wichtigen Ausführungsform umfaßt die Bioinsektizidzusammensetzung ein benetzbares Pulver, Stäubemittel, Pellet oder kolloidales Konzentrat. Das Pulver umfaßt Bakterienzellen, welche ein hierin offenbartes neues Kristallprotein exprimieren. Bevorzugte Bakterienzellen sind B. thuringiensis-Zellen, jedoch werden Bakterien wie B. megaterium-, B. subtilis-, E. coli- oder Pseudomonas sp.-Zellen, welche mit einem hierin offenbarten DNA-Segment transformiert sind und das Kristallprotein exprimieren, auch als nützlich angesehen. Solche trockene Formen der Insektizidzusammensetzungen können derart formuliert sein, daß sie sich unmittelbar bei der Benetzung auflösen oder alternativ in einer Weise mit kontrollierter Wirkstofffreisetzung, verzögerter Wirkstofffreisetzung oder einer anderen zeitabhängigen Wirkstofffreisetzung auflösen.
In einer vierten wichtigen Ausführungsform umfaßt die Bioinsektizidzusammensetzung eine wäßrige Suspension von Bakterienzellen, wie die oben beschriebenen, welche das Kristallprotein exprimieren. Solche wäßrigen Suspensionen können als eine konzentrierte Stammlösung, welche vor der Anwendung verdünnt wird, oder alternativ als eine gebrauchsfertige verdünnte Lösung bereitgestellt werden.
Für diese Verfahren in Verbindung mit der Verwendung von Bakterienzellen kann der zelluläre Wirt, welcher das/die Kristallprotein-Gen(e) enthält, in irgendeinem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden; wenn das DNA-Konstrukt einen Selektionsvorteil bereitstellt, wird für eine Selektionsmedium gesorgt, so daß im wesentlichen alle oder alle Zellen das B. thuringiensis-Gen beibehalten. Diese Zellen können dann im Einklang mit herkömmlichen Verfahren geerntet werden. Alternativ können die Zellen vor dem Ernten behandelt werden.
Wenn die Insektizidzusammensetzungen intakte B. thuringiensis-Zellen umfassen, welche das Protein von Interesse exprimieren, können solche Bakterien durch eine Vielzahl von Verfahren formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulate oder Stäubemittel verwendet werden, indem sie mit verschiedenen inerten Materialien, wie anorganischen Mineralien (Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate und dergleichen), oder botanischen Materialien (pulverisierte Maiskolben, Reisschalen, Walnußschalen und dergleichen) vermischt werden. Die Formulierungen können Verteilungsmittel-Haftmittel-Adjuvanzien, Stabilisierungsmittel, andere Pestizidzusätze oder Tenside einschließen. Flüssige Formulierungen können wäßrig oder nichtwäßrig sein und als Schäume, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dergleichen verwendet werden. Die Bestandteile können Fließmittel, Tenside, Emulgiermittel, Dispergiermittel oder Polymere einschließen.
Alternativ können die neuen chimären Cry-Proteine durch rekombinante bakterielle Expressionssysteme in vitro hergestellt und für die anschließende Ausbringung im Feld isoliert werden. Ein solches Protein kann entweder in Zellrohlysaten, Suspensionen, Kolloiden, etc. vorliegen, oder kann alternativ vor der Formulierung in eine aktive Biozidformulierung gereinigt, verarbeitet, gepuffert und/oder weiterverarbeitet werden. Desgleichen kann es unter bestimmten Verhältnissen wünschenswert sein, Kristalle und/oder Sporen aus Bakterienkulturen, welche das Kristallprotein exprimieren, zu isolieren und Lösungen, Suspensionen oder kolloidale Zubereitungen solcher Kristalle und/oder Sporen als aktive Bioinsektizidzusammensetzung auszubringen.
Ungeachtet des Anwendungsverfahrens ist die ausgebrachte Menge der aktiven Komponente(n) eine insektizid wirksame Menge, welche abhängig von solchen Faktoren wie zum Beispiel der zu bekämpfenden besonderen Coleoptera-Insekten, der zu behandelnden besonderen Pflanze oder Feldfrucht, den Umweltbedingungen und dem Verfahren, der Rate und der Quantität der Ausbringung der insektizid aktiven Zusammensetzung variiert.
Die beschriebenen Insektizidzusammensetzungen können durch Formulierung von entweder der Bakterienzelle, der Kristall- und/oder Sporensuspension oder der isolierten Proteinkomponente mit dem gewünschten landwirtschaftlich verträglichen Trägern hergestellt werden. Die Zusammensetzungen können vor der Applikation durch ein geeignetes Verfahren, wie Lyophilisieren, Gefriertrocknen oder Trocknen, oder in einem wäßrigen Träger, Medium oder geeigneten Verdünnungsmittel wie eine Salzlösung oder einem anderen Puffer formuliert werden. Die formulierten Zusammensetzungen können in Form eines Stäubemittels oder eines granulären Materials oder einer Suspension in Öl (pflanzlich oder mineralisch) oder Wasser oder von Öl/Wasser-Emulsionen oder als ein benetzbares Pulver oder in Kombination mit irgendeinem anderen Trägermaterial, welches für die landwirtschaftliche Ausbringung geeignet ist, vorliegen. Geeignete landwirtschaftliche Träger können fest oder flüssig sein und sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Der Begriff "landwirtschaftlich verträglicher Träger" schließt alle Adjuvanzien ein, z. B. inerte Komponenten, Dispergiermittel, Tenside, Klebrigmacher, Bindemittel, etc., die üblicherweise bei der Insektizidformulierungstechnik verwendet werden; diese sind den Fachleuten der Insektizidformulierung hinreichend bekannt. Die Formulierungen können mit einem oder mehreren festen oder flüssigen Adjuvanzien gemischt und durch verschiedene Verfahren, z. B. durch homogenes Mischen, Vermischen und/oder Vermahlen der Insektizidzusammensetzung mit geeigneten Adjuvanzien mittels herkömmlicher Formulierungstechniken, zubereitet werden.
Die erfindungsgemäßen Insektizidzusammensetzungen werden in die Umgebung des Coleoptera-Zielinsekts, typischerweise auf die Blätter der zu schützenden Pflanze oder Feldfrucht, durch herkömmliche Verfahren, vorzugsweise durch Sprühen, ausgebracht. Die Intensität und Dauer der Insektizidanwendung wird im Hinblick auf die Bedingungen festgelegt, welche für das (die) besondere(n) Pestizid(e), die zu behandelnde(n) Nutzpflanze(n) und die besonderen Umweltbedingungen spezifisch sind. Das proportionale Verhältnis von Wirkstoffbestandteil zu dem Träger hängt natürlich von der chemischen Natur, Löslichkeit und Stabilität der Insektizidzusammensetzung sowie der besonderen beabsichtigten Formulierung ab.
Andere Ausbringungstechniken, z. B. Zerstäuben, Bespritzen, Einweichen, Bodeninjektion, Samenbeschichtung, Sämlingbeschichtung, Sprühen, Belüften, Vernebeln, Atomisieren und dergleichen, sind auch möglich und können unter bestimmten Umständen erforderlich sein, wie z. B. bei Insekten, welche einen Wurzel- oder Halmbefall ver ursachen, oder zur Ausbringung auf empfindliche Vegetationen oder Zierpflanzen. Diese Ausbringungsverfahren sind den Fachleuten ebenfalls hinreichen bekannt.
Die erfindungsgemäßen Insektizidzusammensetzungen können in dem Verfahren der Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Verbindungen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, anderen Pestiziden, verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in Verbindung mit anderen Behandlungen wie mit Tensiden, Detergenzien, Polymeren oder Formulierungen mit einer zeitabhängigen Wirkstofffreisetzung verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Insektizidzusammensetzungen können entweder für die systemische oder die topische Anwendung formuliert werden.
Die Konzentration der Insektizidzusammensetzung, welche für die Ausbringung in die Umwelt, die systemische Anwendung oder den Blattauftrag verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von der Art der einzelnen Formulierung, dem Mittel der Ausbringung, den Umweltbedingungen und dem Grad der Biozidaktivität. Typischerweise liegt die Bioinsektizidzusammensetzung in der ausgebrachten Formulierung in einer Konzentration von mindestens etwa 0,5 Gew.-% vor und kann bis zu und einschließlich etwa 99 Gew.-% betragen. Trockene Formulierungen der Zusammensetzungen können etwa 0,5 bis etwa 99 Gew.-% oder mehr der Zusammensetzung umfassen, während flüssige Formulierungen im allgemeinen etwa 0,5 bis etwa 99 Gew.-% oder mehr des Wirkstoffbestandteils umfassen. Formulierungen, welche intakte Bakterienzellen umfassen, enthalten im allgemeinen etwa 10⁴ bis etwa 10¹² Zellen/mg.
Die Insektizidformulierung kann in einer oder mehreren Anwendungen, falls erforderlich, an eine bestimmte Pflanze verabreicht oder auf einen Zielbereich aufgebracht werden, wobei eine typische Feldausbringungsrate pro Hektar in der Größenordnung von etwa 50 g bis etwa 500 g des Wirkstoffbestandteils oder von etwa 500 g bis etwa 1.000 g oder von etwa 1.000 g bis etwa 5.000 g oder mehr des Wirkstoffbestandteils liegt.
2.13 Antikörperzusammensetzungen und Herstellungsverfahren
In bestimmten Ausführungsformen erwägen die Erfinder die Verwendung von Antikörpern, entweder monoclonal oder polyclonal, welche an die hierin offenbarten Kristallproteine binden. Mittel zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt (vgl. z. B. Harlow und Lane, 1989; hierin unter Bezugnahme eingeschlossen). Die Verfahren zur Erzeugung von monoclonalen Antikörpern (mAbs) folgen im allgemeinen den gleichen Grundsätzen wie für die Herstellung von polyclonalen Antikörpern. Kurz zusammengefaßt wird ein polyclonaler Antikörper dadurch hergestellt, daß ein Tier mit einer erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzung immunisiert wird und das Antiserum aus dem immunisierten Tier gewonnen wird. Ein große Auswahl von Tierarten kann für die Herstellung von Antiseren verwendet werden. Typischerweise ist das zur Herstellung von anti-Antiseren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege.
Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen ist ein Kaninchen eine bevorzugte Wahl für die Herstellung von polyclonalen Antikörpern.
Wie auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt ist, kann eine bestimmte Zusammensetzung hinsichtlich ihrer Immunogenität variieren. Es ist daher oft notwendig, das Immunsystem des Wirts zu stimulieren, wie durch Kopplung eines Peptid- oder Polypeptid-Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine wie Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können auch als Träger verwendet werden. Mittel zur Konjugation eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und schließen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und Bisbiazo-behandeltes Benzidin ein.
Wie auf dem Fachgebiet auch hinreichend bekannt ist, kann die Immunogenität einer bestimmten immunogenen Zusammensetzung durch die Verwendung von unspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, welche als Adjuvanzien bekannt sind, verstärkt werden. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvanzien schließen komplettes Freundsches Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, enthaltend abgetötete Zellen von Mycobacterium tuberculosis), unvollständiges Freundsches Adjuvans und Aluminiumhydroxid-Adjuvans ein.
Die bei der Herstellung von polyclonalen Antikörpern verwendete Menge der immunogenen Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von der Art des Immunogens sowie des zur Immunisierung verwendeten Tiers. Eine Vielzahl von Wegen kann verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Herstellung von polyclonalen Antikörpern kann durch Entnehmen von Blut des immunisierten Tiers zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Eine zweite Injektion, eine Nachimpfung, kann auch verabreicht werden. Das Verfahren der Nachimpfung und Titration wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Wenn ein gewünschter Immunogenitätsgrad erreicht ist, kann dem immunisierten Tier Blut abgenommen und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann verwendet werden, um mAbs herzustellen.
mAbs können durch die Anwendung von hinreichend bekannten Techniken, wie den in US-Patent 4,196,265 veranschaulichten (hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen), ohne weiteres hergestellt werden. Typischerweise beinhaltet diese Technik die Immunisierung eines geeigneten Tiers mit einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, z. B. einem gereinigten oder teilweise gereinigten Kristallprotein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird in einer Art und Weise verabreicht, welche wirksam ist, um Antikörper produzierende Zellen zu stimulieren. Nagetiere wie Mäuse und Ratten sind bevorzugte Tiere, jedoch ist die Verwendung von Kaninchen-, Schafs- oder Froschzellen auch möglich. Die Verwendung von Ratten kann gewisse Vorteile vorsehen (Goding, 1986, S. 60–61), aber Mäuse werden bevorzugt, wobei die BALB/c-Maus am meisten bevorzugt wird, da diese meistens routinemäßig verwendet wird und im allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen ergibt.
Nach der Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential für die Produktion von Antikörpern, besonders B-Lymphocyten (B-Zellen), zur Verwendung in dem mAb-Erzeugungsprotokoll ausgewählt. Diese Zellen können aus biopsierten Milzen, Mandeln oder Lymphknoten oder aus einer peripheren Blutprobe erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen werden bevorzugt, die Ersteren weil sie eine ergiebige Quelle für Antikörper produzierende Zellen sind, welche in dem sich teilenden Plasmablastenstadium vorliegen, und die Letzteren, welche peripheres Blut leicht zugänglich ist. Oft ist eine Reihe von Tieren immunisiert worden, und die Milz eines Tiers mit dem höchsten Antikörpertiter wird entnommen, und die Milz-Lymphocyten werden durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze erhalten. Typischerweise enthält eine Milz aus einer immunisierten Milz etwa 5 × 10⁷ bis 2 bis 10⁸ Lymphocyten.
Die Antikörper produzierenden B-Lymphocyten aus dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer unsterblichen Myelomzelle fusioniert, im allgemeinen mit einer Myelomzelle derselben Spezies wie das Tier, welches immunisiert wurde. Myelomzelllinien, welche zur Verwendung in Hybridome erzeugenden Fusionsverfahren geeignet sind, produzieren vorzugsweise keine Antikörper, besitzen eine hohe Fusionseffizienz und weisen Enzymdefizienzen auf, welche dann ein Wachstum in bestimmten Selektionsmedien, welche nur das Wachstum der gewünschten Fusionszellen (Hybridome) fördern, unmöglich machen.
Jede einer Reihe von Myelomzellen, welche den Fachleuten bekannt sind (Goding, S. 65–66, 1986; Campbell, S. 75–83, 1984), kann verwendet werden. Zum Beispiel, wenn das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind alle in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen nützlich.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1-Myelomzelllinie (auch als P3-NS-1-Ag4-1 bezeichnet), welche ohne weiteres von der NIGMS Human Genetic Mutant Cell-Hinterlegungsstelle durch Ersuchen um die Zelllinien-Hinterlegungsnummer GM3573 erhältlich ist. Eine andere Maus-Myelomzelllinie, welche verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente murine Maus-Myelom-SP2/0-"Nicht-Erzeuger"-Zelllinie.
Verfahren zur Erzeugung von Hybriden aus Antikörper produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen üblicherweise das Mischen von somatischen Zellen mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 2 : 1, obgleich das Verhältnis jeweils von etwa 20 : 1 bis etwa 1 : 1 variieren kann, in Gegenwart eines Mittels oder von Mitteln (chemische oder elektrische), welche die Fusion von Zellmembranen begün stigen. Fusionsverfahren unter Verwendung des Sendai-Virus (Kohler und Milstein, 1975; 1976), sowie solche unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG), wie 37% (Vol./Vol.) PEG (Gefter et al., 1977), sind beschrieben worden. Die Anwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist auch geeignet (Goding, 1986, S. 71–74).
Fusionsverfahren bringen üblicherweise lebensfähige Hybride in geringen Häufigkeiten, etwa 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8, hervor. Jedoch stellt dies kein Problem dar, da sich die lebensfähigen, fusionierten Hybride von den nicht fusionierten Stammzellen (besonders den nicht fusionierten Myelomzellen, welche sich normalerweise fortgesetzt unbegrenzt teilen würden) durch das Züchten in einem Selektionsmedium unterschieden werden. Das Selektionsmedium ist im allgemeinen ein Medium, das ein Mittel enthält, welches die de novo-Synthese von Nucleotiden in dem Gewebekulturmedium blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo-Synthese von sowohl Purinen als auch Pyrimidinen, während Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wenn Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als eine Quelle für Nucleotide ergänzt (HAT-Medium). Wenn Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. In HAT-Medium können nur Zellen überleben, welche fähig sind, einen Nucleotidrückgewinnungsweg zu unterhalten. Die Myelomzellen sind bezüglich der Schlüsselenzyme des Rückgewinnungswegs, z. B. der Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT), defizient und können nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Abbauweg unterhalten, aber sie haben eine begrenzte Lebensdauer in Kultur und sterben im allgemeinen innerhalb von etwa zwei Wochen. Daher sind die einzigen Zellen, welche in dem Selektionsmedium überleben können, solche Hybride, welche sich aus Myelom- und B-Zellen gebildet haben.
Diese Züchtung stellt eine Population von Hybridomen bereit, aus welchen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Typischerweise wird die Selektion von Hybridomen durch das Züchten der Zellen mittels Einzelclon-Verdünnung in Mikrotiterplatten, gefolgt durch das Testen der einzelnen Clon-Überstände (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität, ausgeführt. Der Test sollte empfindlich, einfach und schnell sein, wie Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, cytotoxische Assays, Plaqueassays, Dot-Immunbindungsassays und dergleichen.
Die ausgewählten Hybridome würde man anschließend seriell verdünnen und in einzelne Antikörper produzierende Zelllinien clonieren, wobei die Clone dann unbegrenzt vermehrt werden können, um mAbs bereitzustellen. Die Zelllinien können für die mAb-Herstellung in zwei wesentlichen Verfahren verwendet werden. Eine Probe der Hybridome kann einem histokompatiblen Tier des Typs, welcher verwendet wurde, um die somatischen Zellen und die Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion bereitzustellen, gespritzt werden (oft in die Bauchfellhöhle). Das mit der Injektion behandelte Tier entwickelt Tumore, welche den spezifischen monoclonalen Antikörper sezernieren, der durch das fusionierte Zellhybrid hergestellt wird. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie Serum oder Aszitesflüssigkeit, können dann punktiert werden, um mAbs in hoher Konzentration bereitzustellen. Die einzelnen Zelllinien können auch in vitro gezüchtet werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem sie ohne weiteres in hohen Konzentrationen erhalten werden. Die durch jedes Verfahren hergestellten mAbs können mittels Filtrations-, Zentrifugations- und verschiedenen Chromatographieverfahren, wie HPLC oder Affinitätschromatographie, gegebenenfalls weiter gereinigt werden.
3.0 Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen machen einen Teil der vorliegenden Beschreibung aus und sind eingeschlossen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen. Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Verbindung mit der ausführlichen Beschreibung der hierin vorgestellten spezifischen Ausführungsformen verständlicher.
1: Die Wildtyp-δ-endotoxine und die relevanten Restriktionsstellen, welche zur Konstruktion der erfindungsgemäß wichtigen Hybrid-δ-Endotoxine verwendet wurden, sind in 1A schematisch dargestellt. Es ist nur die DNA dargestellt, welche das δ-Endotoxin codiert, das in dem angegebenen Plasmid enthalten ist (gekennzeichnet durch die Vorsilbe "pEG"). Die B. thuringiensis-Stämme, welche die angegebenen Plasmide enthalten, sind durch die Vorsilbe "EG" gekennzeichnet. Die in der Erfindung beschriebenen Hybrid-δ-Endotoxine sind in 1B schematisch dargestellt und sind an den Wildtyp-δ-Endotoxinen in 1A ausgerichtet.
2: Eine gleiche Menge jeder gewaschenen sporenbildenden B. thuringiensis-Kultur wurde durch eine SDS-PAGE analysiert. Bahn a: Kontrolle – der Cry1Ac produzierende B. thuringiensis-Stamm EG11070; b: EG11060; c: EG11062; d: EG11063; e: EG11065; f: EG11067; g: EG11071; h: EG11073; i: EG11074; j: EG11088; k: EG11090; und 1: EG11091.
3: Solubilisierte Hybrid-δ-Endotoxine wurden Trypsin für 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten ausgesetzt. Das erhaltene Material wurde durch eine SDS-PAGE analysiert. Die Menge des restlichen aktiven δ-Endotoxin-Fragments wurde mittels Abtastdensitometrie unter Verwendung eines Molecular Dynamics Modell 300A-Densitometers quantitativ bestimmt. Der Prozentsatz des restlichen aktiven Toxins wurde gegen die Zeit aufgetragen. Wildtyp-Cry1Ac-δ-Endotoxin (nicht ausgefülltes Kästchen) diente als Kontrolle.
4: Schematische Darstellungen der Wildtyp-Toxine und der relevanten Restriktionsstellen, welche zur Konstruktion des durch pEG381 codierten und in EG11768 exprimierten Hybrid-δ-Endotoxins verwendet wurden. Es ist nur die DNA dargestellt, welche das δ-Endotoxin codiert, das in dem angegebenen Plasmid enthalten ist (gekennzeichnet durch die Vorsilbe "pEG").
4.0 Kurze Beschreibung der Sequenzidentifizierungen
SEQ ID NO: 1 ist der Oligonucleotidprimer A.
SEQ ID NO: 2 ist der Oligonucleotidprimer B.
SEQ ID NO: 3 ist der Oligonucleotidprimer C.
SEQ ID NO: 4 ist der Oligonucleotidprimer D.
SEQ ID NO: 5 ist der Oligonucleotidprimer E.
SEQ ID NO: 6 ist der Oligonucleotidprimer F.
SEQ ID NO: 7 ist der Oligonucleotidprimer G.
SEQ ID NO: 8 ist der Oligonucleotidprimer H.
SEQ ID NO: 9 ist die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des EG11063-Hybrid-δ-Endotoxins.
SEQ ID NO: 10 gibt in der Drei-Buchstaben-Abkürzungsform die Aminosäuresequenz für das in SEQ ID NO: 9 spezifizierte Hybrid-δ-Endotoxin an.
SEQ ID NO: 11 ist die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des EG11074-Hybrid-δ-Endotoxins.
SEQ ID NO: 12 gibt in der Drei-Buchstaben-Abkürzungsform die Aminosäuresequenz für das in SEQ ID NO: 11 spezifizierte Hybrid-δ-Endotoxin an.
SEQ ID NO: 13 ist die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des EG11735-Hybrid-δ-Endotoxins.
SEQ ID NO: 14 gibt in der Drei-Buchstaben-Abkürzungsform die Aminosäuresequenz für das in SEQ ID NO: 13 spezifizierte Hybrid-δ-Endotoxin an.
SEQ ID NO: 15 ist die 5'-Austauschstelle für pEG1065, pEG1070 und pEG1074.
SEQ ID NO: 16 ist die 5'-Austauschstelle für pEG1067, pEG1072 und pEG1076.
SEQ ID NO: 17 ist die 5'-Austauschstelle für pEG1068, pEG1077 und pEG365.
SEQ ID NO: 18 ist die 5'-Austauschstelle für pEG1088 und pEG1092.
SEQ ID NO: 19 ist die 5'-Austauschstelle für pEG1089 und die 3'-Austauschstelle für pEG1070 und pEG1072.
SEQ ID NO: 20 ist die 5'-Austauschstelle für pEG1091.
SEQ ID NO: 21 ist die 3'-Austauschstelle für pEG1065, pEG1067, pEG1068, pEG1093, pEG378 und pEG365.
SEQ ID NO: 22 ist die 3'-Austauschstelle für pEG1088.
SEQ ID NO: 23 ist der Oligonucleotidprimer I.
SEQ ID NO: 24 ist der Oligonucleotidprimer J.
SEQ ID NO: 25 ist die Nucleinsäuresequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz für das ein Hybrid-Kristallprotein codierende Gen von EG11092.
SEQ ID NO: 26 ist die Drei-Buchstaben-Abkürzungsform der Aminosäuresequenz des durch den Stamm EG11092 produzierten Hybrid-Kristallproteins, welches durch SEQ ID NO: 25 codiert wird.
SEQ ID NO: 27 ist die Nucleinsäuresequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz für das ein Hybrid-Kristallprotein codierende Gen von EG11751.
SEQ ID NO: 28 ist die Drei-Buchstaben-Abkürzungsform der Aminosäuresequenz des durch den Stamm EG11751 produzierten Hybrid-Kristallproteins, welches durch SEQ ID NO: 27 codiert wird.
SEQ ID NO: 29 ist die Nucleinsäuresequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz für das ein Hybrid-Kristallprotein codierende Gen von EG11091.
SEQ ID NO: 30 ist die Drei-Buchstaben-Abkürzungsform der Aminosäuresequenz des durch den Stamm EG11091 produzierten Hybrid-Kristallproteins, welches durch SEQ ID NO: 29 codiert wird.
SEQ ID NO: 31 ist der Oligonucleotidprimer K.
SEQ ID NO: 32 ist die 5'-Austauschstelle für pEG378 und pEG381.
SEQ ID NO: 33 ist die Nucleinsäuresequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz für das ein Hybrid-Kristallprotein codierende Gen von EG11768.
SEQ ID NO: 34 kennzeichnet in der Drei-Buchstaben-Abkürzungsform die Aminosäuresequenz des durch den Stamm EG11768 produzierten Hybrid-Kristallproteins, welches durch SEQ ID NO: 33 codiert wird.
SEQ ID NO: 35 ist die 3'-Austauschstelle für pEG1074, pEG1076, pEG1077 und pEG381.
5.0 Beschreibung von veranschaulichenden Ausführungsformen
5.1 Verfahren für die Züchtung von B. thuringiensis zur Herstellung von Cry-Proteinen
Die hierin beschriebenen B. thuringiensis-Stämme können mittels bekannten üblichen Medien und Fermentationstechniken gezüchtet werden. Nach Beendigung des Fermentationszyklus können die Bakterien geerntet werden, indem zuerst die Sporen und Kristalle von B. thuringiensis aus der Fermentationsbrühe durch Mittel, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, abgetrennt werden. Die gewonnenen Sporen und Kristalle von B. thuringiensis können durch die Zugabe von Tensiden, Dispergiermitteln, inerten Trägern und anderen Komponenten, um die Handhabung und Anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern, zu einem benetzbaren Pulver, einem flüssigen Konzentrat, Granulaten oder anderen Formulierungen zubereitet werden. Die Formulierungs- und Anwendungsverfahren sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und werden zusammen mit handelsüblichen Stämmen von B. thuringiensis (HD-1), welche gegenüber Lepidoptera-Insekten, z. B. Raupen, aktiv sind, angewendet.
5.2 Rekombinante Wirtszellen zur Expression von Cry-Genen
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können in eine große Vielzahl von mikrobiellen Wirten eingeschleust werden. Die Expression des Toxingens resultiert, direkt oder indirekt, in der intrazellulären Herstellung und Beibehaltung des Pestizids. Mit geeigneten Wirten, z. B. Pseudomonas, können die Mikroben zu den Stellen, wo sie sich in Lepidoptera-Insekten vermehren oder durch die Insekten aufgenommen werden, gebracht werden. Das Ergebnis ist eine Bekämpfung der unerwünschten Insekten. Alternativ kann die Mikrobe, welche das Toxingen trägt, unter Bedingungen behandelt werden, welche die Aktivität des in der Zelle produzierten Toxins verlängern. Die behandelte Zelle kann dann in der Umgebung eines oder mehrerer Zielschädlinge ausgebracht werden. Das erhaltene Produkt behält die Toxizität des B. thuringiensis-Toxins bei.
Geeignete Wirtszellen, wobei die das Pestizid enthaltenden Zellen behandelt werden, um die Aktivität des Toxins in der Zelle zu verlängern, wenn die behandelte Zelle anschließend in die Umgebung eines oder mehrerer Zielschädlinge ausgebracht wird, können entweder Prokaryonten oder Eukaryonten einschließen, die normalerweise auf solche Zellen begrenzt sind, welche keine Substanzen produzieren, die für höhere Organismen wie Säuger toxisch sind. Jedoch können Organismen, welche Substanzen produzieren, die für höhere Organismen toxisch sind, verwendet werden, wenn das Toxin instabil ist oder die Einsatzmenge ausreichend gering ist, um jede Möglichkeit einer Toxizität für einen Säugerwirt zu vermeiden. Als Wirte sind die Prokaryonten und die niederen Eukaryonten, wie Pilze, von besonderem Interesse. Veranschaulichende Prokaryonten, sowohl Gram-negative als auch Gram-positive, schließen Enterobacteriaceae wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae wie Rhizobium; Spirillaceae wie Photobakterien, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae wie Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomycetales und Nitrobacteracea ein. Unter den Eukaryonten befinden sich Pilze wie Phycomycetes und Ascomycetes, welche Hefen wie Saccharomyces und Schizosaccharomyces einschließen; und Basidiomycetes-Hefen wie Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dergleichen.
Eigenschaften von besonderem Interesse bei der Auswahl einer Wirtszelle für Herstellungszwecke schließen die Einfachheit der Einschleusung des B. thuringiensis-Gens in den Wirt, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Expressionseffizienz, die Stabilität des Pestizids in dem Wirt und das Vorhandensein von zusätzlichen genetischen Eigenschaften ein. Eigenschaften von Interesse zur Verwendung als eine Pestizidmikrokapsel schließen schützende Eigenschaften für das Pestizid, wie dicke Zellwände, eine Pigmentation und die intrazelluläre Verpackung oder Bildung von Einschlußkörpern; eine Blattaffinität; eine fehlende Toxizität gegenüber Säugern; ein Anreiz für die Aufnahme durch Schädlinge; eine einfache Abtötung und Fixierung ohne eine Schädigung des Toxins; und dergleichen ein. Andere Gesichtspunkte schließen die Einfachheit der Formulierung und Handhabung, die Wirtschaftlichkeit, die Lagerfähigkeit und dergleichen ein.
Wirtsorganismen von besonderem Interesse schließen Hefen wie Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. und Sporobolomyces sp.; phylloplane Organismen wie Pseudomonas sp., Erwinia sp. und Flavobacterium sp.; oder andere solche Organismen wie Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp., Streptomyces sp. und der gleichen ein. Spezifische Organismen schließen Pseudomonas aeruginosa. P. fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, B. thuringiensis, B. subtilis, E. coli, Streptomyces lividans und dergleichen ein.
Die Behandlung der Mikrobenzelle, z. B. einer Mikrobe, enthaltend das B. thuringiensis-Toxingen, kann durch chemische oder physikalische Mittel oder durch eine Kombination von chemischen und/oder physikalischen Mitteln erfolgen, so lange die Technik weder die Eigenschaften des Toxins nachteilig beeinflußt, noch die Fähigkeit der Zellen im Hinblick auf den Schutz des Toxins vermindert. Beispiele für chemische Reagenzien sind Halogenierungsmittel, besonders Halogene der Ordnungszahl 17–80. Insbesondere kann Iod unter milden Bedingungen und für einen ausreichenden Zeitraum, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen, verwendet werden. Andere geeignete Techniken schließen die Behandlung mit Aldehyden wie Formaldehyd und Glutaraldehyd; anti-infektiösen Mitteln wie Zephiranchlorid und Cetylpyridiniumchlorid; Alkoholen wie Isopropyl und Ethanol; verschiedenen histologischen Fixierungsmitteln wie Lugolsche Iodlösung, Bouinsche Fixierungslösung und Hellysche Fixierungslösung (vg. z. B. Humason, 1967); oder eine Kombination von physikalischen (Hitze) und chemischen Mitteln, welche die Aktivität des in der Zelle produzierten Toxins erhalten und verlängern, wenn die Zelle an einen geeigneten Wirt verabreicht wird, ein. Beispiele für physikalische Mittel sind eine Bestrahlung mit kurzen Wellenlängen, wie γ-Strahlung und Röntgenstrahlung, Einfrieren, UV-Bestrahlung, Gefriertrocknung und dergleichen. Die verwendeten Zellen sind üblicherweise intakt und liegen bei der Behandlung im wesentlichen in der proliferativen Form vor, anstatt in einer Sporenform, obwohl in einigen Fällen Sporen verwendet werden können.
Wenn das B. thuringiensis-Toxingen mit Hilfe eines geeigneten Vektors in einen mikrobiellen Wirt eingeschleust wird und der Wirt in einem lebenden Stadium in die Umwelt ausgebracht wird, ist es wesentlich, daß bestimmte Wirtsmikroben verwendet werden. Es werden Mikroorganismuswirte ausgewählt, die bekanntermaßen die "Phytosphäre" (phylloplan, phyllosphär, rhizosphär und/oder rhizoplan) einer oder mehrerer Nutzpflanzen von Interesse besiedeln. Diese Mikroorganismen werden so gewählt, daß sie in der Lage sind, in der besonderen Umgebung (Nutzpflanze oder andere Insektenhabitate) mit den Wildtyp-Mikroorganismen zu konkurrieren, für eine stabile Beibehaltung und Expression des Gens, welches das Polypeptid-Pestizid codiert, zu sorgen und wünschenswerterweise für einen besseren Schutz des Pestizids vor einem umweltbedingten Abbau und einer umweltbedingten Inaktivierung zu sorgen.
Eine große Zahl von Mikroorganismen ist bekannt, welche die Blattebene (die Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder die Rhizosphäre (den Boden, welcher die Pflanzenwurzeln umgibt) einer großen Vielzahl von wichtigen Nutzpflanzen bewohnt. Diese Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Pilze ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z. B. der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes; Pilze, besonders Hefen, z. B. der Gattung Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche phytosphären Bakterienarten wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus und Azotobacter vinlandii; sowie phytosphäre Hefearten wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pllulans.
5.3 Definitionen
Die folgenden Worte und Ausdrücke haben die nachstehend angegebenen Bedeutungen.
Breites Spektrum: verweist auf einen großen Bereich von Insektenarten. Insektizidaktivität mit breitem Spektrum: Toxizität gegenüber einem großen Bereich von Insektenarten.
Expression: Die Kombination von intrazellulären Prozessen einschließlich Transkription und Translation, welche ein codierendes DNA-Molekül wie ein Strukturgen durchläuft, um ein Polypeptid herzustellen.
Insektizidaktivität: Toxizität gegenüber Insekten.
Insektizidspezifität: Die durch ein Kristallprotein gezeigte Toxizität gegenüber mehreren Insektenarten.
Spezifität innerhalb einer Ordnung: Die Toxizität eines bestimmten Kristallproteins gegenüber Insektenarten innerhalb einer Insektenordnung (z. B. der Ordnung Lepidoptera).
Spezifität zwischen Ordnungen: Die Toxizität eines bestimmten Kristallproteins gegenüber Insektenarten aus verschiedenen Ordnungen (z. B. der Ordnungen Lepidoptera und Diptera).
LC₅₀: Die letale Konzentration eines Kristallproteins, welche eine 50%-ige Mortalität der behandelten Insekten hervorruft.
LC₉₅: Die letale Konzentration eines Kristallproteins, welche eine 95%-ige Mortalität der behandelten Insekten hervorruft.
Promotor: Eine Erkennungsstelle in einer DNA-Sequenz oder einer Gruppe von DNA-Sequenzen, welche ein Expressionskontrollelement für ein Strukturgen vorsieht und an welche eine RNA-Polymerase spezifisch bindet und die RNA-Synthese (Transkription) des Gens einleitet.
Regeneration: Verfahren zur Züchtung einer Pflanze aus einer Pflanzenzelle (z. B. einem Pflanzenprotoplasten oder -explantat).
Strukturgen: Ein Gen, welche exprimiert wird, um ein Polypeptid herzustellen.
Transformation: Ein Verfahren zur Einschleusung einer exogenen DNA-Sequenz (z. B. eines Vektors oder eines rekombinanten DNA-Moleküls) in eine Zelle oder einen Protoplasten, worin die exogene DNA in ein Chromosom eingebaut wird oder zu einer autonomen Replikation fähig ist.
Transformierte Zelle: Eine Zelle, deren DNA durch die Einschleusung eines exogenen DNA-Moleküls in die Zelle verändert worden ist.
Transgen: Ein exogenes Gen, welches, wenn in das Genom einer Wirtszelle eingebaut durch ein Verfahren wie Transformation, Elektroporation, Teilchenbeschuß und dergleichen, durch die Wirtszelle exprimiert und in das Genom der Zellen integriert wird, so daß das Merkmal oder die Merkmale, welche durch die Expression des Transgens hervorgerufen werden, an die Nachkommen der transformierten Zelle vererbt werden.
Transgene Zelle: Irgendeine Zelle, abgeleitet oder regeneriert aus einer transformierten Zelle oder abgeleitet aus einer transgenen Zelle. Beispielhafte transgene Zellen schließen Pflanzenkallusse, abgeleitet aus einer transformierten Pflanzenzelle, und besonders Zellen wie Blatt-, Wurzel- oder Stammzellen, z. B. somatische Zellen, oder reproduktive Zellen (Keimzellen), erhalten aus einer transgenen Pflanze, ein.
Transgene Pflanze: Eine Pflanze oder ein Nachkomme hiervon, abgeleitet aus einer transformierten Pflanzenzelle oder einem Protoplasten, wobei die Pflanzen-DNA ein eingeschleustes exogenes DNA-Molekül enthält, welches ursprünglich nicht in einer nativen, nicht-transgenen Pflanze derselben Art vorhanden ist. Die Begriffe "transgene Pflanze" und "transformierte Pflanze" sind auf dem Fachgebiet zuweilen als synonyme Begriffe verwendet worden, um eine Pflanze zu definieren, deren DNA ein exogenes DNA-Molekül enthält. Jedoch nimmt man an, daß es wissenschaftlich korrekter ist, auf eine regenerierte Pflanze oder einen Kallus, welche(r) aus einer transformierten Pflanzenzelle oder einem Protoplasten erhalten wurde, als eine transgene Pflanze zu verweisen, und dieser Wortgebrauch wird hierin befolgt.
Vektor: Ein DNA-Molekül, welches zur Replikation in einer Wirtszelle fähig ist und/oder welches mit einem anderen DNA-Segment funktionell verbunden werden kann, um die Replikation das verknüpften Segments zu bewirken. Ein Plasmid ist ein beispielhafter Vektor.
5.4 Sonden und Primer
Gemäß einem anderen Aspekt ermöglicht die durch die Erfindung bereitgestellte DNA-Sequenzinformation die Herstellung von relativ kurzen DNA (oder RNA)-Sequenzen, welche die Fähigkeit besitzen, mit Gensequenzen der ausgewählten hierin offenbarten Polynucleotide spezifisch zu hybridisieren. Gemäß diesen Aspekten werden Nucleinsäuresonden mit einer geeigneten Länge unter Berücksichtigung einer ausgewählten Kristallprotein-Gensequenz, z. B. einer Sequenz wie die in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 gezeigten, hergestellt. Die Fähigkeit solcher Nucleinsäuresonden, mit einer Gensequenz, welche ein Kristall protein codiert, spezifisch zu hybridisieren, macht sie für eine Vielzahl von Ausführungsformen besonders nützlich. Besonders bedeutsam ist, daß die Sonden in einer Vielzahl von Assays zum Nachweis der Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer bestimmten Probe verwendet werden können.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Verwendung von Oligonucleotid primern vorteilhaft. Die Sequenz von solchen Primern wird unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynucleotids zur Verwendung beim Nachweis, bei der Amplifikation oder Mutation eines definierten Segments eines Kristallprotein-Gens aus B. thuringiensis mittels der PCR^TM-Technologie entworfen. Segmente von verwandten Kristallprotein-Genen aus anderen Spezies können auch mittels PCR^TM unter Verwendung solcher Primer amplifiziert werden.
Um bestimmte der erfindungsgemäßen Vorteile bereitzustellen, schließt eine bevorzugte Nucleinsäuresequenz, welche für Hybridisierungsstudien oder -tests verwendet wird, Sequenzen ein, welche zu mindestens einem Bereich von etwa 14 bis 30 Nucleotiden einer Sequenz, welche ein Kristallprotein codiert, wie die in SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 gezeigten, komplementär sind. Eine Länge von mindestens 14 Nucleotiden trägt dazu bei, sicherzustellen, daß das Fragment eine ausreichende Länge besitzt, um ein Doppelstrangmolekül zu bilden, welches sowohl stabil aus auch selektiv ist. Moleküle mit komplementären Sequenzen über Bereiche mit einer Länge von mehr als 14 Basen werden im allgemeinen trotzdem bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und auf diese Weise die Qualität und die Ordnung der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Im allgemeinen wird bevorzugt, Nucleinsäuremoleküle zu konstruieren, die Gen-komplementäre Bereiche von 14 bis 20 Nucleotiden oder auch mehr, falls gewünscht, aufweisen. Solche Fragmente können zum Beispiel durch direkte Synthese des Fragments durch chemische Mittel, durch Anwendung einer Nucleinsäurereproduktionstechnik, wie der PCR^TM-Technik von US-Patent 4,683,195 und 4,683,202, oder durch das Ausschneiden ausgewählter DNA-Fragmente aus rekombinanten Plasmiden, enthaltend geeignete Insertionen und geeignete Restriktionsstellen, ohne weiteres hergestellt werden.
5.5 Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung schließt einen Expressionsvektor ein, der ein erfindungsgemäßes Polynucleotid umfaßt. So ist in einer Ausführungsform ein Expressionsvektor ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, umfassend einen Promotor, welcher funktionell verbunden ist mit einer codierenden Region, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, wobei die codierende Region mit einer Transkriptionsterminationsregion funktionell verbunden ist, wodurch der Promotor die Transkription der codierenden Region steuert.
So wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "funktionell verbunden", daß ein Promotor mit einer codierenden Region in einer solchen Weise verknüpft ist, daß die Transkription der codierenden Region durch den Promotor kontrolliert und reguliert wird. Mittel zur funktionellen Verbindung eines Promotors mit einer codierenden Region sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt.
Promotoren, welche in Bakterien wirksam sind, sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Beispielhafte und bevorzugte Promotoren für die Bacillus-Kristallproteine schließen die sigA-, sigE- und sigK-Genpromotoren ein. Alternativ können die nativen, durch Mutagenese veränderten oder rekombinanten Promotoren eines Gens, welches ein Kristallprotein codiert, selbst verwendet werden.
Wenn ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor zur Transformation einer Pflanze verwendet werden soll, wird ein Promotor gewählt, welcher die Fähigkeit besitzt, die Expression in Pflanzen zu steuern. Promotoren, welche in Pflanzen wirksam sind, sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Bei der Expression des Polypeptids in Pflanzen sind Promotoren nützlich, welche induzierbar, viral, synthetisch, konstitutiv, wie beschrieben (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985), und zeitlich reguliert, räumlich reguliert und räumlich-zeitlich reguliert (Chau et al., 1989) sind.
Ein Promotor wird auch im Hinblick auf seine Fähigkeit ausgewählt, die Transkriptionsaktivität für die codierende Region der transformierten Pflanzenzelle oder der transgenen Pflanze zu regulieren. Strukturgene können durch eine Vielzahl von Promotoren in Pflanzengeweben gesteuert werden. Promotoren können nahezu konstitutiv sein, wie der CaMV35S-Promotor, oder gewebespezifische oder entwicklungsspezifische Promotoren, welche zweikeimblättrige Pflanzen oder einkeimblättrige Pflanzen beeinflussen.
Wenn der Promotor ein nahezu konstitutiver Promotor wie CaMV35S ist, wird eine Erhöhung der Polypeptidexpression in einer Vielzahl von transformierten Pflanzengeweben nachgewiesen (z. B. Kallus, Blatt, Samen und Wurzel). Alternativ können die Effekte einer Transformation unter Verwendung von integrierenden Pflanzenvektoren, welche einen gewebespezifischen Promotor enthalten, zu spezifischen Pflanzengeweben geleitet werden.
Ein beispielhafter gewebespezifischer Promotor ist der Lectin-Promotor, welcher für Samengewebe spezifisch ist. Das Lectinprotein in Sojabohnensamen wird durch ein einziges Gen (LeI) codiert, welches nur während der Samenreifung exprimiert wird und etwa 2 bis etwa 5% der Gesamt-mRNA des Samens ausmacht. Das Lectin-Gen und der samenspezifische Promotor sind vollständig charakterisiert und zur Steuerung der samenspezifischen Expression in transgenen Tabakpflanzen verwendet worden (Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al., 1990).
Ein Expressionsvektor, enthaltend eine codierende Region, welche ein Polypeptid von Interesse codiert, wird derart konstruiert, daß er sich unter der Kontrolle des Lectin-Promotors befindet, und dieser Vektor wird zum Beispiel durch ein Protoplasten-Transformationsverfahren (Dhir et al., 1991) in Pflanzen eingeschleust. Die Expression des Polypeptids wird spezifisch auf die Samen der transgenen Pflanze ausgerichtet.
Eine transgene Pflanze der vorliegenden Pflanze, welche aus einer Pflanzenzelle erzeugt wurde, die mit einem gewebespezifischen Promotor transformiert ist, kann mit einer zweiten transgene Pflanze, welche sich aus einer Pflanzenzelle entwickelt hat, die mit einem anderen gewebespezifischen Promotor transformiert wurde, gekreuzt werden, um eine hybride transgene Pflanze zu erzeugen, welche die Effekte einer Transformation in mehr als einem spezifischen Gewebe zeigt.
Beispielhafte gewebespezifische Promotoren sind Mais-Sucrosesynthetase I (Yang et al., 1990), Mais-Alkoholdehydrogenase I (Vogel et al., 1989), Mais-Leichternte-Komplex (Simpson, 1986), Mais-Hitzeschockprotein (Odell et al., 1985), die kleine Untereinheit der RuBP-Carboxylase aus der Erbse (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), Ti-Plasmid-Mannopinsynthase (Langridge et al., 1989), Ti-Plasmid-Nopalinsynthase (Langridge et al., 1989), Petunien-Chalconisomerase (Van Tunen et al., 1988), das glycinreiche Bohnen-Protein I (Keller et al., 1989), das CaMV35S-Transkript (Odell et al., 1985) und Kartoffel-Patatin (Wenzler et al., 1989). Bevorzugte Promotoren sind der Blumenkohlmosaikvirus (CaMV35S)-Promotor und die kleine Untereinheit S-E9 des RuBP-Carboxylase-Promotors.
Die Wahl eines Expressionsvektors und schließlich die funktionelle Verbindung einer Region, welche ein Polypeptid codiert, mit einem bestimmten Promotor hängt direkt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, z. B. von dem Bereich und der zeitlichen Abstimmung der Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle. Dies sind hinreichend bekannte Einschränkungen, welche mit dem Fachgebiet der Konstruktion von rekombinanten DNA-Molekülen verbunden sind. Jedoch ist ein bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlicher Vektor in der Lage, die Expression der Region, welche ein Polypeptid codiert, mit welcher er funktionell verbunden ist, zu steuern.
Typische Vektoren, welche zur Expression von Genen in höheren Pflanzen nützlich sind, sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und schließen Vektoren ein, welche aus dem beschriebenen tumorinduzierenden (Ti) Plasmid von Agrobacterium tumefaciens (Rogers et al., 1987) abgeleitet sind. Jedoch ist bekannt, daß mehrere andere integrierende Pflanzenvektorsysteme in Pflanzen wirksam sind, einschließlich der beschriebene pCaMVCN-Transferkontrollvektor (Fromm et al., 1985). pCaMVCN (erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ) schließt den Blumenkohlmosaikvirus-CaMV35S-Promotor ein.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt der zur Expression des Polypeptids verwendete Vektor einen Selektionsmarker ein, welcher in einer Pflanzenzelle wirksam ist, vorzugsweise einen Arzneistoffresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Arzneistoffresistenz-Marker ist das Gen, dessen Expression eine Kanamycin-Resistenz zur Folge hat; d. h. das beschriebene (Rogers et al., 1988) chimäre Gen, welches den Nopalinsynthase- Promotor, die Tn5-Neomycin-Phosphotransferase II (nptII) und die 3'-nichttranslatierte Region der Nopalinsynthase enthält.
Die RNA-Polymerase transkribiert eine codierende DNA-Sequenz über eine Stelle, wo eine Polyadenylierung auftritt. Typischerweise dienen DNA-Sequenzen, welche einige Hundert Basenpaare stromabwärts der Polyadenylierungsstelle angeordnet sind, dazu, die Transkription zu terminieren. Solche DNA-Sequenzen werden hierin als Transkriptionsterminationsregionen bezeichnet. Solche Regionen sind für eine wirksame Polyadenylierung einer transkribierten Boten-RNA (mRNA) erforderlich.
Mittel zur Herstellung von Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Expressionsvektoren (Transformationsvektoren), welche zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, und Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren sind in den US-Patenten 4,971,908, 4,940,835, 4,769,061 und 4,757,011 beschrieben. Solche Vektoren können so modifiziert werden, daß sie eine erfindungsgemäße codierende Sequenz einschließen.
Eine Vielzahl von Verfahren ist entwickelt worden, um eine DNA mit Vektoren über komplementäre kohäsive Enden oder glatte Enden funktionell zu verbinden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymerbereiche an das zu inserierende DNA-Segment und an die Vektor-DNA angehängt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen verbunden, um rekombinante DNA-Moleküle zu bilden.
Eine codierende Region, welche ein Polypeptid codiert, das die Fähigkeit besitzt, eine Insektizidaktivität auf eine Zelle zu übertragen, ist vorzugsweise ein chimäres Gen, welches ein B. thuringiensis-Kristallprotein codiert. In bevorzugten Ausführungsformen weist ein solches Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34, oder eines funktionellen Gegenstücks einer oder mehrerer dieser Sequenzen auf. Im Einklang mit solchen Ausführungsformen wird eine codierende Region, umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33, ebenfalls bevorzugt.
5.6 Transformierte oder transgene Pflanzenzellen
Ein Bakterium, eine Hefezelle oder eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze, transformiert mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, ist ebenfalls eingeschlossen. Ein(e) transgene(s) Bakterium, Hefezelle, Pflanzenzelle oder Pflanze, abgeleitet aus einer solchen transformierten oder transgenen Zelle ist auch eingeschlossen. Typischerweise ähneln die Mittel zur Transformation solchen hinreichend bekannten Mitteln, welche verwendet werden, um andere Bakterien oder Hefen wie E. coli oder S. cerevisiae zu transformieren.
Verfahren zur DNA-Transformation von Pflanzenzellen schließen die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation, die Protoplastentransformation, den Gen transfer in Pollen, die Injektion in Fortpflanzungsorgane, die Injektion in unreife Embryonen und den Teilchenbeschuß ein. Jedes dieser Verfahren hat deutliche Vorteile und Nachteile. Folglich muß ein bestimmtes Verfahren zur Einschleusung von Genen in eine bestimmte Pflanzenart nicht notwendigerweise für eine andere Pflanzenart das wirksamste Verfahren sein, aber es ist hinreichend bekannt, welche Verfahren für eine bestimmte Pflanzenart nützlich sind.
Es gibt viele Verfahren zur Einschleusung von transformierenden DNA-Segmenten in Zellen, aber nicht alle sind zur Übertragung von DNA in Pflanzenzellen geeignet. Man nimmt an, daß geeignete Verfahren praktisch jedes Verfahren einschließen, durch das eine DNA in eine Zelle eingeschleust werden kann, wie durch Infektion mit A. tumefaciens und verwandten Agrobacterium-Spezies, durch direkte Übertragung von DNA, wie zum Beispiel durch eine PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten (Omirulleh et al., 1993), durch Trocknung/Inhibition-vermittelte DNA-Aufnahme, durch Elektroporation, durch Rühren mit Siliciumcarbidfasern, durch Beschleunigung von DNA-beschichteten Teilchen, etc. In bestimmten Ausführungsformen werden Beschleunigungsverfahren bevorzugt und schließen zum Beispiel den Mikroprojektilbeschuß und dergleichen ein.
Die Technik zur Einschleusung von DNA in Zellen ist den Fachleuten hinreichend bekannt. Vier allgemeine Verfahren zur Übertragung eines Gens in Zellen sind beschrieben worden: (1) chemische Verfahren (Graham und van der Eb, 1973); (2) physikalische Verfahren wie die Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Wong und Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) und die Genkanone (Johnston und Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis und Anderson, 1988a; 1988b); und (4) Rezeptor-vermittelte Mechanismen (Curiel et al., 1991, 1992; Wagner et al., 1992).
5.6.1 Elektroporation
Die Anwendung von kurzen Hochspannungsimpulsen auf eine Vielzahl von tierischen und pflanzlichen Zellen resultiert in der Bildung von Poren mit einer Größe im Nanometerbereich in der Plasmamembran. Die DNA wird entweder über diese Poren oder als eine Folge der Umverteilung von Membrankomponenten, welche den Verschluß der Poren begleitet, direkt in das Zellcytoplasma aufgenommen. Die Elektroporation ist außerordentlich wirksam und kann sowohl zur vorübergehenden Expression von clonierten Genen als auch zur Etablierung von Zelllinien, welche integrierte Kopien des Gens von Interesse tragen, verwendet werden. Die Elektroporation bringt im Gegensatz zur Calciumphosphat-vermittelten Transfektion und Protoplastenfusion häufig Zelllinien hervor, die eine integrierte Kopie oder meistens einige integrierte Kopien der fremden DNA tragen.
Die Einschleusung von DNA mit Hilfe der Elektroporation ist den Fachleuten hinreichend bekannt. Bei diesem Verfahren werden bestimmte die Zellwand abbauende Enzyme, wie Pektin abbauende Enzyme, verwendet, um die Ziel-Empfängerzellen für eine Transformation durch Elektroporation empfindlicher zu machen als unbehandelte Zellen.
Alternativ werden Empfängerzellen durch eine mechanische Verletzung für eine Transformation empfindlicher gemacht. Um eine Transformation mittels Elektroporation zu bewirken, kann man entweder zerreibbare Gewebe wie eine Suspensionskultur von Zellen oder einen embryonalen Kallus verwenden, oder man kann alternativ unreife Embryonen oder andere organisierte Gewebe direkt transformieren. Die Zellwände der ausgewählten Zellen würden teilweise abgebaut, indem man sie Pektin abbauenden Enzymen (Pektolyasen) oder einer mechanischen Verletzung in einer kontrollierten Art und Weise ausgesetzt. Solche Zellen wären dann für einen DNA-Transfer durch Elektroporation empfänglich, welcher in diesem Stadium ausgeführt werden kann, und die transformierten Zellen werden dann durch ein geeignetes Selektions- oder Screeningprotokoll, abhängig von der Art der neu eingebauten DNA, identifiziert.
5.6.2 Mikroprojektilbeschuß
Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zur Übertragung von transformierenden DNA-Segmenten in Pflanzenzellen ist der Mikroprojektilbeschuß. Bei diesem Verfahren können Teilchen mit Nucleinsäuren beschichtet und durch eine vorwärtstreibende Kraft in Zellen übertragen werden. Beispielhafte Teilchen schließen solche ein, welche aus Wolfram, Gold, Platin und dergleichen bestehen.
Ein Vorteil des Mikroprojektilbeschusses, zusätzlich dazu, daß er ein wirksames Mittel für eine reproduzierbare, stabile Transformation von einkeimblättrigen Pflanzen ist, ist, daß weder die Isolierung von Protoplasten (Cristou et al., 1988), noch eine Empfindlichkeit gegen eine Agrobacterium-Infektion erforderlich sind. Ein veranschaulichende Ausführungsform eines Verfahrens zur Übertragung von DNA in Maiszellen mittels Beschleunigung ist eine Biolistics Particle Delivery System-Vorrichtung, welche verwendet werden kann, um DNA-beschichtete Teilchen oder Zellen durch einen Schirm, wie einen Edelstahlschirm oder Nytex-Schirm, auf eine Filteroberfläche, bedeckt mit in Suspension gezüchteten Maiszellen, hin zu bewegen. Der Schirm zerstreut die Teilchen, so daß sie nicht in großen Aggregaten in die Empfängerzellen übertragen werden. Man nimmt an, daß ein Schirm, welcher zwischen der Projektilapparatur und den zu beschießenden Zellen angeordnet ist, die Größe von Projektilaggregaten verringert und zu einer höheren Transformationshäufigkeit durch die Verringerung einer durch die Empfängerzellen erlittenen Schädigung durch Projektile, welche zu groß sind, beiträgt.
Für den Beschuß werden Zellen in Suspension vorzugsweise auf Filtern oder einem festen Kulturmedium konzentriert. Alternativ können unreife Embryonen oder andere Zielzellen auf einem festen Kulturmedium angeordnet werden. Die zu beschießenden Zellen werden in einem geeigneten Abstand unterhalb der Makroprojektil-Abbremsplatte positioniert. Falls gewünscht, werden auch ein oder mehrere Schirme zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu beschießenden Zellen positioniert. Durch die Anwendung der hierin dargelegten Techniken kann man bis zu 1.000 oder mehr Loci von Zellen, welche vorübergehend ein Markergen exprimieren, erhalten. Die Anzahl der Zellen in einem Locus, welche das exogene Genprodukt 48 Stunden nach dem Beschuß exprimieren, reicht oft von 1 bis 10 und durchschnittlich 1 bis 3.
Bei der Beschußtransformation kann man die Kulturbedingungen vor dem Beschuß und die Beschußparameter optimieren, um die maximale Anzahl an stabilen Transformanten zur erhalten. Sowohl die physikalischen als auch die biologischen Parameter für den Beschuß sind bei dieser Technik wichtig. Physikalische Faktoren sind solche, welche die Manipulation des DNA/Mikroprojektil-Präzipitats beinhalten, oder solche, welche den Flug und die Geschwindigkeit von entweder den Makro- oder Mikroprojektilen beeinflussen. Biologische Faktoren schließen alle Schritte ein, welche mit der Manipulation von Zellen vor und unmittelbar nach dem Beschuß verbunden sind, die osmotische Einstellung von Zielzellen, um dazu beizutragen, das mit dem Beschuß verbundene Trauma zu lindern, und auch die Art der transformierenden DNA, wie eine linearisierte DNA oder intakte, stark verdrillte Plasmide. Man nimmt an, daß Manipulationen vor dem Beschuß für eine erfolgreiche Transformation von unreifen Embryonen besonders wichtig sind.
Demgemäß wird erwartet, daß es wünschenswert sein kann, verschiedene der Beschußparameter in Kleinversuchen anzupassen, um die Bedingungen zu optimieren. Es kann besonders wünschenswert sein, physikalische Parameter wie Spaltabstand, Fluglänge, Gewebeabstand und Heliumdruck einzustellen. Man kann auch die Traumareduktionsfaktoren (TRFs) durch die Modifizierung von Bedingungen, welche den physiologischen Zustand der Empfängerzellen beeinflussen und welche daher die Transformations- und Integrationseffizienzen beeinflussen können, minimieren. Zum Beispiel kann der osmotische Zustand, die Gewebehydratation und das Subkulturstadium oder der Zellzyklus der Empfängerzellen für eine optimale Transformation angepaßt werden. Die Ausführung von anderen routinemäßigen Anpassungen ist für Fachleute im Hinblick auf die vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
Die Verfahren einer Teilchen-vermittelten Transformation sind den Fachleuten hinreichend bekannt. US-Patent 5,015,580 beschreibt die Transformation von Sojabohnen mittels einer solchen Technik.
5.6.3 Agrobacterium-vermittelter Transfer
Der Agrobacterium-vermittelter Transfer ist ein häufig verwendbares System für die Einschleusung von Genen in Pflanzenzellen, da die DNA in ganze Pflanzengewebe eingeschleust werden kann, wodurch die Notwendigkeit für die Regeneration einer intakten Pflanze aus einem Protoplasten umgangen wird. Die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Pflanzenintegrationsvektoren, um eine DNA in Pflanzenzellen einzuschleusen, ist auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Vgl. zum Beispiel die beschriebenen Verfahren (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). Die gentechnische Veränderung von Baumwollpflanzen mittels des Agrobacterium-vermittelten Transfers ist in US-Patent 5,004,862 beschrieben, während die Transformation von Salatpflanzen in US-Patent 5,349,124 beschrieben ist. Ferner ist die Integration der Ti-DNA ein relativ genauer Prozeß, welcher wenige Umlagerungen zur Folge hat. Die zu übertragende DNA-Region ist durch die Grenzsequenzen definiert, und üblicherweise wird eine dazwischenliegende DNA in das Pflanzengenom inseriert, wie beschrieben wurde (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).
Moderne Agrobacterium-Transformationsvektoren sind zur Replikation in E. coli sowie Agrobacterium fähig, was geeignete Manipulationen ermöglicht, wie beschrieben wurde (Klee et al., 1985). Außerdem haben jüngste technische Fortschritte bezüglich von Vektoren für den Agrobacterium-vermittelten Gentransfer die Anordnung von Genen und Restriktionsstellen in den Vektoren verbessert, um die Konstruktion von Vektoren zu erleichtern, welche in der Lage sind, verschiedene Gene, welche ein Polypeptid codieren, zu exprimieren. Die beschriebenen Vektoren (Rogers et al., 1987) besitzen geeignete Multilinkerregionen, welche von einem Promotor und einer Polyadenylierungsstelle für die direkte Expression von inserierten Genen, welche ein Polypeptid codieren, umgeben sind, und sind für die vorliegenden Zwecke geeignet. Zusätzlich können Agrobacterium-Zellen, enthaltend sowohl "bewaffnete" als auch "unbewaffnete" Ti-Gene, für die Transformation verwendet werden. Dieses Verfahren ist bei solchen Pflanzenarten, bei denen eine Agrobacterium-vermittelte Transformation wirksam ist, wegen der günstigen und definierten Art des Gentransfers das Verfahren der Wahl.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Blattscheiben und anderen Geweben wie Kotyledonen und Hypokotyledonen scheint auf Pflanzen begrenzt zu sein, welche Agrobacterium natürlicherweise infiziert. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist bei zweikeimblättrigen Pflanzen am wirksamsten. Wenige einkeimblättrige Pflanzen scheinen natürliche Wirte für Agrobacterium zu sein, obwohl transgene Pflanzen in Spargel unter Verwendung von Agrobacterium-Vektoren hergestellt worden sind, wie beschrieben wurde (Bytebier et al., 1987). Daher müssen kommerziell wichtige Getreidepflanzen wie Reis, Mais und Weizen üblicherweise durch andere Verfahren transformiert werden. Jedoch, wie oben erwähnt, kann die Transformation von Spargel auch unter Verwendung von Agrobacterium erreicht werden (vgl. z. B. Bytebier et al., 1987).
Eine transgene Pflanze, welche durch Agrobacterium-Transformationsverfahren erzeugt wurde, enthält typischerweise ein einziges Gen auf einem Chromosom. Solche transgenen Pflanzen können im Hinblick auf das hinzugefügte Gen als heterozygot bezeichnet werden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Verwendung des Wortes "heterozygot" üblicherweise das Vorhandensein eines komplementären Gens an dem gleichen Locus des zweiten Chromosoms eines Chromosomenpaares voraussetzt und kein solches Gen in einer Pflanze, welche ein hinzugefügtes Gen enthält, vorhanden ist, wie in diesem Fall, nimmt man an, daß ein exaktere Bezeichnung für eine solche Pflanze eine "unabhängige Segregante" ist, da das hinzugefügte exogene Gen während der Mitose und Meiose unabhängig segregiert.
Mehr bevorzugt wird eine transgene Pflanze, welche im Hinblick auf das hinzugefügte Strukturgen homozygot ist; d. h. eine transgene Pflanze, welche zwei hinzugefügte Gene enthält, und zwar ein Gen an dem gleichen Locus auf jedem Chromosom eines Chromosomenpaares. Eine homozygote transgene Pflanze kann durch sexuelle Paarung (Selbstbefruchtung) einer unabhängigen segreganten transgenen Pflanze, welche ein einziges hinzugefügtes Gen enthält, Keimung von einigen der produzierten Samen und Untersuchen der erhaltenen erzeugten Pflanzen auf eine erhöhte Carboxylaseaktivität im Verhältnis zu einer Kontrolle (nativ, nicht transgen) oder einer unabhängigen segreganten transgenen Pflanze erhalten werden.
Es ist selbstverständlich, daß auch zwei verschiedene transgene Pflanzen gepaart werden können, um Nachkommen hervorzubringen, welche zwei unabhängig segregierende hinzugefügte exogene Gene enthalten. Die Selbstbefruchtung von geeigneten Nachkommen kann Pflanzen hervorzubringen, welche im Hinblick auf beide hinzugefügten exogenen Gene, welche ein Polypeptid von Interesse codieren, homozygot sind. Die Rückkreuzung mit einer Elternpflanze und die Auskreuzung mit einer nicht transgenen Pflanze sind auch eingeschlossen.
Die Transformation von Pflanzenprotoplasten kann unter Anwendung von Verfahren auf der Basis einer Calciumphosphat-Präzipitation, Polyethylenglykol-Behandlung, Elektroporation und Kombinationen dieser Behandlungen erreicht werden (vgl. z. B. Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 198; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).
Die Anwendung dieser Systeme auf verschiedene Pflanzenarten hängt von der Fähigkeit ab, diese besondere Pflanzenart aus Protoplasten regenerieren zu können. Veranschaulichende Verfahren zur Regeneration von Getreidepflanzen aus Protoplasten sind beschrieben (vgl, z. B. Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).
Um Pflanzenarten zu transformieren, welche nicht erfolgreich aus Protoplasten regeneriert werden können, können andere Verfahren angewendet werden, um eine DNA in intakte Zellen oder Gewebe einzuschleusen. Zum Beispiel kann die Regeneration von Getreidepflanzen aus unreifen Embryonen oder Explantaten erreicht werden, wie beschrieben wurde (Vasil, 1988). Zusätzlich kann die "Teilchenkanonen"- oder Hochgeschwindigkeitsmikroprojektiltechnik angewendet werden (Vasil, 1992).
Unter Anwendung der letzteren Technik wird die DNA auf der Oberfläche von kleinen Metallteilchen durch die Zellwand hindurch in das Cytoplasma getragen, wie beschrieben wurde (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988). Die Metallteilchen durchdringen mehrere Schichten von Zellen und ermöglichen somit die Transformation von Zellen innerhalb von Gewebeexplantaten.
5.6.4 Genexpression in Pflanzen
Aufgrund der Tatsache, daß der Codon-Gebrauch in Pflanzen mehr demjenigen von Menschen und anderen höheren Organismen ähnelt als dem von einzelligen Organismen wie Bakterien, werden unmodifizierte Bakteriengene in transgenen Pflanzenzellen häufig unzureichend exprimiert. Die offensichtliche allgemeine GC-Gehalt-Vorliebe in Codon-Position 3 ist durch Murray et al. (1990) ausführlich beschrieben worden. Die in dieser Arbeit beschriebenen 207 Pflanzengene erlauben die Zusammenstellung von Codon-Präferenzen für Aminosäuren in Pflanzen. Diese Autoren beschreiben den Unterschied zwischen dem Codon-Gebrauch in einkeimblättrigen Pflanzen und zweikeimblättrigen Pflanzen, sowie die Unterschiede zwischen Genen, welche durch Chloroplasten codiert werden, und solchen, welche durch den Kern codiert werden. Mittels der bereitgestellten Codon-Häufigkeitstabellen können Fachleute eine solche bakterielle Sequenz zur Expression in Pflanzen durch Modifikation der DNA-Sequenzen, um eine Codon-Vorliebe für G oder C in der dritten Position vorzusehen, entwerfen.
Die Arbeit von Diehn et al. (1996) beschreibt ausführlich die Modifikation einer Prokaryonten-gesteuerten Gensequenz, um eine Expression in Pflanzen zu ermöglichen. Iannacone et al. (1997) beschreiben die Transformation von Auberginenpflanzen mit einen gentechnisch veränderten B. thuringiensis-Gen, welches ein Endotoxin der cry3-Klasse codiert. Unter Verwendung von Sequenzen, welche Polyadenylierungssequenzen, ATTA-Sequenzen und Spleißstellen vermeiden, wurde ein synthetisches Gen konstruiert, welches die Expression des codierten Toxins in Pflanzen ermöglicht. Die Expression des grün fluoreszierenden Proteins der Qualle in transgenen Tabakpflanzen ist durch Rouwendal et al. (1997) beschrieben worden. Unter Verwendung eines synthetischen Gens, wurde eine Codon-Vorliebe für C + G in der dritten Position hervorgerufen, um die Expression des heterologen Gens in Pflanzen zu ermöglichen.
Fütterer und Hohn (1996) beschreiben die Effekte von mRNA-Sequenzen, Leadersequenzen, polycistronischen Informationen und internen Ribosomenbindungsstellenmotiven auf die Expression in Pflanzen. Die Modifikation solcher Sequenzen durch die Konstruktion von synthetischen Genen ermöglicht die Expression von viralen mRNAs in transgenen Pflanzenzellen.
Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte im Hinblick auf die Herstellung von transgenen Pflanzen, welche bakterielle Proteine wie B. thuringiensis-Kristallproteine exprimieren, gemacht worden sind, sind die Ergebnisse der Expression von nativen Bakteriengenen in Pflanzen oft enttäuschend. Im Gegensatz zu der Genetik von Mikroorganismen war den ersten Pflanzengenetikern wenig über die Faktoren bekannt, welche die heterologe Expression von fremden Genen in Pflanzen beeinflussen. In den letzten Jahren sind jedoch mehrere mögliche Faktoren einbezogen worden, welche in unterschiedlichen Graden für die Expressionsrate eines Proteins durch eine bestimmte codierende verantwortlich sein könnten. Zum Beispiel ist den Wissenschaftler nun bekannt, daß die Aufrechterhaltung einer wesentlichen Konzentration einer bestimmten mRNA in der Zelle tatsächlich ein wichtiger Faktor ist. Unglücklicherweise sind die Gründe für ein geringes Fließgleichgewichtsniveau einer mRNA, welche fremde Proteine codiert, sehr vielfältig. Als erstes könnte die Synthese einer RNA vollständiger Länge nicht in einer hohen Häufigkeit erfolgen. Dies könnte zum Beispiel durch die frühzeitige Termination einer RNA während der Transkription oder infolge einer unerwarteten mRNA-Prozessierung während der Transkription verursacht werden. Als zweites könnte eine RNA vollständiger Länge in der Pflanzenzelle hergestellt werden, aber dann im Kern in einer Art und Weise prozessiert (Spleißen, PolyA-Addition) werden, welche keine funktionelle mRNA hervorbringt. Falls die RNA nicht richtig synthetisiert, terminiert und polyadenyliert wird, kann sie nicht in das Cytoplasma zur Translation transportiert werden. Entsprechend wird im Cytoplasma, falls mRNAs verminderte Halbwertszeiten aufweisen (welche durch ihre Primär- oder Sekundärsequenz bestimmt werden), eine unzureichende Menge des Proteinprodukts hergestellt. Außerdem gibt es einen Einfluß, dessen Bedeutung ungewiß ist, der Translationseffizienz auf die mRNA-Halbwertszeit Zusätzlich faltet sich jedes RNA-Molekül zu einer bestimmten Struktur oder möglicherweise einer Familie von Strukturen, welche durch seine Sequenz bestimmt wird. Die besondere Struktur einer RNA kann zu einer größeren oder geringeren Stabilität im Cytoplasma führen. Die Struktur per se ist wahrscheinlich auch eine Determinante der mRNA-Prozessierung im Kern. Unglücklicherweise ist es unmöglich vorherzusagen und nahezu unmöglich festzustellen, welche Struktur eine RNA (ausgenommen tRNA) in vitro oder in vivo hat. Jedoch ist es wahrscheinlich, daß eine drastische Veränderung der Sequenz einer RNA einen großen Einfluß auf die gefaltete Struktur hiervon hat. Es ist wahrscheinlich, daß die Struktur per se oder besondere Strukturmerkmale bei der Festlegung der RNA-Stabilität auch eine Rolle spielen.
Um diese Begrenzungen im Hinblick auf die Expression eines fremden Gens zu überwinden, haben Forscher bestimmte Sequenzen und Signale in RNAs identifiziert, welche unter Umständen eine spezifische Auswirkung auf die RNA-Stabilität haben. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist es daher wünschenswert, die Expression der offenbarten Nucleinsäuresegmente in Pflanzen zu optimieren. Ein besonderes Verfahren hierfür ist die Veränderung des Bakteriengens, um Sequenzen oder Motive zu entfernen, welche die Expression in einer transformierten Pflanzenzelle vermindern. Das Verfahren zur Konstruktion einer codierenden Sequenz für eine optimale Expression in Pflanzen wird häufig als "Botanisieren" einer DNA-Sequenz bezeichnet.
Besonders problematische Sequenzen sind die A + T-reichen Sequenzen. Unglücklicherweise, da B. thuringiensis ein A + T-reiches Genom besitzt, müssen native Kristallprotein-Gensequenzen häufig modifiziert werden, um eine optimale Expression in einer Pflanze zu erreichen. Das Sequenzmotiv ATTTA (oder AUUUA, so wie es in RNA vorkommt) ist als eine destabilisierende Sequenz in der mRNA einer Säugerzelle identifiziert worden (Shaw und Kamen, 1986). Viele kurzlebige mRNAs besitzen A + T-reiche, 3'-nichttranslatierte Regionen, und diese Regionen weisen häufig die ATTTA-Sequenz auf, welche zuweilen in mehreren Kopien oder als Multimere (z. B. ATTTAATTTA...) vorhanden ist. Shaw und Kamen zeigten, daß die Übertragung des 3'-Endes einer instabilen mRNA auf eine stabile RNA (Globin oder VA1) die Halbwertszeit der stabile RNA drastisch verringerte. Sie zeigten weiterhin, daß ein Pentamer von ATTTA eine starke destabilisierende Wirkung auf eine stabile Information hatte, und daß dieses Signal seine Wirkung ausüben konnte, unabhängig davon, ob es am 3'-Ende oder innerhalb der codierenden Sequenz befand. Jedoch scheint die Anzahl der ATTTA-Sequenzen und/oder der Sequenzzusammenhang, in dem sie vorkommen, auch für die Festlegung wichtig zu sein, ob sie als destabilisierende Sequenzen wirksam sind. Shaw und Kamen zeigten, daß ein Trimer von ATTTA eine viel geringere Auswirkung als ein Pentamer auf die mRNA-Stabilität hatte, und daß ein Dimer oder ein Monomer keinen Einfluß auf die Stabilität hatte (Shaw und Kamen, 1986). Es ist anzumerken, daß Multimere von ATTTA, wie ein Pentamer, automatisch eine A + T-reiche Region erzeugen. Es wurde gezeigt, daß dies ein cytoplasmatischer Effekt und kein nuklearer Effekt ist. In anderen instabilen mRNAs kann die ATTTA-Sequenz in nur einer einzigen Kopie vorhanden sein, aber sie ist häufig in einer A + T-reichen Region enthalten. Aus den bis heute gesammelten Daten über tierische Zellen ist ersichtlich, daß ATTTA zumindest in einigen Zusammenhängen für die Stabilität wichtig ist, aber es ist noch nicht möglich vorherzusagen, welche Vorkommen von ATTTA destabilisierende Elemente sind oder ob irgendeiner dieser Effekte wahrscheinlich in Pflanzen zu beobachten ist.
Einige Studien über den mRNA-Abbau in tierischen Zellen zeigen auch, daß der RNA-Abbau in einigen Fällen mit einem nucleolytischen Angriff in A + T-reichen Regionen beginnen kann. Es ist nicht klar, ob diese Spaltungen an ATTTA-Sequenzen erfolgen. Es gibt auch Beispiele für mRNAs, die eine unterschiedliche Stabilität in Abhängigkeit von dem Zelltyp, in dem sie exprimiert werden, oder von dem Stadium innerhalb des Zellzyklus, in dem sie exprimiert werden, zeigen. Zum Beispiel sind Histon-mRNAs während der DNA-Synthese stabil, aber instabil, falls die DNA-Synthese unterbrochen wird. Für diesen Effekt scheint das 3'-Ende einiger Histon-mRNAs verantwortlich zu sein (Pandey und Marzluff, 1987). Er scheint nicht durch ATTTA vermittelt zu werden, noch ist deutlich, wodurch die unterschiedliche Stabilität dieser mRNA kontrolliert wird. Ein anderes Beispiel ist die unterschiedliche Stabilität von IgG-mRNA in B-Lymphocyten während der B-Zellreifung (Genovese und Milcarek, 1988). Ein letztes Beispiel ist die Instabilität einer mutierten β-Thalassämie-Globin-mRNA. In Knochenmarkzellen, wo dieses Gen normalerweise exprimiert wird, ist die mutierte mRNA instabil, während die Wildtyp-mRNA stabil ist. Wenn das mutierte Gen in HeLa- oder L-Zellen in vitro exprimiert wird, zeigt die mutierte mRNA keine Instabilität (Lim et al., 1988). Diese Beispiele weisen alle darauf hin, daß die mRNA-Stabilität durch Zelltyp- oder Zellzyklus-spezifische Faktoren vermittelt werden kann. Ferner ist diese Art der Instabilität auch nicht mit spezifischen Sequenzen assoziiert. Aufgrund dieser Unklarheiten ist es nicht möglich, vorherzusagen, welche RNAs wahrscheinlich in einer bestimmten Zelle instabil sind. Außerdem kann selbst das ATTTA-Motiv, abhängig von der Art der Zelle, in welcher die RNA vorliegt, unterschiedlich wirksam sein. Shaw und Kamen (1987) haben berichtet, daß die Aktivierung der Proteinkinase C den durch ATTTA vermittelten Abbau blockieren kann.
Die Addition einer Polyadenylatkette an das 3'-Ende ist ein allgemeines Merkmal der meisten eukaryontischen mRNAs, sowohl in Pflanzen als auch in Tieren. Der gegenwärtig angenommene Mechanismus der PolyA-Addition ist, daß das wachsende Transkript über das reife 3'-Ende hinaus verlängert wird. In diesem Transkript sind Signale für eine Polyadenylierung und eine korrekte Bildung des 3'-Endes enthalten. Diese Prozessierung am 3'-Ende beinhaltet die Spaltung der mRNA und die Addition von PolyA an das reife 3'-Ende. Durch die Suche nach Konsensussequenzen in der Nähe des PolyA-Bereiches in sowohl pflanzlichen als tierischen mRNAs ist es möglich gewesen, Konsensussequenzen zu identifizieren, welche anscheinend an der PolyA-Addition und der Spaltung am 3'-Ende beteiligt sind. Für beide Prozesse scheinen dieselben Konsensussequenzen wichtig zu sein. Diese Signale sind typischerweise eine Variation der Sequenz AATAAA. In tierischen Zellen sind einige Varianten dieser Sequenz, welche funktionell sind, identifiziert worden; in Pflanzenzellen scheint es einen größere Auswahl von funktionellen Sequenzen zu geben (Wickens und Stephenson, 1984; Dean et al., 1986). Da diese Konsensussequenzen alle Variationen von AATAAA darstellen, sind sie alle A + T-reiche Sequenzen. Diese Sequenz ist typischerweise 15 bis 20 bp vor dem PolyA-Bereich in einer reifen mRNA zu finden. Studien an tierischen Zellen zeigen, daß diese Sequenz sowohl an der PolyA-Addition als auch an der 3'-Reifung beteiligt ist. Ortsspezifische Mutationen in dieser Sequenz können diese Funktionen zerstören (Conway und Wickens, 1988; Wickens et al., 1987). Jedoch ist auch beobachtet worden, daß Sequenzen, welche bis zu 50 bis 100 bp 3' zu dem mutmaßlichen PolyA-Signal vorliegen, ebenfalls erforderlich sind; d. h. ein Gen, das eine normale AATAAA-Sequenz aufweist, aber stromabwärts ersetzt oder unterbrochen worden ist, wird nicht richtig polyadenyliert (Gil und Proudfoot, 1984; Sadofsky und Alwine, 1984; McDevitt et al., 1984). Das heißt, daß das PolyA-Signal selbst nicht für eine vollständige und richtige Prozessierung ausreichend ist. Es ist noch nicht bekannt, welche spezifischen Stromabwärtssequenzen zusätzlich zu dem PolyA-Signal erforderlich sind, oder ob es eine spezifische Sequenz gibt, welche diese Funktion hat. Daher kann eine Sequenzanalyse nur potentielle PolyA-Signale identifizieren.
Bei natürlich vorkommenden mRNAs, welche normalerweise polyadenyliert sind, ist beobachtet worden, daß durch Unterbrechung dieses Prozesses, entweder durch Veränderung des PolyA-Signals oder anderer Sequenzen in der mRNA, sehr große Effekte auf der Ebene der funktionellen mRNA erhalten werden können. Dies ist bei mehreren natürlich vorkommenden mRNAs beobachtet worden, wobei die Ergebnisse bisher genspezifisch sind.
Es ist gezeigt worden, daß in natürlichen mRNAs eine korrekte Polyadenylierung bei der mRNA-Anreicherung wichtig ist, und daß die Unterbrechung dieses Prozesses die mRNA-Konzentrationen wesentlich beeinflussen kann. Jedoch ist zu wenig bekannt, um vorherzusagen, welchen Effekt Veränderungen in einem normalen Gen haben. Bei einem heterologen Gen ist es sogar noch schwerer, die Folgen vorherzusagen. Jedoch ist es möglich, daß die identifizierten mutmaßlichen Stellen nicht richtig wirksam sind. Das heißt, diese Stellen können nicht als richtige PolyA-Stellen wirksam sein, aber fungieren statt dessen als atypische Stellen, welche instabile mRNAs ergeben.
In Tierzellsystemen ist die AATAAA-Sequenz das weitaus häufigste Signal, welches in mRNAs stromaufwärts des PolyA-Signals identifiziert wurde, jedoch sind auch mindestens vier Varianten gefunden worden (Wickens und Stephenson, 1984). Bei Pflanzen sind längst nicht so viele Untersuchungen durchgeführt worden, aber es ist klar, daß mehrere Sequenzen, welche AATAAA ähnlich sind, verwendet werden können. Die in Tabelle 4 als bedeutend oder unbedeutend bezeichneten Pflanzenstellen beziehen sich nur auf die Studie von Dean et al. (1986), welche nur drei Typen von Pflanzengenen analysierten. Die Bezeichnung von Polyadenylierungsstellen als bedeutend oder unbedeutend bezieht sich nur auf die Häufigkeit ihres Vorkommens als funktionelle Stellen in natürlich vorkommenden Genen, welche analysiert worden sind. Im Falle von Pflanzen ist dies eine sehr begrenzte Datenbank. Es ist schwer, mit Sicherheit vorherzusagen, daß eine als bedeutend oder unbedeutend bezeichnete Stelle mehr oder weniger wahrscheinlich teilweise oder vollständig wirksam ist, wenn sie in heterologen Genen, wie solchen, welche die erfindungsgemäßen Kristallproteine codieren, vorkommen.
Tabelle 4 Polyadenylierungsstellen in Pflanzengenen
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von synthetischen Pflanzengenen bereit, wobei die Gene ihr Proteinprodukt in wesentlich höheren Raten exprimieren als die Wildtyp-Gene, welche bisher im allgemeinen bei der Pflanzentransformation verwendet wurden. Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch neue synthetische Pflanzengene bereit, welche nicht pflanzliche Proteine codieren.
Wie oben beschrieben, ist die Expression von nativen B. thuringiensis-Genen in Pflanzen oft problematisch. Die Natur der codierenden Sequenzen von B. thuringiensis-Genen unterscheidet sie von Pflanzengenen sowie von vielen anderen in Pflanzen exprimierten heterologen Genen. Insbesondere sind B. thuringiensis-Gene sehr reich (~62%) an Adenin (A) und Thymin (T), während Pflanzengene und die meisten anderen Bakteriengene, welche in Pflanzen exprimiert worden sind, einen A + T-Gehalt in der Größenordnung von 45–55% aufweisen.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes und der begrenzten Codon-Auswahl für eine Aminosäure findet man den "Überschuß" an A + T in den strukturellen codierenden Sequenzen von einigen Bacillus-Spezies in der dritten Position der Codons.
Das heißt, die Gene einiger Bacillus-Spezies weisen A oder T als das dritte Nucleotid in vielen Codons auf. Folglich kann der A + T-Gehalt zum Teil die Vorliebe des Codon-Gebrauchs bestimmen. Außerdem ist erkennbar, daß Gene eine maximale Funktion in dem Organismus, in dem sie sich entwickeln, entfalten. Dies bedeutet, daß bestimmte Nucleotidsequenzen, welche in einem Gen aus einem Organismus vorkommen, in dem sie keine Rolle spielen können, außer daß sie einen bestimmten Bereich von Aminosäuren codieren, das Potential haben, als Genkontrollelemente (wie transkriptionelle Promotoren oder Terminatoren, PolyA-Additionsstellen, Intron-Spleißstellen oder spezifische mRNA-Abbausignale) in einem anderen Organismus erkannt zu werden. Es ist vielleicht überraschend, daß solche falsch abgelesenen Signale nicht ein häufigeres Merkmal der heterologen Genexpression sind, aber dies kann zum Teil durch den relativ homogenen A + T-Gehalt (–50%) von vielen Organismen erklärt werden. Der A + T-Gehalt zusammen mit der Natur des genetischen Codes sieht im Hinblick auf die Wahrscheinlichkeit des Vorkommens einer bestimmten Oligonucleotidsequenz deutliche Einschränkungen vor. So ist es viel weniger wahrscheinlich, daß ein Gen aus E. coli mit einem A + T-Gehalt von 50% irgendein A + T-reiches Segment enthält, als ein Gen aus B. thuringiensis.
Um eine hohe Expressionsrate der δ-Endotoxin-Gene in Pflanzen zu erhalten, wird typischerweise eine vorhandene strukturelle codierende Sequenz ("Strukturgen"), welche das δ-Endotoxin codiert, durch die Entfernung von ATTTA-Sequenzen und mutmaßlichen Polyadenylierungssignalen durch ortsspezifische Mutagenese der DNA, welche das Strukturgen umfaßt, modifiziert. Am meisten bevorzugt wird, daß im wesentlichen alle Polyadenylierungssignale und ATTTA-Sequenzen entfernt werden, obwohl erhöhte Expressionsraten beobachtet werden, wenn nur ein Teil der beiden oben identifizierten Sequenzen entfernt wird. Alternativ, falls ein synthetisches Gen hergestellt wird, welches die Expression des gewünschten Proteins codiert, werden die Codons so gewählt, daß die ATTTA-Sequenz und mutmaßliche Polyadenylierungssignale vermieden werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließen mutmaßliche Polyadenylierungssignale AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA und CATAAA ein, aber sind nicht notwendigerweise darauf begrenzt. Beim Ersetzen der ATTTA-Sequenzen und der Polyadenylierungssignale werden vorzugsweise Codons verwendet, welche die Codons vermeiden, die selten in Pflanzengenomen vorkommen.
Die ausgewählte DNA-Sequenz wird abgesucht, um Regionen mit mehr als vier aufeinanderfolgenden Adenin (A)- oder Thymin (T)-Nucleotiden zu identifizieren. Die A + T-Regionen werden auf mutmaßliche Pflanzen-Polyadenylierungssignale abgesucht. Obwohl durch das Fehlen von fünf oder mehr aufeinanderfolgenden A- oder T-Nucleotiden die meisten Pflanzen-Polyadenylierungssignale eliminiert werden, wird, wenn mehr als eine der unbedeutenden Polyadenylierungssignale innerhalb von zehn Nucleotiden voneinander identifiziert wird, die Nucleotidsequenz dieser Region vorzugsweise anschließend verändert, um diese Signale zu entfernen, während die ursprünglich codierte Aminosäuresequenz beibehalten wird.
Der zweite Schritt ist das Betrachten der etwa 15 bis etwa 30 Nucleotidreste, welche die im ersten Schritt identifizierte A + T-reiche Region umgeben. Falls der A + T-Gehalt der umgebenden Region weniger als 80% beträgt, sollte die Region auf Polyadenylierungssignale untersucht werden. Die Veränderung der Region auf der Basis von Polyadenylierungssignalen ist abhängig von (1) der Anzahl der vorhandenen Polyadenylierungssignale, und (2) des Vorhandenseins eines bedeutenden Pflanzen-Polyadenylierungssignals.
Der erweiterte Region wird auf das Vorhandensein von Pflanzen-Polyadenylierungssignalen untersucht. Die Polyadenylierungssignale werden durch ortspezifische Mutagenese der DNA-Sequenz entfernt. Der erweiterte Region wird auch auf mehrere Kopien der ATTTA-Sequenz untersucht, welche ebenfalls durch Mutagenese entfernt werden.
Es wird auch bevorzugt, daß Regionen, welche viele aufeinanderfolgende A + T-Basen oder G + C-Basen umfassen, unterbrochen werden, da vorhergesagt werden kann, daß für diese Regionen eine höhere Wahrscheinlichkeit für die Bildung von Haarnadelstrukturen infolge einer Selbstkomplementarität besteht. Daher würde die Insertion von heterogenen Basenpaaren die Wahrscheinlichkeit einer auf Selbstkomplementarität beruhenden Sekundärstrukturbildung verringern, welche bekanntermaßen die Transkription und/oder Translation in einigen Organismen hemmt. In den meisten Fällen können die ungünstigen Effekte unter Verwendung von Sequenzen, welche nicht mehr als fünf aufeinanderfolgende A + T-Basen oder G + C-Basen enthalten, minimiert werden.
5.7 Herstellung von insektenresistenten transgenen Pflanzen
Somit kann die Menge eines Gens, welches ein Polypeptid von Interesse codiert (d. h. ein bakterielles Kristallprotein oder Polypeptid mit einer Insektizidaktivität gegenüber einer oder mehreren Insektenarten), in einer Pflanze wie Mais durch die Transformation solcher Pflanzen mittels Teilchenbeschußverfahren erhöht werden (Maddock et al., 1991). Beispielsweise wird ein Expressionsvektor, enthaltend eine codierende Region für ein B. thuringiensis-Kristallprotein und einen geeigneten selektierbaren Marker, in eine Suspension von embryonalen Maiszellen (Getreidezellen) unter Verwendung einer Teilchenkanone zur Übertragung der auf Mikroprojektilen aufgetragenen DNA eingeschleust. Transgene Pflanzen werden aus transformierten embryonalen Kallussen regeneriert, welche die offenbarten insektiziden Kristallproteine exprimieren. Der Teilchenbeschuß ist erfolgreich angewendet worden, um Weizen zu transformieren (Vasil et al., 1992).
Die DNA kann auch durch den direkten DNA-Transfer in Pollen, wie beschrieben wurde (Zhou et al., 1983; Hess, 1987; Luo et al., 1988), in Pflanzen eingeschleust werden. Die Expression von Genen, welche ein Polypeptid codieren, kann durch Injektion der DNA in die. Fortpflanzungsorgane einer Pflanze, wie beschrieben wurde (Pena et al., 1987), erreicht werden. Die DNA kann auch direkt in die Zellen von unreifen Embryonen injiziert werden, wobei die getrockneten Embryonen rehydriert werden, wie beschrieben wurde (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986).
Die Entwicklung oder Regeneration von Pflanzen aus entweder einzelnen Pflanzenprotoplasten oder verschiedenen Explantaten ist auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt (Weissbach und Weissbach, 1988). Dieser Regenerations- und Züchtungsprozeß schließt typischerweise die Schritte der Selektion von transformierten Zellen und der Züchtung dieser vereinzelten Zellen über die üblichen Stadien der Embryonalentwicklung bis zu einem bewurzelten Pflänzchenstadium ein. Transgene Embryonen und Samen werden in ähnlicher Weise regeneriert. Die erhaltenen transgenen, bewurzelten Schößlinge werden dann in ein geeignetes Pflanzenwachstumsmedium wie Erde gepflanzt.
Die Entwicklung oder Regeneration von Pflanzen, enthaltend das fremde exogene Gen, das ein Polypeptid von Interesse codiert, welches durch Agrobacterium aus Blattexplantaten eingeschleust wurde, kann durch Verfahren erreicht werden, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, wie beschrieben wurde (Horsch et al., 1985. Bei diesem Verfahren werden Transformanten in Gegenwart eines Selektionsmittels und in einem Medium, welches die Regeneration von Schößlingen bei der zu transformierenden Pflanzenart induziert, gezüchtet, wie beschrieben wurde (Fraley et al., 1983). Insbesondere beschreibt US-Patent 5,349,124 ausführlich die Erzeugung von genetisch transformierten Salatzellen und daraus erhaltenen Pflanzen, welche hybride Kristallproteine exprimieren, die eine Insektizidaktivität gegenüber Lepidoptera-Larven auf solche Pflanzen übertragen.
Dieses Verfahren bringt typischerweise innerhalb von zwei bis vier Monaten Schößlinge hervor, und diese Schößlinge werden dann in ein geeignetes Medium, enthaltend das Selektionsmittel und ein Antibiotikum, um ein bakterielles Wachstums zu verhindern, welches die Wurzelbildung induziert, übertragen. Schößlinge, welche sich in Gegenwart des Selektionsmittels unter Bildung von Pflänzchen bewurzeln, werden dann in Erde oder ein anderes Medium übertragen, um die Bildung von Wurzeln zu ermöglichen. Diese Verfahren variieren in Abhängigkeit von der verwendeten einzelnen Pflanzenart, wobei solche Variationen auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind.
Vorzugsweise sind die regenerierten Pflanzen selbstbefruchtend, um homozygote transgene Pflanzen, wie oben besprochen, bereitzustellen. Andernfalls werden die aus den regenerierten Pflanzen erhaltenen Pollen gekreuzt, um aus Samen gezüchtete Pflanzen von landwirtschaftlich wichtigen, vorzugsweise durch Inzucht erzeugten, Zuchtlinien bereitzustellen. Umgekehrt werden Pollen aus Pflanzen solcher wichtigen Zuchtlinien verwendet, um regenerierte Pflanze zu bestäuben. Eine erfindungsgemäße transgene Pflanze, enthaltend ein gewünschtes Polypeptid, wird unter Anwendung von Verfahren, welche dem Fachmann hinreichend bekannt sind, gezüchtet.
Eine erfindungsgemäße transgene Pflanze weist somit eine erhöhte Menge einer codierenden Region auf (z. B. ein cry-Gen), welche eines oder mehrere der hierin offen barten chimären Cry-Polypeptide codiert. Eine bevorzugte transgene Pflanze ist eine unabhängige Segregante und kann das Gen und dessen Aktivität an ihre Nachkommen weitergeben. Eine mehr bevorzugte transgene Pflanze ist im Hinblick auf das Gen homozygot und überträgt dieses Gen auf alle ihre Nachkommen durch sexuelle Paarung. Samen aus einer transgenen Pflanze können auf dem Acker oder in einem Gewächshaus herangezogen werden, und die erhaltenen geschlechtsreifen transgenen Pflanzen sind selbstbestäubend, um reine Zuchtpflanzen zu erzeugen. Die Nachkommen dieser Pflanzen werden reine Zuchtlinien, welche zum Beispiel auf eine erhöhte Insektizidkapazität gegenüber Coleoptera-Insekten, vorzugsweise auf dem Acker, unter einer Reihe von Umweltbedingungen beurteilt werden. Die Erfinder erwarten, daß die vorliegende Erfindung bei der Erzeugung von transgenen Pflanzen von Mais, Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Tomate, Kartoffel, Flachs, Roggen, Gerste, Canola, Weizen, Hafer, Reis, anderen Getreidesorten, Gemüse, Früchten, Obstbäumen, Beeren, Rasengräsern, Zierpflanzen, Sträuchern und Bäumen von besonderem Nutzen ist.
5.8 Ribozyme
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, welche bestimmte mRNA-Spezies spalten. In bestimmten Ausführungsformen ziehen die Erfindung die Auswahl und die Verwendung von Ribozymen in Betracht, welche fähig sind, die erfindungsgemäßen RNA-Segmente zu spalten, sowie deren Verwendung, um die Aktivität von Ziel-mRNAs in bestimmten Zelltypen oder Geweben zu verringern.
Sechs Basenvarianten von natürlich vorkommenden enzymatischen RNAs sind gegenwärtig bekannt. Jede kann die Hydrolyse von RNA-Phosphodiesterbindungen in trans-Stellung unter physiologischen Bedingungen katalysieren (und kann folglich andere RNA-Moleküle spalten). Im allgemeinen sind enzymatische Nucleinsäuren wirksam, indem sie zuerst an eine Ziel-RNA binden. Eine solche Bindung kommt über den Ziel-Bindungsanteil einer enzymatischen Nucleinsäure zustande, der in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem enzymatischen Teil des Moleküls, welcher die Spaltung der Ziel-RNA bewirkt, gehalten wird. Folglich erkennt die enzymatische Nucleinsäure zuerst eine Ziel-RNA und bindet dann daran über eine komplementäre Basenpaarung, und ist nach der Bindung an die richtige Stelle enzymatisch wirksam, um die Ziel-RNA zu schneiden. Die strategische Spaltung einer solchen Ziel-RNA hebt deren Fähigkeit auf, die Synthese eines codierten Proteins zu steuern. Nach der Bindung einer enzymatischen Nucleinsäure an ihre Ziel-RNA und die Spaltung des RNA-Zielmoleküls, wird sie aus der RNA freigesetzt, um nach anderen Zielmolekülen zu suchen, und kann wiederholt an neue Zielmoleküle binden und diese spalten.
Die enzymatische Natur eines Ribozyms ist gegenüber vielen Techniken wie der Antisense-Technik (wobei ein Nucleinsäuremolekül einfach an ein Nucleinsäure-Zielmolekül bindet, um die Translation hiervon zu blockieren) vorteilhaft, da die Konzentration eines Ribozyms, welche notwendig ist, um eine therapeutische Behandlung zu beein flussen, geringer ist als die eines Antisense-Oligonucleotids. Dieser Vorteil weist auf die Fähigkeit des Ribozyms hin, enzymatisch wirksam zu sein. So ist ein einziges Ribozymmolekül in der Lage, viele Moleküle einer Ziel-RNA zu spalten. Außerdem ist das Ribozym ein sehr spezifischer Inhibitor, wobei die Spezifität der Inhibition nicht nur von dem Basenpaarungsmechanismus der Bindung an die Ziel-RNA abhängt, sondern auch von dem Mechanismus der Ziel-RNA-Spaltung. Einzelne Fehlpaarungen oder Basensubstitutionen nahe der Spaltstelle können die katalytische Aktivität eines Ribozyms vollständig aufheben. Ähnliche Fehlpaarungen in Antisense-Molekülen verhindern deren Wirkung nicht (Woolf et al., 1992). Folglich ist die Spezifität der Wirkung eines Ribozyms größer als die eines Antisense-Oligonucleotids, welches an dieselbe RNA-Stelle bindet.
Das enzymatische Nucleinsäuremolekül kann in Form eines Hammerkopf-, Haarnadel-, Hepatitis-δ-Virus-, Gruppe I-Intron- oder RNaseP-RNA- (in Verbindung mit einer RNA-Leadersequenz) oder Neurospora VS-RNA-Motivs vorliegen. Beispiele für Hammerkopfmotive sind bei Rossi et al. (1992) beschrieben; Beispiele für Haarnadelmotive sind bei Hampel et al. (Eur. Pat. EP 0360257 ), Hampel und Tritz (1989), Hampel et al. (1990) und Cech et al. (US-Patent 5,631,359) beschrieben; ein Beispiel für das Hepatitis-δ-Virus-Motivs ist bei Perrotta und Been (1992) beschrieben; ein Beispiel des RNaseP-Motivs ist bei Guerrier-Takada et al. (1983) beschrieben; ein Neurospora VS-RNA-Ribozymmotiv ist bei Collins (Saville und Collins, 1990; Saville und Collins, 1991; Collins und Olive, 1993) beschrieben; und ein Beispiel des Gruppe I-Introns ist bei Cech et al. (US-Patent 4,987,071) beschrieben. Das wichtigste Merkmal eines erfindungsgemäßen enzymatischen Nucleinsäuremoleküls ist, daß es eine spezifische Substratbindungsstelle besitzt, welche zu einer oder mehreren der Zielgen-RNA-Regionen komplementär ist, und daß es Nucleotidsequenzen innerhalb oder in der Umgebung der Substratbindungsstelle besitzt, welche eine RNA-Spaltaktivität auf das Molekül übertragen. Folglich müssen die Ribozymkonstrukte nicht auf die hierin erwähnten spezifischen Motive begrenzt sein.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Klasse von enzymatischen Spaltungsmitteln bereit, welche einen hohen Spezifitätsgrad im Hinblick auf die RNA eines gewünschten Zielmoleküls zeigen. Das enzymatische Nucleinsäuremolekül ist vorzugsweise auf eine stark konservierte Sequenzregion einer Ziel-mRNA ausgerichtet, so daß die spezifische Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands durch entweder eine oder mehrere enzymatische Nucleinsäuren vorgesehen werden kann. Solche enzymatischen Nucleinsäuremoleküle können gegebenenfalls exogen auf spezifische Zellen übertragen werden. Alternativ können die Ribozyme durch DNA- oder RNA-Vektoren, welche auf spezifische Zellen übertragen werden, exprimiert werden.
Kleine enzymatische Nucleinsäuremotive (z. B. die Hammerkopf- oder Haarnadelstruktur) können für eine exogene Übertragung verwendet werden. Die einfache Struktur dieser Moleküle verbessert die Fähigkeit der enzymatischen Nucleinsäure, in die Zielregionen der mRNA-Struktur einzudringen. Alternativ können katalytische RNA- Moleküle innerhalb von Zellen durch eukaryontische Promotoren exprimiert werden (z. B. Scanlon et al., 1991; Kashani-Sabet et al., 1992; Dropulic et al., 1992; Weerasinghe et al., 1991; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Sarver et al., 1990). Für Fachleute ist erkennbar, daß jedes Ribozym in eukaryontischen Zellen durch den geeigneten DNA-Vektor exprimiert werden kann. Die Aktivität solcher Ribozyme kann durch ihre Freisetzung aus dem primären Transkript durch ein zweites Ribozym verstärkt werden (Draper et al., Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 93/23569, und Sullivan et al., Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 94/02595; Ventura et al., 1993; Ohkawa et al., 1992; Taira et al., 1991; Ventura et al., 1993).
Ribozyme können direkt zugegeben werden oder können in einem Komplex mit kationischen Lipiden, als Lipidkomplexe, verpackt in Liposomen oder in anderer Weise an Zielzellen abgegeben werden. Die RNA-Moleküle oder RNA-Komplexe können an relevante Gewebe ex vivo oder in vivo durch Injektion, Aerosolinhalation, Infusionspumpe oder -kanüle, mit oder ohne Einschließung hiervon in Biopolymere, lokal verabreicht werden.
Ribozyme können konstruiert werden, wie bei Draper et al. (Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 93/23569) oder Sullivan et al. (Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 94/02595) beschrieben ist, und zum Testen in vitro und in vivo synthetisiert werden, wie beschrieben wurde. Solche Ribozyme können auch hinsichtlich der Übertragung optimiert werden. Obwohl spezifische Beispiele bereitgestellt werden, ist den Fachleuten bewußt, daß gegebenenfalls äquivalente RNA-Zielmoleküle in anderen Spezies verwendet werden können.
Hammerkopf- oder Haarnadel-Ribozyme können durch Faltung am Computer einzeln analysiert werden (Jaeger et al., 1989), um zu beurteilen, ob sich die Ribozymsequenzen zu der geeigneten Sekundärstruktur falten. Ribozyme mit ungünstigen intramolekularen Wechselwirkungen zwischen den Bindungsarmen und dem katalytischen Kern werden nicht berücksichtigt. Wahlweise können die Bindungsarmlängen variiert werden, um die Aktivität zu optimieren. Im allgemeinen sind mindestens 5 Basen auf jedem Arm in der Lage, an die Ziel-RNA zu binden oder in anderer Weise damit in Wechselwirkung zu treten.
Ribozyme des Hammerkopf- oder Haarnadelmotivs können so konstruiert werden, daß sie sich an verschiedene Stellen in der mRNA-Information anlagern, und können chemisch synthetisiert werden. Das angewendete Syntheseverfahren folgt dem Verfahren für eine normale RNA-Synthese, wie bei Usman et al. (1987) und bei Scaringe et al. (1990) beschrieben ist, und macht Gebrauch von üblichen Nucleinsäure-Schutz- und Kopplungsgruppen, wie Dimethoxytrityl am 5'-Ende und Phosphoramidite am 3'-Ende. Durchschnittliche Ausbeuten einer stufenweisen Kopplung sind typischerweise > 98%. Haarnadel-Ribozyme können in zwei Teilen synthetisiert und unter Rekonstruktion eines aktiven Ribozyms aneinandergelagert werden (Chowrira und Burke, 1992). Ribozyme können umfassend modifiziert werden, um die Stabilität durch die Modifikation mit Nuclease-resistenten Gruppen, zum Beispiel 2'-Amino, 2'-C-Allyl, 2'-Fluoro, 2'-o-Methyl oder 2'-H (für eine Übersicht vgl. Usman und Cedergren, 1992), zu erhöhen. Ribozyme können durch Gelelektrophorese unter Anwendung von allgemeinen Verfahren oder durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt und in Wasser resuspendiert werden.
Die Ribozymaktivität kann durch Veränderung der Länge der Ribozym-Bindungsarme oder durch die chemische Synthese von Ribozymen mit Modifikationen, die ihren Abbau durch Serum-Ribonucleasen verhindern (vgl. z. B. Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 92/07065; Perrault et al., 1990; Pieken et al., 1991; Usman und Cedergren, 1992; Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 93/15187; Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 91/03162; US-Patent 5,334,711; und Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 94/13688, welche verschiedene chemische Modifikationen beschreiben, die an den Zuckereinheiten von enzymatischen RNA-Molekülen vorgenommen werden können), und Modifikationen, welche deren Wirksamkeit in Zellen erhöhen, sowie durch Entfernung von Stamm II-Basen, um die RNA-Synthesezeiten zu verkürzen und die chemischen Anforderungen zu verringern, optimiert werden.
Sullivan et al. (Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 94/02595) beschreibt die allgemeinen Verfahren zur Übertragung von enzymatischen RNA-Molekülen. Ribozyme können durch eine Vielzahl von Verfahren, mit welchen die Fachleute vertraut sind, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Einkapselung in Liposomen, durch Iontophorese oder durch Einschließen in andere Vehikel, wie Hydrogele, Cyclodextrine, bioabbaubare Nanokapseln und bioadhäsive Mikrokügelchen, an Zellen verabreicht werden. Für einige Indikationen können Ribozyme ex vivo direkt an Zellen oder Gewebe, mit oder ohne den oben erwähnten Vehikeln, abgegeben werden. Alternativ kann die RNA/Vehikel-Kombination durch direkte Inhalation, durch direkte Injektion oder durch Verwendung eines Katheders, einer Infusionspumpe oder Kanüle, lokal abgegeben werden. Andere Übertragungswege schließen, aber sind nicht begrenzt auf, die intravaskuläre, intramuskuläre, subkutane oder Gelenk-Injektion, Aerosolinhalation, orale (Tabletten- oder Pillenform), topische, systemische, okkulare, intraperitoneale und/oder intrathekale Abgabe ein. Ausführlichere Beschreibungen der Ribozym-Übertragung und -Verabreichung werden bei Sullivan et al. (Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 94/02595) und Draper et al. (Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 93/23569) vorgesehen.
Ein anderes Mittel zur Anreicherung von hohen Konzentrationen eines oder mehrerer Ribozyme innerhalb von Zellen ist der Einbau der das Ribozym codierenden Sequenzen in einen DNA-Expressionsvektor. Die Transkription der Ribozymsequenzen wird durch einen Promotor für die eukaryontische RNA-Polymerase I (polI), RNA-Polymerase II (polII) oder RNA-Polymerase III (polIII) gesteuert. Transkripte von polI- oder polIII-Promotoren werden in allen Zellen in hohen Raten exprimiert; die Raten eines bestimmten polII-Promotors in einem bestimmten Zelltyp hängen von der Art der in der Nähe befindlichen genregulatorischen Sequenzen (Enhancer, stumme Sequenzen, etc.) ab. Prokaryontische RNA-Polymerase-Promotoren können auch verwendet werden, mit der Maßgabe, daß das prokaryontische RNA-Polymeraseenzym in den geeigneten Zellen exprimiert wird (Elroy-Stein und Moss, 1990; Gao und Huang, 1993; Lieber et al., 1993; Zhou et al., 1990). Die durch solche Promotoren exprimierten Ribozyme können in Säugerzellen wirksam sein (z. B. Kashani-Saber et al., 1992; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Yu et al., 1993; L'Huillier et al., 1992; Lisziewicz et al., 1993). Solche Transkriptionseinheiten können in eine Vielzahl von Vektoren zur Einschleusung in Säugerzellen eingebaut werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Plasmid-DNA-Vektoren, Virus-DNA-Vektoren (wie Adenovirus- oder Adeno-assoziierte Vektoren) oder Virus-RNA-Vektoren (wie Retrovirus-, Semliki-Forrest-Virus- oder Sindbisvirus-Vektoren).
Die erfindungsgemäßen Ribozyme können als diagnostische Hilfsmittel verwendet werden, um eine Gendrift sowie Mutationen innerhalb von Zelllinien oder Zelltypen zu untersuchen. Sie können auch verwendet werden, um die Konzentrationen des RNA-Zielmoleküls abzuschätzen. Die enge Beziehung zwischen der Ribozymaktivität und der Struktur der Ziel-RNA ermöglicht den Nachweis von Mutationen in einer Region des Moleküls, welche die Basenpaarung und die dreidimensionale Struktur der Ziel-RNA verändert. Unter Verwendung von mehreren der in dieser Erfindung beschriebenen Ribozymen kann man Nucleotidaustäusche kartieren, welche für die RNA-Struktur und -Funktion in vitro sowie in Zellen und Geweben wichtig sind. Die Spaltung von Ziel-RNAs mit Ribozymen kann verwendet werden, um die Genexpression zu inhibieren und die Rolle (im wesentlichen) von spezifischen Genprodukten in bestimmten Zellen oder Zelltypen zu definieren.
5.9 Isolierung von homologen Genen und Genfragmenten
Die erfindungsgemäßen Gene und δ-Endotoxine schließen nicht nur die hierin offenbarten Sequenzen vollständiger Länge ein, sondern auch Fragmente dieser Sequenzen oder Fusionsproteine, welche die charakteristische Insektizidaktivität der hierin spezifisch veranschaulichten Sequenzen beibehalten.
Für den Fachmann sollte es ersichtlich sein, daß insektizide δ-Endotoxine durch mehrere Mittel identifiziert und erhalten werden können. Die spezifischen Gene oder Teile hiervon können von einer Kultur-Hinterlegungsstelle erhalten werden oder zum Beispiel unter Verwendung eines Gensynthesegeräts synthetisch konstruiert werden. Variationen dieser Gene können durch Standardtechniken zur Einführung von Punktmutationen ohne weiteres konstruiert werden. Fragmente dieser Gene können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Exonucleasen oder Endonucleasen gemäß Standardverfahren ebenfalls hergestellt werden. Zum Beispiel können Enzyme wie Bal31 oder die ortspezifische Mutagenese verwendet werden, um systematisch Nucleotide an den Enden dieser Gene abzuspalten. Unter Verwendung einer Vielzahl von anderen Restriktionsenzymen können auch Gene erhalten werden, welche aktive Fragmente codieren. Proteasen können verwendet werden, um direkt aktive Fragmente dieser δ-Endotoxine zu erhalten.
Äquivalente δ-Endotoxine und/oder Gene, welche diese äquivalenten δ-Endotoxine codieren, können mittels den hierin bereitgestellten Lehren auch aus Bacillus-Stämmen und/oder DNA-Genbanken isoliert werden. Zum Beispiel können Antikörper gegen die hierin offenbarten und beanspruchten δ-Endotoxine verwendet werden, um andere δ-Endotoxine aus einer Mischung von Proteinen zu identifizieren und zu isolieren. Genauer können Antikörper gegen die Teile der δ-Endotoxine, welche am konstantesten sind und sich am stärksten von anderen B. thuringiensis-δ-Endotoxinen unterscheiden, erzeugt werden. Diese Antikörper können dann verwendet werden, um spezifisch äquivalente δ-Endotoxine mit der charakteristischen Insektizidaktivität durch eine Immunpräzipitation, einen Enzym-gebundenen Immunoassay (ELISA) oder ein Western-Blot-Verfahren zu identifizieren.
Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung der erfindungsgemäßen δ-Endotoxine und Gene ist durch die Verwendung von Oligonucleotidsonden. Diese Sonden sind Nucleotidsequenzen, welche einen nachweisbaren Marker aufweisen. Wie auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt ist, falls das Sondenmolekül und die Nucleinsäureprobe unter Bildung einer starken Bindung zwischen den zwei Molekülen hybridisieren, kann mit ziemlicher Sicherheit angenommen werden, daß die Sonde und die Probe im wesentlichen identisch sind. Der nachweisbare Marker der Sonde stellt ein Mittel für den Nachweis in einer bekannten Art und Weise bereit, ob eine Hybridisierung stattgefunden hat. Eine solche Sondenanalyse stellt ein schnelles Verfahren zur Identifizierung von erfindungsgemäßen formiziden δ-Endotoxin-Genen bereit.
Die Nucleotidsegmente, die als erfindungsgemäße Sonden verwendet werden, können unter Verwendung von DNA-Synthesegeräten mittels Standardverfahren synthetisiert werden. Bei der Verwendung der Nucleotidsegmente als Sonden wird die einzelne Sonde mit irgendeinem geeigneten Marker markiert, welcher den Fachleuten bekannt ist, einschließlich radioaktive und nicht-radioaktive Marker. Typische radioaktive Marker schließen ³²P, ¹²⁵I, ³⁵S oder dergleichen ein. Eine mit einem radioaktiven Isotop markierte Sonde kann aus einer Nucleotidsequenz, welche zu der DNA-Probe komplementär ist, durch eine herkömmliche Nicktranslationsreaktion unter Verwendung einer DNase und einer DNA-Polymerase konstruiert werden. Die Sonde und die Probe können dann in einer Hybridisierungspufferlösung kombiniert und bei einer geeigneten Temperatur gehalten werden, bis eine Aneinanderlagerung stattfindet. Danach wird die Membran gewaschen, um fremde Materialien abzuspülen, wobei die Probe und die gebundenen Sondenmoleküle zurückbleiben, welche typischerweise mittels Autoradiographie und/oder Flüssigkeitsszintillationszählung nachgewiesen und quantifiziert werden.
Nicht-radioaktive Marker schließen zum Beispiel Liganden wie Biotin oder Thyroxin, sowie Enzyme wie Hydrolasen oder Peroxidasen oder die verschiedenen chemilumineszierenden Verbindungen wie Luciferin oder fluoreszierende Verbindungen wie Fluorescein und dessen Derivate ein. Die Sonde kann auch an beiden Enden mit verschiedenen Arten von Markern markiert sein, um die Trennung zu erleichtern, wie zum Beispiel durch die Verwendung eines Isotopenmarkers an dem oben erwähnten Ende und einem Biotinmarker an dem anderen Ende.
Die Doppelstrangbildung und -stabilität hängt von der wesentlichen Komple mentarität zwischen den zwei Strängen eines Hybrids ab, und, wie oben angemerkt, kann ein gewisser Grad von Fehlpaarungen toleriert werden. Daher schließen die erfindungsgemäßen Sonden Mutationen (sowohl einzelne als auch mehrere), Deletionen, Insertionen der beschriebenen Sequenzen und Kombinationen hiervon ein, wobei die Mutationen, Insertionen und Deletionen die Bildung von stabilen Hybriden mit dem Ziel-Polynucleotid von Interesse ermöglichen. Mutationen, Insertionen und Deletionen können in eine bestimmte Polynucleotidsequenz auf vielfältige Weise durch Verfahren, welche dem Fachmann gegenwärtig bekannt sind, und möglicherweise durch andere Verfahren, welche in der Zukunft bekannt werden, eingeführt werden.
Die möglichen Variationen in den aufgeführten Sonden ist zum Teil auf die Redundanz des genetischen Codes zurückzuführen. Das heißt, daß aufgrund der Redundanz des genetischen Codes mehr als ein codierendes Nucleotidtriplett (Codon) für die meisten Aminosäuren, welche zur Herstellung von Proteinen verwendet werden, verwendet werden kann. Daher können verschiedene Nucleotidsequenzen eine bestimmte Aminosäure codieren. So können die Aminosäuresequenzen der B. thuringiensis-δ-Endotoxine und Peptide durch äquivalente Nucleotidsequenzen, welche dieselbe Aminosäuresequenz des Proteins oder Peptids codieren, hergestellt werden. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung solche äquivalenten Nucleotidsequenzen ein. Umgekehrte und komplementäre Sequenzen sind auch ein Aspekt der vorliegenden Erfindung und können ohne weiteres durch einen Fachmann verwendet werden. Außerdem ist gezeigt worden, daß Proteine mit einer identifizierten Struktur und Funktion durch Veränderung der Aminosäuresequenz konstruiert werden können, falls solche Veränderungen die Sekundärstruktur des Proteins nicht verändern (Kaiser und Kezdy, 1984). Folglich schließt die vorliegende Erfindung Mutanten der hierin gezeigten Aminosäuresequenz ein, welche die Sekundärstruktur des Proteins nicht verändern, oder welche, falls die Struktur verändert wird, die biologische Aktivität im wesentlichen beibehalten. Ferner schließt die Erfindung auch Mutanten von Organismen ein, welche das gesamte oder einen Teil eines erfindungsgemäßen Gens, welches ein δ-Endotoxin codiert, aufgenommen haben. Solche Mutanten können durch Techniken hergestellt werden, welche den Fachleuten hinreichend bekannt sind. Zum Beispiel kann eine UV-Bestrahlung verwendet werden, um Mutanten von Wirtsorganismen herzustellen. Desgleichen können solche Mutanten asporogene Wirtszellen einschließen, welche ebenfalls durch Verfahren hergestellt werden können, die auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind.
6.0 Beispiele
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen. Den Fachleuten sollte bewußt sein, daß die in den Beispielen offenbarten Techniken, die repräsentative Techniken befolgen, welche die Erfinder entdeckt haben, bei der Ausführung der Erfindung hinreichend wirksam sind und folglich als bevorzugte Verfahren zu deren Ausführung angesehen werden können. Jedoch sollte den Fachleuten im Hinblick auf die vorliegende Offenbarung bewußt sein, daß viele Veränderungen bei den spezifischen Ausführungsformen, welche offenbart werden, durchgeführt werden können und dennoch das gleiche oder ein ähnliches Ergebnis erhalten wird, ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
6.1 Beispiel 1 – Konstruktion von B. thuringiensis-Hybrid-δ-Endotoxinen
Die B. thuringiensis-"Shuttle"-Vektoren pEG853, pEG854 und pEG857, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind beschrieben worden (Baum et al., 1990). pEG857 enthält das Cry1Ac-Gen, cloniert in pEG853 als ein SphI-BamHI-DNA-Fragment. pEG1064 wurde in einer solchen Weise konstruiert, daß die KpnI-Stelle innerhalb des cry1Ac-Gens erhalten wurde und die KpnI-Stelle in der multiplen Clonierungsstelle (MCS) von pEG857 eliminiert wurde. Dies wurde erreicht, indem die pEG857-DNA aufeinanderfolgend einem begrenzten KpnI-Verdau unterzogen wurde, so daß nur eine KpnI-Stelle geschnitten wird, das überhängende KpnI-5'-Ende durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt wurde, um glatte DNA-Enden zu erzeugen, und die glatten Enden der DNA durch die T4-DNA-Ligase verknüpft wurden. pEG318 enthält das cry1F-Gen (Chambers et al., 1991), cloniert in die XhoI-Stelle von pEG854 als ein XhoI-SalI-DNA-Fragment. pEG315 enthält das cry1C-Gen aus Stamm EG6346 (Chambers et al., 1991), cloniert in die XhoI-BamHI-Stellen von pEG854 als ein SalI-BamHI-DNA-Fragment.
1A zeigt eine schematische Darstellung der DNA, welche die vollständigen cry1Ac-, cry1Ab- cry1C- und cry1F-Gene codiert, die in pEG854/pEG1064, pEG20, pEG315 bzw. pEG318 enthalten sind. Einmalige Restriktionsstellen, welche bei der Konstruktion von bestimmten Hybridgenen verwendet wurden, sind auch gezeigt. 1B zeigt eine schematische Darstellung von Hybridgenen, welche für die vorliegende Erfindung relevant sind. In einigen Fällen wurde eine übliche PCR^TM-Amplifikation mit mutagenen Oligonucleotidprimern angewendet, um geeignete Restriktionsstellen in DNA-Fragmente einzubauen, welche zur Konstruktion des Hybridgens verwendet wurden. Bestimmte Hybridgen-Konstruktionen konnten nicht durch eine Restriktionsfragment-Subclonierung erhalten werden. In solchen Fällen wurde eine überlappende PCR^TM-Verlängerung (PCR^TM overlap extension, POE) verwendet, um das gewünschte Hybridgen zu konstruieren (Horton et al., 1989). Die folgenden Oligonucleotidprimer (bezogen von Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) wurden verwendet:
Primer A: 5'-GGATAGCACTCATCAAAGGTACC-3' (SEQ ID NO: 1).
Primer B: 5'-GAAGATATCCAATTCGAACAGTTTCCC-3' (SEQ ID NO: 2)
Primer C: 5'-CATATTCTGCCTCGAGTGTTGCAGTAAC-3' (SEQ ID NO: 3)
Primer D: 5'-CCCGATCGGCCGCATGC-3' (SEQ ID NO: 4)
Primer E: 5'-CATTGGAGCTCTCCATG-3' (SEQ ID NO: 5)
Primer F: 5'-GCACTACGATGTATCC-3' (SEQ ID NO: 6)
Primer G: 5'-CATCGTAGTGCAACTCTTAC-3' (SEQ ID NO: 7)
Primer H: 5'-CCAAGAAAATACTAGAGCTCTTGTTAAAAAAGGTGTTCC-3' (SEQ ID NO: 8)
Primer I: 5'-ATTTGAGTAATACTATCC-3' (SEQ ID NO: 23)
Primer J: 5'-ATTACTCAAATACCATTGG-3' (SEQ ID NO: 24)
Primer K: 5'-TCGTTGCTCTGTTCCCG-3' (SEQ ID NO: 31)
Die in 1B beschriebenen Plasmide, welche die erfindungsgemäß relevanten Hybrid-δ-Endotoxin-Gene enthalten, werden nachstehend beschrieben. Die Isolierung oder Reinigung von DNA-Fragmenten, welche mittels Restriktion von Plasmid-DNA, PCR^TM-Amplifikation oder POE erzeugt wurden, verweist auf die aufeinanderfolgende Anwendung einer Agarose-TAE-Gelelektrophorese und die Verwendung des Geneclean Kits (Bio 101) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. pEG1065 wurde durch eine PCR^TM-Amplifikation des cry1F-DNA-Fragments unter Verwendung des Primerpaars A und B und pEG318 als DNA-Matrize konstruiert. Das erhaltene PCR^TM-Produkt wurde isoliert, mit AsuII und KpnI geschnitten und dazu verwendet, das entsprechende AsuII-KpnI-DNA-Fragment in pEG857 zu ersetzen. Das Plasmid pEG1067 wurde mittels POE und unter Verwendung der DNA-Fragmente SauI-KpnI von cry1F und AsuII-ClaI von cry1Ac, welche aus pEG318 bzw. pEG857 isoliert wurden, konstruiert. Das erhaltene POE-Produkt wurde mit dem Primerpaar A und B einer PCR^TM-Amplifikation unterzogen, mit AsuII und KpnI geschnitten und dazu verwendet, das entsprechende AsuII-KpnI-Fragment in pEG857 zu ersetzen.
pEG1068 wurde konstruiert, indem das aus pEG857 isolierte SacI-KpnI-DNA-Fragment von cry1Ac durch das entsprechende SacI-KpnI-DNA-Fragment, welches aus cry1F (pEG318) isoliert worden war, ersetzt wurde. pEG1070 wurde konstruiert, indem das aus pEG1065 isolierte SacI-KpnI-DNA-Fragment durch das entsprechende SacI-KpnI-DNA-Fragment, welches aus cry1Ac (pEG857) isoliert worden war, ersetzt wurde. pEG1072 wurde konstruiert, indem das aus pEG1067 isolierte SacI-KpnI-DNA-Fragment durch das entsprechende SacI-KpnI-DNA-Fragment, welches aus cry1Ac (pEG857) isoliert worden war, ersetzt wurde. pEG1074, pEG1076 und pEG1077 wurden konstruiert, indem das SphI-XhoI-DNA-Fragment aus pEG1064 durch mittels PCR^TM amplifizierte SphI-XhoI-DNA-Fragment aus pEG1065, pEG1067 bzw. pEG1068 unter Verwendung des Primerpaars C und D ersetzt wurde. pEG1089 wurde konstruiert, indem das SphI-SacI-DNA-Fragment von pEG1064 durch das isolierte und mit SphI und SacI geschnittene PCR^TM-Produkt von cry1F welches unter Verwendung des Primerpaars D und E und der Matrize pEG318 erzeugt worden war, ersetzt wurde.
pEG 1091 wurde konstruiert, indem das SphI-SacI-DNA-Fragment von pEG 1064 durch das isolierte und mit SphI und SacI geschnittene PCR^TM-Produkt von cry1C, welches unter Verwendung des Primerpaars D und H und der Matrize pEG315 erzeugt worden war, ersetzt wurde.
pEG1088 wurde mittels POE unter Verwendung eines cry1Ac-DNA-Fragments, welches unter Verwendung des Primerpaars B und F erzeugt wurde, und eines cry1C-DNA-Fragments, welches unter Verwendung des Primerpaars A und G erzeugt wurde, konstruiert. Das SacI-KpnI-Fragment wurde aus dem erhaltenen POE-Produkt isoliert und dazu verwendet, das entsprechende SacI-KpnI-Fragment in pEG1064 zu ersetzen.
pEG365 wurde konstruiert, indem zuerst das SphI-KpnI-DNA-Fragment aus pEG1065 durch das entsprechende cry1Ab-DNA-Fragment, welches aus pEG20 isoliert worden war, ersetzt wurde, um pEG364 zu erhalten. Das SacI-KpnI-DNA-Fragment aus pEG364 wurde dann durch das entsprechende cry1Fb-DNA-Fragment, welches aus pEG318 isoliert worden war, ersetzt.
pEG1092 wurde konstruiert, indem das KpnI-BamHI-DNA-Fragment aus pEG1088 durch das entsprechende DNA-Fragment, welches aus pEG315 isoliert worden war, ersetzt wurde. pEG1092 unterscheidet sich von dem cryAb/cry1C-Hybrid-δ-Endotoxin-Gen, welches in der Internat. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. WO 95/06730 offenbart ist.
pEG1093 wurde konstruiert, indem das SphI-AsuII-DNA-Fragment aus pEG1068 durch das entsprechende SphI-AsuII-DNA-Fragment, welches aus pEG20 isoliert worden war, ersetzt wurde.
pEG378 wurde mittels POE unter Verwendung eines cry1Ac-DNA-Fragments, welches unter Verwendung des Primerpaars B und I und unter Verwendung von pEG857 als Matrize erzeugt wurde, und eines cry1F-DNA-Fragments, welches unter Verwendung des Primerpaars A und J und unter Verwendung von pEG318 als Matrize erzeugt wurde, konstruiert. Das erhaltene POE-Produkt wurde mit AsuII und KpnI geschnitten, und das erhaltene isolierte DNA-Fragment wurde verwendet, um das entsprechende AsuII-KpnI-DNA-Fragment in pEG1064 zu ersetzen.
pEG381 wurde konstruiert, indem das AsuII-XhoI-DNA-Fragment in pEG1064 durch das entsprechende AsuII-XhoI-DNA-Fragment, welches durch die PCR^TM-Amplifikation von pEG378 unter Verwendung des Primerpaars C und K isoliert worden war, ersetzt wurde.
6.2 Beispiel 2 – Herstellung der Hybrid-Toxine in B. thuringiensis
Die Plasmide, welche die in Beispiel 1 beschriebenen Hybrid-Toxine codieren, wurden in B. thuringiensis eingeschleust, wie beschrieben wurde (Mettus und Macalusco, 1990). Die erhaltenen B. thuringiensis-Stämme wurden in 50 ml C-2-Medium gezüchtet, bis die gesamte Kultur Sporen bildete, und anschließend lysiert (etwa 48 h). Da die Kristallbildung eine Voraussetzung für die effiziente kommerzielle Herstellung von δ-Endotoxinen in B. thuringiensis ist, wurde eine mikroskopische Analyse durchgeführt, um Kristalle in den sporenbildenden Kulturen zu identifizieren (Tabelle 5).
Tabelle 5 Kristallbildung durch die Hybrid-δ-Endotoxine
Die δ-Endotoxin-Produktion für einige der in Tabelle 5 aufgeführten B. thuringiensis-Stämme wurde durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), wie durch Baum et al., 1990, beschrieben, untersucht. Ein gleiches Volumen der Kulturen jedes B. thuringiensis-Stamms wurde in C-2-Medium gezüchtet, bis die gesamte Kultur Sporen bildete, und anschließend lysiert. Die Kulturen wurden zentrifugiert, und das Sporen/Kristall-Pellet wurde zweimal mit gleichen Volumina von destilliertem, deionisiertem Wasser gewaschen. Das, am Ende erhaltene Pellet wurde in einem Volumen von 0,005% Triton X-100^® suspendiert, welches der Hälfte des Kulturvolumens entsprach. Ein gleiches Volumen jeder gewaschenen Kultur wurde durch eine SDS-PAGE analysiert, wie in 2 dargestellt ist.
Die Mehrzahl der Hybride, umfassend Cry 1Ac und Cry 1F, bildeten in B. thuringiensis stabile Kristalle. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist EG11088, worin das aktive Toxinfragment dem reziproken Austausch von EG11063 entsprechen würde. Zwei der drei Hybride, umfassend Cry1Ac und Cry1C, EG11087 und EG11090, bildeten in B. thuringiensis keine Kristalle, obwohl diese reziproken Hybride die aktivierten Toxinfragmente der Kristalle bildenden Stämme EG11063 und EG11074 nachahmen.
Jeder der mittels SDS-PAGE untersuchte Stamm erzeugte eine gewisse δ-Endotoxin-Konzentration. Wie erwartet, stellten jedoch solche Kulturen, welche als Kristall-negativ identifiziert wurden, sehr wenig Protein her (z. B. Bahn e: EG11065; Bahn f: EG11067; Bahn j: EG11088; und Bahn k: EG11090). Als Referenz sind typische Ausbeuten für ein kristallbildendes δ-Endotoxin für Cry1Ac (Bahn a) angegeben. Mehrere Hybrid-δ-Endotoxine stellten vergleichbare Proteinkonzentrationen her, einschließlich EG11060 (Bahn b), EG11062 (Bahn c), EG11063 (Bahn d; SEQ ID NO: 10) und EG11074 (Bahn i; SEQ ID NO: 12). Die Daten zeigen deutlich, daß eine effiziente Hybrid-δ-Endotoxin-Herstellung in B. thuringiensis nicht vorhersagbar ist und in Abhängigkeit von den Stamm-δ-Endotoxinen, welche zur Konstruktion des Hybrids verwendet wurden, variiert.
6.3 Beispiel 3 – Proteolytische Prozessierung der Hybrid-δ-Endotoxine
Der proteolytische Abbau der Protoxinform des δ-Endotoxins zu einem stabilen aktiven Toxin erfolgt, sobald die δ-Endotoxin-Kristalle im Mitteldarm der Larve solubilisiert sind. Eine Maßeinheit für die potentielle Aktivität von δ-Endotoxinen ist die Stabilität des aktiven δ-Endotoxins in einer proteolytischen Umgebung. Um die proteolytische Empfindlichkeit der Hybrid-δ-Endotoxine zu untersuchen, wurden das solubilisierte Toxin einem Trypsinverdau unterzogen. Die δ-Endotoxine wurden aus sporenbildenden B. thuringiensis-Kulturen gereinigt und quantifiziert, wie beschrieben wurde (Chambers et al., 1991). Genau 250 μg jedes Hybrid-δ-Endotoxin-Kristalls wurden in 30 mM NaHCO₃, 10 mM DTT (Gesamtvolumen 0,5 ml) solubilisiert. Das Trypsin wurde zu dem solubilisierten Toxin in einem Verhältnis von 1 : 10 zugegeben. Nach geeigneten Zeiträumen wurden 50 μl-Aliquots entnommen und in 50 μl Laemmli-Puffer überführt, für 3 min auf 100°C erhitzt und in einem Trockeneis-Ethanol-Bad zur nachfolgenden Analyse eingefroren. Die Trypsin-Spaltprodukte der solubilisierten Toxine wurden durch eine SDS-PAGE analysiert, und die Menge des aktiven δ-Endotoxins zu jedem Zeitpunkt wurde mittels Densitometrie quantifiziert. Eine graphische Darstellung der Ergebnisse aus diesen Untersuchungen ist in 3 gezeigt.
Das Wildtyp-Cry1Ac wird schnell zu dem aktiven δ-Endotoxin-Fragment prozessiert, welches für die Dauer der Untersuchung stabil ist. Die Hybrid-δ-Endotoxine aus EG11063 und EG11074 werden auch zu aktiven δ-Endotoxin-Fragmenten prozessiert, welche für die Dauer der Untersuchung stabil sind. Die Prozessierung des EG11063- δ-Endotoxins läuft langsamer ab, und zu jedem Zeitpunkt verbleibt ein höherer Prozentsatz dieses aktiven δ-Endotoxin-Fragments. Obwohl die Hybrid-δ-Endotoxine aus EG11060 und EG11062 zu aktiven δ-Endotoxin-Fragmenten prozessiert werden, sind diese Fragmente gegen eine weitere Spaltung empfindlicher und werden in unterschiedlichen Geschwindigkeiten während des Verlaufs der Untersuchung abgebaut. Die 5'-Austauschstellen zwischen cry1Ac und cry1F für die EG11062- und EG11063-δ-Endotoxine ergeben Toxine, welche sich nur durch 21 Aminosäurereste unterscheiden (vgl. 1). Jedoch wird die Wichtigkeit der Beibehaltung von Cry1Ac-Sequenzen an diesen Positionen durch den viel schnelleren Abbau des EG11062-δ-Endotoxins offensichtlich. Diese Daten zeigen, daß verschiedene Hybrid-δ-Endotoxine, welche unter Verwendung derselben Stamm-δ-Endotoxine konstruiert wurden, sich hinsichtlich der biochemischen Eigenschaften, wie der proteolytischen Stabilität, wesentlich unterscheiden können.
6.4 Beispiel 4 – Bioaktivität der Hybrid-δ-Endotoxine
B. thuringiensis-Kulturen, die das gewünschte δ-Endotoxin exprimieren, wurden gezüchtet, bis alle Zellen eine Sporenbildung zeigten, und anschließend lysiert und gewaschen, wie in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die δ-Endotoxin-Konzentrationen für jede Kultur wurden durch eine SDS-PAGE quantifiziert, wie beschrieben wurde (Baum et al., 1990). Im Falle von Bioassay-Screenings wurde eine einzige geeignete Konzentration jeder gewaschenen δ-Endotoxin-Kultur topisch in 32 Vertiefungen, enthaltend 1,0 ml Nahrungsersatz pro Vertiefung (Oberfläche 175 mm²), eingebracht. Eine einzelne frisch geschlüpfte Larve wurde in jede der behandelten Vertiefungen gelegt, und die Schale wurde mit einem durchsichtigen, perforierten Mylarfilm abgedeckt. Die Larvenmortalität wurde nach 7-tägiger Fütterung beurteilt, und die Mortalität in Prozent wurde als das Verhältnis der Anzahl der toten Larven zu der Gesamtanzahl an behandelten Larven, 32, ausgedrückt.
Im Falle von LC₅₀-Bestimmungen (δ-Endotoxin-Konzentration, die eine Mortalität von 50% ergibt) wurden δ-Endotoxine aus den B. thuringiensis-Kulturen gereinigt und quantifiziert, wie durch Chambers et al. (1991) beschrieben wurde. Acht Konzentrationen der δ-Endotoxine wurden durch serielle Verdünnung in 0,005% Triton X-100^® hergestellt, und jede Konzentration wurde topisch in Vertiefungen, enthaltend 1,0 ml Nahrungsersatz, eingebracht. Die Larvenmortalität wurde nach 7-tägiger Fütterung beurteilt (32 Larven für jede δ-Endotoxin-Konzentration). In allen Fällen diente das Verdünnungsmittel als Kontrolle.
Ein Vergleich der Cry1A/Cry1F-Hybrid-Toxine durch Bioassay-Screenings ist in Tabelle 6 gezeigt. Die Hybrid-δ-Endotoxine aus den Stämmen EG11063 und EG11074 behalten die Aktivitäten der Stamm-Cry1Ac- und -Cry1F-δ-Endotoxine bei. Außerdem behält das Hybrid-δ-Endotoxin aus EG11735 die Aktivität seiner Stamm-Cry1Ab- und -Cry1F-δ-Endotoxine bei. Die durch die Stämme EG11061, EG11062, EG11071 und EG11073 hergestellten δ-Endotoxine besitzen keine Insektizidaktivität gegenüber den getesteten Insektenlarven, obwohl sie (1) mindestens ein Stamm-δ-Endotoxin umfassen, welches gegenüber den angegebenen Larven aktiv ist, und (2) stabile, gut definierte Kristalle in B. thuringiensis bilden. Diese Ergebnisse veranschaulichen die nicht vorhersagbaren Eigenschaften von Hybrid-Toxin-Konstruktionen.
Für die Daten in Tabelle 6 wurden alle Stämme als gewaschene, sporenbildende Kulturen getestet. Für jedes getestete Insekt wurden äquivalente Mengen der δ-Endotoxine verwendet, und die Insektizidaktivität wurde auf den Stamm bezogen, der die höchste Mortalität in Prozent zeigt (++++).
Tabelle 6 Bioassay-Screenings von Cry1A/Cry1F-Hybrid-δ-Endotoxinen
Die in 1 beschriebenen δ-Endotoxine und die in Bioassay-Screenings gezeigte Insektizidaktivität wurden in Form von gereinigten Kristallen untersucht, um deren LC₅₀-Werte zu bestimmen (vgl. Tabelle 7). Die aus den Stämmen EG11063, EG11074, EG11091 und EG11735 gereinigten δ-Endotoxine zeigen alle eine erhöhte Aktivität gegenüber dem Heerwurm (S. frugiperda und S. exigua) im Vergleich zu irgendeinem der getesteten Wildtyp-δ-Endotoxine. Die EG11063- und EG11074-δ-Endotoxine ergeben identische aktive Toxinfragmente (1B), wie durch ihre ähnlichen LC₅₀-Werte bei den untersuchten Insekten erkennbar ist. Ein unerwartetes Ergebnis, welches aus diesen Daten offensichtlich wird, ist, daß ein Hybrid-δ-Endotoxin wie EG11063, EG11092, EG11074, EG11735 oder EG11751 die Aktivität seiner jeweiligen Stamm-δ-Endotoxine beibehalten kann und gegenüber von bestimmten Insekten wie S. exigua eine viel höhere Aktivität als jedes Stamm-δ-Endotoxin zeigen kann. Dieses breite Spektrum der Insektizidaktivität bei ähnlichen oder geringeren Dosen als bei den Stamm-δ-Endotoxinen, zusammen mit der Konzentration der Toxinproduktion des Wildtyps (Beispiel 2), machen diese Proteine für die Herstellung in B. thuringiensis besonders geeignet. Obwohl das aus EG11091 abgeleitete δ-Endotoxin eine bessere Aktivität gegenüber S. frugiperda und S. exigua zeigt als seine Stamm-δ-Endotoxine, hat es die Aktivität gegenüber H. virescens und H. zea, welche dem Cry1Ac-Stamm-Toxin zuzuschreiben ist, verloren. Dieser begrenzte Wirtsbereich, zusammen mit einer geringeren Toxinausbeute, welche für das EG11091-δ-Endotoxin beobachtet wurde (Beispiel 2), machen es für Herstellung in B. thuringiensis weniger zugänglich.
Tabelle 7 LC₅₀-Werte für die gereinigten Hybrid-δ-Endotoxine^a
In Tabelle 7 sind die LC₅₀-Werte in Nanogramm gereinigtem δ-Endotoxin pro Vertiefung (175 mm²) ausgedrückt und entsprechen den zusammengenommen Werten für 2 bis 6 Wiederholungsversuchen. N. D. = Nicht bestimmt.
Tabelle 8 beschreibt die DNA-Sequenzen, welche die 5'- und 3'-Austauschstellen der erfindungsgemäß relevanten Hybrid-δ-Endotoxine umgeben. Wie durch die SEQ ID NO: erkennbar ist, haben bestimmte Hybrid-δ-Endotoxine gemeinsame Austauschstellen.
Zur Untersuchung des Effekt von anderen kleinen Veränderungen in der Austauschstelle, welche für die Konstruktion des Hybrid-Endotoxins ausgewählt wird, wurde die Aktivität von EG11751 und EG11063 gegenüber S. exigua und H. zea verglichen (Tabelle 9). Die Daten zeigen deutlich, daß die Eigenschaften des Hybrid-Endotoxins verbessert werden können, indem die Austauschstelle zwischen den zwei Stamm-δ-Endotoxinen verändert wird. In diesem Beispiel wurde die Austauschstelle in dem EG11751-δ-Endotoxin um 75 Basenpaare in 3'-Richtung verschoben, verglichen mit dem EG11063-δ-Endotoxin, wobei eine verbesserte Insektizidaktivität erhalten wird. Obwohl keine wesentliche Verbesserung der Aktivität gegenüber S. exigua zwischen EG11063 und EG11751 beobachtet wird, wird eine wesentliche Verbesserung der H. zea-Aktivität um beinahe das 4fache für EG11751 beobachtet. Es ist wichtig anzumerken, daß Verbesserungen im Hinblick auf die Bioaktivität von Hybrid-δ-Endotoxinen durch eine Veränderung der Austauschstellen nicht vorhersagbar sind. Im Falle von EG11062 hebt die Verschiebung der Austauschstelle um 63 Basenpaare 5' zu der EG11063-Austauschstelle die Insektizidaktivität auf, wie in Tabelle 8 gezeigt ist.
Tabelle 9 Bioaktivität von EG11063 und EG11751
Um den Effekt von Veränderungen in der Austauschstelle für Hybrid-δ-Endotoxine weiter zu untersuchen, wurde das durch pEG381 codierte Hybrid-δ-Endotoxin mit denen verglichen, welche durch pEG378 und pEG1068 codiert werden. In diesem Beispiel wurde die 3'-Austauchstelle für das durch pEG381 codierte Hybrid-δ-Endotoxin im Vergleich zu dem pEG378-Hybrid-δ-Endotoxin um 340 Basenpaare in 5'-Richtung verschoben. Die Daten in Tabelle 9 zeigen, daß diese Veränderung eine Erhöhung der Aktivität gegenüber S. frugiperda-Aktivität im Vergleich zu den durch pEG378 und pEG1066 codierten δ-Endotoxinen zur Folge hatte, während die erhöhte Aktivität beibehalten wird, welche für das durch pEG381 codierte δ-Endotoxin im Vergleich zu dem durch pEG1068 codierten δ-Endotoxin beobachtet wurde (vgl. Tabelle 8). Dieses Ergebnis ist unerwartet, da das aus der Proteolyse der codierten δ-Endotoxine von pEG378 und pEG381 erhaltene aktivierte Toxin identisch sein sollte. Dieses Beispiel zeigt ferner, daß Austauschstellen innerhalb des Protoxinfragments von δ-Endotoxinen eine große Auswirkung auf die Insektizidaktivität haben können.
Tabelle 10 Bioaktivität von Toxinen welche durch pEG378, pEG381 und pEG1068 codiert werden
6.5 Beispiel 5 – Aktivität der Hybrid-Toxine gegenüber anderen Schädlingen
Die erfindungsgemäßen Toxine wurden auch gegenüber anderen Schädlingen getestet, einschließlich des südwestlichen Maisbohrers und zwei gegenüber der Sojabohne aktiven Schädlingen. Die Toxinproteine wurden solubilisiert, zu der Nahrung zugesetzt und in einem Bioassay gegen die Zielschädlinge getestet. Die Hybrid-Toxine zeigten bei allen drei Schädlingen eine sehr wirksame Bekämpfung.
Tabelle 11 LC₅₀- und EC₅₀-Bereiche von Hybrid-Toxinen beim südwestlichen Maisbohrer^1,2
Tabelle 12 LC₅₀-Werte von chimären Kristallproteinen bei Sojabohnenschädlingen¹
6.6 Beispiel 6 – Aminosäuresequenzen der neuen Kristallproteine 6.6.1 Aminosäuresequenz des EG11063-Kristallproteins (SEQ ID NO: 10)
6.6.2 Aminosäuresequenz des EG11074-Kristallproteins (SEQ ID NO: 12)
6.6.3 Aminosäuresequenz des EG11735-Kristallproteins (SEQ ID NO: 14)
6.6.4 Aminosäuresequenz des EG11092-Kristallproteins (SEQ ID NO: 26)
6.6.5 Aminosäuresequenz des EG11751-Kristallproteins (SEQ ID NO: 28)
6.6.6 Aminosäuresequenz des EG11091-Kristallproteins (SEQ ID NO: 30)
6.6.7 Aminosäuresequenz des EG11768-Kristallproteins (SEQ ID NO: 34)
6.7 Beispiel 7 – DNA-Sequenzen, welche die neuen Kristallproteine codieren 6.7.1 DNA-Sequenz codierend das EG11063-Kristallprotein (SEQ ID NO: 9)
6.7.2 DNA-Sequenz, codierend das EG11074-Kristallprotein (SEQ ID NO: 11)
6.7.3 DNA-Sequenz, codierend das EG11735-Kristallprotein (SEQ ID NO: 13)
6.7.4 DNA-Sequenz, codierend das EG11092-Kristallprotein (SEQ ID NO: 25)
6.7.5 DNA-Sequenz, codierend das EG11751-Kristallprotein (SEQ ID NO: 27)
6.7.6 DNA-Sequenz, codierend das EG11091-Kristallprotein (SEQ ID NO: 29)
6.7.7 DNA-Sequenz, codierend das EG11768-Kristallprotein (SEQ ID NO: 33)
6.8 Beispiel 8 – Isolierung von transgenen Pflanzen, welche gegen Cry*-Varianten resistent sind
6.8.1 Pflanzengenkonstruktion
Die Expression eines Pflanzengens, welches in Form einer doppelsträngigen DNA vorliegt, beinhaltet die Transkription einer Boten-RNA (mRNA) von einem Strang der DNA durch ein RNA-Polymeraseenzym und die anschließende Prozessierung des primären mRNA-Transkripts innerhalb des Kerns. An der Prozessierung beteiligt ist eine 3'-nichttranslatierte Region, die Polyadenylatnucleotide an das 3'-Ende der RNA anhängt. Die Transkription von DNA in eine mRNA wird durch eine DNA-Region reguliert, welche üblicherweise als "Promotor" bezeichnet wird. Die Promotorregion enthält eine Basensequenz, welche der RNA-Polymerase das Signal gibt, sich an die DNA anzulagern und die Transkription einer mRNA unter Verwendung von einem der DNA-Stränge als eine Matrize zu initiieren, um einen entsprechenden RNA-Strang herzustellen.
Eine Reihe von Promotoren, welche in Pflanzenzellen aktiv sind, ist in der Literatur beschrieben worden. Solche Promotoren können aus Pflanzen oder Pflanzenviren erhalten werden und schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, die Nopalinsynthase (NOS)- und Octopinsynthase (OCS)-Promotoren (welche auf tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens getragen werden), die Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-19S- und -35S-Promotoren, den durch Licht induzierbaren Promotor aus der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase (ssRUBISCO, ein in sehr großer Zahl vorkommendes Pflanzen-Polypeptid) und den Braunwurzmosaikvirus (FMV)- 35S-Promotor ein. Alle diese Promotoren sind verwendet worden, um verschiedene Arten von DNA-Konstrukten zu erzeugen, die in Pflanzen exprimiert worden sind (vgl. z. B. US-Patent Nr. 5,463,175.
Der einzelne ausgewählte Promotor sollte fähig sein, eine ausreichende Expression der das Enzym codierenden Sequenz zu bewirken, um die Herstellung einer wirksamen Menge des Proteins zu erreichen. Eine Reihe von bevorzugten Promotoren sind konstitutive Promotoren, wie die CaMV35S- oder FMV35S-Promotoren, welche in den meisten Pflanzenorganen hohe Expressionsrate ergeben (US-Patent Nr. 5,378,619, hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen). Eine andere Gruppe von bevorzugten Promotoren sind die in Wurzeln vermehrt vorkommenden oder wurzelspezifischen Promotoren, wie der CaMV-gesteuerte 4-as-1-Promotor oder der Weizen POX1-Promotor (US-Patent Nr. 5,023,179, hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen; Hertig et al., 1991). Die in Wurzeln vermehrt vorkommenden oder wurzelspezifischen Promotoren werden zur Bekämpfung des Maiswurzelwurms (Diabroticus sp.) in transgenen Maispflanzen besonders bevorzugt.
Die in den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten (d. h. chimären Pflanzengenen) verwendeten Promotoren können gegebenenfalls modifiziert werden, um ihre Kontrolleigenschaften zu beeinflussen. Zum Beispiel kann der CaMV35S-Promotor mit dem Teil des ssRUBISCO-Gens ligiert werden, der die Expression von ssRUBISCO in Abwesenheit von Licht unterdrückt, um einen Promotor zu erzeugen, der in Blättern, aber nicht in Wurzeln aktiv ist. Der erhaltene chimäre Promotor kann verwendet werden, wie hierin beschrieben ist. Für die Zwecke dieser Beschreibung schließt der Ausdruck "CaMV35S"-Promotor folglich Variationen eines CaMV35S-Promotors ein, z. B. Promotoren, welche mittels Ligierung mit Operatorregionen, einer zufälligen oder kontrollierten Mutagenese, etc. abgeleitet werden. Ferner können die Promotoren so verändert werden, daß sie mehrere "Enhancersequenzen" enthalten, um die Erhöhung der Genexpression zu begünstigen.
Die durch ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt hergestellte RNA enthält auch eine 5'-nichttranslatierte Leadersequenz. Diese Sequenz kann aus dem Promotor abgeleitet sein, welcher für die Expression des Gens ausgewählt wurde, und kann spezifisch modifiziert werden, um die Translation der mRNA zu verstärken. Die 5'-nichttranslatierten Regionen können auch aus viralen RNAs, aus geeigneten eukaryontischen Genen oder aus einer synthetischen Gensequenz erhalten werden. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Konstrukte begrenzt, worin die nichttranslatierte Region aus der 5'-nichttranslatierten Sequenz, die mit der Promotorsequenz verbunden ist, abgeleitet ist.
Für eine optimale Expression in einkeimblättrigen Pflanzen wie Mais sollte auch ein Intron in das DNA-Expressionskonstrukt eingeschlossen werden. Dieses Intron wird typischerweise in der Nähe des 5'-Endes der mRNA in der nichttranslatierten Sequenz eingebracht. Dieses Intron könnte, aber ist nicht darauf beschränkt, aus eine Reihe von Introns, welche das Mais-hsp70-Intron ausmachen (US-Patent Nr. 5,424,412, hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen), oder dem Reis-ActI-Intron (McElroy et al., 1990) erhalten werden. Wie nachstehend gezeigt, ist das Mais-hsp 70-Intron in der vorliegenden Erfindung nützlich.
Wie oben angemerkt, enthält die 3'-nichttranslatierte Region der erfindungsgemäßen chimären Pflanzengene ein Polyadenylierungssignal, welches in Pflanzen wirksam ist, um die Addition von Adenylatnucleotiden an das 3'-Ende der RNA zu bewirken. Beispiele für bevorzugte 3'-Regionen sind (1) die 3'-transkribierten, nichttranslatierten Regionen, enthaltend das Polyadenylierungssignal von tumorinduzierenden (Ti)-Plasmidgenen aus Agrobacterium, wie das Nopalinsynthase (NOS)-Gen, und (2) Pflanzengene wie das ssRUBISCO-E9-Gen der Erbse (Fischhoff et al., 1987).
6.8.2 Pflanzentransformation und Expression
Ein chimäres Transgen, enthaltend eine strukturelle codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung, kann durch ein geeignetes Verfahren, wie die hierin ausführlich beschriebenen, in das Genom einer Pflanze inseriert werden. Geeignete Pflanzentransformationsvektoren schließen die aus einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleiteten, sowie die z. B. durch Herrera-Esterella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) und die Eur. Pat. Anmeldg. Veröffentl.-Nr. EP 0120516 offenbarten ein. Zusätzlich zu den aus dem Ti-Plasmid oder dem die Wurzelbildung induzierenden (Ri)-Plasmid von Agrobacterium abgeleiteten Pflanzentransformationsvektoren können andere Verfahren angewendet werden, um die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte in Pflanzenzellen zu inserieren. Solche Verfahren können zum Beispiel die Verwendung von Liposomen, die Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme von freier DNA erhöhen, die Übertragung von freier DNA mittels Mikroprojektilbeschuß und die Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen einschließen (Fromm et al., 1986; Armstrong et al., 1990; Fromm et al., 1990).
6.8.3 Konstruktion von Pflanzentransformationsvektoren für Cry*-Transgene
Für die wirksame Expression der hierin offenbarten cry*-Varianten in transgenen Pflanzen muß das Gen, welches die Varianten codiert, eine geeignete Sequenzzusammenstellung aufweisen (Diehn et al., 1996).
Um ein cry*-Gen in einen Vektor einzubringen, welcher für die Expression in einkeimblättrigen Pflanzen geeignet ist (d. h. unter der Kontrolle des verstärkten Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotors und verknüpft mit dem hsp70-Intron, gefolgt durch eine Nopalinsynthase-Polyadenylierungsstelle, so wie in US-Patent Nr. 5,424,412; hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen), wird der Vektor mit geeigneten Enzymen wie NcoI und EcoRI geschnitten. Die größere Vektorbande von etwa 4,6 kb wird dann einer Elektrophorese unterzogen, gereinigt und mit Hilfe der T4-DNA-Ligase mit dem geeigneten Restriktionsfragment, welches das botanisierte cry*-Gen enthält, ligiert. Das Ligie rungsgemisch wird dann in E. coli transformiert, Carbenicillin-resistente Kolonien werden gewonnen, und die Plasmid-DNA wird durch DNA-Minipräp-Verfahren gewonnen. Die DNA kann dann einer Restriktionsendonuclease-Analyse mit Enzymen wie NcoI und EcoRI (zusammen), NotI und PstI unterzogen werden, um Clone zu identifizieren, welche die das cry*-Gen codierende Sequenz, verknüpft mit dem hsp70-Intron, unter der Kontrolle des verstärkten CaMV35S-Promotors enthalten.
Um das Gen in einen Vektor einzubringen, der für die Gewinnung von stabil transformierten und insektenresistenten Pflanzen geeignet ist, kann das Restriktionsfragment aus pMON33708, enthaltend die Lysinoxidase codierende Sequenz, verknüpft mit dem hsp70-Intron, unter der Kontrolle des verstärkten CaMV35S-Promotors, mittels Gelelektrophorese und einer Reinigung isoliert werden. Dieses Fragment kann dann mit einem Vektor wie pMON30460 ligiert werden, welcher mit NotI und der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm behandelt wurde (pMON30460 enthält die codierende Sequenz für die Neomycin-Phosphotransferase unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors). Kanamycin-resistente Kolonien können dann durch Transformation dieses Ligierungsgemisches in E. coli erhalten werden, und Kolonien, welche das resultierende Plasmid enthalten, können durch einen Restriktionsendonucleaseverdau von Plasmid-Minipräp-DNAs identifiziert werden. Restriktionsenzyme wie NotI, EcoRV, HindIII, NcoI, EcoRI und BglII können verwendet werden, um die geeigneten Clone zu identifizieren, die das Restriktionsfragment richtig inseriert in die entsprechende Stelle von pMON30460 in einer solchen Orientierung enthalten, daß beide Gene in einer Tandemanordnung vorliegen (d. h. das 3'-Ende der cry*-Gen-Expressionskassette ist mit dem 5'-Ende der nptII-Expressionskassette verknüpft). Die Expression des Cry*-Proteins durch den erhaltenen Vektor wird dann in Pflanzenprotoplasten durch Elektroporation des Vektors in Protoplasten, gefolgt durch einen Protein-Blot und eine ELISA-Analyse, bestätigt. Dieser Vektor kann in die genomische DNA von Pflanzenembryonen wie Mais durch Teilchenkanonenbeschuß, gefolgt durch eine Paromomycin-Selektion, um Maispflanzen zu erhalten, welche das cry*-Gen exprimieren, im wesentlichen wie beschrieben in US-Patent Nr. 5,424,412, hierin unter Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen, eingeschleust werden. In diesem Beispiel wurde der Vektor durch den gleichzeitigen Beschuß mit einem Plasmid, welches eine Hygromycin-Resistenz überträgt, in unreife Embryonen-Scutella von Mais, gefolgt durch eine Hygromycin-Selektion und Regeneration, eingeschleust. Transgene Maislinien, welche das cry*-Protein exprimieren, werden dann durch eine ELISA-Analyse identifiziert. Aus Samen gezogene Nachkommen dieser Ereignisse werden dann anschließend auf einen Schutz vor einer Anfälligkeit gegen Insektfraß getestet.
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Alle der hierin offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können im Hinblick auf die vorliegende Offenbarung ohne unnötiges Experimentieren hergestellt bzw. ausgeführt werden. Obwohl die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist den Fachleuten bewußt, daß Variationen hinsichtlich der Zusammensetzungen und Verfahren sowie der Schritte oder der Reihenfolge von Schritten des hierin beschriebenen Verfahrens vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Insbesondere ist erkennbar, daß bestimmte Mittel, welche sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, die hierin beschriebenen Mittel ersetzen können, während die gleichen oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Alle solche ähnlichen Ersatzstoffe und Modifikationen, welche für die Fachleute offensichtlich sind, sind im Schutzumfang der Erfindung, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert, eingeschlossen.
8.0 Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Nukleinsäuresegment, umfassend ein Gen, welches ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 kodiert.
Nukleinsäuresegment nach Anspruch 1, worin das Gen ein Polypeptid mit einer Insektizidaktivität gegenüber Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea oder Ostrinia nubilalis kodiert.
Nukleinsäuresegment nach Anspruch 2, worin das Nukleinsäuresegment aus dem Bacillus thuringiensis-Stamm NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 oder NRRL B-21781 isolierbar ist.
Nukleinsäuresegment nach Anspruch 3, worin das Nukleinsäuresegment spezifisch zu einem Nukleinsäuresegment, welches eine Sequenz von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33 darstellt oder komplementär dazu ist, hybridisiert.
Nukleinsäuresegment nach Anspruch 4, worin das Nukleinsäuresegment die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 33, oder ein Komplement dazu umfasst.
Nukleinsäuresegment nach Anspruch 5, worin das Gen funktionsfähig an einen Promotor, welcher das Gen in einer Wirtzelle exprimiert, gebunden ist.
Rekombinanter Vektor, umfassend das Nukleinsäuresegment des Anspruchs 6.
Verwendung eines Nukleinsäuresegments gemäß Anspruch 6 zur Herstellung einer insektenresistenten transgenen Pflanze.
Verwendung des Nukleinsäuresegments gemäß Anspruch 6, umfassend das Exprimieren des Gens in einer Wirtzelle und Sammeln des exprimierten Polypeptids.
Verwendung des Nukleinsäuresegments gemäß Anspruch 6 zur Herstellung einer rekombinanten Polypeptidzusammensetzung.
Wirtzelle nach Anspruch 9, worin die Wirtzelle eine Bakterienzelle ist.
Wirtzelle nach Anspruch 11, worin die Zelle eine E. coli-, B. thuringiensis-, B. subtilis-, B. megaterium- oder eine Pseudomonas spp.-Zelle ist.
Wirtzelle nach Anspruch 12, worin die Zelle ein B. thuringiensis-Stamm NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 oder NRRL B-21781 ist.
Wirtzelle nach Anspruch 9, worin die Wirtzelle eine Pflanzenzelle ist.
Wirtzelle nach Anspruch 14, worin die Zelle ein Polypeptid mit Insektizidaktivität gegenüber Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea oder Ostrinia nubilalis bildet.
Verwendung einer Wirtzelle gemäß Anspruch 15 zur Herstellung einer transgenen Pflanze.
Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin das Polypeptid gegenüber Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea oder Ostrinia nubilalis insektizide Wirkung aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin das Polypeptid aus dem Bacillus thuringiensis-Stamm NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 oder NRRL B-21781 isolierbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin das Polypeptid 0,5 Gew.-% bis 99 Gew.-% der Zusammensetzung, vorzugsweise 50 Gew.-% bis 99 Gew.-% der Zusammensetzung umfasst.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, herstellbar mittels eines Verfahrens, umfassend die Schritte: (a) Kultivierung einer Zelle eines B. thuringiensis-Stamms NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 oder NRRL B-21781 unter Bedingungen, welche zur Bildung einer Zusammensetzung, welche ein B. thuringiensis-Polypeptid von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 oder SEQ ID NO: 34 umfasst, mit Insektizidwirksamkeit in der Lage sind; (b) Erhalten der Zusammensetzung aus der Zelle.
Verwendung einer Zusammensetzung mit Insektizidaktivität gemäß Anspruch 21 zur Herstellung einer Pflanzenschutzsprühzubereitung.
Verfahren zur Herstellung eines B. thuringiensis-Kristallproteins, umfassend: (a) Kultivierung einer Zelle eines B. thuringiensis-Stamms NRRL B-21579, NRRL B-21580, NRRL B-21581, NRRL B-21635, NRRL B-21636 oder NRRL B-21781 unter Bedingungen, welche zur Herstellung eines B. thuringiensis-Kristallproteins mit Insektizidaktivität wirksam sind; und (b) Erhalt des B. thuringiensis-Kristallproteins aus der Zelle, worin das Kristallprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 34.
Verfahren zum Abtöten einer Insektenzelle, umfassend das Bereitstellen einer insektizidwirksamen Menge einer Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 17 bis 21 in einer Insektenzelle.
Verfahren nach Anspruch 24, worin die Insektenzelle in einem Insekt umfasst ist.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das Insekt die Zusammensetzung durch Einnahme einer mit der Zusammensetzung beschichteten Pflanze zu sich nimmt.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das Insekt die Zusammensetzung durch Einnahme einer transgenen Pflanze, welche die Zusammensetzung exprimiert, zu sich nimmt.
Transgene Pflanze oder Samen davon mit in deren/dessen Genom eingefügtem Transgen, welches ein Polypeptid kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 34.
Transgene Pflanze oder Samen davon nach Anspruch 28, worin das Transgen die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQID NO: 25, SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 33 umfasst.