BR9713219B1

BR9713219B1 - vetor recombinante, célula hospedeira de microorganismo recombinante, método de uso de um segmento de ácido nucléico, método para detectar uma sequência de ácidos nucléicos codificando uma proteìna cristal, composição e método para preparar uma proteìna cristal.

Info

Publication number: BR9713219B1
Application number: BRPI9713219-5A
Authority: BR
Inventors: William P Donovan; Judith C Donovan; Annette C Slaney
Priority date: 1996-09-24
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2010-11-30
Also published as: WO1998013498A1; US6063756A; DE69735776D1; CA2267665A1; AR010993A1; TR199900650T2; CN100473725C; EP1015592A1; ATE324447T1; AR054156A2; US6399330B1; KR20000048593A; PL189474B1; EP1015592B1; MXPA99002819A; US20060051822A1; CA2267665C; US6949626B2; US20030144192A1; PL332414A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETOR RE-COMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICROORGANISMO RE-COMBINANTE, MÉTODO DE USO DE UM SEGMENTO DE ÁCIDO NU-CLÉICO, MÉTODO PARA DETECTAR UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDOSNUCLÉICOS CODIFICANDO UMA PROTEÍNA CRISTAL, COMPOSIÇÃOE MÉTODO PARA PREPARAR UMA PROTEÍNA CRISTAL".

1. Fundamentos da Invenção

A presente invenção é um pedido de continuação em parte combase na Patente US Série Número 08/718.905, depositado em 24 de setem-bro de 1996, cujo teor completo encontra-se especificamente aqui incorpo-rado a título de referência.

1.1 Campo da Invenção

A presente invenção refere-se em geral aos campos da biologiamolecular. Mais particularmente, certas modalidades referem-se a métodose composições compreendendo segmentos de DNA1 e proteínas derivadasde espécies bacterianas. Mais particularmente, ela se refere a novos genescryET33 e CryET34 do Bacillus thuringiensis codificando proteínas cristaistóxicas para coleópteros. São apresentados vários métodos para fazer e u-sar esses segmentos de DNA1 segmentos de DNA codificando proteínas Crysinteticamente modificadas e proteínas cristais nativas e sintéticas, tais co-mo, por exemplo, o uso de segmentos de DNA como sondas de diagnósticoe moldes para produção de proteínas, e o uso de proteínas, carreadores deproteína de fusão e peptídios em várias aplicações imunológicas e diagnos-ticas. São também apresentados métodos para fazer e usar segmentos deácidos nucléicos no desenvolvimento de células de planta transgênica con-tendo os segmentos de DNA aqui apresentados.

1.2 Descrição da Técnica Correlata

1.2.1 Proteínas cristais de Bacillus thuringiensis

Uma das características singulares do B. thuringiensis é suaprodução de proteínas cristais durante a esporulação que são especifica-mente tóxicas para determinadas ordens e espécies de insetos. Muitascepas diferentes de B. thuringiensis mostraram produzir proteínas cristaisinseticidas. Composições incluindo cepas de B. thuringiensis que produzemproteínas inseticidas tendo atividade inseticida contra insetos lepidópteros edípteros encontram-se comercialmente disponíveis e são usadas como in-seticidas ambientalmente aceitáveis porque são bastante tóxicas para o in-seto-alvo específico, mas são inofensivas para as plantas e outros organis-mos não-alvos.

O mecanismo de atividade inseticida das proteínas cristais de B.thuringiensis foi extensamente estudado na década passada. Foi mostradoque as proteínas cristais são tóxicas para o inseto apenas depois da inges-tão da proteína pelo inseto. O pH alcalino e enzimas proteolíticas no intesti-no médio do inseto solubilizam as proteínas, dessa forma permitindo a libe-ração de componentes que são tóxicos para o inseto. Estes componentestóxicos rompem as células do intestino médio fazendo com que o inseto dei-xe de se alimentar e, eventualmente, levam o inseto à morte. Por este moti-vo, o B. thuringiensis mostrou ser inseticida eficaz e ambientalmente seguroem se tratando de várias pragas de insetos.

Como observado por Hofte et al. (1989), a maioria das cepasde B. thuringiensis são ativas contra insetos da ordem dos Lepidópteros,isto é insetos de lagartas. Outras cepas de B. thuringiensis são insetici-damente ativas contra insetos da ordem dos Dípteros, isto é, moscas emosquitos, ou contra ambos os tipos de insetos lepidópteros e dípteros.Nos últimos anos, algumas cepas de B. thuringiensis foram apresentadascomo produtoras de proteínas cristais que são tóxicas para insetos daordem dos Coleópteros, isto é, besouros (Krieg et al., 1983; Sick et al.,1990; Lambert et al., 1992).

1.2.2 Proteínas Cristais enéticas

Inúmeros genes codificando proteínas cristais foram clonadosde várias cepas de B. thuringiensis. A revisão feita por Hõfte et al. (1989)discute os genes e proteínas que foram identificados em B. thuringiensisantes de 1990, e apresenta a nomenclatura e o esquema de classificaçãoque vem sendo tradicionalmente aplicado aos genes e proteínas de B. thu-ringiensis. Genes cry\ codificam proteínas Cryl tóxicas para lepidópteros.Genes cryll codificam proteínas Cryll que são tóxicas tanto para lepidópte-ros como para dípteros. Genes crylll codificam proteínas Crylll tóxicas paracoleópteros, ao passo que genes crylV codificam proteínas CryIV tóxicaspara dípteros.

Recentemente foi proposta uma nova nomenclatura que classifi-ca sistematicamente os genes cry tendo por base a homologia de seqüên-cias de DNA ao invés de as especificidades do inseto. Este esquema declassificação está resumido na Tabela 1.Tabela 1

Nomenclatura revisada de δ-endotoxinas de B. thuringiensis

<table>table see original document page 5</column></row><table>Tabela 1 - continuação

<table>table see original document page 6</column></row><table>

a Adaptado de: http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/8ac/7/í;sthuringiensisl index.html

1.2.3 Identificação de proteínas cristais tóxicas para insetos coleópteros

A utilidade de proteínas cristais bacterianas como inseticidas foiampliada quando foi relatado o primeiro isolamento de uma cepa de B. thu-ringiensis tóxica para coleópteros (Kreig et al., 1983; 1984). Esta cepa (des-crita na Patente US N0 4.766.203, especificamente aqui incorporada a títulode referência), designada B. thuringiensis var. tenebrionis, é relatada comosendo tóxica para larvas dos insetos coleópteros Agelastica alni (besouro dafolha de amieiro azul ["blue alder Ieaf beetle"]) e Leptinotarsa decemlineata(besouro da batata do Colorado).

A Patente US N0 4.766.203 (especificamente aqui incorporada atítulo de referência) refere-se a uma proteína cristal inseticida de 65 - 70 qui-Iodaltons (kDa) identificada em B. thuringiensis tenebrionis (veja tambémBerhnard1 1986). Sekar et al. (1987) relatam a clonagem e caracterização deum gene para uma proteína cristal de B. thuringiensis tenebrionis tóxica paracoleópteros. O tamanho previsto do polipeptídio (conforme deduzido da se-qüência de genes) é 73 kDa, no entanto, a proteína isolada consiste de umcomponente de 65 kDa. Hofte et al. (1987) também relatam a seqüência deDNA para o gene clonado de B. thuringiensis tenebrionis, com a seqüênciado gene sendo idêntica àquela relatada por Sekar et al. (1987).

McPherson et al. (1988) descrevem uma seqüência de DNA pa-ra o gene de controle de inseto clonado de B. thuringiensis tenebrionis; aseqüência era idêntica àquela relatada por Sekar et al. (1987). Foi verificadoque células de E. coli e células de Pseudomonas fluorescens ancorando ogene clonado são tóxicas para larvas do besouro da batata do Colorado.

A Publicação de Pedido de Patente Int. n0 WO 91/07481, datadade 30 de maio de 1991, descreve mutantes de B. thuringiensis que produ-zem altos rendimentos das mesmas proteínas inseticidas originalmente pro-duzidas pelas cepas de origem com rendimentos inferiores. Mutantes dacepa B. thuringiensis tenebrionis tóxica para coleópteros estão apresentados.

Uma cepa tóxica para coleópteros, designada B. thuringiensisvar. san diego, foi relatada por Herrnstadt et al. (1986) para produzir umaproteína cristal de 64 kDa tóxica para alguns coleópteros, incluindo PyrrhaltaIuteola (besouro da folha de olmo), Anthonomus gradis (gorgulho do algo-dão), Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado), Osiorhyn-chus sulcatus (gorgulho da videira preta), Tenebrio molitor (larva de farinhaamarela), Haltica zombacina e Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata(besouro do pepino manchado do oeste).

A seqüência de DNA de um gene de toxina de B. thuringiensissan diego para coleópteros foi relatada por Herrnstadt et al. (1987); e foidescrito na Patente US N0 4.771.131. A seqüência do gene de toxina de B.thuringiensis san diego é idêntica àquela relatada por Sekar et al. (1987)para o gene de toxina de B. thuringiensis tenebrionis para coleópteros. Krieget al. (1987) demonstrou que B. thuringiensis san diego era idêntica à B. thu-ringiensis tenebrionis, com base em vários testes diagnósticos.

Uma outra cepa de B. thuringiensis, EG2158, foi relatada porDonovan et al. (1988) e descrita na Patente US N0 5.024.837. EG2158 pro-duz uma proteína cristal CryC de 73 kDa que é inseticida para insetos cole-ópteros. Sua seqüência de DNA era idêntica àquela relatada por Sekar et al.(1987) para o gene de toxina de B. thuringiensis tenebrionis clonado. Estegene de toxina para coleópteros é chamado de gene crylllA por Hõfte et al.,1989. Duas proteínas menores de 30 e 29 kDa também foram observadasnesta cepa, mas ainda não foram caracterizadas (Donovan et al., 1988).

A Patente US N0 5.024.837 também descreve cepas híbridas deB. thuringiensis var. kurstaki que mostraram atividade contra insetos lepidóp-teros e coleópteros. A Patente US N0 4.797.279 (correspondente ao docu-mento EP 0221024) descreve uma B. thuringiensis híbrida transformadacom um plasmídio de B. thuringiensis var. kurstaki contendo um gene codifi-cando uma proteína cristal tóxica para lepidópteros e um plasmídio de B.thuringiensis tenebrionis contendo um gene codificando uma proteína cristaltóxica para coleópteros. A cepa híbrida de B. thuringiensis produz proteínascristais características daquelas feitas tanto por B. thuringiensis kurstaki co-mo por B. thuringiensis tenebrionis. A Patente US N0 4.910.016 (correspon-dente ao documento EP 0303379) descreve um isolado de B. thuringiensisidentificado como B. thuringiensis MT 104 que tem atividade inseticida con-tra coleópteros e lepidópteros.

A Publicação de Pedido de Patente Européia N0 0318143 des-creve um gene parcialmente modificado intato de B. thuringiensis tenebrio-nis e vetores recombinantes compreendendo o mesmo para direcionar aexpressão de uma proteína tendo toxidez para insetos coleópteros, e a Pu-blicação de Pedido de Patente Européia N0 0324254 descreve B. thuringi-ensis A30, uma cepa que tem atividade inseticida contra insetos coleópte-ros, incluindo larvas de besouro da batata do Colorado, larvas da minhocade raiz do milho e gorgulhos de algodão.A Patente US N0 4.999.192 (correspondente à EP 0328383)descreve B. thuringiensis PS40D1 que tem atividade inseticida contra larvasde besouro da batata do Colorado. A cepa também foi identificada via análi-se de sorotipo como sendo sorovar 8a8b, morrisoni. A Patente US N05.006.336 (correspondente à EP 0346114) descreveu um isolado de B. thu-ringiensis, designado PS122D3, que foi sorotipado como sorovar 8a8b, mor-risoni e que apresentou atividade herbicida contra larvas de besouro da ba-tata do Colorado. A Patente US N0 4.966.765 (correspondente ao documen-to EP 0330342) descreve uma cepa de B. thuringiensis, PS86B1 (identifica-da via análise de sorotipo como sendo sorovar tolworthi), que tem atividadeinseticida contra o besouro da batata do Colorado.

A seqüência de nucleotídeos de um gene crylllB e sua proteínatóxica para coleópteros codificada estão reportadas por Sick et al. (1990),mas a cepa fonte de B. thuringiensis é identificada apenas via análise desorotipo como sendo a subespécie tolworthi. A Patente US N0 4.966.155,concedida em 26 de fevereiro de 1991, de Sick et al. (correspondente à EP0337604), descreve um gene de toxina de B. thuringiensis obtido da B. thu-ringiensis 43F ativa coleópteros, e a seqüência de gene parece idêntica aogene crylllB. B. thuringiensis 43F é apresentada como sendo ativa contra obesouro da batata do Colorado e Leptinotarsa texana.

A Publicação de Pedido de Patente Européia N0 0382990 des-creve duas cepas de B. thuringiensis, btPGS1208 e btPGS1245, que produ-zem proteínas cristais de 74 e 129 kDa, respectivamente, que apresentamatividade inseticida contra larvas de besouro da batata do Colorado. A se-quência de DNA relatada para o gene de toxina produzindo a proteína de 74kDa parece estar relacionada com aquela do gene crylllB de Sick et al.(1990).

A Publicação de Pedido de Patente Int. PCT N0 WO 90/13651)apresenta cepas de B. thuringiensis que contêm um gene de toxina codifi-cando uma proteína de 81 kDa que é tida como tóxica para insetos tantolepidópteros como coleópteros. A Patente US N0 5.055.293 apresenta o usode B. Iaterosporous para controle do inseto minhoca de raiz do milho (Dia-brotica).

2. Sumário da Invenção

Em acentuado contraste com a técnica anterior, as novas prote-ínas cristais CryET33 e CryET34 ativas contra coleópteros da presente in-venção e as novas seqüências de DNA que codificam as mesmas represen-tam uma nova classe de proteínas cristais de B. thuringiensis, e não com-partilham homologia de seqüência com qualquer das cepas descritas na lite-ratura acima mencionada. O isolado de B. thuringiensis descrito e reivindi-cado nesta invenção representa a primeira cepa de B. thuringiensis kurstakique mostrou ser tóxica para coleópteros. As cepas de B. thuringiensis dapresente invenção compreendem novos genes cry que expressam toxinasde proteína tendo atividade inseticida contra coleópteros tais como insetosdos gêneros Popillia e Tribolium.

Um aspecto da presente invenção refere-se a novos segmentosde ácidos nucléicos que compreendem dois genes de δ-endotoxina tóxicospara coleópteros tendo seqüências de bases de nucleotídeos e seqüênciasde aminoácidos; deduzidas como ilustrado nas figura 1A, figura 1B e figura1C. Doravante, estes genes são designados cryET33 (SEQ ID N0 1) e cr-yET34 (SEQ ID N0 2). O gene cryET33 tem uma região de codificação quese estende das bases de nucleotídeos 136 a 936 mostradas nas figura 1A,figura 1B e figura 1C, e-o gene c/yET34 tem uma região de codificação quese estende das bases de nucleotídeos 969 a 1346 mostradas nas figura 1A,figura 1B e figura 1C.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se às proteínasinseticidas codificadas pelos novos genes cryET33 e c/yET34. A seqüênciade aminoácidos deduzida da proteína CryET33 (SEQ ID N0 3), codificadapelo gene cryET33 das bases de nucleotídeos 136 a 936, está mostrada nasfigura 1A, figura 1B e figura 1C. A seqüência de aminoácidos deduzida daproteína CryET34 (SEQ ID N0 4), codificada pelo gene cryET34 das basesde nucleotídeos 969 a 1346, também está mostrada nas figura 1 A, figu-ra 1B e figura 1C. As proteínas apresentam atividade inseticida contra inse-tos da ordem dos Coleópteros, em particular gorgulho do algodão, tribólio ebesouro japonês.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma culturabiologicamente pura de uma bactéria B. thuringiensis do tipo selvagem, ce-pa EG10327, depositada em 14 de dezembro de 1994 junto ao AgriculturalResearch Culture Collection1 Northern Regional Research Laboratory(NRRL) com Acesso N0 NRRL B-21365. B. thuringiensis EG10327 está des-crita abaixo nas seções 5.1 - 5.3. B. thuringiensis EG10327 é uma cepa deB. thuringiensis natural que contém genes que estão relacionados com osgenes cryET33 e cryET34 da presente invenção ou são idênticos aos mes-mos. EG10327 produz proteínas inseticidas de 29 kDa e 14 kDa que estãorelacionadas com as proteínas CryET33 e CryET34 aqui apresentadas ousão idênticas às mesmas.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um vetorrecombinante compreendendo um ou ambos dos novos genes c/yET33 ecryET34, uma célula hospedeira recombinante transformada com esse vetorrecombinante, e uma cultura biologicamente pura da bactéria recombinanteassim transformada. Em modalidades preferidas, a bactéria é de preferênciaB. thuringiensis tal como a cepa recombinante EG11402 (depositada em 14de dezembro de 1994 junto ao NRRL, com Acesso N0 B-21366) descrita noexemplo 8 e a cepa recombinante EG11403 (depositada em 14 de dezem-bro de 1994 junto ao NRRL, com Acesso N0 B-21367) descrita no exemplo7. Em uma outra modalidade preferida, a bactéria é de preferência E. coli,tal como as cepas recombinantes EG11460 (depositada em 14 de dezembrode 1994 junto ao NRRL, com Acesso N0 B-21364). Todas as cepas deposi-tadas junto ao NRRL foram depositadas no 'Patent Culture Collection' se-gundo os termos do Tratado de Budapeste, e foram obtidos relatórios deviabilidade segundo o 'international Receipt Form BP/4'.

2.1 Segmentos de DNA crvET33 e cryET34

A presente invenção também se refere a segmentos de DNA,que podem ser isolados de virtualmente qualquer fonte, que são isentos deDNA genômico total e que codificam os novos peptídios aqui apresentados.Segmentos de DNA codificando estas espécies de peptídio podem demons-trar codificar proteínas, polipeptídios, subunidades, domínios funcionais eoutros de produtos genéticos relacionados com proteínas cristais e outrosprodutos genéticos não relacionados com as mesmas. Além disso, essessegmentos de DNA podem ser sintetizados inteiramente in vitro usando mé-todos que são bastante conhecidos pelos versados na técnica.

O gene cryET33 tem uma seqüência de bases de nucleotídeosmostrada nas figurai A, figura 1B e figura 1C. O gene cryET33 (SEQ ID N01) codifica a proteína CryET33 de 29 kDa tendo uma seqüência de aminoá-cidos mostrada nas figurai A, figura 1B e figura 1C (SEQ ID N°: 3). O genecryET34 (SEQ ID N0 2) codifica a proteína CryET34 de 14 kDa tendo umaseqüência de aminoácidos mostrada nas figurai A, figura 1B e figura 1C(SEQ ID N°: 4).

Conforme aqui usado, o termo "segmento de DNA" refere-se auma molécula de DNA que fora isolada isenta de DNA genômico total deuma espécie particular. Portanto, um segmento de DNA que codifica umaproteína cristal ou peptídio refere-se a um segmento de DNA que contémseqüências de codificação de proteína cristal e ainda é isolado, ou purificadoisento, de DNA genômico total da espécie da qual o segmento de DNA éobtido, o que no presente caso é o genoma do gênero bacteriano gram-positivo, Bacillus, e em particular a espécie conhecida como B. thuringiensis.Incluídos no termo "segmento de DNA" estão segmentos de DNA e frag-mentos menores desses segmentos, e também vetores recombinantes, in-cluindo, por exemplo, plasmídios, cosmídios, fagemídios, fagos, vírus e ou-tros.

De maneira similar, um segmento de DNA compreendendo umgene codificador de uma proteína cristal isolada ou purificada refere-se a umsegmento de DNA que pode incluir, além de seqüências de codificação depeptídios, certos outros elementos tais como seqüências reguladoras, subs-tancialmente isoladas de outros genes naturais ou seqüências de codifica-ção de proteínas. Nesse contexto, o termo "gene" é usado para simplicidadepara se referir uma unidade de codificação de proteína, polipeptídio ou pep-tídio funcional. Como será entendido pelos versados na técnica, este termofuncional inclui tanto seqüências genômicas, seqüências de opérons e seg-mentos de genes construídos menores que expressam, ou podem ser adap-tados para expressar, proteínas, polipeptídios ou peptídios.

"Substancialmente isolado de outras seqüências de codificação"significa que o gene de interesse, neste caso um gene codificando uma pro-teína cristal bacteriana, forma a parte significativa da região de codificaçãodo segmento de DNA, e que o segmento de DNA não contém porções gran-des de DNA codificador natural, tais como fragmentos cromossômicos gran-des ou outros genes funcionais ou regiões de codificação de opérons. Natu-ralmente, isso se refere ao segmento de DNA como originalmente isolado, enão exclui genes, genes recombinantes, Iigantes sintéticos ou regiões decodificação posteriormente adicionadas ao segmento pelo homem.

Em modalidades particulares, a invenção refere-se a segmentosde DNA isolados e vetores recombinantes que incorporam seqüências deDNA que codificam uma espécie de peptídio ou proteína Cry que inclui, emsua seqüência de aminoácidos uma seqüência de aminoácidos, essencial-mente como apresentada na SEQ ID N0 3 ou SEQ ID N0 4.

O termo "uma seqüência essencialmente como apresentada naSEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4" significa que a seqüência corresponde subs-tancialmente a uma porção da seqüência de SEQ ID N0 3 ou SEQ ID N°: 4 etem relativamente poucos aminoácidos que não são idênticos aos aminoáci-dos de qualquer dessas seqüências, ou um equivalente biologicamente fun-cional dos mesmos. O termo "equivalente biologicamente funcional" é bas-tante conhecido na técnica e ainda está definido detalhadamente neste rela-tório (por exemplo, veja Modalidades Ilustrativas). Por conseguinte, seqüên-cias que têm entre cerca de 70% e cerca de 80%, ou mais preferivelmenteentre cerca de 81% e cerca de 90%, ou ainda mais preferivelmente entrecerca de 91% e cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidosou equivalência funcional aos aminoácidos de SEQ ID N0 3 ou SEQ ID N0 4serão seqüências que são "essencialmente como apresentadas na SEQ IDN0 3 ou SEQ ID N0 4".

Também ficará entendido que as seqüências de aminoácidos eácidos nucléicos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos Nou C terminais ou seqüências 5' ou 3' adicionais, e ainda ser essencialmentecomo apresentadas em uma das seqüências aqui apresentadas, desde quea seqüência satisfaça os critérios apresentados acima, incluindo a manuten-ção da atividade biológica da proteína onde a expressão da proteína estáenvolvida. A adição de seqüências terminais particularmente se aplica a se-qüências de ácidos nucléicos que podem, por exemplo, incluir várias se-qüências não codificadoras flanqueando uma das porções 5' ou 3' da regiãode codificação ou podem incluir várias seqüências internas, isto é, introns,que se sabe ocorrer em genes.

Os segmentos de ácidos nucléicos da presente invenção, inde-pendente do comprimento da seqüência de codificação, podem ser combi-nados com outras seqüências de DNA, tais como promotores, sinais de po-liadenilação, sítios de enzima de restrição adicionais, sítios de clonagemmúltiplos, outros segmentos codificadores e outros, para que seu compri-mento total possa variar consideravelmente. É portanto considerado que umfragmento de ácido nucléico de quase qualquer comprimento pode ser em-pregado, com o comprimento total sendo, de preferência, limitado pela faci-lidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante pretendido.

Por exemplo, podem ser preparados fragmentos de ácidos nucléicos queincluem uma extensão contígua curta que codifica as seqüências de, peptí-dios apresentada na SEQ ID N0: 3 ou SEQ ID N0: 4, ou que são idênticos oucomplementares a seqüências de DNA que codificam qualquer um dos pep-tídios apresentados na SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, e particularmente ossegmentos de DNA apresentados na SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2. Porexemplo, seqüências de DNA tais como cerca de 18 nucleotídeos e que têmaté cerca de 10.000, cerca de 5.000, cerca de 3.000, cerca de 2.000, cercade 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 e cerca de14 pares de base de comprimento (incluindo todos os comprimentos inter-mediários) também são considerados como úteis.

Será facilmente entendido que "comprimentos intermediários",nesses contextos, significa qualquer comprimento entre as faixas citadas,tais como 18, 19, 20, 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32 etc.; 50, 51, 52, 53, etc.;100, 101, 102, 103 etc.; 150, 151, 152, 153 etc.; incluindo todos os númerosinteiros nas faixas de 200 - 500, 500 - 1.000, 1.000 - 2.000, 2.000 - 3.000,3.000 - 5.000 e até e incluindo seqüências de cerca de 5200 nucleotídeos eoutras.

Também ficará entendido que esta invenção não está limitadaàs seqüências particulares de ácidos nucléicos que codificam peptídios dapresente invenção, ou que codificam a seqüência de aminoácidos de SEQID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4, inclusive as seqüências de DNA que são particu-larmente apresentadas na SEQ ID N0 1 ou SEQ ID N°: 2. Vetores recombi-nantes e segmentos de DNA isolados podem portanto incluir diversamenteas regiões de codificação de peptídios, regiões codificadores que contêmalterações ou modificações selecionadas na região de codificação básica,ou podem codificar polipeptídios maiores que não obstante incluem essasregiões de codificação de peptídios ou podem codificar proteínas ou peptí-dios equivalentes biologicamente funcionais que têm seqüências de amino-ácidos variantes.

Os segmentos de DNA da presente invenção abrangem peptí-dios equivalentes biologicamente funcionais. Estas seqüências podem surgircomo conseqüência de degeneração de códon e equivalência funcional quese sabe ocorrerem naturalmente em seqüências de ácidos nucléicos e nasproteínas assim codificadas. Alternativamente, as proteínas ou peptídiosfuncionalmente equivalentes podem ser criadas via a aplicação de tecnolo-gia de DNA recombinante, onde podem ser criadas alterações na estruturada proteína, com base em considerações das propriedades dos aminoáci-dos sendo trocados. As alterações criadas pelo homem podem ser introdu-zidas através da aplicação de técnicas de mutagênese direcionada para osítio, por exemplo, introduzir aperfeiçoamentos para a antigenicidade da pro-teína ou testar mutantes para examinar a atividade ao nível molecular.

Se desejado, também se pode preparar peptídios e proteínas defusão, por exemplo, onde as regiões de codificação de peptídios são alinha-das na unidade de expressão com outras proteínas ou peptídios tendo fun-ções desejadas, tais como para fins de purificação ou imunodetecção (porexemplo, proteínas que podem ser purificadas por cromatografia por afini-dade e regiões de codificação de rótulo de enzima, respectivamente).

Vetores recombinantes formam outros aspectos da presenteinvenção. Vetores particularmente úteis são considerados como sendo osvetores nos quais a porção de codificação do segmento de DNA1 seja codifi-cando uma proteína inteira ou um peptídio menor, é posicionada sob o con-trole de um promotor. O promotor pode estar na forma do promotor que énaturalmente associado com os peptídios codificadores de genes da presen-te invenção, conforme pode ser obtido por isolamento das seqüências nãocodificadoras 5' localizadas a montante do segmento codificador ou exon,por exemplo, usando tecnologia de clonagem recombinante e/ou PCR®,junto com as composições aqui apresentadas.

2.2 Segmentos de DNA cryET33 e cryET34 como sondas e iniciadores dehibridização

Além de seu uso para direcionar a expressão de proteínas oupeptídios cristais da presente invenção, as seqüências de ácidos nucléicosverificadas nesta invenção também têm uma variedade de outros usos. Porexemplo, elas também têm utilidade como sondas ou iniciadores em moda-Iidades de hibridização de ácido nucléico. Como tal, verifica-se que segmen-tos de ácidos nucléicos que compreendem uma região de seqüência queconsiste de pelo menos uma seqüência contígua comprida de 14 nucleotí-deos e que tem a mesma seqüência que o segmento de DNA contíguocomprido de 14 nucleotídeos da SEQ ID N0 1 ou SEQ ID N0 2 ou é comple-mentar à mesma terá utilidade particular. Seqüências idênticas ou comple-mentares contíguas mais compridas, por exemplo aquelas de cerca de 20,30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, etc. (incluindo todos os com-primentos intermediários e até e inclusive seqüências inteiras de 5200 paresde base), também terão utilidade em certas modalidades.

A capacidade dessas sondas de ácido nucléico para se hibridi-zar especificamente em seqüências de codificação de proteína cristal vaitorná-las de utilidade para detectar a presença de seqüências complementa-res em uma dada amostra. No entanto, são previstos outros usos que inclu-em o uso das informações da seqüência para a preparação de iniciadoresde espécies mutantes, ou iniciadores para uso na preparação de outrasconstruções genéticas.

Moléculas de ácidos nucléicos tendo regiões de seqüência queconsistem extensões de nucleotídeos contíguos de 10 - 14, 15 - 20, 30, 50ou ainda de 100 - 200 nucleotídeos ou mais, idênticas ou complementares àseqüência de DNA de SEQ ID N0 1 ou SEQ ID N0 2, são particularmenteverificadas como sondas de hibridização para uso, por exemplo, "Southern eNorthen blotting. Fragmentos menores em geral vão encontrar utilidade emmodalidades de hibridização, onde o comprimento da região complementarcontígua pode ser variado, tal como entre cerca de 10 - 14 e cerca de 100ou 200 nucleotídeos, porém extensões complementares contíguas maiorespodem ser usadas, de acordo com as seqüências complementares de com-primento que se deseja detectar.

Naturalmente, fragmentos também podem ser obtidos por outrastécnicas tais como, por exemplo, por cisalhamento mecânico ou digestãopor enzimas de restrição. Segmentos ou fragmentos de ácidos nucléicospequenos podem ser facilmente preparados, por exemplo, por síntese diretado fragmento por meios químicos, como é comumente praticado usando umsintetizador de oligonucleotídeo automático. Também, fragmentos podemser obtidos por aplicação da tecnologia de reprodução de ácidos nucléicos,tal como a tecnologia de PCR® das patentes US 4.683.195 e 4.683.202(ambas aqui incorporadas a título de referência), por introdução de sequên-cias selecionadas em vetores recombinantes para produção recombinante,e por outras técnicas de DNA recombinante geralmente conhecidas pelosversados na técnica da biologia molecular.

Por conseguinte, as seqüências de nucleotídeos da invençãopodem ser usadas por sua capacidade de seletivamente formar moléculasdúplices com extensões complementares de fragmentos de DNA. Depen-dendo da aplicação desejada, pode-se desejar empregar condições variá-veis de hibridização para obter graus variáveis de seletividade de sonda emrelação à sequência-alvo. Para aplicações que requerem alta seletividade,será tipicamente desejado empregar condições relativamente rigorosas paraformar os híbridos, por exemplo, serão selecionadas condições de teor desal relativamente baixo e/ou temperatura elevada, tais como oferecidas porNaCI cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M a temperaturas de cerca de 50°C acerca de 70°C. Essas condições seletivas toleram pouca, se houver, incom-patibilidade entre a sonda e o molde ou cordão-alvo, e seriam particularmen-te adequadas para isolar segmentos de DNA codificadores de proteína cris-tal. A detecção de segmentos de DNA via hibridização é bastante conhecidapelos versados na técnica, e os ensinamentos das patentes US 4.965.188 e5.176.995 (ambas aqui incorporadas a título de referência) são exemplifica-tivos dos métodos de análise por hibridização. Ensinamentos tais como a-queles encontrados nos textos de Maloy et al. 1993, Segai 1976, Prokop1991 e Kuby 1991 são particularmente relevantes.

Naturalmente, para algumas aplicações, por exemplo, onde sedeseja preparar mutantes empregando um cordão de iniciador mutante hi-bridizado para um molde subjacente ou onde se tenta isolar seqüências decodificação de proteína cristal de espécies relacionadas, equivalentes fun-cionais, ou similares, condições de hibridização menos rigorosas serão tipi-camente necessárias para permitir a formação do heterodúplex. Nessas cir-cunstâncias, pode-se desejar empregar condições tais como sal de cerca de0,15 M a cerca de 0,9 M, a temperaturas que variam de cerca de 20°C acerca de 55°C. Espécies de hibridização cruzada podem dessa forma serfacilmente identificadas como sinais de hibridização positiva em relação ahibridizações de controle. Em qualquer caso, em geral aprecia-se que ascondições podem ser tornadas mais rigorosas pela adição de quantidadescrescentes de formamida, que serve para desestabilizar o dúplex híbrido damesma maneira que na temperatura aumentada. Assim, as condições dehibridização podem ser facilmente manipuladas, e dessa forma geralmentehaverá um método de escolha dependendo dos resultados desejados.

Em certas modalidades, vai ser vantajoso empregar as seqüên-cias de ácidos nucléicos da presente invenção em combinação com ummeio apropriado, tal como um rótulo, para determinar a hibridização. É co-nhecida na técnica uma ampla variedade de meios indicadores apropriados,que incluem Iigantes fluorescentes, radioativos, enzimáticos ou outros Iigan-tes, tais como avidina/biotina, que são capazes de dar um sinal detectável.

Em modalidades preferidas, provavelmente será desejado empregar um ró-tulo fluorescente ou uma etiqueta de enzima, tal como urease, fosfatase al-calina ou peroxidase, no lugar de reagentes radioativos ou outros reagentesindesejáveis para o meio ambiente. No caso de etiquetas de enzima, sãoconhecidos substratos indicadores colorimétricos que podem ser emprega-dos para fornecer um meio visível para o olho humano ou espectrofotometri-camente para identificar a hibridização específica com amostras contendoácidos nucléicos complementares.

Em geral, acredita-se que as sondas de hibridização aqui descri-tas serão úteis tanto como reagentes em hibridização em solução como emmodalidades que empregam uma fase sólida. Em modalidades que envol-vem uma fase sólida, o DNA (ou RNA) de teste é adsorvido ou de algumaforma afixado a uma matriz ou superfície selecionada. Este ácido nucléicode cordão simples fixado é então submetido à hibridização específica comsondas selecionadas em condições desejadas. As condições selecionadasvão depender das circunstâncias particulares com base nos critérios particu-lares requeridos (dependendo, por exemplo, do teor de G+C, do tipo do áci-do nucléico-alvo, da fonte de ácido nucléico, do tamanho da sonda de hibri-dização etc.). Depois de lavagem da superfície hibridizada para remover mo-léculas de sonda não-especificamente ligadas, a hibridização específica édetectada, ou mesmo quantificada, por meio do rótulo.

2.3 Vetores recombinantes e expressão de proteínas cristais

Em outras modalidades, verifica-se que serão ganhas determi-nadas vantagens colocando-se o segmento de DNA codificador sob o con-trole de um promotor recombinante ou heterólogo. Conforme aqui usado, umpromotor recombinante ou heterólogo refere-se a um promotor que normal-mente não está associado a um segmento de DNA codificando uma proteí-na cristal ou peptídio em seu ambiente natural. Esses promotores podemincluir promotores normalmente associados com outros genes, e/ou promo-tores isolados de qualquer célula bacteriana, virótica, eucariótica ou vegetal.Naturalmente, será importante empregar um promotor que eficazmente dire-cione a expressão do segmento de DNA no tipo celular, organismo, ou ani-mal vivo, escolhido para expressão. O uso de combinações de promotor etipo celular para expressão de proteína é geralmente conhecido pelos ver-sados na técnica de biologia molecular, por exemplo, veja Sambrook et al.,1989. Os promotores empregados podem ser constitutivos, ou indutíveis, epodem ser usados nas condições apropriadas para direcionar expressão denível elevado do segmento de DNA introduzido, tal como é vantajoso naprodução em grande escala de proteínas ou peptídios recombinantes. Sis-temas promotores apropriados considerados para uso em expressão de ní-vel elevado incluem, porém sem limitação, o sistema de vetores de expres-são Pichia (Pharmacia LKB Biotechnology).

Junto com as modalidades de expressão para preparar proteí-nas e peptídios recombinantes, verifica-se que segmentos de DNA maiscompridos serão, mais freqüentemente usados, com os segmentos de DNAcodificando a seqüência de peptídios inteira sendo mais preferidos. No en-tanto, será apreciado que o uso de segmentos de DNA mais curtos para di-recionar a expressão de peptídios cristais ou regiões de núcleo epitópicas,tal como .pode ser usado para gerar anticorpos de antiproteínas cristais,também se encontra dentro do escopo da invenção. Segmentos de DNAque codificam antígenos de peptídio de cerca de 8 a cerca de 50 aminoáci-dos de comprimento, ou mais preferivelmente de cerca de 8 a cerca de 30aminoácidos de comprimento, ou ainda mais preferivelmente de cerca de 8a cerca de 20 aminoácidos de comprimento são considerados como particu-larmente úteis. Esses epítopos de peptídio podem ser seqüências de ami-noácidos que compreendem seqüências de aminoácidos contíguas da SEQID N0 3 ou SEQ ID N0 4.

2.4 Transgenes de proteína cristal e plantas transqênicas

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece méto-dos para a produção de uma planta transgênica que expressa um segmentode ácidos nucléicos codificando a nova proteína cristal da presente inven-ção. O processo de produção de plantas transgênicas é bastante conhecidona literatura. Em geral, o método compreende transformar uma célula hos-pedeira adequada com um segmento de DNA que contém um promotor ope-racionalmente ligado a uma região de codificação que codifica uma proteínacristal CryET33 ou CryET34 de B. thuringiensis. Essa região de codificaçãogeralmente está operacionalmente ligada a uma região de terminação detranscrição, pelo que o promotor é capaz de acionar a transcrição da regiãode codificação na célula, e assim transmitir à célula a capacidade de produ-zir a proteína recombinante in vivo. Alternativamente, em casos em que sedeseja controlar, regular ou reduzir a quantidade de uma proteína cristal re-combinante particular expressa em uma célula transgênica particular, a in-venção também fornece a expressão de mRNA anti-sentido de proteína cris-tal. O uso de mRNA anti-sentido como meio de controle ou redução daquantidade de uma dada proteína de interesse em uma célula é bastanteconhecido na literatura.

Um outro aspecto da invenção compreende plantas transgêni-cas que expressam um gene ou segmento de gene codificando uma oumais das novas composições polipeptídicas aqui descritas. Conforme aquiusado, o termo "planta transgênica" refere-se a uma planta que tem se-qüências de DNA incorporadas, incluindo, porém sem limitação, genes quetalvez não estejam normalmente presentes, seqüências de DNA normal-mente não transcritas em RNA ou traduzidas em uma proteína ("expressas")ou quaisquer outros genes ou seqüências de DNA que se deseje introduzirna planta não transformada, tais como genes que podem estar normalmentepresentes na planta não transformada mas que se deseja transformar gene-ticamente ou ter a expressão alterada.

Verifica-se que em alguns casos o genoma de uma plantatransgênica da presente invenção terá sido aumentado através da introdu-ção estável de um ou mais transgene cryET33 ou cryET34, seja nativos ousinteticamente modificados ou alterados. Em alguns casos, mais de umtransgene será incorporado no genoma da célula vegetal hospedeira trans-formada. Este é o caso quando mais de um segmento de DNA codificadorde proteína cristal é incorporado no genoma de tal planta. Em certas situa-ções, pode ser desejável ter uma, duas, três, quatro ou mesmo mais proteí-nas cristais de B. thuringiensis (seja nativas ou recombinantemente criadas)incorporadas e estavelmente expressas na planta transgênica transformada.

Um gene preferido que pode ser introduzido inclui, por exemplo,uma seqüência de DNA codificando uma proteína cristal de origem bacteria-na, e particularmente uma ou mais daquelas aqui descritas que são obtidasde Bacillus spp. Seqüências de ácidos nucléicos altamente preferidas sãoaquelas obtidas de B. thuringiensis, ou qualquer das seqüências que foramgeneticamente construídas para reduzir ou aumentar a atividade inseticidada proteína cristal na célula hospedeira transformada.

Meios para transformar uma célula vegetal e a preparação deuma linhagem celular transgênica são bastante conhecidos na literatura, eestão discutidos neste relatório. Vetores, plasmídios, cosmídios, YACs (cro-mossomos artificiais de levedura) e segmentos de DNA para uso na trans-formação dessas células, naturalmente, vão geralmente compreender osopérons, genes ou seqüências derivadas de gene da presente invenção,seja nativos ou sintéticos, e particularmente aqueles que codificam as prote-ínas cristais apresentadas. Essas construções de DNA podem ainda incluirestruturas tais como promotores, intensificadores, poliligantes ou ainda se-qüências de genes que têm atividade positiva ou negativamente reguladorasobre os genes de interesse particulares, conforme desejado. O segmentode DNA ou gene pode codificar uma proteína cristal nativa ou modificada,que será expressa nas células recombinantes resultantes, e/ou que transmi-tirá um fenótipo aperfeiçoado para a planta regenerada.

Essas plantas transgênicas podem ser desejáveis para aumen-tar a resistência inseticida de uma planta monocotiledônea ou dicotiledôneapor incorporação, nessa planta, de um segmento de DNA transgênico codifi-cando uma ou mais proteínas cristais CryET33 e/ou CryET34 que é tóxicapara insetos coleópteros. Plantas particularmente preferidas incluem turfa,trigo, verduras, plantas ornamentais, árvores frutíferas e outras.Em um aspecto relacionado, a presente invenção também a-brange uma semente produzida pela planta transformada, uma progêniedessa semente e uma semente produzida pela progênie da planta transgê-nica original, produzida de acordo com o processo acima. Essa progênie esementes vão ter um transgene de proteína cristal estavelmente incorporadoem seu genoma, e essas plantas descendentes vão herdar os traços confe-ridos pela introdução de um transgene estável de maneira mendeliana. To-das essas plantas transgênicas tendo incorporados em seu genoma seg-mentos de DNA transgênicos codificando uma ou mais proteínas ou polipep-tídios cristais CryET33 e/ou CryET34 são aspectos desta invenção.

2.5 Mutagênese específica de sítio

Mutagênese específica de sítio é uma técnica útil na preparaçãode peptídios individuais, ou proteínas ou peptídios equivalentes biologica-mente funcionais, por meio de mutagênese específica do DNA subjacente. Atécnica oferece ainda uma maneira rápida de preparar e testar variantes deseqüência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações pre-cedentes, por introdução de uma ou mais alterações da seqüência de nu-cleotídeos no DNA. A mutagênese específica de sítio permite a produção demutantes através do uso de seqüências de oligonucleotídeos específicasque codificam a seqüência de DNA da mutação desejada, bem como umnúmero suficiente de nucleotídeos adjacentes, para proporcionar uma se-qüência de iniciadores de tamanho e complexidade de seqüência suficientespara formar um dúplex estável nos dois lados da junção de deleção sendoatravessada. Tipicamente, um iniciador de cerca de 13 ou cerca de 14 oucerca de 16 ou cerca de 17 até e inclusive cerca de 18 ou cerca de 19 oucerca de 20, ou cerca de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou mesmo cercade 30, 40 ou cerca de 50 ou mais nucleotídeos de comprimento é preferido,com cerca de 5 a cerca de 10 resíduos nos dois lados da junção da seqüên-cia sendo alterados.

Em geral, a técnica de mutagênese específica de sítio é bastan-te na literatura, como exemplificado por várias publicações. Como será a-preciado, a técnica tipicamente emprega um vetor de fago que existe tantona forma de cordão simples como na de cordão duplo. Vetores típicos úteisem mutagênese direcionada para o sítio incluem vetores tal como o fagoM13. Esses fagos encontram-se facilmente comercialmente disponíveis eseu uso é geralmente bastante conhecido pelos versados na técnica. Plas-mídios de cordão duplo também são rotineiramente empregados na muta-gênese direcionada para o sítio que elimina a etapa de transferir o gene deinteresse de um plasmídio para um fago.

Em geral, a mutagênese direcionada para o sítio de acordo comesta invenção é realizada obtendo-se primeiro um vetor de cordão simplesou separando-se por fusão dois cordões de um vetor duplo que inclui emsua seqüência uma seqüência de DNA que codifica o peptídio desejado. Uminiciador de oligonucleotídeo contendo a seqüência alterada desejada é pre-parada em geral sinteticamente. Este iniciador é então anelado com o vetorde cordão simples, e submetido a enzimas de polimerização de DNA taiscomo fragmento Klenow de polimerase I de E. coli, para completar a síntesedo cordão contendo mutação. Assim, é formado um heterodúplex onde umcordão codifica o seqüência não alterada original e o segundo cordão con-tém a mutação desejada. Este vetor heterodúplex é então usado para trans-formar ou transfèctar células apropriadas, tais como células de E. coli, e sãoselecionados clones que incluem vetores recombinantes contendo a dispo-sição de seqüências alteradas.

A preparação de variantes de seqüência dos segmentos de DNAcodificadores de peptídios selecionados usando mutagênese direcionadapara o sítio é fornecida como um meio de produzir espécies potencialmenteúteis e não pretende ser Iimitativa já que existem outras maneiras pelasquais variantes de seqüências de peptídios e as seqüências de DNA quecodificam as mesmas podem ser obtidas. Por exemplo, vetores recombinan-tes codificando a seqüência de peptídios desejada podem ser tratados comagentes mutagênicos, tal como hidroxilamina, para obter variantes de se-quência.2.6 Composições de anticorpos de CryET33 e CryET34 e métodos de pro-dução

Em modalidades particulares, os inventores verificam o uso deanticorpos, sejam monoclonais ou policlonais, que se ligam às proteínascristais aqui apresentadas. Meios para preparar e caracterizar anticorpossão bastante conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Antibodies: A Labo-ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; aqui incorporada a títu-lo de referência). Os métodos para gerar anticorpos monoclonais (mAbs)geralmente começam pelas mesmas linhas que as usadas para prepararanticorpos policlonais. Em resumo, um anticorpo policlonal é preparado i-munizando-se um animal com uma composição imunogênica de acordo coma presente invenção e colhendo-se anti-soro do animal imunizado. Uma am-pla gama de espécies animais pode ser usada para a produção de anti-soro.Tipicamente o animal usado para produção de anti-anti-soro é um coelho,um camundongo, um rato, um hamster, um porquinho-da-índia ou uma ca-bra. Por causa do volume relativamente grande de sangue nos coelhos, ocoelho é uma escolha preferida para produção de anticorpos policlonais.

Como se sabe na técnica, uma dada composição pode variarem sua imunogenicidade. Normalmente é portanto necessário reforçar osistema imunológico do hospedeiro, o que pode ser obtido por acoplamentode um imunógeno de peptídio ou polipeptídio a um carreador. Carreadoresexemplificativos e preferidos são hemocianina de lapa ("keyhole limpet") (K-LH) e albumina de soro bovino (BSA). Outras albuminas tais como albuminade ovo, albumina de soro de camundongo ou albumina de soro de coelhotambém podem ser usadas como carreadores. Meios para conjugar um po-lipeptídio a uma proteína carreadora são bastante conhecidos na técnica eincluem glutaraldeído, éster de m-maleimidobencoil-N-hidroxissuccinimida,carbodiimida e benzidina bis-biazotizada.

Como também se sabe na técnica, a imunogenicidade de umacomposição imunogênica particular pode ser intensificada pelo uso de esti-muladores inespecíficos da resposta imunológica, conhecidos como adju-vantes. Adjuvantes exemplificativos e preferidos incluem adjuvante de Fre-und completo (um estimulador inespecífico da resposta imunológica conten-do Mycobacterium tuberculosis morta), adjuvantes de Freund incompletos eadjuvante de hidróxido de alumínio.

A quantidade de composição imunogênica usada na produçãode anticorpos policlonais varia com a natureza do imunógeno assim comocom o animal usado para imunização. Várias vias podem ser usadas paraadministrar o imunógeno (subcutânea, intramuscular, intradérmica, intrave-nosa e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais pode ser moni-torada por amostragem de sangue do animal imunizado em vários pontosdepois da imunização. Uma segunda injeção de reforço também pode serdada. O processo de reforço e titulação é repetido até que seja obtido o títu-lo adequado. Quando se obtém um nível desejado de imunogenicidade, oanimal imunizado pode ser sangrado e o soro isolado e armazenado, e/ou oanimal pode ser usado para gerar mAbs.

mAbs pode ser facilmente preparado através do uso de técnicasbastante conhecidas, tais como aquelas exemplificadas na patente US4.196.265, aqui incorporada a título de referência. Tipicamente, esta técnicaenvolve imunização de um animal adequado com uma composição imuno-gênica selecionada, por exemplo, uma proteína, polipeptídio ou peptídio cris-tal purificado ou parcialmente purificado. A composição de imunização éadministrada de maneira eficaz para estimular as células produtoras de anti-corpos. Roedores tais como camundongos e ratos são animais preferidos,no entanto, o uso de células de coelho, carneiro ou sapo também é possível.

O uso de ratos pode oferecer certas vantagens (Goding, 1986, pp. 60-61),mas camundongos são preferidos, com o camundongo BALB/c sendo maispreferido uma vez que ele é mais comumente usado e geralmente forneceuma percentagem mais elevada de fusões estáveis.

Depois da imunização, células somáticas com o potencial paraproduzir anticorpos, especificamente linfócitos B (células B), são seleciona-das para uso no protocolo de geração de mAb. Estas células podem ser ob-tidas de baços, amígdalas e nódulos linfáticos biopsados, ou de uma amos-tra de sangue periférico. Células do baço e células de sangue periférico sãopreferidas, as primeiras porque são uma rica fonte de células produtoras deanticorpos que estão no estágio de divisão de plasmablastos, e as últimasporque o sangue periférico é facilmente acessível. Normalmente, um grupode animais terá sido imunizado e o baço do animal com a titulação mais ele-vada de anticorpo será removido e os linfócitos do baço obtidos por homo-geneização do baço com uma seringa. Tipicamente, o baço de um camun-dongo imunizado contém aproximadamente 5x107a2x108 linfócitos.

Os linfócitos B produtores de anticorpos do animal imunizadosão então fundidos com células de uma célula de mieloma imortal, geral-mente uma célula da mesma espécie que o animal que foi imunizado. Li-nhagens celulares de mieloma adequadas para uso nos procedimentos defusão produtora de hibridoma são de preferência não-produtoras de anticor-pos, têm alta eficiência de fusão, e deficiências de enzimas que as tornamincapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimentoapenas das células fundidas desejadas (hibridomas).

Qualquer uma de inúmeras células de mieloma pode ser usada,como sabem os versados na técnica (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell,pp. 75-83, 1984). Por exemplo, onde o animal imunizado é camundongo,pode-se usar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4 1, Sp210-Ag14, FO,NSO/U, MPC/11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; para ratos, pode-se usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210; e U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6 são todas úteis com relação a fusõesde células humanas.

Uma célula de mieloma de murino preferida é a linhagem celularde mieloma NS-1 (também chamada de P3-NS-1-Ag4-1), que se encontrafacilmente disponível no NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository so-licitando o número de depósito de linhagem celular GM3573. Uma outra li-nhagem celular de mieloma de camundongo que pode ser usada é a linhacelular não-produtora SP2/0 de mieloma murino de camundongo resistenteà 8-azaguanina.

Métodos para gerar híbridos de células de baço ou nódulo linfá-tico produtoras de anticorpos e células de mieloma usualmente compreen-dem a misturação de células somáticas com células de mieloma em umarazão de 2:1, embora a razão possa variar de cerca de 20:1 a cerca de 1:1,na presença de um agente ou agentes (químicos ou elétricos) que promo-vam a fusão de membranas celulares. Foram descritos métodos de fusãousando vírus Sendai (Kohler & Milstein, 1975; 1976), e aqueles usando poli-etileno glicol (PEG)1 tal como PEG 37% (v/v) (Gefter et al., 1977). O uso demétodos de fusão induzida eletricamente também é apropriado (Goding,1986, pp. 71-74).

Procedimentos de fusão usualmente produzem híbridos viáveisa baixas freqüências, cerca de 1 χ 10"6 a 1 χ 10"8. No entanto, isso não re-presenta um problema, já que os híbridos fundidos viáveis são diferenciadosdas células não fundidas de origem (particularmente as células de mielomanão fundidas que normalmente continuariam a se dividir indefinidamente)por cultura em um meio seletivo. O meio seletivo é geralmente um meio quecontém um agente que bloqueia a síntese de novo de nucleotídeos no meiode cultura de tecidos. Agentes exemplificativos e preferidos são aminopteri-na, met0trexat0;e azasserina. Aminopterina e metotrexato bloqueiam a sín-tese tanto de purinas como de pirimidinas, ao passo que a azasserina blo-queia apenas a síntese de purina. Onde se usa aminopterina ou metotrexa-to, o meio é sumplementado com hipoxantina e timidina como fonte de nu-cleotídeos (meio HAT). Quando se usa azasserina, o meio é suplementadocom hipoxantina.

O meio de seleção preferido é HAT. Apenas células capazes deoperar vias de salvamento de nucleotídeos são capazes de sobreviver nomeio HAT. As células de mieloma são defeituosas em enzimas chaves davia de salvamento, por exemplo, hipoxantina fosforribosil transferase (H-PRT), e não conseguem sobreviver. As células B podem operar esta via,mas têm um período de vida limitado em cultura e geralmente morrem emcerca de duas semanas. Portanto, as únicas células que podem sobrevivernos meios seletivos são os híbridos formados de células de mieloma e B.

Essa cultura fornece uma população de hibridomas da qual hi-bridomas específicos são selecionados. Tipicamente, a seleção de hibrido-mas é realizada por cultivo das células por diluição em clone único em pla-cas de microtitulação, seguido de teste dos sobrenadantes clonais individu-ais (depois de cerca de duas a três semanas) quanto à reatividade deseja-da. A análise deve ser sensível, simples e rápida, tal como radioimunoanáli-ses, imunoanálises de enzima, análises de citotoxidez, análises de placaanálises de imunoligação a mácula ("dot immunobinding assays")e outras.

Os hibridomas selecionados são então seguidamente diluídos eclonados em linhagens celulares produtoras de anticorpos individuais, cujosclones podem ser então indefinidamente propagados para fornecer mAbs.As linhagens celulares podem ser explorados para produção de mAb de du-as maneiras básicas. Uma amostra do hibridoma pode ser injetada (freqüen-temente na cavidade peritoneal) em um animal histocompatível do tipo quefoi usado para fornecer as células somáticas e de mieloma para a fusão ori-ginal. O animal injetado desenvolve tumores que secretam o anticorpo mo-noclonal específico produzido pelo híbrido celular fundido. Os líquidos corpo-rais do animal, tais como soro ou líquido de ascite, podem ser então extraí-dos para dar mAbs em concentração elevada. As linhagens celulares indivi-duais também podem ser cultivadas in vitro, onde os mAbs são naturalmen-te secretados no meio de cultura do qual eles podem ser facilmente obtidosem concentrações elevadas. Os mAbs produzidos por qualquer meio podemser purificados, se desejado, usando filtração, centrifugação e vários méto-dos cromatográficos tais como HPLC e cromatografia por afinidade.

2.7 ELISAs e imunoprecipitação

ELISAs podem ser usados junto com a invenção. Em uma análi-se por ELISA, proteínas ou peptídios incorporando seqüências de antígenosde proteínas cristais são imobilizados em uma superfície selecionada, depreferência uma superfície que apresenta uma afinidade por proteína talcomo os compartimentos de uma placa de microtitulação de poliestireno.Depois de lavagem para remover o material incompletamente adsorvido, édesejável ligar ou revestir os compartimentos da placa de análise com umaproteína inespecífica que conhecida como sendo antigenicamente neutraem relação ao anti-soro de teste tal como albumina de soro bovino (BSA),caseína ou soluções de leite em pó. Isso permite o bloqueio de sítios de ad-sorção inespecíficos na superfície de imobilização e dessa forma reduz o("background") causado por ligação inespecífica de anti-soro sobre a super-fície.

Depois da ligação de material antigênico ao reservatório, reves-timento com um material não-reativo para reduzir o "background" e lavagempara remover o material não ligado, a superfície de imobilização é contatadacom o anti-soro ou extrato clínico ou biológico a ser testada de maneira útilpara a formação de complexo imunológico (antígeno/anticorpo). Essas con-dições de preferência incluem diluição do anti-soro com diluentes tais comoBSA, gama globulina bovina (BGG) e solução salina tamponada com fosfato(PBS)/Tween®. Esses agentes adicionados também tendem a ajudar naredução de "background" inespecífico. O anti-soro em camadas é então dei-xado incubar por cerca de 2 a cerca de 4 horas, a temperaturas de prefe-rência da ordem de cerca de 25° a cerca de 27°C. Depois da incubação, asuperfície contatada com anti-soro é lavada para remover material não imu-nocomplexado. Um procedimento de lavagem preferido inclui lavagem comuma solução tal como PBS/Tween® ou tampão de borato.

Depois da formação de imunocomplexos específicos entre aamostra de teste e o antígeno ligado e subsequente lavagem, a ocorrência equantidade constante de formação de imunocomplexo podem ser determi-nadas submetendo-se o mesmo a um segundo anticorpo tendo especifici-dade para o primeiro. Para fornecer um meio de detecção, o segundo anti-corpo de preferência vai ter uma enzima associada que vai gerar um desen-volvimento de cor mediante incubação com um substrato cromogênico a-propriado. Assim, por exemplo, é desejado contatar e incubar a superfícieligada a anti-soro com uma IgG anti-humana conjugada com urease ou pe-roxidase por um período de tempo e em condições que favorecem o desen-volvimento de formação de imunocomplexo (por exemplo, incubação por 2horas à temperatura ambiente em uma solução contendo PBS tal como PBSTween®).

Depois da incubação com o segundo anticorpo etiquetado comenzima e subsequente lavagem para remover o material não ligado, a quanti-dade de rótulo é quantificada por incubação com um substrato cromogênicotal como púrpura de uréia e bromocresol ou ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolina)-6-sulfônico (ABTS) e H2O2, no caso de peroxidase como o rótu-lo de enzima. A quantificação é então obtida por medição do grau de geraçãode cor, por exemplo usando um espectrofotômetro de espectro visível.

Os anticorpos de proteínas anticristais da presente invenção sãoparticularmente úteis para o isolamento de outros antígenos de proteínacristal por imunoprecipitação. Imunoprecipitação envolve a separação dòcomponente antígeno-alvo de uma mistura de complexos, e é usada paradiscriminar ou isolar quantidades diminutas de proteína. Para o isolamentode proteínas membranosas, células devem ser solubilizadas em micelasdetergentes. Sais não-iônicos são preferidos, uma vez que outros agentestais como sais de bile, precipitam em pH ácido ou na presença de cátionsbivalentes.

Em uma modalidade alternativa, os anticorpos da presente in-venção são úteis para a estreita justaposição de dois antígenos. Isso é par-ticularmente útil para aumentar a concentração localizada de antígenos, porexemplo pares de enzima-substrato.

2.8 "Western Blots"

As composições da presente invenção vão encontrar grandeutilidade em análise do "imunoblott" ou da "wertem blot". Os anticorpos deantipeptídio podem ser usados como reagentes primários de alta afinidadepara a identificação de proteínas imobilizadas sobre uma matriz suporte só-lida, tal como nitrocelulose, nylon ou combinações das mesmas. Junto comimunoprecipitação, seguida de eletroforese em gel, estes podem ser usadoscomo reagente de uma única etapa para uso na detecção de antígenos con-tra os quais reagentes secundários usados na detecção do antígeno cau-sam um "background" adverso. Isso é especialmente útil quando os antíge-nos estudados são imunoglobulinas (impossibilitando o uso de imunoglobu-linas ligando componentes de paredes de células bacterianas), os antígenosestudados sofrem reação cruzada com o agente de detecção, ou migram aomesmo peso molecular relativo que um sinal de reação cruzada.

Métodos de detecção imunológicos para uso junto com a técnicada "Western blotting" incluem anticorpos secundários enzimaticamente, ra-diomarcado ou fluorescentemente etiquetados contra a porção toxina sãoconsiderados de uso particular nesse contexto.

2.9 Seleção de proteínas cristais e kits de detecção

A presente invenção também fornece métodos e kits para análi-se de amostras suspeitas de conter polipeptídios de proteínas cristais oupolipeptídios relacionados com proteínas cristais, ou células produtoras des-tes polipeptídios. Um kit pode conter um ou mais anticorpos da presente in-venção, e também pode conter reagentes para detecção de uma interaçãoentre uma amostra e um anticorpo da presente invenção. O(s) reagente(s)fornecido(s) pode(m) ser rádio, fluorescentemente ou enzimaticamente rotu-lado. O kit pode conter um agente radiorrotulado conhecido capaz de se Ii-gar a um ácido nucléico ou anticorpo da presente invenção, ou interagir como mesmo.

O(s) reagente(s) do kit pode(m) ser fornecido(s) como uma solu-ção líquida, preso a um suporte sólido ou como pó seco. De preferência,quando o(s) reagente(s) é(são) fornecido(s) em uma solução líquida, a solu-ção líquida é uma solução aquosa. De preferência, quando o(s) reagente(s)fornecido(s) está(ão) preso(s) a um suporte sólido, o suporte sólido pode ser-um meio de cromatografia, uma placa de teste tendo uma pluralidade decompartimentos, ou uma lâmina de microscópio. Quando o(s) reagente(s)fornecido(s) é(são) um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição deum solvente adequado, que pode ser fornecido.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção refere-se amétodos de imunodetecção e kits associados. Foi proposto que as proteínasou peptídios cristais da presente invenção podem ser empregadas para de-tectar anticorpos tendo reatividade com os mesmos ou, alternativamente,anticorpos preparados de acordo com a presente invenção podem ser em-pregados para detectar proteínas cristais ou peptídios contendo epítoposrelacionados com proteína cristal. Em geral, esses métodos vão incluir pri-meiro a obtenção de uma amostra suspeita de conter tal proteína, peptídioou anticorpo, o contato da amostra com um anticorpo ou peptídio de acordocom a presente invenção, conforme o caso, em condições eficazes parapermitir a formação de um imunocomplexo, e em seguida a detecção dapresença do imunocomplexo.

Em geral, a detecção de formação de imunocomplexo é bastan-te conhecida na técnica e pode ser obtida através da aplicações de numero-sos métodos. Por exemplo, a presente invenção verifica a aplicação de téc-nicas de ELISA, RIA, "imunoblot" (por exemplo, "dot blot"), imunofluorescên-cia indireta e outras. Geralmente, a formação de imunocomplexo vai ser de-tectada através do uso de um rótulo, tal como um radiorrótulo ou uma eti-queta de enzima (tal como fosfatase alcalina, peroxidase da raiz-forte ououtra). Naturalmente, podem ser encontradas vantagens adicionais atravésdo uso de um Iigante de ligação secundária tal como um segundo anticorpoou uma disposição de ligação a Iigante de biotina/avidina, como conhecidona literatura.

Para fins de análise, é proposto que se pode empregar virtual-mente qualquer amostra suspeita de compreender seja uma proteína oupeptídio cristal ou um peptídio ou anticorpo relacionado com proteína cristalque se tenta detectar, conforme o caso. É considerado que essas modalida-des podem ter aplicaçãana titulação de amostras de antígeno ou anticorpo,na seleção de hibridomas e outros. Em modalidades relacionadas, a presen-te invenção verifica a preparação de kits que podem ser empregados paradetectar a presença de proteínas cristais ou peptídios e/ou anticorpos rela-cionados em uma amostra. As amostras podem incluir células, sobrenadan-tes de células, suspensões de células, extratos de células, frações de enzi-mas, extratos de proteínas ou outras composições livres de células suspei-tas de conter proteínas ou peptídios cristais. De um modo geral, kits de a-cordo com a presente invenção vão incluir uma proteína cristal, peptídio ouum anticorpo adequado direcionado contra tal proteína ou peptídio, juntocom um reagente de imunodetecção e um meio para contatar o anticorpo ouantígeno e reagente. O reagente de imunodetecção irá tipicamente compre-ender um rótulo associado com o anticorpo ou antígeno, ou associado comum iigante de ligação secundária. Ligantes exemplificativos podem incluirum anticorpo secundário direcionado contra o primeiro anticorpo ou antíge-no ou um Iigante de biotina ou avidina (ou estreptavidina) tendo um rótuloassociado. Naturalmente, como observado acima, inúmeros rótulos exempli-ficativos são conhecidos na literatura e todos esses rótulos podem ser em-pregados junto com a presente invenção.

O recipiente geralmente vai incluir um vial no qual o anticorpo,antígeno ou reagente de detecção pode ser colocado, e de preferência ade-quadamente separado em alíquotas. Os kits da presente invenção tambémvão tipicamente incluir um meio para conter os recipientes de anticorpo, an-tígeno e reagente hermeticamente fechado para venda comercial. Essesrecipientes podem incluir recipientes de plástico injetável ou moldado porsopro nos quais os viais desejados são retidos.

2.10 Seqüências de núcleos epitópicos

A presente invenção também se refere a composições de prote-ína ou peptídio,· isentas de células totais e outros peptídios, que compreen-dem uma proteína ou peptídio purificado que incorpora um epítopo que éimunologicamente reativo cruzado com um ou mais anticorpos de proteínaanti-cristal. Em particular, a invenção se refere a seqüências de núcleo epi-tópicos derivadas de proteínas ou peptídios Cry.

Como aqui usada, a expressão "incorporando um epítopo(s) queé imunologicamente reativo cruzado com um ou mais anticorpos de proteínaanticristal" refere-se a um antígeno de peptídio ou proteína que inclui umaestrutura primária, secundária ou terciária similar a um epítopo localizadoem uma proteína ou polipeptídio cristal. O nível de similaridade geralmenteserá de um grau tal que anticorpos monoclonais ou policlonais direcionadoscontra a proteína ou polipeptídio cristal também vão se ligar ao antígeno depeptídio ou proteína reativo cruzado, reagir com o mesmo ou de algumaforma reconhecer o mesmo. Vários métodos de imunoanálise podem serempregados junto com esses anticorpos, tais como, por exemplo, a técnicada "Western Blot", ELISA, RIA e outros, todos sendo conhecidos pelos ver-sados na técnica.

A identificação de epítopos imunodominantes Cry1 e/ou seusequivalentes funcionais, adequados para uso em vacinas é um assunto rela-tivamente fácil. Por exemplo, pode-se empregar os métodos de Hopp, comoensinado na patente US 4.554.101, aqui incorporada a título de referência,que ensina a identificação e preparação de epítopos a partir de seqüênciasde aminoácidos com base na hidrofilicidade. Os métodos descritos em vá-rios outros papéis, e programas de software com base nos mesmos, tam-bém podem ser usados para identificar seqüências de núcleos epitópicas(veja, por exemplo, Jameson & Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; Patente US N04.554.101). A seqüência de aminoácidos dessas "seqüências de núcleosepitópicas" pode ser então facilmente incorporada em peptídios, seja atra-vés da aplicação de síntese de peptídios ou de tecnologia recombinante.

Peptídios preferidos para uso de acordo com a presente inven-ção geralmente terão da ordem de cerca de 8 a cerca de 20 aminoácidos decomprimento, e mais preferivelmente cerca de 8 a cerca de 15 aminoácidosde comprimento. Foi proposto que peptídios derivados de proteína cristalantigênicos mais curtos vão oferecer vantagens em certas circunstâncias,por exemplo, na preparação de análises de detecção imunológica. Vanta-gens exemplificativas incluem a facilidade de preparação e purificação, ocusto relativamente baixo e reprodutibilidade aperfeiçoada de produção, ebiodistribuição vantajosa.

Foi proposto que vantagens particulares da presente invençãopodem ser realizadas através da preparação de peptídios sintéticos que in-cluem seqüências de núcleos epitópicos/imunogênicos modificados e/ouestendidos que resultam em um peptídio epitópico "universal" direcionadopara proteínas cristais, e em particular Cry e seqüências relacionadas comCry. Essas seqüências de núcleos epitópicos são aqui identificadas em as-pectos particulares como regiões hidrófilas do antígeno de polipeptídio parti-cular. Propõe-se que essas regiões representem aquelas que são as maisprováveis de promover estimulação de célula T ou célula B e, assim, causara produção de anticorpos específicos.Uma seqüência de núcleos epitópicos, conforme aqui usado, éuma extensão relativamente curta de aminoácidos que é "complementar"aos sítios de ligação a antígeno nos anticorpos direcionados para proteínacristal aqui apresentados, e portanto vai se ligar aos mesmos. Adicionalmen-te ou alternativamente, uma seqüência de núcleos epitópicos é aquela quevai dar origem a anticorpos que são reativos cruzados com anticorpos dire-cionados contra as composições de peptídio da presente invenção. Ficaráentendido que, no contexto da presente invenção, o termo "complementar"refere-se a aminoácidos ou peptídios que apresentam uma força de atraçãoentre si. Assim, certas seqüências de núcleos epitópicos da presente inven-ção podem ser operacionalmente definidas em termos de sua capacidadepara competir com a ligação do antígeno de proteína desejado com o anti-soro direcionado para proteína correspondente, ou talvez deslocar a mesma.

Em geral, não se acredita que o tamanho do antígeno de poli-peptídio seja particularmente crucial, desde que ele seja suficientementegrande para transportar a seqüência ou seqüências de núcleos identifica-das. A menor seqüência de núcleos útil prevista pela presente invenção ge-ralmente teria um comprimento da ordem de cerca de 8 aminoácidos, comseqüências da ordem 10 a 20 sendo mais preferidas. Assim, esse tamanhogeralmente vai corresponder aos menores antígenos de peptídio preparadosde acordo com a invenção. No entanto, o tamanho do antígeno pode sermaior quando desejado, desde que ele contenha uma seqüência de núcleosepitópicos básica.

A identificação de seqüências de núcleos epitópicos é conhecidapelos versados na técnica, por exemplo, como descrito na patente US4.554.101, aqui incorporada a título de referência, que ensina a identificaçãoe preparação de epítopos de seqüências de aminoácidos com base na hi-drofilicidade. Além disso, numerosos programas de computador encontram-se disponíveis para uso na previsão de porções antigênicas de proteínas(veja, por exemplo, Jameson & Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Programas deanálise computadorizada de seqüências de peptídios (por exemplo, o soft-ware DNAStar®, DNAStar, Inc., Madison, Wl) também podem ser úteis nacriação de peptídios sintéticos de acordo com a presente invenção.

Sínteses de seqüências epitópicas, ou de peptídios que incluemum epítopo antigênico em sua seqüência, são facilmente realizadas usandotécnicas de síntese convencionais tal como o método de fase sólida (porexemplo, através do uso de um sintetizador de peptídio comercialmente dis-ponível tal como um Sintetizador de Peptídio Modelo 430A da Applied Bi-osystems). Antígenos de peptídio sintetizados desta maneira podem ser en-tão divididos em alíquotas em quantidades predeterminadas e armazenadosde formas convencionais, tal como em soluções aquosas ou ainda mais pre-ferivelmente em um pó ou estado Iiofilizado para uso iminente.

Em geral, devido à estabilidade relativa dos peptídios, eles po-dem ser facilmente armazenados em soluções aquosas por períodos detempo razoavelmente longos se desejado, por exemplo até seis meses oumais, em virtualmente qualquer solução aquosa sem degradação ou perdade atividade antigênica apreciável. No entanto, onde é considerado armaze-namento aquoso prolongado geralmente será desejável incluir agentes queincluem tampões tais como tampões de Tris ou fosfato para manter um pHde cerca de 7,0 a cerca de 7,5. Além disso, pode ser desejável incluir agen-tes que inibam crescimento microbiano, tais como azida de sódio ou Merthi-olate. Para armazenamento prolongado em estado aquoso vai ser desejávelarmazenar as soluções a cerca de 4°C ou, mais preferivelmente, congela-das. Naturalmente, onde os peptídios são armazenados em um estado Iiofi-lizado ou em pó, eles podem ser armazenados virtualmente indefinidamen-te, por exemplo, em alíquotas dosada's que podem ser reidratadas com umaquantidade predeterminada de água (de preferência destilada) ou tampãoantes do uso.

2.11 Equivalentes funcionais biológicos

Modificação e alterações podem ser feitas na estrutura dos pep-tídios da presente invenção e dos segmentos de DNA que os codificam eainda obter uma molécula funcional que codifica uma proteína ou peptídiocom características desejáveis. A seguir encontra-se uma discussão combase na alteração dos aminoácidos de uma proteína para criar um equiva-lente, ou mesmo uma molécula de segunda geração aperfeiçoada. Em mo-dalidades particulares da invenção, proteínas cristais alteradas são conside-radas úteis para aumentar a atividade inseticida da proteína, e consequen-temente aumentar a atividade inseticida e/ou a expressão do transgene re-combinante em uma célula vegetal. As alterações nos aminoácidos podemser obtidas alterando-se os códons da seqüência de DNA, de acordo com oscódons dados na Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 38</column></row><table>Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos poroutros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda significativa decapacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, re-giões de ligação a antígeno de anticorpos ou sítios de ligação em moléculasde substrato. Como é a capacidade interativa e a natureza de uma proteínaque definem a atividade funcional biológica da proteína, certas substituiçõesnas seqüências de aminoácidos podem ser feitas em uma seqüência de pro-teína e, naturalmente, em sua seqüência de codificação de DNA subjacente,e não obstante obter uma proteína com propriedades similares. É assimconsiderado pelos inventores que várias alterações podem ser feitas nasseqüências de peptídios das composições apresentadas, ou nas seqüênciasde DNA correspondentes que codificam os referidos peptídios sem perdasignificativa de sua utilidade ou atividade biológica.

Para fazer essas alterações, deve-se levar em consideração oíndice hidropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropático doaminoácido para conferir função biológica interativa a uma proteína é geral-mente conhecida na técnica (Kyte & Doolittle, 1982, aqui incorporada a títulode referência). Aceita-se que o caráter hidropático relativo do aminoácidocontribui para a estrutura secundária da proteína resultante que, por suavez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo en-zimas, substratos, receptores, DNA1 anticorpos, antígenos e outros.

Cada aminoácido recebeu um índice hidropático com base emsua hidrofobicidade e características de carga (Kyte & Doolittle, 1982), estessão: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); Ieucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); ciste-ína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofanio (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5);Iisina (-3,9) e arginina (-4,5).

Sabe-se na técnica que certos aminoácidos podem ser substitu-idos por outros aminoácidos tendo um índice ou escore hidropático similar eainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, aindaobter uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Para fazer essasalterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos variamentre ± 2 é preferida, os que variam entre ± 1 são particularmente preferi-dos, e os entre ± 0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

É também entendido na técnica que a substituição de aminoáci-dos similares pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A pa-tente US 4.554.101, aqui incorporada a título de referência, relata que a hi-drofilicidade média local mais elevada de uma proteína, segundo reguladapela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, está correlacionadacom uma propriedade biológica da proteína.

Como detalhado na patente US 4.554.101, os seguintes valoresde hidrofilicidade foram dados aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0);Iisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); aspara-gina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); ala-nina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); Ieuci-na (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Fica entendido que um aminoácido pode ser substituído por ou-tro tendo um vaJor de hidrofilicidade similar e ainda obter uma proteína bio-Iogicamente equivalente e, em particular, imunologicamente equivalente.Nessas alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofili-cidade variam entre ± 2 é preferida, aqueles que variam entre ± são particu-larmente preferidos, e aqueles que variam entre ± 0,5 são ainda mais parti-cularmente preferidos.

Como descrito acima, as substituições de aminoácidos são por-tanto geralmente com base na similaridade relativa dos substituintes da ca-deia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicida-de, carga, tamanho e outros. Substituições exemplificativas que levam emconsideração várias das características precedentes são bastante conheci-das na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina etreonina; glutamina e asparagina; e valina, Ieucina e isoleucina.

2.12 Composições de proteína cristal como inseticidas e métodos de uso

Os inventores consideram que as composições de proteína cris-tal aqui descritas vão encontrar utilidade particular como inseticidas paraaplicação tópica e/ou sistêmica a culturas de campo, gramas, frutas e vege-tais, e plantas ornamentais. Em uma modalidade preferida, a composiçãobioinseticida compreende uma suspensão escoável em óleo de células bac-terianas que expressa uma nova proteína cristal aqui apresentada. De prefe-rência, as células são células de B. thuringiensis EG10327, no entanto,qualquer célula hospedeira bacteriana expressando os novos segmentos deácidos nucléicos aqui descritos e produzindo uma proteína cristal é verifica-da como útil, tal como B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coii ouPseudomonas spp.

Em uma outra modalidade importante, a composição bioinsetici-da compreende um grânulo dispersavel em água. Este grânulo compreendecélulas bacterianas que expressam uma nova proteína cristal aqui descrita.Células bacterianas preferidas são células de B. thuringiensis EG10327, noentanto, bactérias tais como células de B. thuringiensis, B. megaterium, B.subtilis, E. coii ou Pseudomonas spp. transformadas com um segmento deDNA descrito nesta invenção e expressando a proteína cristal também sãoconsideradas úteis.

Em uma terceira modalidade importante, a composição bioinse-ticida compreende um pó umectável, poeira, pélete ou concentrado coloidal.Este pó compreende células bacterianas que expressam uma nova proteínacristal aqui descrita. Células bacterianas preferidas são células de B. thurin-giensis EG10327, no entanto, bactérias tais como células de B. thuringien-sis, B. megaterium, B. subtilis, E. coii ou Pseudomonas spp. transformadascom um segmento de DNA descrito nesta invenção e expressando a proteí-na cristal também são consideradas úteis. Essas formas secas das compo-sições inseticidas podem ser formuladas para se dissolver imediatamentecom umectação ou, alternativamente, se dissolver na forma de liberaçãocontrolada, de liberação contínua ou outra forma dependente do tempo.

Em uma quarta modalidade importante, a composição bioinseti-cida compreende uma suspensão aquosa de células bacterianas, tais comoaquelas descritas acima que expressam a proteína cristal. Essas suspen-sões aquosas podem ser fornecidas como uma solução de estoque concen-trada que é diluída antes da aplicação ou, alternativamente, como uma solu-ção diluída pronta para aplicar.

Para esses métodos que envolvem a aplicação de células bacte-rianas, o hospedeiro celular contendo o(s) gene(s) de proteína cristal podeser cultivado em qualquer meio nutriente conveniente, onde a construção deDNA oferece uma vantagem seletiva, proporcionando um meio seletivo paraque substancialmente todas ou todas as células retenham o gene de B. thu-ringiensis. Essas células podem ser então colhidas de acordo com maneirasconvencionais. Alternativamente, as células podem ser tratadas antes dacolheita.

Quando as composições inseticidas compreendem células de B.thuringiensis contendo a proteína de interesse, essas bactérias podem serformuladas de várias maneiras. Elas podem ser empregadas como pós,grânulos ou poeiras umectáveis, por misturação com vários materiais iner-tes, tais como minerais inorgânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fos-fatos e outros) ou materiais botânicos (espigas de milho em pó, cascas dearroz, cascas de noz e outros). As formulações podem incluir adjuvantes deespalhamento-adesão, agentes estabilizantes, outros aditivos pesticidas outensoativos. Formulações líquidas podem ser aquosas ou não-aquosas eempregadas como espumas, suspensões, concentrados emulsificáveis eoutros. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emul-sificantes, dispersantes ou polímeros.

Alternativamente, as novas proteínas cristais CryET33 e/ou Cr-yET34 podem ser preparadas por sistemas de expressão bacteriana nativosou recombinantes in vitro e isoladas para subsequente aplicação em campo.Essa proteína pode estar em lisados, suspensões, colóides etc. de célulasbrutas ou, alternativamente, pode ser purificada, refinada, tamponada e/ouainda processada, antes da formulação em uma formulação biocida ativa.De maneira similar, em certas circunstâncias, pode ser desejável isolar cris-tais e/ou esporos de culturas bacterianas expressando a proteína cristal eaplicar soluções, suspensões ou preparações coloidais desses cristais e/ouesporos como a composição bioinseticida ativa.Independente do método de aplicação, o(s) componente(s) ati-vo(s) são aplicados a uma quantidade inseticidamente eficaz, que vai variardependendo de fatores tais como, por exemplo, os insetos coleópteros es-pecíficos a serem controlados, a planta ou cultura específica a ser tratada,as condições ambientais, e o método, a taxa e a quantidade de aplicação dacomposição inseticidamente ativa.

As composições inseticidas descritas podem ser feitas por for-mulação da suspensão de células, cristais e/ou esporos bacterianos, ou docomponente proteína isolada com o veículo agricolamente aceitável deseja-do. As composições podem ser formuladas antes da administração em ummeio apropriado tal como um meio liofilizado, secado por congelamento,dessecada ou em um veículo ou meio aquoso ou um diluente adequado, talcomo solução salina ou outro tampão. As composições formuladas podemestar na forma de um material em pó ou granular, ou uma suspensão emóleo (vegetal ou mineral), ou emulsões de água ou óleo/água, ou como umpó umectável, ou em combinação com qualquer outro material carreadoradequado para aplicação agrícola. Veículos agrícolas adequados podem sersólidos ou líquidos e são bastante conhecidos na técnica. O termo "veículoagricolamente aceitável" cobre todos os adjuvantes, por exemplo, compo-nentes inertes, dispersantes, tensoativos, aderentes, aglutinantes etc. quesão comumente usados na tecnologia de formulação de inseticida; estessão bastante conhecidos pelos versados na formulação de inseticida. Asformulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvantes sólidos oulíquidos e preparadas de várias maneiras, por exemplo, por misturação ho-mogênea, combinação e/ou trituração da composição inseticida com adju-vantes adequados usando técnicas de formulação convencionais.

As composições inseticidas desta invenção são aplicadas aoambiente do inseto coleóptero-alvo, tipicamente sobre a folhagem da plantaou cultura a ser protegida, por métodos convencionais, de preferência poraspersão. A concentração e duração da aplicação inseticida vão ser ajusta-das de acordo com as condições específicas para a(s) praga(s), cultura(s)particulares) a ser(em) tratada(s) e condições ambientais particulares. Arazão proporcional de ingrediente ativo para veículo naturalmente vai de-pender da natureza química, solubilidade e estabilidade da composição in-seticida, bem como da formulação particular verificada.

Outras técnicas de aplicação, por exemplo, polvilhamento, es-pargimento, imersão, injeção no solo, revestimento de semente, revestimen-to de muda, aspersão, aeração, enevoamento, atomização e outras tambémsão viáveis e podem ser requeridas em determinadas circunstâncias taiscomo, por exemplo, insetos que provocam infestação da raiz ou talo, ou pa-ra aplicação à vegetação delicada ou plantas ornamentais. Esses procedi-mentos de aplicação também são bastante conhecidos pelos versados natécnica.

A composição inseticida da invenção pode ser empregada nométodo da invenção isolada ou em combinação com outros compostos queincluem, porém sem limitação, outros pesticidas. O método da invençãotambém pode ser usado em conjunto com outros tratamentos tais como ten-soativos, detergentes, polímeros ou formulações de liberação com o tempo.As composições.inseticidas da presente invenção podem ser formadas parauso sistêmico ou tópico.

A concentração da composição inseticida que é usada para apli-cação ambiental, sistêmica ou foliar vai variar amplamente dependendo danatureza da formulação particular, do meio de aplicação, das condições am-bientais e do grau de atividade biocida. Tipicamente, a composição bioinse-ticida vai estar presente na formulação aplicada a uma concentração de pelomenos cerca de 1 % em peso e pode ser de até e inclusive cerca de 99% empeso. Formulações secas das composições podem variar de cerca de 1 % acerca de 99% ou mais em peso da composição, ao passo que formulaçõeslíquidas geralmente vão compreender de cerca de 1% a cerca de 99% empeso ou mais do ingrediente ativo. Formulações que compreendem célulasbacterianas intatas geralmente vão conter de cerca de 104 a cerca de107 células/mg.

A formulação inseticida pode ser administrada a uma planta par-ticular ou uma área-alvo em uma ou mais aplicações conforme necessário,com uma típica taxa de aplicação em campo por hectare variando da ordemde cerca de 50 g a cerca de 500 g de ingrediente ativo, ou de cerca de 500g a cerca de 1000 g, ou de cerca de 1000 g a cerca de 5000 g ou mais deingrediente ativo.

3. Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos fazem parte do presente relatório descritivo e es-tão incluídos para demonstrar melhor certos aspectos da presente invenção.A invenção será melhor entendida com referência a um ou mais desses de-senhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades espe-cíficas aqui apresentadas.

As figura 1A, figura 1B e figura C mostram a seqüência de basesde nucleotídeos do gene cryET33 (SEQ ID N0 1) e do gene cryET34 (SEQID N°2), e a seqüência de aminoácidos deduzida correspondente da proteí-na CryET33 (SEQ ID N0 3) e da proteína CryET34 (SEQ ID N0 4).

A figura 2 mostra um mapa de restrição de pEG246. As localiza-ções e orientações do gene cryET33 (SEQ ID N0 1) e do gene cryET34(SEQ ID N°2) estão indicadas por setas. pEG246 é funcional em E. coli umavez que é derivado de pBR322, e é resistente à ampicilina (AmpR). As abre-viações dos sítios de clivagem de endonuclease de restrição são as seguin-tes: R = EcoRIl B = BamH\. Também mostrado na figura 2 está um marca-dor de tamanho de um quilobase (1 kb).

A figura 3, alinhada com a figura 2 e com base na mesma esca-la, mostra um mapa de restrição de pEG1246. As localizações e orientaçõesdo gene cryET33 (SEQ ID N0 1) e do gene cryET34 (SEQ ID N°2) estão in-dicadas por setas. pEG1246 é derivado do plasmídio pEG246 (figura 2) econtém o plasmídio pNN101 de Bacillus spp. (que expressa tanto resistênciaa cloranfenicol [CamR] como a resistência à tetraciclina [TetR]) inserido nosítio BamHl de pEG246. pEG1246 é funcional tanto em E. coli como em B.thuringiensis. As abreviações são as mesmas que as da figura 2.

4. Descrição de Modalidades Ilustrativas

4.1 Algumas vantagens da invenção

B. thuringiensis EG10327 é uma cepa natural que apresentaatividade herbicida contra insetos coleópteros que incluem gorgulho do al-godão, larvas de tribólio (Tribolium castaneum) e larvas de besouro japonês(Popillia japonica). B. thuringiensis EG2158 contém genes de proteínas cris-tais tóxicas para coleópteros similares aos genes das proteínas cristais deEG10327 ou idênticos aos mesmos. Dois novos genes de toxina cristal, de-signados c/yET33 e cryET34, foram clonados de EG2158. O gene cryET33codifica a proteína cristal CryET33 de 29 kDa, e o gene CryET34 codifica aproteína cristal CryET34 de 14 kDa. As proteínas cristais CryET33 e Cr-yET34 são tóxicas para larvas de tribólio, larvas de gorgulho do algodão elarvas de besouro japonês.

4.2 Definições

As palavras e expressões a seguir têm os significados apresen-tados abaixo.

Expressão: a combinação de processos intracelulares, inclusivetranscrição e translação, sofridos por uma molécula de DNA de codificaçãotal como um gene estrutural para produzir um polipeptídio.

Promotor: um sítio de reconhecimento em uma seqüência deDNA ou grupo de seqüências de DNA que fornecem um elemento de contro-le de expressão para um gene estrutural e ao qual RNA polimerase especifi-camente se liga e inicia a síntese de RNA (transcrição) daquele gene.

Regeneração: o processo de crescimento de uma planta a partirde uma célula vegetal (por exemplo, protoplasto ou explante vegetal).

Gene estrutural: um gene que é expresso para produzir um poli-peptídio.

Transformação: um processo de introdução de uma seqüênciade DNA exógena (por exemplo um vetor, uma molécula de DNA recombi-nante) em uma célula ou protoplasto no qual o DNA exógeno é incorporadoem um cromossomo ou é capaz de replicação autônoma.

Célula transformada: uma célula cujo DNA fora alterado pelaintrodução de uma molécula de DNA exógena naquela célula.

Célula transqênica: qualquer célula derivada ou regenerada deuma célula transformada ou derivada de uma célula transgênica. Célulastransgênicas exemplificativas incluem calos vegetais derivados de uma célu-la vegetal transformada e células particulares tais como células de folha,raiz, caule, por exemplo, somáticas, ou células reprodutoras (germes) obti-das de uma planta transgênica.

Planta transgênica: uma planta ou progênie da mesma derivada

de uma célula ou protoplasto vegetal transformado, onde o DNA da plantacontém uma molécula de DNA exógena introduzida não originalmente pre-sente em uma planta não transgênica nativa da mesma cepa. As expres-sões "planta transgênica" e "planta transformada" foram às vezes usadas naliteratura como sinônimos para definir uma planta cujo DNA contém umamolécula de DNA exógena. No entanto, acredita-se ser mais cientificamentecorreto referir-se a uma planta ou calo regenerado obtido de uma célula ouprotoplasto vegetal transformado como sendo uma planta transgênica, eesse uso será seguido nesta invenção.

Vetor: uma molécula de DNA capaz de replicação em uma célu-la hospedeira e/ou à qual um outro segmento de DNA pode ser operacio-nalmente ligado para efetuar replicação do segmento ligado. Um plasmídio éum exemplo de vetor.

4.2 Sondas e iniciadores

Em um outro aspecto, as informações de seqüência de DNAoferecidas pela invenção possibilitam a preparação de seqüências de DNA(ou RNA) relativamente curtas tendo capacidade de hibridizar especifica-mente em seqüências de genes dos polinucleotídeos selecionados apresen-tados nesta invenção. Nesses aspectos, sondas de ácidos nucléicos decomprimento apropriado são preparadas com base em uma consideraçãode uma seqüência de genes de proteína cristal, por exemplo uma seqüênciatal como mostrada na SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2. A capacidade dessesDNAs e sondas de ácidos nucléicos para hibridizar especificamente em umaseqüência de genes codificando uma proteína cristal torna-os de utilidadeparticular em uma variedade de modalidades. Mais importante, as sondaspodem ser usadas em várias análises para detecção da presença de se-qüências complementares em uma dada amostra.Em certas modalidades, é vantajoso usar iniciadores de oligonu-cleotídeos. A seqüência desses iniciadores é designada usando-se um poli-nucleotídeo da presente invenção para uso na detecção, ampliação ou mu-tação de um segmento definido de um gene de proteína cristal de B. thurin-giensis usando tecnologia de PCR®. Segmentos de genes de proteína cris-tal relacionados de outras espécies também podem ser ampliados por Ρ-ΟΚ® usando esses iniciadores.

Para fornecer algumas das vantagens de acordo com a presenteinvenção, uma seqüência de ácidos nucléicos empregada para estudos ouensaios de hibridização inclui seqüências que são complementares a pelomenos uma extensão de aproximadamente 14 a 30 nucleotídeos de com-primento de uma seqüência codificando uma proteína cristal, tal como aque-la mostrada na SEQ ID N0 1 ou SEQ ID N0 2. Um tamanho de pelo menos14 nucleotídeos de comprimento ajuda a assegurar que o fragmento será detamanho suficiente para formar uma molécula dúplex que é estável e seleti-va. Moléculas tendo seqüências complementares a extensões com mais de14 bases de comprimento são geralmente preferidas, contudo, para aumen-tar a estabilidade e a seletividade do híbrido, e dessa forma melhorar a qua-lidade e o grau de moléculas híbridas específicas obtidas. Geralmente serápreferido criar moléculas de ácidos nucléicos tendo extensões de 14 a 20nucleotídeos complementares ao gene, ou ainda maiores quando desejado.Esses fragmentos podem ser facilmente preparados, por exemplo, por sinte-tização direta do fragmento por meios químicos, por aplicação da tecnologiade reprodução de ácidos nucléicos, tal como a tecnologia de PCR® das Pa-tentes US 4.683.195 e 4.683.202, aqui incorporadas a título de referência,ou por excisão de fragmentos de DNA selecionados de plasmídios recombi-nantes contendo inserções apropriadas e sítios de restrição adequados.

4.4 Vetores de expressão

A presente invenção verifica um vetor de expressão compreen-dendo um polinucleotídeo da presente invenção. Assim, em uma modalidade,um vetor de expressão é uma molécula de DNA isolada e purificada compre-endendo um promotor operacionalmente ligado a uma região de codificaçãoque codifica um polipeptídio da presente invenção, região de codificação essaque é operacionalmente ligada a uma região de término de transcrição, peloque o promotor promove a transcrição da região de codificação.

Como aqui usado, a expressão "operacionalmente ligado" signi-fica que um promotor é conectado a uma região de codificação de tal manei-ra que a transcrição dessa região de codificação é controlada e regulada poraquele promotor. Meios para operacionalmente ligar um promotor a umaregião de codificação são bastante conhecidos na técnica.

Em uma modalidade preferida, a expressão recombinante deDNAs codificando as proteínas cristais da presente invenção é preferível emuma célula hospedeira de Bacillus. Células hospedeiras preferidas incluemB. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis e bacilos relacionados, com célu-las hospedeiras de B. thuringiensis sendo altamente preferidas. Promotoresque funcionam em bactérias são bastante conhecidos na literatura. Umpromotor exemplificativo e preferido para as proteínas cristais de Bacillusincluem todos os promotores de genes de proteína cristal conhecidos, inclu-indo o promotor do gene c/yET33 e cryET34. Alternativamente, promotoresde genes codificando proteína cristal mutageneizada ou recombinante po-dem ser construídos pela mão do homem e usados para promover a ex-pressão dos novos segmentos de genes apresentados nesta invenção.

Em uma. modalidade alternativa, a expressão recombinante deDNAs codificando as proteínas cristais da presente invenção é realizadausando-se um bactéria gram-negativa transformada tal como uma célulahospedeira de E. coli ou Pseudomonas spp. Promotores que funcionam emalto nível de expressão de polipeptídios-alvos em células hospedeiras gram-negativas de E. coli e outras também são bastante conhecidos na técnica.

Onde um vetor de expressão da presente invenção é usado pa-ra transformar uma planta, é selecionado um promotor que tem a capacida-de de promover a expressão em plantas. Promotores que funcionam emplantas também são bastante conhecidos na técnica. Úteis na expressão dopolipeptídio em plantas são os promotores que são induzíveis, viróticos, sin-téticos, constitutivos como descrito (Poszkowski et ai., 1989; Odell et al.,1985), e temporariamente regulados, espacialmente regulados e espaço-temporalmente regulados (Chau et ai., 1989).

Um promotor também é selecionado por sua capacidade de di-recionar a atividade transcricional da célula vegetal transformada ou da plan-ta transgênica para a região de codificação. Genes estruturais podem seracionados por uma variedade de promotores em tecidos vegetais. Os pro-motores podem ser quase-constitutivos, tal como o promotor CaMV 35S, oupromotores específicos para tecido ou específicos para o desenvolvimentoque afetam dicotiledôneas ou monocotiledôneas.

Onde o promotor é um promotor quase-constitutivo tal comoCaMV 35S, são verificados aumentos na expressão de polipeptídios emuma variedade de tecidos vegetais transformados (por exemplo calo, folha,semente e raiz). Alternativamente, os efeitos da transformação podem serdirecionados para tecidos vegetais específicos usando-se vetores de inte-gração de planta contendo um promotor específico para tecido.

Um promotor específico para tecido exemplificativo é o promotorlectina, que é específico para tecido de semente. A proteína Lectina em se-mentes de soja é codificada um único gene (Le1) que é expresso apenasdurante e maturação da semente e responsável por cerca de 2 a cerca de5% do total de mRNA na semente. O gene lectina e o promotor específicopara semente foram totalmente caracterizados e usados para direcionar aexpressão específica para semente em plantas de tabaco transgênicas(Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al., 1990).

Um vetor de expressão contendo uma região de codificação quecodifica um polipeptídio de interesse é construído de modo a ficar sob o con-trole do promotor lectina e esse vetor é introduzido em plantas usando, porexemplo, um método de transformação de protoplasto (Dhir et al., 1991). Aexpressão do polipeptídio é direcionada especificamente para as sementesda planta transgênica.

Uma planta transgênica da presente invenção produzida de umacélula vegetal transformada com um promotor específico para tecido podeser cruzada com uma segunda planta transgênica desenvolvida de uma cé-lula vegetal transformada com um promotor específico para tecido diferentepara produzir uma planta transgênica híbrida que mostra os efeitos da trans-formação em mais de um tecido específico.

Promotores específicos para tecido exemplificativos são sacaro-se sintetase 1 de milho (Yang et al., 1990), álcool desidrogenase 1 de milho(Vogel et al., 1989), "light harvesting complex" de milho (Simpson, 1986),proteína de choque térmico de milho (Odell et al., 1985), RuBP carboxilasede subunidade pequena de ervilha (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al.,1983), manopina sintase do plasmídio Ti (Langridge et al., 1989), nopalinasintase do plasmídio Ti (Langridge et al., 1989), calcona isomerase de petú-nia (Van Tunen et al., 1988), proteína 1 rica em glicina de feijão (Keller et al.,1989), transcrição de CaMV 35s (Odell et al., 1985) e patatina de batata(Wenzler et al., 1989). Promotores preferidos são o vírus do mosaico dacouve-flor (CaMV 35S) e a RuBP carboxilase de subunidade pequena S-E9.

A escolha de qual vetor de expressão e finalmente a qual pro-motor uma região de codificação de polipeptídio será ligada depende dire-tamente das propriedades funcionais desejadas, por exemplo, da localiza-ção e do tempo de expressão da proteína, e da célula hospedeira a sertransformada. Estas são limitações básicas bastante conhecidas na técnicade construção de moléculas de DNA recombinantes. No entanto, um vetorútil na prática da presente invenção é capaz de direcionar a expressãoda região de codificação de polipeptídio à qual ele está operacionalmenteligado.

Vetores típicos úteis para expressão de genes em plantas supe-riores são bastante conhecidos na técnica e incluem vetores derivados doplasmídio indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito (Ro-gers et al., 1987). No entanto, sabe-se que vários outros sistemas de vetorintegrantes de planta funcionam em plantas, incluindo o vetor de controle detransferência pCaMVCN descrito (Fromm et al., 1985). O plasmídiopCaMVCN (disponível na Pharmacia, Piscataway, NJ) inclui o promotorCaMV 35S do vírus do mosaico da couve-flor.

Em modalidades preferidas, o vetor usado para expressar o po-lipeptídio inclui um marcador de seleção que é eficaz em uma célula vegetal,de preferência um marcador de seleção resistente a drogas. Um marcadorde seleção resistente a drogas preferido é o gene cuja expressão resulta emresistência à canamicina; isto é, o gene quimérico contendo o promotor no-palina sintase, Tn5 neomicina fosfotransferase Il (nptll) e região não-transladada 3' de nopalina sintase descritos (Rogers et al., 1988).

RNA polimerase transcreve uma seqüência de DNA de codifica-ção através de um sítio onde ocorre poliadenilação. Tipicamente, seqüên-cias de DNA localizadas algumas centenas de pares de base a jusante dosítio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. Essas seqüên-cias de DNA são aqui chamadas de regiões de terminação de transcrição.Essas regiões são requeridas para uma poliadenilação eficiente do RNAmensageiro (mRNA) transcrito.

Meios para preparar vetores de expressão são bastante conhe-cidos na técnica. A expressão (vetores de transformação) usada para trans-formar plantas e os métodos para fazer esses vetores estão descritos nasPatentes US N°s 4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 e 4.757.011, cujos relató-rios estão aqui incorporados a título de referência. Esses vetores podem sermodificados de maneira a incluir uma seqüência de codificação de acordocom a presente invenção.

Vários métodos foram desenvolvidos para ligar operacionalmen-te DNA a vetores via terminais coesivos complementares ou extremidadescegas. Por exemplo, sistemas homopoliméricos complementares podem seradicionados ao segmento de DNA a ser inserido e ao vetor DNA. O vetor e osegmento de DNA são então unidos por uma ligação de hidrogênio entre asextremidades homopoliméricas complementares para formar moléculas deDNA recombinantes.

Uma região de codificação que codifica um polipeptídio tendocapacidade para conferir atividade inseticida a uma célula é de preferênciaum gene codificador da proteína cristal CryET33 ou CryET34 de B. thuringi-ensis. Em modalidades preferidas, esse polipeptídio tem a seqüências deresíduos de aminoácidos da SEQ ID N0 3 ou SEQ ID N0 4, ou um equivalen-te funcional dessa seqüência. De acordo com essas modalidades, uma regi-ão de codificação compreendendo a seqüência de DNA da SEQ ID N0 1 oua seqüência de DNA de SEQ ID N0 4 também é preferida.

4.5 Características das novas proteínas cristais

A presente invenção fornece novos polipeptídios que definemuma proteína cristal CryET33 ou CryET34 de B. thuringiensis total ou umaparte da mesma.

Em uma modalidade preferida, a invenção descreve e reivindicaum proteína CryET33 isolada e purificada. A proteína CryET33 compreendeuma seqüência de 267 aminoácidos, e tem uma massa molecular calculadade 29.216 Da. A CryET33 tem uma constante isoelétrica calculada (pl) iguala 4,78. A composição de aminoácidos da proteína CryET33 está dada naTabela 3.

Tabela 3

Composição d e aminoácidos da CryET33

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Em uma outra modalidade, a invenção descreve e reivindicauma proteína CryET34 isolada e purificada. A proteína CryET34 compreen-de uma seqüência de 126 aminoácidos e tem uma massa molecular calcu-lada de 14.182 Da. O constante isoelétrica calculada (pl) da CryET34 é4,26. A composição de aminoácidos da proteína CryET34 está dada na Ta-bela 4.

Tabela 4

Composição de aminoácidos da CryET33

<table>table see original document page 54</column></row><table>

4.6 Nomenclatura das novas proteínas

Os inventores deram arbitrariamente as designações CryET33 eCryET34 para as novas proteínas da invenção. De maneira similar, as de-signações arbitrárias de cryET33 e CryET34 foram dadas às novas seqüên-cias de ácidos nucléicos que codificam esses poiipeptídios, respectivamen-te. A indicação formal das designações do gene e da proteína com base nanomenclatura revisada de endotoxinas de proteína cristal (Tabela 1) serádada por uma comissão sobre a nomenclatura de B. thuringiensis, formadapara classificar sistematicamente proteínas cristais de B. thuringiensis. Osinventores acreditam que as designações arbitrariamente dadas da presenteinvenção serão substituídas pela nomenclatura oficial dada para essas se-quências.

4.7 Células de plantas transformadas ou transgênicas

Métodos e composições para transformar uma bactéria, umacélula de levedura, ou uma célula vegetal, ou uma planta inteira com um oumais vetores de expressão compreendendo um segmento de gene codifi-cando uma proteína cristal são outros aspectos deste relatório. Uma bacté-ria transgênica, célula de levedura, célula vegetal ou planta derivada de talprocesso de transformação ou a progênie e sementes de tal planta transgê-nica também são outras modalidades verificadas.

Meios para transformar bactérias e células de levedura são bas-tante conhecidos na técnica. Tipicamente, os meios de transformação sãosimilares aos meios bastante conhecidos usados para transformar outrasbactérias ou levedura tais como E. coli ou Saccharomyces cerevisiae. Méto-dos para transformação de DNA de células vegetais incluem transformaçãode planta mediada por Agrobacterium, transformação de protoplasto, trans-ferência de gene para o pólen, injeção em órgãos reprodutores, injeção emembriões imaturos e bombardeamento de partículas. Cada um desses mé-todos apresentam vantagens e desvantagens distintas. Assim, um métodoparticular para introduzir genes em uma cepa de planta particular pode nãoser necessariamente o mais eficaz para uma outra cepa de planta, porém sesabe quais métodos são úteis para uma cepa de planta particular.

Existem muitos métodos para introdução de segmentos DNA detransformação em células, mas nem todos são adequados para transferirDNA para células vegetais. Acredita-se que métodos adequados incluemvirtualmente qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em umacélula, tal como por infecção por Agrobaeterium, transferência de DNA talcomo, por exemplo, por transformação mediada por PEG de protoplastos(Omirulleh et al., 1993), por absorção de DNA mediada por desseca-ção/inibição, por eletroporação, por agitação com fibras de carbureto de silí-cio, por aceleração de partículas revestidas com DNA etc. Em certas moda-lidades, os métodos de aceleração são preferidos e incluem, por exemplo,bombardeamento de microprojéteis e outros.A tecnologia para introdução de DNA em células é bastante co-nhecida pelos versados na técnica. Foram descritos quatro métodos genéri-cos para transferir um gene para células: (1) métodos químicos (Grahamand van der Eb1 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) métodos físicos, tais comomicroinjeção (Capecchi, 1980), eletroporação (Wong & Neumann1 1982;Fromm et al., 1985; Patente US N0 5.384.253) e a pistola de genes (Johns-ton & Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) vetores viróticos (Clapp, 1993; Luet al., 1993; Eglitis & Anderson, 1988a; 1988b); e (4) mecanismos mediadospor receptores (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).4.7.1 Eletroporação

A aplicação de rápidos pulsos elétricos de alta voltagem a umavariedade de células animais e vegetais leva à formação de poros de tama-nho nanométrico na membrana plasmática. O DNA é diretamente inseridono citoplasma da célula seja através desses poros ou como conseqüênciada redistribuição dos componentes da membrana que acompanha o fecha-mento dos poros. A eletroporação pode ser extremamente eficiente e podeser usada tanto para expressão transitória de genes de clones como paraestabelecimento de linhagens celulares que transportam cópias integradasdo gene de interesse. A eletroporação, ao contrário da transformação medi-ada por fosfato de cálcio e da fusão de protoplastos, freqüentemente dá ori-gem a linhagens celulares que transportam uma, ou no máximo algumas,cópias integradas do DNA estranho.

A introdução de DNA por meio de eletroporação é bastante co-nhecida pelos versados na técnica. Neste método, certas enzimas degrada-doras de parede celular, tais como as enzimas degradadoras de pectina,são empregadas para tornar as células recipientes-alvos mais suscetíveis àtransformação por eletroporação do que as células não tratadas. Alternati-vamente, as células recipientes são tornadas mais suscetíveis à transforma-ção por lesão ("wounding") mecânica. Para efetuar transformação por ele-troporação pode-se empregar tecidos friáveis, tal como uma cultura de célu-las em suspensão ou calo embriogênico ou, alternativamente, embriões ima-turos ou outras tecidos organizados podem ser transformados diretamente.Poder-se-ia degradar parcialmente as paredes celulares das células esco-lhidas expondo-se as mesmas a enzimas degradadoras de pectina (pectoli-ases) ou lesando-se mecanicamente as mesmas de maneira controlada.

Essas células seriam então recipientes para transferência de DNA por ele-troporação, que pode ser realizada neste estágio, e as células transforma-das então identificadas por um protocolo de seleção ou análise adequado,dependente da natureza do DNA recém-incorporado.

4.7.2 Bombardeamento de microproiéteis

Um outro método vantajoso para transferir segmentos de DNAtransformados para células vegetais é o bombardeamento de microprojéteis.Neste método, partículas podem ser revestidas com ácidos nucléicos etransferidas para células por uma força propulsora. Partículas exemplificati-vas incluem aquelas compreendidas de tungstênio, ouro, platina e similares.

Uma vantagem do bombardeamento de microprojéteis, além deser um meio eficaz de transformação estável reprodutível de monocotiledô-neas, é que não requer o isolamento de protoplastos (Cristou et a!., 1988)nem a suscetibiüdade à infecção por Agrobacterium. Uma modalidade ilus-trativa de um método para transferir DNA para células de milho por acelera-ção é um Sistema de Transferência de Partículas Biolísticas, que pode serusado para impelir partículas revestidas com DNA ou células através deuma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou Nytex, para uma superfíciede filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. A tela dis-persa as partículas para que elas não sejam transferidas para as célulasrecipientes em agregados grandes. Acredita-se que uma tela interposta en-tre o aparelho de projéteis e as células a serem bombardeadas reduz o ta-manho dos agregados de projéteis e pode contribuir para uma freqüência detransformação mais elevada reduzindo os danos impostos às células recipi-entes por projéteis demasiado grandes.

Para o bombardeamento, as células em suspensão são de pre-ferência concentradas em filtros ou meio de cultura sólido. Alternativamente,embriões imaturos ou outros células-alvo podem ser dispostos em meio decultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas a umadistância apropriada abaixo da placa de anteparo de microprojéteis. Se de-sejado, uma ou mais telas são também posicionadas entre o dispositivo deaceleração e as células a serem bombardeadas. Por meio do uso de técni-cas aqui apresentadas pode-se obter até 1000 focos ou mais de células ex-pressando transitoriamente um gene marcador. O número de células em umfoco que expressa o gene exógeno produzido 48 horas pós-bombardea-mento geralmente varia de 1 a 10 e em média de 1 a 3.

Na transformação por bombardeamento, pode-se otimizar ascondições de cultivo pré-bombardeamento e os parâmetros de bombardea-mento para produzir os números máximos de transformantes estáveis. Pa-râmetros tanto físicos como biológicos para o bombardeamento são impor-tantes nesta tecnologia. Fatores físicos são aqueles que envolvem a mani-pulação do precipitado de DNA/microprojéteis ou aqueles que afetam a tra-jetória e a velocidade de macro ou microprojéteis. Fatores biológicos inclu-em todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imedia-tamente depois do bombardeamento, no ajuste osmótico de células-alvospara ajudar a aliviar o trauma associado com bombardeamento, e tambémna natureza do DNA transformante, tal como DNA Iinearizado ou plasmídiossuperenrolados intatos. Acredita-se que manipulações pré-bombardeamentosão especialmente importantes para uma transformação bem-sucedida deembriões imaturos.

Por conseguinte, acredita-se que se pode desejar ajustar váriosdos parâmetros de bombardeamento em estudos de pequena escala paraotimizar totalmente as condições. Pode-se particularmente desejar ajustarparâmetros físicos, tais como distância de separação, distância da trajetória,distância de tecido e pressão de hélio. Pode-se também minimizar os fato-res de redução de trauma (TRFs) modificando-se as condições que influen-ciam o estado fisiológico das células recipientes e que podem portanto influ-enciar as eficiências de transformação e integração. Por exemplo, o estadoosmótico, hidratação do tecido e o estágio de subcultura ou ciclo celular dascélulas recipientes podem ser ajustados para transformação ótima. A reali-zação de outros ajustes de rotina será conhecida pelos versados na técnicaà luz do presente do relatório.

4.7.3 Transferência mediada por Aprobacterium

Transferência mediada por Agrobacterium é um sistema ampla-mente aplicável para introduzir genes em células vegetais porque o DNApode ser introduzido em tecidos vegetais totais, dessa forma desviando anecessidade de regeneração de uma planta intata de um protoplasto. O usode vetores de integração de planta mediada por Agrobacterium para introdu-zir DNA em células vegetais é bastante conhecido na técnica. Veja, por e-xemplo, os métodos descritos (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). Alémdisso, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso resul-tando em algumas redisposições. A região de DNA a ser transferida é defi-nida pelas seqüências de borda, e DNA intermédio é usualmente inserido nogenoma da planta como descrito (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al.1987).

Vetores de transformação de Agrobacterium modernos são ca-pazes de replicação em E. eoli bem como em Agrobaeterium, permitindomanipulações convenientes como descrito (Klee et al., 1985). Além do mais,avanços tecnológicos recentes em vetores para transferência de gene me-diada por Agrobaeterium melhoraram a disposição de genes e sítios de res-trição nos vetores para facilitar a construção de vetores capazes de expres-sar vários genes codificadores de polipeptídio. Os vetores descritos (Rogerset al., 1987) possuem regiões multiligadoras convenientes flanqueadas porum promotor e um sítio de poliadenilação para expressão direta de genescodificadores de polipeptídio inseridos e são adequados para os presentesfins. Além disso, Agrobaeterium contendo genes Ti armados e desarmadospode ser usada para as transformações. Nas cepas de planta em que atransformação mediada por Agrobaeterium é eficiente, esse é o método es-colhido por causa da natureza simples e definida da transferência de genes.

Transformação mediada por Agrobaeterium de discos de folha eoutros tecidos, tais como cotilédones e hipocótilos parece estar limitada àsplantas que a Agrobaeterium infeta naturalmente. Transformação mediadapor Agrobaeterium é mais eficiente em plantas dicotiledôneas. Algumas mo-nocotiledôneas parecem ser hospedeiros naturais para Agrobacterium, em-bora plantas transgênicas tenham sido produzidas em aspargos usando ve-tores de Agrobacterium como descrito (Bytebier et al., 1987). Portanto, grãosde cereais comercialmente importantes, tais como arroz, milho e trigo po-dem ser usualmente transformados usando-se métodos alternativos. No en-tanto, como mencionado acima, a transformação de aspargos usando Agro-bacterium também pode ser obtida (veja, por exemplo, Bytebier et al., 1987).

Uma planta transgênica formada usando métodos de transfor-mação de Agrobacterium tipicamente contém um único gene em um cro-mossomo. Essas plantas transgênicas podem ser classificadas como "hete-rozigotas" para o gene adicionado. No entanto, visto que o uso da palavra"heterozigota" normalmente implica na presença de um gene complementarno mesmo local do segundo cromossomo de um par de cromossomos, eesse gene não existe em uma planta contendo um gene adicionado comoaqui, acredita-se que um nome mais preciso para tal planta seja um segre-gante independente, porque o gene exógeno adicionado segrega indepen-dentemente durante a mitose e a meiose.

Mais preferida é uma planta transgênica que é homozigota para ogene estrutural adicionado, isto é, uma planta transgênica que contém doisgenes adicionados, um gene no mesmo local em cada cromossomo de umpar de cromossomos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida porcruzamento sexuado ("selfing") de uma planta transgênica segregante inde-pendente que contém um único gene adicionado, germinação de algumas dassementes produzidas e análise das plantas resultantes produzidas quanto àatividade de carboxilase melhorada em relação a um controle (nativo, nãotransgênico) ou uma planta transgênica segregante independente.

Deve ficar entendido que duas plantas transgênicas diferentestambém podem ser cruzadas para produzir descendentes que contêm doisgenes exógenos adicionados segregando independentemente. "Selfing" deprogênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para osdois genes exógenos adicionados que codificam um polipeptídio de interes-se. Cruzamento reversível com uma planta pai e cruzamento com uma plan-ta não transgênica também são considerados.

4.7.4 Outros métodos de transformação

A transformação de protoplastos vegetais pode ser obtida usan-do métodos à base de precipitação de fosfato de cálcio, tratamento com po-lietileno glicol, eletroporação e combinações desses tratamentos (veja, porexemplo, Potrykus et aí., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1986; Uchi-miya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).

A aplicação desses sistemas a diferentes cepas de planta de-pende da capacidade de regeneração daquela cepa de planta particular apartir de protoplastos. Métodos ilustrativos para a regeneração de cereais apartir de protoplastos estão descritos (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al.,1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Para transformar cepas de planta que não são regeneradas comêxito a partir de protoplastos, outras maneiras de introduzir DNA em célulasou tecidos intatos podem ser utilizadas. Por exemplo, a regeneração de ce-reais a partir de embriões imaturos ou explantes pode ser efetuada comodescrito (Vasil, 1988). Além disso, pode ser utilizada a tecnologia de "pistolade partículas" ou de microprojéteis a alta velocidade (Vasil, 1992).

Usando essa última tecnologia, o DNA é transportado através daparede celular e para dentro do citoplasma na superfície de pequenas partí-culas metálicas como descrito (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabeet al., 1988). As partículas metálicas penetram através de várias camadasde células e dessa forma permitem a transformação de células dentro deexplantes teciduais.

4.8 Métodos para produção de plantas transgênicas resistentes a insetos

Transformando uma célula hospedeira adequada, tal como umacélula vegetal, com um segmento contendo o gene cryET33 e/ou cryET34recombinante, a expressão da proteína cristal codificada (isto é, uma proteí-na cristal ou polipeptídio bacteriano tendo atividade inseticida contra coleóp-teros) pode resultar na formação de plantas resistentes a insetos.

A título de exemplo, pode-se utilizar um vetor de expressão con-tendo uma região de codificação para uma proteína cristal de B. thuringien-s/s e um marcador selecionável apropriado para transformar uma suspensãode células vegetais embriônicas, tais como células de trigo ou milho, usandoum método tal como bombardeamento de partículas (Maddock et al., 1991;Vasil et al., 1992) para transferir o DNA aplicado como revestimento em mi-croprojéteis para as células recipientes. Plantas transgênicas são então re-generadas a partir de calos embriônicos transformados que expressam asproteínas inseticidas.

A formação de plantas transgênicas também pode ser realizadausando outros métodos de transformação celular que são conhecidos natécnica, tal como transferência de DNA mediada por Agrobacterium (Fraleyet al., 1983). Alternativamente, o DNA pode ser introduzido em plantas portransferência direta do DNA para o pólen (Zhou et al., 1983; Hess, 1987;Luo et al., 1988), por injeção do DNA nos órgãos reprodutores de uma plan-ta (Pena et al., 1987), ou por injeção direta de DNA nas células de embriõesimaturos seguida da reidratação de embriões dessecos (Neuhaus et al.,1987; Benbrook et al., 1986).

A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir detransformantes de um único protoplasto vegetal ou de vários explantestransformados são bastante conhecidos na técnica (Weissbach & Weissba-ch, 1988). Esse processo de regeneração e crescimento tipicamente incluias etapas de seleção de células transformadas, cultura das células individu-alizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embriônico atra-vés do estágio de muda ("plantlet") com raiz. Embriões e sementes transgê-nicos são regenerados de maneira similar. Os brotos com raiz transgênicosresultantes são em seguida plantados em um meio de crescimento de plan-tas apropriado tal como solo.

O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o geneexógeno estranho que codifica um polipeptídio de interesse introduzido porAgrobacterium de explantes foliares pode ser obtido por métodos bastanteconhecidos da técnica tal como descrito (Horsch et al., 1985). Nesse proce-dimento, transformantes são cultivados na presença de um agente seletivo eem um meio que induz a regeneração de brotos na cepa de planta sendotransformada como descrito (Fraley et al., 1983).

Esse procedimento tipicamente produz brotos em dois a quatromeses e os brotos são então transferidos para um meio indutor de raiz a-propriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para impedir cresci-mento bacteriano. Os brotos que criaram raízes na presença do agente sele-tivo para formar mudas ("plantlets") são então transplantados para o solo ououtro meio para possibilitar a produção de raízes. Esses procedimentos va-riam dependendo da cepa de planta particular empregada, essas variaçõessendo bastante conhecidas na técnica.

De preferência, as plantas regeneradas são auto polinizadaspara fornecer plantas transgênicas homozigotas, como discutido anterior-mente. Também, pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plan-tas cultivadas de semente de linhagens agronomicamente importantes, depreferência endógamas. Ao contrário, o pólen de plantas dessas linhagensimportantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta trans-gênica da presente invenção contendo um polipeptídio desejado é cultivadausando métodos, bastante conhecidos pelo versado na técnica.

Uma planta transgênica desta invenção tem assim uma quanti-dade aumentada de uma região de codificação (por exemplo, um gene cry)que codifica o polipeptídio Cry de interesse. Uma planta transgênica preferi-da é um segregante independente- e pode transmitir aquele gene e sua ativi-dade para sua progênie. Uma planta transgênica mais preferida é homozigo-ta para aquele gene, e transmite aquele gene para toda a sua descendênciapor cruzamento sexuado. A semente de uma planta transgênica pode sercultivada no campo ou em estufa, e as plantas transgênicas sexualmentemaduras são auto-polinizadas para gerar plantas de reprodução verdadei-ras. A progênie dessas plantas torna-se linhagens de reprodução verdadei-ras que são avaliadas, por exemplo, quanto à capacidade inseticida aumen-tada contra insetos coleópteros, de preferência no campo, em uma gama decondições ambientais. Os inventores consideram que a presente invençãovai encontrar utilidade particular na criação de plantas transgênicas de inte-resse comercial, que incluem turfas, trigo, milho, arroz, cevada, aveia, umavariedade de plantas ornamentais e vegetais, bem como inúmeras árvores eplantas de nozes e frutos.

5. Exemplos

Os exemplos a seguir destinam-se a demonstrar modalidades5 preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos versados na técnica queas técnicas apresentadas nos exemplos a seguir representam técnicas veri-ficadas pelo inventor que funcionam bem na prática da invenção, e podemassim ser consideradas constitutivas de modos preferidos para sua prática.

No entanto, os versados na técnica devem, à luz do presente relatório, a-preciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicasapresentadas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem sair doespírito e escopo da invenção.

5.1 Exemplo 1 - Isolamento de B. thuringiensis EG10327

Amostras de pó de cultura foram obtidas de várias fontes nosEstados Unidos e no exterior, tipicamente em instalações de armazenagemde grãos. As amostras de pó de cultura foram tratadas e espalhadas sobreplacas de ágar para isolar colônias individuais do tipo Bacillus como descritona Patente US 5.264.364.

O gene crylllA clonado, anteriormente conhecido como o genecryC de B. thuringiensis cepa EG2158, descrito em Donovan et al. (1988), eo gene crylllB2 clonado, anteriormente conhecido como o gene crylllC de B.thuringiensis cepa EG4691, descrito em Donovan et al., 1992, foram usadoscomo sondas em procedimentos de hibridização de colônia. A sonda de ge-ne crylllA consistia em um fragmento de restrição de DNA Hindlll-Xbal de2,0 kb radioativamente rotulado como descrito em Donovan et al., 1988. Asonda de gene crylllB2 consistia em um fragmento de restrição de DNA Ss-pl de 2,4 kb radioativamente rotulado como descrito em Donovan et al.,1992. Os procedimentos de hibridização de colônia foram realizados comodescrito na Patente US 5.264.364.

Aproximadamente 43.000 colônias do tipo Bacillus de cinqüentae quatro amostras de pó de cultura de várias localidades foram sondadascom as sondas crylllA e crylllB2 radioativamente rotuladas. Uma amostra depó de cultura da Grécia continha aproximadamente 100 colônias do tipo Ba-cillus naturais que hibridizaram com as sondas crylllA e crylllB2. Análise devárias destas colônias naturais do tipo selvagem indicaram que elas eramidênticas às colônias de B. thuringiensis, e uma colônia, designadaEG10327, foi selecionada para ulterior estudo. B. thuringiensis cepaEG10327 foi depositada em 14 de dezembro de 1994 segundo os termos doTratado de Budapeste junto ao NRRL com Acesso N0 NRRL B-21365.

Subseqüentemente, aproximadamente 84.000 colônias do tipoBacillus de 105 amostras de pó de cultura de várias localidades tambémforam analisadas com as sondas crylllA e crylllB2 radioativamente rotula-das, mas sem sucesso na identificação de qualquer outra cepa contendonovos genes do tipo crylll.

Foi verificado que B. thuringiensis cepa EG10327 é insèticida-mente ativa contra as larvas de insetos coleópteros, principalmente o tribó-lio, o gorgulho do algodão e o besouro japonês. A cepa EG10327 não apre-sentou atividade inseticida mensurável em relação à minhoca de raiz do mi-lho do sul ou Oi besouro da batata do Colorado segundo as condições deensaio usadas. Um gene, designado "crylllA truncado", foi isolado da cepaEG10327, e sua seqüência de bases de nucleotídeos determinada. Foi veri-ficado que o gene crylllA truncado era idêntico aos dois primeiros terços dogene crylllA (descrito como o gene cryC por Donovan et al., 1988) mas nãocontinha o um terço final do gene crylllA. O gene crylllA truncado da cepaEG10327 produziu muito pouca, se alguma, proteína inseticida e não foi ca-racterizado.

5.2 Exemplo 2 - Avaliação do sorotipo flagelar de EG10327

Para caracterizar a cepa EG10327 foram conduzidos vários es-tudos. Um estudo foi realizado para caracterizar seu sorotipo flagelar. Estesdados estão apresentados abaixo.

O sorotipo flagelar da cepa EG10327 foi determinado no Iabora-tório do Dr. M.-M. Lecadet no Instituto Pasteur, Paris, França. O sorotipo deEG10327 foi determinado de acordo com os métodos descritos por H. deBarjac (1981), e verificou-se ser Bacillus thuringiensis kurstaki (H3a, 3b, 3c).Foi verificado que as cepas de B. thuringiensis anteriormente descritas con-tendo genes relacionados com crylU eram sorotipo morrisoni (cepa EG2158contendo crylllA); sorotipo tolworthi (cepa EG2838 contendo crylllB); e soro-tipo kumamotoensis (cepa EG4961) contendo crylllB2) (Rupar et al., 1991).

EG10327 representa a primeira cepa B. thuringiensis kurstaki que foi de-monstrada ser tóxica para coleópteros.

5.3 Exemplo 3 - Avaliação das proteínas cristais de EG10327

A cepa EG10327 foi ademais avaliada por caracterização dasproteínas cristais que ela produz. Estes estudos foram realizados cultivando-se EG10327 em meio de esporulação de DSG [caldo nutriente Difco 0,8%(p/v), glicose 0,5% (p/v), K2HPO4 10 mM, KH2PO4 10 mM, Ca(NO3)2 1 mM,MgSO4 0,5 mM, MnCI2 10 μΜ, FeSO4 10 μΜ]. A cultura esporulada conten-do esporos e proteínas cristais foi então colhida por centrifugação e suspen-dida em água desionizada. As proteínas cristais foram solubilizadas da sus-pensão de esporos e cristais de EG10327 por incubação da suspensão emum tampão de solubilização [Tris 0,14 M pH 8,0, dodecil sulfato de sódio(SDS) 2% (p/v), 2-mercaptoetano) 5% (v/v), glicerol 10% (v/v) e azul de bro-mofenol 0,1% (p/v) a IOO0C por 5 min.

As proteínas cristais solubilizadas tiveram seu tamanho fracio-nado por eletroforese em um gel de acrilamida (análise por SDS-PAGE).Depois de fracionamento de tamanho, as proteínas foram visualizadas porcoloração com corante de Coomassie. A análise por SDS-PAGE mostrouque uma proteína cristal principal de aproximadamente 29 kDa, doravantedesignada proteína CryET33, e uma proteína cristal principal de aproxima-damente 14 kDa, doravante designada proteína CryET34, foram solubiliza-das da cultura esporulada de EG10327.

A proteína CryET33 de 29 kDa e a proteína CryET34 de 14 kDade EG10327 foram ainda caracterizadas por determinação de suas seqüên-cias de aminoácidos NH2-terminais da seguinte maneira. A cultura esporula-da de EG10327 foi incubada com tampão de solubilização e as proteínascristais solubilizadas tiveram seu tamanho fracionado através de um gel deacrilamida por análise por SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas dogel para um filtro de nitrocelulose por técnicas convencionais de eletroanáli-se da mancha. A proteína CryET33 e a proteína CryET34 que foram transfe-ridas para o filtro por eletroanálise da mancha foram visualizadas por colo-ração do filtro com corante de Coomassie. Porções do filtro contendo a pro-teína CryET33 e a proteína CryET34 foram excisadas com uma lâmina debarbear. Desta maneira a proteína CryET33 e a proteína CryET34 foramobtidas em formas puras como proteínas manchadas sobre pedaços sepa-rados de filtro de nitrocelulose.

As proteínas CryET33 e CryET34 purificadas contidas nos pe-daços de filtro de nitrocelulose foram submetidas a um procedimento de de-gradação de Edman automatizado convencional para determinar a seqüên-cia de aminoácidos NHfe-terminal de cada proteína.

A seqüência NH2-terminal da proteína CryET33 de EG10327 foideterminada como sendo:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20GlyllelleAsnlleGlnAspGlulleAsnAsnTyrMetLysGIuVaITyrGIyAIaThr(SEQ ID NO:5)

A seqüência NH2-terminal da proteína CryET34 de EG10327 foideterminada como sendo:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20TyrValTyrAsnValThrPheThrlIeLysPheTyrAsnGluGlyTrpGlyGlyPro(Ala) (Asn)

(SEQ ID NO:6)

Os resíduos de aminoácidos listados entre parênteses abaixo daseqüência da proteína CryET34 representam aminoácidos alternativos po-tenciais que podem estar presentes na proteína CryET34 na posição indica-da. Aminoácidos alternativos são possíveis devido à incerteza inerente queexiste no uso do procedimento de degradação de Edman automatizado paradeterminação das seqüências de aminoácidos de uma proteína.

Algoritmos de computador (Kom e Queen, 1984) foram usadospara comparar a seqüência N-terminal das proteínas CryET33 e CryET34com seqüências de aminoácidos de todas as proteínas cristais de B. thurin-giensis das quais os inventores têm conhecimento, incluindo as seqüênciasde todas as proteínas cristais de B. thuringiensis que foram publicadas naliteratura científica, pedidos de patente internacionais ou patentes concedi-das. Uma lista das proteínas cristais cujas seqüências foram publicadas jun-to com a fonte de publicação está mostrada na Tabela 5.

Tabela 5

Proteínas Cristais de B. thuringiensis Descritas na Literatura

<table>table see original document page 68</column></row><table>Tabela 5 - continuação

<table>table see original document page 69</column></row><table>Tabela 5 -

<table>table see original document page 70</column></row><table>

A seqüência N-terminal da proteína CryET34 de EG10327nãose mostrou homóloga a qualquer das proteínas cristais de B. thuringiensisconhecidas, identificadas na Tabela 5.

5.4 Exemplo 4 - Caracterização da proteína cristal CrvET33 de EG2159

Foi previamente determinado que a proteína CryIIIA de 68 kDade EG2159 (doravante a proteína CryC em Donovan et al., 1988) era tóxicapara o besouro da batata do Colorado, mas não fora identificada nenhumaproteína na cepa que tivesse atividade contra lepidópteros ou dípteros.

A cepa EG2159 foi derivada de B. thuringiensis cepa EG2158por cura de um plasmídio de 150 MDa de EG2158 (descrita em Donovan etal„ 1988). EG2159 é idêntica à EG2158 com a diferença de que EG2159não tem um plasmídio de 150 MDa presente na EG2158. Uma das duasproteínas cristais produzidas por EG2159, a proteína CryIIIA de 68 kDa, foiisolada e o gene que a codifica foi clonado e sequenciado. Estes resultadosforam anteriormente descritos pelos inventores (Donovan et al., 1988). Umaespécie de proteína secundária, uma proteína de 29 kDa de EG2159, aindanão foi caracterizada.

Este exemplo descreve a caracterização desta proteína cristalCryET33 de 29 kDa de B. thuringiensis EG2159.

5.4.1 Isolamento de proteína cristal de EG2159

As proteínas cristais de Eg2159 foram solubilizadas suspenden-do-se uma cultura esporulada de EG2159 contendo esporos mais proteínascristais em um tampão de solubilização de proteína a 80°C por 3 min. Asproteínas cristais solubilizadas tiveram seu tamanho fracionado por SDS-PAGE e as proteínas no gel de SDS-PAGE foram visualizadas por coloraçãocom corante de Coomassie. Pedaços de gel contendo a proteína de 29 kDaforam cortados do gel de SDS-PAGE com uma lâmina de barbear e a prote-ína foi separada dos pedaços de gel por procedimentos convencionais deeletroeluição. Estes estudos resultaram em uma preparação purificada daproteína CryET33 de B. thuringiensis cepa EG2159.

5.4.2 Sequênciamento NHp-terminal da proteína de 29 kDa

A seqüência de aminoácidos NH2-terminal da proteína CryET33purificada foi determinada por degradação de Edman automatizada. A se-qüência de aminoácidos da porção NH2-terminal da proteína de 29 kDa foideterminada como sendo:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

MetGlyllelleAsnlleeGlnAspGIuIIeAsn-MtyMetLysGIuVaITyrGIyAIa

(SEQ ID N°:7) (SEQ ID N°:8)Tracejado (---) na posição 12 indica que este resíduo de aminoácido nãopôde ser determinado para a proteína CryET33 de EG2159.

5.4.3 Resultados

Comparação da seqüência da proteína CryET33 de EG10327(SEQ ID N0 5) e a seqüência NH2-terminal da proteína de 29 kDa previa-mente não caracterizada (Donovan et al., 1988)observada em EG2159 SEQID N0 7, SEQ ID N0 8) sugeriu que a extremidade NH2-terminal da proteínade 29 kDa de EG2159 era idêntica à proteína CryET33 de EG10327, com adiferença de um resíduo metionina (Met) inicial presente na proteína Cr-yET33 de EG2159.

5.5 Exemplo 5 - Isolamento de um fragmento de DNA compreendendo osgenes crvET33 e crvET34 de EG2158

Como descrito acima, a cepa EG2159 foi derivada da cepaEG2158. Portanto, EG2158 contém o mesmo gene para a proteína Cr-yET33, doravante denominado gene cryET33, como a cepa EG2159. Paraclonar o gene cryET33 foi usada genética invertida. Uma sonda de oligonu-cleotídeo de 33 mer (designada WD68) codificando os aminoácidos 1 a 11do terminal NH2 da proteína CryET33 foi sintetizada. A seqüência de WD68 é:

Si-Atgggaattattaatattcaagatgaaattaat-S' (seq id n° 9)

WD68 foi usado como sonda em estudos de hibridização damancha do Sul como descrito abaixo em tentativas para identificar um frag-mento de DNA de EG2158 que continha o gene cryET33 para a proteínaCryET33 de 29 kDa. DNA total foi extraído de EG2158 por um método delisozima/fenol convencional. O DNA extraído foi digerido com as enzimas derestrição de DNA Hindlll e EcoRI, e o DNA digerido teve seu tamanho fra-cionado por eletroforese através de um gel de agarose. Os fragmentos deDNA foram transferidos pela técnica da mancha do gel para um filtro de ni-trocelulose usando métodos previamente descritos (Southern, 1975), e ofiltro foi incubado com o oligonucleotídeo WD68 que fora radioativamenterotulado com T4 cinase e [γ-32Ρ] ATP. Não foi encontrado nenhum fragmen-to de restrição de DNA singular de EG2158 no qual a sonda WD68 hibridiza-ra especificamente.

Um método diferente foi então usado para identificar um frag-mento de restrição de DNA que continha o gene cryET33. Uma sonda deoligonucleotídeo de 56 mer (designada WD73) codificando os aminoácidos1 a 19 do terminal NH2 da proteína CryET33 foi sintetizada. A seqüência deWD73 é:

5'-ATGGGAATT ATT AAT ATTCAAG ATG AAATTAATN N NTATATG AAAG AAGTATA TGG-3' (SEQ ID N0 10)

onde os três Ns correspondentes ao aminoácido 12 de WD73 representamtrês nucleotídeos inosina. Resíduos de inosina foram usados nesta posiçãopara codificar o aminoácido desconhecido correspondente na posição 12 naseqüência NhVterminaI da proteína CryET33. Inosina é considerada um nu-cleotídeo neutro, e não promove nem bloqueia a ligação de cordões deDNA. WD73 foi radioativamente rotulado com T4 cinase e [γ-32Ρ] ATP e u-sado para sondar um filtro de nitrocelulose contendo os fragmentos de res-trição Hindlll e EcoRI de tamanho fracionado do DNA total de EG2158.WD73 hibridizou especificamente em um fragmento Hindlll de aproximada-mente 7,9 kb, e em um fragmento EcoRI de aproximadamente 5,2 kb deDNA de EG2158.

5.6 Exemplo 6 - Clonagem dos genes crvET33 e crvET34 de EG2158

Para isolar o fragmento EcoRI de 5,2 kb descrito no exemploanterior, uma biblioteca de plasmídios da cepa EG2158 foi construída porligação de fragmentos de restrição EcoRI de DNA de tamanho selecionadoda cepa EG2158 no vetor pBR322 de E. coli. Este procedimento envolveuprimeiro a obtenção de DNA total da cepa EG2158 por Iise celular seguidapor extração de DNA em fenol, em seguida digestão do DNA total com aenzima de restrição EcoRI, eletroforese do DNA digerido através de um gelde agarose, excisão de um pedaço de gel contendo fragmentos de DNA E-coRI de tamanho variando de aproximadamente 4,0 a 6,0 kb, e eletroeluiçãodos fragmentos de restrição EcoRI de tamanho selecionado do pedaço degel de agarose. Estes fragmentos foram misturados com o vetor de plasmí-dio pBR322 de E. coli, que também fora digerido com EcoRI. O vetor p-BR322 transporta o gene para AmpR e o vetor replica em E. coli. T4 DNAIigase e ATP foram adicionados à mistura de fragmentos de restrição detamanho selecionado de DNA da cepa EG2158 e do vetor pBR322 digeridopara permitir que o vetor pBR322 se ligasse com os fragmentos de restriçãoda cepa EG2158.

A biblioteca de plasmídios foi então transformada em células deE. coli, um organismo hospedeiro sem os genes cryET33 e cryET34 de inte-resse, da seguinte maneira. Depois da ligação, a mistura de DNA foi incu-bada com uma cepa hospedeira de E. coli AmpR, HB101, que fora tornadacompetente usando procedimentos convencionais com CaCb- E. coli HB101foi usada como a cepa hospedeira porque estas células são facilmentetransformadas com plasmídios recombinantes e porque HB101 não contémnaturalmente genes para proteínas cristais de B. thuringiensis. Como o p-BR322 expressa AmpR, todas as células hospedeiras adquirindo um plasmí-dio recombinante foram AmpR. Depois da transformação das células hospe-deiras com os plasmídios recombinantes, as células foram espalhadas so-bre meio de ágar que continha Amp. Depois de incubação por uma noite auma temperatura de 37°C, milhares de colônias de E. coli se desenvolveramno ágar contendo Amp1 e estas colônias foram transferidas pela técnica damancha para filtros de nitrocelulose para subsequente sondagem.

O oligonucleotídeo WD73 radioativamente rotulado foi entãousado como uma sonda de DNA em condições que permitiram que a sondase ligasse especificamente às colônias hospedeiras transformadas que con-tinham o fragmento EcoRI de 5,2 kb de DNA da cepa EG2158. Várias colô-nias de E. coli hibridizaram especificamente na sonda WD73. Uma colôniade hibridização em WD73, designada E. coli EG11460, foi ainda estudada.E. coli EG11460 continha um plasmídio recombinante, designado pEG246,que consistia em pBR322 mais o fragmento de restrição EcoRI inserido deDNA da cepa EG2158 de aproximadamente 5,2 kb. Um mapa de restriçãodo pEG246 está mostrado na figura 2. E. coli cepa EG11460 contendopEG246 fora depositada junto ao Agricultural Research Culture Collection,Northern Regional Research Laboratory (NRRL) segundo os termos do Tra-tado de Budapeste com Acesso N0 NRRL B-21364.

A seqüência de bases de nucleotídeos de aproximadamente umterço do fragmento EcoRI de 5,2 kb clonado de pEG246 foi determinadausando-se o método de didesóxi de Sanger padrão. Sequenciamento reve-Iou que o fragmento de 5,2 kb continha duas estruturas de leitura aberta ad-jacentes codificando proteínas e, em particular, dois novos genes de proteí-nas cristais. A estrutura de leitura aberta a montante, designada cryET33,codificava a proteína cuja seqüência NH2-terminal coincidia com a seqüên-cia NH2-terminal da proteína CryET33 de 29kDa das cepas EG2159 eEG10327. O gene a jusante, designado cryET34, codificada a proteína cujaseqüência de aminoácidos coincidia com a seqüência de aminoácidos se-qüência NH2-terminal determinada para a proteína CryET34 de 14 kDa deEG10327. A seqüência de DNA desses novos genes são significativamentediferentes das seqüências dos genes de proteínas cristais conhecidos de B.thuríngiensis listados na Tabela 5.

A seqüência de DNA do gene cryET33 (SEQ ID N0 1) e a se-qüência de aminoácidos deduzida da proteína CryET33 (SEQ ID N0 3) codi-ficadas pelo gene cryET33 estão mostradas nas figura 1A, figura 1B e figura1C. A porção de codificação de proteína do gene cryET33 (SEQ ID N0 1) édefinida pelos nucleotídeos iniciando na posição 136 e terminando na posi-ção 936. O tamanho da proteína CryET33 (SEQ ID N0 3) conforme deduzidodo gene cryET33 (SEQ ID N0 1) é 29.216 Da (267 aminoácidos). Tambémmostradas nas figura 1A, figura 1B e figura 1C estão a seqüência de DNAdo gene cryET34 (SEQ ID N0 2) e a seqüência de aminoácidos deduzida daproteína CryET34 (SEQ ID N0 4) codificada pelo gene cryET34. A porção decodificação de proteína do gene cryET34 (SEQ ID N0 2) é definida pelos nu-cleotídeos iniciando na posição 969 e terminando na posição 1346. O tama-nho da proteína CryET34 (SEQ ID N0 4) conforme deduzido do gene cr-yET34 (SEQ ID N°2) é 14.182 Da (126 aminoácidos).

Algoritmos de computador (Kom & Queen, 1984; Altschul et al.,1990) foram usados para comparar as seqüências de DNA dos genes cr-yET33 e cryET34 e as seqüências de aminoácidos deduzidas das proteínasCryET33 e CryET34 com as seqüências de todos os genes e proteínas cris-tais cry de B. thuringiensis das quais os inventores têm conhecimento (des-critos na seção 5.3, exemplo 3, e listados na Tabela 5) e com as seqüênciasde todos os genes e proteínas contidos no Genome Sequence Data Base(National Center for Genome Resources, Santa Fe, NM). Foi verificado quea seqüência do gene cryET34 (SEQ ID N0 2) e a seqüência deduzida da pro-teína CryET34 (SEQ ID N0 4) estão relacionadas com quaisquer genes ouproteínas conhecidas, respectivamente. Foi verificado que a seqüência dogene cryET33 (SEQ ID N0 1) tinha identidade de seqüência com apenas umgene conhecido e a identidade de seqüência era muito baixa. A seqüênciado gene cryET33 (801 nucleotídeos) era 38% idêntica à seqüência de umgene de B. thuringiensis subsp. thompsoni (1.020 nucleotídeos) descrito porBrown e Whiteley (1992). Foi verificado que a seqüência deduzida da prote-ína CryET33 (SEQ ID N0 3) tinha identidade de seqüência com apenas umaproteína conhecida e a identidade de seqüência era muito baixa. Foi verifi-cado que a seqüência completa de aminoácidos da proteína CryET33 (267aminoácidos) era 27% idêntica à seqüência completa de aminoácidos deuma proteína cristal de B. thuringiensis subsp. thompsoni (340 aminoácidos)descrita por Brown e Whiteley, 1992, para uma proteína tóxica para lagartas.

A seqüência de DNA imediatamente a montante do gene cr-yET33 (figura J A, figura 1B e figura 1C, nucleotídeos 1 a 135) foi pesquisa-da quanto a homologias com todas as seqüências de DNA a montante co-nhecidas dos genes de proteína cristal e com as seqüências de DNA de to-dos os genes conhecidos no Genome Sequence Database (Tabela 5). Asseqüências de DNA imediatamente a montante das regiões de codificaçãode genes normalmente contêm promotores para expressão dos genes cor-respondentes. Esta pesquisa resultou em nenhuma homologia encontrada.

5.7 Exemplo 7 - Expressão dos genes cryET33 e cryET34 recombinantes

A experiência mostrou que genes de toxina cristal de B. thurin-giensis clonados são pobremente expressos em E. coli, mas normalmentesão altamente expressos em cepas de B. thuringiensis recombinantes.pEG246, contendo os genes cryET33 e cryET34 (figura 2), é capaz de repli-car em Ε. coli mas não em B. thuringiensis. Para obter um plasmídio con-tendo os genes cryET33 e cryET34 e capaz de replicar em B. thuringiensis,um plasmídio de Bacillus spp. foi inserido em pEG246 como descrito abaixo.

O plasmídio pNN101 de Bacillus spp. (Norton et al., 1985) capazde replicar em B. thuringiensis e conferindo resistência a cloranfenicol (Ca-mR) e resistência à tetraciclina (Tetp) foi digerido com BamHI e o plasmídiodigerido foi misturado com o plasmídio pEG246 que fora digerido com Ba-mHI. Os dois plasmídios foram ligados entre si com T4 Iigase mais ATP. Amistura de ligação foi então usada para transformar células DH5a de E. colicompetentes. Depois de incubação com a mistura de plasmídios, as célulasforam plaqueadas sobre placas de ágar contendo Tet. Esperava-se que ascélulas que tivessem absorvido um plasmídio consistindo de pNN101 ligadocom pEG246 fossem TetR. Depois de incubação por aproximadamente 20horas, várias colônias de £. coli TetR cresceram nas placas de ágar conten-do Tet.

DNA de plasmídio foi então isolado de uma colônia TetR. Oplasmídio foi digerido com BamHI1 e analisado por eletroforese através deum gel de agarose. O plasmídio, que foi designado pEG1246, consistia emdois fragmentos de DNA BamHI de 5,8 kb e 9,6 kb correspondendo aosplasmídios pNN101 e pEG246, respectivamente. Um mapa de restrição depEG1246 está mostrado na figura 3.

B. thuringiensis cepa EG10368 foi então transformada por ele-troporação com pEG1246 usando-se métodos anteriormente descritos (Ma-caluso e Mettus, 1991). Células hospedeiras não-transformadas deEG10368 são cristal negativas (Cry") e Cams. Depois de eletroporação, amistura de transformação foi espalhada sobre um meio de ágar contendoCam e foi incubada por aproximadamente 16 horas a 30°C. Células trans-formadas de pEG1246 seriam CamR. Uma colônia CamR, designada B. thu-ringiensis cepa EG11403, continha um plasmídio cujo padrão de restriçãoera idêntico ao de pEG 1246.

Células da cepa EG11403 foram cultivadas em meio de esporu-lação de DSG contendo Cam a 22°C - 25°C até que ocorresse esporulaçãoe Iise celular (4 - 5 dias). Exame microscópico revelou que a cultura esporu-Iada da cepa EG11403 continha esporos e pequenos cristais de escoamen-to livre de formato irregular e em forma de haste. Os cristais se pareciamcom aqueles observados com uma cultura esporulada da cepa EG10327.

Esporos, cristais e fragmentos celulares da cultura esporuladada cepa EG11403 foram colhidos por centrifugação. O pélete centrifugadofoi lavado uma vez com água desionizada, e o pélete suspendido em águadesionizada.

As proteínas cristais na suspensão de EG11403 foram caracte-rizadas por solubilização e análise por SDS-PAGE. A análise por SDS-PAGE revelou que a cepa EG11403 produzia duas proteínas importantes de29 kDa e 14 kDa. Como esperado, a proteína de 29 kDa e a proteína de 14kDa da cepa EG11403 tinham o tamanho idêntico à proteína CryET33 de 29kDa e à proteína CryET34 de 14 kDa, respectivamente, produzidas pela ce-pa EG10327. A cepa EG11403 foi depositada em 14 de dezembro de 1994junto ao Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Rese-arch Laboratory (NRRL) segundo os termos do Tratado de Budapeste, comAcesso N0 NRRL B-21367.

O gene codificando a proteína CryET33 de 29 kDa de EG11403é o gene cryET33 e o gene codificando a proteína CryET34 de 14 kDa é ogene cryET34, B. thuringiensis cepas EG11403 e EG10327 produziramquantidades aproximadamente iguais da proteína CryET33. Em contraste,B. thuringiensis cepa EG2158 produziu aproximadamente 1/10 da quantida-de da proteína CryET33 que a cepa EG11403 ou a cepa EG10327.

5.8 B. thuringiensis EG11402 contendo crylllB3, crvET33 e crvET34

Foi anteriormente mostrado que a proteína cristal de B. thuringi-ensis designada CrylllB3 era tóxica para larvas do besouro japonês (PatenteUS N0 5.264.364). No exemplo a seguir, verificou-se que as proteínas Cr-yET33 e CryET34 eram tóxicas para gorgulho do algodão e larvas de besou-ro japonês. A proteína Cry3B3 não compartilha homologia de seqüência deaminoácidos com a proteína CryET33 nem com a proteína CryET34. Emuma tentativa para produzir uma cepa tendo toxidez intensificada para o be-souro japonês, o gene cry3B3, o gene cryET33 e o gene cryET34 foramcombinados em uma cepa, da seguinte maneira.

A cepa EG10364 é uma cepa de B. thuringiensis do tipo selva-gem contendo o gene crylllB3. EG10364 produz a proteína Cry3B3 tóxicapara larvas de besouro japonês. pEG1246 (figura 3) contendo os genes cr-yET33 e cryEG34 foi usado para transformar EG10364 por eletroporaçãopara dar origem à cepa EG11402. EG11402 é idêntica à EG10364 com adiferença de que EG11402 também contém pEG1246 (contendo os genescryET33 e cryET34 clonados), e é consequentemente CamR.

A cepa EG11402 foi cultivada em meio de esporulação de DSGmais Cam à temperatura ambiente até que ocorresse esporulação e Iise ce-lular (4-5 dias). As proteínas cristais foram solubilizadas da cultura esporu-lada de EG11402 e as proteínas solubilizadas tiveram seu tamanho fracio-nado por SDS-PAGE. Esta análise revelou que a cepa EG11402 produziutrês proteínas cristais: uma proteína cristal de 70 kDa correspondente à pro-teína CrylllB3, uma proteína cristal de 29 kDa correspondente à proteínaCryET33, e uma proteína cristal de 14 kDa correspondente à proteína Cr-yET34. Análise por SDS-PAGE mostrou que a cepa EG1-364, que fora culti-vada de maneira idêntica à EG11402 com a diferença de quem sem cloran-fenicol, produziu a proteína CrylllB3 de 70 kDa em quantidades similares àsda EG11402. A cepa EG11402 foi depositada em 14 de dezembro de 1994segundo os termos do Tratado de Budapeste junto ao Agricultural ResearchCulture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL) com A-cesso N0 NRRL B-21366.

5.9 Exemplo 9 - Toxidez de CrvET33 e CryET34 para larvas de besourojaponês

A toxidez para larvas de besouro japonês (Popillia japonica) foideterminada para três cepas de B. thuringiensis, (1) cepa EG10327 produ-zindo as proteínas cristais CryET33 e CryET34; (2) cepa EG10364 produ-zindo a proteína cristal CryET33; e (3) cepa Eg11402 produzindo as proteí-nas cristais CryET33, CryET34 e Cry3B3.

As cepas EG10327, EG10364 e EG11402 foram cultivadas emmeio de esporulação de DSG à temperatura ambiente (20 a 23°C) até queocorresse esporulação e Iise celular (4-5 dias). Para EG11402, o meio con-tinha 5 μ9/ηιΙ Cam. O caldo de fermentação foi concentrado por centrifuga-ção e os péletes, contendo esporos, proteínas cristais e fragmentos celula-res, foram secos por congelamento para dar pós ou foram novamente sus-pendidos em água desionizada para dar suspensões aquosas. As quantida-des das proteínas cristais Cry3B3 e CryET33 nos pós secos por congela-mento e nas suspensões foram quantificadas usando técnicas de SDS-PAGE e rastreamento em densitômetro de géis de SDS-PAGE coloridos deCoomassie com proteína Cry3A purificada e quantificada como padrão. Aquantidade da proteína CryET34 foi estimada por inspeção visual dos géisde SDS-PAGE coloridos de Coomassie. Esta inspeção indicou que a quan-tidade da proteína CryET34 era aproximadamente equivalente à quantidadeda proteína CryET34 nas cepas EG10327 e EG11402.

O procedimento de bioensaio para larvas de besouro japonês foirealizado da seguinte maneira. Pós secos por congelamento de cada cepa aser testada foram suspendidos em um diluente (uma solução aquosa con-tendo Triton X-100® 0,005%) e foram incorporados em 100 ml de dieta arti-ficial líquida quente (50 - 60°C), com base na dieta de inseto anteriormentedescrita (Ladd, 1986). As misturas foram deixadas solidificar em placas dePetri, e tampões de 19-mm de diâmetro da dieta solidificada foram entãocolocados em copos plásticos de 17,76 cc (5/8 onças). Foi introduzida umalarva de besouro japonês em cada copo, os copos foram cobertos com umatampa e mantidos a 25°C por quatorze dias antes que a mortalidade Iarvalfosse avaliada. Duas replicações de dezesseis larvas cada foram realizadasneste estudo.

Os resultados deste teste de toxidez estão mostrados abaixo naTabela 6, onde a atividade inseticida está apresentada como percentagemde larvas mortas, com a mortalidade percentual sendo corrigida para mortedo controle, o controle sendo diluente apenas incorporado no tampão dedieta.Tabela 6

<table>table see original document page 81</column></row><table>

aND1 não-determinado.

Os resultados mostrados na Tabela 6 demonstram que as prote-ínas CryET33 e CryET34 possuem toxidez significativa para larvas de be-souro japonês. EG10327, que produz as proteínas CryET33 e CryET34, étóxica para larvas de besouro japonês. EG10364, que produz a proteínaCry3B3, também é tóxica para larvas de besouro japonês. Quando os genescryET33 e cryET34 são adicionados à EG10364, resultando em EG11402que produz as proteínas CryET33 e CryET34 além da proteína Cry3B3, foiobservada uma toxidez intensificada para larvas de besouro japonês.5.10 Exemplo 10 - Toxidez de CryET33 e CryET34 para larvas de tribólio

A toxidez para larvas de tribólio (Tribolium castaneum) foi de-terminada para quatro cepas de B. thuringiensis: (1) EG10327 produzindoas proteínas cristais CryET33 e CryET34; (2) EG10364 produzindo a proteí-na cristal Cry3B3; (3) EG11403 produzindo as proteínas cristais CryET33 eCryET34; e (4)EG11402 produzindo as proteínas cristais Cry3B3, CryET33 eCryET34. As quatro cepas foram cultivadas em meio de DSG até que ocor-resse esporulação e Iise celular, e suspensões aquosas ou pós secos porcongelamento foram preparados como descrito no exemplo 9. A toxidez decada cepa contra tribólio foi determinada aplicando-se uma quantidade co-nhecida de cada preparação de cepa a uma dieta artificial e deixando-se aslarvas de tribólio se alimentarem da dieta.

Os resultados deste teste de toxidez estão mostrados na Tabela7, onde a atividade inseticida está apresentada como percentagem de mor-taüdade dos insetos, com a mortalidade sendo corrigida para morte do con-trole, o controle sendo diluente apenas incorporado na dieta.

Tabela 7

Toxidez das proteínas CryET33, CryET34 e Cry3B3 para larvas de tribólio

<table>table see original document page 82</column></row><table>

aND1 não determinado.

Os resultados mostrados na Tabela 7 demonstram que as prote-ínas CryET33 e CryET34 possuem um nível significativo de toxidez para lar-vas de tribólio. A cepa natural EG10327, que produz as proteínas CryET33 eCryET34, é altamente tóxica para larvas de tribólio. EG10364, que produz aproteína Cry3B3, é tóxica para larvas de tribólio. EG11403, que produz asproteínas CryET33 e CryET34, é tóxica para larvas de tribólio. Quando osgenes cryET33 e cryET34 são adicionados à EG10364, resultando emEG11402, foi observada uma toxidez intensificada para larvas de tribólio nacepa resultante que produz as proteínas CryET33, CryET34 e Cry3B3.

5.11 Exemplo 11 - Toxidez de CryET33 e CrvET34 para larvas de qorqulhodo algodão

EG11403 produzindo as proteínas CryET33 e CryET34 foi culti-vada como descrito. A proteína cristal foi lavada, solubilizada em tampão decarbonato, dialisada e filtrada através de um acrodisco de 0,2 U. a toxidezdas proteínas solubilizadas foi então determinada adicionando-se umaquantidade conhecida das proteínas à dieta artificial e fazendo larvas degorgulho do algodão se alimentarem da dieta. Os resultados deste teste detoxidez estão mostrados abaixo, onde a atividade inseticida está apresenta-da como (1) mortalidade percentual, com a mortalidade sendo corrigida paramorte do controle usando um tampão de controle; ou (2) mortalidade per-centual + a percentagem de larvas não se desenvolvendo além do primeiroinstar, com a mortalidade sendo corrigida para morte do controle usando umtampão de controle.

Os resultados nas Tabela 8 e Tabela 9 demonstram que as pro-teínas CryET33 e CryET34 têm um nível significativo de toxidez para larvasde gorgulho do algodão.

Tabela 8

(1) Mortalidade percentual de gorgulho do algodão

<table>table see original document page 83</column></row><table>

Tabela 9

<table>table see original document page 83</column></row><table>6. Referências

As referências a seguir, até onde fornecem detalhes processuaisexemplificativos ou outros detalhes suplementares àqueles apresentadosneste relatório, estão especificamente aqui incorporadas a título de referência.

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Todas as composições e métodos aqui descritos e reivindicadospodem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz do pre-sente relatório. Embora as composições e métodos desta invenção tenhamsido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará aparente para osversados na técnica que variações podem ser aplicadas à composição, aosmétodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descritosem que se saia do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especifi-camente, ficará aparente que certos agentes que estão quimicamente e fisio-logicamente relacionados podem substituir os agentes aqui descritos desdeque os mesmos resultados ou resultados similares sejam obtidos. Todasestas substituições e modificações similares aparentes para os versados natécnica são consideradas dentro do espírito, escopo e conceito da invençãoconforme definida pelas reivindicações anexas. Por conseguinte, os direitosexclusivos que se deseja patentear são como descritos nas reivindicaçõesabaixo.

Claims

1. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreenderum segmento de ácido nucléico de seqüência SEQ ID N0 :1 ou SEQ ID N°: 2operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.

2. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de consistir no pEG246 como encontrado na célula hospe-deira NRRL B-21364 ou pEG1246 como encontrado na célula hospedeiraNRRL B-21366 ou na célula hospedeira NRRL B-21367.

3. Célula hospedeira de microorganismo recombinante, caracte-rizada pelo fato de ser transformada com o vetor recombinante, como defini-do na reivindicação 1, e ainda ser definida como uma célula procariótica.

4. Célula hospedeira de microorganismo recombinante, de acor-do com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ainda ser definida comouma célula bacteriana.

5. Célula hospedeira de microorganismo recombinante, de acor-do com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida célulabacteriana é uma célula de E. coli, B. thuringiensis, B. subtilis, B. megateri-um ou Pseudomonas sp.

6. Célula hospedeira de microorganismo recombinante, de acor-do com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida célulabacteriana é E. coli NRRL B-21364, B. thuringiensis NRRL B-21366 ou B.thuringiensis NRRL B-21367.

7. Método de uso de um segmento de ácido nucléico consistindona seqüência SEQ ID N0 :1 ou SEQ ID N°: 2, para expressão da proteínacristal, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) preparar um vetor recombinante no qual o referido segmentode ácido nucléico é posicionado sob controle de um promotor;(b) introduzir o referido vetor recombinante em uma célula hos-pedeira;(c) cultivar a referida célula hospedeira para expressar a referidaproteína cristal; e(d) recolher a referida proteína cristal expressa.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o referido vetor recombinante é pEG246, como encontrado nacélula hospedeira NRRL B-21364 ou pEG1246, como encontrado na célulahospedeira NRRL B-21366 ou na célula hospedeira NRRL B-21367.

9. Método para detectar uma seqüência de ácidos nucléicos co-dificando uma proteína cristal, em que a referida proteína cristal consiste naseqüência SEQ ID n°:3 ou SEQ ID n°:4, caracterizado pelo fato de que com-preende as etapas de:(a) obter amostras de ácidos nucléicos suspeitas de codificar areferida proteína cristal;(b) contatar as referidas amostras de ácidos nucléicos com umsegmento de ácidos nucléicos isolado consistindo em uma seqüência depelo menos 30 nucleotídeos contíguos da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N°: 2 oucomplementar das mesmas, em condições severas compreendendo 0,02M a 0,15M de NaCI à temperatura de 50°C a 70°C; e(c) detectar os ácidos nucléicos complementares hibridizadosassim formados, em que a detecção da hibridização indica a presença dareferida seqüência de ácidos nucléicos codificando a referida proteína cristal.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o segmento de ácido nucléico isolado consiste na SEQ ID N0 :9ou SEQIDN0: 10.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracteriza-do pelo fato de que o segmento de ácido nucléico isolado compreende umrótulo detectável e os ácidos nucléicos complementares hibridizados sãodetectados pela detecção do referido rótulo.

12. Composição, caracterizada pelo fato de compreender de 1%a 50%, em peso, de uma proteína cristal tendo a seqüência de aminoácidode SEQ ID N°:3 ou SEQ ID N°:4 e um veículo agriculturamente aceitávelcontendo pelo menos um adjuvante selecionado dentre componentes iner-tes, dispersantes, tensoativos, aderentes e aglutinantes, em que a referidacomposição compreende um extrato de células, suspensão de células, ho-mogenato de células, Iisado de células, sobrenadante de células, filtrado decélulas ou pélete de células de Bacillus thuringiensis NRRL B-21366, Bacil-Ius thuringiensi, NRRL B-21367 e E.coli NRRL B-21364 recombinantes.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza-da pelo fato de que compreende a proteína cristal tendo a seqüência de a-minoácidos de SEQ ID N°:3 ou SEQ ID N°:4 e tem atividade inseticida contrao bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), o besouro-japonês (Popilliajaponica) ou o besouro-castanho (Tribolium castaneum).

14. Método para preparar uma proteína cristal, caracterizadopelo fato de que compreende:(a) cultivar uma célula do Bacillus thuringiensis NRRL B-21365,NRRL B-21366 ou NRRL B-21367 em condições eficazes para produzir umaproteína cristal compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDN°:3 ou SEQ ID N°:4; e(b) obter a referida proteína cristal da referida célula.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS(1) INFORMAÇÕES GERAIS:(1) REQUERENTE:(A) NOME: ECOGEN, INC.(B) RUA: 2005 Cabot Boulevard West(C) CIDADE: Langhorne(D) ESTADO: Pensilvânia(E) PAÍS: EUA(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19047-3023(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: COMPOSIÇÕES DE CRYET33 E CRYET34DE BACILLUS THURINGIENSIS E USOS PARA AS MESMAS(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 10(iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR:(A) TIPO DE MEIO: Disco flexível(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO)(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:(A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/718.905(B) DATA DE DEPÓSITO: 24 SET 1996(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N0: 1:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 807 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N0: 1:ATGGGAATTA TTAATATCCA AGATGAAATT AATAATTACA TGAAAGAGGT ATATGGTGCA 60ACAACTGTTA AAAGCACATA CGATCCCTCA TTCAAAGTAT TTAATGAATC TGTGAcACCC 120CAATTCACTG AAATTCCAAC AGAACCTGTA AATAATCAAT TAACTACAAA AAGAGTAGAT 180AATACGGGTA GTTACCCAGT AGAAAGTACT GTATCGTTCA CATGGACGGA AACCCATACA 240GAAACAAGTG CAGTAACTGA GGGAGTGAAA GCCGGCACCT CAATAAGTAC TAAACAATCT 300TTTAAATTTG GTTTTGTTAA CTCTGATGTT ACTTTAACGG TATCAGCAGA ATATAATTAT 360AGTACAACAA ATACAACTAC AACAACAGAA ACACACACCT GGTCAGATTC AACAAAAGTA 420ACTATTCCTC CCAAAACTTA TGTGGAGGCT GCATACATTA TCCAAAATGG AACATATAAT 480GTTCCGGTTA ATGTAGAATG TGATATGAGT GGAACTTTAT TTTGTAGAGG GTATAGAGAT 54 0GGTGCGCTTA TTGCAGCAGT TTATGTTTCT GTAGCGGATT TAGCAGATTA CAATCCAAAT 600TTAAATCTTA-CAAATAAAGG GGATGGAATT GCTCACTTTA AAGGTTCGGG TTTTATAGAG 660GGTGCACAAG GCTTGCGAAG CATTATTCAG GTTACAGAAT ATCCACTAGA TGATAATAAA 720GGTCGCTCGA CACCAATAAC TTATTTAATA AATGGTTCAT TAGCACCAAA TGTTACATTA 780AAAAATAGCA ACATAAAATT TTAATAA 807(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 2:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 381 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 2:ATGACAGTAT ATAACGCAAC TTTCACCATT AATTTCTATA ATGAAGGAGA ATGGGGGGGG 60CCAGAACCAT ATGGTTATAT AAAAGCATAT CTTACAAATC CAGATCATGA TTTTGAAATT 120TGGAAACAAG ATGATTGGGG GAAAAGTACT CCTGAGAGAA GTACTTATAC GCAAACGATT 180AAAATAAGTA GCGACACTGG TTCCCCTATA AACCAAATGT GTTTTTATGG TGATGTGAAA 240GAATACGACG TAGGAAATGC AGATGATATT CTCGCTTATC CAAGTCAAAA AGTATGCAGT 300ACACCTGGTG TAACAGTACG ACTTGATGGC GATGAGAAAG GTTCTTATGT GACAATTAAG 360TATTCCTTGA CTCCAGCATA A 381(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 3:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 267 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 3:Met Gly Ile lie Asn Ile Gln Asp Glu Ile Asn Asn Tyr Met Lys Glu-1 5 10 15Val Tyr Gly Ala Thr Thr Val Lys Ser Thr Tyr Asp Pro Ser Phe Lys-20 25 30Val Phe Asn Glu Ser Val Thr Pro Gln Phe Thr Glu Ile Pro Thr Glu-35 40 45Pro Val Asn Asn Gln Leu Thr Thr Lys Arg Val Asp Asn Thr Gly Ser50 55 60Tyr Pro Val Glu Ser Thr Val Ser Phe Thr Trp Thr Glu Thr His Thr-65 70 75 80Glu Thr Ser Ala Val Thr Glu Gly Val Lys Ala Gly Thr Ser Ile Ser-85 90 95Thr Lys Gln Ser Phe Lys Phe Gly Phe Val Asn Ser Asp Val Thr Leu-100 105 HOThr Val Ser Ala Glu Tyr Asn Tyr Ser Thr Thr Asn Thr Thr Thr Thr-115 120 125Thr Glu Thr His Thr Trp Ser Asp Ser Thr Lys Val Thr Ile Pro Pro-130 135 140Lys Thr Tyr Val Glu Ala Ala Tyr Ile Ile Gln Asn Gly Thr Tyr Asn-145 150 155 160Val Pro Val Asn Val Glu Cys Asp Met Ser Gly Thr Leu Phe Cys Arg-165 170 175Gly Tyr Arg Asp Gly Ala Leu Ile Ala Ala Val Tyr Val Ser Val Ala-180 185 190Asp Leu Ala Asp Tyr Asn Pro Asn Leu Asn Leu Thr Asn Lys Gly Asp-195 200 205Gly Ile Ala His Phe Lys Gly Ser Gly Phe Ile Glu Gly Ala Gln Gly-210 215 220Leu Arg Ser Ile Ile Gln Val Thr Glu Tyr Pro Leu Asp Asp Asn Lys-225 230 235 240Gly Arg Ser Thr Pro Ile Thr Tyr Leu Ile Asn Gly Ser Leu Ala Pro-245 250 255Asn Val Thr Leu Lys Asn Ser Asn Ile Lys Phe-260 265(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 4:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 126 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 4:Met Thr Val Tyr Asn Ala Thr Phe Thr Ile Asn Phe Tyr Asn Glu Gly-1 5 10 15Glu Trp Gly Gly Pro Glu Pro Tyr Gly Tyr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr-20 25 30Asn Pro Asp His Asp Phe Glu Ile Trp Lys Gln Asp Asp Trp Gly Lys-35 40 45Ser Thr Pro Glu Arg Ser Thr Tyr Thr Gln Thr Ile Lys Ile Ser Ser-50 55 60Asp Thr Gly Ser Pro Ile Asn Gln Met Cys Phe Tyr Gly Asp Val Lys-65 70 75 80Glu Tyr Asp Val Gly Asn Ala Asp Asp Ile Leu Ala Tyr Pro Ser Gln-85 90 95Lys Val Cys Ser Thr Pro Gly Val Thr Val Arg Leu Asp Gly Asp Glu-100 105 110Lys Gly Ser Tyr Val Thr Ile Lys Tyr Ser Leu Thr Pro Ala-115 120 125(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 5:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N0: 5:Gly Ile Ile Asn Ile Gln Asp Glu Ile Asn Asn Tyr Met Lys Glu Val-1 5 10 15Tyr Gly Ala Thr(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 6:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 6:Thr Val Tyr Asn Val Thr Phe Thr Ile Lys Phe Tyr Asn Glu Gly Glu- 1 5 10 15Trp Gly Gly Pro- 20(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N0: 7:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 7:Met Gly Ile Ile Asn Ile Gln asp Ile Asn- 1 510(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 8:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N0: 8:Tyr Met Lys Glu Val Tyr Gly Ala- 1 5(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 9:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 33 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 9:ATGGGAATTA TTAATATTCA AGATGAAATT AAT 33(2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID N°: 10:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 56 pares de base(B) TIPO: ácido nucléico(C) CORDÃO: simples(D) TOPOLOGIA: linear(ix) ASPECTO:(A): NOME/CHAVE: base modificada(B) LOCALIZAÇÃO: 34..36(C) OUTRAS INFORMAÇÕES: mod_base = OUTRO/nota = "N = Inosina"(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID N°: 10:ATGGGAATTA TTAATATTCA AGATGAAATT AATNNNTATA TGAAAGAAGT ATATGG 56