UA75317C2 - Виділений і очищений кристалічний білок bacillus thuringiensis, композиція кристалічного білка, очищений сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб застосування сегмента нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб виявлення послідовності нуклеїнових кислот, що кодує кристалічний білок, очищене антитіло, генероване шляхом використання кристалічного білка, штам клітин bacillus thuringiensis, що містить сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує кристалічний білок, спосіб одержання кристалічного білка, інсектицидна композиція, яка містить кристалічний білок - Google Patents

Abstract

Описані штами Bacillus thuringiesis, які містять нові кристалічні білки, що мають інсектицидну активність проти твердокрилих комах, включаючи хруща каштанового (Tribolium castaneum) або японського жука (Popillia japonica). Описані також гени нового кристалічного токсину B. thuringiensis, які кодують кристалічні білки, токсичні для твердокрилих комах, а саме, кристалічний білок (29 кДа) (SEQ ID N 3) і кристалічний білок (14 кДа) (SEQ ID N 4), відповідно. Кристалічні білки є токсичними також для личинок хруща каштанового і для личинок японського жука. Крім того, описані способи одержання і використання трансгенних клітин, що містять нові нуклеїнокислотні послідовності даного винаходу.

Description

Опис винаходу

Ця заявка є частковим продовженням |заявки США МеО08/718905 від 24 вересня 1996), що цілком включена в 2 даний опис у виді посилання.

Даний винахід стосується області молекулярної біології. Більш конкретно, у деяких варіантах свого здійснення, даний винахід стосується способів і композицій, що включають ДНК-сегменти і білки, які походять від бактерій. Ще більш конкретно, даний винахід стосується нових генів сгуЕТЗЗ і сгуЕТЗ34, які походять від

Васійив (пигіпдіепзіз, і кодують кристалічні білки, що є токсичними для твердокрилих комах. Описані різні 70 способи одержання і використання зазначених ДНК-сегментів; ДНК-сегментів, що кодують синтетично модифіковані білки Сгу; і нативних і синтетичних кристалічних білків, наприклад, використання ДНК-сегментів у якості діагностичних зондів і матриць для продукування білків; і використання білків, гібридних білків-носіїв ії пептидів у різних імунологічних і діагностичних цілях. У даний заявці також описані способи одержання і використання нуклеїнокислотних сегментів для продукування трансгенних рослинних клітин, що містять

ДНК-сегменти, описані в даний заявці.

Кристалічні білки Васіїиз (пигіпдіепвіз

Одним з унікальних відмітних ознак бактерії В.(пПигіпдіепзіз є продукування нею кристалічних білків у процесі споруляції, які мають специфічну токсичність для деяких загонів і видів комах. Було показано, що багато різних штамів В.(Пигіпдіепвіз продукують інсектицидні кристалічні білки. Композиції, що включають штами В. игіпдіепзіз, які продукують білки, що мають інсектицидну активність проти лускокрилих і двокрилих комах, виготовляються промисловістю, і використовуються у якості екологічно прийнятних інсектицидів, оскільки, вони є абсолютно токсичними тільки для конкретних видів комах, на які спрямована їхня дія, але не роблять несприятливого впливу на рослини й інші організми, на які дія цих інсектицидів не спрямована.

Механізм інсектицидної активності кристалічних білків В.Пигіпдіепзіз був особливо широко досліджуваний с 29 за останнє десятиліття. Було показано, що кристалічні білки є токсичними для комах тільки після того, як цей Ге) білок ковтається комахою. Завдяки лужному рн і присутності протеолітичних ферментів у середній кишці комахи, ці білки солюбілізуються, у результаті чого визволяються компоненти, токсичні для даної комахи. Ці токсичні компоненти руйнують клітини середньої кишки комахи, приводять до припинення її харчування, а в деяких випадках, і до загибелі комахи. Виходячи з цього, було показано, що В.(Пигіпдіепзіз є ефективним і екологічно - безпечним інсектицидом, що може бути використаний для боротьби з різними комахо-шкідниками. «--

Як указувалося Нойе еї аї., (1989), більшість інсектицидних штамів В.(пигіпдіепзіз мають активність проти комах загону Лускокрилих, тобто, комах-гусениць. Інші штами В.игіпдіепвіз мають інсектицидну о активність проти загону Двокрилих, тобто, мух і комарів, або проти лускокрилих і двокрилих комах. За останні (У роки, було встановлено, що декілька штамів В.(Пигіпдіепвзіз, які продукують кристалічні білки, є токсичними 325 для комах загону Твердокрилих, тобто, жуків (Кгіед еї а!., 1982; Зіск еї а!., 1990; І атбегі еї аї., 19921. -

Генетика кристалічних білків

Ряд генів, що кодують кристалічні білки, були клоновані з декількох штамів В.(Пигіпдіепзіз. В огляді

Нойе еї аї., (1989) обговорюються гени і білки, що були ідентифіковані в штамах В.Пигіпдіепзіз до 1990 « року, і подана номенклатура і схема класифікації що традиційно застосовується до генів і білків З 50 В. Пигіпдіепзіз. Гени сгуї кодують білки Сгу І які є токсичними для лускокрилих комах. Гени сгу ІЇ кодують с білки Стгу Ії, що є токсичними як для лускокрилих, так і для двокрилих комах. Гени сгу ЇЇ кодують білки Стгу

Із» Ш, які є токсичними для твердокрилих комах, а гени сгу М кодують білки Сту М, що є токсичними для двокрилих комах.

Недавно була запропонована нова номенклатура, яка являє собою систематичну класифікацію генів сгу, засновану не на специфічності до комах, а на гомологи їхніх ДНК-послідовностей. Ця схема класифікації подана і в таблиці 1. 1

Ф

- 5 4 о ю зо вв

СУТЕЬ СтУЕ(в) М73253 ав 17710 о ук в і 20 вв 11000001 см 5 о

Як зо -

Фо ю з щі « ю З с

І» - с с ев 170 ою й ЕД и о почи сан м а Адаптовано з: пер: //ерипіх.Бріо!.вивх. ас. ик/Ноте/Меї! Стісктоге/В/іпаех, піті 99 Ідентифікація кристалічних білків, що є токсичними для твердокрилих комах

ГФ) Бактеріальні кристалічні білюи стали широко використовуватися у якості інсектицидів відтоді, коли було т повідомлено про перше виділення токсичного для твердокрилих комах штаму В.(Пигіпдіепвіз (Кгієд еї аї., 1983; 1984). Повідомлялося, що цей штам (описаний у патенті США. Мо4766203), що уводиться в даний час у опис за допомогою посилання, іменований В.(пигіпдіепзіз типовий вид (епергіопіз, є токсичним для личинок 60 твердокрилих комах Адеїавзіїса аїпі (листоїда вільхового) і І ерііпоїагза десетіїпеа(а (колорадського жука).

ЇУ патенті США Мо4766203) (який уводиться в даний опис за допомогою посилання) описаний інсектицидний кристалічний білок розміром 65-70 кілодальтонів (кДа), ідентифікований як В.Пигіпдіепвзіз (епербгіопіз (див. також, Вегппага, 1986). ЗекКаг і ін. (1987) повідомляють про клонування і характеризацію гена, який кодує кристалічний білок, що походить від В.(Пигіпдіепзіз (епергіопіз, і токсичний для твердокрилих комах. бо Передбачений розмір цього поліпептиду (установленого виходячи з генної послідовності) складає 7ЗкДа, однак,

виділений білок складається, в основному, із б5кДа-компоненту. Нойе й ін. (1987) також описують

ДНК-послідовність клонованого гена з В.(пигіпдіепзіз (епебргіопіз, причому, цій послідовність ідентична послідовності, описаній Зекаг і ін. (1987).

МесРІпегзоп і ін. (1988) описують ДНК-послідовність для клонованого гена інсектицидного білка з

В. игіпдіепзіз (епебгіопіз; причому, послідовність цього гена ідентична послідовності, описаній ЗекКаг і ін. (1987). Було виявлено, що клітини Е.соїї і клітини Рзейдотопаз ПЙцогезсепз містять клонований ген, що є токсичним для личинок колорадського жука.

ЇУ Міжнародній патентній заявці МоУУО 91/07481, опублікованій ЗО травня 1991), описані мутанти 7/0 В.Впигіпдіепвіз, що продукують високі рівні тих же самих інсектицидних білків, які продукуються вихідними батьківськими штамами, але на більш низьких рівнях. Були описані мутанти штаму В.(Пигіпдіепвіз (епебгіопів, токсичного для твердокрилих комах.

Неїтпвіайді і ін. (1986) описують токсичний для твердокрилих комах штам, позначений В.(Пигіпдіепвів типовий вид зап діедо, що продукує кристалічний б4кДа-білок, який є токсичним для деяких твердокрилих комах, /5 Включаючи Ругтайа Ішеоіа (листоїд в'язовий); Апіпопо-тиз дгадіз (довгоносик бавовняний); І еріїпоїагза десетіїпеаїа (колорадський жук); Озіогпупспиз зійсайе (скосарь борознистий); Тепебгіо тоїйог (борошняний хрущак великий), Наїйса 20т-Брасіпа; і Оіабгоїїса ипаесітрипсіаійа (блошка західна одинадцятикрапкова).

ДНК-послідовність гена токсину, токсичного для твердокрилих, що походить від В.(Пигіпдіепзів зап аїіеодо, була встановлена Негїтпвіайді і ін. (1987) і описана |в патенті США Мо4771131). Послідовність гена токсину

В. ВПигіпдіепзіз зап адіедо ідентична послідовності, описаній ЗекКкаг і ін. (1987) для клонованого гена токсину, токсичного для твердокрилих В.(ППигіпдіепзізв (епебгіопіз. За допомогою різних діагностичних тестів, Кгіед і ін. (1987) продемонстрували, що штам В .(Пигіпдіепвіз зап діедо ідентичний штаму В.(пигіпдіепвіз (епебгіопів.

Інший штам В.Пигіпдіепзіз, ЕС2158, був виявлений Юопомап і ін. (1988) і описаний |у патенті США

Мо5024807Ї. Штам ЕбС2158 продукує кристалічний 7ЗкДа-білок СгуС, що має інсектицидну активність проти с ов твердокрилих комах. Його ДНК-послідовність ідентична послідовності, описаній ЗеКаг і ін. (1987) для клонованого гена токсину В.Пигіпдіепвіз Їепебгіопіз. Цей ген токсину для твердокрилих був позначений Нокйе і і) ін. (1989) геном сгушА. Для цього штаму також були виявлені два більш дрібних білки розміром 30- і 29-кДа, але вони не були охарактеризовані (Оопомап еї а/!., 1988).

ЇУ патенті США Мо5024837| також описаний гібрид штамів В.(Пигіпдіепзіз типовий вид Кигеїакі, що виявляв ч- зо активність як проти лускокрилих, так і проти твердокрилих комах. (У патенті США Ме4797279 (відповідному ЕР 0221024) описаний гібрид В.(игіпдіепзіз, трансформований плазмідою, що походить від В.(Пигіпдіепвів (87 типового виду Кигзіакі, і містить ген, який кодує кристалічний білок, токсичний для лускокрилих; і плазмідою, с що походить від В.Пигіпдіепзіз (епергіопіз, і містить ген, що кодує кристалічний білок, токсичний для твердокрилих. Гібридний штам В.(пигіпдіепзіз продукує кристалічні білки, що мають як властивості білків, які о

Зв ПОХОДЯТЬ від В.(пигіпдіепвзіз Кигеїакі, так і властивості білків, які походять від В.Пигіпдіепвіз ї- іепергіопіз. (У опатенті США Мо4910016 (відповідному ЕР 0303379) описаний ізолят В .Пигіпдіепвів, ідентифікований як В.(Пигіпдіепзіз МТ 104, який має інсектицидну активність проти твердокрилих і лускокрилих комах.

ІВ опублікованій Європейській патентній заявці Мо0318143)| описаний інтактний частково модифікований ген « від В.Пигіпдіепзіз (епебгіопіз, і рекомбінантні вектори, що містять цей ген, і здатні до спрямованої з с експресії білка, який має токсичність для твердокрилих комах; а |в опублікованій Європейській патентній заявці Мо0324254) описаний штам В (Пигіпдіепвзіз АЗО, що має інсектицидну активність проти твердокрилих комах, ;» включаючи личинки колорадського жука, личинки блішки довговусої, і довгоносика бавовняного.

ЇУ патенті США Мо4999192 (відповідному ЕР 0328383)|) описаний штам В .Пигіпдіепзіз РЗ40О1, що має інсектицидну активність проти личинок колорадського жука. Цей штам був також ідентифікований за допомогою -І сіротипування як сіротип вавб, то!гтізопі. (У патенті США Мо5006336 (відповідному ЕР 0346114)| описаний ізолят

В. Вигіпдіепзіз, позначений РЗ12203, що був сіротипований як сіротип вав8б, тогтізопі, і який має інсектицидну о активність проти личинок колорадського жука. (У патенті США Мо4966765 (відповідному ЕР 0346114))| описаний 2) штам В.Пигіпдіепзіз, РЗ8ФБВІ (ідентифікований за допомогою сіротипування як сіротип (оїмогійі), що має інсектицидну активність проти колорадського жука. - Нуклеотидні послідовності гена сгуПШВ і білок, що кодується ним, який є токсичним для твердокрилих "М комах, були описані Зіск і ін. (1990), однак, штам-джерело В.(Пигіпдіепзіз був ідентифікований лише шляхом сіротипування як сіротип (оїм'огійпі. ГУ патенті США Мо4966156, виданому 26 лютого 1991р. зіск і ін. (відповідному ЕР 0337604)), описаний ген токсину В.(Пигіпдіепзіз, отриманий із штаму 4З3Е В.Пигіпдіепзіз, що ов має активність проти твердокрилих комах, і його генна послідовність виявилась ідентичною гену сгуППІВ.

Повідомлялося, що штам 4ЗЕ В (пПигіпдіепвзіз має активність проти колорадського жука і І ерііпо-іагза (ехапа.

Ф) ІВ опублікованій Європейській патентній заявці Мо03829901 описані два штаму В.Пигіпдіепзіз, БІРОЗ1208 і ка БЕРєРО51245, що продукують кристалічні білки розміром 74 і 129кДа, відповідно, що мають інсектицидну активність проти личинок колорадського жука. Виявилось, що ДНК-послідовність, установлена для гена токсину, який бо продукує 74кДа-білок, є родинною гену сгуІІВ, описаному зІіскК і ін. (1990).

ІВ опублікованій Міжнародній патентній заявці РСТ УУО 90/136511) описані штами В .Пигіпдіепвзів5, що містять ген токсину, який кодує 81кДа-білок, що, як указується, є токсичним як для лускокрилих, так і для твердокрилих комах. (У патенті США Мо5055293) описане використання В.Іагегозрогоиз для боротьби з блошкою довговусою (Оіабгоїіса). 65 Даний винахід різко відрізняється від попередніх робіт тим, що він стосується нових кристалічних білків

СтуЕТЗЗ і Стує 134, і нових ДНК-послідовностей, які кодують ці білки, що представляють новий клас кристалічних білків В.(пигіпдіепвіз, і не мають загальної гомології послідовностей із жодним зі штамів, описаних у вищевказаній літературі. Ізолят В. Пигіпдіепзіз, описаний і заявлений у даному винаході, являє собою перший із виявлених штамів В.(Пигіпдіепвіз Кигвіакі, що, як було показано, має токсичність для твердокрилих комах.

Штами В.Пигіпдіепзіз даного винаходу містять нові гени сгу, що експресують білкові токсини, які мають інсектицидну активність проти твердокрилих комах, таких як, комахи роду Роріїїса і ТгіроЇїшт.

В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується нових нуклеїнокислотних сегментів, які містять два гени токсичного для твердокрилих комах Б5-ендотоксину, що мають нуклеотидні послідовності і виведені амінокислотні послідовності, проілюстровані на Фіг.1а, Фіг.1в і Фіг.1с. Далі, ці гени будуть позначатися 7/0 9УЕТЗЗ (ЗЕО 10 Мої) Її сгуєт34 (ЗЕО ІО Мо2). Ген сгуЕТЗ3З має кодуючу область, що простирається від нуклеотидної основи 136 до основи 939, як показано на Фіг.А, Фіг.1В і Фіг.1С; а ген сгуєТтТ34 має кодуючу область, що простирається від нуклеотидної основи 969 до основи 1349, як показано на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С.

В іншому своєму аспекті, даний винахід стосується інсектицидних білків, що кодуються новими генами

СТУЕТЗЗ і сгуЕєТ34. Виведена амінокислотна послідовність білка СТУЕТЗ3З (ЗЕО ІЮО МоЗ), кодована геном сгуєТ33, 7/5 що простирається від нуклеотидної основи 136 до основи 936, показана на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. Виведена амінокислотна послідовність білка СтуЕє1734 (ЗЕО ІЮ Мо4), кодована геном сгуЕТ34, що простирається від нуклеотидної основи 969 до основи 1346, також показана на Фіг1А, Фіг1В і Фіг1С. Ці білки мають інсектицидну активність проти комах загону твердокрилих, а зокрема, проти довгоносика бавовняного, хрущака каштанового і хрущака японського (японського жука).

В іншому своєму аспекті даний винахід стосується біологічно чистої культури природного штаму ЕС10327 бактерії В.(пигіпдіепзіз дикого типу, депонованого 14 грудня 1994р. Науково-дослідною колекцією сільськогосподарських культур. Північною регіональною дослідницькою лабораторією (Могійегп Кедіопаї

Кезеагсі І арогаїогу, МКК) під номером доступу Мо МКК. В-21365. Штам ЕС10327 В. Пигіпдіепзіз являє собою природний штам В.(Пигіпдіепзіз, що містить гени, які є родинними або ідентичними генам сгуЕТЗЗ і сгуЕєТ34 сч ов даного винаходу. Штам ЕС10327 продукує інсектицидні 29кДа- і 14кДа-білки, які є родинними або ідентичними білкам СтуУЕєТЗ3З і СТУЕТ34, описаним у даний заявці. і)

В іншому своєму аспекті, даний винахід стосується рекомбінантного вектора, що містить один або обидва нових гени сгуЕТЗЗ і сгуєТ34; рекомбінантної клітини-хазяїна, трансформованої таким рекомбінантним вектором; і біологічно чистої культури рекомбінантної бактерії, трансфордованої зазначеним вектором. У кращих варіантах М зо здійснення винаходу, кращою бактерією є В.(Пигіпдіепвзіз, така як, рекомбінантний штам ЕС11402 (депонований 14 грудня 1994р. МЕВІ. під номером доступу В-21366), описаний у прикладі 8, і рекомбінантний штам ЕС11403 ж7 (депонований 14 грудня 1994р. МКК. під номером доступу В-21367), описаний у прикладі 7. В іншому кращому с варіанті здійснення даного винаходу кращою є бактерія Е.соїї, така як, рекомбінантні штами ЕбС11460 (депоновані 14 грудня (1994р. МАККІ під номером доступу В-21364). Усі штами, депоновані МКК, були о депоновані Колекцією патентних культур відповідно до Будапештського договору, і було отримано депозитне ї- свідчення про життєздатність штамів відповідно до встановленої Міжнародної форми про депонування ВР/4.

ДНЕК-сегменти генів сгуєТЗЗ і сгуєТ 34

Даний винахід також стосується ДНК-сегментів, що можуть бути виділені практично з будь-якого джерела; які не містять повної геномної ДНК; і які кодують нові пептиди, описані в даний заявці. Було показано, що «

ДНК-сегменти, що кодують пептиди цього виду, можуть кодувати білки, поліпептиди, субодиниці, функціональні па) с домени і т.і. родинних кристалічним білкам Продуктів або інших неродинних генних продуктів. Крім того, ці

ДНК-сегменти можуть бути цілком синтезовані іп міїго із використанням методів, добре відомих фахівцям. ;» Ген сгуєТ3З маф нуклеотидну послідовність, показану на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг.1С. Ген сгуєТтЗ33 (5ЕО ІЮ Мо) кодує 29кДа-білок сгуЕєЕТ3З3, що має амінокислотну послідовність, показану на Фіг1А, Фіг.1В і Фіг1С (5ЕО ІЮ

МеЗ). Ген сгуєТ34 (ЗЕО ІО Мо2) кодує 14кДа-білок СтуЕТ34, що має амінокислотну послідовність, показану на -І ФігЛ1А, Фіг.1В і Фіг.1С (5ЕО ІЮ Мод).

Використовуваний у даному описі термін "ДНК-сегмент" стосується виділеної ДНК-молекули, що не містіть 1 повної геномної ДНК даного виду. Тому, "ДНК-сегмент, що кодує кристалічний білок або пептид" означає 2) ДНК-сегмент, що містить кодуючі послідовності кристалічного білка, вже виділені або очищені з повної геномної 5о ДНК бактеріального виду, від якого був отриманий цей ДНК-сегмент, і який, у даному випадку, є грам-позитивною - бактерією роду Васійи5, а зокрема, виду Васіїїиз, відомого як В.(Пигіпдіепзіз. Термін "ДНК-сегмент" включає "М ДНК-сегменти і більш дрібні фрагменти цих сегментів, а також рекомбінантні вектори, включаючи, наприклад, плазміди, косміди, фагміди, фаги, віруси і т.і.

Аналогічно, ДНК-сегмент, що містить виділений або очищений ген, який кодує кристалічний білок, означає

ДНК-сегмент, що може, крім того, включати послідовності, що кодують пептид, деякі інші елементи, такі як, регуляторні послідовності, відділені, в основному, від інших природних генів; або послідовності, що кодують

Ф) білок. У цьому зв'язку, термін "ген" використовують просто для позначення одиниці, що кодує функціональний ка білок, поліпептид або пептид. При цьому, слід також відзначити, що цей функціональний термін включає обидві геномні послідовності, послідовності оперону і більш дрібні сконструйовані генні сегменти, які експресують во білки, поліпептиди або пептиди, або можуть бути адаптовані для їхньої експресії.

Термін "виділений, в основному, з інших послідовностей, що кодують", - означає, що потрібний ген, а в даному випадку, ген, який кодує бактеріальний кристалічний білок, складає значну частину кодуючої області

ДНК-сегмента, і що цей ДНК-сегмент не містить великих ділянок природної кодуючої ДНК, таких як великі хромосомні фрагменти або інші функціональні гени або кодуючі області оперону. Саме собою зрозуміло, що цей 65 термін включає спочатку виділений ДНК-сегмент, і не виключає гени, рекомбінантні гени, синтетичні лінкери, або області, що кодують, які були пізніше штучно додані до сегмента.

У конкретних варіантах свого здійснення даний винахід стосується виділених ДНК-сегментів і рекомбінантних векторів, що включають ДНК-послідовності, що кодують пептид виду Стгу, амінокислотна послідовність якого включає амінокислотну послідовність, в основному, подану в ЗЕО ІЮО МоЗ3З або 5ЕО ІЮО Мо4,

Термін "амінокислотна послідовність, в основному, подана в ЗЕО ІЮО Мо3З або 5ЕО ІЮ Мо4" означає, що ця послідовність відповідає, в основному, частини послідовності або ЗЕС ІЮО Мо3, або ЗЕО ІЮО Мо4, і має відносно невелике число амінокислот, що не є ідентичними або біологічно функціонально еквівалентними амінокислотам будь-якій із зазначених послідовностей. Термін "біологічно функціонально еквівалентний" добре зрозумілий будь-якому фахівцю, і, крім того, він точно визначений у даному описі (див., наприклад, "Ілюстративні 70 варіанти здійснення винаходу"). Відповідно до цього, амінокислотні послідовності, що мають ідентичність або функціональну еквівалентність з амінокислотами ЗЕО ІЮО МоЗ або 5ЕО ІЮО Мо4 від біля 7095 до біля 8095, або переважно, від біля 8195 до біля 9095, а більш переважно, від біля 9195 до біля 9995, будуть вважатися послідовностями, що, в основному, подані в ЗЕО ІЮ Мо3З або ЗЕО ІЮ Мо4.

Слід також відзначити, що амінокислотні і нуклеїнокислотні послідовності можуть включати додаткові /5 Залишки, такі як додаткові М- або С-кінцеві амінокислотні послідовності або 5- або 3'-послідовності, але, при цьому, вони будуть вважатися, в основному, такими, як послідовності, подані в одній із вищеописаних послідовностей, за умови, що ці послідовності задовольняють критеріям, викладеним вище, включаючи збереження біологічної активності білка, у тому випадку, якщо Це стосується експресії білка. Зокрема, до нуклеінокислотних послідовностей можуть бути додані кінцеві послідовності, і вони можуть, наприклад, включати

Візні некодуючі послідовності, що фланкують або 5-, або 3'-частини кодуючої області або вони можуть включати різні внутрішні послідовності, тобто, інтрони, що як відомо, присутні усередині генів.

Нуклеїнокислотні сегменти даного винаходу, незалежно від довжини самої кодуючої послідовності можуть бути об'єднані з іншими ДНК-послідовностями, такими як промотори, сигнали поліаденілування, додаткові сайти ферментів, що рестриктують, сайти множинного цлонування, інші сегменти, що кодують, і т.і. так, що їхня повна сч ов довжина може значно варіюватися. А тому, якщо взяти до уваги той факт, що може бути використаний нуклеінокислотний фрагмент майже будь-якої довжини, то повна довжина, переважно, обмежується просто о шляхом розробки або використання відповідного протоколу техніки рекомбінантних ДНК. Так, наприклад, можуть бути отримані нуклеїнокислотні фрагменти, що включають коротку безупинну ділянку, що кодує або пептидні послідовності, описані в 5ЕО І Мо3З або ЗЕО І Мо4, або фрагменти, що ідентичні або комплементарні ч- зо ДНК-послідовностям, що кодують будь-який пептид у послідовності ЗЕСО ІЮ Мо3 або ЗЕО ІЮО Мо4, а зокрема,

ДНК-сегменти, описані в ЗЕО І Мої або 5ЕО ІЮО Мо2. Так, наприклад, можуть бути також використані --

ДНК-послідовності, такі як, послідовності у біля 18 нуклеотидів, і послідовності, що складають аж до біля с 10000, біля 5000, біля 3000, біля 2000, біля 1000, біля 500, біля 200, біля 100, біля 50, і біля 14 пар основ у довжину (включаючи усі фрагменти з проміжними довжинами). о

Для кожного фахівця зовсім очевидно, що, у даному контексті, термін "проміжні довжини" означає будь-яку ї- довжину, що складає проміжне значення між вищевказаними інтервалами, таку як, 18, 19, 20, 21, 22, 23 і т.д.; 30, 31, 32 і т.д.; 50, 51, 52, 53, і т.д; 100, 101, 102, 103, і т.д; 150, 151, 152, 153 і т.д; включаючи всі цілі числа 200-500; 500-1000; 1000-2000; 2000-3000; 3000-5000; і аж до цих значень, а також включаючи послідовності приблизно в 5200 нуклеотидів і т.Ї. «

Слід також відзначити, що даний винахід не обмежується конкретними нуклеїнокислотними послідовностями, з с що кодують пептиди даного винаходу або які кодують амінокислотні послідовності зЗЕО ІЮ Мо3З або ЗЕО ІЮО Мо4, включаючи ті ДНК-послідовності, що, зокрема, описані в 5ЕО ІЮО Мої або ЗЕО ІО Мо2. Тому, рекомбінантні з вектори і виділені ДНК-сегменти можуть, так чи інакше, включати самі пептид-кодуючі області; кодуючі ділянки, несучі обрані зміни або модифікації в основній області, що кодує; або вони можуть кодувати більш великі поліпептиди, що, при цьому, включають ці пептид-кодуючі області; або вони можуть кодувати біологічно -І функціонально еквівалентні білки або пептиди, що мають варіантні амінокислотні послідовності.

ДНК-сегменти даного винаходу включають біологічно функціональні еквівалентні пептиди. Такі послідовності о можуть продукуватися в результаті виродженості кодонів і функціональної еквівалентності пептидів, які 2) кодуються, що, як відомо, властиво природним нуклеїнокислотним послідовностям і білкам, що кодовані ними. 5р Альтернативно, функціонально еквівалентні білки або пептиди можуть бути сконструйовані з використанням - техніки рекомбінантних ДНК, де модифікації можуть бути внесені в структуру білка виходячи з властивостей "М амінокислотних послідовностей, що повинні бути змінені. Потрібні модифікації можуть бути штучно введені з використанням техніки сайт-направленого мутагенезу, наприклад, для внесення змін в антигенність білка або для тестування мутантів із метою оцінки їхньої активності на молекулярному рівні.

Якщо необхідно, то можуть бути також отримані гібридні білки і пептиди, у яких, наприклад, первинна структура областей, які кодують пептид, у тій же самій одиниці, що експресує, порівнюєтеся з іншими білками

Ф) або пептидами, які мають потрібні функції, наприклад, із метою обчищення або імунодетекції (наприклад, білки, ка що можуть бути очищені за допомогою афінної хроматографії; і області що кодують ферментну мітку, відповідно). во У ще одному своєму аспекті, даний винахід стосується рекомбінантних векторів. Особливо кращими є вектори, у яких кодуюча частина ДНК-сегмента, незалежно від того, кодує вона повнорозмірний білок чи більш дрібний пептид, знаходиться під контролем промотору. Цей промотор може бути промотором, що у природних умовах асоціюється з геном, який кодує пептиди даного винаходу, і може бути отриманий шляхом виділення 5'--екодуючих послідовностей, розташованих вище сегмента, що кодує, або екзону, наприклад, із використанням 65 техніки рекомбінантного клонування і/або РОК тм-технології, описаній в даній заявці у зв'язку з одержанням композицій.

СтуєтТЗз3- і сгуєТ34-ДНК-сегменти, використовувані у якості гібридизаційних зондів і праймерів

Крім використання для регулювання експресії кристалічних білків або пептидів даного винаходу, розглянуті вище нуклеїнокислотні послідовності також використовуються у ряді інших цілей. (Наприклад, вони можуть бути також використані у якості зондів або праймерів в експериментах по гібридизації нуклеїнової кислоти. Власне кажучи, передбачається, що особливе застосування можуть знайти нуклеїнокислотні сегменти, що містять область послідовності, яка складається, принаймні, із послідовності довжиною в 14 безперервно слідуючих один за одним нуклеотидів, що мають ту ж послідовність, або послідовність, комплементарну послідовності

ДНК-сегмента довжиною в 14 безперервно слідуючих один за одним нуклеотидів у ЗЕО ІО Мо1 або 5ЕО ІЮО Мо2. У /о деяких варіантах здійснення даного винаходу, можуть бути використані більш довгі ідентичні або комплементарні послідовності із суміжних безперервно слідуючих один за одним нуклеотидів, наприклад, послідовності, що складаються із біля 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000п.0о., і т.д. (включаючи всі проміжні довжини і вище, і включаючи повнорозмірну послідовність із 5200 пар основ).

Здатність таких нуклеїнокислотних зондів специфічно гібридизуватися з послідовностями, що кодують 7/5 Кристалічний білок, дозволяє використовувати ці зонди для виявлення присутності комплементарних послідовностей у даному зразку. Однак, вони можуть бути використані й в інших цілях, включаючи використання даних про послідовність для одержання праймерів мутантних видів, або праймерів, використовуваних для одержання інших генетичних конструкцій.

Передбачається, що нуклеїнокислотні молекули, які мають області послідовності, що складаються із ділянок із 10-14, 15-20, 30, 50, або навіть 100-200 безперервно слідуючих один за одним нуклеотидів або т.., ідентичних або комплементарних ДНК-послідовностям ЗЕО ІЮО Мо1 або 5ЕО ІЮО Мо2, є особливо придатними для використання у якості гібридизаційних зондів, наприклад, у Саузерн- і Нозерн-блотінгу. Більш дрібні фрагменти, в основному, можуть бути використані при здійсненні гібридизації, де довжина безперервної комплементарної області може варіюватися, наприклад, від біля 10-14 і до біля 100 або 200 нуклеотидів, але сч ов для детекції, якщо це необхідно, можуть бути також використані і більш великі безперервні комплементарні о ділянки, відповідно до довжини комплементарних послідовностей.

Очевидно, що фрагменти можуть бути також отримані іншими методами, такими як, наприклад, метод механічної фрагментації або гідроліз ферментами, що рестриктують. Невеликі нуклеїнокислотні сегменти або фрагменти можуть бути легко отримані, наприклад, методом прямого синтезу фрагмента хімічними способами, М зо як це звичайно робиться, із використанням автоматичного олігонуклеотидного синтезатора. Крім того, фрагменти можуть бути отримані шляхом застосування технології репродукування нуклеїнової кислоти, такої як технологія --

РСКтм, описана |в заявках на Патент США Мо4683195 і 46832021 (кожна з яких вводиться в даний винахід за с допомогою посилання), шляхом вбудовування обраних послідовностей у рекомбінантні вектори для рекомбінантного продукування, або шляхом застосування інших технологій рекомбінантних ДНК, в основному, о з5 відомих фахівцям в області молекулярної біології. ї-

Відповідно до цього, нуклеотидні послідовності даного винаходу можуть бути використані за їхню здатністю до селективного утворення дуплексних молекул із комплементарними ділянками ДНК-фрагментів. У залежності від розглянутого застосування, може статися бажаним використовувати різні умови гібридизації для досягнення різних Ступенів селективності зонда стосовно послідовності-мішені. Для застосувань, що вимагають високої « селективності, звичайно/ із метою одержання гібридів, може статися бажаним використовувати відносно жорсткі с умови, наприклад, можуть бути обрані умови з відносно низькою концентрацією солі і/або високою й температурою, наприклад, такі як, присутність від біля 0,02М до біля 0,15М Май при температурі від біля 509 до "» біля 702С. Такі селективні умови майже не допускають, або взагалі не допускають, невідповідності між зондом і матрицею або ланцюгом-мішенню, і повинні бути особливо відповідними для виділення ДНК-сегментів, що

Кодують кристалічний білок. Детекція ДНК-сегментів за допомогою гібридизації добре відома фахівцям, і - і приклади методів гібридизаційного аналізу наводяться |в патентах США МоМо4965188 і 5176995) (кожний із яких сл вводиться в даний опис за допомогою посилання). Особливо підхожий опис цієї техніки можна також знайти |в роботах Маїоу еї а/!., 1993; Зедаї! 1776; РгоКор, 1991; і Кибу, 19911. (95) Саме собою зрозуміло, що для деяких застосувань, наприклад, там, де для одержання мутантів бажано шу 50 використовувати ланцюг мутантного праймера, гібридизований з нижчерозташованою матрицею, або там, де необхідно знайти і виділити послідовності, що кодують кристалічний білок, і походять від родинних штамів, що функціональних еквівалентів, або т.і., звичайно вимагаються менше жорсткі умови гібридизації для того, щоб міг утворитися гетеродуплекс. У цих випадках, може статися кращим використовувати такі умови, як присутність від біля 0,15М до біля 0,9М солі, при температурі від біли 20 оС до біля 55290. Перехресно види, що гібридизуються, можуть бути, тим самим, легко ідентифіковані, як сигнали позитивної гібридизації у порівнянні о з контрольними гібридизаціями. У будь-якому випадку, можна загалом відзначити, що умови можуть бути зроблені більш жорсткими шляхом додавання зростаючих кількостей формаміду, який служить для дестабілізації їмо) гібридного дуплекса так само, як і підвищена температура. Таким чином, умови гібридизації можуть бути легко змінені, і обраний метод залежить від бажаних результатів. 6о0 У деяких варіантах здійснення даного винаходу, для оцінки гібридизації може статися переважним використовувати нуклеїнокислотні послідовності даного винаходу в комбінації з відповідними засобами, такими як, мітка. Фахівцям відомий широкий ряд індикаторних засобів, включаючи флуоресцентні, радіоактивні, ферментативні і інші ліганди, такі як, авідин/біотин, які здатні давати сигнал, що детектується. У кращих варіантах здійснення винаходу, замість радіоактивних або інших небажаних з екологічної точки зору реагентів, 65 переважно, використовувати флуоресцентну мітку або ферментну мітку, таку як, уреаза, лужна фосфатаза або пероксидаза. Стосовно ферментних міток, відомо, що в цьому випадку, для забезпечення їхньої візуалізації як людським оком, так і спектрофотометричним прибором, можуть бути використані колометричні індикаторні субстрати, які дозволяють ідентифікувати специфічну гібридизацію з використанням зразків, що містять комплементарні нуклеїнові кислоти.

Взагалі, вважається, що гібридизаційні зонди, описані у даний заявці, можуть бути використані у якості реагентів для гібридизації у розчині, а у деяких варіантах, може бути також використана тверда фаза. У тих варіантах даного винаходу, де використовується тверда фаза, ДНК, що тестується, (або РНК) адсорбують або як-небудь інакше приєднують до обраної матриці або до поверхні. Потім, цю фіксовану одноланцюжну нуклеїнову кислоту піддають специфічній гібридизації з обраними зондами у відповідних умовах. Вибір умов /о залежить від конкретних обставин, і визначається виходячи з конкретно необхідних критеріїв (наприклад, у залежності від вмісту С-С, типу нуклеїнової кислоти-мішені джерела нуклеїнової кислоти, розміру гібридизаційного зонда і т.і.). Після промивання гібридизованої поверхні так, щоб були віддалені неспецифічно зв'язані молекули-зонди, специфічну гібридизацію детектують, або навіть оцінюють кількісно за допомогою мітки.

Рекомбінантні вектори й експресія кристалічних білків

В інших варіантах здійснення даного винаходу, передбачається, що деякі переваги можуть бути досягнуті шляхом приміщення ДНК-сегмента, що кодує, під контроль рекомбінантного або гетерологічного промотору.

Використовуваний у даному описі термін "рекомбінантний або гетерологічний промотор" означає промотор, який у природних умовах звичайно не асоціюється з ДНК-сегментом, що кодує кристалічний білок або пептид. Такими промоторами можуть бути промотори, які звичайно асоціюються з іншими генами, і/або промотори, виділені з будь-яких бактеріальних, вірусних, еукаріотичних або рослинних клітин. В основному, дуже важливо використовувати промотор, який ефективно направляє експресію ДНК-сегмента в тип клітини, організм, або навіть тварину, обрані для експресії. Використання промоторів і комбінацій типів клітин для експресії білка, в основному, відомо кожному фахівцю в області молекулярної біологи, |див., наприклад, Затрьгоок еї аї., 19891.

Відповідними промоторами можуть бути конститутивні або індуцибельні промотори, що можуть бути використані сч ов У відповідних умовах для досягнення високих рівнів експресії убудованого ДНК-сегмента, так, щоб їх можна було застосовувати для великомасштабного продукування рекомбінантних білків і пептидів. Відповідними (8) промоторними системами, що можуть бути використані для експресії високих рівнів білка, є, але не обмежуються ними, векторна система експресії Ріспіа (Рпагтасіа І КВ Віобесппо!іоду).

Що стосується варіантів здійснення експресії для одержання рекомбінантних білків і пептидів, то М зо вважається, що в більшості випадків можуть бути використані більш довгі ДНК-сегменти; при цьому, найбільш кращими є ДНК-сегменти, що кодують повну пептидну послідовність. Однак, слід зазначити, що даний винахід (87 також передбачає використання більш коротких ДНК-сегментів для спрямованої експресії кристалічних пептидів, с або епітопних корових областей, таких, які можуть бути використані для генерування антитіл проти кристалічного білка. Особливо відповідними вважаються ДНК-сегменти, що кодукіть пептидні антигени довжиною Щео, від біля 8 до біля 50 амінокислот, або більш переважно від біля 8 до біля ЗО амінокислот, або навіть більш ча переважно, від біля 8 до біля 20 амінокислот. Такими пептидними епітопами можуть бути амінокислотні послідовності, що включають безперервні амінокислотні послідовності з ЗЕО ІЮ Мо3З або ЗЕО ІЮ Мо4.

Трансгени кристалічних білків і трансгенні рослини

У ще одному своєму аспекті даний винахід стосується способів продукування трансгенної рослини, що « експресує нуклеїнокислотний сегмент, який кодує новий кристалічний білок даного винаходу. Спосіб в с продукування трансгенних рослин добре відомий фахівцям. Загалом, цей спосіб передбачає трансформацію . відповідної клітини-хазяїна ДНК-сегментом, що містить промотор, правильно приєднаний до кодуючої області, и?» яка кодує кристалічний білок СТУЕТЗ3З або Стуєт34 ВуПигіпдіепзіз. Така кодуюча область, звичайно правильно з'єднана з областю термінації транскрипції, завдяки чому зазначений промотор здатний регулювати транскрипцію кодуючої області у клітині, забезпечуючи, тим самим, здатність клітини продукувати -І рекомбінантний білок іп мімо. Альтернативно, у тих випадках, коли бажано здійснювати контроль, регуляцію або зниження кількості рекомбінантного кристалічного білка, що конкретно експресується в конкретній трансгенній 1 клітині, даний винахід також передбачає експресію антисмислової мРНК кристалічного білка. Використання 2) антисмислової МРНК як засобу для регулювання або зниження кількості даного потрібного білка в клітині добре

Відомо фахівцям. - В іншому своєму аспекті даний винахід стосується трансгенних рослин, що експресують ген або генний

І сегмент, який кодує одну або декілька нових поліпептидних композицій, описаних у даний заявці.

Використовуваний у даному описі термін "трансгенна рослина" означає рослину, що містить убудовані

ДНК-послідовності, включаючи, але не обмежуючись ними, гени, які, цілююом ймовірно, не існують у природі; дв ДНК послідовності, що як правило, не транскрибуються в РНК, або не транслюються ("експресуються") з творенням білка; або будь-які інші гени або ДНК-послідовності, які бажано ввести в нетрансформовану рослину,

Ф) такі як, гени, що, в основному, можуть бути присутніми у нетрансформованій рослині, але які бажано або ка сконструювати методами генної інженерії, або модифікувати так, щоб вони мали змінену експресію.

У деяких випадках, необхідно, щоб геном трансгенної рослини даного винаходу був збільшений за бо допомогою стабільного введення одного або декількох трансгенів сгуєТЗ33 або сгуЕтТ34, які можуть бути нативними, синтетично модифікованими, або мутантними. У деяких випадках, у геном трансформованої рослинної клітини-хазяїна може бути введене більш одного трансгена. Таким випадком є, наприклад, випадок, коли в геном рослини вводять ДНК-сегмент, що кодує більш, ніж один кристалічний білок. У деяких ситуаціях, може статися бажаним мати один, два, три, чотири або навіть більш кристалічні білки В.(Пигіпдіепзіз (або б5 нативних, або рекомбінантно сконструйованих), включених і таких, що стабільно експресуються у трансформованій трансгенній рослині.

Кращим геном, що може бути убудований, є, наприклад, ДНК-послідовність, яка кодує кристалічний білок, і походить від бактерії, а зокрема, один або декілька генів, що описані в даний заявці, і які були отримані від видів Васійй5. У високому ступені кращими нуклеїнокислотними послідовностями є послідовності, отримані від

Вапигіпдіепвів, або будь-яка з цих послідовностей, яка була генетично сконструйована для зниження або збільшення інсектицидної активності кристалічного білка в такій трансформованій клітині-хазяїні.

Засоби, використовувані для трансформації рослинної клітини і для одержання трансгенної клітинної лінії, добре відомі фахівцям, і обговорюються у даному описі. Вектори, плазміди, косміди, МАС (штучні дріжджові хромосоми) і ДНК-сегменти, використовувані для трансформації таких клітин, містять, зрозуміло, в основному, /о оперони, гени, або послідовності даного винаходу, що походять від генів, або нативні або синтетично сконструйовані послідовності, а зокрема, послідовності, які кодують кристалічні білка, що описуються. Ці

ДНК-конструкції можуть, крім того, включати структури, такі як, промотори, енхансери, полілінкери, або навіть генні послідовності, що мають позитивно або негативно-регуляторну активність стосовно конкретних генів, які представляють інтерес. ДНК-сегмент або ген може кодувати або нативний, або модифікований кристалічний 7/5 білок що може бути експресований в отриманих рекомбінантних клітинах, і/або який може забезпечувати поліпшений фенотип генерованій клітині.

Такими трансгенними рослинами можуть бути, переважно, однодольні або дводольні рослини, що мають підвищену резистентність до інсектициду, завдяки введенню в ці рослини трансгенного ДНК-сегмента, який кодуює один або декілька кристалічних білків СтуЕТЗЗ і/або СтуЕТ34, що є токсичними для твердокрилих комах.

Особливо кращими рослинами є трави, які утворюють дерн, пшениця, овочеві рослини, декоративні рослини, плодові дерева, і т.і.

У своєму родинному аспекті даний винахід також стосується насіння, продукованого трансформованою рослиною; потомства, отриманого від цього насіння; і насіння, продукованого потомством вихідної трансгенної рослини, отриманої відповідно до вищевказаного способу. Таке потомство і насіння будуть містити трансген, що сч ов КОДуЄ кристалічний білок, і стабільно убудований у їхнім геном, і ці потомствені рослини будуть успадковувати ознаки, повідомлені їм шляхом уведення стабільного трансгена методами менделеївської генетики. Усі зазначені (8) трансгенні рослини, що мають убудовані в їхній геном трансгенні ДНК-сегменти, які кодують один або декілька кристалічних білків або поліпептидів СтуЕТЗ3 і/або СтуЕТ34, являють собою аспекти даного винаходу.

Сайт-специфічний мутагенез ї- зо Сайт-специфічний мутагенез являє собою техніку, використовувану для одержання окремих пептидів, або біологічно функціональних еквівалентних білків або пептидів за допомогою специфічного мутагенезу на основі (87

ДНК. Крім того, ця техніка дозволяє легко одержати і проаналізувати варіанти послідовностей, наприклад, с приймаючи до уваги одне або декілька з вищевказаних посилань, шляхом введення однієї або декількох модифікацій нуклеотидної послідовності в ДНК. Сайт-специфічний мутагенез дозволяє продукувати мутанти за о

Зз5 Допомогою використання специфічних олігонуклеотидних послідовностей, що містять ДНК-послідовність із ї- потрібною мутацією, а також достатнє число суміжних нуклеотидів, і одержувати праймерну послідовність потрібного розміру і з потрібною варіабельністю послідовностей для утворення стабільного дуплекса, що простирається по обидві сторони від делеційного стику. Звичайно, кращим є праймер довжиною від біля 13, або біля 14, або біля 16, або біля 17 включно, і включаючи, до біля 18, або біля 19, або біля 20, або біля 21, « 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, або навіть до біля 30, 40, або біля 50 або т.і. нуклеотидів, де біля 5-10 в с залишків на обох сторонах від стику послідовності є зміненими. . В основному, техніка сайт-специфічного мутагенезу добре відома фахівцям, і описана в різних публікаціях. и?» Слід зазначити, що звичайно, у цій техніці використовують фаговий вектор, що є присутнім як в одноланцюжній, так і в дволанцюжній формі. Типовими векторами, використовуваними в сайт-специфічному мутагенезі, є такі

Вектори, як фаг М13. Цей фаг є комерційно доступним і його використання, в основному, добре відомо фахівцям. -І Дволанцюжні плазміди також традиційно використовуються в сайт-специфічному мутагенезі, що дозволяє виключити стадію переносу потрібного гена з плазміди у фаг. 1 В основному, відповідно до даного винаходу, сайт-специфічний мутагенез здійснюють спочатку шляхом оо одержання одноланцюжного вектора або дисоціації шляхом плавлення дволанцюжного вектора, що у своїй послідовності містить ДНК-послідовність, яка кодує потрібний пептид. Олігонуклеотидний праймер, що несе - потрібну мутовану послідовність, одержують, в основному, синтетично. Потім цей праймер гібридизують з "М одноланцюжним вектором, і піддають обробці ферментами, що полімеризують ДНК, такими як фрагмент

Кленова полімерази | Е.соїї, для завершення повного синтезу ланцюга, що несе мутацію. У такий спосіб утворюється гетеродуплекс, де один ланцюг кодує вихідну немутовану послідовність, а другий ланцюг несе потрібну мутацію. Потім, цей гетеродуплексний вектор використовують для трансформації відповідних клітин, таких як, клітини Е.соїї, і відбирають клони, що містять рекомбінантні вектори, які несуть відповідним чином (Ф, розташовану мутовану послідовність. ка Одержання варіантів послідовності обраних ДНК-сегментів, що кодують пептид, із використанням сайт-направленого мутагенезу, є одним із способів продукування потенційно корисних видів, але цей спосіб не бор повинний розглядатися як деяке обмеження, оскільки можуть бути використані й інші способи, що передбачають одержання варіантів послідовностей пептидів і ДНК-послідовностей, що кодують ці пептиди. Так, наприклад, для одержання варіантних послідовностей, рекомбінантні вектори, що кодують потрібну пептидну послідовність, можуть бути оброблені мутагенними агентами, такими як, гідроксиламін.

Композиції, що включають антитіло проти СтуЕєТ33 і СтуЕє 1734, і способи їх одержання 65 У конкретних варіантах здійснення винаходу, автори даного винаходу використовували антитіла, або моноклональні, або поліклональні, що зв'язуються з кристалічними білками, описаними в даний заявці. Способи одержання і характеризації антитіл добре відомі фахівцям |див., наприклад. Апіїроду: А Іарогаїгу МапцпааїЇ,

Соїа бргіпуд Нагбог І арогайогу, Мем МогКк, 19881; цей опис вводиться в дану заявку за допомогою посилання). У способах генерування моноклональних антитіл (тАбБ) звичайно використовуються ті ж самі лиінії, що

Використовуються для одержання поліклональних антитіл. Інакше кажучи, поліклональне антитіло продукують шляхом імунізації тварини імуногенною композицією даного винаходу, і від імунізованої тварини беруть антисироватку. Для продукування антисироватки можуть бути використані тварини широкого ряду. Звичайно, тваринами, використовуваними для продукування антисироватки, є кролики, миші, пацюки, хом'ячки, морські свинки, або кози. Для продукування поліклональних антитіл, кращими є кролики, оскільки вони мають відносно 7/о Великий об'єм крові.

Фахівцям добре відомо, що дана композиція може варіюватися за своєю імуногенністю. Тому, часто виявляється необхідним додатково стимулювати імунну систему хазяїна, що може бути досягнуте шляхом зв'язування пептидного або поліпептидного імуногена з носієм. Прикладами кращих носіїв є гемоціанін лімфи равлика (КІМ) і альбумін бичачої сироватки (ВЗА). У якості носіїв можуть бути також використані й інші альбуміни, такі як овальбумін, альбумін мишиної сироватки, або альбумін кролячої сироватки. Кон'югування поліпептиду з білком-носієм може бути здійснено способами, добре відомими фахівцям, наприклад, із використанням глутаральдегіду, м-малеїімідобенкоїл-М-гідроксисукцинімідоефіру, карбодиміду, і біс-біазотованого бензидину.

Фахівцям також добре відомо, що імуногенність конкретної імуногенної композиції може бути посилена шляхом використання неспецифічних стимуляторів імунної відповіді, відомих як ад'юванти. Типовими і кращими адювантами є повний ад'ювант Фрейнда (неспецифічний стимулятор імунної відповіді, що містить "убиту" бактерію Мусобасіегіт (ирегсціовіз), неповний ад'ювант Фрейнда, і ад'ювант на основі гідроксиду алюмінію.

Кількість імуногенної композиції, використовуваної для продукування поліклональних антитіл, варіюється в залежності від природи імуногена, а також від тварини, використовуваної для імунізації. Для введення сч об Їмуногена можуть бути використані різні способи (підшкірний, внутрішньом'язовий, Ччрезшкірний, внутрішньовенний і внутрішньоочеревинний). Продукування поліклональних антитіл може бути простежене і) шляхом узяття проб крові від імунізованої тварини в різних ділянках організму тварини після його імунізації.

Може бути також уведена друга (бустер)-ін'єкція. Процес введення бустер-ін'єкцій і титрування повторюють доти, поки не буде отриманий відповідний титр. При досягненні потрібного рівня імуногенності, кров М

Зо імунізованої тварини може бути зібрана, а сироватка може бути виділена і збережена, і/або ця тварина може бути використана для продукування моноклональних антитіл (тАБ). --

Моноклональні антитіла (тАбБ) можуть бути легко отримані з використанням добре відомої техніки, с

Інаприклад, описаної в патенті США Мо419626), що вводиться в даний опис за допомогою посилання. Звичайно ця техніка передбачає імунізацію відповідної тварини обраною Імуногенною композицією, наприклад, очищеним о або частково очищеним кристалічним білком, поліпептидом або пептидом. Композицію, яка імунізує, уводять ї- способом, ефективним для стимуляції клітин, що продукують антитіло. Кращими тваринами є гризуни, такі як, миші і пацюки, однак, можуть бути також використані клітини кроликів, овець або жаб. Використання пацюків може мати деякі переваги (Содіпо, 1986, рр.60-61), але краще використовувати мишей, особливо кращими є миші ВАЇ В/с, оскільки вони використовуються найбільш часто, і дають, в основному, найбільш високий відсоток « стабільних гібридів. в с Після імунізації; для генерування тАБ відповідно до звичайної схеми, відбирають соматичні клітини, здатні . продукувати антитіла, зокрема, лімфоцити В (В-клітини). Ці клітини можуть бути отримані шляхом біопсії із и?» селезінки, мигдалин або лімфатичних вузлів, або зі зразків периферійної крові. Клітини селезінки і клітини периферійної крові є кращими, перші, тому, що вони являють собою багате джерело клітин, які продукують антитіло, що знаходяться в стадії лімфобластів, які діляться, а другі - тому що, периферійна кров є легко -І доступним джерелом. Часто імунізують ряд різних тварин, після чого селезінку з найбільш високим титром видаляють, і лімфоцити селезінки одержують шляхом гомогенізації селезінки шприцом. Звичайно селезінка і-й імунізованої миші містить приблизно 5х107-2Х1089 лімфоцитів. (95) Потім В-лімфоцити, що продукують антитіло, отримані від імунізованої тварини, піддають злиттю з шу 20 імррталізованими мієломними клітинами, звичайно, клітинами тварини того ж виду, який було імунізовано.

Кращими мієломними лініями, що підходять для використання в процедурах злиття з метою продукування "і гібридом, є клітини, що не продукують антитіл, мають високу ефективність злиття, і не містять ферментів, що повідомляють цим клітинам нездатність зростати у визначених селективних середовищах, які підтримують ріст тільки потрібних злитих клітин (гібридом).

Може бути використаний будь-який вид з ряду існуючих мієломних клітин, відомих фахівцям |Соаїпа, рр.65-66, 1986; Сатрреї, рр.75-83, 1984). Так, наприклад, якщо імунізованою твариною є миша, то можуть бути о використані РЗ-ХбЗ/А9д8, Х63-А98.653,. М51/1-Ад41, 5р210-А914, РО, МОЛ), МРО-11, МРОС11-Х45-СТО 1,7 і ко 5194/5ХХО Виї; якщо імунізованими тваринами є пацюки, то можуть бути використані К210.КСУЗ, УЗ3-А91.2.3,

ІК98ЗЕ ї 48210; а якщо для злиття використовуються клітини людини, то можуть бути використані усі О-266, 6о ОМ1500-окО2, ПІСК- ОМ-НМУуг і 0С729-6.

Однією з кращих мієломних клітин миші є мієломна клітинна лінія М5-1 (що позначається також

РЗ-М5-1-Ада-1), яка легко може бути отримана зі сховища генетичних мутантних клітин людини (Нитап Сепеїйїс

Мшапі СеїЇ Керозіюгу, МІСМ5) шляхом запиту в цьому сховищі клітинної лінії 5М3573. Іншою мієломною мишиною клітинною лінією, що може бути використана, є резистентна до 8-азагуаніну непродукуюча клітинна 65 лінія, мишиної мієломи ЗР2/0.

Методи генерації гібридів клітин що продукують антитіло селезінки, або лімфовузлів і мієломних клітин звичайно передбачають змішування соматичних клітин із мієломними клітинами у відношенні 2:11, хоча це відношення може варіюватися в межах від біля 20:1 до біля 1:1, відповідно, у присутності агента або агентів (хімічних або електричних), що стимулюють злиття клітинних мембран. Були описані методи злиття з використанням вірусу Сендай (Копіег 8 Міївіеіп, 1975; 1976), і з використанням поліетиленгліколю (ПЕГ), такого як 3795 (об/др) ПЕГ (Сепйег еї аї., 1977). Відповідними для використання є також методи електрично індукованого злиття (Содіпо, 1986, рр.71-74).

Процедури злиття звичайно продукують життєздатні гібриди при низькій частоті, біля 1 х1075-1Х510738, Однак, у цьому зв'язку не виникає ніяких проблем, оскільки життєздатні злиті гібриди можуть бути диференційовані від 70 батьківських незлитих клітин (зокрема, від незлитих мієломних клітин, що звичайно, повинні безперервно ділитися) шляхом культивування в селективному середовищі. Таким селективним середовищем звичайно є середовище, що містить агент, який блокує де помо синтез нуклеотидів у середовищі для культивування тканин.

Типовими і кращими агентами є аміноптерин, метотрексат і азасерин. Аміноптерин і метотрексат блокують де помо синтез як пуринів, так і піримідинів, тоді як азасерин блокує тільки синтез пуринів. Якщо 75 використовується аміноптерин або метотрексат, то в середовище добавляють гіпоксантин і тимідин як джерело нуклеотидів (середовище НАТ). Якщо використовується азасерин, то в середовище добавляють гіпоксантин.

Кращим селективним середовищем є НАТ. У середовищі НАТ можуть виживати тільки клітини, здатні діяти шляхом "реутилізації" нуклеотидів. Мієломні клітини є дефіцитними по Ключових ферментах "реутилізаційного" шляху, наприклад, по гіпоксантин-фосфоріоозилтрансферазі (НРКТ), і вони не можуть виживати в цьому середовищі. В-клітини можуть діяти цим шляхом, але вони мають обмежений життєвий цикл у культурі, і звичайно гинуть приблизно через два тижні. Тому, тільки клітини, що можуть виживати в селективних середовищах, є гібридами, утвореними від мієломи і В-клітин.

Це культивування дає популяцію гібридом, із якої відбирають специфічні гібридоми. Звичайно, добір гібридом здійснюють шляхом культивування клітин методом одноклонового розведення в планшетах для с мікротитрування з наступним аналізом окремих клональних супернатантів (приблизно через 2-3 тижні) для о одержання потрібної реактивності. Цей аналіз повинний бути чутливим, простим і швидким, таким як, радіоїмуноаналізи, імуноферментні аналізи, аналізи на цитотоксичність, аналізи методом бляшок, дот-блот-імуноаналізи на зв'язування, і т.і.

Потім відібрані гібридоми піддають серійному розведенню і клонують в окремі клітинні лінії що продукують че антитіло, клони яких можуть бути потім розмножені до нескінченності з продукуванням тАБ. Ці клітинні лінії можуть бути використані для продукування тАБ двома основними способами. Зразок гібридоми може бути - ін'єкційований (часто в черевну порожнину) гістосумісній тварині того типу, що був використаний для со продукування соматичних і мієломних клітин для початкового злиття. У ін'єкційованої тварини розвивається пухлина, що секретує специфічні моноклональні антитіла, продукує гібридними злитими клітинами. Потім, о фізіологічні рідини тварини, такі як, сироватка або асцитна рідина, можуть бути віддалені з одержанням тАБ їч- високої концентрації. Окремі клітинні лінії можуть бути також культивовані іп мійго, де тАБ звичайно секретуються в культуральне середовище, із якого вони можуть бути легко отримані у високих концентраціях.

Якщо необхідно, продуковані тАб можуть бути потім очищені методом фільтрації, центрифугування, і різними « хроматографічними методами, такими як, ВЕЖХ або афінна хроматографія.

ЕИЗА і імунопреципітація - с З метою даного винаходу можуть бути використані аналізи ЕП ІЗА. В аналізі ЕГІ5ЗА, білки або пептиди, що ц включають послідовності антигенних кристалічних білків, імобілізують на обраній поверхні, переважно, на ,» поверхні, що має спорідненість до даного білка, такій як, лунки полістиролового планшета для мікротитрування.

Після відмивання для видалення неповністю адсорбованого матеріалу лунки аналітичного планшета, переважно, зв'язують із неспецифічним білком, або сенсибілізують неспецифічним білком, який, як відомо, є - І антигенно нейтральним стосовно антисироватці, що тестується, таким як, альбумін бичачої сироватки (В5А), казеїн або розчини сухого молока. Ця процедура дозволяє блокувати ділянки неспецифічної адсорбції на і-й поверхні, що імобілізує, і, тим самим, сприяє зниженню фону, обумовленого неспецифічним зв'язуванням (9) антисироватки на поверхні лунок. шу 20 Після зв'язування антигенного матеріалу з лункою, сенсибілізації нереакційноздатним матеріалом для зниження фону, і промивання для видалення незв'язаного матеріалу, поверхню, що імобілізує, піддають контакту і з антисироваткою або з досліджуваним клінічним або біологічним екстрактом способом, що сприяє утворенню імунного комплексу (антиген/антитіло) Ці умови передбачають, переважно, розведення антисироватки розріджувачами, такими як, В5А, бичачий гама-глобулін (ВО), і забуферений фосфатом фізіологічний розчин (РВЗ)УТвінФ. Ці додані агенти також сприяють зниженню неспецифічного зв'язування. Потім нанесений шар антисироватки залишають для інкубування протягом від біля 2 до біля 4 години, при температурі, переважно,

ІФ) порядку від біля 259 до біля 2720. Після інкубування, поверхню, яка контактує з антисироваткою, промивають їмо) для видалення матеріалу, який не утворив імунокомплекс. Краща процедура промивання передбачає промивання таким розчином, як РВЗ/ІвінФ), або боратним буфером. 60 Після утворення специфічних імунних комплексів між зразком, що тестується, і зв'язаним антигеном, і після наступного промивання, поява цього імунокомплекса і навіть його кількості можуть бути визначені за допомогою взаємодії, якій піддають цей імунокомплекс із "другим" антитілом, що має специфічність до першого антитіла.

Для здійснення цього Способу виявлення, "друге" антитіло переважно, кон'югують із ферментом, що генерує колірне фарбування після його інкубування з відповідним хромогенним субстратом. Так, наприклад, необхідно, 65 щоб зв'язана з антисироваткою поверхня контактувала або була інкубована з антитілом, що кон'юговане з уреазою або пероксидазою проти імуноглобулінів людини дО протягом такого періоду часу й у таких умовах, які сприяють прояву фарбування, зв'язаному з утворенням імунокомплекса (наприклад, інкубування протягом 2 годин при кімнатній температурі в розчині, що містить РВ5, такому як, РВ5-Твінф)).

Після інкубування з "другим" антитілом, міченим ферментом, і наступним відмиванням для видалення незв'язаного матеріалу, кількість мітки може бути оцінена шляхом інкубування з хромогенним субстратом, таким як, сечовина і бромкрезоловий пурпурний або 2,2'-азино-ди-(3З-етил-бензтіазолін)-6-сульфонова кислота (АВТ) і

НьО», у випадку, якщо у якості ферментної мітки використовується пероксидаза. Потім, кількісна оцінка може бути проведена шляхом виміру ступеня продукування фарбування, наприклад, із використанням спектрофотометру у візуальній області спектрів. 70 Антитіла проти кристалічних білків даного винаходу можуть бути, зокрема, використані для виділення інших кристалічних білкових антигенів шляхом імунопреципітації. Імунопреципітація передбачає виділення цільового антигенного компонента із суміші комплексу, і використовується для розпізнавання або виділення невеликих кількостей білка. Для виділення мембрани, білкові клітини повинні бути солюбілізовані в міцели детергента.

Кращими є неїійоногенні солі, оскільки інші агенти, такі як солі жовчних кислот, осаджуються при кислотному рН або у присутності двовалентних катіонів.

В альтернативному експерименті, антитіла даного винаходу можуть бути використані для замикання місцеположення двох антигенів. Цей метод є особливо ефективним для підвищення локалізованої концентрації антигенів, наприклад, пар "фермент-субстрат".

Вестерн-блотінг

Композиції даного винаходу можуть бути широко використані в імуноблот-аналізі або Вестерн-блот-аналізі.

Антитіла проти пептидів можуть бути використані у якості високоафінних первинних реагентів для ідентифікації білків, імобілізованих на твердій матриці-носії, такій як нітроцелюлоза, нейлон, або їхні комбінації. У сполученні з імунопреципітацією із наступним гель-електрофорезом, вони можуть бути використані у якості реагенту для одностадійної детекції антигенів, проти яких вторинні реагенти, використовувані для детекції сч ов антигену, дають небажаний фон. їхнє використання є особливо кращим у тому випадку, коли досліджуваними антигенами є імуноглобуліни (що дозволяє уникнути використання імуноглобулінів, які зв'язуються з і) компонентами клітинної стінки бактерій), і в цьому випадку досліджувані антигени перехресно реагують з агентом, що детектує, або вони мігрують при тій же самій відносній молекулярній масі, що і сигнал, який реагує перехресно. ї- зо Вважається, що особливо цінними в цьому відношенні є методи імунологічної детекції, що проводяться в сполученні з Вестерн-блотінгом, і передбачають використання мічених ферментами, радіоактивно мічених, або (87 флуоресцентно-мічених "Інших" антитіл проти молекули токсину. с

Набори для скринінгу і детекції кристалічних білків

У даному винаході описані методи і набори для скринінгу зразків, що приблизно містять поліпептиди о кристалічного білка або поліпептиди, що походять від кристалічного білка, або клітини, що продукують такі ї- поліпептиди. Набір може містити одне або декілька антитіл даного винаходу, і може також містити реагент(и) для детекції взаємодії між зразком і антитілом Даного винаходу. Отриманий реагент(и) може бути радіоактивно-, фруоресцентно-, або ферментативно-міченим. Цей набір може містити відомий радіоактивно мічений агент, здатний зв'язувати або взаємодіяти з нуклеїновою кислотою або антитілом даного винаходу. «

Реагент(и) цього набору може бути виготовлений у виді рідкого розчину, у виді матеріалу, зв'язаного з з с твердим носієм, або у виді сухого порошку. Переважно, «щоб реагент(и) був виготовлений у виді рідкого розчину, який є водяним розчином. Якщо реагенти зв'язують із твердим носієм, то кращим твердим носієм може ;» бути хроматографічне середовище, тест-планшет, що має безліч лунок, або предметне скло для мікроскопа.

Якщо реагенти виготовляють у виді сухого порошку, то цей порошок може бути розведений з одержанням розчину шляхом додавання відповідного розчинника, який може бути підготовлений заздалегідь. -І В інших варіантах свого здійснення, даний винахід стосується способів імунодетекції і асоційованих з ними наборів. Було припущено, що кристалічні білюи або пептиди даного винаходу можуть бути використані для 1 детекції антитіл, які зв'язуються з ними; або, альтернативно, антитіла, отримані відповідно до даного 2) винаходу, можуть бути використані для детекції кристалічних білків або пептидів, що містять епітоп родинного кристалічного білка. Загалом, у цих способах, спочатку одержують зразок, що, приблизно, містить зазначений - білок, пептид або антитіло, а потім, цей зразок піддають контакту з антитілом або пептидом даного винаходу в

І умовах, ефективних для утворення імунокомплексу, і якщо це утворення мало місце, то здійснюють детектування присутності цього імунокомплексу.

В основному, процедура детекції утворення імунокомплексу добре відома фахівцям і може бути здійснена різними способами. Так, наприклад, для цієї мети, даний винахід передбачає проведення аналізів ЕГІ5А, РІА, імуноблотінгу (наприклад, дот-блот-аналізу), непрямого імунофлуоресцентного аналізу т.і. В основному,

Ф) утворення імунокомплексу може бути виявлене; за допомогою мітки, такої як, радіоактивна мітка або ферментна ка мітка (така як, лужна фосфатаза, пероксидаза хріну, або т.і). Зрозуміло, може статися кращим використовувати вторинний ліганд для зв'язування, таких як, "друге" антитіло або система біотин/авідинового ліганду для бо Зв'язування, добре відома фахівцям.

Було припущено, що для аналізу може бути використаний практично будь-який досліджуваний зразок, що, приблизно, містить або кристалічний білок або пептид, або пептид, родинний кристалічному білку, або антитіло проти цього білка, як розглядається в даному випадку. При цьому, передбачається, що ці варіанти здійснення винаходу можуть знайти застосування при титруванні зразків антигену або антитіла, при доборі гібридом, і т.Ї. 65 У родинних варіантах свого здійснення, даний винахід стосується виготовлення наборів, що можуть бути використані для виявлення присутності кристалічних білків або родинних білків, і/або антитіл у зразку. У якості прикладів можуть служити клітини, супернатанти клітин, клітинні екстракти, ферментні фракції, білкові екстракти, або інші безклітинні композиції, що, приблизно, містять кристалічні білки або пептиди. Узагалі говорячи, набори даного винаходу можуть включати відповідний кристалічний білок, пептид, або антитіло, спрямоване проти такого білка або пептиду, разом із реагентом для імунодетекції, і тарою для утримування антитіла або антигену і реагенту. Реагент, що імунодетектує, звичайно включає мітку, асоційовану з антитілом або антигеном, або мітку, асоційовану з вторинним зв'язуючим лігандом. Прикладами таких лігандів є "друге" антитіло, спрямоване проти "першого" антитіла або антигену, або біотиновий або авідиновий (або стрептавідиновий) ліганд, що має асоційовану мітку. Як вказувалося вище, мабуть, що для цілей даного 7/0 винаходу може бути використаний цілий ряд традиційних міток, добре відомих фахівцям.

У якості тари звичайно використовується посуд, у який можуть бути поміщені антитіло, антиген або реагент, що детектує, а переважно, їхні аліквоти. Набори даного винаходу звичайно також включають засоби для утримування тари з антитілами, антигенами, і реагентами в герметично закритому виді для комерційної реалізації. Такою тарою можуть бути видувні пластикові контейнери, у яких зберігаються потрібний посуд.

Епітопні корові послідовності

Даний винахід також стосується білкових або пептидних композицій, що не містять інтактних клітин і інших пептидів, і містять очищений білок або пептид, який має епітоп, що імунологічно перехресно реагує з одним або декількома антитілами проти кристалічного білка. Зокрема, даний винахід стосується епітопних корових послідовностей, що походять від білків або пептидів Стгу.

Використовуваний у даному описі термін " що містить епітоп, який імунологічно перехресно реагує з одним або декількома антитілами проти кристалічного білка" стосується пептиду або білкового антигену, який має первинну, вторинну або третинну структуру, аналогічну епітопу, локалізованому усередині кристалічного білка або поліпептиду. При цьому, ступінь подібності є, в основному, такою, що моноклональні або поліклональні антитіла, спрямовані проти кристалічного білка або поліпептиду, будуть також зв'язуватися, реагувати, або с г як-небудь інакше розпізнавати перехресно-реактивний пептидний або білковий антиген. У сполученні з такими антитілами можуть бути використані різні методи імуноаналізу, наприклад, такі як, Вестерн-блотінг, ЕГІЗА, і)

РІА, і т.і., усі з яких добре відомі фахівцям.

Ідентифікація імунодомінантних епітопів Стгу, і/або їх функціональних еквівалентів, що підходять для використання у вакцинах, є відносно прямим методом. Так, наприклад, можуть бути використані методи Норр, ї- зо (описані в патенті США Мо4554101), що вводиться в даний опис за допомогою посилання, і в якому описана ідентифікація й одержання епітопів з амінокислотної послідовності на основі її гідрофільності. Ці методи -- описані в деяких інших роботах, і для ідентифікації епітопних корових послідовностей можуть бути також с використані комп'ютерні програми, розроблені на основі цих методів |див., наприклад, Чхатезоп 5 УМоїї, 1988;

МОЇ еї а!., 1988; патент США Мо4554101). Амінокислотна послідовність цих "епітопних корових послідовностей" що)

Зз5 Може бути потім легко введена в пептиди з використанням методу пептидного синтезу або з використанням ча техніки рекомбінантних ДНК.

Кращими пептидами для використання в даному винаході є пептиди, що мають довжину порядку від біля 8 до біля 20 амінокислот, а більш переважно від біля 8 до біля 15 амінокислот. Було припущено, що більш короткі пептиди, що походять від антигенного кристалічного білка, мають, у деяких випадках, більше переваг, « 70 наприклад, при проведенні імунологічного аналізу. Прикладами таких переваг є легке одержання й обчищення, в с відносно низька вартість і краща відтвореність продуктів, і кращий біологічний розподіл.

Й Було припущено, що конкретні переваги даного винаходу можуть бути реалізовані шляхом одержання и? синтетичних пептидів, що включають модифіковані і/або подовжені епітопні/муногенні корові послідовності, що дозволяють одержати "універсальний" епітопний пептид, спрямований на кристалічні білки, а зокрема, на Сту-послідовності або Стгу-родинні послідовності. У конкретному аспекті даного винаходу, ці епітопні -І послідовності ідентифікують як гідрофільні області конкретного поліпептидного антигену. Було припущено, що ці області являють собою ділянки, що, цілком ймовірно, індукують Т-клітинну або В-клітинну стимуляцію, а, отже, о дозволяють виявити продукування специфічного антитіла. 2) Використовувані в даному винаході епітопні корові послідовності являють собою відносно коротку ділянку, 5р що складається з амінокислот, що є "комплементарними" антигензв'язуючим сайтам або зв'язуються з цими - сайтами на антитілах, спрямованих проти кристалічного білка, і описаних у даній заявці. Крім того, або "М альтернативно, епітопна корова послідовність являє собою послідовність, що виявляє антитіла, які перехресно реагують з антитілами, спрямованими проти пептидних композицій даного винаходу. При цьому, слід зазначити, що в контексті даного опису, термін "комплементарний" стосується амінокислот або пептидів, що мають здатність зв'язуватися один з одним. Таким чином, деякі епітопні корові послідовності даного винаходу можуть бути чітко визначені за їхню здатністю конкурувати за зв'язування або, мабуть, витискати зв'язування

Ф) потрібного білкового антигену з антисироваткою, спрямованою на відповідний білок. ка При цьому, очевидно, що розмір поліпептидного антигену, в основному, не грає вирішальної ролі, за умови, що він має довжину, принаймні, достатню для здійснення ідентифікації корової послідовності або бор послідовностей. Очевидно, найменшою коровою послідовністю, що може бути використана в даному винаході, є послідовність, що має довжину приблизно біля 8 амінокислот, а більш переважно, приблизно від 10 до 20 амінокислот. Таким чином, цей розмір звичайно відповідає самим дрібним пептидним антигенам, отриманим відповідно до даного винаходу. Однак, якщо необхідно, цей антиген може мати більш великий розмір за умови, що він містить основну епітопну корову послідовність. 65 Ідентифікація епітопних корових послідовностей відома фахівцям, і описана, |наприклад, у патенті США

Мо45541011, що вводиться в даний опис за допомогою посилання, і в якому описана ідентифікація й одержання епітопів з амінокислотної послідовності виходячи з гідрофільності. Крім того, можуть бути використані численні комп'ютерні програми, призначені для визначення антигенних ділянок білків |див., наприклад, д9Уатезоп 8: УМоїї, 1988; УМОЇї! еї а!., 1988). Програми для комп'ютеризованого аналізу пептидних послідовностей (наприклад, ОМАЗІагое зоїймаге, ОМАЗІаг, Іпс., Мадізоп, МУ) можуть бути також використані для конструювання синтетичних пептидів відповідно до даного опису.

Синтез епітопних послідовностей або пептидів, що містять у своїй послідовності антигенний епітоп, може бути легко здійснений із використанням стандартної техніки синтезу, такої як, метод твердофазного синтезу (наприклад, із використанням комерційно доступного синтезатора, такого як Аррієй Віозузіетз Моаде! 430А /о Реріде Зупіпевігег). Потім синтезовані в такий спосіб пептидні послідовності розділяють на аліквоти з заздалегідь визначеною кількістю, і зберігають відповідним чином, наприклад, у виді водяних розчинів, або навіть, більш переважно, у виді порошку або в ліофілізованому стані, аж до їхнього використання.

Узагалі говорячи, завдяки відносній стабільності пептидів, вони можуть легко зберігатися, якщо це необхідно, у водяних розчинах протягом досить тривалого часу, наприклад, до 6 місяців або більш, практично в 7/5 будь-якому водяному розчині, не виявляючи, при цьому, помітного розкладання, або не утрачаючи своєї антигенної активності. Однак, якщо передбачається більш тривале збереження у водяному розчині, то в цьому випадку, звичайно, кращими є агенти, що включають буфери, такі як, Тріс або фосфатні буфери, у яких рн підтримується від біля 7,0 до біля 7,5. Крім того, може статися кращим використовувати агенти, що інгібують ріст мікробів, такі як, азид натрію або Мертіолат. Для тривалого збереження у водяному стані, розчини бажано берегти при біля 42С, а більш переважно, у замороженому стані. Зрозуміло, якщо пептиди зберігаються в ліофілізованому або порошкоподібному стані, то вони можуть зберігатися, практично, нескінченно, наприклад, у заздалегідь визначених аліквотах, що, перед їхнім застосуванням, можуть бути повторно гідратовані з використанням попередньо визначеної кількості води (переважно, дистильованої) або буфера.

Біологічно функціональні еквіваленти с

У структуру пептидів даного винаходу і ДНК-сегментів, що кодують ці пептиди, можуть бути внесені модифікації і зміни, у результаті чого може бути отримана функціональна молекула, яка кодує білок або пептид о із потрібними властивостями. Нижче наводиться обговорення, що стосується замін амінокислот білка з метою створення еквівалента, або навіть поліпшення молекули другої генерації. У конкретних варіантах здійснення даного винаходу, передбачається, що мутовані кристалічні білки можуть бути використані для підвищення ї- зо інсектицидної активності білка, і отже, для підвищення інсектицидної активності і/або експресії рекомбінантного трансгена в рослинній клітині. Заміни амінокислот можуть бути здійснені шляхом заміни кодонів. (7

ДНК-послідовності на відповідні кодони, подані в таблиці 2. со ю зв м лячно 00оле, (А|всл|восівов|вс

Цевно 000 (був сесію 111 опертнова кислота дер|р сАсівАЮ 11

Глутшміова кюслотаею є ЄАА(вАС ч 4 Фенлаланно ев сю | 11 З с тлмно 000 (ву оса восоооово . Пед 000 неон сасією 000 » зелеино ле А АюсАЮЮ ля 000 бік АААДААЄ 1 Леще пеніс род оооо Сол соо сив|с0о - Метонно мем лою! 10 сл делявно 00 ААСІАЮ

Проялю 000 сс сссосвієсо

Фо тлушмно (вп слАДЄАЄ 1 з ю двно 0000 Аюов| ло оАоо Сол сос сос со

Серяє 000 Беб5о лосів оса осо осо осо тм Треойно000опєрт) АСААСв АСУ!

Вале 0000 Ма воловосвовівюю

Лвитовано (тем ев) 000 25 Тирозин 0 тугх ріс рАЮ! ЇЇ о Наприклад, деякі амінокислоти в структурі білка можуть бути замінені іншими амінокислотами без значної їмо) втрати здатності зв'язування з такими структурами, як, наприклад області антитіл, що зв'язують антиген, або сайтів зв'язування на молекулах субстрату. Оскільки саме здатність зв'язувати і природа білка визначає бо біологічну функціональну активність цього білка, то в послідовності білка можуть зроблені деякі амінокислотні заміни, і, саме собою зрозуміло, ці заміни можуть бути зроблені в його ДНК-послідовності, що кодує, але, при цьому, може бути отриманий білок із подібними властивостями. Тому, автори даного винаходу вважають, що в пептидних послідовностях описаних композицій або у відповідних ДНК-послідовностях, що кодують зазначені пептиди, можуть бути зроблені різні заміни без утрати їхньої біологічної цінності або активності. бБ Проведення таких замін може бути здійснено з урахуванням гідропатичного індексу. Важливість цього гідропатичного індексу амінокислот у повідомленні даному білку інтерактивної біологічної функції, в основному, відома фахівцям (Куїе 85 ЮооіШе, 1982, ця робота вводиться в даний опис за допомогою посилання). Вважається, що відносний гідропатичний характер амінокислоти повідомляється вторинній структурі отриманого білка, що, у свою Чергу, визначає взаємодію білка з іншими молекулами, наприклад, із ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антитілами, антигенами, і т.і.

Кожній амінокислоті приписують гідропатичний індекс виходячи з її гідрофобності і зарядної характеристики (Кут. 8 ОооіШе, 1982), так, наприклад, ізолейцин (4,5); валін (14,2); лейцин (13,8); фенілаланін (2,8); цистеїн/цистин (2,5); метіонін (1,93; аланін (1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,99; тірозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (-3,5)3; аспартат (-3,5); /о аспаргін (-3,5); лізин (-3,9); і аргінін (-4,5).

Відомо, що деякі амінокислоти можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають аналогічний гідропатичний індекс або оцінку, і ця заміна, проте, приводить до одержання білка з аналогічною біологічною активністю, тобто, до одержання білка з біологічно еквівалентною функцією. При проведенні таких замін, переважно здійснювати заміну амінокислот, гідропатичний індекс яких складає в межах -2, більш переважно, у 7/5 межах 4-1, а ще більш переважно, у межах -0,5.

Фахівцям також відомо, що заміна еквівалентних амінокислот може бути ефективно здійснена виходячи з гідрофільності. (У патенті США Мо4554101), що вводиться в даний опис за допомогою посилання, указується, що найбільше значення локальної середньої гідрофільності білка, що визначається гідрофільністю його суміжних амінокислот, корелює з біологічною властивістю цього білка.

Як докладно описано |в патенті США Мо4554101), амінокислотним залишкам були приписані наступні значення гідрофільності: аргінін (43,0); лізин (ї-3,0); аспартат (43,0 -1); глутамат (3,041); серин (0,3); аспаргін (140,2); глутамін (10,2); гліцин (0); треонін (-0,4)3; пролін (-0,5--1); аланін (-0,53); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); тірозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); триптофан (-3,4). Ге

Слід зазначити, що деякі амінокислоти можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають аналогічне (5) значення ліпофільності, і ця заміна, проте, приводить до одержання білка з аналогічною біологічною активністю, тобто до одержання білка з біологічно еквівалентною функцією. При проведенні таких замін, переважно здійснювати заміну амінокислот, значення ліпофільності яких складає порядку 42, більш переважно, порядку 41, а ще більш переважно, порядку --0,5. в.

Як указувалося вище, амінокислотні заміни проводять, в основному, виходячи з відносної подібності «- замісників бокових ланцюгів амінокислот, наприклад, їхньої гідрофобності, гідрофільності, заряду, розміру, і т.і. Характерні заміни, що здійснюють з обліком різних вищевказаних характеристик, добре відомі фахівцям, і і) такими замінами є: аргінін і лізин; глутамат і аспаратат; серин і треонін; глутамін і аспаргін; і валін, ю лейцин і ізолейцин.

Зо Композиції кристалічних білків у якості інсектицидів і способи їхнього використання в.

Автори даного винаходу вважають, що композиції кристалічних білків, описані в даний заявці, є особливо цінними при їхньому використанні у якості інсектицидів для місцевої і/або системної обробки польових культур, трав, фруктів і овочів, і декоративних рослин. У кращому варіанті здійснення винаходу, біоінсектицидна « композиція містить масляну текучу суспензію бактеріальних клітин, що експресують новий кристалічний білок, описаний у даний заявці. Кращими клітинами є клітини ЕсС10327 В.Пигіпдіепзіз однак, у даному винаході може о) с бути використана будь-яка бактеріальна клітина, що експресує нові нуклеїнокислотні сегменти, описані в даний "» заявці, які продукують кристалічний білок, наприклад, така клітина, як В.(пигіпдіепзіз, В.тедайегійт, " В.зибН5, Е.соїї, або Рзейдотопаз зрр.

В іншому важливому варіанті даного винаходу, біоіїнсектицидна композиція включає гранули, що вододиспергуються. Ці гранули містять бактеріальні клітини, які експресують новий кристалічний білок, - описаний у даний заявці. Кращими бактеріальними клітинами є клітини ЕС10327 В (Пигіпдіепвзів, однак, у даному с винаході можуть бути також використані бактеріальні клітини, такі як, В.(пигіпдіепвзіз, В.тедаїйегійт,

В.зибійї5, Е.соїї, або Рзейдотопаз зрр., трансформовані ДНК-сегментом, описаним у даний заявці, і такі, що і експресують кристалічний білок. -оУу 70 У третьому, важливому варіанті даного винаходу, біоїнсектицидна композиція містить дуст, порошок, що змочується, гранули, або колоїдальний концентрат. Вищезгаданий порошок містить бактеріальні клітини, що "м експресують новий кристалічний білок, описаний у даний заявці. Кращими бактеріальними клітинами є клітини

ЕР10327 ВПигіпдіепзіз, однак, у даному винаході можуть бути також використані бактеріальні клітини, такі як, В.(Пигіпдіепзіз, В.тедаїегішт, В.зибБій5, Е.соїї, або Рзепдотопаз зрр., трансформовані ДНК-сегментом, го описаним у даний заявці, і такі, що експресують кристалічний білок. Такі сухі форми інсектицидних композицій

Ге) можуть бути виготовлені так, щоб вони відразу розчинялися після їхній змочування; або альтернативно, вони можуть бути виготовлені у виді композицій із регульованим вивільненням, із пролонгованим вивільненням, або з о яким-небудь іншим залежним від часу вивільненням.

У четвертому важливому варіанті здійснення даного винаходу, біоїнсектицидна композиція містить водяну 60 суспензію бактеріальних клітин, описаних вище, що експресують кристалічний білок. Такі водяні суспензії можуть бути виготовлені у виді маткового концентрованого розчину, що розводять безпосередньо перед застосуванням, або альтернативно, вони можуть бути виготовлені у виді готового розведеного розчину.

У цих способах, що передбачають використання бактеріальних клітин, клітини-хазяїни, що містять ген(и) кристалічного білка, можуть бути культивовані в будь-якому стандартному живильному середовищі, у якому бо /ДНК-конструкція має селективну перевагу для даного селективного середовища, так, щоб, в основному, усі, або абсолютно всі клітини містили ген В.(Пигіпдіепвів. Ці клітини можуть бути потім зібрані стандартним способом.

Альтернативно, ці клітини можуть бути оброблені до їхнього збору.

Якщо інсектицидні композиції містять інтактні клітини В.(пигіпдіепзіз, що експресують потрібний білок, то такі бактерії можуть бути отримані декількома шляхами. Вони можуть бути отримані у виді порошків, що

Змочуються, гранул або дуетів шляхом їхнього змішування з різними інертними матеріалами, такими як, неорганічні мінерали (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати, і т.і) або з рослинними матеріалами (здрібненими кукурудзяними початками, рисовою лушпайкою, горіховою шкаралупою, і т.і.). Ці композиції можуть включати адгезивні добавки, що стабілізують агенти, інші пестициди добавки, або поверхнево-активні речовини.

Рідкі композиції можуть бути виготовлені на водяній основі, або вони можуть бути безводними і використані у 7/0 виді піни, суспензій, концентратів, що емульгуються, або т.і. Інгредієнтами цих композицій можуть бути реологічні агенти, поверхнево-активні речовини, емульгатори, що диспергують агенти, або полімери.

Альтернативно, нові білки СтуЕТ33 і/або Стуєт34 можуть бути отримані за допомогою нативних або рекомбінантних систем, що експресують, іп міїго і виділені для наступного застосування на полях. Такий білок може бути присутнім у неочищених клітинних лізатах, суспензіях, колоїдах, і т.і., або альтернативно, перед /5 введенням в активний біоцидний препарат, він може бути виділений, очищений, забуферений, і/або підданий якійсь додатковій обробці. Аналогічним способом, у деяких випадках, може статися бажаним виділити кристали іабо спори з бактеріальних культур, що експресують кристалічний білок, і використовувати розчини, суспензії, колоїдні препарати, що містять ці кристали і/або спори, у якості активної біоінсектицидної композиції.

Незалежно від способу застосування, кількість активного компонента (компонентів) є інсектицидно-ефективною кількістю, що може варіюватися в залежності від таких чинників, як наприклад, конкретний вид твердокрилої комахи, проти якого спрямований інсектицид; конкретний вид оброблюваної рослини або культури; умови навколишнього середовища, а також спосіб, норма, і кількість інсектицидно активної композиції, що наноситься.

Описані інсектицидні композиції можуть бути виготовлені з використанням бактеріальних клітин, суспензій сч ов кристалів і/або спор, або виділених білкових компонентів у сполученні з агрономічно прийнятним носієм. Перед застосуванням, ці композиції можуть бути виготовлені у відповідному виді, наприклад, у ліофілізованому, і) осушеному шляхом виморожування, осушеному в десікаторі, або у водяному носії, у середовищі або у відповідному розріджувачі, такому як, фізіологічний розчин або інший буфер. Отримані композиції можуть бути виготовлені у виді дусту або гранульованого матеріалу, або суспензії в маслі (рослинному або мінеральному), М зо або у виді водяних емульсій або емульсій типу "вода/масло", або у виді порошку, що змочується, або в комбінації з будь-яким іншим матеріалом-носієм, що підходить для застосування в агрономічних цілях. --

Відповідні агрономічні носії можуть бути твердими або рідкими, і добре відомі фахівцям. Термін "агрономічно с прийнятний носій" включає всі ад'юванти, наприклад, інертні компоненти, що диспергують агенти, поверхнево-активні речовини, адгезивні агенти, зв'язувальні речовини, і т.і., що звичайно використовуються в о технології виготовлення інсектицидних препаратів, і який добре відомі фахівцям в області виготовлення ї- інсектицидних препаратів. Ці композиції можуть бути змішані з одним або декількома твердими або рідкими ад'ювантами, і отримані різними способами, наприклад, шляхом гомогенного змішування, змішування і/або здрібнювання інсектицидної композиції з відповідними ад'ювантами, із використанням стандартної техніки виготовлення інсектицидних препаратів. «

Інсектицидні композиції даного винаходу наносять на ділянки, що уражаються цільовими твердокрилими з с комахами, звичайно на листи потребуючих захисту рослин або культур, стандартними способами, переважно,

Й шляхом оприскування. Інтенсивність і тривалість обробки залежить від умов, характерних для конкретного виду и?» шкідника (шкідників), оброблюваної культури (культур) і конкретних умов навколишнього середовища.

Співвідношення між кількостями активного інгредієнта і носія звичайно залежить від хімічної природи, розчинності і стабільності інсектицидної композиції, а також від конкретно використовуваної композиції. -І Може також статися доцільним, а в деяких випадках і необхідним, наприклад, у випадку комах, що уражають корені або стебла, або для обробки овочів-делікатесів або декоративних рослин, використовувати іншу техніку о нанесення композиції, наприклад, запилення, розбризкування, пропитку, зрошення грунту, нанесення на насіння оо (протравка) , нанесення на сход, оприскування, розбризкування з літака (аерація), аегрозольне дощування, дрібнодисперсне оприскування, і т.і. Ці способи нанесення інсектицидів також добре відомі фахівцям. - Інсектицидна композиція даного винаходу може бути використана в способі даного винаходу як окремо, так і "М в сполученні з іншими сполуками, включаючи (але не обмежуючись ними) інші пестициди. Спосіб даного винаходу може бути також використаний у сполученні з обробкою іншими засобами, такими як, поверхнево-активні речовини, детергенти, полімери, або препарати з пролонгованим вивільненням. Інсектицидні 5 Композиції даного винаходу можуть бути виготовлені для системного або для місцевого застосування.

Концентрація інсектицидної композиції, що використовується для нанесення на ділянки, які оточують дану (Ф, рослину, для системного внесення, або для нанесення на листи рослини, може широко варіюватися в ка залежності від природи конкретної композиції, способу обробки, умов навколишнього середовища, і ступеню біологічної активності композиції. Звичайно, біоінсектицидна композиція присутня у препараті, що наноситься, во В концентрації, яка становить, принаймні, біля 195 мас, і може доходити аж до біля 9995 мас, включно. Сухі препарати можуть містити від біля 195 до біля 9995, або більш по масі композиції, а рідкі препарати можуть містити від біля 195 до біля 9995 мас. або більш активного інгредієнта. Препарати, що включають інтактні бактеріальні клітини, звичайно містять від біля 107 до біля 10'"клітин/мг.

Інсектицидна композиція може бути нанесена на конкретну рослину або на потрібну ділянку шляхом одного 65 або декількох обробок, якщо це необхідно; при цьому, при звичайній польовій обробці, норма внесення на один гектар складає порядку від біля 50г до біля 500г активного інгредієнта, або від біля 500г до біля 1000г, або від біля 1000г до біля 5000г або більш активного інгредієнта.

Малюнки складають частину опису даного винаходу і додатково ілюструють деякі аспекти даного винаходу.

Для кращого розуміння даного винаходу нижче наводиться більш докладний опис конкретних варіантів його здійснення з посиланнями на один або декілька з цих малюнків.

На Фіг.1А, Фіг.1вВ і Фіг1С показані нуклеотидні послідовності гена сгує7 33 (ЗЕ ІЮО Мо1) і гена сгує7 34 (ЗЕО ІО Мог), і виведені амінокислотні послідовності білка СТУЕТЗЗ (ЗЕО І МоЗ) і білка СтУЕТ34 (5ЕО ІЮ Мод).

На Фіг.2 показана рестрикційна карта плазміди рЕс246. Розташування й орієнтація гена сгуєТ33 (ЗЕО ІЮ Мої) і гена сгуєТ34 (5ЕО ІЮО Мо2) показані стрілками. Плазміда рЕС246б є функціональною в Е.соїї, оскільки вона 70 походить від рВКЗ22, і резистентна до ампіциліну (Атр"У. Для сайтів розщеплення ендонуклеазами, що рестрикують, були використані наступні скорочення: К-ЕсокКІ, В-ВатнНі. На Фіг.2 також показаний маркер розміру в одну тисячу пар основ (1Кб).

На Фіг.3, де також приведені первинні структури й у тому ж масштабі, що на Фіг.2, показана рестрикційна карта плазміди рЕС1246. Розташування й орієнтація гена сгуЕТЗЗ (ЗЕО ІЮО Мої) і гена сгуєТ34 (ЗЕО ІЮ Мог2) 75 зазначені стрілками. Плазміда рЕС1246 походить від плазміди рЕС246 (Фіг.2) і містить плазміду РММ101 Васіїїйв врр (який експресує ген резистентності до хлорамфеніколу |Сат З) і ген резістентності до тетрацикліну Те", вставлену в ВатНі-сайт плазміди рЕС246. Плазміда рЕФС1246 є функціональною як у Е(.соїії, так і в

В. игіпдіепзіз. На цьому малюнку були використані ті ж самі скорочення, що і на Фіг.2.

Опис ілюстративних варіантів здійснення винаходу

Деякі переваги даного винаходу

Штам ЕС 10327 ВуПигіпдіепвіз є природним штамом, що має інсектицидну активність проти твердокрилих комах, включаючи довгоносика бавовняного, личинки хрущака каштанового (ТгіроїШт савіапецйт), і личинки японського жука (Рорійа |іаропіса). Штам ЕсС2158 В.Пигіпдіепзіз містить гени кристалічного білка, токсичного для твердокрилих комах, що аналогічні або ідентичні генам кристалічного білка штаму Еб10327. Двагени нових СМ

Кристалічних токсинів, позначені сгуЕТЗЗ і сгуЕєТ34, були клоновані з ЕС2158. Ген СтуЕТЗ33 кодує кристалічний о білок СТУЕТЗ3 розміром 29кДа, а ген сгуЕєТ34 кодує кристалічний білок СтуєТ34 розміром 14кДа. Кристалічні білки СтуЕєТ33 і СтуЕєТ34 є токсичними для личинки хрущака каштанового, личинки довгоносика бавовняного, і личинки японського жука.

Визначення ї-

Нижче визначені значення наступних термінів і понять:

Експресія: комбінація внутрішньоклітинних процесів, включаючи транскрипцію і трансляцію, яким піддається -- кодуюча ДНК-молекула, така як, структурний ген, для продукування поліпептиду. со

Промотор: сайт розпізнавання на ДНК-послідовності або групи ДНК-послідовностей, що забезпечує регуляцію експресії структурного гена, і з яким специфічно зв'язується РНК-полімераза, ініціюючи синтез РНК й (транскрипцію) цього гена. ї-

Регенерація: процес вирощування рослини з рослинної клітини (наприклад, із протопласту або експлантату рослини).

Структурний ген: ген, що експресується з продукуванням поліпептиду . «

Трансформація: процес введення екзогенної ДНК-послідовності (наприклад, вектори, рекомбінантної

ДНК-молекули) у клітину або протопласт, у якій (або в якому) ця екзогенна ДНК вбудовується в хромосому цієї - с клітини і має здатність реплікуватися. а Трансформована клітина: клітина, ДНК якої модифікована шляхом введення в цю клітину молекули "» екзогенної ДНК.

Трансгенна клітина: будь-яка клітина, що походить, або регенерована, з трансформованої клітини, або походить з трансгенної клітини. Прикладами трансгенних клітин є калюси рослин, що походять від -| трансформованої рослинної клітини, а зокрема, від такої клітини, як клітина листа, кореню, стебла, наприклад, сл соматичні клітини або репродуктивні клітини, отримані від трансгенної рослини.

Трансгенна рослина: рослина або її потомство, що походить від трансформованої рослинної клітини або (95) протопласта, де ДНК цієї рослини містить уведену екзогенну ДНК-молекулу, що не присутня у нативній ши 20 нетрансгенній рослині того ж самого виду. Терміни "трансгенна рослина" і "трансформована рослина" іноді використовуються фахівцями як синоніми для визначення рослини, ДНК який містить екзогенну ДНК-молекулу. що Однак, зовсім очевидно, що більш правильним із наукового погляду визначенням терміна "трансгенна рослина" є "регенерована рослина або калюс, отримані з трансформованої рослинної клітини або протопласта", і нижче, при використанні цього терміна буде матися на увазі саме цей зміст.

Вектор: ДНК-молекула, здатна реплікуватися у клітині -хазяїні, і/або ДНК-молекула, до якої може бути правильно приєднаний інший ДНК-сегмент так, щоб це приєднання забезпечувало реплікацію приєднаного о сегмент. Типовим вектором є плазміда. іме) Зонди і праймери

В іншому аспекті даного винаходу, інформація про ДНК-послідовність, отримана завдяки даному винаходові, 60 дозволяє одержувати відносно короткі ДНК (або РНК)-послідовності, що володіють здатністю специфічно гібридизуватися з генними послідовностями обраних поліолігонуклеотидів, описаних у даний заявці. У цих аспектах, нуклеїнокислотні зонди відповідної довжини одержують виходячи з генної послідовності обраного кристалічного білка, наприклад, такої послідовності, як показана в ЗЕО ІЮ Мо1 або ЗЕО ІЮО Мо2. Здатність таких

ДНК ії нуклеїнокислотних зондів специфічно гібридизуватися з послідовністю гена, який кодує кристалічний 65 білок, робить їх особливо цінними для використання в різних цілях. Найбільш важливо, що ці зонди можуть бути використані в ряді аналізів для виявлення присутності комплементарних послідовностей у даному зразку.

У деяких варіантах даного винаходу, переважно використовувати олігонуклеотидні праймери. Послідовність таких праймерів конструюють із використанням полінуклеотиду даного винаходу для детекції, ампліфікації або мутації визначеного сегмента гена кристалічного білка В.(Пигіпдіепзіз із використанням Рек тм-технології. З використанням таких праймерів за допомогою РСКтм можуть бути також ампліфіковані сегменти генів родинних кристалічних білків, що походять від інших видів.

Для досягнення визначених переваг даного винаходу, кращими нуклеїнокислотними послідовностями для досліджень або аналізів, проведених методом гібридизації, є послідовності, які комплементарні, принаймні, ділянці, що складається з 14-30 нуклеотидів, або більш довгій ділянці послідовності, що кодує кристалічний 70 білок, такий як, послідовність, показана в ЗЕО ІЮО Мої або 5ЕО ІО Мо2. Розмір фрагмента, принаймні, у 14 нуклеотидів, дає гарантію того, що цей фрагмент буде мати довжину, достатню для утворення як стабільної, так і селективної дуплексної молекули. Молекули, що мають комплементарні послідовності більшої довжини, чим у 14 основ, звичайно є більш кращими, хоча б для підвищення стабільності і селективності гібриду, і тим самим для підвищення якості і ступеню специфічності отриманих гібридних молекул. В основному, переважно 75 сконструювати нуклеїнокислотні молекули, що мають комплементарні ділянки генів довжиною 14-20 нуклеотидів, або навіть більш довгі ділянки. Такі фрагменти можуть бути легко отримані, наприклад, шляхом прямого синтезу фрагмента хімічними методами, шляхом застосування техніки репродукування нуклеїнових кислот, такої як,

РСкК тм-технологія, (описана в патентах США Мо4683195 і 46832021, які вводяться в даний опис за допомогою посилання, або шляхом вирізання обраних ДНК-фрагментів із рекомбінантних плазмід, що містять відповідні вставки і відповідні рестрикційні сайти.

Вектори, що експресують

У даному винаході розглядається вектор, що експресує, який містить полінуклеотид даного винаходу. Таким чином, в одному з варіантів даного винаходу, вектором що експресує, є виділена й очищена ДНК-молекула, яка містить промотор, правильно приєднаний до кодуючої області, що кодує поліпептид даного винаходу, і яка Ге! правильно з'єднана з областю термінації транскрипції, у результаті чого зазначений промотор регулює о транскрипцію області, що кодує .

Використовуваний у даний заявці термін "правильно приєднаний" означає, що промотор з'єднаний з областю, що кодує , таким чином, що транскрипція цієї кодуючої області контролюється і регулюється цим промотором.

Способи правильного приєднання промотору до області, що кодує, добре відомі фахівцям. ї-

У кращому варіанті здійснення винаходу, рекомбінантна експресія ДНК, що кодують кристалічні білки даного винаходу, відбувається, переважно, у клітинах-хазяїнах Васіїйй5. Кращими клітинами-хазяїнами є -

В. Пигіпдіепзіз, В.тедаїйегішт, В.5иБіййїв і інші бацили, а найбільш кращими клітинами-хазяїнами є клітини со

В. Вигіпдіепзіз. Промотори, що функціонують у бактеріях, добре відомі фахівцям. Типовим і кращим промотором для кристалічних білків Васіййз є будь-який із відомих промоторів генів кристалічних білків, включаючи о промотори генів сгуЕєТ33 і сгуєТ34. Альтернативно, промотори мутованого або рекомбінантного гена, що кодує /-Їч« кристалічний білок, можуть бути штучно сконструйовані фахівцем і використані для стимуляції експресії нових генних сегментів, описаних у даний заявці.

В альтернативному варіанті здійснення винаходу, рекомбінантну експресію ДНК, що кодують кристалічний « білок даного винаходу, здійснюють із використанням трансформованої грам-негативної бактерії, такої як, Клітина-хазяїн бактерії Е.соїї або Рзейдотопаз зрр. Промотори, що функціонують із високим рівнем експреси - с цільових поліпептидів у Е.сої| і в інших грам-негативних клітинах-хазяїнах, також добре відомі фахівцям. ц У випадку, коли вектор даного винаходу, що експресує, використовується для трансформації рослини, "» вибирають такий промотор, який здатний регулювати експресію в рослинах. Промотори, що функціонують у рослинах також добре відомі фахівцям. Промоторами, що підходять для експресії поліпептиду в рослинах, є індуцибельні, вірусні, синтетичні, і конститутивні промотори, описані в літературі (Роз2КомузКкі еї аї., 1989; -і Оаеї! еї аї., 1985), і промотори з тимчасовою регуляцією, просторовою регуляцією, і з просторово-тимчасовою сл регуляцією ІСпаї еї а/!., 1989).

Промотор вибирають також за його здатністю направляти транскрипційну активність трансформованих (95) рослинних клітин або трансгенних рослин в область, що кодує. Структурні гени можуть знаходитися під шу 50 контролем ряду промоторів у тканинах рослин. Промотори можуть бути майже-конститутивними промоторами, такі як, як промотор 355 СамУМ, або ткане-специфічними або стадієспецифічними промоторами, що що функціонують у дводольних або однодольних рослинах.

Якщо промотором є майже-конститутивний промотор, такий як, промотор 355 Саму, то посилення експресії поліпептиду спостерігається в ряді тканин трансформованої рослини (наприклад, у кал юсі, листах, насіннях і в

Корені). Дія, що альтернативно трансформує, може бути спрямована на специфічні тканини рослин шляхом використання вектора рослини, що інтегрує, який містить тканеспецифічний промотор. о Прикладами тканеспецифічного промотору є промотор лектину, що є специфічним для тканини насінь. Білок іме) лектин у бобах сої кодується єдиним геном (Геї), що експресується тільки під час дозрівання, і становить від біля 2 до біля 595 від загальної мРНК насінь. Ген лектину і сім'яспецифічний промотор цілком охарактеризовані 60 і використовуються для напрямку специфічної експресії в трансгенні рослини тютюну (МоаКіп еї аї., 1983;

І Іпавігот еї аї., 19901).

Вектор, що експресує, який містить область, що кодує потрібний поліпептид, конструюють так, щоб ця область, яка кодує, знаходилася під контролем промотору лектину, і цей вектор вводять у рослини з використанням, наприклад, методу трансформації протопластів |Опіг ек аї.,, 1991). Експресія поліпептиду 65 специфічно направляється в насіння трансгенної рослини.

Трансгенна рослина даного винаходу, що продукується із рослинної клітини, трансформованої тканеспецифічним промотором, може бути схрещена з іншою трансгенною рослиною, вирощеною із рослинної клітини, трансформованої іншим тканеспецифічним промотором, з одержанням гібридної трансгенної рослини, що виявляє ефекти трансформації в більш, ніж одній специфічній тканині.

Прикладами тканеспецифічних промоторів є промотор сахарозо-синтетази 1 кукурудзи |Мапо еї аї., 1990), промотор алкоголь-дегідрогенази 1 кукурудзи |Моде! еї аїЇ., 1989), промотор світлозбираючого комплексу кукурудзи (Зітрзоп, 1986), промотор білка теплового шоку кукурудзи ІОдеї! еї аї., 1985), промотор невеликої субодиниці карбоксилази КиРВ гороху |Роцізеп еї а!., 1986; Сазптоге еї а!., 1983), промотор манопінсинтази плазміди Ті (І апогідде еї аї.,, 1989), промотор нопалінсинтази плазміди Ті (І апогідде еї аї., 1989), промотор /о халкон-їзомерази петунії |Мап Типеп еї а), промотор багатого гліцином білка 1 бобів |КеПег еї аї., 1989), промотор транскрипту 355 СамМм ГОдеїЇ еї аїІ., 1985) і промотор пататіну картоплі (МУепліег еї аї., 1989).

Кращими промоторами є промотор вірусу мозаїки кольорової капусти (СаммМ 355) і промотор невеликої субодиниці 5-Е9 карбоксилази КиИРВ.

Вибір вектора, що експресує, і, у кінцевому рахунку, промотору кодуючої області поліпептиду, правильно /5 приєднаного до цієї області, залежить безпосередньо від потрібних функціональних властивостей, наприклад, від розташування і часу експресії білка, і від клітини-хазяїна, що трансформується. Ці обмеження добре відомі фахівцям в області конструювання рекомбінантних молекул ДНК. Однак, вектором, що підходить для використання в даному винаході, є вектор, здатний регулювати експресію області поліпептиду, що кодує, до якої він правильно приєднаний.

Типові вектори, використовувані для експресії генів у вищих рослинах, добре відомі фахівцям, і такими векторами є вектори, що походять від плазміди Адгорасіегішт (Ітетасіепз (Ті), що індукує пухлини описаній

Кодег еї аї., 1987). Однак, відомі і деякі інтегруючі векторні системи рослин, що функціонують у рослинах, включаючи плазмідний вектор регуляції переносу рСаммсМ, описаний у літературі (Гготт еї аї., 1985).

Плазміда рСаммсмМ (що постачається фірмою РІагтасіа, Різсаїажлау, МУ) включає промотор 353 вірусу мозаїки сч ов Кольорової капусти Саму.

У кращому варіанті здійснення винаходу, вектор, використовуваний для експресії поліпептиду, включає і) селективний маркер, що є ефективним у рослинній клітині, переважно, селективний маркер резистентності до лікарського засобу. Кращим маркером селективності до лікарського засобу є ген, експресія якого приводить до резистентності до канаміцину, тобто, хімерний ген, що містить промотор нопалін-синтази, М. зо Неоміцин-фосфотрансферази І! Тп5 (прі), Ї 3-область нопалін-синтази, що нетранслюеться, (описану Кодегз еї а!., 1988). -

РНК-полімераза транскрибує ДНК-послідовність, яка кодує, за допомогою сайта поліаденілування. Звичайно, с

ДНК-послідовності, розташовані на декілька сотень пар основ нижче сайта поліаденілування, служать для термінації транскрипції. Ці ДНК-послідовності називаються областями термінації транскрипції. Ці області о необхідні для ефективного поліаденілування транскрибованої матричної РНК (мРНК). ї-

Способи одержання векторів, що експресують, добре відомі фахівцям. Вектори, що експресують (що трансформують), використовувані для трансформації рослин, і методи одержання цих векторів (описані в патентах США МоМо4971908, 4940835, 4769061 і 4757011), які вводяться в даний опис за допомогою посилання.

Ці вектори можуть бути модифіковані так, щоб вони включали кодуючу послідовність даного винаходу. «

Були розроблені різні методи для правильного з'єднання ДНК із векторами за допомогою комплементарних ств) с липких кінців або тупих кінців. Так, наприклад, комплементарні гомополімерні ділянки можуть бути додані до

ДНК-сегмента, що вставляється, і до векторного ДНК. Потім вектор і ДНК-сегмент з'єднують за допомогою ;» водневого зв'язку між гомополімерними "хвостами" з утворенням рекомбінантних ДНК-молекул.

Кодуючою областю, що кодує поліпептид, яка має здатність забезпечувати інсектицидну активність клітині, є переважно, ген, що кодує кристалічний білок СтуЕєТ33З і Стує 734 В (Пигіпдіепзіз. У кращих варіантах здійснення -І винаходу, такий поліпептид має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо3З або 5ЕО ІЮО Мо4, або функціональний еквівалент цих послідовностей. Відповідно до таких варіантів, кращою є також кодуюча область, що містить 1 ДНЕ-послідовність ЗЕО ІЮ Мо1 або ДНК-послідовність ЗЕО ІЮ Мо2. 2) Характеризація нових кристалічних білків

Даний винахід стосується нових поліпептидів, що складають весь або частину кристалічного білка СТУЕТЗЗ - або СтуєтТ34 В Пигіпдіепвів. "М У кращому варіанті даного винаходу описаний і заявлений виділений і очищений білок СтуЕєТ33. Білок

СтуєТЗ33 включає послідовність із 267 амінокислот, і має обчислену молекулярну масу 29,216Да. Білок СтуЕТЗ3З3 має обчислену ізоелектричну константу (р1), рівну 4/78. Амінокислотний склад білка СтуЕєТ33 наводиться в ов таблиці 3. о ю 5 вв

СІЧ 15 (5,6) Тиг за (Б)

171633 м1180вя 70 В іншому кращому варіанті даного винаходу описаний і заявлений виділений і очищений білок СтуЕ 734. Білок

СтуєТЗ34 включає послідовність із 126 амінокислот, і має обчислену молекулярну масу 14,182 Так. Білок СтТуУЕТ34 має обчислену ізоелектричну константу (р1), рівну 4,26. Амінокислотний склад білка СтуЕєТ34 наводиться в таблиці 4. - - хх пв 60111863 ю я 0161 й м0011121 05 бв0121 п яв001108 63 81114183 вю001105 п сч о 67777181 633 М 68 м зо

М со

Номенклатура нових білків

Автори даного винаходу довільно позначили нові білки СгуЕТЗ3З3 і СтуЕтТ34. Аналогічним способом, нові о

Зз5 Нуклеїнокислотні послідовності, що кодують ці поліпептиди, були довільно позначені сгуЕТЗЗ і сгуєгтТз4, ча відповідно. Формальне надання позначення гену і білку засновано на переглянутій номенклатурі ендотоксинів кристалічних білків (таблиця 1) відповідно до рішення Комітету по номенклатурі В.(Пигіпдіепзіз, створеного для систематичної класифікації кристалічних білків В.«(пигіпдіепзіз. Автори даного винаходу вважають, що ці довільно привласнені позначення будуть замінені офіційною номенклатурою, установленою для цих « послідовностей. - с Трансформовані клітини-хазяїни і трансгенні рослини й До інших аспектів даного опису відносяться способи і композиції для трансформації бактерії, дріжджової "» клітини, рослинної клітини, або цілої рослини одним або декількома векторами, що експресують, які містять генний сегмент, що кодує кристалічний білок. Ще одним варіантом даного винаходу є трансгенна бактерія, дріжджова клітина, рослинна клітина або рослина, отримана в результаті такого процесу трансформації, або -І потомство і насіння, що походять від такої трансгенної рослини.

Методи трансформації бактеріальних і дріжджових клітин добре відомі фахівцям. Звичайно, використовувані і-й способи трансформації аналогічні добре відомим способам, застосовуваним для трансформації інших бактерій со або дріжджів, таких, як Е.соїї або Засспаготусез сегемізіае. Методи трансформації ДНК рослинної клітини включають Адгорасіегійт-опосередковану трансформацію, трансформацію протопластів, перенос гена в пилок, - ін'єкцію в репродуктивні органи, ін'єкцію в незрілі ембріони і бомбардування частками. Кожний метод має свої "І особливі переваги і недоліки. Так, наприклад, один конкретний метод уведення генів у конкретний вид рослини необов'язково повинний бути найефективнішим для введення гена в інший вид рослини; однак, фахівцям добре відомо, які із цих методів можуть бути використані для даного конкретного виду рослини.

Існує багато методів уведення ДНК-сегментів, що трансформують, у клітини, але не усі вони є відповідними для доставки ДНК у рослинні клітини. Відповідним методом є, мабуть, практично будь-який метод, за допомогою іФ) якого ДНК може бути введена в клітину, наприклад, такий як, інфікування агробактерією Аадгорасіегішт, пряма ко доставка ДНК, наприклад, така як, ПЕГ-опосередкована трансформація протопластів (|(ОтігшПей еї аї., 1993), упровадження ДНК шляхом висушування/інгібування, електропорація, шляхом розмішування з волокнами з бо карбіду кремнію, шляхом прискорення ДНК-покритих часток, і т. У деяких варіантах здійснення винаходу, кращими методами є, наприклад, бомбардування мікрочастинками, і т.ї. Техніка введення ДНК у клітини добре відома фахівцям. Були описані чотири загальних методи доставки гена в клітини: (1) хімічні методи |(Сгапат 5 мап дег Ер, 1973; 7айоика! ек аіІ./ 19921; (2) фізичні методи, такі як, мікроінжекція (Сарессі, 1980), електропорація (Мопд 5 Меитапп, 1982; Рготт еї аіІ., 19855; патент США Мо5 384253) і "метод пострілу з 65 дробовика" Юоппвіоп 85: Тапо, 1994; Рупап еї аї., 19931); (3) методи з використанням вірусних векторів (Сіарр, 1993; Ї и еї аї., 1993; Едійів 5 Апдеггзоп, 1988а; 198801; і (4) методи на основі опосередкованих рецепторами механізмів (Сигіє! еї аї., 1991; 1992; М/адпег еї а/!., 19921.

Електропорація

Додавання коротких електричних імпульсів високої напруги до ряду клітин тварин і рослин приводить до утворення пір нанометрового розміру в плазматичній мембрані. ДНК уводиться прямо в цитоплазму клітини або через ці пори, або в результаті перерозподілу мембранних компонентів, що супроводжує закриття пір.

Електропорація може бути винятково ефективною, і може бути використана як для короткочасної експресії генів клонів, так і для одержання клітинних ліній, що несуть інтегровані копії потрібного гена. На відміну від трансфекції, проведеної з використанням фосфату кальцію, і за допомогою злиття протопластів, елекропорація /о часто дозволяє одержувати клітинні лінії що несуть одну, або, у більшості випадків, декілька інтегрованих копій чужорідної ДНК.

Метод уведення ДНК у клітину шляхом, електропорації добре відомий фахівцям. У цьому методі, деякі ферменти, що руйнують клітинну стінку, такі як, ферменти, що розкладають пектин, використовують для того, щоб зробити реципієнтні клітини-мішені більш сприйнятливими для трансформації шляхом електропорації, чим /5 Неопрацьовані клітини. Альтернативно, клітини-реципієнти роблять більш сприйнятливими до трансформації шляхом механічного ушкодження. Для здійснення трансформації шляхом електропорації можна використовувати або більш тендітні тканини, такі як, суспензіонна культура клітин, або ембріогенний калюс; або альтернативно, можна безпосередньо трансформувати незрілі ембріони, або інші організовані тканини. Для цього, стінку потрібної клітини піддають часткової деградації шляхом її обробки ферментами, що розкладають пектин, 2о (пектолазами), або механічному ушкодженню регульованим способом. Після цього такі ушкоджені клітини стають реципієнтами для переносу ДНК шляхом електропорації, що може бути здійснена на цій стадії, а потім трансформовані клітини ідентифікують шляхом відповідного добору або відповідно до протоколу скринінгу в залежності від природи нововведеної ДНК.

Бомбардування мікрочастинками сч

Більш кращим методом упровадження ДНкК-сегментів, що трансформують, у рослинні клітини є бомбардування цих клітин мікрочастинками. У цьому методі, частки можуть бути покриті нуклеїновими кислотами і) і введені в клітини за допомогою сили, що прискорює. Прикладами таких часток є частки, що складаються із вольфраму, золота, платини, і т.і.

Перевага методу бомбардування мікрочастинками, крім того, що він є ефективним способом здійснення М зо стабільної щодо відтворення трансформації однодольних рослин, полягає ще й у тому, що для нього не потрібно ні виділення протопластів (|Стгівіои еї а)., 1988), ні повідомлення клітинам сприйнятливості до -

Адгорасіегіит-інфекції. ілюстративним прикладом методу доставки ДНК у клітини кукурудзи шляхом прискорення (се часток є біобалістична система доставки часток (Віоїїзісз Рагіїсіе Юеїїмегу Зувіет), яка може бути використана для проштовхування часток, покритих ДНК, або клітин через екран, що загороджує, такий як, як о зв екран із нержавіючої сталі або екран Муїех, на поверхню фільтра, покритого клітинами кукурудзи, ї- культивованими в суспензії. Цей екран диспергує частки так, що вони не можуть бути доставлені в клітини-реципієнти у виді великих агрегатів. Очевидно, що це загородження, яке знаходиться між апаратом для "пострілу", і клітинами, що бомбардуються, сприяє зниженню розміру агрегатів часток, що бомбардують, і може забезпечувати більш високу частоту трансформації шляхом зменшення ушкодження, яке наноситься « Клітинам-реципієнтам занадто великими частками, що бомбардують. в с Для здійснення бомбардування, переважно, щоб клітини в суспензії були сконцентровані на фільтрах або на . твердому культуральному середовищі. Альтернативно, незрілі ембріони або інші клітини-мішені можуть бути и?» поміщені на тверде культуральне середовище. Клітини, що бомбардуються, поміщують на відповідній відстані нижче пластини, що загороджує, яка перешкоджає проходженню "макровибухівки". Якщо необхідно, то між пристроєм, який прискорює, і клітинами, що бомбардуються, може бути поміщений один або декілька екранів, які -І загороджують. За допомогою використання техніки, описаної вище, можна одержати до 1000 або більш фокусів клітин, що короткочасно експресують маркерний ген. Число клітин у фокусі, що експресує продукт екзогенного 1 гена через 48 годин після бомбардування, часто становить від 1 до 10, а в середньому, 1-3. 2) При трансформації шляхом бомбардування, для одержання максимального числа стабільних 5о трансформантів можна оптимізувати умови культивування перед бомбардуванням. У цій технології є дуже - важливими як фізичні, так і біологічні параметри бомбардування. Фізичними чинниками є параметри, що "М відносяться до маніпуляції ДНК/осадженню мікрочастинок, або параметри, що впливають на траєкторію польоту і швидкість або макро-, або мікрочастинок. Біологічними чинниками є всі стадії здійснення маніпуляцій із клітинами перед і безпосередньо після бомбардування, осмотичне коректування клітин-мішеней для ослаблення дв ушкодження клітин, зв'язаних із бомбардуванням, а також природа що трансформує ДНК, така як, лінеаризована

ДНК або інтактна суперспіральна плазміда. Очевидно, що маніпуляції, проведені перед бомбардуванням, мають

Ф) особливо важливе значення для успішної трансформації незрілих ембріонів. ка У зв'язку з цим, вважається, що для повної оптимізації умов може статися бажаним провести коректування різних параметрів бомбардування в маломасштабних дослідженнях. Може статися особливо кращим провести бо коректування таких фізичних параметрів, як розмір зазору, траєкторія польоту, товщина тканини, тиск гелію.

Можна також мінімізувати чинники, що редукують пошкодження, (ТКЕ), шляхом модифікації умов, які впливають на фізіологічний стан клітин-реципієнтів, і які можуть, тому, впливати на ефективність трансформації й інтеграції. Так, наприклад, осмотичний стан, гідратація тканини, і стан субкультури або клітинного циклу клітини-реципієнта можуть бути скоректовані для здійснення оптимальної трансформації. Здійснення інших бе Бутинних маніпуляцій будуть легко зрозумілі кожному фахівцю виходячи з опису даного винаходу.

Адгорасіегіт-опосередкований перенос

Адгорасіегічт-опосередкований перенос являє собою широко використовувану систему для впровадження генів у рослинні клітини, оскільки в цьому випадку, ДНК може бути введена в тканині цілої рослини, що дозволяє уникнути необхідності регенерувати інтактну рослину з протопласту. Використання векторів для

Адгорасіегійт-опосередкованого інтегрування з метою введення ДНК у рослинні клітини добре відомо фахівцям.

Див., наприклад, методи, (описані Егаіеу еї аї., 1985; Кодег еї аїЇ., 1987). Крім того, інтеграція ТіІ-ДНК є відносно точним способом, що приводить до декількох реаранжировок. Область прийнятної ДНК визначається прикордонними послідовностями, а інтрон звичайно вбудовується в геном рослини, (як описано бріеітапп еї аї., 1986; догдепзеп еї аї., (1987). 70 Існуючі в даний час вектори для трансформації агробактерією (Адгорасіегішт) здатні до реплікації в Е.сої також добре, як і в Адгорасіегіт, що дозволяє проводити стандартні маніпуляції, (описані Кіее еї аї., (19853). Крім того, недавні успіхи в одержанні векторів для Адгорасіегіпт-опосередкованого переносу генів, дозволили удосконалити методи вбудовування генів і рестрикційних сайтів у вектори, що полегшило конструювання векторів, здатних експресувати гени, що кодують різні поліпептиди. Ці описані вектори (Кодегв 7/5 2 аї., 1987) мають стандартні мультилінкерні області, фланковані промотором і сайтом поліаденілування для прямої експресії інсертованих генів, що кодують поліпептид, і можуть бути використані з метою даного винаходу. Крім того, для трансформації може бути використана бактерія Адгорасіегійт, що містить гени активованої або інактивованої Ті. Завдяки тому, що цей метод забезпечує легкий і точний перенос генів, він може бути обраний для трансформації тих рослинних штамів, де Адгобасіегіпт-опосередкована трансформація 2о є ефективною.

Адгорасіегіит-опосередкована трансформація дисків листів і інших тканин, таких як, сім'ядоля і гіпокотиль (підсім'ядольне коліно), мабуть, обмежена рослинами, що звичайно уражаються агробактерією.

Адгорасіегійт-опосередкована трансформація є найбільш ефективною для дводольних рослин. Деякі однодольні рослини є, мабуть, природними хазяїнами для Адгобрасіегішт, хоча були продуковані трансгенні сч об рослини спаржі з використанням векторів на основі Адгорасіегішт, як (описано Вугеріег еї аї. (1987)). Тому, комерційно важливі зернові культури, такі як, рис, кукурудза, і пшениця, в основному, повинні бути і) трансформовані з використанням альтернативних методів. Однак, як було згадано вище, із використанням

Адго-расієгіцт може бути також здійснена трансформація спаржі |див., наприклад, Вуїебіегега!., 19871.

Трансгенна рослина, продукована методами з використанням Адгобасіегішт, звичайно містить один ген на ї- зо одній хромосомі. Можна сказати, що такі трансгенні рослини є гетерозіготними за доданим геном. Однак, оскільки використання слова "гетерозіготний" звичайно припускає присутність комплементарного гена в томуж 87 самому локусі другої хромосоми хромосомної пари, а в рослині, що містить один вищевказаний додатковий ген, с такого гена немає, то, мабуть, що більш точним визначенням для такої рослини буде "незалежний сегрегант", оскільки доданий екзогенний ген незалежно сегрегує під час мітозу і мейозу. о

Більш кращою трансгенною рослиною є рослина, гомозіготна за доданим структурним геном, тобто, р. трансгенна рослина, що містить два доданих гени: за одним геном в тому самому локусі на кожній хромосомі хромосомної пари. Гомозіготна трансгенна рослина може бути отримана шляхом статевого розмноження (самозапилення) трансгенної рослини незалежного сегреганту, що містить один доданий ген, а потім пророщування деяких з продукованих насінь, і аналізу продукованих рослин на підвищену карбоксилазну « 70 активність у порівнянні з контрольною (нативною, нетрансгенною) або трансгенною рослиною незалежного в с сегреганту.

Й При цьому, слід зазначити, що дві різних трансгенних рослини можуть бути також схрещені для продукування а потомства, що містить два сегрегуючих незалежно доданих екзогенних гени. Шляхом самозапилення відповідного потомства можна продукувати рослини, що є гомозіготними за обома доданими екзогенними

Генами, що кодують потрібний поліпептид. Передбачається також поворотне схрещування (бекросінг) із -І батьківською рослиною й ауткросінг із нетрансгенною рослиною.

Інші методи трансформації о Трансформація протопластів рослин може бути здійснена з використанням методів, заснованих на осадженні 2) фосфатом кальцію, обробці поліетиленгліколем, електропорації, і комбінації цих обробок |див., наприклад,

РоїгуКив еї аїЇ.,, 1985; 10г72 еї аЇ., 1985; Ггогпт еї аї.,, 1986; Оспітіуа еї аї., 1986; Саїйв еї аї., 1987; - Магсоне еї! а/., 19881. "М Застосування цих систем до різних видів рослин залежить від здатності даного виду рослини до регенерації з протопластів. ілюстративні методи регенерації злакових культур із протопластів описані в літературі

І(Ечіїтига еї аї., 1985; Тогіууата еї аії., 1986; Хатада еї аї., 1986; Ар-ашіан еї а/!., 19861.

Для трансформації тих видів рослин, що не можуть бути успішно регенеровані з протопластів, можуть бути використані інші методи впровадження ДНК у інтактні клітини або тканини. Так, наприклад, регенерація злаків

Ф) із незрілих ембріонів або експлантатів може бути здійснена (як описано Мазвгі! (1988)). Крім цього, може бути ка використана техніка "вистрілювання часток" або високошвидкісна технологія з застосуванням мікрочастинок

ЇМазії, 1992). во З використанням останньої технології, ДНК упроваджують через клітинну стінку в цитоплазму шляхом її нанесення на поверхню дрібних металевих часток (як описане Кіевїп еї аї., (1987); КіІевїп еї аї., (1988); МесСаре еї а, (1988)). Ці металеві частки проникають через шари клітин, а тому дають можливість здійснювати трансформацію клітин усередині експлантатів тканин.

Способи продукування резистентних до комах трансгенних рослин 65 Шляхом трансформації відповідної клітини-хазяїна, такої як, рослинна клітина, рекомбінантним сегментом, що містить ген сгуЕєТЗЗ і/або сгуЕТ34, експресія кристалічного білка, що кодується, (тобто, бактеріального кристалічного білка або поліпептиду, що має інсектицидну активність проти твердокрилих комах) може приводити до продукування резистентних до комах рослин.

Так, наприклад, для трансформації суспензії ембріонних рослинних клітин, таких як, пшениця або кукурудза, методом бомбардування часток (Майдоск еї аїЇ., 1991; МавзіїЇ ей аїЇ.,, 1992)| для доставки нанесеної на мікрочастинки ДНК у клітини-реципієнти, може бути використаний експресуючий вектор, що містить кодуючу область кристалічного білка В.Пигіпдіепзіз, і відповідний селективний маркер. Потім трансгенні рослини регенерують із трансформованих ембріонних калюсів, що експресують інсектицидні білки.

Продукування трансгенних рослин може бути також здійснене з використанням інших методів трансформації 7/0 Клітини, відомих фахівцям, таких як, Адгорасіегійт-опосередкований перенос ДНК (Ргаіеу еї аї., 19831.

Альтернативно, ДНК може бути введена в рослини шляхом прямого переносу ДНК у пилок (пон еї аї., 1983;

Неззв, 1987; І цо еї аї., 1988) шляхом ін'єкції ДНК у репродуктивні органи рослини (Реп'яха еї аї., 1987), або шляхом прямої ін'єкції ДНК у клітини незрілих ембріонів із наступною повторною гідратацією осушених ембріонів

ІМешийпашзг еї аї., 1987; Вепрогоок еї аї!., 19861.

Регенерація, вирощування і культивування рослин із трансформантів-протопластів однієї рослини або з різних трансформованих експлантатів добре відомі фахівцям (УУеіззраспи 8: МУеіззрасі, 1988). Цей процес регенерації і вирощування звичайно включає стадії добору трансформованих клітин, культивування цих окремо обраних клітин із здійсненням проміжних стадій вирощування ембріонів і висаджування паростків що пустили корені. Трансгенні ембріони і насіння регенерують аналогічним способом. Отримані трансгенні укорінені пагони потім висаджують у відповідне середовище для вирощування рослин, таке як, фунт.

Вирощування або регенерація рослин, що містять чужорідний екзогенний ген, що кодує потрібний поліпептид, уведений за допомогою Адгобасіегіцт, із експлантатів листів можуть бути здійснені методами, добре відомими фахівцям і (описаними в літературі Ногесп еї аі., 1985). У цих методах, трансформанти культивують у присутності обраного агента й у середовищі, що індукує регенерацію пагонів у трансформовану лінію рослини, сч гв |Як описано Егаїеу еї а/., 1983).

Цей метод звичайно дозволяє продукувати пагони через 2-4 місяця, після чого ці пагони переносять у і) відповідне середовище, що стимулює утворення коренів і містить селективний агент й антибіотик для попередження росту бактерій. Потім, пагони, що утворюють корені в присутності селективного агента з утворенням паростків, пересаджують у грунт або інше середовище, що стимулює утворення коренів. Ці ї- зо процедури варіюються в залежності від конкретно використовуваної лінії рослини, і такі варіанти добре відомі фахівцям. --

Як обговорювалося вище, для одержання гомозіготних трансгенних рослин, переважно, щоб регенеровані со рослини були самопильними. У будь-якому випадку, пилок, отриманий від регенерованих рослин піддають перехресному схрещуванню з вирощеними з насінь рослинами, що представляють агрономічну цінність, о зв переважно інбредної лінії. | навпаки, пилок, отриманий від рослин цих цінних ліній, використовують для ї- запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину даного винаходу, що містить потрібний поліпептид, культивують із використанням методики, добре відомої фахівцям.

Таким чином, трансгенна рослина даного винаходу має підвищену кількість кодуючої області, (наприклад, гена сгу), яка кодує потрібний поліпептид Сту. Кращою трансгенною рослиною є незалежний сегрегант, і ця « рослина може передавати зазначений ген і його активність потомству. Більш кращою є трансгенна рослина, - с гомозіготна за цим геном, і така, що передає цей ген усьому своєму потомству після статевого розмноження.

Семена, отримані від трансгенної рослини, можуть бути вирощені в полі або в теплиці, і отримані зрілі ;» трансгенні рослини піддають самозапиленню, у результаті чого продукуються рослини чистої генеалогічної лінії.

Потомство цих рослин стає рослинами чистої генеалогічної лінії що оцінюють, наприклад, на підвищену інсектицидну активність проти твердокрилих комах, переважно, у польових умовах, у визначеному інтервалі -І умов навколишнього середовища. Автори даного винаходу вважають, що особливо перспективним є створення трансгенних рослин, які представляють комерційну цінність, включаючи різні трави, що утворюють дерн, о пшеницю, кукурудзу, рис, ячмінь, овес, ряд декоративних рослин і овочевих рослин, а також ряд горіхових і оо плодових дерев і рослин.

ПРИКЛАДИ

- Нижченаведені приклади ілюструють кращі варіанти здійснення винаходу. При цьому, слід зазначити, що

І методи, описані в цих прикладах, ілюструють методику, розроблену автором даного винаходу для практичного здійснення винаходу, а тому можна вважати, що вони являють собою кращі способи його здійснення. Однак, у зв'язку з описом даного винаходу, варто врахувати, що в конкретних варіантах його здійснення може бути

Зроблена безліч змін з одержанням такого ж або схожого результату, але, при цьому, зазначені зміни не повинні виходити за рамки суті й об'єму даного винаходу. іФ) ПРИКЛАД 1 ка Виділення ЕС10327 В. Пигіпдіепвів

Порошкоподібні зразки культури були отримані з різних джерел у регіонах США і за їхніми межами, звичайно бо З зерносховищ. Зразки культури обробляли і розподіляли по чашках з агаром для виділення окремих колоній типу Васіїїюв, (як описано в патенті США Мо52643641|.

Клонований ген сгу111А, відомий, головним чином, як ген сгуС штаму ЕС2158 ВуПигіпдіепзіз, описаний

Бопо-мап і ін. (1988), і клонований ген сгу1!1182, відомий, головним чином, як ген сгу111С штаму ЕбС4961

В.игіпдіепзіз, описаний ЮОопомап і ін. (1992), використовували у якості зондів у процедурах по гібридизації 65 колоній. Зонд гена сгу!11А складався із радіоактивно міченого 2,0 т.І.о.-Ніпа111-ХраІ-рестрикційного фрагмента ДНК, описаного Юопо-мап і ін. (1988). Зонд гена сгу11182 складався із радіоактивно міченого 2,4

Т.п.о-Звзрі-рестрикційного фрагмента ДНК, описаного Юопомап і ін. (1992). Процедури по гібридизації колоній здійснювали як (описані в Патенті США. Мо52643641.

Приблизно 43000 колоній типу Васіїйи5 від 54 порошкоподібних зразків культури, узятих із різних ділянок, Зондували радіоактивно міченими зондами сгу1171А і сгу11182. Один порошкоподібний зразок культури від

Сгеесе містив приблизно 100 природних колоній типу Васійй5, що гібридизувались із зондами сгу11182 і сгу111А. Аналіз деяких із цих природних колоній дикого типу вказував на те, що вони були ідентичні колоніям

В. игіпдіепвзіз, і одну колонію, позначену ЕС 10327, відбирали для подальшого дослідження. Штам ЕС10327

В. ВПигіпдіепзіз був депонований 14 грудня 1994 року під номером доступу МОМККІ В-21365 відповідно до 7/0 Будапештським договору про депонування культур.

Потім приблизно 84000 колоній типу Васіййз від 105 порошкоподібних зразків культур, узятих із різних ділянок, були також скриновані з використанням радіоактивно-мічених зондів сгу!1182 і сту ША, але ідентифікація яких-небудь інших штамів, що містять нові гени типу сгу111 виявилась безуспішною.

Було виявлено, що штам ЕбС10327 В. Пигіпдіепзіз мав інсектицидну дію проти личинок твердокрилих комах, особливо, хрущака каштанового, довгоносика бавовняного і японського жука. Штам ЕС10327 не мав інсектицидної дії проти Блошки длинновусої або колорадського жука яку можна виявити в умовах проведеного аналізу. Ген, названий "сгу111А-усіченим" геном, виділяли зі штаму ЕС10327, і визначали його нуклеотидну послідовність. Було виявлено, що сгу111А-усічений ген був ідентичний першим 2/3 гена сгуПА (описаного

Вопомагп і ін. (1988) як ген сгусС), але не містив кінцеву 1/3 гена сгу111А. Усічений ген сгу111А штаму Еб10327 2о продукував дуже невелику кількість (якщо взагалі продукував ) інсектицидного білка і, крім того, не був охарактеризований.

ПРИКЛАД 2

Оцінка флагелярного серотипу штаму Еб10327

Для характеризації штаму ЕС10327 були проведені деякі дослідження. Одне дослідження було проведено сч ов для характеризації його флагелярного серотипу. Отримані дані подані нижче: флагелярний серотип штаму Еб10327 визначали в лабораторії Ог.М-М.І есадеї в Інституті Пастера, Париж, і)

Франція. Серотип Еб10327 визначали методами, описаними Н.де Вагіас (1981), і було виявлено, що цим серотипом є Васіїйив5 (пигіпдіепзіз КигвФакі (НЗа, ЗБ, Зс). Було виявлено, що попередньо описані штами

В. игіпдіепзіз, що містять сгуПІ-родинні гени, являють собою серотип тоїтізопі (штам ЕС2158, що містить М зо 9ГУ111А); серотип (оі-могйі (штам Еб2838, що містить сгу!118:); Її штам Китатоїоепвзіз (штам Еб4961, що містить сгу11182) (Кираг еї аї., 1991). 510327 являє собою перший із виявлених штамів В.Пигіпдіепвіз --

Кигеіакі, що є токсичним для твердокрилих. с

ПРИКЛАД З

Оцінка кристалічних білків штаму ЕС10327 о

Штам ЕС10327, крім того, оцінювали шляхом характеризації кристалічних білків, що він продукує. Ці ї- дослідження здійснювали шляхом культивування штаму ЕС10327 у середовищі для споруляції ОБО (0,895 (мас/об.) живильний бульйон Оіїсо, 0,595 (мас/об.) глюкоза, 10ММ КоНРО,, 10ММ КНоРО,, 1мМ Са(Мо»з)», 0,5ММ

Мао), 1ОмкМ Мис», їОмМмкМ Резо,)|. Після цього, споруловану культуру, що містить спори і кристалічні білки, збирали шляхом центрифугування, і суспендували в деїіонізованій воді. Кристалічні білки солюбілізували « із суспензії спор і кристалів ЕФ10327 шляхом інкубування суспензії в буфері для солюбілізації (0,14М Тріс, з с рНа,О, 295 (мас./об6.) додецилсульфату натрію (ДСН), 590 (об./о6.) 2-меркаптоетанолу, 1090 (об./об.) гліцерину, і . 0,195 (мас./об.) бромфенолового синього) при 1002С протягом 5 хвилин. «» Солюбілізовані кристалічні білки були фракціоновані за розміром за допомогою електрофорезу на акріламідному гелі (ДСН-ПААГ-аналіз). Після фракціонування за розміром, білки візуалізували шляхом фарбування барвником кумаси. ДСН-ПААГ-аналіз показав, що зі спорулованої культури ЕбС10327 були -І солюбілізовані мажорний кристалічний білок розміром приблизно 29кДа, називаний далі білком СгуУЕТЗЗ, і мажорний кристалічний білок розміром приблизно 14кДа, називаний далі білком СтуЕ 134. іні Потім, 29кДа-білок СтуЕєтТ33 і 14кДа-білок СтуЕтї34 штаму ЕС10327 були охарактеризовані шляхом

Ге) визначення їх МН»-кінцевих амінокислотних послідовностей, як описано нижче. Споруловану культуру ЕС10327 5ор інкубували з буфером для солюбілізації і солюбілізовані кристалічні білки фракціонували за розміром на - акриламідному гелі шляхом аналізу, проведеного за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу. Білки переносили з "І гелю на нітроцелюлозний фільтр за допомогою стандартної техніки електроблотінгу. Білок СтуЕТ33 і білок

СтуєТ34, що переносили на фільтр методом електроблотінгу, візуалізували шляхом фарбування фільтра барвником кумаси. Частини фільтра, що містять білок СтуУЕТЗЗ і білок СтуєТ34, вирізували лезом бритви. У

Цьому способі, білки СтТуУЕТЗЗ і СтуЕТ34 були отримані в чистому виді як білки, перенесені методом блотінгу на окремі частини нітроцелюлозного фільтра. іФ) З метою визначення МН о-кінцевої амінокислотної послідовності кожного білка, очищені білки СтуєТтТЗ3 і ко СтуєЕТЗ34, що містяться на частинах нітроцелюлозного фільтра, піддавали стандартній автоматизованій процедурі деградації за Едманом. во Було встановлено, що МНо-кінцевою послідовністю білка СТУЕЄТ33 штаму ЕС10327 є послідовність: б5

123456789 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 20 сім епеАзпПесіпАзроіцІеАзпАзпТуємМмецкузвимМматуєїуАатнг (ЗБОЮ МО:5)

Було встановлено, що МНо-кінцевою послідовністю білка СТуУєЄТ34 штаму ЕС10327 є послідовність: 1234567891011 12 13 14 15 16 17 18 1920 2 ТргуаІТугАзпуаітигРНетипіеСуєРветТугАвпоШ уч ТгроїусіуРго (Аа) (Авп) (ЗЕО І МО:6)

Амінокислотні залишки, зазначені в дужках нижче послідовності білка СтуЕТ34, являють собою можливі альтернативні амінокислоти, що можуть бути присутні у білюу СтуЕТ34 у даному положенні. Присутність ЄМ альтернативних амінокислот можливо через неточність, що має місце при використанні автоматичної процедури о деградації за Едманом при визначенні амінокислотних послідовностей білка.

Комп'ютерні алгоритми (Когп 5: Оцееп, 1984) використовували для порівняння М-кінцевих послідовностей білків СтуЕТ33 і СтуЕєтТ34 з амінокислотними послідовностями всіх кристалічних білків В.(Пигіпдіепві5, що відомі авторам винаходу, включаючи послідовності всіх кристалічних білків В.(пигіпдієпвів, що були ї- опубліковані в науковій літературі, міжнародних патентних заявках, або виданих патентах. Перелік кристалічних «-- білків, послідовності яких опубліковані, а також джерела публікацій подані в таблиці 5. со й

В.аПигіпдіепвів, описані в літературі - « 2 с . г» - сл о з » тя о з 69 бо СтузАко У. Васіегіо!., 174:549-557 о і 20 см 5 о

Як зо -

Фо ю з щі « ю З с

І» - 1 с Було виявлено, що М-кінцева послідовність білка СТУЄТ34 штаму ЕС10327 не має гомології з якими відомими кристалічними білками В .(пПигіпдіепзіз, ідентифікованими в таблиці 5. - ПРИКЛАД 4 «М Характеризація кристалічного білка сгуєТ33 штаму ЕС2159

Було попередньо визначено, що б8кДа-сгуША-білок Еб2159 (називаний білком Стус у роботі Юопомагп і ін., 1988) є токсичним для колорадського жука, але цей білок не був ідентифікований у штамі, що має інсектицидну активність для лускокрилих або двокрилих комах.

Штам Еб2159 був отриманий із штаму ЕС2158 В.(пПигіпдіепзіз шляхом відпалення 150МДа-плазміди зі штаму (Ф) Еб2158 (як описане в роботі Юопомагп і ін., 1988). Штам ЕС2159 був ідентичний штаму ЕС2158, за винятком того,

ГІ що штам Еб2159 не містив 150МДа-плазміду, яка присутня у штамі ЕС2158. Був виділений один із двох кристалічних білків, продукованих штамом ЕС2159, а саме, б8кДа-СтуППА-білок, і був клонований і секвенований во Тен, що кодує цей білок. Ці результати були раніше описані авторами (Оопомап і ін., 1988). Крім того, вид мінорного білка, 29кДа-білка ЕС2159, не був охарактеризований.

У цьому прикладі описана характеризація зазначеного кристалічного 29кДа-білка СтууЕТ33 від ЕС2159

В игіпдіепвів.

Виділення кристалічних білків із Е62159 65 Кристалічні білки ЕС2159 були солюбілізовані шляхом суспендування спорулованої культури штаму ЕС2159, що містить спори і кристалічні білки, у буфері для солюбілізації білка при 80 9С протягом 3 хвилин.

Солюбілізовані кристалічні білюи фракціонували за розміром шляхом електрофорезу в ПААГ із ДСН, і білки в

ДСН-ПААГ-гелі візуалізували шляхом фарбування барвником кумаси. Гелеві зрізи, що містять 29кДа-білок, вирізували з ДСН-ПААГ-гелю лезом бритви, а білки виділяли з гелевих зрізів за допомогою стандартних процедур електроелюції. У результаті цих досліджень був отриманий очищений препарат білка СТУЕТЗ3З із штаму

Еб2159 В Пигіпдіепвів.

МН»-кінцеве секвенування 29кДа-білка

МН»-кінцеву амінокислотну послідовність очищеного білка СтуЕТЗ33 визначали автоматичним методом деградації за Едманом. Як було визначено, Амінокислотною послідовністю МН»-кінцевої частини 29кДа-білка є 70 послідовність: 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Меї Су Пе Пе Азп Че іп Авр Си Це Ап --

Тут Меї СГузоіцУуаї! Туг Су Аа о (5ЕО ІО МО:7) (ЗЕО 0 МО:8)

Пунктирна лінія (----) у положенні 12 указує на те, що амінокислотний залишок не може бути визначений для білка СТУЕТ3З3 штаму ЕС2159.

Результати

Порівняння послідовності білка СТУЕТЗ3З штаму ЕС10327 (5ЕО ІЮО Моб) із МН о-кінцевою послідовністю раніше «М неохарактеризованого 29кДа-білка (Оопомап і ін., 1988), що спостерігається в Еб2159 (ЗЕО ІЮО Мо7, ЗЕО ІЮ Мов), о дало підставу припустити, що МН»о-кінець 29кДа-білка ЕС2159 ідентичний білку СтуУЕТЗ3З3 штаму ЕС10327, за винятком початкового метіонінового (Меї) залишку, що присутній у білку СТУЕТЗ3З штаму ЕсС2159.

ПРИКЛАД 5

Виділення ДНК-фрагмента, що включає гени сгуЕТЗ3З і сгуЕє Т34, із штаму ЕС2158 -

Як описано вище, штам Еб2159 походив від штаму Еб2158. Отже, ЕС2158 містить ген, ідентичний гену білка «-

СтуЕТЗЗ, називаний далі геном сгуЕТЗЗ, як і штам ЕбС2159. Для клонування гена сгуЕєТ3З3 була використана "зворотна генетика". Був синтезований З3З-мірний олігонуклеотидний зонд (позначений МУОб8), що кодує (О амінокислоти 1-11 МН»е-кінця білка СтуЕТ33. Нижче подана послідовність УУОб68: ю в-АТОООЗААТТАТТААТАТТСААСАТОАЛААТТААТ-3 (ЗЕО ІЮ Ме 9) ї-

Послідовність МУО68 використовували у якості зонда для Саузерн-гібридизації, як описано нижче, із метою ідентифікації ДНК-фрагмента від штаму Еб2158, що містив ген сгуєТЗ33 для 29кДа-білка сгуЕєТ33. Повну ДНК « екстрагували з Еб2158 стандартним методом із використанням лізоциму/фенолу. Екстраговану ДНК гідролізували ферментами, що рестриктують ДНК, Ніпай| і Єсокі, і гідролізовану ДНК фракціонували за розміром у с шляхом електрофорезу в агарозному гелі. ДНК-фрагменти переносили методом блотінгу з гелю на й нітроцелюлозний фільтр із використанням описаних раніше методів (Зоційпег, 1975), і цей фільтр інкубували з "» олігонуклеотидом МУО68, що був радіоактивно позначений кіназою 14 і |Г-2РІ-АТР. Якогось унікального рестрикційного ДНК-фрагмента від ЕС2158, що специфічно гібридизувався 6 із зондом М/О68, виявлено не було.

Потім використовували різні методи ідентифікації ДНК-рестрикційного фрагмента, що містив ген сгуЕєТ33. Був -І синтезований 56-мірний олігонуклеотидний зонд (позначений М/073), що кодує амінокислоти 1-19 МН»е-кінця сл білка СтуЕТ33. Послідовність М/О7З являє собою: с 5-АТОСОААТТАТТААТАТТСААСАТОАААТТААТМММТАТАТОАААСААСТАТАТОС-3 що (БЕО ІЮ Ме 10)

Що. де ділянка в три "М" відповідають амінокислоті 12 послідовності М/Ю0О7З3, що представляє три інозинових нуклеотиди. Інозинові залишки були використані в цьому положенні для кодування відповідної невідомої амінокислоти в положенні 12 у МН»-кінцевої послідовності білка СТУЕТ33. Вважається, що інозин є нейтральним 29 нуклеотидом, і не один із промоторів не перешкоджає його зв'язуванню з ДНК-ланцюгами. МУ/О7З радіоактивно

ГФ) мітили кіназою Т4 і (Г-З2РІ-АТР, і використовували для зондування нітроцелюлозного фільтра, що містить т фракціоновані за розміром рестрикційні Ніпаїй ї ЕсокІ-фрагменти повної ДНК штаму ЕС2158. М/О7З3 специфічно гібридизувався з НіпапПІ-фрагментом приблизно в 7,9т.і.0., і з ЕсоКІ-фрагментом приблизно в 5,2т.і0о., ДНК штаму ЕС2158. 60 ПРИКЛАД 6

Клонування генів сгуЕєТЗ3З і сгуєТ34 із штаму ЕС2158

Для виділення 5,2Т.і.0.-ЕсоКІ-фрагмента, описаного в попередньому прикладі. Плазмідну бібліотеку штаму

Еб2158 конструювали шляхом легування відібраних за розміром рестрикційних Есокі-ДНК-фрагментів від штаму

Еб2158 у вектор рВКЗ322 Е.соїї. Ця процедура включала спочатку одержання повної ДНК із штаму ЕС2158 65 Шляхом лізису клітин, із наступною екстракцією ДНК фенолом, а потім проводили гідроліз повної ДНК ферментом, що рестрикує, ЕсокіІІ, електрофорез гідролізованої ДНК у агарозному гелі, вирізання гелевого зрізу, що містить Есокі-ДНК-фрагменти розміром у межах приблизно від 4,0 до 6б,От.і.о, і нарешті, електроелюцію відібраних за розміром рестрикційних ЕсокКі-фрагментів із зрізу агарозного гелю. Ці фрагменти змішували з плазмідним вектором рКВЗ22 Е.соїї, що також був гідролізований ферментом Есокі. Вектор рбК322 несе ген резистентності до ампіциліну (Атр") і цей вектор реплікувався в Е.соїї. Для легування вектора рВА322 із рестрикційними фрагментами штаму ЕС2158, до суміші відібраних за розміром рестрикційних фрагментів ДНК від штаму ЕС2158 і гідролізованого вектора рВК322 добавляли ДНК-лігазу Т4 і АТР.

Потім, плазмідну бібліотеку трансформували в клітини мікроорганізму-хазяїна Е.соїї, що не містить 70 потрібні гени сгуЕтТ33 і сгуєтТ34, як описано нижче. Після легування, ДНК-суміш інкубували з мікроорганізмом-хазяїном Атр 2-Е.соїї, НВ101, що був зроблений компетентним із використанням стандартних

СасСіІо-процедур. Штам НВІ101 Е.соїї був використаний у якості штаму-хазяїна, оскільки ці клітини легко трансформуються рекомбінантними плазмідами, і оскільки, природний штам НВ101 не містить генів кристалічних білків. В.«йпигіпдіепзів. Оскільки, рВЕ322 експресує Атр" то всі клітини-хазяїни, що одержали рекомбінантну 75 плазміду, є резистентними до ампіциліну (Атр"3. Після трансформації клітин-хазяїв рекомбінантними плазмідами, клітини розсіювали на агарове середовище, що містило Атр. Після інкубування протягом ночі при температурі 372С, на агарі, що містив Атр, було вирощено декілька тисяч колоній Е.соїї, після чого, ці колони блотували на нітроцелюлозні фільтри для наступного зондування.

Потім, радіоактивно мічений олігонуклеотид МУО0О7З використовували у якості ДНК-зонду в умовах, що дозволяли зондувати специфічне зв'язування трансформованих колоній-хазяїнів, що містять 5,2т.1.0.-ЕсоКі-фрагмент ДНК штаму ЕбС2158. Декілька колоній Е.соїї специфічно гібридизувались із зондом

М/073. Крім того, було проведене дослідження однієї колонії, що гібридизує МУО7З3, позначеної ЕС11460 Ес.соїї.

ЕС11460 Е.соїї містив рекомбінантну плазміду, позначену рЕС246, що складалася з рВК322 і введеного рестрикційного ЕсоКі-фрагмента ДНК від штаму ЕбС2158 розміром приблизно 5,2т.і0о. Рестрикційна карта с рЕС246 показана на Фіг.2. Штам ЕсС11460 Е.соді, що містить рЕс246, був депонований у Науково-дослідній Го) колекції сільськогосподарських культур, Північної регіональної науково-дослідної лабораторії (МКК) відповідно до Будапештському договору про депонування мікроорганізмів під номером доступу МКК. В-21364.

Нуклеотидну послідовність, що становить приблизно одну третину від клонованого 5,2Т.і.0.-ЕсоКі-фрагмента рЕС246, визначали з використанням стандартного дідезокси-методу Сенгера. Секвенування виявило, що - 5,2т.1.0о.--фрагмент містив дві суміжні відкриті рамки зчитування, що кодують білки, а, зокрема, два нових гени «-- кристалічного токсину. Вище розташована відкрита рамка зчитування, позначена сгуЕТ33, кодувала білок,

МНе»-кінцева послідовність якого відповідала МН о-кінцевм послідовності 29кДа-білка СтуУЕТЗ3З3 штамів ЕС2159 і і,

ЕС10327. Нижчерозташований ген, позначений сгуЕТ34, кодував білок, амінокислотна послідовність якого ю відповідала МН»о-кінцевій амінокислотній послідовності, визначеній для 14кДа-білка СтуєТ34 штаму Еб10327.

ДНК-послідовності цих нових генів значно відрізнялися від послідовностей відомих генів кристалічних токсинів -

В. игіпдіепзіз, перерахованих у таблиці 5.

ДНК-послідовність гена сгуєТЗ3З3 (ЗЕО ІЮ Мо) і виведена амінокислотна послідовність білка СтУЕТ3З (ЗЕО ІЮ

Мо3) , кодованого геном сгуЕТ33, показані на Фіг.1А, Фіг.18В і Фіг.1С. Частину гена, що кодує білок, сгуЕєТЗ3З3 « (ЗЕО ІЮО Мо) визначали по нуклеотидам, починаючи з положення 136 і кінчаючи положенням 936. Розмір білка

СТУЕТЗЗ (ЗЕО ІЮО МоЗ) як білка, виведеного з гена сгуєТ3З (5ЕО ІЮ Мо1), становив 29216 Так (267 амінокислот). З с Як показано на Фіг.1А, Фіг.1В і Фіг1С, цими послідовностями є ДНК-послідовність гена сгує734 (З5ЕО ІЮО Мо2) і "» виведена амінокислотна послідовність білка СтуЕєТ34 (ЗЕО ІЮ Мо4), кодована геном сгуЕТ34. Частину гена, що " кодує білок, сгуєЕТ34 (5ЕО ІЮ Мо2) визначали по нуклеотидам, починаючи з положення 969 і кінчаючи положенням 1346. Розмір білка СтуєТ34 (ЗЕО ІЮО Мо4) як білка, виведеного з гена сгуєТ34 (ЗЕО ІЮ Мо2), становив 14182кДа (126 амінокислот). - Для порівняння ДНК-послідовностей генів сгуЕТЗЗ і сгуЕєТ34 і виведених амінокислотних послідовностей с білків СтуУЕТЗ3 і Стуєт34 із послідовностями всіх генів В.(Пигіпдіепвіз сгу і кристалічних білків, відомих авторам винаходу (описаних у розділі 5.3 приклада 3, і перерахованих у таблиці 5), і з послідовностями всіх о генів і білків, наявних у базі даних геномних послідовностей (Майопа! Сепіег Тог Сзепоте Кезоигсез, Запіа Ее, -о 70 ММ) використовували комп'ютерні алгоритми |(Когп 5: Оцееп, 1984; АїЇвспц! еї аї., 1990). Якоїсь подібності відомих генів або білків із послідовністю гена сгуєТ34 (5ЕО ІЮО Мо2) і виведеною послідовністю білка СтуЕє 734

Що (ЗЕО ІО Мо4), відповідно, виявлено не було. Було встановлено, що послідовність гена сгуєТЗ3З (ЗЕО ІЮ Мо1) ідентична тільки послідовності одного відомого гена, і ідентичність цієї послідовності дуже низка.

Послідовність гена сгуЕєТ3З3 (801 нуклеотид) була на 3895 ідентична послідовності гена В .(пПигіпдіепвіз підвиду 29 Іотрзопі (1020 нуклеотидів), (описаного Вгом/п 8: МУпі(еіеу (1992))Ї. Було виявлено, що виведена послідовність (ФІ білка сгуєТ33 (ЗЕО ІЮ Мо3) має послідовність, ідентичну тільки одну відомому білку, і ця ідентичність дуже низка. Було виявлено, що повна амінокислотна послідовність білка СтТуЕТЗ33З (267 амінокислот) на 27905 ідентична о повній амінокислотній послідовності кристалічного білка В.(Пигіпдіепзіз підвиду (потрзопі (340 амінокислот), (описаного Вгом/п 8: УУпі(еіеу, 19921, який є токсичним для гусениць. бо ДНК-послідовність, розташовану безпосередньо вище гена сгуЕ7Т733 (ФіглЛА, 18 і 1С, нуклеотиди 1-135), досліджували на гомологію з усіма відомими вищерозташованими ДНК-послідовностями генів кристалічних білків, і з ДНК-послідовностями усіх відомих генів у базі даних геномних послідовностей (таблиця 5).

ДНК-послідовності, розташовані безпосередньо вище областей генів, що кодують, часто містять промотори для експресії відповідних генів. Якоїсь гомології в результаті цього дослідження виявлено не було. бо ПРИКЛАД 7

Експресія рекомбінантних генів сгуЕТЗ3З і сгуЕєТ34

Експеримент показав, що клоновані гени кристалічного токсину В.(игіпдіепзіз слабко експресувались у

Е.соїї, але в більшості випадків, добре експресувапись у рекомбінантних штамах В.(пигіпдіепзіз. рЕС246, яка містить гени сгуЕєТЗЗ і сгуЕєЕТЗ34 (Фіг.2), здатна реплікуватися в Е.соїї, але не реплікується в В.(Пигіпдіепвів.

Для одержання плазміди, що містить гени сгуЕєТт3З3 і сгуєт34, і здатної реплікуватися в В.(Пигіпдіепвів, плазміду Васіїнз зрр. вводили в рЕС246, як описано нижче.

Плазміду рІММ1О1 Васіййз врр. (Могіоп еї аіІ., 1985), здатну реплікуватися в В.(Пигіпдіепвів, і таку, що має резистентність до хлорамфеніколу (Сат!")3 і резистентністю до тетрацикліну (Те(У), гідролізували 70 ферментом Ватні, і цю гідролізовану плазміду змішували з плазмідою рЕС246б, що була гідролізована ферментом Ватні. Дві плазміди легували разом із лігазою ТАФАТР. Потім леговану суміш використовували для трансформації компетентних клітин ОН5БА Ес.соїї. Після інкубування із сумішшю плазмід, клітини висівали на чашки з агаром, що містять тетрациклін. Як і очікувалося, клітини, у які була включена плазміда, яка складається з рММ101, лігованої із рЕС246, були резістентними до тетрацикліну (Теї У). Після інкубування 75 приблизно протягом 20 годин, декілька резистентних до тетрацикліну (Тег М) колоній Е.соїї вирощували на чашках з агаром, що містять тетрациклін.

Плазмідну ДНК виділяли з однієї Теї А. колонії. Плазміду гідролізували ферментом Ватні і піддавали електрофорезу у агарозному гелі. Плазміда, позначена рЕсС1246, складалася з двох ВатНі-фрагментів ДНК розміром 5,8т.і.о і 9,бт.їо., що відповідають плазмідам рММ101 і рЕС246, відповідно. Рестрикційна карта рЕС1246 показана на Фіг.3.

Потім, штам ЕС10368 В.Пигіпдіепвіз трансформували шляхом електропорації плазмідою рЕС1246 із використанням описаних раніше методів |Масанзо 5 Мейизв, 1991). Нетрансформовані клітини штаму-хазяїна

ЕС10368 є негативними по кристалічному білку (Сгу) і сприйнятливими до хлорамфеніколу (Сат З). Після електропорації, суміш для трансформації розподіляли на агарове середовище, що містить Сат, і інкубували с 29 приблизно протягом 16 годин при температурі 30 С. рЕС-1246-трансформовані клітини повинні бути (У резистентними до хлорамфеніколу. Одна Сат"-колонія, позначена штамом ЕС11403 В.Пигіпдієпвів, містила плазміду, рестрикційна карта якої була ідентична рестрикційній карті плазміди рЕС1246.

Клітини штаму ЕС11403 культивували в середовищі для споруляції О50, що містить Сат, при температурі М 20 від 22 до 259С, доти, поки не відбувалася споруляція і клітинний лізис (4-5 днів). Оцінка за допомогою мікроскопа виявила, що спорильована культура штаму ЕС11403 містила спори і невеликі кристали «- веретеноподібної форми, що переміщаються вільно, і неправильної форми. Ці кристали були подібні з со кристалами, що спостерігаються у спорульованої культури штаму ЕС10327.

Спори, кристали і клітинний дебріс із спорульованої культури штаму ЕС11403 збирали шляхом іс) центрифугування. Осад після центрифугування один раз промивали деіїонізованою водою, і цей осад чн суспендували в деіонізованій воді.

Кристалічні білки в суспензії Еб11403 охарактеризовували шляхом солюбілізації й аналізу за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН. ДСН-ПААГ-аналіз виявив, що штам Еб11403 продукував два мажорних білки 29кДа і 14кДа. Як і очікувалося, 29кДа-білок і 14кДа-білок штаму ЕС11403 були ідентичні за розміром з « 20 29кДа-білком СтуЕєТ33 і 14кДа-білком СтуЕТ34, відповідно, продукованими штамом ЕС10327. Штам ЕС11403 був з с депонований 14 грудня 1994 року під номером доступу МОМАККІ У-21367 у Науково-дослідній колекції сільськогосподарських культур Північної регіональної науково-дослідної лабораторії (МКК!) відповідно до :з» Будапештському договору про депонування мікроорганізмів.

Геном, що кодує 29кДа-білок СТУЕєЕТ33 штаму ЕС11403, є ген сгуЕєТ33, а геном, що кодує 14кДа-білок СтТуУЕТ34 штаму ЕС11403, є ген сгуєТ34. Штам ЕС11403 і штам ЕС10327 В.Пигіпдіепзіз продукували приблизно рівні -І кількості білка СтуЕтТ33. На відміну від цього, штам Ес2158 В.Пигіпдіепзіз продукувал приблизно 1/10 кількості білка СтуЕТ33, як і штам ЕС10327 або штам ЕС11403. о ПРИКЛАД 8 с Штам ЕС11402 В (пПигіпдіепвів, що містить сгу!ПІВЗ, сгуєТЗЗ і сгуєТ34

Раніше було виявлено, що кристалічний білок В (Пигіпдіепзіз, позначений сгуППІВЗ, є токсичним для личинок - японського жука |Патент США Мо5264364|. У нижченаведеному прикладі було виявлено, що білки СтуєТЗ3 і «М СтуєЕТЗ4 є токсичними для личинок довгоносика бавовняного і личинок японського жука. Білок Стузвз3 не має загальної амінокислотної послідовності, гомологічної або з білююм СтуЕєтТ33, або з білком СтуЕТ34. У спробі продукування штаму, що має підвищену токсичність для японського жука, ген СтуЗВЗ, ген сгуЕє"7ТЗ3З і сгуєТ34 об'єднували в один штам, як описано нижче.

Штам ЕС10364 є штамом В (Ппигіпдіепзіз дикого типу, що містить ген сгуПППВЗ3. Штам ЕС10364 продукує білок (Ф) Стузвз3, токсичний для личинок японського жука. рЕС1246 (Фіг.3), що містить гени сгуЕТ3З3 і сгуєтз4,

ГІ використовували для трансформації ЕС10364 шляхом електропорації з одержанням штаму ЕС11402. Штам

ЕбС11402 ідентичний штаму ЕбС10364, за винятком того, що Еб11402 також містить плазміду рРЕС1246 (несучу бор Клоновані гени сгуЕєТЗ3З і сгуЕє ТЗ4), і отже, має резистентність до Сат (Сат Кк

Штам Еб11402 вирощували на середовищі для споруляції ОЗОжСат при кімнатній температурі доти, поки не відбувалася споруляція і клітинний лізис (4-5 днів). Кристалічні білки солюбілізували зі спорульованої культури ЕС114052, і ці Солюбілізовані білки фракціонували за розміром шляхом електрофорезу в ПААГ із ДСН.

Цей аналіз виявив, що штам ЕС11402 продукував три кристалічних білка: кристалічний 7ОкДа-білок, що 65 Відповідає білку СтуІІВЗ, кристалічний 29кДа-білок, що відповідає білку СтуЕєТ33, і кристалічний 14кДа-білок, що відповідає білку СтуЕТ34. Аналіз, проведений за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН показав, що штам

ЕС10364, який був вирощений тим же способом, що і ЕС11402, але без хлорамфеніколу, продукував 7ОкДа-білок СтуїПВЗ у кількостях, аналогічних кількостям, що продукуються штамом Еб11402. Штам ЕС11402 був депонований 14 грудня 1994 Науково-дослідною колекцією сільськогосподарських культур Північною регіональною науково-дослідною лабораторією (МКК) під номером доступу МОМККІ. У-21366.

ПРИКЛАД 9

Токсичність СТУЕТЗЗ і СТУЕТЗ4 для личинок японського жука

Токсичність для личинок японського жука (Рорійа |іаропіса) визначали для трьох штамів В.ППигіпдіепвів: (1) для штаму ЕС10327, що продукує кристалічні білки СтУЕТЗЗ і СтуЕТ34; (2) штаму Ес10364, що продукує 70 кристалічний білок СтуЗВ 3; і (3) штаму ЕС11402, що продукує кристалічні білки СТУЕТЗ3З, СтуЕєТ34 і Стузв3.

Штами ЕС10327, ЕС10364 і ЕС11402 вирощували в середовищі для споруляції ОБО при кімнатній температурі (20-232С) до тих пір, поки не відбувалася споруляція і клітинний лізис (4-5 днів). Для штаму

ЕСбС11402, середовище містило бБмкг/мл Сат. Бульйон для ферментації концентрували шляхом центрифугування, і осади, що містять спори, кристалічні білки, і клітинний дебріс, або ліофілізували з 75 одержанням порошків, або ресуспендували в деіонізованій воді з одержанням водяних суспензій. Кількості кристалічних білків СтуЕє733 і СтуЗзВвЗ3 у ліофілізованих порошках і в суспензіях кількісно оцінювали за допомогою електрофорезу в ПААГ із ДСН, і простежували за допомогою денситометра кумаси-забарвлених

ДСН-ПААГ-гелей з очищеним і кількісно оціненим білком СтузА, використовуваним у якості стандарту. Кількість білка СтуєТ34 оцінювали шляхом візуальної оцінки Кумаси-забарвлених ДСН-ПААГ-гелей. Ця оцінка вказувала на те, що кількість білка СтуєТ34 приблизно еквівалентна кількості білка СтуєЄТ34 у штамах Ес10327 | Ев11402.

Процедуру біоаналізу для личинки японського жука здійснювали наступним способом. Ліофілізовані порошки кожного штаму, що тестується, суспендували в розріджувачі (водяному розчині, що містить 0,00595 Тритону

Х-1008), і вводили в 10Омл гарячого (50-60 22) рідкого штучного корму, отриманого на основі попередньо розробленого раціону (Іада, 1986). Ці суміші залишали для ствердження в чашках Петрі, а потім диски Га отвердженого корму діаметром 19мм поміщали в пластикові чашки ємністю 5/8 унцій. У кожну чашку вводили одну личинку японського жука, після чого чашки закривали кришкою і витримували протягом чотирнадцятьох о днів при 252С, а потім оцінювали відсоток загибелі личинок. Це дослідження проводили в двох дублікатах із шістнадцятьох личинок кожний.

Результати цього тесту на токсичність подані нижче в таблиці б, де інсектицидна активність виражена у їх» відсотках загиблих личинок; при цьому, відсоток загибелі личинок був скоректований на загибель контрольних личинок, а в контрольний корм був уведений тільки розріджувач. -- со ї

СтТуЕТЗ4 і СтуЗзВЗ для личинок японського жука ї-

М ЗЕ МИС ПО ч 4 З с 1 вує сююмя| 00 . ємо ю и? -І Результати, подані в таблиці 6, показали, що білки СтТУЕТЗ3З і СТУЕТ34 мають значну токсичність для личинки японського жука. ЕС10327, що продукує білки СтуЕТЗ3З і СтуЕТ34, є також токсичним для личинки японського о жука. Якщо в ЕС 10327 додати гени сгуЕТЗ3 і сгуЕєТ34, то це приведе до одержання ЕС11402, що, крім білка оо СтуЗзвз3, продукує білки СтуУЕТЗ33 і СтуЕТЗ34 і, як спостерігалося, має підвищену токсичність для личинки японського жука. - ПРИКЛАД 10

І Токсичність СТУЕТЗЗ і СТУЕТЗ4 для личинки хрущака каштанового

Токсичність для личинок хрущака каштанового (ТгіроїШт савіапешт) визначали для трьох штамів

В. Вигіпдіепвів: (1) для штаму ЕС10327, що продукує кристалічні білки СтуєТ3З і Стує 34; (2) штаму ЕС1О0О364, в що продукує кристалічний білок СтуЗВ3; і (3) штаму Еб11402, що продукує кристалічні білки СТУЕТЗ33, СтуЕє Т34 і

СтузЗв3. Чотири штами вирощували в середовищі для споруляції ОО при кімнатній температурі (20-232С) доти,

Ф) поки не відбувалася споруляція і клітинний лізис, після чого одержували водяні суспензії або ліофілізовані ко порошки, як описано в прикладі 9. Токсичність кожного штаму проти личинок хрущака каштанового визначали шляхом нанесення відомої кількості кожного препарату штаму на штучний корм і цей корм згодовували личинкам бо хрущака каштанового.

Результати цього тесту на токсичність подані нижче в таблиці 7, де інсектицидна активність виражена у відсотках загиблих личинок; при цьому, відсоток загибелі личинок був скоректований на загибель контрольних личинок, а в контрольний корм був уведений тільки розріджувач. 65 Таблиця 7

СтТуЕТЗ4 і СтуЗзВЗ для личинок хрущака каштанового й І в НИ ПО 0 ув осюмяу 0 о тує юю 100010 ємо 1 ю 1700 15 , , , , ,

Результати, подані в таблиці 7, показали, що білки СтТУЕТЗ3З і СТУЕТ34 мають значну токсичність для личинки хрущака каштанового. Природний штам Ес 10327, що продукує білки СтуЕТЗ3З і СтуЕТЗ34, є у високому ступені токсичним для личинок хрущака каштанового. ЕС10364, що продукує білок СтуЗзВЗ3, є токсичним для личинок хрущака каштанового. ЕС11403, що продукує білок СтуЕТ33 і СтуЕТ34, є токсичним для личинок хрущака 20 каштанового. Якщо в ЕС10327 додати гени сгуЕТЗ3З і сгуЕТЗ34, то це приведе до одержання штаму ЕС11402, що, продукує білки СТУЕТЗ33, Стує Т34 і СтуЗВ3З, і, як спостерігалося, має підвищену токсичність для личинок хрущака каштанового.

ПРИКЛАД 11

Токсичність СТУЕТЗЗ і СТУЕТЗ34 для личинок довгоносика бавовняного сч 25 Штам Ес11403, що продукує білки СтуЕТЗ3З і СтуЕТ34, був вирощений як описано вище. Кристали білка промивали, солюбілізували в карбонатному буфері, діалізували і фільтрували через 0,2од. акродиску. Потім (о) визначали токсичність солюбілізованих білків шляхом додавання відомої кількості білків до штучного корму, і цей кормом згодовували личинкам довгоносика бавовняного. Результати тесту на токсичність подана нижче, де інсектицидна активність виражена або як (1) відсоток загибелі личинок, де цей відсоток загибелі личинок був чн зо скоректований на розмір загибелі контрольних личинок із використанням контрольного буфера; або як (2) відсоток загибелі личинок відсоток личинок, що не розвивалися після досягнення ними першої вікової стадії; ьо де цей відсоток загибелі був скоректований на розмір загибелі контрольних личинок із використанням со контрольного буфера.

Результати, подані в таблиці 8 і в таблиці 9, показали, що білки СТУЕТ3З3 і СгуЕТ34 мають значний рівень М) 35 токсичності для личинок довгоносика бавовняного. чн личинок довгоносика бавовняного « з З с з 511770 -І мо іо (95) з » (2) Відсоток загибелі ц о з бо

Посилання

Нижченаведені посилання, що можуть служити, деякою мірою, прикладом способів і інших процедур, б5 докладно описаних у даний заявці, вводяться в даний опис за допомогою посилання:

Патент США Мо4196265, виданий 1 квіт. 1980.

Патент США Мо4554101, виданий 19 листоп. 1985.

Патент США Мо4683195, виданий 28 липня 1987.

Патент США Мо4683202, виданий 28 липня 1987.

Патент США Мо4757011, виданий 12 липня 1988.

Патент США Мо4766203, виданий 23 серп. 1988.

Патент США Мо4769061, виданий 6 верес. 1988.

Патент США Мо4771131, виданий 13 верес. 1988.

Патент США Мо4797279, виданий 10 січн. 1989. 70 Патент США Мо4910016, виданий 20 березня 1990.

Патент США Мо4940835, виданий 23 лют. 1990.

Патент США Мо4965188, виданий 23 жовт. 1990.

Патент США Мо4966765, виданий ЗО жовт. 1990.

Патент США Мо4971908, виданий 20 листоп. 1990.

Патент США Мо4996155, виданий 26 лют. 1991.

Патент США Мо4999192, виданий 12 березня 1991.

Патент США Мо5006336, виданий 9 квіт. 1991.

Патент США Мо5024837, виданий 18 червня 1991.

Патент США Мо5055293, виданий 8 жовт. 1991.

Патент США Мо5055294, виданий 8 жовт. 1991.

Патент США Мо5128130, виданий 15 жовт. 1991.

Патент США Мо5176995, виданий 15 жовт. 1991.

Патент США Мо5187091, виданий 15 жовт. 1991.

Патент США Мо5264364, виданий 23 листоп. 1993. с

Патент США Мо5286486, виданий 15 лют. 1994.

Патент США Мо5384253, виданий 24 січн. 1995. о

Патент США Мо5441884, виданий 15 серп. 1995.

Євр. патент Мо0308199, опублікований 22 березня 1989.

Євр. патент Мо0318143, опублікований 31 травня 1989. М зо Євр. патент Мо0324254, опублікований 19 липня 1989.

Євр. патент Мо0382990, опублікований 22 серп. 1990. -

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 90/13651, опубл. 15 листопад. 1990. с

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 91/07481, опубл. 30 травня 1991.

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 91/10725, опубл. 25 липня 1991. о

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 91/16433, опубл. 31 жовт. 1991. ї-

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 93/03154, опубл. 18 лют. 1993.

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 94/13785, опубл. 23 червня 1994.

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 94/16079, опубл. 21 липня 1994.

Між. публ. пат. заяв. МОУМУО 95/02693, опубл. 26 січн. 1995. «

Між. публ. пат. заяв. МОУУО 95/06730, опубл. 9 березня 1995. з с Між. публ. пат. заяв. МОУМУО 95/30752, опубл. 16 лист. 1995.

Й Між. публ. пат. заяв. МОМУО 95/30753, опубл. 16 лист. 1995. и? Арашпіан ега/!., Віобгесппоіоду, 4:1087, 1986.

Аае!танп еї а!., ОМА, 2/3:183-193. 1983.

Айеп апа Споцп, "агде ипіатейПаг ІПрозотев м/ййп ом иріаКе іпіо ї(Шйе гейсцоепаоїпеїйа! вувіет, ЕРЕЕ5 -І І ей., 223:42-46, 1987.

Аїївспциі еї а!., "Вавіс Іоса! аіїдптенпі зеагсй ісо1," У. Мої. Віоі.. 215:403-410, 1990. о Агуідзоп еї а!., Мої. Віої!., 3:1533-1534, 1989. 2) Вашт еї а!., Аррі. Епмігоп. Місгобіої!., 56:3420-3428, 1990.

Вепьгоок еї аї., Іп: Ргосеедіпоз Віо Ехро 1986, Вибегмогій, Зіопепат, МА, рр.27-54, 1986. - Вегппага, РЕМ5 Місгобіоі. І ейф., 33:261-265, 1986. "М Воїїмаг еї аї., бепе, 2:95, 1977.

Вгом/п апа Мупі(еїеу, у. Васіегіо!., 174:549-557,1992.

Вугебіег еї аі!., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА, 84:5345,1987.

Саїїв еї аІ., Сепез апа ОемеіІортепі, 1:1183,1987.

СатрреїЇ, Іп: Мопосіопа! Апіроду Тесппоіоду, Іарогаїогу Тесппідоез іп Віоспетівігу апа Моїіесшаг

Ф) Віоіоду, МоіІ.13, Вигаеп апа Моп Кпіррепрего, Еадв. рр.75-83, ЕІвемісег, Атвіегдат, 1984. ка Саресспі, "Нідпй ейісіепсу ігапвіогтайоп бу айїгесі птісгоіїпіесйоп ої ОМА іпіо сийигей таттаїап сеїЇв,"

СеїІ, 22(2):479-488, 1980. во Савзптоге еї аі., Сеп. Епо. ої Ріапів, Ріепит Ргезз, Мем/ ХогКк, 29-38, 1983.

Спатрьегз еї аї., 9. Васіегіо!., 173:3966-3976, 1991.

Спапо еї а!., Майшге. 375:615, 1978.

Спа еї аї!., Зсіепсе, 244:174-181, 1989,

СІарр, "Ботаййс депе (Пегару іпіо Пептаїйороієїіс сеїЇв. Сигпгепі віай5 апа їшшге ітріісайопе, Сі. 65 Регіпаїйа!., 20(1): 155-168, 1993.

Соимгеиг еї аі., "Мапосарзціев, а пем/ Іузозотоїгоріс сагіег," РЕВ5І ей., 84:323-326, 1977.

Соимгеицг, "РоїуаІКуІеуапоасгуїа(ез аз соїПоіда! агид сагієге," Ст Кему. Тпег. Огид Саїтіег Зуві.,5:1-20, 1988.

Стісктоге еї аї., Абзіг. 281п Аппи. Мееї. 5ос. Іпмегі. Раїйої!., СогпеїЇ Опімегейу, Каса, МУ, 1995.

Стів еї а!., Ріапі Рпузіої, 87:671-674, 1988.

Сигіеї, Адагма!ї, МУадпег, Соцеп, "Адепомігиз еппапсетепі ої ігапаТетп-роїуузіпе-тедіабедй депе деїїмегу,"

Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА. 88(19):8850-8854, 1991.

Сигівї, МУадпег, СойцЦеп, ВітвіієЇ Адагпгмаї!ї, їі, ІоеспеіІ, Ни, "Нідп-ейісіепсу депе (ігапеїег тедіабєй Бу адепомігив соиріеа ю ОМА-роїуїузіпе сотріехев," Нит. Сеп. ТНег., 3(2): 147-154, 1992.

Ое Вагіас, Іп: МісгобіаІ Сопіго!Ї ої Ревів апа Ріапі Оізеазез, Н. О. Вигдев5, ед., Асадетіс Ргезв, І опдоп, 70 36-43, 1981.

Бопомап еї аї., Аррі. Епмігоп. Місговіо. 58:3921-3927, 1992.

Бопомап еї аї., Мої. Сеп. Сепеї., 214:365-372, 1988.

Едійїв апа Апаегеоп, "Кеїйго мігаї месіоге бог о іпігодисіоп ої о депез іп татртаїйап сеїв;"

Віогїесппідцевз. 6(7):608-614, 1988.

Еодійів, Капіой, Копп, Кагзоп, Моеп, Іоїйгор, Віаезе, Ападегзоп, "КейїгомігаІ-тедіаФеай депе (гапеїтег іпо

Петороїеїйіс сеїІв," Ама. Ехр. Мед. Віої!., 241:19-27, 1988.

Еіспепіацб. 9. Васіегіо!., 138(2):559-566, 1979. Ріегз еї аї., Майшге, 273:113,1978. Егаіеєу еї аї..

Віоїесппоіоду, 3:629, 1985. Егаіеу еї аїЇ. Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 804803, 1983. Еготт, Тауїог,

УМаїрої, "Ехргезвіоп ої депевз ігапвіетей іпіо топосої апа дісої ріапі сеїв Бу еїіесігорогайоп, Ргос. Май.

Асай. 5сі. ОБА, 82(17):5824-5828, 1985.

Ецітига еї а)ї.. Ріапі Тіззце Сииге І еЦегв, 2:74, 1985.

Еупап, УУерзіег, ЕшШег, Наупез, Запіого, Коріпзоп, "ОМА массіпев: ргойесіїме іттипігайопе Бу рагепіегаї, тисовзаї, апа депе дип іпосціайопв," Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 90(24):11478-11482, 1993. бамгоп-ВигКе апа Вайт, Сепеї. Епдіпеег., 13:237-263, 1991. сч

Сепйег еї аі.. Зотаї. СеїЇ Сепеї. 3:231-236, 1977.

СІ еї аї., 9. Віої. Спет., 270:27277-27282, 1995. о

Содіпо, Мопосіопа! Апіібодієв: Ргіпсіріеєз апа Ргасіїсе, рр.60-74. 2па Едійоп, Асадетіс Ргезз, Опапао, РІ, 1986.

Соеааеї! еї аї!., Майиге, 281:544, 1979,

Соеааеї! еї аї., Мисі. Асіаз Кез., 8:4057, 1980. М зо Стгапат апа мап дег Ер, "Тгапеїогтайоп ої гаї сейв Бу ОМА ої Ппитап адепомігив 5, Мігоіоду, 54(2):536-539, 1973. --

Сгееп, Мисі. Асідз Кевз. 16(1):369, 1988. Огоспиівкі еї аї., У. Мої. Віої!., 254:447-464, 1995. с

Нагіому апа І апе, Апііродієг: А І арогаїогу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагбог І арогагу, Соїа Зргіпд Нагрог, МУ, 1988.

Непгу-МіспеМйапа еї аі)., "АНасптепі ої апіібіоїсв (о папорагісіев; Ргерагайоп, агод-гееазе апа о апійтісгобріа! асіїмцу іп міго," Іпї. 9. Рпагт., 35:121-127, 1987. ї-

Негтвзіаєвді еї а/ї., Віо/ТесппоіІоду, 4:305-308, 1986.

Негїтпзіаді еї аї.. Сепе, 57:37-46, 1987.

Незз еї аі.,Ч). Аду. Епгуте Кеа., 7:149, 1968.

Незз, Іпіегп Кеу. Суі., 107:367, 1987. «

Ніїбег, Водтег, Зтй, КопПег, "Віоїївііс (гапеїогтацоп ої сопіадіа ої Воїгуоііпіа ТисКеїапа", з с Ніхтетанп еї аї, 9. ВіоІ. Спет., 255:2073, 1980.

Нопе апа уУпігеіеу, Місгобіої. Кем., 53:242-255, 1989. з Ноке еї аї., Мисі. Асіаз Кез., 15:7183, 1987.

Ноїіапа еї аї.. Віоспетівігу, 17:4900, 1978.

Нопее еї аї., Мої. Місгобіо!., 5:2799-2806, 1991. -І Ноомег еї а/!., (Еаз.), Кетіпдіоп'єз Рпагтасеціїса! Зсіепсев, 15Іп Еайіоп, Маск Рибіїзпіпд Со., Еазіоп, РА, 1975.

Ноготг еї аї.. Сепе, 77:61-68, 1989. 1 Какига еї аї.. Зсіепсе, 198:1056, 1977. 2) Уатевзоп апа УУоїї, "Те Апіїдепіс Іпдех: А Моме! АІдогійт ог Ргедісіпуд Апііїдепіс Оейегтіпапів," Зітри.

Аррі. Віовсі., 4(1): 181-6, 1988. - УЧоппвіоп апа Тапуд, "Сепе дип ігапетесіоп ої апіта! сеї апа депейіс іттипігайоп, Меїйпоаз Сеї|. Віо)/.,

І 4З(А):353-365, 1994. «ЩЧопез, Сепеїйїісв, 85:12 1977.

Чд9огдепзеп еї а!., Мої. Сеп. Сепеї, 207:471, 1987. 5Б Кеїег еї аІ., ЕМВО))., 8:1309-14, 1989.

Кіпдзтап еї а!.. Сепе. 7:141, 1979. (Ф) КіІєвїп еї аї.. Майкшге, 327:70, 1987. ка Кіевїп еї аї., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 85:8502-8505, 1988.

Кпідні еї аї., 9. Віої. Спет., 270:17765-17770, 1995. во Копіег апа Міївіейп, Еишг. 9. Іттипої., 6:511-519, 1976.

Копіег апа Міїзієвїп, Майиге, 256:495-497, 1975,

Кот апа Оцееп, ОМА, 3:421-436, 1984.

Кгеїд еї аІ.. Ап25Спавеа. ІподзКае, РПапгепвзспші?, От-меїгвспиці2, 57:145-150, 1984.

Кгеїд еї аї.. Іп: гапдем Епі., 96:500-508, 1983. 65 Ктеод еї аї.. У. Аррі. Епі, 104:417-424, 1987.

Киву, Іп: Іттипоіоду 2па Едікоп, МУ. Н. Ргеетап 5 Сотрапу, Мем ХогК, 1994.

Куїе апа ОооіішШе, "А вітріе теїой їог аізріауйїпд (Ше Пуайгораїйіс спагасіег ої а ргоївіп," 39. Мо).

Віої., 157(1): 105-132, 1982.

Їада ог., 9. Есоп. Епіотої., 79:00668-671, 1986.

І атрбегі еї а!., Аррі. Епмігоп. Місгобріоі!., 58:2536-2642, 19926.

Ї атбегі єї аї.. Сепе, 110:131-132,1992а.

Ї апогідде еї аі!., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА, 86:3219-3223, 1989.

Ї ее еї аі!., Віоспет. Віорпуз. Кев. Сотт., 216:306-312, 1995.

І Іпавігот еї а!., Оемеортепіа! Сепеїйісв, 11:160, 1990. 70 І ог єї аІ.,Мої. Сеп. Сепеї, 199:178, 1985.

ГИ, Хіао, СіІарр, Ії, Вгохтеуег, "Нідпй ейПісіепсу гейгомігаї тедіаєєй депе (гапзаисіоп о іпіо віпдіе івоїаїей іттайшге апа геріааріе СОзЗ4(Зю) Петаїйороїеїіс віет/ргодепійог сейв їйот Ппитап иштріїїса! сога

Біоса," 9. Ехр. Мед. 178(6):2089-2096, 1993.

Ї цо еї а)... Ріапі Мої. Вісі. Керогіег, 6:165, 1988.

Масаїйзо апа Мейиз,7. Васіегіа!|., 173:1353-1356,1991.

Мадоаоск еї аї.. Трпіга Іпіегпайопа! Сопдгезз ої Ріапі МоіІесціаг Віоіоду, Арзігасі 372, 1991.

Маїсу еї а!., "Місгоріа! Сепеїйісв" 2па Едійоп. допез апа Вагпей Рибіїзпегв, Вовіоп, МА, 1994.

Маїсу, "Ехрегітепіа! Тесппідцез іп Васіегіаї Сепейсв" допез апа Вапен РгоКор, А., апа Ваїраї, Кк. К. "Кесотріпапі ОМА Тесппоіоду І" Апп. М.М. Асай. Зсі, Мої. 646, 1991.Мапіайів еї аїЇ.. іп: МоіІесшаг Сіопіпд: а Габогаюгу Мапиаї, Соїа Зргіпу Нагрог І арогаюгу, Соїа Зргіпуд Нагрог, МУ, 1982.

Магсоке еї аї.. Майге, 335:454, 1988.

Мазгзгоп еї аї., У. Віоії. Спет., 270:20309-20315, 1995.

МссСарье еї! а!.. Віосїесппоіоду, 6:923, 1988.

МеРпегзоп еї аї., Віо/Тесппоіоду, 6:61-66, 1988. сч

Мейиз апа Масаїизо, Аррі. Епмігоп. Місгопіо!., 56:1128-1134, 1990.

Меишйашзг еї аї., Тпеог. Аррі. Сепеї, 75:30. 1987. (8)

Могогп еї аї., Ріазтіа, 13:211-214, 1985,

Оаеї еї аІ.,Макшге,313:810, 1985.

Отігиенй еї а/!.. Ріапі МоіІесціаг Віоіоду. 21:415-428, 1993. М зо Репа єї аї., Майшге, 325:274, 1987.

Роз2Комузкі еї аі.. ЕМВО))., 3:2719, 1989, -

Роїгукиз еї аїЇ.. Мої. Сеп. Сепеї, 199:183. 1985. с

Роцігеп еї аі.,Мої. Сеп. Сепеї, 205:193-200, 1986.

РгоКор апа Ваїраї, Апп. М. У. Асад. Зсі. 646, 1991. о

Кодеге еї аїЇ, іп: Меїйодз Рог Ріапі Моїесшаг Віоіоду, А. МУеіїзвраспи апа Н. УУеіїззрасіи, едв., Асадетіс ї-

Ргезз Іпс., Зап Оіедо, СА 1988.

Кодегз еї аї., Мей. Іп Епгутої., 153:253-277, 1987.

Кираг еї аі., Арр. Епмігоп. Місгобіої., 57:3337-3344, 1991.

ЗатргооК еї аїЇ.. Іп: МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїгу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагрог І арогаїогу, Соїд Зргіпд «

Нагброг, МУ, 1989, з с зедаї, Віоспетіса! СаІсціайопв, 2па Едйіоп. дойп У/іІеу 5 Зопв, Мем Хогк, 1976. . Зекаг еї аї., Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА, 84:7036-7040, 1987. и? зіск еї аї., Мисі. Асіаз Кез., 18:1305, 1990.

Зітрзоп, Зсіепсе, 233:34, 1986.

Боцвегп,.у. Мої. Віо!., 98:503-517, 1975. -І Зріеітапп еї а!.,Мої. Сеп. Сепеї, 205:34, 1986.

Тогіуата еї аіІ., Тпеог Аррі. Сепеї, 73:16, 1986. 1 Оспітіуа еї аі!., Мої. Сеп. Сепеї, 204:204, 1986. 2) Мап Типеп егаІ., ЕМВО))., 7:1257, 1988.

Мавіі еї аї, /"Негбрісіде-гевівїапі Тепіе (гапздепіс м/пеаї ріапів оБріаїпеа ру / тісгоргоіїесШе - ротбрагатепі ої гедепегаріє етбгуодепіс саПив," Віоїесппоіоду, 10:667-674, 1992. "М Мазі, Віоїесппоіоду, 6:397, 1988.

Могакіп еї а/ї.. СеїІ, 34:1023, 1983.

МУадпег ебг аі., "Соицріпуд ої адепо мігив (о (гапвгегтіп-роїіуузіпе/ОМА сотріехез дгеайу еппапсевз ов Гесеріог-тедіаФі депе деїймегу апа ехргевзвіоп ої (гапеїесівй депев, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОА, 89 (13):6099-6103, 1992. (Ф) МУеівврасп апа МУеізвраси, Меї(йод»в їтог Ріапі Моїесціаг Віоіоду, (едв.). Асадетіс Ргевззв, Іпс., Зап Оіедо, ка СА, 1988.

Уепліег єї аї.. Ріапі Мо). Віо!., 12:41-50, 1989, во УМО! еї а)... Зітри. Аррі. Віовсі., 4(1): 187-91 1988.

УМУопд апа Мецтапп, "ЕІесігіс Яеід теаіасеай депе ігапегег, Віоспіт. Віорпуз. Кев. Соттип. 107(2):584-587, 1982.

Уатада егї а!., Ріапі Сеї! Кер., 4:85, 1986.

Уапад егаї., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА, 87:4144-48, 1990. 65 7ацПоикаІ, МУадпег, СоЦеп, РпПййрвз, РіапК, Зіеїіпівіпї, Сигієї, Вітв(іеії, "Тгапвіегіпіесіоп: а підну ейпісіепі мау ю ехргевзз депе сопвігисів іп ейшкагуоїїіс сеїІв," Апп. М. У. Асай. Зсі., 660:136-153, 1992.

7пои еї а|., Меїйовдз іп Епгутоіоду, 101:433, 1983.

Список послідовностей (1) Загальна інформація: (1) Заявник: (А) Ім'я, прізвище: ЕСОСЕМ, ІМС. (В) Вулиця: 2005 Сабої Вошемага УУеві (С) Місто: І апдапогпе (Ю) Штат: Пенсільванія 70 (Е) Країна: США (Р) Поштовий індекс: 19047-3032 (І) Назва винаходу: композиції білків СТУЕТЗЗ і СтуєТ34 В «пПигіпдіепвів і їхнє використання (ПП) Число послідовностей: 10 (ІМ) Форма комп'ютерного зчитування: (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: РС сумісна з ІВМ (С) Операційна система: РО-ЮОЗ/М5-БО5 (0) Програмне забезпечення: Раїепіїп Кеїеазе й 1,0, Мегвіоп 21,30 (ЕРО) (МІ) Дані попередньої заявки: (А) Номер заявки: ОЗ 08/718905 (В) Дата подачі: 24 верес. 1996 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо1: (І) Характеристики послідовності: сч (А) Довжина:.807 пар основ (В) Тип: нуклеїнова кислота і) (С) Число ланцюгів: один (ОБ) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5БЕО ІЮ Мо1: ч- | й ; - (ЇХТ) Ойисаниє последоватенвности ЗО ТО ою т: с

ВІбЯВААТТА ТТАКТКЕССК АОАТОКИНЯт ААТАВІТАСЯ ТИКААНАЕТ АТАК Ж

ВЕКАСТОТТА ВАВССАСАТА СОАТСССтТсА ТІСААЛСТАтТ ТТААТОААТС Тотодсвссс 329 ї-

СсАдтТоВОстО ДАдсААс повАстТатТА КАТАдтТсВАт ТАдСтТАСЬКА ВадАСтТАВИх пвх

ХКЕКОВОСТА стТІНЕеСО АОАААНТАСТ ОТ сАтоолонах дАссснтяєи о с СКАДСАДСТЯ САСТААСТЯА СОСАСТОАНА ОССООСАССТ СААТААОТИС ТАААСААТСТ Зо а ш т. 15 ВЕТВСВАСКА АТАСААСТИС БАСАКСАСВИ ВСАСВСВОСТ ОЗТОАОКТТС ВАСИВАДОТЬ 4

ДСТАТЕССТО ССААААСТІА ТОТОЗАВОСТ ОСАТАСАТТА: ТОСАДААТОЯ ЛАВАТАТААТ во: сл ЖетТКТІСсте ШСАЛАЖСТТА ТОТОСАНОСТ БСАТКСНТТА ТОСАЛАХТСЯ ААСИТИТАДТ 4 г ЕТССООЄТА АТЕТАОААТО ТОАТАТОАВТ ОСААСТІТАТ ІТТОТАСАба ОТАТАЯАБАЄ 540

Кк Не а з ЯТААНІСТТА СААКТАААНЯ СОЛТОСААТТ ОСТСАСТТХА ЛАООТТОСОО ТТТАТМНАЯ бо яв сетосАскМя бСТІООСКАЄ САТТАТТОАЄ СТТАСАНАвтТ АТссастлсал тадткананА Таб

ДКВРЕТВОСА ВСАТАКАКТІ ТІКАХАА. от 60 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо2: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 381 пари основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюжність: одноланцюжна 65 (Юр) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5БЕО ІЮ Мо2:

-ВТОАСАЯТКТ АТКАСОСДАС ТІТСАССАТТ ААТТТСТАТА АРОЛАСВАСА АтобоовУва во ; ССЛОВАССАТ АІОСТТАТАТ ВАЛАССАТАТ СІТВСАЙАТС СВбАТСЯТОВ ТІТТОВМАТЕ 300 т фКАтТАВОАСО ТАИООААКНОС АСМНЕАТАТТ СТЕОСТІКУЄ САЛОТСКАДА АбТИТИСАЄЄ 300 всисетосто ТААСАЯТАСЕ ЯСТІЯАТОЯС ЗАТОАОАААЄ ОІТСТТАТОТ ЗАСЛАТІВНЄ 360 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 267 амінокислот (В) Тип: Амінокислотна (С) Ланцюжність: одноланцюжна (ОБ) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності БЕО ІЮ МоЗ с (8) ї- «- со

ІС) м. « ші с з -І 1 (95) - 50 що

Ф) іме) 60 б5

Ме с1у пт ме два пів бій Ар бів Тієе Аво АяпоТух Мав пує бі й 5. Зо 15

Маї тую сіу дія тнє тне Маї пуш чех тих тук Авр тво Ваг ВЕ щув

Уві рве лай бі Бек Мйї ТВг тко бів РБе Тбх бра Їзе РКО Тх ві 10 35. 40 йо шко Уаї дюполан пра ви Тк Тк ую ле уаї Ам Ай тТве прусвех 15 лук то Мах 015 Бех тн чав бе Рв тТву Тер ТБх Яр Твх бів ЖНх

І 7 че во; сі тве вах дів чаї тт бін біу Узі бує Віа біу їх бек І1Ж Ва: 20 як во 88

В : : "не чаї вик дів біта тус деп Тух бек Ти ТВх дп ТБеотве Тше ТБЕ о

Щі ЕЕ 00000 даю 125 літ бур би Ж тре Тер Вт дбР Бе ТНЕ Пуз Чаї Мт ТАЖ РЕВ РРО С 30 со та їаб «- яв тк суб ах ау Аза кій Туж їів її бід лях сіу Те Тук див о як во 7 ав ко ю ллаї бхо Чаї Аж Маі бі» суя кар ее Бек шіу твж тий РЕЄ Суя АЯ 40 Має Твг Чаї тух дав дів тих не твЕ ТІ Ази ба Ту Жед біл бу з с З В та зв щ са ткр Шу БІУ Бо сіб то Тух біу Ту їМе Був йта тух те тн 45 х т Аяп рко ану Ні ВЯб тбж с) І) Тр Бу» бій йшр Ай тир бу ут - 20 Бех таж то бір Ажу Вес ТБх Тук ТВ бів Три їХе їує шіє: вах вах що: 55 ве що дар ТВ біу беж руо їіе Айва їй Меб Суб Фе Тув сту Аве уві ув

Кі "в зб ше Я і

Ф. та чук дар Чаї піу дяд діа хр йвр іє їси Аіа тТук йко ех бів. ю в 85. зв й 60 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо4: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 126 амінокислот (В) Тип: Амінокислотна (С) Ланцюжність: одноланцюжна 65 (ОБ) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5БЕО ІЮ Мод:

Меж Тік Чаї Тук Авзп Аїа Тіт Рпе ТІ І1іа Азп Рне Тук Азп біц 01у 1 5 10 15 й , | . бі ТЕв сіу сбі1у рРко зі рРко Тух біу Тут І1іє цуз Аіа Тух Цеви ТЕ 20 25 30

АвзпоБгко Азр Ніз Азр ре біз Ії Тер уз піп Азр Авр тТхр бі1у цуз то 35 40 45

Бек Тпж РКО бій Акч беж ТЕ Тут ТБі біп Тк Кі пув І1їв Бег бег 50 55 (те!

Азр Тіх сО1у бек Рто І1є Азп бів Меє Суз Рпе тух сіу Азр Чаї буз 65 то 75 80 бій Тук Азр Маї 01у Ап Аза Ар АБр І1е цей Аїа Тух Рго Зех вій . 85 зо 35 цув уаї Сув бек Тіх рРго біу уаї ТБх Маї Агу Печ Авр о сіу Ар ІЧ сч 100 ха5 110 о цуз с1у БВех Тук Чаї Тк Ії Ццуз Тут Бех Пцеп Тік Рго Аїа 115 120 125 к

Зо (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Моб: «- (І) Характеристики послідовності: со (А) Довжина: 20 амінокислот (В) Тип: Амінокислотна ІФ) (С) Ланцюжність: одноланцюжна їч- (О) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5ЕО ІЮ Моб:

Сіу Іїе 1іє Азп 116 Сіп Ар Сі» 11е Азп Азп Тук Мес Гуз бій МУаї « 10 15 - с 1 5 :» Туг бі1у Аїа ТНг : 20 -І (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Моб: о : . (І) Характеристики послідовності: (95) (А) Довжина: 20 амінокислот ши 20 (В) Тип: Амінокислотна (С) Ланцюжність: одноланцюжна що (Ю) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5ЕО ІЮ Моб:

Трг Уаї Туг Авп Уаї Те Ре Тс Іїе Гуз Рпе Туг Азп Бій 1у Сі о 1 5 го 15 іме) 60

Тгтр 1у С1у Рго 20 в5 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо7: (І) Характеристики послідовності:

(А) Довжина: 11 амінокислот (В) Тип: Амінокислотна (С) Ланцюжність: одноланцюжна (ОБ) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5БЕО ІЮ Мо7:

Ме біу І12е І1ї1е Азп Т1е іп Авр біц ІЇ1їе6є Авп то 1 5 10 (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо8: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 8 амінокислот (В) Тип: Амінокислотна (С) Ланцюжність: одноланцюжна (ОБ) Топологія: лінійна (ХІ) Опис послідовності 5ЕО ІЮ Мов:

Туг Меї пПуз бі Уа1 Тук сіу Аі1а 1 5 сч о (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Ме9: (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 33 пари основ М (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Ланцюжність: одноланцюжна -- (ОБ) Топологія: лінійна с (ХІ) Опис послідовності 5ЕО ІЮ Мо:

ІС) " АТОССААТТА ТТААТАТТСА АСАТСАААТТ ДАТ й (2) Дані послідовності БЕО ІЮ Мо10: « (І) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 56 пар основ но) с (В) Тип: нуклеїнова кислота "» (С) Ланцюжність: одноланцюжна " (ОБ) Топологія: лінійна (ІХ) Відмінна риса: (А) Назва/Ключ: модифікована основа це. (В) Локалізація: 34..36 «сл (Ю) Додаткова інформація: /мод.основа - Доповн./прим.-"М-інозин" (ХІ) Опис послідовності ЕС ІЮ Мо10: (95) .

Зо АМОСССААТТА ТТААТАТІТСА АСАТСАААТТ ААТМММТАТА що

ТСАДАСААСТ АТАТОС

ГФ! Усі композиції і методи, описані і заявлені в даний заявці можуть бути здійснені виходячи з даного опису без зайвого експериментування. Хоча композиції і методи даного винаходу були описані на кращих прикладах ко його здійснення, однак, для кожного фахівця очевидно, що в композиціях, методах і в стадіях або в послідовності стадій здійснення описаних методів можуть бути внесені зміни, що не виходять за рамки суті й 60 об'єму винаходу. Більш конкретно, слід зазначити, що ті ж самі або схожі результати повинні досягатися при заміні деяких агентів, використовуваних у даному винаході, іншими агентами, які мають подібні хімічні і фізичні властивості. При цьому, для кожного спеціаліста очевидно, що всі такі заміни і модифікації не повинні виходити за рамки суті й об'єму даного винаходу, визначеного в його формулі. Тому очевидно, що ексклюзивні права на патентування визначені в поданій нижче формулі винаходу. б5

Claims (40)

Формула винаходу

1. Виділений і очищений кристалічний білок Васійив5 (Пигіпдіепзіз, що містить амінокислотну послідовність 2 8ЕОЮ Мо З або ЗЕО ІЮ Мо 4.

2. Білок за п. 1, який відрізняється тим, що вказаний кристалічний білок виділяють із Васіиз (Пигіпдіепвів ЕС10327 (МКК. В-21365), Е011402 (МАК. В-21366) або ЕС11403 (МАК. В-21367).

З. Білок за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний кристалічний білок має розмір приблизно 29 кКДа або приблизно 14 КДа, як було визначено методом електрофорезу в ПААГ із ДСН. 70

4. Білок за п. 1, який відрізняється тим, що включений у композицію, яка містить від приблизно 1 95 до приблизно 50 95 мас. вказаного кристалічного білка.

5. Білок за п. 1, який відрізняється тим, що включений у композицію, отриманий способом, що включає наступні стадії: (а) культивування клітини штаму ВасшШивз (Ппигіпдіепвіз, що містить сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує кристалічний білок, що відповідає амінокислотним послідовностям ЗЕО ІЮО Мо З або ЗЕО ІО Мо 4, або обом в умовах, ефективних для продукування вказаного кристалічного білка; і (Б) одержання із вказаної клітини вказаного кристалічного білка.

б. Білок за п. 5, який відрізняється тим, що стадія (Б) включає, крім того, одержання вказаного кристалічного білка у кількості від приблизно 1 95 до приблизно 50 95 мас.

7. Композиція кристалічного білка за п. 1, який відрізняється тим, що містить білки з амінокислотними послідовністями ЗЕО ІЮО Мо З та 5ЕО ІЮО Мо 4 і має інсектицидну активність проти довгоносика бавовняного, японського жука (Роріїїа іаропіса) або хруща каштанового (ТгіроїїшШт сазіапеит).

8. Очищений сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує кристалічний білок ЗЕО ІЮ Мо З або 5ЕО ІЮ Мо 4.

9. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 8, який відрізняється тим, що додатково визначений як такий, що с 29 включає послідовність нуклеїнової кислоти 5ЕО ІЮ Мо 1 або комплементарну їй послідовність, або послідовність, Ге) що гібридизується в жорстких умовах в присутності від близько 0,02 М до близько 0,15 М Масі і температурі від близько 502 до близько 702 з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо1, або послідовність нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ Мо 2 або комплементарну їй послідовність, або послідовність, що гібридизується в жорстких умовах в присутності від близько 0,02 М до близько 0,15 М Масі і температурі від близько 502С до близько 702С з послідовністю ЗЕО ІЮ - мро, -

10. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 8, який відрізняється тим, що визначений як РНК-сегмент.

11. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 8, який відрізняється тим, що кодує кристалічний білок, який має о довжину приблизно 267 амінокислот, або кодує кристалічний білок, який має довжину приблизно 126 Іо) амінокислот.

12. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 8, який відрізняється тим, що включений в рекомбінантний вектор. -

13. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 12, який відрізняється тим, що вказаний рекомбінантний вектор являє собою рЕС246 і знаходиться в клітині-хазяїні МККІ. В-21364 або являє собою рЕС1246 і знаходиться в клітині-хазяїні МКК. В-21367. « дю

14. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 12, який відрізняється тим, що вказаний сегмент нуклеїнової кислоти з функціонально зв'язаний із промотором. с

15. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 12, який відрізняється тим, що вбудований в рекомбінантну :з» клітину-хазяїн.

16. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 15, який відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн є прокаріотичною клітиною. - 15

17. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 16, який відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн є бактеріальною клітиною. 1

18. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 17, який відрізняється тим, що вказаною бактеріальною клітиною є с клітина виду Е-.соїї, В.(пигіпдіепвзіз, В.з!ибБійв, В.тедаїйегішт, або Рзепдотопазв.

19. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 18, який відрізняється тим, що вказаною бактеріальною клітиною є - 70 Е.соїї МАК. 8-21364, Впигіпдіепвіз МАК! 8В-21365, В.Ппигіпдіепзіз МАК. В-21366, або В уПигіпдіепзіз МКК. ще В-21367.

20. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 15, який відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн є еукаріотичною клітиною.

21. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 20, який відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн є рослинною 59 клітиною. ГФ)

22. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 21, який відрізняється тим, що вказаною рослинною клітиною є клітина 7 кукурудзи, пшениці, рослини, що утворює дерн, овочевої рослини, плодового дерева або декоративної рослини.

23. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 15, який відрізняється тим, що вказана клітина-хазяїн експресує сегмент нуклеїнової кислоти для продукування вказаного кристалічного білка. 60

24. Сегмент нуклеїнової кислоти по п. 8, який відрізняється тим, що вбудований у трансгенну рослину.

25. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 24, який відрізняється тим, що вказаний сегмент нуклеїнової кислоти включений у потомство трансгенної рослини.

26. Сегмент нуклеїнової кислоти за п. 24, який відрізняється тим, що вказаний сегмент нуклеїнової кислоти включений у насіння трансгенної рослини. бо

27. Спосіб застосування сегмента нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, як визначено в послідовності ЗЕО ІЮ Мо З або ЗЕО ІЮ Мо 4 для експресії білка, який включає наступні стадії: (а) одержання рекомбінантного вектора, що включає сегмент нуклеїнової кислоти згідно з п. 8, який знаходиться під контролем промотору; (Б) введення вказаного рекомбінантного вектора в клітину-хазяїн; (с) культивування вказаної клітини-хазяїна для експресії вказаного білка і (4) відокремлення вказаного експресованого білка.

28. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що вказаним рекомбінантним вектором є рЕс246, що знаходиться в клітині-хазяїні МКК. В-21364, або є рЕС1246, що знаходиться в клітині-хазяїні МКК. В-21367. 70

29. Виділений сегмент нуклеїнової кислоти, охарактеризований як сегмент нуклеїнової кислоти, який включає область послідовності, що складається принаймні із 18 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ Мо 1 або ЗЕО ІО Мо 2, або комплементарної їм.

30. Виділений сегмент нуклеїнової кислоти за п. 29, який відрізняється тим, що включений в набір для визначення наявності нуклеїнової кислоти, що включає у відповідному контейнері виділену нуклеїнову кислоту і /5 реагент для детекції.

31. Виділений сегмент нуклеїнової кислоти за п. 30, який відрізняється тим, що містить послідовності ЗЕО ІЮ Мо 1, БЕО ІЮО Мо 2 або комплементарні їм.

32. Спосіб виявлення послідовності нуклеїнових кислот, що кодує кристалічний білок, де вказаний білок містить послідовності ЗЕО ІЮО Мо З або ЗЕО ІЮО Мо 4, який включає наступні стадії: (а) одержання зразка нуклеїнових кислот, що, ймовірно, кодують кристалічний білок послідовності ЗЕО ІЮ Мо З або 5ЕО ІЮ Мо 4; (Б) контактування вказаного зразка нуклеїнових кислот із виділеним сегментом нуклеїнової кислоти, що кодує вказаний кристалічний білок в жорстких умовах в присутності від близько 0,02 М до близько 0,15М Масі і температурі від близько 502 до близько 702С, ефективних для гібридизації в основному комплементарних сч нуклеїнових кислот; і (с) виявлення отриманих у такий спосіб гібридизованих комплементарних нуклеїнових кислот. о

33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що виділений сегмент нуклеїнової кислоти включає мітку, що детектується, і де вказані гібридизовані комплементарні нуклеїнові кислоти виявляються за допомогою цієї мітки.

34. Очищене антитіло, яке генероване шляхом використання білка за п. 1 як імуногена. ча

35. Антитіло за п. 34, яке включене в набір для імунодетекції, що містить у відповідному контейнері антитіло і реагент для імунодетекції. -

36. Спосіб виявлення кристалічного білка, що містить послідовності ЗЕО ІЮО Мо З або 5ЕО ІО Мо 4 у со біологічному зразку, який включає стадії: (а) одержання біологічного зразка, що, ймовірно, містить вказаний кристалічний білок; о (Б) контактування зазначеного зразка з антитілом згідно з п. 34, в умовах, ефективних для утворення ї- імунокомплексів; і (с) виявлення утворених у такий спосіб імунокомплексів.

37. Штам клітин Васіййв5 (пигіпдіепзіз, що містить сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, який містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО Мо З або ЗЕО) ІЮО Мо 4, або обидві. «

38. Штам клітин Васіїйив (Нигіпдіепвіз згідно з п. 37, який відрізняється тим, що клітини мають МАК! номер ше) с доступу В-21365, В-21366 або В-21367. й

39. Спосіб одержання кристалічного білка, який містить амінокислотні послідовності ЗЕО ІЮО Мо З або ЗЕО ІЮ «» Мо 4, що включає: (а) культивування клітини Васійшв Іпигіпдіепзіз за п. 37 в умовах, ефективних для продукування вказаного Кристалічного білка; і -і (Б) одержання із вказаної клітини вказаного кристалічного білка.

40.Білок за п.4, одержаний способом за п.39. о 41. Інсектицидна композиція, яка містить кристалічний білок з амінокислотними послідовностями 5ЕО ІЮО Мо З Ге) або ЗЕО ІЮО Мо 4, що має інсектицидну активність проти довгоносика бавовняного, японського жука (Рорійа |аропіса) або хруща каштанового (Тгіроїїшт савіапеит). - 42. Інсектицидна композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що містить від близько 195 до близько 5095 мас. "З кристалічного білка БЕО ІЮ МоЗ або ЗЕО ІЮ Мо 4. Ф) іме) 60 б5