DE69735305T2

DE69735305T2 - ZUSAMMENSETZUNGEN VON BACILLUS THURINGIENSIS CryET29 DIE FÜR KÄFER UND CTENOCEPHALIDES SPP. TOXISCH SIND

Info

Publication number: DE69735305T2
Application number: DE69735305T
Authority: DE
Inventors: J. Mark Wilmington RUPAR; P. William Levittown DONOVAN; Yuping Fremont TAN; C. Annette Hamilton Square SLANEY
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2017-09-26
Also published as: TR199900689T2; PT932682E; AU4657797A; US20030167521A1; US6686452B2; PL332502A1; KR20000048680A; IL129189A0; JP2001506973A; US7572587B2; US6093695A; BR9711554B1; US7186893B2; CA2267667A1; ATE318313T1; CN1245513C; CA2267667C; CN1246893A; EP1681351A1; US20040127695A1

Description

1. Hintergrund der Erfindung
1.1 Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Gebiete der Molekularbiologie. Insbesondere betreffen bestimmte Ausführungsformen Verfahren und Zusammensetzungen, die DNA-Segmente umfassen, und Proteine, die von Bakterienspezies abgeleitet sind. Insbesondere betrifft sie ein neues cryET29-Gen von Bacillus thuringiensis, das ein gegenüber Coleoptera und Katzenflöhen toxisches Kristallprotein codiert. Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser DNA-Segmente, DNA-Segmente, die synthetisch modifizierte CryET29-Proteine codieren, sowie native und synthetische Kristallproteine werden offenbart, wie zum Beispiel die Verwendung von DNA-Segmenten als diagnostische Sonden und Matrizen für die Proteinproduktion sowie die Verwendung von Proteinen, Fusionsproteinträgern und Peptiden in verschiedenen immunologischen und diagnostischen Anwendungen. Ebenfalls offenbart werden Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Nucleinsäuresegmenten bei der Entwicklung von transgenen Pflanzenzellen, die die hier offenbarten DNA-Segmente enthalten.
1.2 Beschreibung des Standes der Technik
1.2.1 Bacillus-thuringiensis-Kristallproteine
Bacillus thuringiensis ist ein Gram-positives Bakterium, das als Kristallproteine bekannte δ-Endotoxine erzeugt, die spezifisch toxisch gegenüber bestimmten Ordnungen und Spezies von Insekten sind. Es hat sich gezeigt, dass viele verschiedene Stämme von B. thuringiensis insektizide Kristallproteine erzeugen. Zusammensetzungen, die B.-thuringiensis-Stämme beinhalten, welche insektizide Proteine erzeugen, sind kommerziell erhältlich und werden als umweltverträgliche Insektizide verwendet, da sie gegenüber dem bestimmten Zielinsekt sehr toxisch, aber gegenüber Pflanzen und anderen Nicht-Ziel-Organismen harmlos sind.
Das B.-thuringiensis-Kristallprotein ist in dem Insekt erst nach der Aufnahme toxisch, wenn der alkalische pH-Wert und proteolytische Enzyme im Mitteldarm des Insekts das Kristallprotein auflösen und die toxischen Komponenten freisetzen. Diese Komponenten zerstören die Zellen des Mitteldarms und bewirken dadurch, dass das Insekt keine Nahrung mehr aufnimmt und schließlich stirbt. Tatsächlich hat sich B. thuringiensis beim Umgang mit verschiedenen Schadinsekten als wirksames und umweltverträgliches Insektizid erwiesen.
Wie Hofte et al. (1989) bemerkten, ist die Mehrzahl der insektiziden B.-thuringiensis-Stämme aktiv gegen Insekten der Ordnung Lepidoptera, d.h. Raupeninsekten. Andere B.-thuringiensis-Stämme sind insektizid aktiv gegen Insekten der Ordnung Diptera, d.h. Fliegen und Mücken, oder sowohl gegen Lepidoptera- als auch gegen Diptera-Insekten. In den letzten Jahren wurde nur von wenigen B.-thuringiensis-Stämmen berichtet, die Kristallproteine erzeugen, welche toxisch gegen Insekten der Ordnung Coleoptera, d.h. Käfer, sind. Bisher gab es keine Berichte von B.-thuringiensis-Stämmen, die aktiv gegenüber Flöhen der Gattung Ctenocephalides in der Ordnung Siphonaptera sind.
Die gegenüber Diptera aktiven Cyt-Toxine unterscheiden sich von den meisten anderen insektiziden B.-thuringiensis-Kristallproteinen dadurch, dass sie kleiner sind und keine konservierten Blöcke mit Sequenzhomologie gemeinsam haben. Diese Proteine weisen in vitro eine breite cytolytische Aktivität auf und sind dennoch in vivo spezifisch toxisch gegenüber Larven von Diptera-Insekten. Diese Eigenschaften wurden an anderer Stelle beschrieben (Chilcott und Ellar, 1988).
1.2.2 Genetik von Kristallproteinen
Mehrere Gene, die Kristallproteine codieren, wurden von mehreren Stämmen von B. thuringiensis kloniert. Eine Übersicht von Höfte et al. (1989) beschreibt den allgemeinen Stand der Technik in Bezug auf die Mehrzahl der identifizierten insektiziden B.-thuringiensis-Stämme, die aktiv gegen Insekten der Ordnung Lepidoptera, d.h. Raupen, sind. Diese Abhandlung beschreibt auch B.-thuringiensis-Stämme mit insektizider Aktivität gegen Insekten der Ordnungen Diptera (d.h. Fliegen und Mücken) und Coleoptera (d.h. Käfer). Mehrere Gene, die Kristallproteine codieren, wurden von mehreren Stämmen von B. thuringiensis kloniert. Höfte et al. (1989) diskutieren die Gene und Proteine, die vor 1990 in B. thuringiensis identifiziert wurden, und legen das Nomenklatur- und Klassifikationsschema dar, das traditionell auf B.-thuringiensis-Gene und -Proteine angewendet wird. Die cry1-Gene codieren Cry1-Proteine, die toxisch gegen Lepidoptera sind. Die cry2-Gene codieren Cry2-Proteine, die toxisch sowohl gegen Lepidoptera als auch gegen Diptera sind. Die cry3-Gene codieren Cry3-Proteine, die toxisch gegen Coleoptera sind, während cry4-Gene Cry4-Proteine codieren, die toxisch gegen Diptera sind, usw.
Vor kurzem wurde eine neue Nomenklatur vorgeschlagen, die die Cry-Proteine systematisch auf der Grundlage der Aminosäuresequenzhomologie und nicht der Insektenzielspezifitäten klassifiziert. Dieses Klassifikationsschema ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 Revidierte Nomenklatur der B.-thuringiensis-δ-Endotoxine^A

^a nach: http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html

1.2.3 Identifizierung von Kristallproteinen, die toxisch gegenüber Coleoptera-Insekten sind
Die Klonierung und Expression eines Gens, das ein gegen Stechmücken wirksames 26-kDa-Toxin aus dem gegen Diptera aktiven B. thuringiensis var. israelensis codiert, wurde beschrieben (Ward et al., 1984), und die Nucleotidsequenz dieses Gens wurde beschrieben (Ward und Ellar, 1986). Die Molekülmasse des Toxinproteins CytA, die aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz berechnet wurde, wurde zu 27 340 Da bestimmt.
Die Nucleotidsequenz des Gens für ein gegen Stechmücken wirksames 27-kDa-Cyt-Protein, das aus B. thuringiensis var. morrisoni Stamm PG14 isoliert wurde, wurde offenbart (Earp und Ellar, 1987). Es zeigte sich, dass die Sequenz dieses Toxinproteins sich um nur einen einzigen Aminosäurerest von dem CytIA-Protein von B. thuringiensis var. israelensis unterscheidet.
Die Identifizierung eines 25-kDa-Proteins, das in vitro cytolytische Aktivität aufweist, wenn es durch Proteolyse aus dem gegen Stechmücken wirksamen B. thuringiensis var. kyushuensis aktiviert wird, wurde schon früher beschrieben (Knowles et al., 1992), und die Nucleotidsequenz des Gens für dieses Protein, CytB, wurde beschrieben (Koni und Ellar, 1993). Die vorausgesagte Molekülmasse des CytB-Proteins beträgt 29 236 Da, und die abgeleitete Aminosäuresequenz ist sehr unterschiedlich, obwohl sie eine erhebliche Sequenzähnlichkeit mit dem CytA-Protein von B. thuringiensis var. israelensis hat.
Die Klonierung und Charakterisierung des Gens für ein 30-kDa-Toxinprotein mit Aktivität auf Coleoptera- und Diptera-Insekten wurde beschrieben (Internationale Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 95/02693, 1995). Dieses Gen, das aus B. thuringiensis PS201T6 isoliert wurde, codiert ein Protein von 29 906 Da, das eine Sequenzidentität von 64% mit dem CytA-Toxin von B. thuringiensis var. israelensis hat.
2. Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues insektizides B.-thuringiensis-Kristallprotein (als CryET29 bezeichnet) und das Gen, das es codiert (als cryET29 bezeichnet), bereit, welche Aminosäure- bzw. Nucleinsäuresequenzen enthalten, die wenig Homologie mit den δ-Endotoxin-Proteinen und Genen des Standes der Technik zeigen. Überraschenderweise zeigt das CryET29-Protein der vorliegenden Erfindung eine bemerkenswerte insektizide Aktivität nicht nur gegen Insekten der Ordnung Coleoptera, sondern auch gegen Flöhe und insbesondere Larven des Katzenflohs Ctenocephalides felis.
In einer wichtigen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Aminosäuresegment bereit, das ein insektizides B.-thuringiensis-CryET29-Kristallprotein (SEQ ID Nr. 2) umfasst, das die in 1A und 1B gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Der codierende Bereich für das CryET29-Protein ist SEQ ID Nr. 1. Das CryET29-Protein zeigt insektizide Aktivität gegen Coleoptera, wie den Südlichen Maiswurzelbohrer, den Westlichen Maiswurzelbohrer, den Kartoffelkäfer, den Japankäfer und den Rotbraunen Reismehlkäfer. In verwandten Ausführungsformen werden auch Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieses Proteins, Derivate und Mutanten davon und gegen diese Proteine gerichtete Antikörper offenbart.
In einer anderen wichtigen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuresegment bereit, das das cryET29-Gen umfasst, welches das hier offenbarte CryET29-Kristallprotein codiert. Die Nucleotidsequenz des cryET29-Gens ist in SEQ ID Nr. 1 angegeben und in 1A und 1B gezeigt. In verwandten Ausführungsformen werden auch Verfahren zur Herstellung, Verwendung, Veränderung, Mutagenisierung, Bestimmung und Quantifizierung dieser Nucleinsäuresegmente offenbart. Ebenfalls offenbart werden diagnostische Verfahren und Assaykits für die Identifizierung und den Nachweis von verwandten cry-Gensequenzen in einer Vielzahl von in-vitro- und in-vivo-Methoden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Bacillus-thuringiensis-Zelle, die ein CryET29-Kristallprotein produziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle ein Bacillus-thuringiensis-Bakterienstamm, der als B. thuringiensis EG4096 bezeichnet wird und am 30. Mai 1996 bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), hinterlegt wurde und die Zugriffs-Nr. NRRL B-21582 erhielt. B. thuringiensis EG4096, das in den Beispielen 1, 2 und 3 näher beschrieben wird, ist ein natürlich vorkommendes Bakterium, das ein cryET29-Gen (SEQ ID Nr. 1) der vorliegenden Erfindung umfasst. EG4096 erzeugt ein neues insektizides Kristallprotein von ungefähr 26 kDa, das die Erfinder als CryET29 (SEQ ID Nr. 2) bezeichnet haben. Am meisten bevorzugt hat die Bacillus-thuringiensis-Zelle die NRRL-Zugriffs-Nr. NRRL B-21582.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Plasmid, Cosmid oder Vektor, der die Nucleinsäuresequenz des gesamten oder eines Teils des cryET29-Gens (SEQ ID Nr. 1) umfasst, eine transformierte Wirtszelle, die ein natives oder rekombinantes cryET29-Gen umfasst, eine Kultur eines rekombinanten Bakteriums, das mit einem solchen Plasmid transformiert ist, wobei das Bakterium vorzugsweise B. thuringiensis ist, wie die rekombinanten Stämme EG11494 und EG11502, die in Beispiel 7 beschrieben sind, und am meisten bevorzugt eine biologisch reine Kultur eines solchen Bakterienstamms. EG11494 wurde am 30. Mai 1996 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens bei der NRRL hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer NRRL B-21583. Alternativ dazu sind die rekombinanten E.-coli-Stämme EG11513 und EG11514, die das neue cryET29-Gen umfassen, ebenfalls bevorzugte Wirte für die Expression des CryET29-Proteins.
2.1 cryET29-DNA-Segmente
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Segmente, die von praktisch jeder Quelle isoliert werden können, die frei von genomischer Gesamt-DNA ist und die die gesamte oder einen Teil der hier offenbarten neuen Peptide codiert. Das cry-ET29-Gen (SEQ ID Nr. 1, 1A und 1B) codiert das 26-kDa-CryET29-Protein, das die in 1A und 1B (SEQ ID Nr. 2) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Es kann sich erweisen, dass DNA-Segmente, die diese Peptidspezies codieren, auch Proteine, Polypeptide, Untereinheiten, funktionelle Domänen und dergleichen von mit Kristallproteinen verwandten oder anderen, nicht verwandten Genprodukten codieren. Außerdem können diese DNA-Segmente ganz in vitro synthetisiert werden, wobei man dem Fachmann wohlbekannte Verfahren verwendet.
Der hier verwendete Ausdruck "DNA-Segment" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das frei von der genomischen Gesamt-DNA einer besonderen Spezies isoliert wurde. Daher bezieht sich "ein DNA-Segment, das ein Kristallprotein oder -Peptid codiert", auf ein DNA-Segment, das Kristallprotein codierende Sequenzen umfasst und dennoch aus der genomischen Gesamt-DNA der Spezies, aus der das DNA-Segment erhalten wird, isoliert oder durch Reinigen davon befreit wurde, was im vorliegenden Fall das Genom der Gram-positiven Bakteriengattung Bacillus und insbesondere der als B. thuringiensis bekannten Spezies ist. Der Ausdruck "DNA-Segment" umfasst auch DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente und auch rekombinante Vektoren einschließlich zum Beispiel Plasmiden, Cosmiden, Phagemiden, Phagen, Viren und dergleichen.
Ähnlich bezieht sich ein "DNA-Segment, das ein isoliertes oder gereinigtes Kristallprotein-codierendes Gen umfasst," auf ein DNA-Segment, das außer den peptidcodierenden Sequenzen noch bestimmte andere Elemente enthalten kann, wie regulatorische Sequenzen, die im Wesentlichen weg von anderen natürlich vorkommenden Genen oder proteincodierenden Sequenzen isoliert sind. In dieser Hinsicht wird der Ausdruck "Gen" der Einfachheit halber verwendet, um eine funktionelle protein-, polypeptid- oder peptidcodierende Einheit zu bezeich nen. Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass dieser funktionelle Ausdruck nicht nur genomische Sequenzen einschließlich extrachromosomaler DNA-Sequenzen, sondern auch Operatorsequenzen und/oder gentechnisch erzeugte Gensegmente umfasst, die Proteine, Polypeptide oder Peptide exprimieren oder so angepasst werden können, dass sie welche exprimieren.
"Im Wesentlichen weg von anderen codierenden Sequenzen isoliert" bedeutet, dass das interessierende Gen, in diesem Fall ein Gen, das ein bakterielles Kristallprotein codiert, den maßgeblichen Teil des codierenden Bereichs des DNA-Segments bildet und dass das DNA-Segment keine großen Teile von natürlich vorkommender codierender DNA, wie große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder operoncodierende Bereiche, enthält. Selbstverständlich bezieht sich dies auf das DNA-Segment in der Form, wie es ursprünglich isoliert wurde, und schließt keine Gene, rekombinanten Gene, synthetischen Linker oder codierenden Bereiche aus, die später von Menschenhand zu dem Segment hinzugefügt wurden.
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die DNA-Sequenzen umfassen, welche ein Cry-Protein oder Peptidspezies codieren, die innerhalb ihrer Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz umfassen, die im Wesentlichen SEQ ID Nr. 2 entspricht. Besonders bevorzugt umfasst die DNA-Sequenz eine Nucleinsäuresequenz, die ein Cry-Protein oder eine Peptidspezies codiert, die innerhalb ihrer Aminosäuresequenz eine wenigstens zehn Aminosäuren lange zusammenhängende Sequenz von SEQ ID Nr. 2 umfassen.
Der Ausdruck "eine Sequenz im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 2 dargelegt" bedeutet, dass die Sequenz im Wesentlichen einem Teil der Sequenz von SEQ ID Nr. 2 entspricht und relativ wenige Aminosäuren aufweist, die mit den Aminosäuren einer dieser Sequenzen nicht identisch oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon sind. Der Ausdruck "biologisch funktionelles Äquivalent" wird in der Technik wohlverstanden und wird hier ausführlich näher definiert (siehe z.B. den Abschnitt "Beispielhafte Ausführungsformen"). Dementsprechend sind Sequenzen, die zwischen etwa 70% und etwa 80% oder vorzugsweise zwischen etwa 81% und etwa 90% oder besonders bevorzugt zwischen etwa 91% und etwa 99% Aminosäure-Sequenzidentität oder funktionelle Äquivalenz mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweisen, Sequenzen, die "im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 2 dargelegt" sind.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen auch zusätzliche Reste enthalten können, wie zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5'- oder 3'-Sequenzen, und dennoch immer noch im Wesentlichen wie in einer der hier offenbarten Sequenzen dargelegt sind, solange die Sequenz die oben dargelegten Kriterien erfüllt, einschließlich der Beibehaltung der biologischen Proteinaktivität, soweit die Proteinexpression betroffen ist. Das Hinzufügen von terminalen Sequenzen gilt insbesondere für Nucleinsäuresequenzen, die zum Beispiel verschiedene nichtcodierende Sequenzen enthalten können, die entweder den 5'- oder den 3'-Teil des codierenden Bereichs flankieren, oder verschiedene interne Sequenzen enthalten können, d.h. Introns, die bekanntermaßen innerhalb von Genen vorkommen.
Die Nucleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung können unabhängig von der Länge der codierenden Sequenz selbst mit anderen DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymstellen, multiplen Klonierungsstellen, anderen codierenden Segmenten und dergleichen, kombiniert werden, so dass ihre Gesamtlänge beträchtlich variieren kann. Es wird daher in Betracht gezogen, dass ein Nucleinsäurefragment von fast beliebiger Länge eingesetzt werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Leichtigkeit der Herstellung und Verwendung in der vorgesehenen Vorschrift für rekombinante DNA eingeschränkt ist. Zum Beispiel können Nucleinsäurefragmente hergestellt werden, die ein kurzes zusammenhängendes Stück enthalten, das die gesamte oder einen Teil der in SEQ ID Nr. 2 offenbarten Peptidsequenz codiert, oder die mit DNA-Sequenzen, die das in SEQ ID Nr. 2 offenbarte Peptid codieren, und insbesondere dem in SEQ ID Nr. 1 offenbarten DNA-Segment identisch oder dazu komplementär sind. Zum Beispiel gelten DNA-Sequenzen wie etwa 14 Nucleotide mit einer Länge von bis zu etwa 10 000, etwa 5000, etwa 3000, etwa 2000, etwa 1000, etwa 500, etwa 200, etwa 100, etwa 50 und etwa 14 Basenpaaren (einschließlich aller dazwischenliegenden Längen) ebenfalls als geeignet.
Man wird ohne weiteres verstehen, dass "dazwischenliegende Längen" in diesem Zusammenhang eine beliebige Länge zwischen den angegebenen Bereichen bedeutet, wie 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 usw.; 21, 22, 23 usw.; 30, 31, 32 usw.; 50, 51, 52, 53 usw.; 100, 101, 102, 103 usw.; 150, 151, 152, 153 usw.; einschließlich aller ganzen Zahlen in den Bereichen von 200-500; 500-1000; 1000-2000; 2000-3000; 3000-5000 und bis zu einschließlich Sequenzen von etwa 10 000 Nucleotiden und dergleichen.
Man wird sich auch darüber im Klaren sein, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen Nucleinsäuresequenzen beschränkt ist, die Peptide der vorliegenden Erfindung codieren oder die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 codieren, einschließlich der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 besonders offenbart ist. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können daher verschiedentlich die polypeptidcodierenden Bereiche selbst, codierende Bereiche, die ausgewählte Veränderungen oder Modifikationen im grundlegenden codierenden Bereich tragen, beinhalten, oder sie können größere Polypeptide codieren, die dennoch diese polypeptidcodierenden Bereiche enthalten, oder sie können biologisch funktionelle äquivalente Proteine oder Peptide codieren, die abweichende Aminosäuresequenzen haben.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen biologisch funktionelle äquivalente Peptide. Solche Sequenzen können als Folge einer Codon-Redundanz und einer funktionellen Äquivalenz entstehen, von denen bekannt ist, dass sie natürlicherweise innerhalb von Nucleinsäuresequenzen und den so codierten Proteinen auftreten. Alternativ dazu können funktionell äquivalente Proteine oder Peptide auch durch Anwendung von DNA-Rekombinationstechnik geschaffen werden, wobei Änderungen der Proteinstruktur eingeführt werden können, und zwar auf der Grundlage von Betrachtungen der Eigenschaften der ausgetauschten Aminosäuren. Vom Menschen gestaltete Änderungen können durch die Anwendung von Techniken der ortsspezifischen Mutagenese eingeführt werden, z.B. zur Einführung von Verbesserungen der Antigenität des Proteins oder zum Testen von Mutanten, um deren Aktivität auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Falls gewünscht, kann man auch Fusionsproteine und -peptide herstellen, z.B. wenn die peptidcodierenden Bereiche innerhalb derselben Expressionseinheit mit anderen Proteinen oder Peptiden, die gewünschte Funktionen aufweisen, ausgerichtet sind, wie etwa für Reinigungs- oder Immunnachweiszwecke (z.B. Proteine, die durch Affinitätschromatographie gereinigt werden können, bzw. Enzymmarker codierende Bereiche).
Rekombinante Vektoren bilden weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung. Als besonders gut geeignete Vektoren gelten diejenigen Vektoren, bei denen der codierende Teil des DNA-Segments, ob er ein Protein voller Länge oder ein kleineres Peptid codiert, unter der Kontrolle eines Promotors positioniert ist. Der Promotor kann in Form des Promotors vorliegen, der natürlicherweise mit einem Gen vergesellschaftet ist, das Peptide der vorliegenden Erfindung codiert, wie man ihn erhalten kann, indem man die 5'-nichtcodierenden Sequenzen isoliert, die sich stromaufwärts des codierenden Segments oder Exons befinden, wobei man zum Beispiel rekombinantes Klonen und/oder PCR^TM-Technik in Verbindung mit den hier offenbarten Zusammensetzungen verwendet.
2.2 DNA-Segmente als Hybridisierungssonden und Primer
Außer ihrer Verwendung zur Anleitung der Expression von Kristallproteinen oder Peptiden der vorliegenden Erfindung haben die hier beschriebenen Nucleinsäuresequenzen auch eine Vielzahl von anderen Verwendungen. Zum Beispiel sind sie auch nützlich als Sonden oder Primer bei Ausführungsformen der Nucleinsäurehybridisierung. Dabei wird in Betracht gezogen, dass Nucleinsäuresegmente, die einen Sequenzbereich umfassen, der aus wenigstens einer 14 Nucleotiden langen zusammenhängenden Sequenz besteht, die dieselbe Sequenz hat wie ein 14 Nucleotide langes zusammenhängendes DNA-Segment von SEQ ID Nr. 1 oder dazu komplementär ist, von besonderem Nutzen sind. Längere zusammenhän gende identische oder komplementäre Sequenzen, z.B. solche von etwa 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10 000 usw. bp (einschließlich aller dazwischenliegenden Längen und bis zu einschließlich der vollen Länge der Sequenzen), werden in bestimmten Ausführungsformen ebenfalls von Nutzen sein.
Aufgrund der Fähigkeit solcher Nucleinsäuresonden, spezifisch mit Kristallprotein-codierenden Sequenzen zu hybridisieren, sind sie beim Nachweis der Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe von Nutzen. Es werden jedoch auch andere Verwendungen ins Auge gefasst, einschließlich der Verwendung der Sequenzinformation für die Herstellung von Primern einer mutanten Spezies oder Primern zur Verwendung bei der Herstellung anderer genetischer Konstrukte.
Nucleinsäuremoleküle mit Sequenzbereichen, die aus zusammenhängenden Nucleotidstücken von 10-14, 15-20, 30, 50 oder sogar 100-200 oder mehr Nucleotiden bestehen, welche mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 identisch oder dazu komplementär sind, werden insbesondere als Hybridisierungssonden zur Verwendung z.B. im Southern- und Northern-Blotting in Betracht gezogen. Kleinere Fragmente werden im Allgemeinen Verwendung in Hybridisierungsausführungsformen finden, wobei die Länge des zusammenhängenden komplementären Bereichs variiert werden kann, wie zwischen etwa 10-14 und etwa 100 oder 200 Nucleotiden, aber je nach der Länge der komplementären Sequenzen, die man nachweisen möchte, können auch größere zusammenhängende komplementäre Bereiche verwendet werden.
Die Verwendung einer Hybridisierungssonde mit einer Länge von etwa 14 Nucleotiden ermöglicht die Bildung eines Duplexmoleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, die zusammenhängende komplementäre Sequenzen über Bereiche mit einer Länge von mehr als 14 Basen umfassen, werden im Allgemeinen bevorzugt, doch um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und den Grad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern, bevorzugt man im Allgemeinen die Gestaltung von Nucleinsäuremolekülen mit genkomplementären Abschnitten von 15 bis 20 zusammenhängenden Nucleotiden oder noch länger, wenn man dies wünscht.
Selbstverständlich können Fragmente auch mit anderen Techniken erhalten werden, wie z.B. durch mechanische Scherkräfte oder durch Abbau mit Restriktionsenzymen. Kleine Nucleinsäuresegmente oder -fragmente können leicht hergestellt werden, zum Beispiel durch direktes Synthetisieren des Fragments mit chemischen Mitteln, wie es bei Verwendung eines automatischen Oligonucleotid-Synthesizers üblicherweise praktiziert wird. Außerdem können auch durch Anwendung von Nucleinsäure-Reproduktionstechnik, wie der PCR^TM-Technik der US-Patente 4,683,195 und 4,683,202, indem man ausgewählte Sequenzen in rekombinante Vektoren für die rekombinante Produktion einführt, und durch andere DNA-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannt sind, Fragmente erhalten werden.
Dementsprechend können die Nucleotidsequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Stücken von DNA-Fragmenten zu bilden. Je nach der beabsichtigten Anwendung möchte man unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen verwenden, um verschiedene Grade der Selektivität der Sonde gegenüber der Zielsequenz zu erreichen. Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, möchte man für die Bildung der Hybride typischerweise relativ stringente Bedingungen einsetzen. Zum Beispiel wird man Bedingungen mit relativ niedrigem Salzgehalt und/oder hoher Temperatur auswählen, wie etwa 0,02 M bis 0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50 °C bis 70 °C. Solche selektiven Bedingungen tolerieren wenn überhaupt nur wenig Fehlpaarungen zwischen der Sonde und dem Matrizen- oder Zielstrang und wären insbesondere für die Isolierung von DNA-Segmenten, die Kristallprotein codieren, geeignet. Der Nachweis von DNA-Segmenten über Hybridisierung ist dem Fachmann wohlbekannt, und die Lehren der US-Patente 4,965,188 und 5,176,995 sind beispielhaft für die Verfahren der Hybridisierungsanalyse. Lehren, wie man sie in den Texten von Maloy et al., 1994, Segal, 1976, Prokop, 1991 und Kuby, 1994 findet, sind besonders relevant.
Bei manchen Anwendungen, zum Beispiel wenn man Mutanten herstellen möchte, indem man einen mutanten Primerstrang einsetzt, der mit einer zugrundeliegenden Matrize hybridisiert ist, oder wenn man Kristallproteincodierende Sequenzen von verwandten Spezies, funktionelle Äquivalente oder dergleichen isolieren möchte, werden typischerweise weniger stringente Hybridisierungsbedingungen benötigt, um die Bildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Umständen möchte man vielleicht Bedingungen einsetzen wie solche, bei denen etwa 0,15 M bis 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 °C bis 55 °C eingesetzt wird. Dadurch können kreuzhybridisierende Spezies leicht als positiv hybridisierende Signale in Bezug auf Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. In jedem Fall ist man sich allgemein darüber im Klaren, dass Bedingungen durch die Zugabe steigender Mengen an Formamid, das dazu dient, den Hybridduplex in derselben Weise wie eine erhöhte Temperatur zu destabilisieren, stringenter gemacht werden können. Die Hybridisierungsbedingungen können also leicht manipuliert werden, und die Methode der Wahl wird also im Allgemeinen von den gewünschten Ergebnissen abhängen.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie einem Marker, zur Bestimmung der Hybridisierung einzusetzen. Eine Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind in der Technik bekannt, einschließlich fluoreszierender, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie Avidin/Biotin, die ein nachweisbares Signal erzeugen können. In bevorzugten Ausführungsformen möchte man wahrscheinlich einen Fluoreszenzmarker oder Enzymmarker, wie Urease, Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstelle von radioaktiven oder anderen umweltunverträglichen Reagentien einsetzen. Im Falle von Enzymmarkern sind kolorimetrische Indikatorsubstanzen bekannt, die eingesetzt werden können, um ein Mittel zu erhalten, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um die spezifische Hybridisierung mit Proben, die komplementäre Nucleinsäuren enthalten, zu identifizieren.
Im Allgemeinen wird in Betracht gezogen, dass die hier beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagentien in der Lösungshybridisierung als auch in Ausführungsformen, bei denen eine feste Phase eingesetzt wird, geeignet sein werden. Bei Ausführungsformen, die eine feste Phase beinhalten, wird die Test-DNA (oder RNA) auf einer ausgewählten Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder in sonstiger Weise fixiert. Diese fixierte, einzelsträngige Nucleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen hängen von den besonderen Umständen auf der Grundlage der besonderen erforderlichen Kriterien ab (die zum Beispiel vom Gehalt an G+C, der Art der Zielnucleinsäure, der Nucleinsäurequelle oder der Größe der Hybridisierungssonde abhängen). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um unspezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mittels eines Markers nachgewiesen oder sogar quantifiziert.
2.3 Rekombinante Vektoren und Proteinexpression
Die Erfindung offenbart und beansprucht auch eine Zusammensetzung, die ein CryET29-Kristallprotein umfasst. Die Zusammensetzung kann bakterielle Wirtszellen, die ein CryET29-Kristallprotein exprimieren, Einschlusskörper oder Kristalle, die das CryET29-Protein enthalten, Kulturüberstand, lysierte Zellen, Zellextrakte, Lysate, Homogenisate und dergleichen umfassen. Die Zusammensetzungen können in wässriger Form oder alternativ dazu in trockener, halbtrockener oder ähnlicher Form, wie als Zellpaste, Zellkuchen oder alternativ dazu gefriergetrocknet, pulverisiert, lyophilisiert, eingedampft oder in einer anderen, ähnlich hergestellten trockenen Form vorliegen. Solche Mittel zur Herstellung von Kristallproteinen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Isolierung und Reinigung bakterieller Proteine wohlbekannt. In bestimmten Ausführungsformen können die Kristallproteine gereinigt, konzentriert, mit anderen Reagentien gemischt oder zu einer gewünschten endgültigen Form verarbeitet werden. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung etwa 1 bis etwa 90 Gew.-% des Kristallproteins und besonders bevorzugt etwa 5 bis etwa 50 Gew.-%.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Kristallproteinzusammensetzungen der Erfindung durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Schritte des Kultivierens einer Bacillus-thuringiensis-Zelle, die ein CryET29-Kristallprotein exprimiert, unter Bedingungen, die die Produktion eines solchen Proteins bewirken, und dann das Gewinnen des Proteins aus der Zelle umfasst. Das Gewinnen eines solchen Kristallproteins kann weiterhin das Reinigen, Konzentrieren, Verarbeiten oder Mischen des Proteins mit einem oder mehreren Reagentien beinhalten. Vorzugsweise wird das CryET29-Kristallprotein in einer Menge von etwa 1 bis etwa 90 Gew.-% und besonders bevorzugt etwa 5 bis etwa 50 Gew.-% erhalten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer CryET29-Kristallprotein-Zusammensetzung. Ein solches Verfahren beinhaltet im Allgemeinen die Schritte des Kultivierens einer Bacillus-thuringiensis-Zelle, die ein CryET29-Kristallprotein exprimiert, unter Bedingungen, die die Produktion des Proteins bewirken, und dann das Gewinnen des so produzierten Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bacillus-thuringiensis-Zelle eine NRRL-B-21582-Zelle oder eine beliebige Bacillus-thuringiensis-Zelle, die ein cryET29-Gensegment enthält. Alternativ dazu können die rekombinanten Plasmidvektoren der Erfindung auch verwendet werden, um andere geeignete bakterielle oder eukaryontische Zellen so zu transformieren, dass sie das Kristallprotein der Erfindung produzieren. Prokaryontische Wirtszellen, zu denen Gram-negative Zellen, wie E. coli, Pseudomonas spp. und verwandte Enterobacteraceae, oder Gram-positive Zellen, wie Bacillus spp. (einschließlich B. megaterium, B. subtilis und B. thuringiensis) und dergleichen, gehören, gelten alle als geeignet bei der Herstellung der Kristallproteine der Erfindung.
In solchen Ausführungsformen wird in Betracht gezogen, dass bestimmte Vorteile gewonnen werden, indem man das codierende DNA-Segment unter die Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors stellt. Der hier verwendete Ausdruck "rekombinanter oder heterologer Promotor" soll sich auf einen Promotor beziehen, der in seiner natürlichen Umgebung normalerweise nicht mit einem DNA-Segment vergesellschaftet ist, das ein Kristallprotein oder -peptid codiert. Solche Promotoren können Promotoren, die normalerweise mit anderen Genen vergesellschaftet sind, und/oder Promotoren, die aus irgendeiner Bakterienzelle, einem Virus, einer Eukaryonten- oder Pflanzenzelle isoliert wurden, umfassen. Natürlich ist es wichtig, einen Promotor einzusetzen, der die Expression des DNA-Segments in dem für die Expression gewählten Zelltyp, Organismus oder sogar Tier effektiv anleitet. Die Verwendung von Kombinationen aus Promotor und Zelltyp für die Proteinexpression ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannt, siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989. Die eingesetzten Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein, und sie können unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um eine Expression des eingeführten DNA-Segments auf hohem Niveau anzuleiten, wie es bei der Produktion von rekombinanten Proteinen oder Peptiden in großem Maßstab vorteilhaft ist. Zu den geeigneten Promotorsystemen, die für die Verwendung bei der Expression auf hohem Niveau in Frage kommen, gehört unter anderem das Pichia-Expressionsvektorsystem (Pharmacia LKB Biotechnology).
In Verbindung mit Expressionsausführungsformen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen und Peptiden wird in Betracht gezogen, dass längere DNA-Segmente am häufigsten verwendet werden, wobei DNA-Segmente, die die gesamte Peptidsequenz codieren, am meisten bevorzugt sind. Man wird sich jedoch darüber im Klaren sein, dass die Verwendung von kürzeren DNA-Segmenten zur Anleitung der Expression von Kristallpeptiden oder epitopischen Kernbereichen, wie sie zur Erzeugung von Anti-Kristallprotein-Antikörpern verwendet werden können, ebenfalls in den Umfang der Erfindung fällt. DNA-Segmente, die Peptidantigene mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 50 Aminosäuren oder vorzugsweise mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 30 Aminosäuren oder besonders bevorzugt mit einer Länge von etwa 3 bis etwa 20 Aminosäuren codieren, gelten als besonders gut geeignet. Solche Peptidepitope können Aminosäuresequenzen sein, die eine zusammenhängende Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 2 umfassen.
2.4 Kristallprotein-Transgene und transgene Wirtszellen
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zelle und insbesondere einer Pflanzen- oder Tierzelle bereit, die ein Nucleinsäuresegment exprimiert, das das neue CryET29-Kristallprotein der vorliegenden Erfindung codiert. Das Verfahren zur Herstellung von transgenen Zellen ist in der Technik wohlbekannt. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren das Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNA-Segment, das einen Promotor enthält, der funktionell mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, der ein B.-thuringiensis-CryET29-Kristallprotein codiert. Ein solcher codierender Bereich ist im Allgemeinen funktionell mit einem Transcriptionsterminationsbereich verknüpft, wodurch der Promotor in der Lage ist, die Transcription des codierenden Bereichs in der Zelle anzutreiben und somit der Zelle die Fähigkeit zu geben, das rekombinante Protein in vivo zu produzieren. Alternativ dazu sorgt die Erfindung in Fällen, bei denen es wünschenswert ist, die Menge eines besonderen rekombinanten Kristallproteins, das in einer besonderen transgenen Zelle exprimiert wird, zu steuern, zu regulieren oder zu senken, auch für die Expression von Kristallprotein-Antisense-mRNA. Die Verwendung von Antisense-mRNA als Mittel zur Steuerung oder Senkung der Menge eines gegebenen interessierenden Proteins in einer Zelle ist in der Technik wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuresegment der Erfindung transformiert ist und die ein Gen oder Gensegment exprimiert, das wenigstens eine oder mehrere der neuen hier offenbarten Polypeptidzusammensetzungen codiert. Der hier verwendete Ausdruck "transgene Pflanzenzelle" soll eine Pflanzenzelle bezeichnen, in die DNA-Sequenzen eingebaut sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gene, die vielleicht normalerweise nicht vorhanden sind, DNA-Sequenzen, die normalerweise nicht zu RNA transcribiert oder zu einem Protein translatiert ("exprimiert") werden, oder irgendwelche anderen Gene oder DNA-Sequenzen, die man in die nichttransformierte Pflanze einführen möchte, wie Gene, die normalerweise in der nichttransformierten Pflanze vorhanden sein können, die man aber entweder gentechnisch verändern oder mit einer geänderten Expression versehen möchte.
Es wird in Betracht gezogen, dass das Genom einer transgenen Pflanze der vorliegenden Erfindung in manchen Fällen durch die stabile Einführung eines cryET29-Transgens, entweder natives cryET29 oder synthetisch modifiziertes oder mutiertes cryET29, erweitert wird. In manchen Fällen wird mehr als ein Transgen in das Genom der transformierten Wirtspflanzenzelle eingebaut. Dies ist dann der Fall, wenn mehr als ein Kristallprotein-codierendes DNA-Segment in das Genom einer solchen Pflanze eingebaut wird. In bestimmten Situationen kann es wünschenswert sein, dass ein, zwei, drei, vier oder noch mehr B.-thuringiensis-Kristallproteine (entweder nativ oder rekombinant verändert) in die transformierte transgene Pflanze eingebaut und stabil exprimiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen führt die Einführung des Transgens in das Genom der Pflanzenzelle zu einer stabilen Integration, wobei die Nachkommen solcher Pflanzen ebenfalls eine Kopie des Transgens in ihrem Genom enthalten. Die Vererbbarkeit dieses genetischen Elements durch die Nachkommen der Pflanze, in die das Gen ursprünglich eingeführt wurde, ist ein bevorzugter Aspekt dieser Erfindung.
Ein bevorzugtes Gen, das eingeführt werden kann, umfasst zum Beispiel eine Kristallprotein-codierende DNA-Sequenz bakteriellen Ursprungs und insbesondere eine oder mehrere der hier beschriebenen, die von Bacillus spp. erhalten werden. In hohem Maße bevorzugte Nucleinsäuresequenzen sind solche, die von B. thuringiensis erhalten werden, oder eine der Sequenzen, die genetisch so verändert wurden, dass die insektizide Aktivität des Kristallproteins in einer solchen transformierten Wirtszelle abnimmt oder zunimmt.
Mittel zum Transformieren einer Pflanzenzelle und zur Herstellung einer transgenen Zelllinie sind in der Technik wohlbekannt (zum Beispiel aus den US-Patenten 5,550,318, 5,508,468, 5,482,852, 5,384,253, 5,276,269 und 5,225,341) und werden hier kurz diskutiert, Vektoren, Plasmide, Cosmide, YACs (künstliche Hefechromosomen) und DNA-Segmente zur Verwendung bei der Transformation solcher Zellen umfassen natürlich im Allgemeinen entweder die Operons, Gene oder von Genen abgeleiteten Sequenzen der vorliegenden Erfindung, entweder nativ oder synthetisch abgeleitet, und insbesondere solche, die die offenbarten Kristallproteine codieren. Diese DNA-Konstrukte können weiterhin Strukturen wie Promotoren, Enhancer, Polylinker oder auch Gensequenzen, die nach Wunsch eine positiv oder negativ regulierende Wirkung auf die besonderen interessierenden Gene haben, beinhalten. Das DNA-Segment oder Gen kann entweder ein natives oder modifiziertes Kristallprotein codieren, das in den resultierenden rekombinanten Zellen exprimiert wird und/oder das der regenerierten Pflanze einen verbesserten Phänotyp verleiht.
Solche transgenen Pflanzen können wünschenswert sein, um die insektizide Resistenz einer Einkeimblättrigen oder Zweikeimblättrigen Pflanze zu erhöhen, indem man in eine solche Pflanze ein transgenes DNA-Segment einbaut, das ein CryET29-Kristallprotein codiert, das für ein Coleoptera-Insekt toxisch ist. Zu den besonders bevorzugten Pflanzen gehören Mais, Weizen, Sojabohnen, Rasengräser, Zierpflanzen, Obstbäume, Sträucher, Gemüse, Korn, Leguminosen und dergleichen oder jede Pflanze, bei der die Einführung eines Kristallprotein-Transgens gewünscht wird.
In einem verwandten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Samen, der von der transformierten Pflanze erzeugt wurde, die Nachkommenschaft eines solchen Samens sowie einen Samen, der von der Nachkommenschaft der ursprünglichen, nach dem obigen Verfahren hergestellten transgenen Pflanze erzeugt wurde. Diese Nachkommenschaft und die Samen weisen ein Kristallprotein-Transgen auf, das stabil in ihr Genom eingebaut ist, und diese Nachkommenpflanzen erben die Eigenschaften, die durch die Einführung eines stabilen Transgens erzielt wurden, in Mendelscher Weise. Alle solchen transgenen Pflanzen, in deren Genom transgene DNA-Segmente eingebaut sind, die ein CryET29-Kristallprotein oder -Polypeptid codieren, sind Aspekte dieser Erfindung.
2.5 Ortsspezifische Mutagenese
Insbesondere die ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, die für die Herstellung von individuellen Peptiden oder biologisch funktionellen äquivalenten Proteinen oder Peptiden durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA geeignet ist. Die Technik liefert weiterhin eine gute Möglichkeit, um Sequenzvarianten unter Einbezug von einer oder mehreren der obigen Überlegungen herzustellen und zu testen, indem man eine oder mehrere Änderungen der Nucleotidsequenz in die DNA einführt. Die ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von Mutanten durch die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie eine ausreichende Anzahl von benachbarten Nucleotiden codieren, so dass man eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität erhält, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der überquerten Deletionsverknüpfung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 17 bis etwa 75 Nucleotiden oder mehr bevorzugt, wobei etwa 10 bis etwa 25 oder mehr Reste auf beiden Seiten der Verknüpfung der Sequenz verändert sind.
Im Allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese in der Technik wohlbekannt, wie durch verschiedene Publikationen beispielhaft belegt wird. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass bei dieser Technik typischerweise ein Phagenvektor eingesetzt wird, der sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form existiert. Zu den typischen Vektoren, die für die ortsspezifische Mutagenese geeignet sind, gehören Vektoren wie der M13-Phage. Diese Phagen sind kommerziell leicht erhältlich, und ihre Verwendung ist dem Fachmann im Allgemeinen wohlbekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenfalls routinemäßig bei der ortsspezifischen Mutagenese eingesetzt, wodurch der Schritt der Übertragung des interessierenden Gens von einem Plasmiden auf einen Phagen weggelassen werden kann.
Im Allgemeinen wird die im Einklang damit erfolgende ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, indem man zuerst einen einzelsträngigen Vektor erhält oder zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA- Sequenz enthält, die das gewünschte Peptid codiert, auseinanderschmilzt. Ein Oligonucleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, im Allgemeinen synthetisch. Dann wird dieser Primer mit dem einzelsträngigen Vektor assoziiert und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie dem Klenow-Fragment der E.-coli-Polymerase I, ausgesetzt, um die Synthese des mutationstragenden Strangs zu beenden. So entsteht ein Heteroduplex, wobei ein Strang die ursprüngliche unmutierte Sequenz codiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dann wird dieser Heteroduplexvektor verwendet, um geeignete Zellen, wie E.-coli-Zellen, zu transformieren oder zu transfizieren, und Klone, die rekombinante Vektoren enthalten, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen, werden ausgewählt. Ein genetisches Selektionsschema wurde von Kunkel et al. (1987) entworfen, um Klone anzureichern, die das mutagene Oligonucleotid enthalten. Alternativ dazu kann auch die Verwendung von PCR^TM mit kommerziell erhältlichen thermostabilen Enzymen, wie Taq-Polymerase, verwendet werden, um einen mutagenen Oligonucleotidprimer in ein amplifiziertes DNA-Fragment einzubauen, das dann in einen geeigneten Klonierungs- oder Expressionsvektor kloniert werden kann. Die PCR^TM-vermittelten Mutageneseverfahren von Tomic et al. (1990) und Upender et al. (1995) liefern zwei Beispiele für solche Vorschriften. Eine PCR^TM, bei der neben einer thermostabilen Polymerase auch eine thermostabile Ligase eingesetzt wird, kann ebenfalls verwendet werden, um ein phosphoryliertes mutagenes Oligonucleotid in das amplifizierte DNA-Fragment einzubauen, das dann in einen geeigneten Klonierungs- oder Expressionsvektor kloniert werden kann. Das von Michael (1994) beschriebene Mutageneseverfahren liefert ein Beispiel für eine solche Vorschrift.
Die Herstellung von Sequenzvarianten der ausgewählten peptidcodierenden DNA-Segmente unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese wird als Mittel zur Herstellung von potentiell nützlichen Spezies angegeben und ist nicht als Einschränkung gemeint, da es auch andere Methoden gibt, mit denen Sequenzvarianten von Peptiden und den diese codierenden DNA-Sequenzen erhalten werden können. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren, die die gewünschte Sequenz codieren, mit mutagenen Mitteln, wie Hydroxylamin, behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid-gesteuertes Mutageneseverfahren" bezieht sich auf matrizenabhängige Verfahren und vektorvermittelte Vermehrung, die zu einer Erhöhung der Konzentration eines speziellen Nucleinsäuremoleküls relativ zu seiner Anfangskonzentration oder zu einer Erhöhung der Konzentration eines nachweisbaren Signals, wie Amplifikation, führen. Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid-gesteuertes Mutageneseverfahren" soll sich auch auf ein Verfahren beziehen, das die matrizenabhängige Verlängerung eines Primermoleküls beinhaltet. Der Ausdruck "matrizenabhängiger Vorgang" bezieht sich auf die Nucleinsäuresynthese eines RNA- oder DNA-Moleküls, wobei die Sequenz des neu synthetisierten Nucleinsäurestrangs durch die wohlbekannten Regeln der komplementären Basenpaarung (siehe zum Beispiel Watson, 1987) festgelegt wird. Typischerweise beinhalten vektorvermittelte Methoden die Einführung des Nucleinsäurefragments in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifikation des Vektors und die Gewinnung des amplifizierten Nucleinsäurefragments. Beispiele für solche Methoden sind im US-Patent Nr. 4,237,224 angegeben.
Mehrere matrizenabhängige Verfahren sind verfügbar, um die interessierenden Zielsequenzen, die in einer Probe vorhanden sind, zu amplifizieren. Eines der am besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR^TM), die im Einzelnen in den US-Patenten Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben ist. Kurz gesagt, bei der PCR^TM werden zwei Primersequenzen hergestellt, die komplementär zu Bereichen auf entgegengesetzten komplementären Strängen der Zielsequenz sind. Ein Überschuss an Desoxynucleosidtriphosphaten wird zusammen mit einer DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase) zu einem Reaktionsgemisch gegeben. Wenn die Zielsequenz in einer Probe vorhanden ist, binden die Primer an das Ziel, und die Polymerase bewirkt, dass die Primer durch Hinzufügen von Nucleotiden entlang der Zielsequenz verlängert werden. Durch Anheben und Absenken der Temperatur des Reaktionsgemischs dissoziieren die verlängerten Primer vom Ziel unter Bildung von Reaktionsprodukten, überschüssige Primer binden an das Ziel und an die Reaktionsprodukte, und der Vorgang wird wiederholt. Vorzugsweise kann ein Reverse-Transcriptase-PCR^TM-Amplifikationsverfahren durchgeführt werden, um die Menge der amplifizierten mRNA zu quantifizieren. Methoden der Polymerase-Kettenreaktion sind in der Technik wohlbekannt. Ein anderes Verfahren zur Amplifikation ist die Ligase-Kettenreaktion (als LCR bezeichnet), die in EP-A-320 308 offenbart ist. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, und in Gegenwart der Zielsequenz bindet jedes Paar an entgegengesetzte komplementäre Stränge des Ziels, so dass sie aneinanderstoßen. In Gegenwart einer Ligase verbinden sich die beiden Sondenpaare unter Bildung einer einzigen Einheit. Durch Temperaturwechsel wie bei der PCR^TM dissoziieren gebundene ligierte Einheiten vom Ziel ab und dienen dann als "Zielsequenzen" für die Ligierung von überschüssigen Sondenpaaren. Das US-Patent Nr. 4,883,750 beschreibt ein alternatives Verfahren der Amplifikation, das der LCR ähnlich ist, zur Bindung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz.
Qbeta-Replicase, die in WO 87/06270 beschrieben wird, kann in der vorliegenden Erfindung ebenfalls als weiteres Amplifikationsverfahren verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die einen Bereich aufweist, der zu demjenigen eines Ziels komplementär ist, in Gegenwart einer RNA-Polymerase zu einer Probe gegeben. Die Polymerase kopiert die replikative Sequenz, die dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermes Amplifikationsverfahren, bei dem Restriktionsendonucleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, welche Nucleotid-5'-[α-thio]triphosphate in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten (Walker et al., 1992), kann ebenfalls für die Amplifikation von Nucleinsäuren in der vorliegenden Erfindung geeignet sein.
Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ist ein weiteres Verfahren zur Durchführung einer isothermen Amplifikation von Nucleinsäuren, das mehrere Durchläufe von Strangverdrängung und Synthese, d.h. Nick-Translation, beinhaltet. Ein ähnliches Verfahren, das Reparatur-Kettenreaktion (RCR) genannt wird, ist ein weiteres Amplifikationsverfahren, das für die vorliegende Erfindung geeignet sein kann und das die Assoziation mehrerer Sonden über einen ganzen Bereich, der für die Amplifikation vorgesehen ist, mit anschließender Reparaturreaktion beinhaltet, wobei nur zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen zwei Basen können zum leichten Nachweis als biotinylierte Derivate hinzugefügt werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei der SDA verwendet.
Sequenzen können auch mit Hilfe einer cyclischen Sondenreaktion (CPR) nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Sonde, die 3'- und 5'-Sequenzen von nicht-CryET29-spezifischer DNA und eine Mittelsequenz von CryET29-Protein-spezifischer RNA aufweist, an in einer Probe vorhandene DNA hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNaseH behandelt, und die Produkte der Sonde werden als unterscheidbare Produkte identifiziert, die ein Signal erzeugen und nach der Verdauung freigesetzt werden. Die ursprüngliche Matrize wird an eine andere Cyclisierungssonde assoziiert, und die Reaktion wird wiederholt. Die CPR beinhaltet also das Amplifizieren eines Signals, das durch Hybridisierung einer Sonde mit einer cryET29-spezifischen exprimierten Nucleinsäure erzeugt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können noch andere Amplifikationsverfahren verwendet werden, die in GB-A-2 202 328 und in WO 89/09284 beschrieben sind. Bei der ersteren Anmeldung werden "modifizierte" Primer in einer PCR-artigen, matrizen- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markierung mit einer Abfangeinheit (z.B. Biotin) und/oder einer Detektoreinheit (z.B. Enzym) modifiziert sein. Bei der letzteren Anmeldung wird ein Überschuss an markierten Sonden zu einer Probe gegeben. In Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt freigesetzt und durch überschüssige Sonde gebunden. Die Spaltung der markierten Sondensignale signalisiert die Anwesenheit der Zielsequenz.
Weitere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren sind auf Transcription basierende Amplifikationssysteme (TAS) (Kwoh et al., 1989; WO 88/10315); dazu gehören die auf einer Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation (NASBA) und 3SR. Bei der NASBA können die Nucleinsäuren für die Amplifikation durch Standard-Phenol/Chloroform-Extraktion, Hitzedenaturierung einer Probe, Behandlung mit Lysepuffer und Minispin-Säulen für die Isolierung von DNA und RNA oder Guanidiniumchlorid-Extraktion von RNA vorbereitet werden. Diese Amplifikationstechniken beinhalten die Assoziation eines Primers, der Kristallprotein-spezifische Sequenzen aufweist. Nach der Polymerisation werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H abgebaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut hitzedenaturiert werden. In beiden Fällen wird die einzelsträngige DNA durch Zugabe eines zweiten Kristallprotein-spezifischen Primers vollständig doppelsträngig gemacht, und anschließend erfolgt eine Polymerisation. Dann werden die doppelsträngigen DNA-Moleküle durch eine Polymerase wie T7 oder SP6 mehrfach transcribiert. In einer isothermen cyclischen Reaktion werden die RNAs einer Reversen Transcription zu doppelsträngiger DNA unterzogen und noch einmal mit einer Polymerase, wie T7 oder SP6, transcribiert. Die resultierenden Produkte, ob sie nun verkürzt oder vollständig sind, zeigen Kristallprotein-spezifische Sequenzen an.
EP-A-329 822 offenbart ein Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, das das cyclische Synthetisieren von einzelsträngiger RNA ("ssRNA"), ssRNA und doppelsträngiger DNA (dsDNA) beinhaltet und gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist eine erste Matrize für ein erstes Primer-Oligonucleotid, das durch Reverse Transcriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Dann wird die RNA durch die Einwirkung von Ribonuclease N (RNase H, eine RNase, die für RNA in einem Duplex mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) aus dem resultierenden DNA: RNA-Duplex entfernt. Die resultierende ssDNA ist eine zweite Matrize für einen zweiten Primer, der ebenfalls die Sequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors (zum Beispiel T7-RNA-Polymerase) 5' von seiner Homologie zu seiner Matrize beinhaltet. Dann wird dieser Primer durch DNA-Polymerase (zum Beispiel das große "Klenow"-Fragment von E.-coli-DNA-Polymerase I) verlängert, was zu einem doppelsträngigen DNA-Molekül (dsDNA) führt, das eine Sequenz, die mit derjenigen der ursprünglichen RNA identisch ist, zwischen den Primern und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann von der geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien von der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann wieder in den Kreislauf eintreten, was zu einer sehr raschen Amplifikation führt. Bei einer geeigneten Wahl der Enzyme kann diese Amplifikation isotherm erfolgen, ohne in jedem Zyklus Enzyme hinzuzufügen. Wegen der cyclischen Natur dieses Vorgangs kann die Startsequenz so gewählt werden, dass sie in Form von entweder DNA oder RNA vorliegt.
WO 89/06700 offenbart ein Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsschema auf der Basis der Hybridisierung einer Promotor/Primer-Sequenz mit einer einzelsträngigen Ziel-DNA ("ssDNA") und anschließender Transcription vieler RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht cyclisch, d.h. aus den resultierenden RNA-Transcripten werden keine neuen Matrizen produziert. Weitere Amplifikationsverfahren sind "RACE" (Frohmann, 1990) und "einseitige PCR^TM" (Ohara, 1989), die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Verfahren auf der Basis einer Ligierung von zwei (oder mehr) Oligonucleotiden in Gegenwart einer Nucleinsäure mit der Sequenz des resultierenden "Dioligonucleotids", wodurch das Dioligonucleotid amplifiziert wird (Wu und Dean, 1996), können bei der Amplifikation von DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
2.6 Antikörperzusammensetzungen und Herstellungsverfahren
In besonderen Ausführungsformen ziehen die Erfinder die Verwendung von Antikörpern, entweder monoklonal oder polyklonal, die an die hier offenbarten Kristallproteine binden, in Betracht. Mittel zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind in der Technik wohlbekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, 1988). Die Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) beginnen im Allgemeinen im Wesentlichen genauso wie die zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Kurz gesagt, ein polyklonaler Antikörper wird hergestellt, indem man ein Tier mit einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung immunisiert und Antiseren von dem immunisierten Tier sammelt. Ein weiter Bereich von Tierspezies kann für die Herstellung von Antiseren verwendet werden. Typischerweise ist das für die Produktion von Anti-Antiseren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Wegen des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen ist ein Kaninchen die bevorzugte Wahl für die Produktion von polyklonalen Antikörpern.
Wie in der Technik wohlbekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren. Es ist daher häufig notwendig, das Wirtsimmunsystem anzukurbeln, was durch Kopplung eines Peptid- oder Polypeptid-Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine, wie Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin, können ebenfalls als Träger verwendet werden. Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids mit einem Trägerprotein sind in der Technik wohlbekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bisbiazotiertes Benzidin.
Wie in der Technik ebenfalls wohlbekannt ist, kann die Immunogenität einer bestimmten Immunogenzusammensetzung durch die Verwendung von unspezifischen Stimulatoren der Immunantwort, die als Adjuvantien bekannt sind, verstärkt werden. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien sind Freunds vollständiges Adjuvans (ein unspezifischer Stimulator der Immunantwort, der abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält), Freunds unvollständige Adjuvantien und Aluminiumhydroxid-Adjuvans.
Die bei der Produktion von polyklonalen Antikörpern verwendete Menge der Immunogenzusammensetzung variiert je nach der Natur des Immunogens sowie des für die Immunisierung verwendeten Tiers. Eine Vielzahl von Wegen kann verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion von polyklonalen Antikörpern kann überwacht werden, indem man zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung Blutproben von dem immunisierten Tier entnimmt. Eine zweite Injektion zum Auffrischen kann ebenfalls gegeben werden. Der Vorgang des Auffrischens und Titrierens wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Wenn ein gewünschtes Maß der Immunogenität erhalten wurde, kann das immunisierte Tier ausbluten gelassen und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann verwendet werden, um mAbs zu erzeugen.
mAbs können leicht unter Verwendung von wohlbekannten Techniken hergestellt werden, wie solche, die beispielhaft im US-Patent 4,196,265 genannt sind. Typischerweise beinhaltet diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tiers mit einer ausgewählten Immunogenzusammensetzung, z.B. einem gereinigten oder partiell gereinigten Kristallprotein, Polypeptid oder Peptid. Die immunisierende Zusammensetzung wird so verabreicht, dass eine Stimulation von antikörperproduzierenden Zellen bewirkt wird. Nagetiere, wie Mäuse und Ratten, sind bevorzugte Tiere, doch ist die Verwendung von Kaninchen-, Schaf- oder Froschzellen ebenfalls möglich. Die Verwendung von Ratten kann gewisse Vorteile bringen (Goding, 1986, 5. 60-61), aber Mäuse sind bevorzugt, wobei die BALB/c-Maus am meisten bevorzugt ist, da diese am meisten routinemäßig verwendet wird und im Allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen ergibt.
Nach der Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zur Produktion von Antikörpern, insbesondere B-Lymphocyten (B-Zellen), zur Verwendung in der Vorschrift zur mAb-Erzeugung ausgewählt. Diese Zellen können aus biopsierten Milzen, Mandeln oder Lymphknoten oder aus einer Probe peripheren Bluts erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt, erstere, weil sie eine reiche Quelle für antikörperproduzierende Zellen sind, die sich im teilenden Plasmablastenstadium befinden, und letztere, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist. Häufig wird eine Gruppe von Tieren immunisiert, und die Milz des Tiers mit dem höchsten Antikörpertiter wird entnommen, und die Milzlymphocyten werden durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze erhalten. Typischerweise enthält eine Milz aus einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphocyten.
Dann werden die antikörperproduzierenden B-Lymphocyten aus dem immunisierten Tier mit Zellen einer unsterblichen Myelomzelle fusioniert, das im Allgemeinen von derselben Spezies stammt wie das Tier, das immunisiert wurde. Myelomzelllinien, die zur Verwendung in hybridomerzeugenden Fusionsverfahren geeignet sind, sind vorzugsweise nichtantikörperproduzierend, haben eine hohe Fusionseffizienz und weisen Enzymmängel auf, aufgrund derer sie nicht in bestimmten selektiven Medien wachsen können, die nur das Wachstum der gewünschten fusionierten Zellen (Hybridome) unterstützen.
Es können beliebige von mehreren Myelomzellen verwendet werden, wie sie dem Fachmann bekannt sind (Goding, 5. 65-66, 1986; Campbell, S. 75-83, 1984). Wenn das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man zum Beispiel P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 sowie UC729-6 sind alle in Verbindung mit Humanzellfusionen geeignet.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1-Myelomzelllinie (auch P3-NS-1-Ag4-1 genannt), die vom NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository leicht erhältlich ist, indem man die Zelllinien-Hinterlegungsnummer GM3573 anfordert. Eine andere Maus-Myelomzelllinie, die verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente nichtantikörperproduzierende Maus-Myelom-SP2/0-Zelllinie.
Verfahren zur Erzeugung von Hybriden von antikörperproduzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen gewöhnlich das Mischen von somatischen Zellen mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 2:1, obwohl das Verhältnis von etwa 20:1 bis etwa 1:1 variieren kann, in Gegenwart eines oder mehrerer Mittel (chemisch oder elektrisch), die die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendai-Virus wurden beschrieben (Kohler und Milstein, 1975; 1976), wie auch solche unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG), wie 37 Vol.-% PEG (Gefter et al., 1977). Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist ebenfalls geeignet (Goding, 1986, 5. 71-74).
Fusionsverfahren erzeugen gewöhnlich lebensfähige Hybride in geringen Häufigkeiten, etwa 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Dies stellt jedoch kein Problem dar, da die lebensfähigen fusionierten Hybride durch Kultivieren in einem selektiven Medium von den nicht fusionierten Stammzellen (insbesondere den unfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unbegrenzt weiterteilen würden) unterschieden werden können. Das selektive Medium ist im Allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, welches die de-novo-Synthese von Nucleotiden in den Gewebekulturmedien blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de-novo-Synthese sowohl von Purinen als auch von Pyrimidinen, während Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wenn Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als Quelle für Nucleotide ergänzt (HAT-Medium). Wenn Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die Nucleotid-Wiederverwendungswege beschreiten können, können in HAT-Medium überleben. Den Myelomzellen fehlen entscheidende Enzyme des Wiederverwendungswegs, z.B. Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT), und daher können sie nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Stoffwechselweg beschreiten, aber sie haben in Kultur nur eine begrenzte Lebensdauer und sterben im Allgemeinen innerhalb von etwa zwei Wochen. Daher sind die einzigen Zellen, die in den selektiven Medien überleben können, die Hybride, die aus Myelom- und B-Zellen gebildet wurden.
Diese Kultur ergibt eine Population von Hybridomen, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Typischerweise erfolgt die Auswahl von Hybridomen durch Kultivieren der Zellen durch Einzelklonverdünnung in Mikrotiterplatten, wobei man die einzelnen Klonüberstände anschließend (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität testet. Der Assay sollte empfindlich, einfach und schnell sein, wie Radioimmunassays, Enzymimmunassays, Cytotoxizitätsassays, Plaqueassays, Dot-Immunbindungsassays und dergleichen.
Dann würde man mit den ausgewählten Hybridomen eine Verdünnungsreihe herstellen und sie in einzelnen antikörperproduzierenden Zelllinien klonieren, wobei die Klone dann unbegrenzt vermehrt werden können, um mAbs zu erhalten. Die Zelllinien können mit zwei grundlegenden Methoden in Bezug auf die mAb-Produktion ausgebeutet werden. Eine Probe des Hybridoms kann in ein histokompatibles Tier des Typs, der verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion zu erhalten, injiziert werden (häufig in die Bauchfellhöhle). Das Tier, das die Injektion erhielt, entwickelt Tumoren, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren, der vom fusionierten Zellhybrid produziert wird. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie Serum oder Ascitesflüssigkeit, können dann angezapft werden, um mAbs in hoher Konzentration zu erhalten. Die einzelnen Zelllinien könnten auch in vitro kultiviert werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem sie leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können. Nach beiden Methoden produzierte mAbs können, falls gewünscht, weiter gereinigt werden, wobei man Filtration, Zentrifugation und verschiedene chromatographische Verfahren, wie HPLC oder Affinitätschromatographie, verwendet.
2.7 Kristallprotein-Screening- und -Immunnachweiskits
Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zum Durchmustern von Proben, von denen man annimmt, dass sie ein CryET29-δ-Endotoxin oder ein Gen, das ein solches Kristallprotein codiert, enthalten könnten, bereit. Eine solche Durchmusterung kann mit Proben wie transformierten Wirtszellen, transgenen Pflanzen, deren Nachkommen oder Samen oder mit Laborproben, von denen man annimmt, dass sie ein solches Polypeptid oder Nucleinsäuresegment enthalten oder produzieren könnten, durchgeführt werden. Ein Kit kann ein neues Nucleinsäuresegment oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Der Kit kann auch Reagentien zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einer Probe und einer Nucleinsäure oder einem Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten. Das bereitgestellte Reagenz kann radioaktiv, fluoreszenz- oder enzymmarkiert sein. Der Kit kann ein bekanntes radioaktiv markiertes Reagens enthalten, das zur Bindung oder Wechselwirkung mit einer Nucleinsäure oder einem Antikörper der vorliegenden Erfindung befähigt ist.
Das Reagenz des Kits kann als flüssige Lösung, an einen festen Träger gebunden oder als getrocknetes Pulver bereitgestellt werden. Wenn das Reagenz in einer flüssigen Lösung bereitgestellt wird, ist die flüssige Lösung vorzugsweise eine wässrige Lösung. Wenn das bereitgestellte Reagenz an einen festen Träger gebunden ist, kann es sich bei dem festen Träger vorzugsweise um ein chroma tographisches Medium, eine Testplatte mit einer Mehrzahl von Näpfen oder einen Objektträger handeln. Wenn das bereitgestellte Reagenz ein trockenes Pulver ist, kann das Pulver durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, das ebenfalls bereitgestellt sein kann, rekonstituiert werden.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immunnachweisverfahren und entsprechende Kits. Es wird vorgeschlagen, dass die Kristallproteine oder -peptide der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, um Antikörper nachzuweisen, die eine Reaktivität gegenüber diesen aufweisen, oder alternativ dazu können Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, eingesetzt werden, um Kristallproteine oder Peptide, die mit Kristallprotein zusammenhängende Epitope enthalten, nachzuweisen. Im Allgemeinen beinhalten diese Verfahren zuerst das Gewinnen einer Probe, von der man annimmt, dass sie ein solches Protein, Peptid oder einen solchen Antikörper enthalten könnte, das In-Kontakt-Bringen der Probe je nachdem mit einem Antikörper oder Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Bildung eines Immunkomplexes ermöglichen, und dann das Nachweisen der Anwesenheit des Immunkomplexes.
Im Allgemeinen ist der Nachweis einer Immunkomplexbildung in der Technik sehr gut bekannt und kann durch Anwendung zahlreicher Ansätze erreicht werden. Zum Beispiel kommt bei der vorliegenden Erfindung die Anwendung von ELISA, RIA, Immunblotting (z.B. Dot Blot) oder indirekten Immunfluoreszenztechniken usw. in Frage. Im Allgemeinen wird die Immunkomplexbildung durch die Verwendung eines Markers, wie eines radioaktiven Markers oder eines Enzymmarkers (wie Alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase) oder ähnliches nachgewiesen. Selbstverständlich kann man durch die Verwendung eines sekundären Bindungsliganden, wie eines zweiten Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Ligandbindungsanordnung, zusätzliche Vorteile finden, wie in der Technik bekannt ist.
Für Assayzwecke wird vorgeschlagen, dass praktisch jede Probe eingesetzt werden kann, von der man annimmt, dass sie je nachdem entweder ein Kristall protein oder -peptid oder ein mit Kristallprotein verwandtes Peptid oder einen Antikörper, den man nachweisen möchte, umfassen könnte. Eine mögliche Anwendung solcher Ausführungsformen bei der Titration von Antigen- oder Antikörperproben bei der Auswahl von Hybridomen usw. wird in Betracht gezogen. In verwandten Ausführungsformen zieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Kits in Betracht, die eingesetzt werden können, um die Anwesenheit von Kristallproteinen oder verwandten Peptiden und/oder Antikörpern in einer Probe nachzuweisen. Proben können Zellen, Zellüberstände, Zellsuspensionen, Zellextrakte, Enzymfraktionen, Proteinextrakte oder andere zellfreie Zusammensetzungen, von denen man annimmt, dass sie Kristallproteine oder -peptide enthalten könnten, enthalten. Allgemein gesagt enthalten Kits gemäß der vorliegenden Erfindung ein geeignetes Kristallprotein, -peptid oder einen Antikörper, der gegen ein solches Protein oder Peptid gerichtet ist, zusammen mit einem Immunnachweisreagens und einer Einrichtung, die den Antikörper oder das Antigen und das Reagens enthält. Das Immunnachweisreagens umfasst typischerweise einen Marker, der mit dem Antikörper oder Antigen oder mit einem sekundären Bindungsliganden assoziiert ist. Beispielhafte Liganden könnten einen sekundären Antikörper, der gegen den ersten Antikörper oder das Antigen gerichtet ist, oder einen Biotin- oder Avidin-(oder Streptavidin-)Liganden mit einem assoziierten Marker umfassen. Wie oben erwähnt, sind in der Technik selbstverständlich mehrere beispielhafte Marker bekannt, und alle solchen Marker können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Der Behälter beinhaltet im Allgemeinen ein Vial, in das der Antikörper, das Antigen oder Nachweisreagens gegeben und vorzugsweise in geeigneter Weise aliquotiert werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung enthalten typischerweise auch eine Einrichtung, die den Antikörper-, Antigen- und Reagensbehälter in engem Zusammenhang für den kommerziellen Vertrieb enthält. Solche Behälter können spritzgegossene oder blasgeformte Kunststoffbehälter umfassen, in die die gewünschten Vials eingebracht werden.
2.8 ELISAs und Immunfällung
ELISAs können in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden. In einem ELISA-Assay werden Proteine oder Peptide, in die Kristallprotein-Antigensequenzen eingebaut sind, auf einer ausgewählten Oberfläche immobilisiert, vorzugsweise einer Oberfläche, die Proteinaffinität aufweist, wie die Näpfe einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach dem Waschen zum Entfernen von unvollständig adsorbiertem Material ist es wünschenswert, die Näpfe der Assayplatte mit einem unspezifischen Protein zu binden oder zu beschichten, das bekanntermaßen antigenneutral in Bezug auf die Testantiseren ist, wie Rinderserumalbumin (BSA), Casein oder Lösungen von Milchpulver. Dies ermöglicht eine Blockierung von unspezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und reduziert so den Hintergrund, der durch unspezifische Bindung von Antiseren auf der Oberfläche verursacht wird.
Nach der Bindung von antigenem Material an den Napf, dem Beschichten mit einem unreaktiven Material zum Reduzieren des Hintergrunds und dem Waschen zur Entfernung von ungebundenem Material wird die immobilisierende Oberfläche mit den Antiseren oder dem zu testenden klinischen oder biologischen Extrakt in einer Weise in Kontakt gebracht, die zur Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) führt. Solche Bedingungen beinhalten vorzugsweise das Verdünnen der Antiseren mit Verdünnungsmitteln, wie BSA, Rinder-Gammaglobulin (BGG) und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween^®. Diese hinzugefügten Agentien unterstützen auch häufig die Reduktion des unspezifischen Hintergrunds. Dann werden die geschichteten Antiseren etwa 2 bis etwa 4 h lang bei Temperaturen vorzugsweise in der Größenordnung von etwa 25 °C bis etwa 27 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die mit Antiseren in Kontakt gebrachte Oberfläche gewaschen, um nichtimmunkomplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren umfasst das Waschen mit einer Lösung wie PBS/Tween^® oder Boratpuffer.
Nach der Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antigen und dem anschließenden Waschen kann das Auftreten und sogar die Menge der Immunkomplexbildung bestimmt werden, indem man einen zweiten Antikörper hinzufügt, der Spezifität für den ersten aufweist. Um ein Nachweismittel zu erhalten, weist der zweite Antikörper vorzugsweise ein assoziiertes Enzym auf, das beim Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat eine Farbentwicklung erzeugt. So möchte man zum Beispiel die antiserengebundene Oberfläche während einer Zeit und unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Immunkomplexbildung begünstigen (z.B. 2 h Inkubation bei Raumtemperatur in einer PBS-haltigen Lösung, wie PBS/Tween^®), mit einem Urease- oder Peroxidase-konjugierten Anti-Human-IgG in Kontakt bringen und inkubieren.
Nach der Inkubation mit dem zweiten enzymmarkierten Antikörper und nach dem Waschen zur Entfernung des ungebundenen Materials wird die Menge des Markers durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat, wie Harnstoff und Bromkresolpurpur oder 2,2'-Azinodi(3-ethyl-benzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und H₂O₂ im Falle von Peroxidase als Enzymmarker, quantifiziert. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Grades der Farbbildung erreicht, z.B. mit Hilfe eines Spektrophotometers für Spektren im Sichtbaren.
Die Anti-Kristallprotein-Antikörper der vorliegenden Erfindung sind besonders gut für die Isolierung anderer Kristallprotein-Antigene durch Immunfällung geeignet. Immunfällung beinhaltet die Abtrennung der Zielantigenkomponente aus einem komplexen Gemisch und wird verwendet, um kleinste Proteinmengen zu diskriminieren oder zu isolieren. Für die Isolierung von Membranproteinen müssen Zellen zu Detergensmicellen solubilisiert werden. Nichtionische Salze werden bevorzugt, da andere Mittel, wie Gallensalze, bei saurem pH-Wert oder in Gegenwart von zweiwertigen Kationen ausfallen.
In einer alternativen Ausführungsform sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung für die enge Nebeneinanderstellung von zwei Antigenen geeignet. Dies ist besonders nützlich zur Erhöhung der lokalisierten Konzentration von Antigenen, z.B. Enzym-Substrat-Paaren.
2.9 Western Blots
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden in hohem Maße Verwendung in der Immunblot- oder Western-Blot-Analyse. Die Anti-Peptid-Antikörper können als hochaffine primäre Reagentien für die Identifizierung von Proteinen verwendet werden, die auf einer festen Trägermatrix, wie Nitrocellulose, Nylon oder Kombinationen davon, immobilisiert sind. In Verbindung mit der Immunfällung und anschließenden Gel-Elektrophorese können diese als einstufiges Reagens zur Verwendung beim Nachweis von Antigenen verwendet werden, gegen welche sekundäre Reagentien, die beim Nachweis des Antigens verwendet werden, einen nachteiligen Hintergrund verursachen. Dies ist besonders nützlich, wenn die untersuchten Antigene Immunglobuline sind (was die Verwendung von Immunglobulinen, die Komponenten von Bakterienzellwänden binden, ausschließt), die untersuchten Antigene mit dem Nachweismittel kreuzreagieren oder mit demselben relativen Molekulargewicht wandern wie ein Kreuzreaktionssignal.
Nachweisverfahren auf immunologischer Basis zur Verwendung in Verbindung mit Western Blotting beinhalten enzymatisch, radioaktiv oder fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper gegen die Toxin-Struktureinheit und gelten in dieser Hinsicht als besonders gut geeignet.
2.10 Epitopische Kernsequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Protein- oder Peptidzusammensetzungen, die frei von Gesamtzellen und anderen Peptiden sind und die ein gereinigtes Protein oder Peptid umfassen, das ein Epitop beinhaltet, welches immunologisch kreuzreaktiv gegenüber einem oder mehreren Anti-Kristallprotein-Antikörpern ist. Insbesondere betrifft die Erfindung epitopische Kernsequenzen, die von Cry-Proteinen oder -Peptiden abgeleitet sind.
Der hier verwendete Ausdruck "ein Epitop beinhalten, welches immunologisch kreuzreaktiv gegenüber einem oder mehreren Anti-Kristallprotein-Antikörpern ist" soll sich auf ein Peptid- oder Proteinantigen beziehen, das eine Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur umfasst, die einem Epitop ähnelt, das sich innerhalb eines Kristallproteins oder Polypeptids befindet. Der Grad der Ähnlichkeit wird im Allgemeinen so groß sein, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen das Kristallprotein oder Polypeptid gerichtet sind, auch an das kreuzreaktive Peptid- oder Proteinantigen binden, mit diesem reagieren oder es in sonstiger Weise erkennen. In Verbindung mit solchen Antikörpern können verschiedene Immunassayverfahren eingesetzt werden, wie zum Beispiel Western Blotting, ELISA, RIA usw., die dem Fachmann alle bekannt sind.
Die Identifizierung von immundominanten Cry-Epitopen und/oder ihren funktionellen Äquivalenten, die für die Verwendung in Impfstoffen geeignet sind, ist eine relativ geradlinige Sache. Zum Beispiel kann man die Verfahren von Hopp einsetzen, wie es im US-Patent 4,554,101 gelehrt wird, das die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Die in mehreren anderen Artikeln beschriebenen Verfahren und darauf beruhende Softwareprogramme können auch verwendet werden, um epitopische Kernsequenzen zu identifizieren (siehe zum Beispiel Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; US-Patent 4,554,101). Die Aminosäuresequenz dieser "epitopischen Kernsequenzen" kann dann leicht in Peptide eingebaut werden, entweder durch die Anwendung von Peptidsynthese oder durch Rekombinationstechnik.
Bevorzugte Peptide zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung haben im Allgemeinen eine Länge in der Größenordnung von etwa 8 bis etwa 20 Aminosäuren und besonders bevorzugt etwa 8 bis etwa 15 Aminosäuren. Es wird vorgeschlagen, dass kürzere antigene, von Kristallprotein abgeleitete Peptide unter gewissen Umständen Vorteile ergeben, zum Beispiel bei der Herstellung von immunologischen Nachweisassays. Beispielhafte Vorteile sind die Leichtigkeit der Herstellung und Reinigung, die relativ geringen Kosten und die verbesserte Reproduzierbarkeit der Produktion sowie die vorteilhafte Bioverteilung.
Es wird vorgeschlagen, dass besondere Vorteile der vorliegenden Erfindung durch die Herstellung von synthetischen Peptiden realisiert werden können, die modifizierte und/oder verlängerte epitopische/immunogene Kernsequenzen enthalten, welche zu einem "universalen" epitopischen Peptid führen, das gegen Kristallproteine und insbesondere Cry und verwandte Sequenzen gerichtet ist. Diese epitopischen Kernsequenzen werden hier in besonderen Aspekten als hydrophile Bereiche des besonderen Polypeptidantigens identifiziert. Es wird vorgeschlagen, dass diese Bereiche diejenigen repräsentieren, die am wahrscheinlichsten die T-Zell- oder B-Zell-Stimulation fördern und somit die Produktion spezifischer Antikörper hervorrufen.
Eine epitopische Kernsequenz, wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist ein relativ kurzes Stück von Aminosäuren, das "komplementär" zu antigenbindenden Stellen auf den hier offenbarten, gegen Kristallprotein gerichteten Antikörpern ist und daher an diese bindet. Außerdem oder alternativ dazu ist eine epitopische Kernsequenz eine Sequenz, die Antikörper hervorruft, welche kreuzreaktiv gegenüber Antikörpern sind, die gegen die Peptidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass sich der Ausdruck "komplementär" im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung auf Aminosäuren oder Peptide bezieht, die eine anziehende Kraft aufeinander ausüben. Bestimmte Epitopkernsequenzen der vorliegenden Erfindung können also funktionell anhand ihrer Fähigkeit definiert werden, mit dem gewünschten Proteinantigen zu konkurrieren oder dieses womöglich bei der Bindung mit den entsprechenden, gegen das Protein gerichteten Antiseren zu verdrängen.
Im Allgemeinen ist die Größe des Polypeptidantigens vermutlich nicht besonders entscheidend, solange es wenigstens groß genug ist, um die identifizierten Kernsequenzen oder Sequenzen zu tragen. Die kleinste geeignete Kernsequenz, die in der vorliegenden Offenbarung erwartet wird, hätte im Allgemeinen eine Länge in der Größenordnung von etwa 8 Aminosäuren, wobei Sequenzen in der Größenordnung von 10 bis 20 besonders bevorzugt sind. Diese Größe entspricht also im Allgemeinen den kleinsten Peptidantigenen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden. Die Größe des Antigens kann jedoch gegebenenfalls auch größer sein, solange es eine grundlegende epitopische Kernsequenz enthält.
Die Identifizierung von epitopischen Kernsequenzen ist dem Fachmann bekannt, zum Beispiel gemäß der Beschreibung im US-Patent 4,554,101, das die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie lehrt. Überdies stehen zahlreiche Computerprogramme zur Verfügung, um antigene Teile von Proteinen vorherzusagen (siehe z.B. Jameson und Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Computerisierte Peptidsequenz-Analyseprogramme (z.B. DNAStar^®-Software, DNAStar, Inc., Madison, WI) können ebenfalls geeignet sein, um synthetische Peptide gemäß der vorliegenden Offenbarung zu entwerfen.
Synthesen von epitopischen Sequenzen oder Peptiden, die ein antigenes Epitop innerhalb ihrer Sequenz enthalten, werden leicht mit Hilfe von herkömmlichen Synthesetechniken, wie dem Festphasenverfahren, erreicht (z.B. durch die Verwendung eines kommerziell erhältlichen Peptidsynthesizers, wie ein Peptide Synthesizer Modell 430A von Applied Biosystems). Auf diese Weise synthetisierte Peptidantigene können dann in vorbestimmten Mengen allquotiert und bis zur Verwendung in herkömmlicher Weise, wie in wässrigen Lösungen oder ganz besonders bevorzugt in einem Pulver- oder lyophilisierten Zustand, gelagert werden.
Aufgrund der relativen Stabilität von Peptiden können sie gewünschtenfalls im Allgemeinen leicht während recht langer Zeiträume, z.B. bis zu sechs Monaten oder mehr, in wässrigen Lösungen, und zwar in praktisch jeder wässrigen Lösung, ohne nennenswerte Zersetzung oder Verlust der antigenen Aktivität aufbewahrt werden. Wenn eine längere Lagerung in wässriger Lösung in Betracht gezogen wird, ist es jedoch im Allgemeinen wünschenswert, Mittel einschließlich Puffern, wie Tris- oder Phosphatpuffer, mitzuverwenden, um einen pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 7,5 aufrechtzuerhalten. Außerdem kann es wünschenswert sein, Mittel mitzuverwenden, die das Mikrobenwachstum hemmen, wie Natriumazid oder Merthiolat. Für eine längere Lagerung im wässrigen Zustand ist es wünschenswert, die Lösungen bei etwa 4 °C oder besonders bevorzugt im gefrorenen Zustand zu lagern. Wenn die Peptide im lyophilisierten oder pulverisierten Zustand gelagert werden, können sie selbstverständlich praktisch unendlich lange gelagert werden, z.B. in dosierten Allquoten, die vor der Verwendung mit einer vorbestimmten Menge Wasser (vorzugsweise destilliert) oder Puffer rehydratisiert werden können.
2.11 Kristallproteinzusammensetzungen als Insektizide und Verfahren zu ihrer Verwendung
Die Erfinder ziehen in Betracht, dass die hier offenbarten Kristallproteinzusammensetzungen besondere Verwendung als Insektizide für die topische und/oder systemische Anwendung auf Feldfrüchte, einschließlich unter anderem Reis, Weizen, Mais, Sojabohnen, Tabak, Kartoffeln, Gerste, Canola, Roggen, Hafer, Baumwolle, Sonnenblume, Gräser, wie Weide- und Rasengräser, Obst, Zitrusfrüchte, Nüsse, Bäume, Sträucher und Gemüse sowie Zierpflanzen, Kakteen, Sukkulenten und dergleichen finden.
Offenbart und beansprucht wird eine Zusammensetzung, die eine insektizid wirksame Menge einer Kristallproteinzusammensetzung umfasst. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise die hier offenbarte Aminosäuresequenz von CryET29 oder biologisch funktionelle Äquivalente davon.
Die Insektizidzusammensetzung kann auch ein oder mehrere zusätzliche Kristallproteine umfassen, die dem Fachmann bekannt sind, wie solche, die hier in den Tabellen 1 und 4 beschrieben sind.
Das Insektizid umfasst eine B.-thuringiensis-Zelle oder eine Kultur dieser Zellen oder ein Gemisch von einer oder mehreren B.-thuringiensis-Zellen, die eines oder mehrere der neuen Kristallproteine der Erfindung exprimieren. In bestimmten Aspekten kann es wünschenswert sein, Zusammensetzungen herzustellen, die eine Vielzahl von Kristallproteinen, entweder nativ oder modifiziert, für die Behandlung von einem oder mehreren Typen von dafür anfälligen Insekten enthalten.
Die Erfinder ziehen in Betracht, dass jedes dem Fachmann bekannte Zubereitungsverfahren unter Verwendung der hier offenbarten Proteine zur Herstellung solcher Bioinsektizidzusammensetzungen eingesetzt werden kann. Es kann wünschenswert sein, Ganzzellpräparate, Zellextrakte, Zellsuspensionen, Zellhomogenisate, Zelllysate, Zellüberstände, Zellfiltrate oder Zellkuchen einer Zellkultur (vorzugsweise einer Bakterienzellkultur, wie einer hier beschriebenen B.-thuringiensis-Zellkultur) zuzubereiten, die ein oder mehrere cryET29-DNA-Segmente exprimieren, um die codierten CryET29-Proteine oder -Peptide zu produzieren. Die Verfahren zur Herstellung solcher Zubereitungen sind dem Fachmann bekannt und können zum Beispiel Dehydrierung, Lyophilisierung, Homogenisierung, Extraktion, Filtration, Zentrifugation, Sedimentation oder Konzentration einer oder mehrerer Kulturen von Bakterienzellen, die die in Tabelle 3 beschriebenen B.-thuringiensis-Zellen, die die interessierenden CryET29-Peptide exprimieren, umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung eine fließfähige Ölsuspension, die lysierte oder unlysierte Bakterienzellen, Sporen oder Kristalle umfasst, die eines oder mehrere der hier offenbarten neuen Kristallproteine enthalten. Vorzugsweise sind die Zellen B.-thuringiensis-Zellen, doch gilt jede solche bakterielle Wirtszelle als geeignet, die die hier offenbarten neuen Nucleinsäuresegmente exprimiert und ein Kristallprotein produziert, wie Bacillus spp. einschließlich B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, Escherichia spp. einschließlich E. coli und/oder Pseudomonas spp, einschließlich P. cepacia, P. aeruginosa und P. fluorescens. Alternativ dazu kann die fließfähige Ölsuspension auch aus einer Kombination von einem oder mehreren der folgenden Zusammensetzungen bestehen: lysierte oder unlysierte Bakterienzellen, Sporen, Kristalle und/oder gereinigte Kristallproteine.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung ein wasserdispergierbares Granulat oder Pulver. Dieses Granulat oder Pulver kann lysierte oder unlysierte Bakterienzellen, Sporen oder Kristalle umfassen, die eines oder mehrere der hier offenbarten neuen Kristallproteine enthalten. Bevorzugte Quellen für diese Zusammensetzungen sind Bakterienzel len, wie B.-thuringiensis-Zellen, doch gelten auch Bakterien der Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas, die mit einem hier offenbarten DNA-Segment transformiert sind und das Kristallprotein exprimieren, als geeignet. Alternativ dazu kann das Granulat oder Pulver auch aus einer Kombination von einem oder mehreren der folgenden Zusammensetzungen bestehen: lysierte oder unlysierte Bakterienzellen, Sporen, Kristalle und/oder gereinigte Kristallproteine.
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung ein benetzbares Pulver, einen Sprühnebel, eine Emulsion, ein Kolloid, eine wässrige oder organische Lösung, einen Staub, ein Granulat oder ein kolloidales Konzentrat. Eine solche Zusammensetzung kann entweder unlysierte oder lysierte Bakterienzellen, Sporen, Kristalle oder Zellextrakte, wie sie oben beschrieben sind, enthalten, die eines oder mehrere der hier offenbarten neuen Kristallproteine enthalten. Bevorzugte Bakterienzellen sind B.-thuringiensis-Zellen, doch gelten auch Bakterien wie B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli oder Pseudomonas spp., die mit einem hier offenbarten DNA-Segment transformiert sind und das Kristallprotein exprimieren, als geeignet. Solche trockenen Formen der insektiziden Zusammensetzungen können so zubereitet werden, dass sie sich sofort nach der Benetzung auflösen oder sich alternativ dazu mit gesteuerter Freisetzung, nachhaltiger Freisetzung oder in anderer Weise zeitabhängig auflösen. Alternativ dazu kann eine solche Zusammensetzung auch aus einer Kombination von einem oder mehreren der folgenden Zusammensetzungen bestehen: lysierte oder unlysierte Bakterienzellen, Sporen, Kristalle und/oder gereinigte Kristallproteine.
In einer vierten wichtigen Ausführungsform umfasst die Bioinsektizidzusammensetzung eine wässrige Lösung oder Suspension oder Zellkultur von lysierten oder unlysierten Bakterienzellen, Sporen, Kristallen oder ein Gemisch von lysierten oder unlysierten Bakterienzellen, Sporen und/oder Kristallen, wie die oben beschriebenen, die eines oder mehrere der hier offenbarten neuen Kristallproteine enthalten. Solche wässrigen Lösungen oder Suspensionen können als kon zentrierte Stammlösung, die vor der Anwendung verdünnt wird, oder alternativ dazu als gebrauchsfertige verdünnte Lösung bereitgestellt werden.
Für diese Verfahren, die die Anwendung von Bakterienzellen beinhalten, kann der zelluläre Wirt, der das bzw. die Kristallprotein-Gene enthält, in jedem zweckmäßigen Nährmedium gezüchtet werden, wo das DNA-Konstrukt einen selektiven Vorteil verschafft, was ein selektives Medium ergibt, so dass im Wesentlichen alle oder alle Zellen das B.-thuringiensis-Gen enthalten. Diese Zellen können dann mit herkömmlichen Methoden geerntet werden. Alternativ dazu können die Zellen auch vor der Ernte behandelt werden.
Wenn die insektiziden Zusammensetzungen B.-thuringiensis-Zellen, Sporen und/oder Kristalle, die das bzw. die interessierenden modifizierten Kristallproteine enthalten, umfassen, können solche Zusammensetzungen auf vielerlei Weise zubereitet werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulate oder Stäube oder durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, wie anorganischen Mineralien (Phyllosilicaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dergleichen) oder botanischen Materialien (pulverisierten Maiskolben, Reisspelzen, Walnussschalen und dergleichen), eingesetzt werden. Die Zubereitungen können Spreader-Sticker-Hilfsstoffe, Stabilisatoren, andere pestizide Additive oder Tenside umfassen. Flüssige Zubereitungen können auf wässriger oder nichtwässriger Basis sein und als Schäume, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dergleichen eingesetzt werden. Die Bestandteile können rheologische Mittel, Tenside, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere umfassen.
Alternativ dazu können die neuen, von CryET29 abgeleiteten mutierten Kristallproteine auch durch native oder rekombinante bakterielle Expressionssysteme in vitro hergestellt und für die anschließende Feldanwendung isoliert werden. Ein solches Protein kann entweder in Rohzelllysaten, Suspensionen, Kolloiden usw. vorliegen, oder es kann alternativ dazu gereinigt, verfeinert, gepuffert und/oder weiterverarbeitet werden, bevor man es zu einer aktiven bioziden Zubereitung verarbeitet. Ebenso kann es unter gewissen Umständen wünschenswert sein, Kristalle und/oder Sporen aus Bakterienkulturen, die das Kristallprotein expri mieren, zu isolieren und Lösungen, Suspensionen oder kolloidale Präparate solcher Kristalle und/oder Sporen als aktive bioinsektizide Zusammensetzung anzuwenden.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bekämpfung von Coleoptera-Insekten, die für die hier offenbarten neuen Zusammensetzungen anfällig sind. Ein solches Verfahren umfasst im Allgemeinen das In-Kontakt-Bringen des Insekts oder der Insektenpopulation, -kolonie usw. mit einer insektizid wirksamen Menge einer CryET29-Kristallproteinzusammensetzung. Bei dem Verfahren können CryET29-Kristallproteine, wie die in SEQ ID Nr. 2 offenbarten, oder biologisch funktionelle Äquivalente davon verwendet werden.
Alternativ dazu können bei dem Verfahren auch ein oder mehrere CryET29-Kristallproteine verwendet werden, die von der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder von einer oder mehreren Nucleinsäuresequenzen, die unter Bedingungen mäßiger oder höherer Stringenz mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren, codiert werden. Die Verfahren zum Identifizieren von Sequenzen, die unter Bedingungen mäßiger oder höherer Stringenz mit den offenbarten hybridisieren, sind dem Fachmann wohlbekannt und werden hier diskutiert.
Unabhängig vom Verfahren der Anwendung wird die Menge der aktiven Komponente(n) in einer insektizid wirksamen Menge angewendet, die in Abhängigkeit von Faktoren variiert wie zum Beispiel den speziellen zu bekämpfenden Coleoptera-Insekten, der speziellen zu behandelnden Pflanze oder Feldfrucht, den Umgebungsbedingungen sowie dem Verfahren, der Auftragungsdichte und der Auftragungsmenge der insektizid wirksamen Zusammensetzung.
Die beschriebenen Insektizidzusammensetzungen können hergestellt werden, indem man entweder die Bakterienzell-, Kristall- und/oder Sporensuspension oder die isolierte Proteinkomponente mit dem gewünschten landwirtschaftlich annehmbaren Träger zubereitet. Die Zusammensetzungen können vor der Verabreichung in einem geeigneten Mittel zubereitet werden, zum Beispiel lyophilisiert, gefriergetrocknet, getrocknet oder in einem wässrigen Träger, Medium oder geeigneten Verdünnungsmittel, wie Kochsalzlösung oder einem anderen Puffer. Die zubereiteten Zusammensetzungen können in Form eines Staubs oder Granulats oder einer Suspension in Öl (Pflanzen- oder Mineralöl) oder Wasser oder Öl/Wasser-Emulsionen oder als benetzbares Pulver oder in Kombination mit irgendeinem anderen Trägermaterial, das für die landwirtschaftliche Anwendung geeignet ist, vorliegen. Geeignete landwirtschaftliche Träger können fest oder flüssig sein und sind in der Technik wohlbekannt. Der Ausdruck "landwirtschaftlich annehmbarer Träger" umfasst alle Hilfsstoffe, z.B. inerten Komponenten, Dispergiermittel, Tenside, Klebrigmacher, Bindemittel usw., die gewöhnlich in der Insektizidzubereitungstechnik verwendet werden; diese sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Insektizidzubereitung wohlbekannt. Die Zubereitungen können mit einem oder mehreren festen oder flüssigen Hilfsmittels gemischt und mit verschiedenen Methoden präpariert werden, z.B. durch homogenes Mischen, physikalisches Mischen und/oder Vermahlen der Insektizidzusammensetzung mit geeigneten Hilfsstoffen unter Verwendung von herkömmlichen Zubereitungstechniken.
Die insektiziden Zusammensetzungen dieser Erfindung werden mit herkömmlichen Verfahren, vorzugsweise durch Sprühen, auf die Umgebung des Ziel-Coleoptera-Insekts, typischerweise auf das Laub der zu schützenden Pflanze oder Feldfrucht, aufgetragen. Die Stärke und Dauer der Insektizidanwendung wird im Hinblick auf die Bedingungen, die spezifisch für die besonderen Schädlinge und zu behandelnden Kulturpflanzen sind, und die besonderen Umgebungsbedingungen eingestellt. Das proportionale Verhältnis von Wirkstoff zu Träger hängt natürlich von der chemischen Natur, Löslichkeit und Stabilität der insektiziden Zusammensetzung sowie der besonderen, in Betracht gezogenen Zubereitung ab.
Weitere Auftragungstechniken, zum Beispiel Verstäuben, Versprühen, Imprägnierung, Bodeninjektion, Bodenbestellung, Samenbeschichtung, Sämlingsbeschichtung, Besprühung, Belüftung, Verneblung, Zerstäubung und dergleichen sind ebenfalls möglich und können unter bestimmten Umständen, wie z.B. Insekten, die einen Wurzel- oder Stängelbefall verursachen, oder bei Auftragung auf empfindliche Pflanzen oder Zierpflanzen, erforderlich sein. Diese Auftragungsverfahren sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt.
Die insektizide Zusammensetzung der Erfindung kann bei dem Verfahren der Erfindung einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindungen einschließlich anderer Pestizide, aber nicht auf diese beschränkt, eingesetzt werden. Das Verfahren der Erfindung kann auch in Verbindung mit anderen Behandlungen, wie Tensiden, Detergentien, Polymeren oder Zubereitungen für die zeitlich gesteuerte Freisetzung, verwendet werden. Die insektiziden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können entweder für systemische oder für topische Verwendung zubereitet werden.
Die Konzentration der insektiziden Zusammensetzung, die für die Umgebungs-, systemische oder foliäre Auftragung verwendet wird, variiert stark in Abhängigkeit von der Natur der besonderen Zubereitung, der Auftragungsmethode, den Umgebungsbedingungen und dem Grad der biologischen Aktivität. Typischerweise ist die bioinsektizide Zusammensetzung in der aufgetragenen Zubereitung in einer Konzentration von wenigstens etwa 1 Gew.-% vorhanden und kann in einer Konzentration von bis zu einschließlich etwa 99 Gew.-% vorhanden sein. Trockene Zubereitungen der Zusammensetzungen können etwa 1 bis etwa 99 oder mehr Gew.-% der Zusammensetzung enthalten, während flüssige Zubereitungen im Allgemeinen etwa 1 bis etwa 99 oder mehr Gew.-% des Wirkstoffs enthalten können. Zubereitungen, die intakte Bakterienzellen umfassen, enthalten im Allgemeinen etwa 10⁴ bis etwa 10¹² Zellen/mg.
Die insektizide Zubereitung kann nach Bedarf in einer oder mehreren Anwendungen auf eine besondere Pflanze oder Zielfläche aufgetragen werden, wobei eine typische Feldauftragungsdichte pro Hektar in der Größenordnung von etwa 1 g bis etwa 1 kg, 2 kg, 5 kg oder mehr des Wirkstoffs liegt.
2.12 Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Flöhen
Da das neue Kristallprotein der vorliegenden Erfindung das erste solche identifizierte B.-thuringiensis-δ-Endotoxin ist, das eine insektizide Aktivität gegen Flöhe aufweist, ziehen die Erfinder auch die Zubereitung von pharmazeutischen Zusammensetzungen in Betracht, die Tieren als Prophylaxe und/oder Behandlung von Flohbefall verabreicht werden können, und insbesondere bei Befall mit Mitgliedern der Gattung Ctenocephalides, wie Ctenocephalides felis (deutscher Name: Katzenfloh) und C. canis (deutscher Name: Hundefloh). Während dies nur zwei Vertreter der Ordnung Siphonaptera sind, für die die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung insektizide Aktivität zeigen, wird in Betracht gezogen, dass die Zusammensetzungen auch für die Behandlung anderer, verwandter Insekten, die häufig Tiere befallen, geeignet sein können, und dass diese ebenfalls mit den hier offenbarten neuen Zusammensetzungen bekämpft werden können. Solche Insekten sind im Einzelnen im US-Patent 5,449,681 beschrieben und umfassen unter anderem Vertreter der Gattungen Culex, Culiseta, Bovicola, Callitroga, Chrysops, Cimes, Ctenocephalis, Dermatophilus, Dermatobia und Damalinia.
Daher umfasst ein Aspekt der Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Kristallproteinzusammensetzung umfasst, die hier für die Verabreichung an ein Tier offenbart ist, um einen Befall mit Flöhen oder verwandten Insekten zu verhindern oder zu reduzieren. Ein Verfahren zur Reduktion eines solchen Flohbefalls bei einem Tier wird hier ebenfalls offenbart und beansprucht. Das Verfahren umfasst allgemein die Verabreichung einer insektizid wirksamen Menge einer CryET29-Zusammensetzung an ein Tier. Mittel zur Verabreichung solcher insektiziden Zusammensetzungen an ein Tier sind in der Technik wohlbekannt. Das US-Patent 5,416,102 gibt eine Lehre an für Verfahren und Zubereitungen zur Verhinderung von Flohbefall unter Verwendung einer insektiziden Zusammensetzung.
Solche tiermedizinischen Anti-Siphonaptera-Zusammensetzungen können je nach der besonderen Anwendung nach einer Vielzahl von Verfahren verabreicht werden. Beispiele für Mittel zur Verabreichung von insektiziden Zusammensetzungen an ein Tier sind dem Fachmann wohlbekannt; sie umfassen zum Beispiel Flohhalsbänder, Flohsprays, Tauchbäder, Pulver und dergleichen. Verfahren zur Bereitstellung solcher Zubereitungen an ein Tier sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt; dazu gehören die direkte Auftragung oder passive Auftragung, wie die Vorrichtung, die im US-Patent 4,008,688 beschrieben ist, für die Auftragung von Insektiziden durch eine Haustier-Bettanordnung. Das zu behandelnde Tier kann ein beliebiges Tier sein, das empfindlich oder anfällig für einen Angriff oder Befall durch einen Floh ist, der durch eine hier offenbarte CryET29-Zusammensetzung getötet oder gehemmt werden kann. Solche Tiere können Katzen, Hunde, Pferde, Schweine, Wölfe, Rinder, Mäuse usw. und dergleichen sein, doch ziehen die Erfinder in Betracht, dass Katzen und Hunde als Tiere, die mit den hier offenbarten neuen Zusammensetzungen behandelt werden sollen, besonders bevorzugt sind.
Es wird weiterhin in Betracht gezogen, dass neben der topischen Verabreichung der offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen in manchen Fällen auch eine systemische Verabreichung zu bevorzugen oder wünschenswert sein kann. Für die orale Verabreichung können die Zusammensetzungen mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger zubereitet werden, oder sie können in eine Hart- oder Weichgelatinekapsel eingeschlossen werden, oder sie können zu Tabletten gepresst werden, oder sie können direkt mit der Nahrung auf genommen werden. Für die orale therapeutische Verabreichung können die aktiven Verbindungen mit Trägersubstanzen vermischt und in Form von Fresstabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Waffeln und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparate sollten wenigstens 0,1% aktive Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzungen und Präparate kann selbstverständlich variiert werden und kann zweckmäßigerweise etwa 2 bis etwa 60 Gew.-% der Einheit betragen. Die Menge der aktiven Verbindungen in solchen therapeutisch geeigneten Zusammensetzungen ist so groß, dass man eine geeignete Dosis erhält.
Für die orale Prophylaxe von Flöhen kann das Kristallprotein mit Trägersubstanzen vermischt und in Form eines Gels, einer Paste, eines Pulvers, einer Pille, Tablette, Kapsel oder Aufschlämmung verwendet werden, die dem Tier zum Schlucken gegeben werden können. Alternativ dazu können die Zusammensetzungen auch als Additiv zu Tierfutter, Leckerbissen oder anderen essbaren Zubereitungen gegeben werden. Wenn sie als Tablette oder Kapsel oder dergleichen zubereitet wird, kann die Zusammensetzung auch Folgendes enthalten: ein Bindemittel, wie Tragant, Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine; Trägersubstanzen, wie Dicalciumphosphat; ein Sprengmittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat; und es kann ein Süßungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, oder ein Aromastoff hinzugefügt werden, um die Zusammensetzung für das behandelte Tier schmackhafter zu machen. Ein solches Mittel für die Verabreichung von Flohprophylaktika an ein Tier ist eine Soße, wie sie im US-Patent 4,702,914 beschrieben ist.
Wenn die Darreichungsform eine Kapsel ist, kann sie außer Materialien der obigen Art auch einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorhanden sein, oder um die physikalische Form der Darreichungsform in anderer Weise zu modifizieren. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beiden beschichtet sein. Selbstverständlich sollte jedes Material, das bei der Herstellung einer Darreichungsform verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den eingesetzten Mengen im Wesentlichen nichttoxisch sein. Außerdem können die aktiven Verbindungen in Präparate und Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung eingearbeitet werden.
Alternativ dazu können die hier offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen auch parenteral, intramuskulär oder sogar intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch annehmbare Salze können in Wasser hergestellt werden, das zweckmäßigerweise mit einem Tensid, wie Hydroxypropylcellulose, gemischt wird. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen davon sowie in Öfen hergestellt werden. Unter normalen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthaften diese Präparate ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Zu den pharmazeutischen Formen, die für die Verwendung als injizierbare Form geeignet sind, gehören sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen unmittelbar vor der Verwendung. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss so weit flüssig sein, dass sie leicht mit einer Spritze verabreicht werden kann. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und muss vor der kontaminierenden Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionenmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Gemische davon und/oder Pflanzenöle enthält. Die geeignete Fließfähigkeit kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch die Beibehaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und fungizide Mittel erreicht werden, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen werden vorzugsweise isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid, mitverwendet. Eine verlängerte Resorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln, die die Resorption verzögern, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine, in den Zusammensetzungen erreicht werden.
Wenn man eine systemische Verabreichung, z.B. eine parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung, wünscht, sollte die Lösung in geeigneter Weise gepuffert sein, falls notwendig, und das flüssige Verdünnungsmittel sollte zuerst mit ausreichend Kochsalzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind insbesondere für die intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung geeignet. In diesem Zusammenhang werden sterile wässrige Medien, die eingesetzt werden können, dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Eine Variation der Dosierung wird notwendigerweise je nach dem Zustand, der Größe und der Art des behandelten Tiers erfolgen. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird auf jeden Fall die geeignete Dosis für das Tier individuell bestimmen. Für die Verabreichung an den Menschen sollten die Präparate außerdem Normen bezüglich der Sterilität, Pyrogenie, allgemeinen Sicherheit und Reinheit erfüllen, wie es von den Behörden jeweils gefordert wird.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem man die aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge, gegebenenfalls mit verschiedenen der anderen oben aufgezählten Bestandteile, in das geeignete Lösungsmittel einarbeitet und anschließend sterilfiltriert. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem man die verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in einen sterilen Träger einarbeitet, der das Grunddispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile von den oben aufgezählten enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des Wirkstoffs plus gegebenenfalls eines zusätzlichen gewünschten Bestandteils aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
Die hier offenbarten Zusammensetzungen können in neutraler oder Salzform zubereitet werden. Zu den pharmazeutisch annehmbaren Salzen gehören die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins) und solche, die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen gebildet werden. Mit den freien Carboxygruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen abgeleitet sein, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)hydroxid, und organische Basen sind Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen. Nach der Zubereitung werden Lösungen in einer Weise verabreicht, die mit der Darreichungsform verträglich ist, und zwar in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die Zubereitungen können leicht in einer Vielzahl von Darreichungsformen verabreicht werden, wie Cremes, Lotionen, Sprays, Tauchbäder, Emulsionen, Kolloide oder alternativ dazu, wenn eine systemische Verabreichung wünschenswert ist, als injizierbare Lösungen, Wirkstofffreisetzungskapseln und dergleichen.
Der hier verwendete Ausdruck "Träger" beinhaltet alle möglichen Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Vehikel, Beschichtungen, Verdünnungsmittel, antibakteriellen und fungiziden Mittel, isotonischen und resorptionsverzögernden Mittel, Puffer, Trägerlösungen, Suspensionen, Kolloide und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik wohlbekannt. Solange ein herkömmliches Medium oder Mittel nicht mit dem Wirkstoff unverträglich ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbar" bezieht sich auf molekulare Entitäten und Zusammensetzungen, die keine allergische oder ähnliche ungünstige Reaktion hervorrufen, wenn sie einem Tier verabreicht werden. Die Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung, die ein Protein als Wirkstoff enthält, ist in der Technik wohlbekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare Formen hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen; feste Formen, die zum Auflösen oder Suspendieren in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Bekämpfung und Ausrottung von Siphonaptera-Insekten aus Umweltbereichen, wo ein Befall mit solchen Insekten vermutet wird. Das Verfahren beinhaltet im Allgemeinen das Auftragen einer insektizid wirksamen Menge einer CryET29-Zusammensetzung, wie sie hier offenbart wird, auf einen Bereich, von dem man annimmt, dass er solche Insekten enthält. Die Erfinder ziehen weiterhin die Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Verabreichung an einen Körper oder in den Lebensbereichen und Umgebungen eines Tiers in Betracht, um den Befall mit Flöhen und verwandten Insekten in solchen Bereichen zu verhindern, zu vermindern oder zu reduzieren. Die Kristallproteinzusammensetzung kann in einem Pulver, Spray, Nebel, Granulat, Spülung, Shampoo, Flohhalsband, Tauchbad usw. zubereitet sein, die für die Verabreichung an den Körper des Tiers oder an die Lebensbereiche, Schlafplatzmaterialien, Häuser, Höfe, Hütten, Tierpensionen usw. eines solchen Tiers unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet der tiermedizinischen Insektizidzubereitungen bekannt sind, geeignet sind. Ein Beispiel für eine orale Zubereitung von tiermedizinischen Insektiziden findet man in den Lehren von US-Patent 5,416,102. Die Erfinder ziehen in Betracht, dass die Verwendung solcher Zusammensetzungen bei der Prävention oder Ausrottung von Flöhen auf Haustieren, wie Hunden, Katzen und anderen felltragenden Tieren, einen erheblichen Fortschritt im Stand der Technik darstellen kann, wenn man bedenkt, dass die hier offenbarten neuen Zusammensetzungen die ersten identifizierten Kristallproteine sind, die eine solche wünschenswerte insektizide Aktivität gegen Siphonaptera haben.
2.13 Biologisch funktionelle Äquivalente
In der Struktur der Peptide der vorliegenden Erfindung und der DNA-Segmente, die sie codieren, können Modifikationen und Änderungen vorgenommen werden, wobei man dennoch ein funktionelles Molekül erhält, das ein Protein oder Peptid mit wünschenswerten Eigenschaften codiert. Folgendes ist eine Diskussion auf der Basis einer Veränderung der Aminosäuren eines Proteins unter Schaffung eines äquivalenten oder sogar verbesserten Moleküls der zweiten Generation. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung gelten mutierte Kristallproteine als geeignet, um die insektizide Aktivität des Proteins zu erhöhen und folglich die insektizide Aktivität und/oder Expression des rekombinanten Transgens in einer Pflanzenzelle zu erhöhen. Die Aminosäureänderungen können erreicht werden, indem man die Codons der DNA-Sequenz gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Codons ändert.
Tabelle 2
Zum Beispiel können bestimmte Aminosäuren anstelle von anderen Aminosäuren in einer Proteinstruktur verwendet werden, ohne dass ein nennenswerter Verlust der wechselwirkenden Bindungskapazität mit Strukturen wie zum Beispiel antigenbindenden Bereichen von Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen erfolgt. Da es die Wechselwirkungsfähigkeit und Natur eines Proteins ist, die die biologisch funktionelle Aktivität dieses Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenzsubstitutionen in einer Proteinsequenz und selbstverständlich auch in der zugrundeliegenden codierenden DNA-Sequenz vorgenommen und dennoch ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten werden. Die Erfinder gehen also davon aus, dass verschiedene Veränderungen in den Peptidsequenzen der offenbarten Zusammensetzungen oder entsprechenden DNA-Sequenzen, die die Peptide codieren, ohne nennenswerten Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität vorgenommen werden können.
Wenn solche Änderungen vorgenommen werden, kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindex bei der Übertragung einer wechselwirkenden biologischen Funktion auf ein Protein ist in der Technik allgemein bekannt (Kyte und Doolittle, 1982). Es wird anerkannt, dass der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zur Sekundärstruktur des resultierenden Proteins beiträgt, die wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen, zum Beispiel Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen, definiert.
Jeder Aminosäure ist ein hydropathischer Index auf der Basis ihrer Hydrophobie und Ladungsmerkmale zugeordnet (Kyte und Doolittle, 1982); dies sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5), Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Es ist in der Technik bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit einem ähnlichen hydropathischen Index oder Score ersetzt werden können, was immer noch ein Protein mit ähnlicher biologischer Aktivität ergibt, d.h., wobei man immer noch ein biologisch funktionell äquivalentes Protein erhält. Wenn solche Änderungen vorgenommen werden, ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indices innerhalb von ± 2 gleich sind, bevorzugt, solche, die innerhalb von ± 1 gleich sind, sind besonders bevorzugt, und solche, die innerhalb von ± 0,5 gleich sind, sind ganz besonders bevorzugt.
In der Technik wird auch davon ausgegangen, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis der Hydrophilie vorgenommen werden kann. In US-Patent 4,554,101 heißt es, dass die größte lokale mittlere Hydrophilie eines Proteins, die von der Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren beherrscht wird, mit der biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie im US-Patent 4,554,101 ausgeführt ist, wurden den Aminosäureresten die folgenden Hydrophiliewerte zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
Es wird davon ausgegangen, dass eine Aminosäure anstelle einer anderen mit einem ähnlichen Hydrophiliewert verwendet werden kann, wobei man dennoch ein biologisch äquivalentes und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Protein erhalten wird. Bei solchen Änderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophiliewerte innerhalb von ± 2 gleich sind, bevorzugt, solche, die innerhalb von ± 1 gleich sind, sind besonders bevorzugt, und solche, die innerhalb von ± 0,5 gleich sind, sind ganz besonders bevorzugt.
Wie oben skizziert wurde, beruhen Aminosäuresubstitutionen daher im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure-Seitenkettensubstituenten, zum Beispiel ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung und Größe und dergleichen. Beispielhafte Substitutionen, bei denen verschiedene der obigen Merkmale berücksichtigt werden, sind dem Fachmann wohlbekannt; dazu gehören: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; sowie Valin, Leucin und Isoleucin.
3. Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Bestandteil der vorliegenden Patentschrift und werden mit aufgenommen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung näher zu veranschaulichen. Die Erfindung ist durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung von speziellen Ausführungsformen, die hier präsentiert wird, besser verständlich.
1A und 1B zeigen die Nucleinsäuresequenz des cryET29-Gens (SEQ ID Nr. 1) und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET29-Proteins (SEQ ID Nr. 2).
4. Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues δ-Endotoxin bereit, das als CryET29 bezeichnet wird und gegenüber Larven des Katzenflohs, Ctenocephalides felis, sowie gegen Coleoptera-Insekten, wie den Südlichen und Westlichen Maiswurzelbohrer, Kartoffelkäfer, Japankäfer und Rotbraunen Reismehlkäfer toxisch ist. Es ist wichtig, festzustellen, dass der Trivialname für Ctenocephalides felis (Katzenfloh) insofern etwas irreführend ist, als der Organismus nicht nur auf Katzen parasitiert, sondern auch der hauptsächliche parasitische Floh für Hunde ist (siehe z.B. US-Patent 4,547,360, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird).
4.1 CryET29-DNA-Sonden und -Primer
In einem anderen Aspekt ermöglicht DNA-Sequenzinformation, die durch die Erfindung bereitgestellt wird, die Herstellung von relativ kurzen DNA-Sequenzen (oder RNA-Sequenzen) mit der Fähigkeit, spezifisch mit Gensequenzen der hier offenbarten ausgewählten Polynucleotide zu hybridisieren. In diesen Aspekten werden Nucleinsäuresonden geeigneter Länge auf der Basis einer Betrachtung einer ausgewählten Kristallprotein-Gensequenz hergestellt, zum Beispiel einer Sequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Aufgrund der Fähigkeit solcher Nucleinsäuresonden, spezifisch mit einer Kristallprotein-codierenden Gensequenz zu hybridisieren, sind sie für eine Vielzahl von Ausführungsformen besonders gut geeignet. Was am wichtigsten ist, die Sonden können in einer Vielzahl von Assays verwendet werden, um die Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe nachzuweisen.
In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, Oligonucleotidprimer zu verwenden. Die Sequenz solcher Primer wird unter Verwendung eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung zur Verwendung beim Nachweisen, Amplifizieren oder Mutieren eines definierten Segments eines Kristallprotein-Gens von B. thuringiensis mit Hilfe von PCR^TM-Technik entworfen. Segmente von verwandten Kristallprotein-Genen von anderen Spezies können ebenfalls durch PCR^TM unter Verwendung solcher Primer amplifiziert werden.
4.2 Expressionsvektoren
Die vorliegende Erfindung zieht einen Expressionsvektor in Betracht, der ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst. In einer Ausführungsform ist ein Expressionsvektor also ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, welcher ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wobei der codierende Bereich funktionell mit einem Transcriptionsterminationsbereich verknüpft ist, in dem der Promotor die Transcription des codierenden Bereichs antreibt.
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verknüpft" bedeutet, dass ein Promotor so mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, dass die Transcription dieses codierenden Bereichs von diesem Promotor gesteuert und reguliert wird. Mittel, um einen Promotor funktionell mit einem codierenden Bereich zu verknüpfen, sind in der Technik wohlbekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die rekombinante Expression von DNAs, die die Kristallproteine der vorliegenden Erfindung codieren, vorzugsweise in einer Bacillus-Wirtszelle. Zu den bevorzugten Wirtszellen gehören Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und verwandte Bacillus-Spezies, wobei B.-thuringiensis-Wirtszellen in hohem Maße bevorzugt sind. Promotoren, die in Bakterien funktionieren, sind in der Technik wohlbekannt. Ein beispielhafter und bevorzugter Promotor für die Bacillus-Kristallproteine umfasst alle bekannten Kristallprotein-Gen-Promotoren einschließlich des cryET29-Gen-Promotors und Promotoren, die spezifisch für B.-thuringiensis-Sigmafaktoren, wie σ^E und σ^K, sind (wegen einer Übersicht, siehe Baum und Malvar, 1995). Alternativ dazu können auch mutagenisierte oder rekombinante Promotoren von Kristallprotein-codierenden Genen von Menschenhand gestaltet und zur Förderung der Expression der hier offenbarten neuen Gensegmente verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird die rekombinante Expression von DNAs, die die Kristallproteine der vorliegenden Erfindung codieren, unter Verwendung eines transformierten Gram-negativen Bakteriums, wie einer E.-coli- oder Pseudomonas-spp.-Wirtszelle, durchgeführt. Promotoren, die für die Expression von Ziel-Polypeptiden in E. coli und anderen Gram-negativen Wirtszellen auf hohem Niveau geeignet sind, sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt.
Wenn ein Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, um eine Pflanze zu transformieren, wird ein Promotor ausgewählt, der die Fähigkeit hat, die Expression in Pflanzen anzutreiben. Promotoren, die in Pflanzen funktionieren, sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt. Für die Expression des Polypeptids in Pflanzen geeignet sind Promotoren, die induzierbar, viral, synthetisch, konstitutiv, wie es beschrieben ist (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985), und zeitlich reguliert, räumlich reguliert und raumzeitlich reguliert sind (Chau et al., 1989).
Ein Promotor wird auch aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, die Transcriptionsaktivität der transformierten Pflanzenzelle oder der transgenen Pflanze auf den codierenden Bereich zu lenken. Struktur-Gene können durch eine Vielzahl von Promotoren in Pflanzengeweben angetrieben werden. Promotoren können fast konstitutiv sein, wie der CaMV-35S-Promotor, oder es können gewebespezifische oder entwicklungsspezifische Promotoren sein, die Zweikeimblättrige oder Einkeimblättrige beeinflussen.
Wenn der Promotor ein fast konstitutiver Promotor ist, wie CaMV 35S, findet man bei einer Vielzahl von transformierten Pflanzengeweben (z.B. Kallus, Blatt, Samen und Wurzel) Erhöhungen der Polypeptidexpression. Alternativ dazu können die Wirkungen der Transformation auf spezifische Pflanzengewebe gerichtet werden, indem man Vektoren verwendet, die sich in das Pflanzengenom integrieren und einen gewebespezifischen Promotor enthalten.
Ein beispielhafter gewebespezifischer Promotor ist der Lectin-Promotor, der spezifisch für Samengewebe ist. Das Lectin-Protein in Sojabohnensamen wird von einem einzigen Gen (Le1) codiert, das nur während der Samenreifung exprimiert wird und etwa 2 bis etwa 5% der Gesamt-mRNA des Samens ausmacht. Das Lectin-Gen und der samenspezifische Promotor sind vollständig charakterisiert worden und werden verwendet, um in transgenen Tabakpflanzen eine samenspezifische Expression zu dirigieren (Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al., 1990).
Ein Expressionsvektor, der einen codierenden Bereich enthält, der ein interessierendes Polypeptid codiert, wird so gestaltet, dass er unter der Kontrolle des Lectin-Promotors ist, und dieser Vektor wird in Pflanzen eingeführt, wobei man zum Beispiel ein Protoplasten-Transformationsverfahren verwendet (Dhir et al., 1991). Die Expression des Polypeptids ist spezifisch auf die Samen der transgenen Pflanze gerichtet.
Eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, die aus einer Pflanzenzelle erzeugt wird, die mit einem gewebespezifischen Promotor transformiert ist, kann mit einer zweiten transgenen Pflanze gekreuzt werden, die sich aus einer Pflanzenzelle entwickelt hat, die mit einem anderen gewebespezifischen Promotor transformiert ist, wobei eine transgene Hybridpflanze entsteht, die die Wirkungen der Transformation in mehr als einem spezifischen Gewebe zeigt.
Beispielhafte gewebespezifische Promotoren sind die Promotoren von Mais-Sucrose-Synthase 1 (Yang et al., 1990), Mais-Alkohol-Dehydrogenase 1 (Vogel et al., 1989), Mais-Lichtsammelkomplex (Simpson, 1986), Mais-Hitzeschockprotein (Odell et al., 1985), der kleinen Untereinheit der RuBP-Carboxylase (Rubisco) der Erbse (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), der Mannopin-Synthase des Ti-Plasmids (Langridge et al., 1989), der Nopalin-Synthase des Ti-Plasmids (Langridge et al., 1989), der Petunien-Chalcon-Isomerase (van Tunen et al., 1988), des glycinreichen Proteins 1 der Bohne (Keller et al., 1989), des CaMV-35S-Transcripts (Odell et al., 1985) und von Kartoffel-Patatin (Wenzler et al., 1989). Bevorzugte Promotoren sind der Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-35S-Promotor und der Promotor der kleinen S-E9-Untereinheit der RuBP-Carboxylase.
Die Wahl des Expressionsvektors und letztlich des Promotors, mit dem ein Polypeptid-codierender Bereich funktionell verknüpft wird, hängt direkt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, z.B. dem Ort und der Zeit der Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle. Dies sind wohlbekannte Einschränkungen, die dem Gebiet der Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle inhärent sind. Ein Vektor, der für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist jedoch in der Lage, die Expression des Polypeptidcodierenden Bereichs, mit dem er funktionell verknüpft ist, zu dirigieren.
Typische Vektoren, die für die Expression von Genen in höheren Pflanzen geeignet sind, sind in der Technik wohlbekannt; dazu gehören die beschriebenen Vektoren, die vom tumorinduzierenden (Ti) Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind (Rogers et al., 1987). Es ist jedoch von mehreren anderen sich in Pflanzen integrierenden Vektorsystemen bekannt, dass sie in Pflanzen funktionieren, einschließlich des beschriebenen pCaMVCN-Transfer-Kontrollvektors (Fromm et al., 1985). pCaMVCN (erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ) enthält den Blumenkohlmosaikvirus-CaMV-35S-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der zum Exprimieren des Polypeptids verwendete Vektor einen Selektionsmarker, der in einer Pflanzenzelle wirksam ist, vorzugsweise ein Wirkstoffresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Wirkstoffresistenzmarker ist das Gen, dessen Expression zu Kanamycin-Resistenz führt, d.h., das beschriebene chimäre Gen, das den Nopalin-Synthase-Promotor, Tn5-Neomycin-Phosphotransferase II (nptII) und den 3'-nichttranslatierten Bereich der Nopalin-Synthase enthält (Rogers et al., 1988).
RNA-Polymerase transcribiert eine codierende DNA-Sequenz über eine Stelle hinweg, wo Polyadenylierung erfolgt. Typischerweise dienen DNA-Sequenzen, die sich wenige hundert Basenpaare stromabwärts der Polyadenylierungsstelle befinden, zum Abbruch der Transcription. Diese DNA-Sequenzen werden hier als Transcriptionsterminationsbereiche bezeichnet. Diese Bereiche sind für eine effiziente Polyadenylierung von transcribierter Messenger-RNA (mRNA) erforderlich.
Mittel zur Herstellung von Expressionsvektoren sind in der Technik wohlbekannt. Expressionsvektoren (Transformationsvektoren), die zum Transformieren von Pflanzen verwendet werden, und Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren sind in den US-Patenten Nr. 4,971,908, 4,940,835, 4,769,061 und 4,757,011 beschrieben. Diese Vektoren können so modifiziert werden, dass sie eine codierende Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten.
Eine Vielzahl von Verfahren wurde entwickelt, um ein DNA-Segment über komplementäre klebrige Enden oder glatte Enden funktionell in einen Vektor einzufügen. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymer-Ketten zu dem DNA-Segment, das eingesetzt werden soll, und zur Vektor-DNA hinzugefügt werden. Dann werden der Vektor und das DNA-Segment durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen miteinander verknüpft, wobei rekombinante DNA-Moleküle entstehen.
Ein codierender Bereich, der ein Polypeptid codiert, das die Fähigkeit hat, einer Zelle insektizide Aktivität zu verleihen, ist vorzugsweise ein Gen, das das B.-thuringiensis-Kristallprotein CryET29 codiert. In bevorzugten Ausführungsformen hat ein solches Polypeptid die Aminosäurerestsequenz von SEQ ID Nr. 2 oder eines funktionellen Äquivalents davon. Gemäß solchen Ausführungsformen wird auch ein codierender Bereich bevorzugt, der die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
4.3 Merkmale des CryET29-Kristallproteins
Die vorliegende Erfindung stellt neue Polypeptide bereit, das das ganze oder einen Teil eines B.-thuringiensis-CryET29-Kristallproteins definieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform offenbart und beansprucht die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes CryET29-Protein. Das CryET29-Protein umfasst eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 2 offenbart ist. CryET29 hat eine berechnete isoelektrische Konstante (pI) von 5,88. Die Aminosäurezusammensetzung des CryET29-Proteins ist in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3 Aminosäurezusammensetzung von CryET29
4.4 Transformierte oder transgene Pflanzenzellen
Ein Bakterium, eine Hefezelle oder eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze, die mit einem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transformiert sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Ein transgenes Bakterium, eine transgene Hefezelle, Pflanzenzelle oder Pflanze, die aus einer solchen transformierten oder transgenen Zelle abgeleitet sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Mittel zum Transformieren von Bakterien und Hefezellen sind in der Technik wohlbekannt. Typischerweise sind die Mittel zur Transformation ähnlich den wohlbekannten Mitteln, die zum Transformieren anderer Bakterien oder Hefen, wie E. coli oder Saccharomyces cerevisiae, verwendet werden.
Zu den Verfahren für die DNA-Transformation von Pflanzenzellen gehören die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation, Protoplastentransformation, Genübertragung in Pollen, Injektion in Reproduktionsorgane, Injektion in unreife Embryos und Teilchenbombardierung. Jedes dieser Verfahren hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Ein bestimmtes Verfahren zum Einführen von Genen in einen bestimmten Pflanzenstamm ist also vielleicht nicht notwendigerweise für einen anderen Pflanzenstamm am effektivsten, aber es ist wohlbekannt, welche Verfahren für einen bestimmten Pflanzenstamm geeignet sind.
Zum Beispiel offenbaren die US-Patente 5,538,880 und 5,538,877 (Lundquist und Walters) Verfahren auf Mikroprojektilbasis zur Herstellung von fruchtbarem transgenem Mais. Das US-Patent 5,530,193 (Clark et al.) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von virusresistentem transgenem Mais. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die Fremd-DNA (wie Herbizid-Resistenz-Gene) enthalten, sind im US-Patent 5,633,435 (Barry et al.) offenbart. Das US-Patent 5,563,055 (Thomas und Townsend) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Sojabohnen unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelter Transformation. WO 95/27068 (Beach et al.) offenbart Verfahren zur Herstellung von Pflanzensamen, die genetisch so modifiziert wurden, dass sie ein vorausgewähltes Protein exprimieren. Die Erzeugung transgener Sojapflanzen durch Elektroporation von aus Keimblättern stammenden Protoplasten wird von Dhir und Widholm in WO 92/17598 beschrieben.
Agrobacterium wurde auch von Chee et al. verwendet, um undifferenzierte keimende Meristem- oder Mesokotylzellen erfolgreich zu transformieren (US-Patente 5,169,770 und 5,376,543 sowie WO 89/05859). Das US-Patent 5,597,718 (Brill et al.), das US-Patent 5,521,078 (Maliyakal) und das US-Patent 5,474,925 (Barton und Maliyakal) offenbaren verschiedene Verfahren zur Herstellung von transgener Baumwolle. WO 96/40924 (McBride et al.) beschreibt DNA-Konstrukte, die für die Herstellung von transgener Baumwolle geeignet sind. Eierstockspezifische Gewebetranscriptionsfaktoren wurden für die Transformation von Pflanzen beschrieben, um die gewebespezifische Produktion von heterologen Proteinen in transgener Baumwolle zu steuern (WO 96/26639, Martineau und Martineau, 1996).
Das US-Patent 5,349,126 (Chappell et al.) beschreibt Mittel zur Herstellung von transgenen Pflanzen, wie Tomate, Luzerne, Gerste, Karotten und Tabak, mit einer erhöhten Insektenresistenz. Fry und Zhou (US-Patent 5,631,152) offenbaren ein schnelles Transformationsregenerationssystem, um fruchtbaren transformierten Weizen zu erhalten. Fry und Zhou (EP-A-709 462, 1996) beschreiben die Herstellung von transgenen Einkeimblättrigen Pflanzen, wie Weizen, durch Transformieren von regenerierbarem Gewebe oder embryogenen Kalli mit einer Fremd-DNA. Das US-Patent 5,612,487 (Arntzen und Lam) beschreibt die Herstellung von antiviralem transgenem Tabak. Merikke et al. (US-Patent 5,589,625) beschreiben die Herstellung von transgenen Pflanzen (wie Tabak und Kartoffel), die eine multiple Virusresistenz exprimieren. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung von transgenen Pflanzen, die rekombinante 2,5-alpha-Synthetase-Aktivität enthalten. Das US-Patent 5,422,108 (Fitzmaurice und Mirkov) beschreibt die Herstellung von Pflanzen (einschließlich transgenen Tabaks), die resistent gegen bakterielle Pathogene der Gattungen Agrobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia und Clavibacter sind.
Kauppinen et al. (WO 95/26628, 1995) offenbaren ein Verfahren zur Erzeugung von fruchtbaren transgenen Gerstenpflanzen unter Verwendung von aus Mikrosporen isolierten Protoplasten. Chang et al. (WO 94/13822, 1994) beschreiben die Herstellung von stabil transformierten fruchtbaren Weizenpflanzen durch Bombardierung von Weizengewebe mit DNA, um Weizensorten mit hoher Ernte, hohem Nährwert und Krankheitsresistenz zu entwickeln. WO 93/18168 (Eyal et al., 1993) offenbart die Herstellung von transgenem Weizen, der Fremd-DNA enthält, unter Verwendung von wässrigen DNA-Lösungen, die vor der Befruchtung auf bestäubte Narben von emaskulierten Pflanzenblüten aufgetragen werden. Das US-Patent 5,405,765 und WO 93/04178 (Vasil und Vasil, 1992) offenbaren die Herstellung von transgenen Weizenpflanzen unter Verwendung von DNA-Abgabe an embryonalen Kallus vom Typ C, um die Expression von klonierten Genen (z.B. Herbizidresistenz) in der transformierten Pflanze zu ermöglichen.
Es gibt zwar viele Verfahren zur Einführung von transformierenden DNA-Segmenten in Zellen, aber nicht alle haben sich als geeignet erwiesen, um DNA an Pflanzenzellen abzugeben. Zu den geeigneten Verfahren gehört jedoch vermutlich praktisch jedes Verfahren, mit dem DNA in eine Zelle eingeführt werden kann, wie durch Agrobacterium-Infektion, direkte Abgabe von DNA, wie zum Beispiel durch PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten (Omirulleh et al., 1993), durch Dehydrierung/Hemmung vermittelte DNA-Aufnahme, durch Elektroporation, durch Rühren mit Siliciumcarbidfasern, durch Beschleunigung von DNA-beschichteten Teilchen usw.. In bestimmten Ausführungsformen werden Beschleunigungsverfahren bevorzugt und umfassen zum Beispiel die Mikroprojektil-Bombardierung und dergleichen.
Die Technologie zur Einführung von DNA in Zellen ist dem Fachmann wohlbekannt. Vier allgemeine Verfahren zur Abgabe eines Gens in Zellen wurden beschrieben: (1) chemische Verfahren (Graham und van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) physikalische Verfahren, wie Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Wong und Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) und die Genkanone (Johnston und Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis und Anderson, 1988a; 1988b); und (4) Rezeptor-vermittelte Mechanismen (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).
4.4.1 Elektroporation
Die Anwendung von kurzen elektrischen Hochspannungsimpulsen auf eine Vielzahl von Tier- und Pflanzenzellen führt zur Bildung von nanometergroßen Poren in der Plasmamembran. DNA wird direkt in das Cytoplasma aufgenommen, entweder durch diese Poren oder als Folge der Umverteilung von Membrankomponenten, die mit dem Schließen der Poren einhergeht. Elektroporation kann äußerst effizient sein und kann sowohl für die transiente Expression von klonierten Genen als auch zur Etablierung von Zelllinien, die integrierte Kopien des interessierenden Gens tragen, verwendet werden. Elektroporation führt im Gegensatz zur Calciumphosphat-vermittelten Transfektion und Protoplastenfusion häufig zu Zelllinien, die eine oder höchstens ein paar integrierte Kopien der Fremd-DNA tragen.
Die Einführung von DNA mittels Elektroporation ist dem Fachmann wohlbekannt. Bei diesem Verfahren werden bestimmte zellwandzersetzende Enzyme, wie pektinabbauende Enzyme, eingesetzt, um die gewünschten Empfängerzellen anfälliger für eine Transformation durch Elektroporation zu machen als unbehandelte Zellen. Alternativ dazu werden die Empfängerzellen durch eine mechanische Verwundung anfälliger für eine Transformation gemacht. Um eine Transformation durch Elektroporation zu bewirken, kann man entweder zerreibbare Gewebe, wie eine Suspensionskultur von Zellen oder embryogenen Kallus, einsetzen, oder alternativ dazu kann man unreife Embryos oder andere organisierte Gewebe direkt transformieren. Man würde die Zellwände der gewählten Zellen partiell abbauen, indem man sie pektinabbauenden Enzymen (Pektolyasen) aussetzt oder in kontrollierter Weise mechanisch verwundet. Solche Zellen würden dann empfänglich für eine DNA-Übertragung durch Elektroporation, die in diesem Stadium durchgeführt werden kann, und dann könnten transformierte Zellen je nach der Natur der neu eingebauten DNA durch eine geeignete Selektions- oder Screening-Anweisung identifiziert werden.
4.4.2 Mikroprojektil-Bombardierung
Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zur Abgabe von transformierenden DNA-Segmenten an Pflanzenzellen ist die Mikroprojektil-Bombardierung. Bei diesem Verfahren können Teilchen mit Nucleinsäuren beschichtet und durch eine vorwärtstreibende Kraft an Zellen abgegeben werden. Beispielhafte Teilchen sind solche, die aus Wolfram, Gold und Platin und dergleichen bestehen.
Ein Vorteil der Mikroprojektil-Bombardierung außer der Tatsache, dass sie ein wirksames Mittel ist, um Einkeimblättrige reproduzierbar und stabil zu transformieren, besteht darin, dass weder die Isolierung von Protoplasten (Cristou et al., 1988) noch die Anfälligkeit für eine Agrobacterium-Infektion erforderlich sind. Eine beispielhafte Ausführungsform eines Verfahrens zur Abgabe von DNA an Maiszellen durch Beschleunigung ist ein Biolistics Particle Delivery System, das verwendet werden kann, um mit DNA beschichtete Teilchen oder Zellen durch ein Sieb, wie ein Edelstahl- oder Nytex-Sieb, auf eine Filteroberfläche zu treiben, die mit in Suspension kultivierten Maiszellen bedeckt ist. Das Sieb dispergiert die Teilchen, so dass sie nicht in großen Aggregaten an die Empfängerzellen abgegeben werden. Vermutlich reduziert ein Sieb zwischen der Projektilapparatur und den zu bombardierenden Zellen die Größe der Projektilaggregate und kann zu einer größeren Transformationshäufigkeit beitragen, indem es Schäden reduziert, die bei den Empfängerzellen durch zu große Projektile entstehen.
Für die Bombardierung werden Zellen in Suspension vorzugsweise auf Filtern oder festem Kulturmedium konzentriert. Alternativ dazu können auch unreife Embryos oder andere Zielzellen auf festem Kulturmedium angeordnet sein. Die zu bombardierenden Zeilen befinden sich in einem geeigneten Abstand unterhalb der Makroprojektil-Abfangplatte. Falls gewünscht, befinden sich auch ein oder mehrere Siebe zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu bombardierenden Zellen. Durch die Verwendung der hier dargelegten Techniken kann man bis zu 1000 oder mehr Herde von Zellen erhalten, die ein Marker-Gen transient exprimieren. Die Zahl der Zellen in einem Herd, die das exogene Genprodukt exprimieren, liegt 48 h nach der Bombardierung häufig in einem Bereich von 1 bis 10 und im Durchschnitt 1 bis 3.
Bei der Transformation durch Bombardierung kann man die Kulturbedingungen vor der Bombardierung und die Bombardierungsparameter so optimieren, dass man die maximale Anzahl an stabilen Transformanten erhält. Sowohl die physikalischen als auch die biologischen Parameter für die Bombardierung sind bei dieser Technik wichtig. Physikalische Faktoren sind solche, die die Manipulation des DNA/Mikroprojektil-Niederschlags beinhalten, oder solche, die den Flug und die Geschwindig keit entweder der Makro- oder der Mikroprojektile beeinflussen. Zu den biologischen Faktoren gehören alle Schritte, die an der Manipulation von Zellen vor und unmittelbar nach der Bombardierung beteiligt sind, die osmotische Einstellung von Zielzellen, um die Linderung des mit der Bombardierung einhergehenden Traumas zu unterstützen, und auch die Natur der transformierenden DNA, wie linearisierte DNA oder intakte superspiralisierte Plasmide. Vermutlich sind die vor der Bombardierung erfolgenden Manipulationen für eine erfolgreiche Transformation von unreifen Embryos besonders wichtig.
Dementsprechend wird in Betracht gezogen, dass man vielleicht verschiedene der Bombardierungsparameter in Studien im kleinen Maßstab anpassen möchte, um die Bedingungen vollständig zu optimieren. Man möchte vielleicht insbesondere physikalische Parameter, wie Lückenabstand, Flugabstand, Gewebeabstand und Heliumdruck, einstellen. Man kann auch die Traumareduktionsfaktoren (TRF) durch modifizierende Bedingungen minimieren, die den physiologischen Zustand der Empfängerzellen beeinflussen und die daher auch die Transformations- und Integrationseffizienz beeinflussen können. Zum Beispiel können für eine optimale Transformation der osmotische Zustand, die Gewebehydratisierung und das Subkulturstadium oder der Zellzyklus der Empfängerzellen eingestellt werden. Die Ausführung von anderen Routineeinstellungen wird dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
4.4.3 Agrobacterium-vermittelte Übertragung
Die Agrobacterium-vermittelte Übertragung ist ein breit anwendbares System für die Einführung von Genen in Pflanzenzellen, da die DNA in ganze Pflanzengewebe eingeführt werden kann, wodurch man die Notwendigkeit der Regeneration einer intakten Pflanze aus einem Protoplasten umgeht. Die Verwendung von Agrobacterium-vermittelten Pflanzenintegrationsvektoren für die Einführung von DNA in Pflanzenzellen ist in der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel die beschriebenen Verfahren (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). Weiterhin ist die Integration der Ti-DNA ein relativ genaues Verfahren, das nur zu wenigen Umordnungen führt. Der zu übertragende DNA-Bereich wird durch die Bordersequenzen definiert, und dazwischenliegende DNA wird üblicherweise in das Pflanzengenom eingefügt, wie es beschrieben ist (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).
Moderne Agrobacterium-Transformationsvektoren sind zur Replikation in E. coli sowie Agrobacterium befähigt, was bequeme Manipulationen ermöglicht, wie es beschrieben ist (Klee et al., 1985). Außerdem haben jüngere technologische Fortschritte in Vektoren für die Agrobacterium-vermittelte Gen-Übertragung die Anordnung von Genen und Restriktionsstellen in den Vektoren verbessert, so dass die Konstruktion von Vektoren, die zum Exprimieren verschiedener Polypeptidcodierender Gene befähigt sind, erleichtert wird. Die beschriebenen Vektoren (Rogers et al., 1987) haben zweckmäßige Multilinkerbereiche, die von einem Promotor und einer Polyadenylierungsstelle flankiert werden, für die direkte Expression von eingefügten Polypeptid-codierenden Genen und sind für die vorliegenden Zwecke geeignet. Außerdem kann sowohl Agrobacterium, das funktionelle Ti-Gene enthält, als auch eines, das unschädlich gemachte Ti-Gene enthält, für die Transformationen verwendet werden. In solchen Pflanzenstämmen, bei denen die Agrobacterium-vermittelte Transformation effizient ist, ist sie wegen der leichten und definierten Genübertragung das Verfahren der Wahl.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Blattscheiben und anderen Geweben, wie Keimblättern und Hypokotylen, scheint auf Pflanzen beschränkt zu sein, die natürlicherweise von Agrobacterium infiziert werden. Die Agrobacteriumvermittelte Transformation ist bei Zweikeimblättrigen Pflanzen am effizientesten. Nur wenige Einkeimblättrige scheinen natürliche Wirte für Agrobacterium zu sein, doch wurden bei Spargel mit Hilfe von Agrobacterium-Vektoren transgene Pflanzen erzeugt, wie beschrieben (Bytebier et al., 1987). Daher müssen kommerziell wichtige Getreide, wie Reis, Mais und Weizen, gewöhnlich mit alternativen Verfahren transformiert werden. Wie oben erwähnt, kann jedoch auch die Transformation von Spargel mit Hilfe von Agrobacterium erreicht werden (siehe zum Beispiel Bytebier et al., 1987).
Eine transgene Pflanze, die mit Hilfe von Agrobacterium-Transformationsverfahren gebildet wurde, enthält typischerweise ein einzelnes Gen auf einem einzigen Chromosom. Solche transgenen Pflanzen können als heterozygot in Bezug auf das hinzugefügte Gen bezeichnet werden. Da die Verwendung des Wortes "heterozygot" jedoch gewöhnlich die Anwesenheit eines komplementären Gens auf demselben Locus des zweiten Chromosoms eines Chromosomenpaars impliziert und es kein solches Gen in einer Pflanze gibt, die wie hier nur ein einziges hinzugefügtes Gen enthält, ist ein vermutlich treffenderer Name für eine solche Pflanze eine "unabhängige segregierende", da das hinzugefügte, exogene Gen während der Mitose und Meiose unabhängig segregiert.
Besonders bevorzugt ist eine transgene Pflanze, die homozygot in Bezug auf das hinzugefügte Struktur-Gen ist, d.h., eine transgene Pflanze, die zwei hinzugefügte Gene enthält, jeweils ein Gen auf demselben Locus auf jedem Chromosom eines Chromosomenpaars. Eine homozygote transgene Pflanze kann erhalten werden, indem man eine unabhängig segregierende transgene Pflanze, die ein einzelnes hinzugefügtes Gen enthält, geschlechtlich mit sich selbst paart (Selbstbestäubung), einige der erzeugten Samen keimen lässt und die resultierenden Pflanzen auf eine verstärkte Carboxylase-Aktivität relativ zu einer Kontrolle (nativ, nichttransgen) oder einer unabhängig segregierenden transgenen Pflanze hin analysiert.
Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass auch zwei verschiedene transgene Pflanzen miteinander gepaart werden können, wobei Nachkommen entstehen, die zwei unabhängig segregierende hinzugefügte exogene Gene enthalten. Durch Selbstbestäubung von geeigneten Nachkommen können Pflanzen entstehen, die in Bezug auf beide hinzugefügten exogenen Gene, die ein interessierendes Polypeptid codieren, homozygot sind. Die Rückkreuzung mit einer Elternpflanze und die Kreuzung mit einer nicht verwandten, nichttransgenen Pflanze werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Die Transformation von Pflanzenprotoplasten kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf Calciumphosphat-Fällung, Polyethylenglycol-Behandlung, Elektroporation und Kombinationen dieser Behandlungen beruhen (siehe z.B. Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).
Die Anwendung dieser Systeme auf verschiedene Pflanzenstämme hängt von der Möglichkeit ab, diesen besonderen Pflanzenstamm aus Protoplasten zu regenerieren. Beispielhafte Verfahren zur Regeneration von Getreiden aus Protoplasten sind beschrieben (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).
Um Pflanzenstämme zu transformieren, die aus Protoplasten nicht erfolgreich regeneriert werden können, können andere Methoden zur Einführung von DNA in intakte Zellen oder Gewebe verwendet werden. Zum Beispiel kann die Regeneration von Getreiden aus unreifen Embryos oder Explantaten bewirkt werden, wie es beschrieben ist (Vasil, 1988). Außerdem kann auch "Teilchenkanonen-" oder Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektiltechnik verwendet werden (Vasil, 1992).
Bei Verwendung der letzteren Technik wird DNA auf der Oberfläche von kleinen Metallteilchen durch die Zellwand und in das Cytoplasma getragen, wie es beschrieben ist (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988). Die Metallteilchen dringen durch mehrere Schichten von Zellen und ermöglichen so die Transformation von Zellen innerhalb von Gewebeexplantaten.
4.5 Verfahren zur Herstellung von insektenresistenten transgenen Pflanzen
Durch Transformieren einer geeigneten Wirtszelle, wie einer Pflanzenzelle, mit einem rekombinanten, ein cryET29-Gen enthaltenden Segment kann die Expression des codierten Kristallproteins (d.h. eines bakteriellen Kristallproteins oder -polypeptids mit insektizider Aktivität gegen Coleoptera) zur Bildung von insektenresistenten Pflanzen führen.
Zum Beispiel kann man einen Expressionsvektor, der einen codierenden Bereich für ein B.-thuringiensis-Kristallprotein und einen geeigneten Selektionsmarker enthält, verwenden, um eine Suspension von embryonalen Pflanzenzellen, wie Weizen- oder Maiszellen, zu transformieren, wobei man ein Verfahren wie Teilchenbombardierung (Maddock et al., 1991; Vasil et al., 1992) verwendet, um die DNA, mit der Mikroprojektile beschichtet sind, an die Empfängerzellen abzugeben.
Dann werden transgene Pflanzen aus transformierten embryonalen Kalli, die die insektiziden Proteine exprimieren, regeneriert.
Die Bildung von transgenen Pflanzen kann auch mit Hilfe von anderen Verfahren der Zelltransformation erreicht werden, die in der Technik bekannt sind, wie Agrobacterium-vermittelte DNA-Übertragung (Fraley et al., 1983). Alternativ dazu kann die DNA auch durch direkte DNA-Übertragung in Pollen (Zhou et al., 1983; Hess, 1987; Luo et al., 1988), durch Injektion der DNA in Reproduktionsorgane einer Pflanze (Pena et al., 1987) oder durch direkte Injektion von DNA in die Zellen von unreifen Embryos mit anschließender Rehydratisierung der dehydrierten Embryos (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986) in Pflanzen eingeführt werden.
Die Regeneration, Entwicklung und Kultivierung von Pflanzen aus einzelnen Pflanzenprotoplasten-Transformanten oder aus verschiedenen transformierten Explantaten ist in der Technik wohlbekannt (Weissbach und Weissbach, 1988). Dieser Regenerations- und Wachstumsvorgang beinhaltet typischerweise die Schritte der Selektion von transformierten Zellen, das Kultivieren dieser individualisierten Zellen durch die üblichen Stadien der Embryonalentwicklung hindurch und durch das Stadium des bewurzelten Pflänzchens hindurch. Transgene Embryos und Samen werden ähnlich regeneriert. Die resultierenden transgenen bewurzelten Schösslinge werden danach in ein geeignetes Pflanzenwachstumsmedium, wie Erde, gepflanzt.
Die Entwicklung oder Regeneration von Pflanzen, die das exogene Gen (Fremd-Gen) enthalten, welches ein interessierendes Polypeptid codiert und das durch Agrobacterium aus Blattexplantaten eingeführt wurde, kann durch Verfahren erreicht werden, die in der Technik wohlbekannt sind, wie es beschrieben ist (Horsch et al., 1985). Bei diesem Verfahren werden Transformanten in Gegenwart eines Selektionsmittels und in einem Medium, das die Regeneration von Schösslingen in dem transformierten Pflanzenstamm induziert, kultiviert, wie es beschrieben ist (Fraley et al., 1983).
Dieses Verfahren ergibt typischerweise innerhalb von zwei bis vier Monaten Schösslinge, und diese Schösslinge werden dann auf ein geeignetes wurzelinduzierendes Medium übertragen, das das Selektionsmittel und ein Antibiotikum, um Bakterienwachstum zu verhindern, enthält. Dann werden Schösslinge, die in Gegenwart des Selektionsmittels unter Bildung von Pflänzchen Wurzeln ausbildeten, in Erde oder ein anderes Medium umgepflanzt, um die Erzeugung von Wurzeln zu ermöglichen. Diese Verfahren variieren in Abhängigkeit von dem besonderen eingesetzten Pflanzenstamm, wobei solche Variationen in der Technik wohlbekannt sind.
Vorzugsweise werden die regenerierten Pflanzen einer Selbstbestäubung unterzogen, um homozygote transgene Pflanzen zu erhalten, wie es bereits diskutiert wurde. Ansonsten wird Pollen, der von den regenerierten Pflanzen erhalten wird, mit aus Samen aufgezogenen Pflanzen von agronomisch wichtigen, vorzugsweise ingezüchteten Linien gekreuzt. Umgekehrt wird Pollen von Pflanzen dieser wichtigen Linien verwendet, um regenerierte Pflanzen zu bestäuben. Eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, die ein gewünschtes Polypeptid enthält, wird mit Hilfe von Verfahren kultiviert, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Eine transgene Pflanze dieser Erfindung weist also eine erhöhte Menge eines codierenden Bereichs (z.B. ein cry-Gen) auf, der das interessierende Cry-Polypeptid codiert. Eine bevorzugte transgene Pflanze ist eine unabhängig segregierende und kann das Gen und seine Aktivität an seine Nachkommenschaft weitergeben. Eine besonders bevorzugte transgene Pflanze ist homozygot in Bezug auf dieses Gen und gibt das Gen bei geschlechtlicher Paarung an alle ihre Nachkommen weiter. Samen von einer transgenen Pflanze kann auf dem Feld oder im Gewächshaus ausgesät werden, und die resultierenden geschlechtsreifen Pflanzen werden einer Selbstbestäubung unterzogen, um echte Zuchtpflanzen zu erzeugen. Die Nachkommenschaft dieser Pflanzen wird zu echten Zuchtlinien, die zum Beispiel in Bezug auf erhöhte insektizide Kapazität gegen Coleoptera-Insekten und Katzenflohlarven, vorzugsweise auf dem Feld, unter einer Reihe von Umgebungsbedingungen bewertet werden. Die Erfinder gehen davon aus, dass die vorliegende Erfindung besonderen Nutzen bei der Schaffung von transgenen Pflanzen von kommerziellem Interesse finden wird, einschließlich verschiedener Rasengräser, Weizen, Mais, Reis, Gerste, Hafer, eine Vielzahl von Zierpflanzen und Gemüsen sowie einer Reihe von nuss- und obsttragenden Bäumen und Pflanzen.
4.6 Nomenklatur von CryET29
Die Erfinder haben dem neuen Protein der Erfindung willkürlich die Bezeichnung CryET29 zugeordnet. Ebenso wurde der neuen Nucleinsäuresequenz, die dieses Polypeptid codiert, die willkürliche Bezeichnung cryET29 zugeordnet. Die formale Zuordnung der Gen- und Proteinbezeichnungen auf der Basis der überarbeiteten Nomenklatur der Kristallprotein-Endotoxine (Tabelle 1) wird von einem Komitee für die Nomenklatur von B. thuringiensis erfolgen, das gebildet wurde, um B.-thuringiensis-Kristallproteine systematisch zu klassifizieren. Die Erfinder gehen davon aus, dass die willkürlich zugeordneten Bezeichnungen der vorliegenden Erfindung durch die offizielle Nomenklatur, die diesen Sequenzen zugeordnet wird, ersetzt wird.
4.7 Definitionen
Die folgenden Wörter und Ausdrücke haben die unten dargelegten Bedeutungen.
Ein, eine: Im Einklang mit der ständigen Patenttradition sollen "ein" oder "eine", wie sie in dieser gesamten Offenbarung verwendet werden, "ein/eine oder mehrere" bedeuten.
Breitband: bezieht sich auf einen breiten Bereich von Insektenspezies.
Insektizide Breitbandaktivität: Toxizität gegenüber einem breiten Bereich von Insektenspezies.
Expression: Die Kombination von intrazellulären Vorgängen einschließlich der Transcription und Translation, die ein codierendes DNA-Molekül, wie ein Struktur-Gen, erfährt, so dass ein Polypeptid entsteht.
Insektizide Aktivität: Toxizität gegenüber Insekten.
Insektizide Spezifität: Toxizität, die ein Kristallprotein gegenüber mehreren Insektenspezies aufweist.
Intraorder-Spezifität: die Toxizität eines bestimmten Kristallproteins gegenüber Insektenspezies innerhalb einer Insektenordnung (z.B. Ordnung Lepidoptera).
Interorder-Spezifität: die Toxizität eines bestimmten Kristallproteins gegenüber Insektenspezies aus verschiedenen Ordnungen (z.B. Ordnungen Lepidoptera und Diptera).
LC₅₀: die letale Konzentration an Kristallprotein, die eine Mortalität der behandelten Insekten von 50% bewirkt.
LC₉₅: die letale Konzentration an Kristallprotein, die eine Mortalität der behandelten Insekten von 95% bewirkt.
Promotor: Eine Erkennungsstelle auf einer DNA-Sequenz oder Gruppe von DNA-Sequenzen, die ein Expressionssteuerungselement für ein Struktur-Gen liefert und an die RNA-Polymerase spezifisch bindet und die RNA-Synthese (Transcription) dieses Gens einleitet.
Regeneration: Der Vorgang des Wachsenlassens einer Pflanze aus einer Pflanzenzelie (z.B. Pflanzenprotoplast oder Explantat).
Struktur-Gen: Ein Gen, das exprimiert wird, so dass ein Polypeptid entsteht.
Transformation: Vorgang der Einführung einer exogenen DNA-Sequenz (z.B. eines Vektors, eines rekombinanten DNA-Moleküls) in eine Zelle oder einen Protoplasten, wo diese exogene DNA in ein Chromosom eingebaut wird oder zur autonomen Replikation befähigt ist.
Transformierte Zelle: Eine Zelle, deren DNA durch die Einführung eines exogenen DNA-Moleküls in diese Zelle verändert wurde.
Transgen: Ein Fremd-Gen, das nach Einführung in das Genom einer Wirtszelle durch einen Vorgang wie Transformation, Elektroporation, Teilchenbombardierung und dergleichen von der Wirtszelle exprimiert und in das Genom der Zellen integriert wird, so dass die Eigenschaft oder Eigenshaften, die durch die Expression des Transgens erzeugt werden, von der Nachkommenschaft der transformierten Zelle geerbt werden.
Transgene Zelle: Jede Zelle, die von einer transformierten Zelle abgeleitet ist oder regeneriert wurde oder von einer transgenen Zelle abgeleitet ist. Beispielhafte transgene Zellen sind Pflanzenkalli, die von einer transformierten Pflanzenzelle abgeleitet sind, sowie besondere Zellen, wie Blatt-, Wurzel-, Stängelzellen, z.B. somatische Zellen oder reproduktive Zellen (Keimzellen), die von einer transgenen Pflanze erhalten werden.
Transgene Pflanze: Eine Pflanze oder deren Nachkommenschaft, die von einer transformierten Pflanzenzelle oder einem transformierten Protoplasten abgeleitet sind, wobei die Pflanzen-DNA ein eingeführtes Fremd-DNA-Molekül enthält, das in einer nativen, nichttransgenen Pflanze desselben Stammes ursprünglich nicht vorhanden ist. Die Ausdrücke "transgene Pflanze" und "transformierte Pflanze" werden in der Technik zuweilen als synonyme Ausdrücke verwendet, um eine Pflanze zu definieren, deren DNA ein exogenes DNA-Molekül enthält. Wir halten es jedoch für wissenschaftlich korrekter, eine regenerierte Pflanze oder einen regenerierten Kallus, die bzw. der aus einer transformierten Pflanzenzelle oder einem transformierten Protoplasten erhalten wurde, als transgene Pflanze zu bezeichnen, und diese Verwendung wird hier befolgt.
Vektor: Ein DNA-Molekül, das zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und/oder mit dem ein anderes DNA-Segment funktionell verknüpft werden kann, so dass es zu einer Replikation des daran befestigten Segments kommt. Ein Plasmid ist ein Beispiel für einen Vektor.
5. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind mit aufgenommen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung aufzuzeigen. Der Fachmann sollte sich darüber im Klaren sein, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Ansätze darstellen, von denen die Erfinder herausgefunden haben, dass sie bei der praktischen Ausführung der Erfindung gut funktionieren, und diese können daher als bevorzugte praktische Ausführungsweisen derselben gelten.
5.1 Beispiel 1 – Isolierung von B. thuringiensis EG4096
Getreidestaubproben wurden aus verschiedenen Quellen in den gesamten USA und im Ausland, typischerweise Kornspeichereinrichtungen, erhalten. Die Getreidestaubproben wurden behandelt und auf Agarplatten ausgebreitet, um individuelle Kolonien des Bacillus-Typs zu isolieren, wie es beschrieben ist (Donovan et al., 1993). EG4096 ist ein Wildtyp-B.-thuringiensis-Stamm, der aus einer Getreidestaubprobe aus Thailand isoliert wurde. Phasenkontrastmikroskopie wurde verwendet, um die Kristallmorphologie der Bakterienkolonien, die aus diesem Getreidestaub erzeugt werden, visuell zu untersuchen. Die als EG4096 bezeichnete Kolonie enthielt Endosporen und kristalline Einschlüsse mit einer einzigartigen Morphologie, die kurzen Nadeln ähnelte. Die Anordnung von Plasmiden, die dem Stamm EG4096 nativ sind, ist ebenfalls einzigartig.
Mit einem Insekten-Bioassay dieses Wildtyp-B.-thuringiensis-Stammes wurde bestimmt, dass er eine insektizide Wirkung gegen Larven von Coleoptera-Insekten einschließlich des Südlichen Maiswurzelbohrers, des Westlichen Maiswurzelbohrers, des Kartoffelkäfers, des Rotbraunen Reismehlkäfers und des Japankäfers hat. EG4096 weist auch eine insektizide Aktivität gegen Larven des Katzenflohs auf.
Die Charakterisierung von EG4096 beinhaltete die Analyse von Kristallprotein, das während der Sporenbildung und der Klonierung und Expression des als cryET29 bezeichneten Gens, das das Kristallprotein codiert, von dem Stamm produziert wird. Die insektizide Aktivität sowohl des Wildtypstamms als auch eines rekombi nanven B. thuringiensis, das das klonierte cryET29-Toxin-Gen exprimiert, wurde bestimmt.
5.2 Beispiel 2 – Native Plasmide des B.-thuringiensis-Stamms EG4096
Das Komplement von nativen Plasmiden, die in isoliertem B. thuringiensis EG4096 enthalten sind, wurde durch modifizierte Eckhardt-Agarose-Gel-Elektrophorese bestimmt, wie sie in Gonzalez et al. (1982) beschrieben ist. Das Muster der nativen Plasmide entsprach nicht den Mustern von typischen bekannten Serovarianten (Carlton und Gonzalez, 1985). Die Plasmidgrößen betragen 5,0, 7,2, 6,0 (offen zirkulär), 39, 80 und 100 MDa.
5.3 Beispiel 3 – Kristallprotein von B. thuringiensis EG4096
EG4096 wurde drei Tage lang bei 30 °C in DSM+-Glucose-Sporenbildungsmedium [0,8% (w/v) Difco-Nährbrühe, 0,5% (w/v) Glucose, 10 mM K₂HPO₄, 10 mM KH₂PO₄, 1 mM Ca(NO₃)₂, 0,5 mM MgSO₄, 10 μM MnCl₂, 10 μM FeSO₄] gezüchtet, und während dieser Zeit wuchs die Kultur bis zur stationären Phase, bildete Sporen und lysierte, so dass die Proteineinschlüsse in das Medium freigesetzt wurden. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet, wodurch die Sporen und Kristalle sedimentiert wurden. Das Sediment wurde in einer Lösung von 0,005% Triton X-100^®, 2 mM EDTA gewaschen und erneut zentrifugiert. Das gewaschene Sediment wurde in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens von 0,005% Triton X-100^®, 2 mM EDTA resuspendiert.
Kristallprotein wurde aus der Sporen-Kristall-Suspension solubilisiert, indem man die Suspension 5 min lang bei 100 °C in Solubilisierungspuffer [0,14 M Tris-HCl, pH 8,0, 2% (w/v), Natriumdodecylsulfat (SDS), 5 Vol.-% 2-Mercaptoethanol, 10 Vol.-% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau] inkubierte. Das in Lösung gebrachte Kristallprotein wurde durch SDS-PAGE nach Größe aufgetrennt. Nach der Auftrennung nach Größe wurden die Proteine durch Anfärben mit Coomassie Brilliant Blue R-250 sichtbar gemacht. Diese Analyse zeigte, dass das größere Kristallprotein, das in den Kulturen von EG4096, die Sporen gebildet hatten, vorhanden war, eine Größe von ungefähr 25 kD hatte. Dieses neue Protein wurde als CryET29 bezeichnet.
Um CryET29 näher zu charakterisieren, wurde die NH₂-terminale Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt. Eine Kultur von EG4096, die Sporen gebildet hatte, wurde gewaschen und resuspendiert. Die Suspension wurde in Lösung gebracht und auf einem Acrylamid-Gel laufen gelassen, wobei die Vorschriften für eine SDS-PAGE-Analyse befolgt wurden. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine BioRad-PVDF-Membran übertragen, wobei Standard-Western-Blotting-Verfahren befolgt wurden. Nach der Übertragung wurde die Membran dreimal in dH₂O gespült und 1 min lang in Amido Black 1013 gewaschen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Der Filter wurde 1 min lang in 5% Essigsäure vom Farbstoff befreit und dann in dreimal ausgewechseltem dH₂O gespült. Der Teil des Filters, der die Proteinbande von ungefähr 25 kD enthielt, wurde mit einer Rasierklinge herausgeschnitten. Dieses Verfahren führte zu einer reinen Form von CryET29, das als Protein erhalten wird, welches durch Blotting auf eine PVDF-Membran (BioRad, Hercules, CA) übertragen wird.
Die Bestimmung der NH₂-terminalen Aminosäuresequenz des auf der Membran immobilisierten gereinigten CryET29-Proteins wurde im Department of Physiology an der Tufts Medical School, Boston, MA, durchgeführt, wobei Standardverfahren des automatischen Edman-Abbaus verwendet wurden. Die NH₂-terminale Sequenz wurde bestimmt zu:
Computer-Algorithmen (Korn und Queen, 1984) wurden verwendet, um die N-terminale Sequenz des CryET29-Proteins mit Aminosäuresequenzen aller B.-thuringiensis-Kristallproteine, von denen die Erfinder wissen, einschließlich der Sequenzen aller B.-thuringiensis-Kristallproteine, die in der wissenschaftlichen Literatur, in internationalen Patentanmeldungen oder erteilten Patenten veröffentlicht sind, zu vergleichen. Eine Liste der Kristallproteine, deren Sequenzen veröffentlicht wurden, zusammen mit der Publikationsquelle ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 In der Literatur beschriebene B.-thuringiensis-Kristallproteine
Es zeigte sich, dass die N-terminale Sequenz des CryET29-Proteins zu keiner der in Tabelle 4 identifizierten bekannten B.-thuringiensis-Kristallproteine homolog ist.
5.4 Beispiel 4 – Isolierung eines DNA-Fragments, das das B.-thuringiensis-EG4096-cryET29-Gen umfasst
Um das Gen zu identifizieren, das das CryET29-Protein codiert, wurde eine Oligonucleotidsonde entworfen, die für die NH₂-terminate Aminosäuresequenz des Proteins spezifisch war. Unter Verwendung von Codons, die man typischerweise in B.-thuringiensis-Toxin-Genen findet, wurde ein Oligonucleotid von 35 Nucleotiden von Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) synthetisiert und als wd270 bezeichnet. Die Sequenz von wd270 ist:
5'-ATGTTTTTTAATAGAGTAATTACATTAACAGTACC-3' (SEQ ID NO:4)
Radioaktiv markiertes wd270 wurde als Sonde in Southern-Blot-Studien verwendet, wie es unten beschrieben ist, um ein DNA-Restriktionsfragment zu identifizieren, das das cryET29-Gen enthält. Gesamt-DNA wurde nach dem folgenden Verfahren aus EG4096 extrahiert. Vegetative Zellen wurden in einem Lysepuffer, der 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA und 4 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Die Suspension wurde eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Suspension mit dem gleichen Volumen Phenol, einmal mit dem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (50:48:2) und einmal mit dem gleichen Volumen Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. DNA wurde durch Zugabe von einem Zehntel Volumen 3 M Natriumacetat und dann zwei Volumina 100% Ethanol aus der wässrigen Phase ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugation gewonnen, mit 70% Ethanol gewaschen und in dH₂O resuspendiert.
Dann wurde die extrahierte DNA in getrennten Reaktionen mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen einschließlich EcoRI abgebaut. Die abgebaute DNA wurde durch Elektrophorese durch ein 0,8% Agarose-Gel in 1X TBE über Nacht mit 2 V/cm nach Größe fraktioniert. Die fraktionierten DNA-Fragmente wurden nach dem Verfahren von Southern (1975) auf ein Immobilon-NC-Nitrocellulosefilter (Millipore Corp., Bedford, MA) übertragen. DNA wurde durch Backen bei 80 °C in einem Vakuumofen auf dem Filter fixiert.
Um die DNA-Fragmente zu identifizieren, die die Sequenz enthalten, die den NH₂-Terminus des CryET29-Proteins codiert (siehe Beispiel 3), wurde das Oligonucleotid wd270 an den 5'-Enden radioaktiv markiert und als Hybridisierungssonde verwendet. Um die Sonde radioaktiv zu markieren, wurden 1 bis 5 pmol wd270 zu einer Reaktion gegeben, die [γ-³²P]ATP (3 μl mit 3000 Ci/mmol bei 10 mCi/ml in 20 μl Reaktionsvolumen), einen 10X-Reaktionspuffer (700 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT) und 10 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (Promega Corporation, Madison, WI) enthielt. Die Reaktion wurde 20 min lang bei 37 °C inkubiert, um die Übertragung des radioaktiven Phosphats auf das 5'-Ende des Oligonucleotids zu ermöglichen, so dass es als Hybridisierungssonde geeignet ist.
Dann wurde die markierte Sonde über Nacht bei 45 °C mit dem Nitrocellulosefilter in 3X SSC, 0,1% SDS, 10X Denhardt-Reagens (0,2% BSA, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll), 0,2 mg/ml Heparin, inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Filter bei 45 °C in mehrmals gewechseltem 3X SSC, 0,1% SDS gewaschen, Der Filter wurde trockengelöscht und über Nacht bei –70 °C auf Kodak X-OMAT AR Röntgenfilm (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) mit einer Verstärkerfolie des Typs DuPont Cronex Lightning Plus einwirken gelassen.
Dann wurde die markierte Sonde mit dem Nitrocellulosefilter inkubiert, das dann gewaschen und auf Röntgenfilm einwirken gelassen wurde, so dass man ein Autoradiogramm erhielt.
Bei einer Untersuchung des Autoradiogramms wurden zwei getrennte EcoRI-Restriktionsfragmente von ungefähr 5,0 kb und 7,0 kb identifiziert, die spezifisch mit der markierten wd270-Sonde hybridisierten. Dieses Ergebnis zeigte an, dass Stamm EG4096 entweder zwei nahe verwandte oder identische Kopien des cryET29-Gens enthielt, die beide mit dem wd270-Oligonucleotid hybridisierten.
5.5 Beispiel 5 – Klonierung des cryET29-Gens von B. thuringiensis EG4096
Um die 5,0 und 7,0 Kilobasen (kb) großen EcoRI-Restriktionsfragmente zu isolieren, die das cryET29-Gen enthalten, wurde genomische Gesamt-DNA aus dem Stamm EG4096 isoliert, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist. Die DNA wurde mit EcoRI abgebaut und einer Elektrophorese auf einem Gel mit 0,8% Agarose und 1X TBE über Nacht mit 2 V/cm Gellänge unterzogen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt, so dass die abgebaute DNA sichtbar gemacht werden konnte, wenn sie langwelligem UV-Licht ausgesetzt wurde. Gelscheiben, die DNA-Fragmente von ungefähr 5,0 und 7,0 kb enthielten, wurden mit einer Rasierklinge aus dem Gel herausgeschnitten und in getrennte Dialysebeutel gegeben, die ein kleines Volumen (1 ml) 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) enthielten. Die DNA-Fragmente wurden aus den Gelscheiben in den TE-Puffer eluiert, indem man die Dialysebeutel in eine horizontale Elektrophoreseapparatur gab, die mit 1X TBE gefüllt war, und 2 h lang 100 V anlegte. Dies führt dazu, dass die DNA-Fragmente aus der Gelscheibe in den TE-Puffer wandern. Der TE-Puffer, der die eluierten Fragmente enthielt, wurden dann einer Extraktion mit Phenol:Chloroforn und Ausfällung mit Ethanol unterzogen.
Um eine Bibliothek der beiden Gruppen von größeselektierten EcoRI-Restriktionsfragmenten (ungefähr 5,0 und 7,0 kb) in E. coli zu schaffen, wurden die Fragmente in den Klonierungsvektor pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) ligiert. Der Plasmid-DNA-Vektor pUC18 kann sich in E. coli mit hoher Kopienzahl replizieren und trägt das Gen für die Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin, das als Selektionsmarker verwendet werden kann. Die beiden Gruppen von Fragmenten wurden in getrennten Reaktionen mit EcoRI-abgebautem pUC18 gemischt, das mit bakterieller Alkalischer Phosphatase (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) behandelt worden war, um die 5'-Phosphatgruppen von dem abgebauten Plasmid zu entfernen und dadurch die Religierung des Vektors mit sich selbst zu verhindern. T4-Ligase und ein Ligierungspuffer (Promega Corporation, Madison, WI) wurden zu der Reaktion gegeben, die das abgebaute pUC18 und die größeselektierten EcoRI-Fragmente enthielt. Diese wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Insertion und Ligierung der EcoRI-Fragmente in die pUC18-Vektor-DNA zu ermöglichen.
Die oben beschriebenen Ligierungsgemische wurden getrennt in transformationskompetente E.-coli-DH5α^TM-Zellen (bezogen von GicoBRL, Gaithersburg, MD) eingeführt, wobei die vom Hersteller beschriebenen Vorgehensweisen befolgt wurden. Die transformierten E.-coli-Zellen wurden auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Beide Transformationen ergaben ungefähr 300 ampicillinresistente Kolonien, was die Anwesenheit eines rekombinanten Plasmids in den Zellen jeder Kolonie anzeigte.
Um die Kolonien, die die klonierten 5,0- und 7,0-kb-EcoRI-Fragmente beherbergen, welche die cryET29-Gensequenzen enthalten, zu isolieren, wurden die transformierten E.-coli-Kolonien zuerst auf Nitrocellulose-Filter übertragen. Dies wurde bewerkstelligt, indem man einfach einen Rundfilter (Millipore HATF 085 25, Millipore Corp., Bedford, MA) direkt auf die LB-Ampicillin-Agarplatten legte, die die transformierten Kolonien enthielten. Wenn der Filter langsam von der Platte abgelöst wird, bleiben die Kolonien an dem Filter kleben und ergeben eine exakte Kopie des Musters von Kolonien von der ursprünglichen Platte. Von jeder Kolonie bleiben genügend Zellen auf der Platte zurück, so dass die Kolonien durch 5 bis 6 Stunden Wachstum bei 37 °C wiederhergestellt werden. Dann wurden die Platten bei 4 °C aufbewahrt, bis sie benötigt werden. Dann wurden die Nitrocellulosefilter mit den übertragenen Kolonien mit der Kolonieseite nach oben auf frische LB-Ampicillin-Agarplatten gelegt und bei 37 °C wachsen gelassen, bis sie eine Größe von ungefähr 1 mm im Durchmesser erreichten.
Um die DNA aus den rekambinanten E.-coli-Zellen auf den Nitrocellulosefilter freizusetzen, wurden die Filter 15 min lang mit der Kolonieseite nach oben auf Z Blätter Whatman 3 MM Chromatography Paper (Whatman International Ltd., Maidstone, England), das mit 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl getränkt war, gelegt. Durch diese Behandlung werden die Zellen lysiert und die freigesetzte DNA denaturiert, so dass sie am Nitrocellulose-Filter kleben bleiben kann. Dann wurden die Filter neutralisiert, indem man sie 10 min lang mit der Kolonieseite nach oben auf 2 Blätter Whatman-Papier legte, das mit 1 M NH₄-Acetat, 0,02 M NaOH getränkt war. Dann wurden die Filter in 3X SSC abgespült, an der Luft getrocknet und eine Stunde lang bei 80 °C in einem Vakuumofen gebrannt, um sie für die Hybridisierung vorzubereiten.
Das für das cryET29-Gen spezifische NH₂-terminate Oligonucleotid wd270 wurde am 5'-Ende mit γ-³²P und T4-Polynucleotid-Kinase markiert, wie es oben beschrieben ist. Die markierte Sonde wurde zu den Filtern in 3X SSC, 0,1% SDS, 10X Denhardt-Reagens (0,2% BSA, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll), 0,2 mg/ml Heparin gegeben und über Nacht bei 45 °C inkubiert. Diese Bedingungen wurden gewählt, um eine Hybridisierung des markierten Oligonucleotids mit verwandten Sequenzen zu ermöglichen, die sich auf den Nitrocellulose-Blots der transformierten E.-coli-Kolonien befanden. Nach der Inkubation wurden die Filter bei 45 °C in mehrmals gewechseltem 3X SSC, 0,1% SDS gewaschen. Die Filter wurden trockengelöscht und über Nacht bei –70 °C auf Kodak X-OMAT AR Röntgenfilm (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) mit einer Verstärkerfolie des Typs DuPont Cronex Lightning Plus einwirken gelassen.
Mehrere Kolonien aus jeder Transformation (den oben beschriebenen 5,0- und 7,0-kb-Ligierungsmischungen) hybridisierten mit wd270. Diese Kolonien wurden identifiziert, indem man die Signale auf dem Autoradiogramm mit den Kolonien auf den ursprünglichen Transformationsplatten abglich. Dann wurden die isolierten Kolonien in LB-Ampicillin-Flüssigmedium gezüchtet, aus dem die Zellen geerntet werden konnten, und rekombinantes Plasmid wurde nach dem Standard-Miniprep-Verfahren mit alkalischer Lyse präpariert (beschrieben in Maniatis et al., 1982). Die isolierten Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI abgebaut, um zu bestimmen, ob die klonierten Fragmente der EG4096-DNA die erwartete Größe hatten. Alle hybridisierenden Plasmide sowohl aus den 5,0-kb- als auch aus den 7,0-kb-Konstrukten wiesen ein eingesetztes Fragment der erwarteten Größe auf. Die DNA aus diesen Plasmid-Abbaufragmenten wurde einer Elektrophorese auf Agarose-Gel unterzogen aufgetrennt und auf Nitrocelluloseübertragen, wie es oben beschrieben ist. Dann wurde der Blot mit dem Oligonucleotid wd270, das mit γ-³²P und T4-Polynucleotid-Kinase am 5'-Ende radioaktiv markiert worden war, hybridisiert. EcoRI-Fragmente von zwei der fünf Plasmide, die 5,0-kb-Inserts enthielten, hybridisierten mit der Sonde, was die Anwesenheit des cryET29-Gens auf diesen Fragmenten bestätigte. Eines der Plasmide mit dem 5,0-Insert, die das cryET29-Gen enthielten, wurde als pEG1298 bezeichnet. EcoRI-Fragmente von fünf der sechs Plasmide, die 7,0-kb-Inserts enthielten, hybridisierten mit der Sonde, was die Anwesenheit des cryET29-Gens auf diesen Fragmenten bestätigte. Eines der Plasmide mit dem 7,0-Insert, die das cryET29-Gen enthielten, wurde als pEG1299 bezeichnet.
Der E.-coli-Stamm, der pEG1298 enthielt, wurde als EG11513 bezeichnet. EG11513 wurde am 18. September 1996 bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), hinterlegt und erhielt die Zugriffs-Nr. NRRL B-21624. Der E.-coli-Stamm, der pEG1299 enthält, wurde als EG11514 bezeichnet.
5.6 Beispiel 6 – Bestimmung der DNA-Sequenz des cryET29-Gens
Eine partielle DNA-Sequenz der auf pEG1298 und pEG1299 klonierten Gene wurde bestimmt, wobei bewährte Didesoxy-Kettenabbruch-DNA-Sequenzierungsverfahren (Sanger et al., 1977) befolgt wurden. Die Herstellung der doppelsträngigen Plasmid-Matrizen-DNA erfolgte unter Verwendung eines Qiagen Plasmid Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des Sequenase^TM Version 2.0 DNA Sequencing Kit (United States Biochemical/Amersham Life Science Inc., Cleveland, OH) gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung von ³⁵S-dATP als Markerisotop (erhalten von DuPont NEN^® Research Products, Boston, MA) durchgeführt. Eine denaturierende Gelelektrophorese der Reaktionen wurde auf einem Sequenzierungsgel mit 6% (w/v) Acrylamid, 42% (w/v) Harnstoff durchgeführt. Das getrocknete Gel wurde über Nacht bei Raumtemperatur auf Kodak X-OMAT AR Röntgenfilm (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) einwirken gelassen.
Das NH₂-terminale spezifische Oligonucleotid wd270 wurde als anfänglicher Sequenzierungsprimer verwendet. Die partiellen DNA-Sequenzen wiesen darauf hin, dass die Plasmide pEG1298 und pEG1299 entweder identische oder fast identische Kopien des cryET29-Gens des B.-thuringiensis-Stamms EG409b enthielten. Die gesamte DNA-Sequenz für die Kopien von cryET29 auf den beiden Plasmiden wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren fertiggestellt. Die sukzessiven Oligonucleotide, die als Primer für Sequenzierungsreaktionen verwendet werden sollten, wurden anhand der Sequenzierungsdaten der vorigen Gruppe von Reaktionen entworfen. Auf diese Weise schritt die DNA-Sequenzierung schrittweise sowohl entlang des oberen als auch des unteren Strangs des cryET29-Gens fort.
Die DNA-Sequenz beider Kopien des cryET29-Gens (SEQ ID Nr. 1) ist identisch und in 1 gezeigt. Der proteincodierende Bereich des cryET29-Gens besteht aus 696 Nucleotiden einschließlich eines Stopcodons. Das aus der DNA-Sequenz abgeleitete CryET29-Protein (SEQ ID Nr. 2) besteht aus 231 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 26194 Dalton.
Dann wurden Datenbank-Recherchen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die abgeleitete Aminosäuresequenz des CryET29-Proteins teilweise anderen charakterisierten Proteinen, insbesondere anderen insektiziden Toxinproteinen, identisch ist. Datenbank-Recherchen unter Verwendung von Online-Servern wurden mit dem BLASTP-Programm (Altschul et al., 1990), durchgeführt, das vom National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) zur Verfügung gestellt wurde. Die BLASTP-Recherchen wurden mit der BLOSUM62-Matrix durchgeführt. Die durchsuchte Datenbank bestand aus nichtredundanten GenBank-CDS-Translationen + PDB + SwissProt + SPupdate + PIR.
Nur vier Proteine in diesen Datenbanken wurde identifiziert, die eine signifikante Identität mit CryET29 aufwiesen. Dazu gehörten das Diptera-Toxin CytB (55% Identität; Koni und Ellar, 1993), das Coleoptera/Diptera-Toxin CytA (44,2% Identität; Ward et al., 1984), das Diptera-Toxin PS201T6 (41,1% Identität; WO 95/02693) und das 27 kDa große Bacillus-thuringiensis-morrissoni-Diptera-Toxin (44,2% Identität; Earp und Ellar, 1987).
5.7 Beispiel 7 – Expression des klonierten cryET29-Gens
Um die Eigenschaften des CryET29-Proteins zu charakterisieren, war es notwendig, das klonierte cryET29-Gen in B.-thuringiensis-Zellen zu exprimieren, die negativ in Bezug auf Kristallproteine sind (Cry^–). Die klonierten EcoRI-Fragmente auf pEG1298 und pEG1299 wurden in einen Plasmidvektor eingesetzt, der zur Replikation in B. thuringiensis befähigt war, was die Expression von klonierten Genen ermöglichte.
pEG1298 und pEG1299 wurden mit EcoRI abgebaut, so dass das klonierte 5-kb- bzw. 7-kb-Fragment entfernt wurde. Die abgebauten Plasmide wurden auf einem Agarose-Gel getrennt, und die gewünschten Fragmente wurden aus den Gelscheiben gereinigt, wobei man das GeneClean^®-Verfahren von Bio101 Inc. (Vista, CA) verwendete. Die Fragmente wurden getrennt in einen B.-thuringiensis/E.-coli-Shuttle-Vektor ligiert, der mit EcoRI abgebaut und mit bakterieller Alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Der Shuttle-Vektor pEG1297 war konstruiert worden, indem man das 3,1-kb-EcoRI-Fragment des Bacillus-pNN101 (Norton et al., 1985) in mit NdeI abgebautes pUC18 ligiert. pEG1297 ist zur Replikation sowohl in E. coli als auch B. thuringiensis befähigt und verleiht E. coli Amp^R und B. thuringiensis Resistenz gegen Tetracyclin (Tet) (Tet^R). Die beiden Ligierungsgemische wurden zuerst durch von den Herstellern (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) beschriebenen Transformationsverfahren in E.-coli-DH5α^TM-Zellen eingeführt. Plasmid-DNA wurde aus Amp^R-Transformanten hergestellt, und eine Restriktionsenzymanalyse wurde durchgeführt, um die richtige Konstruktion zu bestätigen. Das Plasmid, das aus dem 5-kb-EcoRI-Fragment von pEG1298, das in pEG1297 eingesetzt ist, besteht, wurde als pEG1302 bezeichnet. Das Plasmid, das aus dem 7-kb-EcoRI-Fragment von pEG1299, das in pEG1297 eingesetzt ist, besteht, wurde als pEG1303 bezeichnet.
pEG1302 und pEG1303 wurden durch Elektroporation (Macaluso und Mettus, 1991) getrennt in den Cry-negativen B.-thuringiensis-Stamm EG10368 eingeführt. Zellen, die transformiert wurden und Tetracyclin-Resistenz aufwiesen, wurden durch Inkubation über Nacht auf LB-Agarplatten, die 10 μg/ml Tet enthielten, selektiert. Eine Tet^R-Kolonie aus jeder Transformation wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Der rekombinante Stamm EG11494 enthält pEG1302 (NRRL B-21583), und der rekombinante Stamm EG11502 enthält pEG1303.
EG11494 und EG11502 wurden 3 Tage lang bei 30 °C in C2-Sporenbildungsmedium, das 10 μg/ml Tetracyclin enthielt, gezüchtet, bis Sporenbildung und Zelllyse erfolgt waren. Die mikroskopische Untersuchung der Kulturen, die Sporen gebildet hatten, zeigte, dass die rekombinanten Stämme kleine kristalline Einschlüsse erzeugten. Diese Kristalle ähneln den vom Wildtyp-Stamm EG4096 produzierten Kristallen, was darauf hinweist, dass das cryET29-Gen in jeder Rekombinante ein funktionelles Gen war, das die Expression des CryET29-Proteins steuern kann.
Die Kulturen von EG11494 und EG11502, die Sporen gebildet hatten, wurden durch Zentrifugation geerntet, gewaschen und in 0,005% Triton X-100^® in einem Zehntel des ursprünglichen Volumens resuspendiert. Das Kristallprotein in den Suspensionen wurde durch SDS-PAGE-Analyse charakterisiert, die die Produktion eines ungefähr 25 kDa großen Proteins sowohl durch EG11494 als auch durch EG11502 ergab. Die durch die rekombinanten Stämme erzeugten 25-kDa-Proteine haben eine identische Größe wie das Kristallprotein von EG4096, was durch Wanderung auf SDS-Gel bestimmt wurde.
Die Menge des in einer bestimmten Probe enthaltenen Toxinproteins wurde für Insekten-Bioassays durch SDS-PAGE quantifiziert. Das mit Coomassie-Blau angefärbte SDS-PAGE-Gel wurde mit einem Densitometer abgemessen und mit einer Standardkurve verglichen, die erzeugt wurde, indem man bekannte Mengen eines Proteins, wie Rinderserumalbumin, auf dasselbe Gel aufbrachte.
5.8 Beispiel 8 – Toxizität von CryET29 gegenüber Larven des Südlichen Maiswurzelbohrers
Die Toxizität gegenüber Larven des Südlichen Maiswurzelbohrers (SCRW; Diabrotica undecimpunctata howardi) wurde für Wildtyp-B.-thuringiensis-EG4096 und für die beiden rekombinanten Stämme, die das CryET29-Protein exprimieren, EG11494 und EG11S02, bestimmt.
EG4096, EG11494 und EG11502 wurden drei Tage lang bei 30 °C in C2-Medium gezüchtet, bis Sporulation und Zelllyse stattgefunden hatten. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 1X dem ursprünglichen Volumen 0,005% Triton X-100^® gewaschen und in 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens 0,005% Triton X-100^® resuspendiert. Zum Vergleich wurde ein rekombinanter B.-thuringiensis-Stamm, EG11535, der das gegenüber Coleoptera toxische Protein Cry3Bb exprimiert (Donovan et al., 1992), in derselben Weise gezüchtet und geerntet.
SCRW-Larven wurden einem Bioassay durch Oberflächenkontamination einer künstlichen Nahrung ähnlich wie bei Marrone et al. (1985), aber ohne Formalin, unterzogen. Jeder Bioassay bestand aus einer Verdünnungsreihe aus acht wässrigen Verdünnungen, wobei Aliquote auf die Oberfläche der Nahrung aufgetragen wurden. Nachdem das Verdünnungsmittel (eine wässrige 0,005%ige Triton-X-100^®-Lösung) getrocknet war, wurden Larven des ersten Häutungsstadiums auf die Nahrung gesetzt und bei 28 °C inkubiert. Pro Dosis wurden zweiunddreißig Larven getestet. Die Mortalität wurde nach sieben Tagen bewertet. Daten aus parallel durchgeführten Bioassays wurden für eine Probitanalyse (Daum, 1970) vereinigt, wobei die Mortalität um die Kontrollmortalität korrigiert wurde, wobei die Kontrolle nur aus Verdünnungsmittel bestand (Abbott, 1925). Die Ergebnisse werden als Menge an CryET29-Kristallprotein pro Napf (175 mm² Nahrungsoberfläche) angegeben, was zu einem LC₅₀-Wert führte, der Konzentration, die 50% der Testinsekten tötete. 95%-Konfidenzintervalle werden ebenfalls angegeben (Tabelle 5).
Tabelle 5 Insektizide Aktivität des CryET29-Proteins gegenüber SCRW-Larven
Die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse beweisen, dass das CryET29-Protein eine signifikante Aktivität auf Larven des Südlichen Maiswurzelbohrers hat. Das von den beiden rekombinanten Stämmen EG11494 und EG11502 produzierte CryET29 weist ebenfalls eine erhebliche Toxizität auf. Die SCRW-Aktivität des in EG11494 und EG11502 produzierten CryET29-Proteins ist etwas geringer als diejenige des Cry3Bb-Proteins, obwohl die 95%-Konfidenzintervalle leicht überlappen, was darauf hinweist, dass der Unterschied vielleicht nicht signifikant ist.
5.9 Beispiel 9 – Toxizität von CryET29 gegenüber Larven des Westlichen Maiswurzelbohrers
Die Toxizität gegenüber Larven des Westlichen Maiswurzelbohrers (SCRW; Diabrotica virgifera virgifera) wurde für Wildtyp-B.-thuringiensis-EG4096 und für die beiden rekombinanten Stämme, die das CryET29-Protein exprimieren, EG11494 und EG11502, bestimmt.
Die Proben wurden im Wesentlichen so hergestellt und die Bioassays im Wesentlichen so durchgeführt, wie es für die SCRW-Assays in Beispiel 8 beschrieben ist. Der Wildtyp-B.-thuringiensis-Stamm EG4961, der das gegenüber Coleoptera aktive Protein Cry3Bb-Protein produziert, wurde als positive Kontrolle in dem Assay mitverwendet (Tabelle 6).
Tabelle 6 Insektizide Aktivität des CryET29-Proteins gegenüber SCRW-Larven
Die Ergebnisse in Tabelle 6 beweisen, dass das CryET29-Protein eine signifikante Aktivität auf Larven des WCRW hat. Weiterhin ist die Aktivität des von den rekombinanten Stämmen EG11494 und EG11502 produzierten CryET29 signifikant höher (d.h. niedrigere LC₅₀-Werte) als die des Proteins, das von dem gegen Coleoptera aktiven B.-thuringiensis-Stamm EG4096961 produziert wird.
5.10 Beispiel 10 – Toxizität von CryET29 gegenüber Larven des Kartoffelkäfers
Die Toxizität gegenüber Larven des Kartoffelkäfers (CPB; Leptinotarsa decemlineata) wurde für den Wildtyp-B.-thuringiensis-Stamm EG4096 und für den rekombinanten Stamm EG11494, der das CryET29-Protein exprimiert, bestimmt. Der rekombinante Stamm EG7231, der das Cry3Bb-Protein exprimiert, wurde zu Vergleichszwecken gezüchtet.
Der Assay mit den CPB-Larven wurde unter Verwendung ähnlicher Techniken durchgeführt wie beim SCRW-Assay, außer dass die Insektennahrung Nr. 9380 von BioServe (mit zugesetzten Kartoffelflocken) anstelle der künstlichen Nahrung verwendet wurde. Die Mortalität wurde nach drei Tagen und nicht nach sieben Tagen beurteilt. Für diesen Assay wurden 16 Insekten pro Dosis verwendet (Tabelle 7).
Tabelle 7 Prozentuale Mortalität von CPB-Larven, die mit CryET29-produzierenden Stämmen behandelt wurden
Die in Tabelle 7 gezeigten Ergebnisse beweisen die insektizide Aktivität des CryET29-Proteins auf CPB-Larven.
5.11 Beispiel 11 – Toxizität von B. thuringiensis EG4096 gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers
Die Toxizität von EG4096 gegenüber Larven des Rotbraunen Reismehlkäfers (Tribolium castaneum) wurde bestimmt, indem man eine gewaschene und konzentrierte Kultur von EG4096, die Sporen gebildet hatte, auf eine künstliche Nahrung auftrug und die Larven sich von der Nahrung ernähren ließ. Sechzehn Larven wurden in dieser Weise behandelt, und die prozentuale Mortalität wurde nach zwei Wochen bewertet. Mit der EG4096-Suspension behandelte Larven wiesen 44% Mortalität auf im Vergleich zu 13% für die unbehandelte Kontrolle. Außerdem wiesen die überlebenden Larven, die mit EG4096 behandelt worden waren, ein erhebliches Zurückbleiben in ihrem Wachstum auf, was auf eine subletale Dosis eines aktiven Toxins hinweist. Die Larven in der unbehandelten Kontrollgruppe zeigten kein solches Zurückbleiben. Diese Ergebnisse beweisen, dass EG4096, das das CryET29-Protein produziert, toxisch gegenüber dem Rotbraunen Reismehlkäfer ist.
5.12 Beispiel 12 – Toxizität von B. thuringiensis EG4096 gegenüber Larven des Japankäfers
Die Toxizität gegenüber Larven des Japankäfers (Popillia japonica) wurde für B. thuringiensis EG4096 bestimmt, das das CryET29-Protein produziert. Aus gewaschenen und konzentrierten Kulturen von EG4096, die Sporen gebildet hatten, wurden gefriergetrocknete Pulver hergestellt. Die Menge des in der Probe vorhandenen CryET29-Proteins wurde durch SDS-PAGE und quantitative Densitometrie der mit Coomassie-Blau angefärbten Gele bestimmt.
Die gefriergetrockneten Pulver wurden in einem Verdünnungsmittel resuspendiert, das 0,005% Triton X-100^® enthielt, und in 100 ml heiße (50-60 °C) flüssige künstliche Nahrung (auf der Basis der von Ladd (1986) beschriebenen Insektennahrung) eingearbeitet. Man ließ die Gemische in Petri-Schalen fest werden, und Pfropfen der fest gewordenen Nahrung mit einem Durchmesser von 19 mm wurden in 5/8-Ounce-Kunststoffbecher gegeben. Eine JB-Larve wurde pro Napf eingeführt, der dann mit einem Deckel abgedeckt und vierzehn Tage lang auf 25 °C gehalten wurde, bevor die Mortalität der Larven bewertet wurde.
Tabelle 8 zeigt den Durchschnitt der Ergebnisse von zwei Parallelansätzen des Bioassays unter Verwendung von 20 Larven pro Ansatz. Die Dosierungen beruhten auf der Menge des CryET29-Proteins in der Probe. Die prozentuale Mortalität wurde nach Abbott (1925) korrigiert.
Tabelle 8 Toxizität von EG4096 gegenüber Larven des Japankäfers
Die in Tabelle 8 gezeigten Ergebnisse beweisen, dass das von EG4096 produzierte CryET29-Protein eine signifikante insektizide Aktivität auf JB-Larven hat.
5.13 Beispiel 13 – Toxizität von B. thuringiensis EG4096 gegenüber Larven des Katzenflohs
Die Toxizität gegenüber Larven des Katzenflohs (Ctenocephalides felis) wurde für B. thuringiensis EG4096 bestimmt, das das CryET29-Protein produziert. Aus gewaschenen und konzentrierten Kulturen von EG4096, die Sporen gebildet hatten, wurden gefriergetrocknete Pulver hergestellt. Die Menge des in der Probe vorhandenen CryET29-Proteins wurde durch SDS-PAGE bestimmt.
Zur Durchführung des Bioassays wurde eine Menge des gefriergetrockneten Pulvers, die 1 mg CryET29-Protein enthält, mit 1 Gramm getrocknetem Rinderblut gemischt, was zu einer Konzentration von 1000 ppm führt. Das Gemisch wurde in 0,1% Triton X-100^® suspendiert und zum Trocknen in eine Glas-Petri-Schale gegossen. Dann wurde die getrocknete Probe zu einem feinen Pulver gemahlen und gleichmäßig auf 32 Bioassay-Näpfe verteilt. In jeden Napf wurde eine Katzenflohlarve gegeben, der dann mit einem Deckel abgedeckt und auf hoher Feuchtigkeit gehalten wurde. Dann wurden die Assays nach sieben Tagen bewertet.
Der Assay wird in dieser Weise durchgeführt, wobei man ein Pulver von EG4096 als Probe verwendet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Mit jeder Dosis wurden zweiunddreißig Larven dem Assay unterzogen. Die prozentuale Mortalität wurde nach 1, 4 und 7 Tagen bewertet. Ein B.-thuringiensis-Stamm, der kein Toxinprotein produziert, EG2205, wurde verwendet, um die Kontrollmortalität zu bewerten.
Tabelle 9 Toxizität von EG4096 gegenüber Larven des Katzenflohs im ersten Häutungsstadium
Die in Tabelle 9 gezeigten Ergebnisse beweisen, dass das vom Bacillusthuringiensis-Stamm EG4096 produzierte CryET29-Protein eine signifikante insektizide Aktivität auf Larven des Katzenflohs Ctenocephalides felis hat.
Die Einzigartigkeit der Aktivität des CryET29-Toxins auf Larven des Katzenflohs wurde nachgewiesen, indem man andere insektizide Kristallproteine von Bacillus thuringiensis in der oben beschriebenen Weise bewertete. Sporen und Kristalle enthaltende Proben von rekombinanten Stämmen von B. thuringiensis, die die folgenden Toxinproteine enthielten, wurden getestet: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2S, Cry3A, Cry3B, Cry3B2 und Cry3B3. Die Merkmale dieser anderen Klassen von Genen insektizider Kristallproteine werden von Hofte et al. (1989) beschrieben. Wegen einer ausführlichen Beschreibung der Cry3-Toxine, siehe US-Patent 5,187,091 und US-Patent 5,264,364. Keines dieser Toxine zeigte irgendeine Toxizität gegenüber den Larven des Katzenflohs, was darauf hinweist, dass das CryET29-Toxinprotein in Bezug auf seine Toxizität gegenüber Larven des Katzenflohs einzigartig unter den bisher isolierten insektiziden B.-thuringiensis-Proteinen ist.
6. Literatur
Die folgenden Literaturstellen wurden oben zitiert:

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Claims

Isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das von einem Polynucleotid codiert wird, das die Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, das eine insektizide Wirkung gegen Insekten hat, die aus den Insektenordnungen Coleoptera und Siphonaptera ausgewählt sind.
Zusammensetzung, die das Polypeptid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, die einen Zellextrakt, eine Zellsuspension, ein Zellhomogenisat, ein Zelllysat, einen Zellüberstand, ein Zellfiltrat oder ein Zellsediment von Bacillus-thuringiensis-NRRL-B-21582- oder -NRRL-B-21583-Zellen umfasst, die bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, hinterlegt wurden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Zusammensetzung ein Pulver, Staub, Pellet, Granulat, Spray, eine Emulsion, ein Kolloid oder eine Lösung ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Zusammensetzung durch Trocknung, Lyophilisierung, Homogenisierung, Extraktion, Filtration, Zentrifugation, Sedimentation oder Konzentration einer Kultur von Bacillus-thuringiensis-Zellen hergestellt ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, die das Polypeptid in einer Menge von etwa 1 bis etwa 50 Gew.-% umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, die als Pulver, Spray, Nebel, Granulat, Spülung, Shampoo oder Tauchbad zubereitet ist.
Flohhalsbandvorrichtung, die das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 umfasst.
Gereinigter Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bindet.
Antikörper gemäß Anspruch 11, der funktionell an einen nachweisbaren Marker gebunden ist.
Immunnachweiskit, der in geeigneten Behältereinrichtungen einen Antikörper gemäß Anspruch 11 oder 12 sowie ein Immunnachweisreagens umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuresegment, das die Aminosäuresequenz, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 3 definiert ist, codiert, oder das Komplement davon.
Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 14, wobei der Sequenzbereich funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der die Sequenz in einer transformierten Wirtszelle exprimiert.
Nucleinsäuresegment gemäß Anspruch 14, das als Nucleinsäuresegment gekennzeichnet ist, das dieselbe Sequenz wie SEQ ID Nr. 1 hat oder zu dieser komplementär ist.
Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zum Abtöten von Katzenflöhen.
Nucleinsäuresegment gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Verwendung bei der Herstellung einer transgenen Pflanze.
Vektor, der das Nucleinsäuresegment gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 19, der als Plasmid, Cosmid, Baculovirus, künstliches bakterielles Chromosom, künstliches Hefechromosom oder viraler Vektor gekennzeichnet ist.
Vektor gemäß Anspruch 19 oder 20, der als rekombinantes Virus, Phage oder Phagemid gekennzeichnet ist.
Transformierte Wirtszelle, die das Nucleinsäuresegment gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 oder den Vektor gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21 umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 22, die als prokaryontische Zelle gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 23, die als Zelle von Agrobacterium spp., Escherichia spp., Bacillus spp. oder Pseudomonas spp. gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, die als eine Zelle von A. tumefaciens, E. coli, B. subtilis, B. megaterium oder B. thuringiensis, wie eine B.-thuringiensis-NRRL-B-21582- oder eine B.-thuringiensis-NRRL-B-21583-Zelle, gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 22, die als eukaryontische Zelle gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 26, die als Pflanzenzelle gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 27, die als Zelle von Mais, Gerste, Luzerne, Hafer, Roggen, Soja, Weizen, Canolaraps, Baumwolle, Tabak, Tomate, Kartoffel, Weidegras, Rasengras, Gemüse, Zierpflanze, Nuss, Beere, Zitrusfrucht oder Obstbaum gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 27, die als Zelle von Mais, Baumwolle, Soja, Weizen oder Gras gekennzeichnet ist.
Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei die Wirtszelle das Nucleinsäuresegment exprimiert, so dass ein insektizides Polypeptid entsteht.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Einführen eines Vektors, der ein Nucleinsäuresegment umfasst, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst, die funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, in eine Wirtszelle; (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des codierten Polypeptids bewirken; und (c) Isolieren des exprimierten Polypeptids aus der Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei das Polypeptid von einem Polynucleotid codiert wird, das die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, gegebenenfalls in einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Flohbefall bei einem Tier.
Bacillus-thuringiensis-Zelle mit der NRRL-Zugriffsnummer NRRL B-21582.
Verfahren zur Herstellung eines insektiziden Polypeptids, umfassend: (a) Kultivieren einer Bacillus-thuringiensis-NRRL-B-21582-Zelle unter Bedingungen, die die Erzeugung eines insektiziden Polypeptids bewirken; und (b) Isolieren des erzeugten insektiziden Polypeptids aus der Zelle.