CN1245513C - 对鞘翅类昆虫和栉头蚤属种昆虫有毒的苏云金芽孢杆菌CryET29组合物 - Google Patents

对鞘翅类昆虫和栉头蚤属种昆虫有毒的苏云金芽孢杆菌CryET29组合物 Download PDF

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Abstract

公开了一种被称为CryET29的新型δ-内毒素，它表现出对下列昆虫有杀虫活性：管翅类昆虫，包括猫蚤(猫栉头蚤(Ctenocephelidesfelis))幼虫，以及鞘翅类昆虫，包括南部玉米食根虫(Diabroticawndecimpunctata)，西部玉米食根虫(D.Virgifera)，Colorado马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，日本甲虫(Popilliajaponica)和红粉甲虫(Tribolium castaneam)。还公开了编码CryET29的核酸区段，包含cryET29 DNA区段的重组载体，宿主细胞和转基因植物。并公开了制备和应用所公开的蛋白质和核酸区段的方法，以及用于在体内或体外检测cryET29和CryET29序列的测试法和诊断试剂盒。

Description

对鞘翅类昆虫和栉头蚤属种昆虫有毒 的苏云金芽孢杆菌CryET29组合物
1.本发明的背景
本发明是一个基于1996年9月26日提交的美国专利流水号08/721,259的部分继续申请，在此特将其全部内容整个引入作为参考。
1.1发明领域
一般地说，本发明是属于分子生物学领域。更具体地说，某些实施方案是关于包含来自某些细菌的DNA区段和蛋白质的方法和组合物。再具体地说，是关于一种来自苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的新型cryET29基因，它能编码对鞘翅目昆虫和猫蚤毒性的结晶蛋白。公开了制备和应用这些DNA区段，这些编码人工修饰CryET29蛋白的DNA区段，以及天然和合成结晶蛋白的多种方法，例如，将DNA区段用作诊断探针和生成蛋白质的模板，以及在多种免疫学和诊断应用中蛋白质、融合蛋白载体和肽的用途。还公开了在培育含有在此公开的DNA区段的转基因植物细胞的过程中，制备和应用核酸区段的方法。
1.2对相关技术的说明
1.2.1苏云金芽孢杆菌结晶蛋白
苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，它产生被称为结晶蛋白的δ-内毒素，对某些昆虫目和种特别有毒。已发现苏云金芽孢杆菌的多种不同菌株能产生杀虫结晶蛋白。包括产生杀虫蛋白的苏云金芽孢杆菌株组合物已可以购得，并且已经用作环境可接受的杀虫剂，因为它们对特定的靶标昆虫非常有毒，但对植物和其它非靶标生物是无害的。
苏云金芽孢杆菌结晶蛋白只有在被摄食后，当昆虫中肠内的碱性pH和蛋白水解酶溶解此结晶蛋白并释放出毒性成分时，才对昆虫有毒。这些成分使中肠细胞破裂，导致昆虫停止吃食而最后死亡。实际上，在处理多种害虫中已证明苏云金芽孢杆菌是一种有效的，环境安全的杀虫剂。
如Hofte et al(1989)曾指出，大多数杀虫的苏云金芽孢杆菌株具有抗鳞翅目昆虫即毛虫的活性。另一些苏云金芽孢杆菌株具有抗双翅目昆虫即蝇和蚊的杀虫活性，或者具有抗鳞翅类和双翅类二种昆虫的杀虫活性。最近几年，还报导了几种苏云金芽孢杆菌株能产生对鞘翅目昆虫即甲虫有毒的结晶蛋白。至今尚无苏云金芽孢杆菌株对蚤目栉头蚤属(Ctenocephalides)具有杀虫活性的报导。
双翅目活性的胞嘧啶毒素(Cyt toxins)不同于绝大多数其它的苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白，它们比较小，并且不共有序列同源性的保守部分。这些蛋白质在体外显示有广泛的溶细胞活性，而在体内，对双翅目昆虫的幼虫特别有毒。对于这些特点已另有论述(Chilcott andEllar，1988)。
1.2.2结晶蛋白的遗传学
已经从几株苏云金芽孢杆菌克隆出多种编码结晶蛋白的基因。Hofet et al(1989)的述评论述了，关于已被鉴定对鳞翅目昆虫即毛虫具有对抗活性的大多数杀虫苏云金芽孢杆菌株的一般技术状况。此论文还论述了对双翅目昆虫(即蝇和蚊)及鞘翅目昆虫(即甲虫)具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌株。多种编码结晶蛋白的基因已经从几株苏云金芽孢杆菌被克隆产生。Hofte et al(1989)对1990年以前在苏云金芽孢杆菌中发现的基因和蛋白质进行了研讨，并制定了已按惯例用于苏云金芽孢杆菌基因和蛋白的术语和分类模式。cry1基因编码鳞翅类毒性的Cry1蛋白。cry2基因编码对鳞翅类和双翅类都具有毒性的Cry2蛋白。cry3基因编码鞘翅类毒性的Cry3蛋白，而cry4基因编码双翅类毒性的Cry4蛋白，等等。
最近，基于氨基酸序列的同源性，而不是基于其靶标昆虫特异性，已提出了对Cry蛋白系统分类的新术语。这种分类模式被概括在表1中。
                                            表1
                              经修改的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素术语a
  新名称   旧名称   基因文库检索号
  Cry1AaCry1AbCry1AcCry1AdCry1AeCry1BaCry1BbCry1BcCry1BdCry1CaCry1CbCry1DaCry1DbCry1EaCry1EbCry1FaCry1FbCry1GaCry1GbCry1HaCry1HbCry1IaCry1IbCry1JaCry1JbCry1KCry2AaCry2AbCry2AcCry3ACry3BaCry3BbCry3CCry4ACry4BCry5AaCry5AbCry5B   CryIA(a)CryIA(b)CryIA(c)CryIA(d)CryIA(e)CryIBET5PEG5CryE1Cry1CCryIC(b)CryIDPrtBCryIECryIE(b)CryIFPrtDPrtACryH2PrtCCryVCryVET4ET1CryIIACryIIBCryIICCryIIIACryIIIBCryIIIB2CryIIIDCryIVACryIVBCryVA(a)CryVA(b)   M11250M13898M11068M73250M65252X06711L32020Z46442U70726X07518M97880X54160Z22511X53985M73253M63897Z22512Z22510U70725Z22513U35780X62821U07642L32019U31527U28801M31738M23724X57252M22472X17123M89794X59797Y00423X07423L07025L07026U19725
  新名称   旧名称   基因文库检索号
  Cry6ACry6BCry7AaCry7AbCry8ACry8BCry8CCry9ACry9BCry9CCry10ACry11ACry11BCry12ACry13ACry14ACry15ACry16ACry17ACry18ACry19ACry1AaCyt1AbCyt1BCyt2ACyt2B   CryVIACryVIBCryIIICCryIIICbCryIIIECryIIIGCryIIIFCryIGCryIXCryIHCryIVCCryIVDJeg80CryVBCryVCCryVD34kDacbm71cbm71CryBP1Jeg65CytACytMCytBCytB   L07022L07024M64478U04367U04364U04365U04366X58120X75019Z37527M12662M31737X86902L07027L07023U13955M76442X94l46X99478X99049Y08920X03182X98793U37196Z14147U52043
a 来自：http：//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html
1.2.3鉴定对鞘翅类昆虫具毒性的结晶蛋白
对于来自双翅类活性苏云金芽孢杆菌以色列变种的26-kDa杀蚊毒素，对其编码基因的克隆和表达已有论述(Ward et al，1984)，并且已报道了这种基因的核苷酸序列(Ward and Ellar，1986)，根据从推导出的氨基酸序列的计算，这种毒素蛋白CytA的分子量被确定为27340 Da。
对于从苏云金芽孢杆菌莫氏变种PG14菌株分离出的27-kDa杀蚊Cyt蛋白，其基因的核苷酸序列已被公开(Earp and Ellar，1987)。发现这种毒素蛋白的序列，仅一个氨基酸残基不同于苏云金芽孢杆菌以色列变种的CytIA蛋白。
较早对25-kDa蛋白的鉴定已有论述(Knowles et al，1992)，这种蛋白在体外当被来自杀蚊苏云金芽孢杆菌九州变种的蛋白水解作用激活时，表现出溶细胞活性，并且已报导了这种蛋白CytB的基因的核苷酸序列(Koni and Ellar，1993)，虽然它与苏云金芽孢杆菌以色列变种的CytA蛋白的确共有显著序列相似性，但是预测的CytB蛋白分子量是29236 Da，推导出的氨基酸序列也完全不同。
对于对鞘翅类和双翅类昆虫具有活性的30-kDa毒素蛋白，对其基因的克隆和特征鉴定也有描述(Intl.Pat.Appl.Pub.No.WO95/02693，1995)。从苏云金芽孢杆菌PS201T6分离出的这种基因编码一个29906 Da的蛋白质，此蛋白质显示与苏云金芽孢杆菌以色列变种的CytA毒素有64％序列相似性。
2.发明概述
本发明提供了一种新颖的苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白(被定名为CryET29)，以及编码此蛋白的基因(被定名为cryET29)，它们分别包含的氨基酸序列和核酸序列，显示同现有技术下的δ-内毒素蛋白和基因很少有同源性。令人惊奇的是，本发明的CryET29蛋白证明不但对鞘翅目昆虫，而且对蚤类，特别是猫蚤，猫栉头蚤具有惊人的杀虫活性。
在一个重要的实施方案中，本发明提供了含有苏云金芽孢杆菌CryET29杀虫结晶蛋白的被分离和纯化的氨基酸区段(SEQ ID NO：2)，它包含图解显示在图1A和图1B中的氨基酸序列。对CryET29蛋白的编码区是SEQ ID NO：1中核苷酸29-721，CryET29蛋白显示对如下鞘翅类昆虫具有杀虫活性：南方玉米食根虫，西部玉米食根虫，Colorado土豆甲虫、日本甲虫，和红粉甲虫。在相关的实施方案中，还公开了制备和应用这种蛋白，其衍生物和突变体，以及针对这些蛋白的抗体的方法。
在另一个重要的实施方案中，本发明提供了被分离和纯化的核酸区段，它包含编码在此公开的CryET29结晶蛋白的cryET29基因。在SEQID NO：1中给出了cryET29基因的核苷酸序列，并图解显示在图1A和图1B中。在相关的实施方案中，还公开了制备，应用，改造，诱变，测定和定量分析这些核酸片段的方法。还公开了以多种体外和体内的方法，用于鉴定和检测相关cry基因序列的诊断方法和检测试剂盒。
本发明的另一方面是产生CryET29结晶蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞。在优选的实施方案中，该细胞是被命名为苏云金芽孢杆菌EG4096的苏云金芽孢杆菌株，该菌株已于1996年5月30日保存在农业研究机构保藏中心(NRRL)，保藏号NRRL B-21582。苏云金芽孢杆菌EG4096是天然存在的菌株，它包含本发明的cryET29基因(SEQ IDNO：1)，在实施例1、2和3中将对此菌株作进一步描述。EG4096产生一种大约26-kDa的新型杀虫结晶蛋白，本发明人已将其命名为CryET29(SEQ ID NO：2)。具有NRRL保藏号NRRL B-21582的苏云金芽孢杆菌细胞是最优选的。
本发明更进一步的内容是包含全部或一部分cryET29基因(SEQID NO：1)的核酸序列的质粒，粘粒或载体，含有天然或重组cryET29基因的转化宿主细胞，以这种质粒转化的重组菌培养物，优选的苏云金芽孢杆菌株是例如在实施例7中所述的重组菌株EG11494和EG11502，而最优选的是这种菌株的生物纯培养物。根据布达佩斯条约的条款，已于1996年5月30日将EG11494保存于NRRL，保藏号NRRLB-21583。按另一种选择，含有新型cryET29基因的大肠杆菌重组株EG11513和EG11514，也是表达CryET29蛋白的优选宿主。
2.1  cryET29 DNA区段
本发明还涉及几种DNA区段，包括实际上可从任何来源分离的DNA区段，不含有全基因组DNA的DNA区段，以及编码全部或部分在此公开的新型蛋白的DNA区段。cryET29基因(SEQ ID NO：1，图1A和图1B)编码26-kDa CryET29蛋白，此蛋白具有在图1A和图1B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。编码这几种肽的DNA区段，还可能证明是编码结晶蛋白相关的，或其它非相关性基因产物的蛋白质，多肽，亚单位，和功能区等的DNA区段。此外，这些DNA区段，还可以应用本领域技术人员熟知的方法，在体外完全人工合成。
在此使用的名词“DNA区段”指的是，已被分离不含特定种类全基因组DNA的DNA分子。因此，编码结晶蛋白或肽的DNA区段指的是，包含结晶蛋白编码序列的DNA区段，但是，此编码序列已从某种菌的全基因组DNA中分离出，或者是从其中纯化出，该DNA区段就是来自这种菌，在本发明的情况下，该区段是革兰氏阳性菌属，芽孢杆菌属，特别是被称为苏云金芽孢杆菌的基因组。包括在此名词“DNA区段”中的有DNA区段和这种区段的小片段，还有重组载体，包括例如质粒，粘粒，噬菌粒，噬菌体，病毒等。
类似地，包含分离或纯化结晶蛋白编码基因的DNA区段指的是，此DNA区段还可能包括除了肽编码序列的某些其它成分，例如基本上从其它天然存在的基因或蛋白质编码序列分离的调节序列。在这方面，为简便起见，名词“基因”被用于表示功能性的蛋白、多肽或肽编码单位。如本领域技术人员熟知的，此功能性术语不仅包括包含染色体外DNA序列的基因组序列，而且包括操纵子序列和/或工程基因区段，这些区段能表达，或者可能是被装配能表达蛋白质、多肽或肽。
“基本上从其它编码序列分离的”意指所研究的基因构成了该DNA区段编码区的重要部分，在此，该基因是编码细菌结晶蛋白的基因，此措辞还意指该DNA区段不包含大部分天然存在的编码DNA，如大染色体片段或者其它的功能性基因或操纵子编码区。当然，这指的是原来已被分离的DNA区段，并且不排除通过人工后来加入此区段的基因，重组基因，合成接头，或编码区。
在特定的实施方案中，本发明涉及一些分离的DNA区段和重组载体，它们掺入了编码一种Cry蛋白或肽的DNA序列，这种Cry蛋白或肽，在其氨基酸序列中包括基本上如在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。更优选的是，此DNA序列包含编码一种Cry蛋白或肽的核酸序列，这种Cry蛋白或肽在其氨基酸序列中，包括SEQ ID NO：2的至少10个紧连的氨基酸序列。
名词“基本上如在SEQ ID NO：2中列出的序列”意指此序列基本上与SEQ ID NO：2序列的一部分相对应，并有相对少数氨基酸不同于任何这些序列的氨基酸，或者是生物学功能等价的氨基酸。名词“生物学功能等价的”是本领域熟知的，在此将进一步作详细规定(例如见例证性实施方案)。相应地，具有约70％-80％的，或更优选地具有约81％-90％的，或者更加优选地具有约91％-99％的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸相同或功能等价的序列，将是“基本上如SEQ ID NO：2中列出的”序列。
还应理解的是，氨基酸或核酸序列都可能包括附加残基，例如附加的N-端或C-端氨基酸，或者5′或3′序列，但仍然基本上是如在此公开的序列之一，只要此序列满足上面列举的标准，包括在涉及蛋白质表达时，保持蛋白质的生物活性。附加末端序列的情况特别适合于核酸序列，例如它可能包括在编码区5′或3′部分侧翼的各种非编码序列，或者可能包括各种内部序列即内含子，已知这些在基因中都存在。
本发明的核酸区段，不论编码序列本身的长度，都可能与其它DNA序列组合，如启动子，聚腺苷酸化信号，附加的限制性酶切位点，多克隆位点，其它的编码区段等，这样使它们的总长度可能非常可观。因此可以设想，几乎任何长度的核酸片段都可使用，其总长度优选取决于制备和在计划的重组DNA方案中的应用的便利。例如，可以制备包括短而紧连的一段核酸片段，此片段编码SEQ ID NO：2中所公开的全部或部分肽序列，或者还可以制备与编码SEQ ID NO：2中所公开肽的DNA序列，特别是与SEQ ID NO：1中所公开的DNA区段相同或互补的核酸片段。例如，还可预期如下各种长度的DNA序列都是有用的：如约14个核苷酸的DNA序列，以及相当于大约10000，5000，3000，2000，1000，500，200，100，50和14个碱基对长度(包括全部中等长度)的DNA序列。
应该容易理解的是，“中等长度”就此而言意指所标示范围之间的任何长度，例如14、15、16、17、18、19、20等等，21、22、23等等，30、31、32等等，50、51、52、53等等，100、101、102、103等等，150、151、152、153等等，包括从200-500，500-1000，1000-2000，2000-3000，3000-5000的全部整数，以及直至并包括大约10000个核苷酸的序列等等。
还应理解到，本发明并不局限于编码本发明肽的特定核酸序列，或者是编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的核酸序列，包括在SEQ IDNO：1中特别公开的DNA序列。因此，重组载体和分离的DNA区段可能广泛地包括这种肽编码区本身，在基础编码区内带有选择性改变或修饰的编码区，或者它们虽然包括这些肽编码区，但还可以编码较大的多肽，或者可以编码具有不同氨基酸序列的，生物功能等价的蛋白质或肽。
本发明的DNA区段包括生物功能性等效的肽。这些序列可能由于密码子丰余性和功能等效性的结果而产生，已知在核酸序列和这样编码的蛋白质中天然存在这种特性。另一方面，功能等效的蛋白质或肽可通过应用重组DNA技术产生，其中，根据被交换氨基酸的特性，可设计改变蛋白质的结构。可通过应用定点诱变技术导入人工设计的改变，例如，以改进蛋白质的抗原性或检测突变体，以便在分子水平测定其活性。
如果需要，还可以制备融合蛋白和肽，例如其中在相同的表达单位内，这些肽编码区与具有所需功能的其它蛋白质或肽相匹配，如为了纯化或免疫检测的目的(例如，分别通过亲和层析，和酶标编码区可纯化的蛋白)。
重组载体构成本发明的另一方面。预期特别有用的载体，是那些其中不论是编码全长度蛋白质或者是较小肽的DNA区段编码区，是处于启动子控制之下的载体。这种启动子可能以同编码本发明肽的基因自然结合的形式存在，因为它可以通过分离位于编码区段或外显子上游的5′非编码序列获得，例如应用与在此公开的组合物有关的重组克隆技术和/或PCRTM技术。
2.2  以DNA区段作为杂交探针和引物
除了将它们用于定向表达本发明的结晶蛋白或肽之外，在此设计的核酸序列还有多种其它用处。例如，在核酸杂交实施方案中，它们还可以用作探针或引物。因此可以设想，将会发现这样一种核酸区段特别有用，它包括由至少14个核苷酸长度的紧连序列组成的序列区，并且此紧连序列具有与SEQ ID NO：1的14个核苷酸长度的紧连DNA区段相同或互补的序列。在某些实施方案中，较长且紧连的相同或互补序列也是有用的，例如那些大约20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000等的序列(包括所有中等长度的，以及直至包括全长度的序列)。
这种核酸探针与结晶蛋白编码序列特异性杂交的能力，将使它们能用于检测给定样品中互补序列的存在。但是，还可设想其它的用途包括将此序列信息用于制备突变种的引物，或者制备用于构建其它基因的引物。
特别设计了具有如下特征的核酸分子作为杂交探针用于例如DNA和RNA印迹试验，此核酸分子含有由大约10-14，15-20，30，50，或者甚至100-200个核苷酸紧连的一段核苷酸组成的序列区，而这紧连的一段核苷酸是与SEQ ID NO：1的DNA序列相同或互补的。发现较小的片段一般用于杂交实施方案，其中紧连互补区的长度可能改变，例如大约10-14，以及约100或200个核苷酸，但是根据所要检测的互补序列的长度，也可以使用较长的紧连互补片段。
使用长度约14个核苷酸的杂交探针，便于形成既稳定又具选择性的双螺旋分子。但是，为了增加杂交的稳定性和选择性，并因此改进所得的特异性杂交分子的质量和水平，通常优选的是具有长度多于14个碱基的较长的一段紧连互补序列的分子。一般愿意设计具有一段15-20个紧连核苷酸的基因互补序列的核酸分子，或者需要时甚至可以更长些。
当然，还可以通过其它技术获得这些片段，例如通过机械剪切或限制性酶切消化。小核酸片段或片段易于制备，可借助于例如用化学方法直接合成这种片段，通常是用自动化的寡核苷酸合成仪来实现。还可以通过如下手段获得这些片段：通过应用核酸复制技术如美国专利4,683,195和4,683,202(均被引入作为参考)的PCRTM技术，通过将选择的序列导入重组载体来重组产生，以及通过分子生物学领域的技术人员通常熟知的其它重组DNA技术。
因此，本发明的核苷酸序列可被利用，是因为它们能与DNA片段的互补链选择性地形成双螺旋分子。取决于预期的应用，要求采用不同的杂交条件，以便达到探针对靶标序列不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，一般要求采用相对严格的形成杂交体的条件，例如可选择较低浓度的盐和/或高温度条件，如在大约50℃-70℃的温度下，提供约0.02M-0.15M NaCl。这些选择性条件只允许在探针和模板或靶标单链之间有很少的错配，并且特别适合用于分离编码结晶蛋白的DNA序列，通过杂交检测DNA区段是本领域技术人员熟知的，美国专利4,965,188和5,176,995(均被引入作为参考)的说明，是杂交分析法的示范性论述。如在Maloy et al，1994；Segal，176；Prokop，1991和Kuby，1994的教科书中可找到的论述特别适用。
当然，对于某些应用，例如当要求制备采用与初始模板杂交的突变引物单链的突变体时，或者当试图从相关种类分离结晶蛋白编码序列，或分离功能等效序列时，为了能形成异源双链，通常只需要较低严格的杂交条件。在这些情况下，可能需要采用如约0.15M-0.9M的盐，约20°-55℃温度范围内的条件。作为相对于对照杂交的阳性杂交信号，因此交叉杂交种可以容易地被鉴定。总之，一般认为，通过加入增加量的甲酰胺，可以使条件变得更严格，此甲酰胺象提高温度一样起作用，以某种方式使杂交双链不稳定。这样，杂交条件可以被容易地控制，并且因此，一般是一种由所要求的结果来决定的选择方法。
在某些实施方案中，使用本发明的核酸序列与适当的技术如标记法相结合，用于杂交测定是便利的。本领域已知广泛多种适合的能给出可检测信号的标记手段，包括荧光标记，放射性标记，酶标记或其它配体如亲和素/生物素标记。在优选的实施方案中，人们很可能希望采用荧光标记或酶标记，如用脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不用放射性标记或其它环境污染试剂。在酶标记的情况下，已知显色指示底物可用于提供人眼或分光光度法可识别的信号，来鉴别与样品所含互补核酸的特异性杂交。
一般可以设想，在此所述的杂交探针既可作为试剂在杂交液中使用，又可在采用固相法的实施方案中使用。在包括固相法的实施方案中，待测DNA(或RNA)是被吸附或者被固定在所选用的基质或表面上。然后使这种被固定的单链核酸，在要求的条件下与选用的探针进行特异性杂交。所选择的条件将取决于基于所要求的特定标准的特定环境(取决于例如G+C含量，靶核酸的类型，核酸的来源，杂交探针的大小等)。在漂洗杂交表面，以便除去非特异性结合的探针分子之后，可借助于标记法对特异性杂交进行检测，或者甚至可以定量测定。
2.3  重组载体和蛋白质表达
本发明还公开了一个包含CryET29结晶蛋白的组合物，并对它要求专利保护。此组合物可能包含表达CryET29结晶蛋白的细菌宿主细胞，含有CryET29蛋白的包涵体或结晶，培养物上清液，破碎的细胞，细胞提取液，溶胞产物，和匀浆等等。此组合物可能以含水的形式存在，或者以干燥，半湿或其它类似形式存在，如细胞浆，细胞沉淀块，或者以冰冻干燥，制成粉末，真空冷冻干燥、蒸发，或其它类似的方法制成干燥形式。这些制备结晶蛋白的方法，是从事细胞蛋白分离和纯化的技术人员所熟知的。在某些实施方案中，该结晶蛋白还可以被纯化，浓缩，与其它药剂混合，或者被加工成所需要的最后形式。此组合物将优选地包含按重量计1％-90％的该结晶蛋白，更优选的是包含按重量计5％-50％的结晶蛋白。
在一个优选的实施方案中，本发明的结晶蛋白组合物可按如下方法制备，它包括在能够有效地产生这种蛋白的条件下培养表达CryET29结晶蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞，然后从此细胞中获得这种蛋白的步骤。为了获得这种结晶蛋白，还可能进一步包括纯化、浓缩、加工，或者将此蛋白同一种或几种药剂混合的步骤。此CryET29结晶蛋白优选地是以大约1％-90％的重量含量获得，更优选的是按重量含量约5％-50％。
本发明还涉及制备CryET29结晶蛋白组合物的方法。这种方法通常包括在能有效地产生这种蛋白的条件下，培养表达CryET29结晶蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞，然后获得如此产生的这种蛋白质的步骤。在优选的实施方案中，苏云金芽孢杆菌细胞是NRRL B-21582细胞，或者是含有cryET29基因区段的其它任何苏云金芽孢杆菌细胞。另一种方法是，可用本发明的重组质粒载体转化其它适合的细菌或真核细胞，来产生本发明的结晶蛋白。原核宿主细胞包括革兰氏阴菌如大肠杆菌，假单胞菌属种，和相关的肠菌科菌，或者革兰氏阳性菌如芽孢杆菌属种(包括巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)等，都被预期可用于制备本发明的结晶蛋白。
在这类实施方案中，预期通过将DNA编码区段安排在重组的，或异源性启动子的控制之下，将可获得某些优势。如在此使用的重组的或异源性启动子，意指在其天然环境下，不是正常与编码结晶蛋白或肽的DNA区段结合的启动子。这类启动子可能包括与其它基因正常结合的启动子，和/或从任何细菌、病毒、真核细胞，或植物细胞分离出的启动子，当然，重要的是采用能在被选择用于表达的细胞类型、微生物、或者甚至动物内，有效地引导DNA区段表达的启动子。将启动子和细胞类型组合用于蛋白质表达，是分子生物学领域技术人员一般熟知的、例如可参见Sambrook et al，1989。所采用的启动子可以是组成型的，或者是诱导的，并且可以在合适的条件下引导被导入的DNA区段进行高水平表达，例如有利于大规模生产重组蛋白或肽的条件。计划用于高水平表达的适合的启动子系统包括，但不限于，毕赤酵母表达载体系统(Pharmacia LKB Biotechnology)。
在有关为了制备重组蛋白和肽的表达实施方案中，预期将最常使用较长的DNA区段，而编码全肽序列的DNA区段是最优选的。但是显然，将较短的DNA区段引导表达结晶蛋白或抗原表位核心区的用途，例如可用于产生抗-结晶蛋白抗体，也属于本发明的范围。设想编码如下长度肽抗原的DNA区段特别有用：大约8-50个氨基酸，或较优选的是大约8-30个氨基酸，或者更加优选的是大约8-20个氨基酸。这种肽抗原表位可以是包含来自SEQ ID NO：2紧连氨基酸序列的氨基酸序列。
2.4  结晶蛋白转基因和转基因宿主细胞
还有另一方面，本发明提供了用于产生转基因细胞的方法，特别是表达编码本发明新型CryET29结晶蛋白的核酸区段的转基因植物或动物细胞。产生转基因细胞的方法是本领域熟知的。概括地说，此方法包括以含有一种启动子的DNA区段转化适当的宿主细胞，此启动子已有效地连接于编码苏云金芽孢杆菌CryET29结晶蛋白的编码区。此编码区通常有效地连接于转录终止区，从而使此启动子能驱动细胞中编码区的转录，并因此赋予细胞在体内产生重组蛋白质的能力。另一方面，在要求控制，调节或减少在特定转基因细胞中表达的特定重组结晶蛋白含量的情况下，本发明还为结晶蛋白反义mRNA的表达创造了条件。用反义mRNA作为控制或减少细胞中某种已知待研究蛋白质含量的手段，是本领域熟知的方法。
在优选的实施方案中，本发明提供了一种已用本发明的核酸区段转化的植物细胞，并且这种植物细胞能表达编码在此所公开的一种或几种新型多肽组合物的基因或基因区段。如在此使用的名词“转基因植物细胞”，意指一种已掺入某种DNA序列的植物细胞，此DNA序列包括但不局限于也许是正常不存在的基因，正常不被转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列，或者是希望导入非转化植物的其它任何基因或DNA序列，例如可能是正常存在于非转化植物的，但希望对它作基因工程处理或希望改变其表达的基因。
预期在某些情况下，通过稳定地导入cryET29转基因，天然的cryET29，或者人工修饰或突变的cryET29，本发明转基因植物的基因组将被扩大，在某些情况下，将把一个以上转基因掺入被转化宿主植物细胞的基因组。将一个以上结晶蛋白编码DNA序列掺入这种植物基因组时的情形就是这样。在某些情况下，理想的可能是有一个、二个、三个、四个，或者甚至更多的苏云金芽孢杆菌结晶蛋白(天然的或基因工程重组的)被掺入转化的转基因植物中，并被稳定地表达。在优选的实施方案中，转基因导入植物细胞的基因组，可导致稳定的整合作用，使这些植物后代的基因组中也含有转基因拷贝。最初已导入此基因的植物子代，对这种遗传成分的遗传性正是本发明的优势所在。
可被导入的优选基因包括例如，细菌来源的编码结晶蛋白DNA序列，特别是一个或几个在此所述的，从芽孢杆菌属种获得的这种DNA序列。最优选的核酸序列是从苏云金芽孢杆菌获得的核酸序列，或者是那些已经基因工程改造，以便降低或增加这种被转化宿主细胞内此结晶蛋白杀虫活性的任何一种序列。
转化植物细胞并制备转基因细胞株的方法，是本领域熟知的(如在美国专利5,550,318；5,508,468；5,482,852；5,384,253；5,276,269和5,225,341中已有例证性说明，特将所有这些专利引入作为参考)，在此仅作简单论述。当然，用于转化这类细胞的载体，质粒，粘粒，YAC(酵母人工染色体)和DNA区段，通常都包含有本发明的操纵子，基因或基因衍生序列，天然的或人工合成的衍生序列，特别是编码所公开结晶蛋白的序列。这些DNA构建物还可进一步包括如下结构，如启动子，增强子，多接头，或者甚至是对所需要的待研究特定基因具有正向或负向调节活性的基因序列。此DNA区段或基因可编码天然的或被修饰的结晶蛋白，它们将在形成的重组细胞中表达，并且/或者将对再生的植物赋予改良的表型。
通过将编码对鞘翅类昆虫有害的CryET29结晶蛋白的转基因DNA区段掺入一种植物，对于增加单子叶或双子叶植物的杀虫抗性，这种转基因植物可能是理想的。特别优选的植物包括玉米、小麦、大豆、草皮草、观赏植物、果树、灌木、蔬菜、谷物、豆科植物等等，或者需要将结晶蛋白转基因导入的任何一种植物。
与本发明有关的还包括由转化植物产生的种子，从这种种子产生的后代，以及由根据上述方法产生的原代转基因植物的后代产生的种子。这些后代和种子将具有被稳定掺入其基因组的结晶蛋白转基因，并且，这些后代植物将按孟德尔方式遗传由导入稳定的转基因所赋予的品质。所有这些已将编码CryET29结晶蛋白或肽的转基因DNA区段掺入其基因组的转基因植物，都是本发明的内容。
2.5  位点特异性诱变
位点特异性诱变，是一种通过对初始DNA特异性诱变，在各种肽，或者生物功能等效的蛋白质或肽的制备过程中有用的技术。此技术还进一步具有快速制备和测定序列变异体的能力，例如结合上述的一种或几种情况，通过将一个或几个核苷酸序列改变导入此DNA。位点特异性诱变使有可能通过使用编码需要突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列，产生突变体，以及足够数量的连续核苷酸，以便为在被切断的缺失接点的二侧形成稳定的双链，提供有足够大小和序列复杂性的引物序列。一般情况下，约17-75个核苷酸或更长一点的引物是优选的，并且在接点两侧，有大约10-25个或更多一点残基被改变。
一般说来，位点特异性诱变技术是本领域熟知的，已有多种论著进行了例证性说明。应该了解的是，该技术一般是使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括如M13噬菌体载体。这些噬菌体容易购得，并且本领域的技术人员对它们的使用通常是熟知的。在定点诱变中，双链质粒也被常规地采用，它可省去将所需的基因从质粒转移至噬菌体的步骤。
概括地说，在此的定点诱变是通过首先获得单链载体或融开双链载体的二条链来进行，在此载体的序列中包含有编码所需肽的DNA序列。并且制备具有所需突变序列的寡核苷酸引物，通常是人工合成。然后以单链载体将此引物退火，并受DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶IKlenow片段的作用，以便完成带有突变单链的合成。这样就形成了异源性二聚体，其中一条链编码原来未突变的序列，另一条链带有所需的突变。然后用这种异源性二聚体载体转化或转染适当的细胞，如大肠杆菌细胞，并选择出包含带有突变序列结构重组载体的克隆。为了富集掺入诱变寡核苷酸的克隆，Kunkel et al(1987)设计了一种基因选择方案。另一种方法是采用PCRTM，以可购得的热稳定酶如Taq聚合酶，可用于将诱变寡核苷酸引物掺入被扩增的DNA片段，然后可将此DNA片段克隆进入适当的克隆或表达载体。Tomic et al(1990)和Upender et al(1995)的PCRTM一介导诱变程序，为此方案提供了二个范例。除热稳定聚合酶外，采用热稳定连接酶的PCRTM法也可用于将磷酸化的诱变寡核苷酸掺入被扩增的DNA片段，然后也可将此DNA片段克隆进入适当的克隆或表达载体。Micheel(1994)所述的诱变程序，为这样一种方案提供了范例。
应用定点诱变制备所选择肽的编码DNA区段的序列变异体，被提供作为产生潜在有用品种的手段，这并不意味着被限制，因为还有其它途径可以得到肽序列变异体和编码它们的DNA序列。例如，为了获得序列变异体，可用诱变剂如羟胺处理编码所需肽序列的重组载体。
在此使用的名词“寡核苷酸定向诱变程序”指的是模板依赖性过程和载体介导的增殖过程，它们可导致增加相对于其起始浓度的特异性核酸分子的浓度，或者增加可检测信号的强度，如放大作用。在此使用的名词“寡核苷酸定向诱变程序”还意指一个包括引物分子模板依赖性延伸的过程。名词“模板依赖性过程”指的是RNA或DNA分子的核酸合成过程，其中新合成核酸链的序列，由熟知的互补碱基配对法则确定(见例如Watson，1987)。通常，载体介导的方法包括将此核酸片段导入DNA或RNA载体，此载体的克隆扩增，以及回收扩增的核酸片段，美国专利No.4,237,224提供了此方法的范例，将此全部被引入作为参考。
多种模板依赖性过程可用于扩增样品中存在的所需靶序列。最著名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(PCRTM)，在美国专利No.4,683,195；4,683,202和4,800,159中对此方法有详述，在此均被全部引入作为参考。简单地说，PCRTM中需制备二个与靶序列的相对互补链上一些区域互补的引物序列。将过量的三磷酸脱氧核苷随同DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一道加到反应混合物中。如果样品中存在靶序列，引物将与靶序列结合，聚合酶将通过加上核苷酸，使引物沿靶序列延伸。通过升高或降低反应混合物的温度，延伸的引物将与靶序列解离，形成反应产物，剩余的引物将与靶序列和此反应产物结合，过程重复进行。为了定量测定被扩增的mRNA量，优选地可进行逆转录酶PCRTM扩增程序。聚合酶链式反应法是本领域熟知的。另一个用于扩增的方法是连接酶链式反应(被称为LCR)，公布于欧洲专利申请公开号320,308，在此全部引入作为参考。LCR中，需制备二个互补的探针对，存在靶序列时，每对探针将与靶序列的相对互补链结合，以致使它们仍连在一起。存在连接酶时，二个探针对将形成一个单位。通过同PCRTM中的温度循环，键接的单位与靶序列解离，然后又作为“靶序列”用于结合剩余的探针对。美国专利No.4,883,750描述了另一种类似于LCR以探针对结合于靶序列的扩增方法，在此将此专利整个引入作为参考。
在PCT国际专利申请公开号No.PCT/US 87/00880中描述的Qβ复制酶，也可以被用作本发明的另一种扩增方法，此专利在此也被全部引入作为参考。在此方法中，先将RNA复制序列加到有RNA聚合酶的样品中，此RNA复制序列具有与靶的一个区域互补的区域。聚合酶将拷贝此复制序列，然后可检测此复制序列。
等温扩增法也可以用于本发明扩增核酸，此方法中是使用限制性内切酶和连接酶来达到扩增靶分子的目标，此靶分子在限制性位点的一条链中含有5′-〔α-硫代〕三磷酸核苷酸(Walker et al，1992，在此整个引入作为参考)。
链替代扩增(SDA)是进行核酸等温扩增的另一种方法，它包括链替代和链合成，即切口翻译的多次循环。被称为修复链式反应(RCR)的类似方法，是可用于本发明扩增的另一种方法，它包括先使几个复盖整个扩增区的探针退火，随后进行4个碱基中仅有二个的修复反应。为了便于检测，其它二个碱基可作为生物素化的衍生物被加入。类似的措施可用于SDA。
也可以用循环性探针反应(CPR)对序列进行检测。在CPR中，使具有非-CryET29特异性DNA的3′和5′序列和CryET29蛋白特异性RNA的中间序列的探针，与样品中存在的DNA杂交。在杂交过程中，用RNA酶H处理反应物，探针产物作为消化后释放的产生信号的特殊产物可被鉴别。使起始模板对另一个循环探针退火，反应又被重复。因此，CPR包括扩增由探针与cryET29特异性表达核酸杂交产生的信号。
在英国专利Appl No.2,202,328和PCT国际专利申请公开号PCT/US 89/01025中描述的另外二种扩增方法也可用于本发明，此二专利均被全部引入作为参考。在前一专利中，是将“被修饰”的引物用于类似于PCR的模板和酶依赖性合成。可以通过以捕捉者部分(如生物素)和/或检测者部分(如酶)标记来修饰引物。在后一专利中，是将过量的标记探针加到样品中。存在靶序列时，探针与之结合，然后被催化裂开。在裂开之后，靶序列被完整地释放出，再与剩余的探针结合。标记探针的裂开成为指示靶序列存在的信号。
其它的核酸扩增程序还包括以转录为基础的扩增系统(TAS)(Kwoh et al，1989，PCT国际专利申请公开号，WO 88/10315，在此全部被引入作为参考)，其中又包括以核酸序列为基础的扩增(NASBA)和3SR。在NASBA中，可通过标准的苯酚/氯仿提取，使样品热变性，用裂解缓冲液和minispin柱处理分离DNA或RNA，或者盐酸鈲盐提取RNA，来制备用于扩增的核酸。这类扩增技术包括使具有结晶蛋白特异性序列的引物退火。在聚合反应之后，用RNA酶H消化DNA/RNA杂合体，同时再次将双链DNA分子加热变性。在这二种情况下，通过加入第二个结晶蛋白特异性引物，并随后进行聚合反应，单链DNA完全变成了双链。然后借助于聚合酶如T7或SP6，对双链DNA进行多股转录。在等温循环反应中，此RNAs被逆转录成双链DNA，并且以聚合酶如T7或SP6进行再一次转录。生成的产物，不伦是被截短的或完整的，都显示具有结晶蛋白特异性序列。
欧洲专利申请公开号329,822，公开了一种包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)，ssDNA和双链DNA(dsDNA)的核酸扩增法，它也可用于本发明，特将此专利全部引入作为参考。ssRNA是用于第一个引物寡核苷酸的第一个模板，它已被逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延长了。然后，通过核糖核酸酶H(RNA酶H，对具有DNA或RNA的RNA双链体特异性的RNA酶)的作用，将RNA从形成的DNA：RNA双链体中除去。形成的ssDNA是用于第二引物的第二模板，它也包括从RNA聚合酶启动子(例如T7 RNA聚合酶)5′至其同源区再至其模板的序列。然后借助了DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I和大“Klnenow”片段)将此引物延伸，形成双链DNA(dsDNA)分子，它具有与位于引物间初始RNA序列相同的序列，并且，在一端具有附加的启动子序列。借助于适当的RNA聚合酶，可将此启动子序列用于制备许多DNA的RNA拷贝。然后这些拷贝可重新进入循环。导致非常迅速的扩增。通过选择适当的酶，此扩增可在等温下进行，在每次循环不需加入酶。鉴于此方法的循环特点，所选择的起始序列可以是DNA或RNA形式。
PCT国际专利申请公开号WO 89/06700公开了一种基于启动子/引物序列与靶单链DNA(“ssDNA”)杂交，随之转录该核酸序列的许多RNA拷贝的核酸序列扩增方案，在此全部引入此专利作为参考。此方法不是循环性的，即新的模板不是从生成的RNA转录物产生。另一些扩增方法包括“RACE”(Frohman，1990)和“单面PCR”(one-sided)(Ohera，1989)，也是本领域技术人员熟知的。
基于在存在具有所生成的“双-寡核苷酸”序列的核酸时，使二个(或多个)寡核苷酸连接，因此扩增此“双-寡核苷酸”的方法(Wuand Deen，1996，在此全部引入作为参考)，也可用于扩增本发明的DNA序列。
2.6  抗体组合物及其生产方法
在特定的实施方案中，本发明者包括应用抗体，即能与在此公开的结晶蛋白结合的单克隆抗体或多克隆抗体。制备和鉴定抗体的方法是本领域熟知的(参见如Harlow and  Lane，1988，在此引入作为参考)。产生单克隆抗体(mAbs)的方法通常是沿着与制备多克隆抗体相同的路线开始。简单地说，多克隆抗体是通过以本发明的致免疫性组合物免疫动物，然后从被免疫的动物收集抗血清来制备，广泛的动物种类都可用于产生抗血清。通常用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。因为兔具有相对多的血量，兔是用于制备多克隆抗体的优选动物。
如本领域周知，某一组合物的免疫原性可能改变。因此，常常必须增强宿主的免疫系统，如通过使蛋白质或肽免疫原与载体偶联可达到此目的。匙孔血兰蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)是范例性优选载体。其它白蛋白如卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白，也可以用作载体。用于使多肽与载体蛋白偶联的偶合剂是本领域所熟知的，包括戊二醛、间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基丁二亚胺酯、碳化二亚胺和双二氮化联苯胺。
又如本领域周知，通过使用称为佐剂的免疫反应非特异性刺激剂，可以提高特定免疫原组合物的免疫原性。范例优选佐剂包括完全福氏佐剂(一种包含杀灭的结核分支杆菌的免疫反应非特异性刺激剂)，不完全福氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的用量，随免疫原的性质以及用于免疫的动物不同而改变。多种途径都可以用于给予免疫原(皮下注射、肌内注射、皮内注射、静脉内注射和腹膜内注射)。多克隆抗体的产生，可通过在免疫后不同时间对免疫动物采血样来监测。还可以给予第二次加强注射。重复进行加强注射和滴定检测过程，直至达到适当的滴度。达到所希望的免疫原水平时，可将免疫动物放血，分离出血清并贮存，以及/或者可将此动物用于产生mAbs。
通过应用熟知的技术，可较容易地制备mAbs，例如在美国专利4,196,265中范例性说明的技术，此专利在此被引入作为参考。概括地说，此技术包括以选用的免疫原组合物，例如纯化的或部分纯化的结晶蛋白，多肽或肽，免疫适当的动物，以能有效地刺激抗体生成细胞的方式给予免疫原组合物。啮齿动物如小鼠和大鼠是优选的动物，但是，使用兔，绵羊、毒蛙细胞也是可能的。虽然使用大鼠可能有某些优点(Goding，1986，pp.60-61)，但是，小鼠仍是优选的。最优选的是BALB/c小鼠，因为它是常用，并且一般能得到较高百分率的稳定融合。
免疫之后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，具体说是，B淋巴细胞(B细胞)用于mAb产生方案。这些细胞可从活体解剖的脾，扁桃体或淋巴结得到或者从外周血样品获得。脾细胞和外周血细胞都是优选的，前者因为它们是处于分裂成浆细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者是因为外周血容易得到。通常是将一批动物免疫，从具有最高抗体滴度的动物分离出脾，并通过用注射器匀浆脾而获得脾淋巴细胞。一般而言，来自免疫小鼠的脾含有大约5×107-2×108淋巴细胞。
然后使来自免疫动物的抗体产生B淋巴细胞，与一般是和免疫动物相同种动物的耐受性骨髓瘤细胞融合。适合用于杂交瘤产生融合程序的骨髓瘤细胞系，优选的是不产生抗体的，具有高融合效率，并且缺乏酶而使其不能在某种选择性培养基中生长的细胞系，这种选择性培养基只维持所需的融合细胞(杂交瘤)生长。
如本领域技术人员已知的若干种骨髓瘤细胞的任何一种都可使用(Goding，pp.65-66，1986；Campbell，pp.75-83，1984)。例如，当免疫动物是小鼠时，可使用P3-X63/Ag8，X63/Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可以使用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3，IR983F和4B210；而U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6全都可用于人细胞的融合。
一种优选的鼠类骨髓病细胞是NS-1骨髓细胞系(也称为P3NS-1-Ag4-1)，通过索取细胞系贮存号GM3573，易于从NIGMS人基因突变细胞贮存库(NIGMS Human Genetic Mutant CellRepository)获得此细胞系。另一种可使用的小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。
产生抗体生成脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞杂交体的方法，通常包括在促进细胞膜融合的一种或几种因素(化学剂或电场作用)存在下，分别将体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，然而此比例可在约20∶1-1∶1的范围内改变。对使用仙台病毒(Kohler andMilsteim，1975，1976)以及使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG(Gefter et al，1977)的融合方法已有描述。应用电场诱导融合的方法也是适用的(Goding，1986，pp.71-74)。
融合过程通常以很低的发生率产生能生存的杂交体，大约1×10-6-1×10-8。但是，这不成问题，因为，通过在选择性培养基中培养，可将能生存的融合杂交体与未融合的亲本细胞(特别是将正常持续无限期分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开。选择性培养基一般是一种含有核苷酸从头合成阻断剂的组织培养的培养基。范例性优选阻断剂有氨基喋呤、氨甲喋呤和氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤基基阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。使用氨基喋呤或氨甲喋呤时，对培养基补加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)，使用氮丝氨酸时，对培养基补加次黄嘌呤。
优选的选择培养基是HAT。只有存在核苷酸补救途径的细胞能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，因此不能存活。虽然B-细胞存在此途径，但是，它们在培养中有有限的生命时间，一般在约2周内死亡。因此，能在选择性培养中存活的唯一细胞是由骨髓瘤细胞和B细胞形成的杂交体细胞。
这种培养可获得杂交瘤细胞群，从中可选出特异性杂交瘤细胞。通常是通过在微量滴定板中，以单个克隆稀释法培养这种细胞来进行杂交瘤细胞的选择，随后对单个克隆的上清液(约2-3周之后)测定所需的反应性。测定法应该灵敏，简便和快速，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法，细胞毒性测定法，噬斑试验和斑点免疫结合测定法等。
随后应将所选择的杂交瘤细胞作系列稀释，并克隆成为产生单一抗体的细胞系，然后，可使其克隆长期增殖，提供mAbs。可按二条基本途径利用此细胞系产生mAb。可将此杂交瘤细胞样品注射(常常是注射进入腹膜腔)给一种组织相容性动物，这种动物应是用于为起初的融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的相同动物类型。被注射的动物将形成分泌由融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可吸取此动物的体液如血清或腹水液，提供高浓度的mAbs。也可将此单一细胞系进行体外培养，在此mAbs被自然分泌进入培养基中，从培养基中容易获得高浓度的mAbs。如果必要，可将由这二种方法产生的mAbs作进一步纯化，可用过滤法，滤心法和各种层析法如HPLC或亲和层析进行纯化。
2.7  结晶蛋白筛选和免疫检测试剂盒
本发明还提供了几种组合物，方法和试剂盒，用于筛选怀疑含有CryET29δ-内毒素或编码这种结晶蛋白的基因的样品。可以对如下各种样品进行筛选：怀疑含有或产生这样一种多肽或核酸区段的转化宿主细胞，转基因植物及其后代或种子，或者实验室样品。试剂盒可以包含本发明的新颖核酸区段或抗体。该试剂盒包含用于检测样品和本发明的核酸或抗体相互作用的试剂。所提供的试剂可以是放射性标记的，荧光标记的，或酶标记的。该试剂盒可包含一个能与本发明的核酸或抗体结合或相互作用的已知放射性标记的试剂。
该试剂盒可以作为液体溶液，附着于固体载体的，或作为干粉的形式被提供。当该试剂以液体溶液提供时，此液体溶液优选地是水溶液。当所提供的试剂是附着于固体载体时，此固体载体优选地可以是层析基质，具有许多小池的测定板，或显微镜载玻片。当所提供的试剂是干粉时，此粉末可以通过加入可能被提供的适当溶剂而再生。
在另一些实施方案中，本发明涉及免疫检测法和相关的试剂盒。建议可将本发明的结晶蛋白或肽用于检测与其有反应性的抗体，或者相反地，可将据本发明制备的抗体用于检测结晶蛋白或含结晶蛋白相关抗原表位的肽。概括地说，这些方法应包括首先获得怀疑含有这种蛋白，肽或抗体的样品，再视情况而定在有利于形成免疫复合物的条件下，使该样品与本发明的抗体或肽接触，然后检测此免疫复合物的存在。
一般来说，检测免疫复合物的形成是本领域非常熟悉的，可通过应用多种方法来达到目的。例如，本发明打算应用ELISA、RIA、免疫印迹法(例如斑点印迹法)，和间接免疫荧光技术等。一般情况下，可通过使用标记物来检测免疫复合物的形成，例如放射性标记或酶标记(如碱性磷酸酶，或辣根过氧化物酶等)。当然，如本领域熟知的，通过使用第二个结合配体如第二抗体或生物素/亲合素配体结合的配置，可发现具有另一些优点。
为了测定的目的，一般认为，实际上任何试图被检测的，怀疑包含结晶蛋白或肽，或者结晶蛋白相关的肽或抗体的样品，都可以被采用。计划使这些实施方案可用于滴定抗原或抗体样品，以及选择杂交瘤等。在相关的实施方案中，本发明打算制备可用于检测样品中结晶蛋白或相关肽，以及/或者抗体的存在的试剂盒。样品可能包括怀疑含有结晶蛋白或肽的细胞，细胞上清液，细胞悬液，细胞提取物，酶片断，蛋白提取物，或其它无细胞组合物。一般地说，本发明的试剂盒将包括一种适合的结晶蛋白，肽或者一种针对这种蛋白或肽的抗体，以及一种免疫检测试剂和容纳抗体或抗原以及试剂的包装盒。此免疫检测试剂一般包括与抗体或抗原，或者与第二结合配体结合的标记物.范例性配体可能包括针对第一抗体或抗原的第二抗体，或者具有结合标记物的生物素或亲和素(或链霉亲和素)配体。当然如上所述，本领域已知多种示范性标记物，所有这些标记物都可能用于本发明。
容器一般包括小药瓶，其中装有，并最好是适当分装的抗体，抗原或检测试剂。本发明的试剂盒通常还包括一种用于容纳抗体，抗原和试剂容器，紧密封装便于销售的包装盒。这种包装盒可能包括喷铸或冲压成型的塑料容器，可将所需的小药瓶固定在其中。
2.8  ELISAs和免疫沉淀法
ELISAs可与本发明共同应用。在ELISA试验中，是将含有结晶蛋白抗原序列的蛋白质或肽固定化在一种所选择的表面上，优选的是表现有蛋白质亲和性的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的小池表面。洗去未完全吸附的材料之后，理想的是再用非特异性蛋白结合或包被此测定板的小池，这种非特异性蛋白是已知对待测抗血清抗原中性的蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白，或乳粉溶液。这样可以封闭固定化表面上的非特异性吸附位点，因此可降低由抗血清对表面非特异性结合引起的背景干扰。
在将抗原物质结合于小池，用非反应性物质包被以便减少背景干扰，以及洗去未结合的物质之后，使此固定化表面以有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成的方式，与待测的抗血清或者临床的或生物学提取物相接触。这些条件优选地包括以稀释剂如BSA，牛γ-球蛋白(BGG)和磷酸缓冲盐水(PBS)/吐温，稀释此抗血清。这些添加剂也有助于减少非特异性背景干扰。叠加上抗血清之后，使之在优选的温度大约25°-27℃下温育2-4小时。温育完成后，冲洗与抗血清接触的表面，以便除去非免疫复合物质。优选的漂洗程序包括以例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液洗。
在使待测样品与结合的抗原之间形成特异性免疫复合物，并随之冲洗之后，通过用对第一抗体具有特异性的第二抗体处理上述材料，可测定免疫复合物的存在，甚至可以定量。为了提供检测手段，第二抗体优选地具有一个标记结合的酶，当与适当的生色底物共同温育时，将产生颜色。例如，一般愿意在有助于促进免疫复合物形成的条件下，使抗血清结合的表面与尿酶或过氧化物酶偶联的抗-人 IgG接触并温育一段时间(例如，在含PBS的溶液如PBS吐温中，室温下温育2小时)。
在与酶标记第二抗体温育，并随之洗去未结合的材料之后，通过与生色底物共同温育可以对标记物进行定量测定，生色底物可用如尿素和/溴甲酚紫，或者在用过氧化物酶作标记的情况下可用2，2′-连氮基-双-(3-乙基-苯基噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和H2O2。然后通过例如使用可见光谱分光光度计测定生色度，可达到定量的目的
本发明的抗-结晶蛋白抗体，对通过免疫沉淀作用分离其它结晶蛋白抗原特别有用。免疫沉淀作用是从混合复合物分离出靶抗原成分，可用于鉴别或分离微量蛋白质。为了分离膜蛋白，必须将细胞溶解成为去垢剂微胞。优选的是非离子盐，因为其它去垢剂如胆汁盐，在酸性pH，或存在二价阳离子时会沉淀。
在另一个实施方案中，本发明的抗体是用于紧密连续二种抗原。这对于增加抗原，例如酶-底物对的局部浓度特别有用。
2.9  蛋白质印迹法
发现本发明的组合物在免疫印迹或蛋白质印迹分析中有很大的用途。该抗-肽抗体可作为高亲和性的第一试剂，用于鉴别固定化在固体载体基质如硝酸纤维素，尼龙，或者它们的组合物上的蛋白质。与免疫沉淀法相结合，随之借助于凝胶电泳，这些抗体可作为单一步骤试剂使用，用于检测某些抗原，针对这些抗原，用于抗原检测的第二试剂会引起不利的背景干扰。当所研究的抗原是免疫球蛋白(不能使用结合免疫球蛋白的细菌细胞壁成分)，所研究的抗原与检测剂有交叉反应，或者当它们以同样的相对分子量作为交叉反应信号移动时，这点特别有用。
在这方面，包括针对毒素部分的酶标、放射性标记，或荧光标记的第二抗体的，与蛋白质印迹法结合使用的以免疫学为基础的检测法，被认为是特别有用的。
2.10  抗原表位核心序列
本发明还涉及不含整体细胞和其它肽的蛋白质或肽组合物，这种组合物包括含有一种抗原表位的纯化蛋白质或肽，这种抗原表位与一种或几种抗-结晶蛋白抗体有免疫学交叉反应性。特别是，本发明涉及来自Cry蛋白或肽的抗原表位核心序列。
如在此使用的措辞“含有一种(或几种)抗原表位，这种抗原表位与一种或几种抗-结晶蛋白抗体有免疫学交叉反应性”，意指一种肽或蛋白质抗原，它包含类似于位于结晶蛋白或多肽内的抗原表位的一级，二级或三级结构。其相似性的水平通常将达到这样一种程度，以致于使针对此结晶蛋白或多肽的单克隆抗体或多克隆抗体，也能与此交叉反应性肽抗原或蛋白抗原结合，与之反应，或者能识别它。多种免疫检测法能与这些抗体结合应用，例如蛋白质印迹法，ELISA和RIA等，所有这些都是本领域技术人员熟知的。
鉴定适合用于疫苗的Cry免疫显性抗原表位和/或其功能等效物，是一件比较简单的事情。例如，可应用在美国专利4,554,101中阐述的HOPP法，在此将此专利引入作为参考，它阐述了根据亲水性对氨基酸序列抗原表位的鉴定和制备。在其它几遍论文中也描述了这种方法，在此基础上的软件程序也可用于鉴定抗原表位核心序列(见例如Jameson和Wolf，1988，Wolf et al，1988，美国专利No.4,554,101)然后，通过应用肽合成技术或重组技术，可容易地将这些“抗原表位核心序列”的氨基酸序列掺入肽中。
适合用于本发明的肽，优选的地一般是长度约8-20个氨基酸的范围，更优选的是长度约8-15个氨基酸。一般认为，在某些情况下，较短的抗原性结晶蛋白来源的肽，例如在用于免疫检测试验的制备中具有某些优点。典型的优点包括易于制备和纯化，比较低的价格和产品具有可重复性，以及有益的生物分布。
我们建议，通过制备如下一种合成肽，可实现本发明的特别优越性，这种合成肽包含被修饰和/或延伸的抗原表位/致免疫性核心序列，因而导致形成了一种朝向结晶蛋白，特别是Cry和Cry-相关序列的“通用性”抗原表位肽。这些抗原表位核心序列，据某些特殊情况在此被鉴定为特定多肽抗原的亲水性区域。据认为，这些区域是最可能引发对T-细胞或B-细胞的刺激作用，因而导致特异性抗体产生的区域。
如在此使用的抗原表位核心序列，是一段比较短的氨基酸链，它与在此公开的针对结晶蛋白的抗体上的抗原结合位点是“互补的”，因而能与之结合。此外或从另一方面说，抗原表位核心序列是这样一种序列，它能诱发产生与针对本发明肽组合物的抗体有交叉反应性的抗体。应该理解的是，根据本发明公开内容，名词“互补”指的是氨基酸或肽显示有相互吸引力。因此，本发明的某些抗原表位核心序列，可实用地根据它们竞争，或者可能是取代所需的蛋白质抗原与相应的针对蛋白质的抗血清结合的能力来确定。
一般而言，据认为多肽抗原的大小不是特别关键性的，只要它至少有足够大小，能携带一个或几个所鉴定的核心序列。本公开内容所预计的最小的有效核心序列，一般相当于大约8个氨基酸的长度，更优选的是大约10-20个氨基酸的序列。因此，这种大小一般相当于本发明制备的最小肽抗原。但是，当需要时，这种抗原可以较大些，只要它包含有基本的抗原表位核心序列。
对抗原表位核心序列的鉴定是本领域的技术人员熟知的，例如，如在美国专利4,554,101中所述，此专利被引入作为参考，它阐述了根据亲水性对氨基酸序列抗原表位的鉴定和制备。并且，已有多种计算机程序可用于预测蛋白质的抗原部分(参见例如Jameson and Wolf，1988，Wolf et al，1988)。计算机肽序列分析程序(例如DNA Star软件，DNA Star.Inc.Madison，WI)还可用于设计本公开内容的合成肽。
应用常规的合成技术如固相技术，可容易地达到合成抗原表位序列，或者合成在其序列中包含抗原表位的肽的目的(例如通过使用可购得的肽合成仪如Appliel Biosystems Model 430A肽合成仪)。然后可将按这种方式合成的肽抗原按预定量等量分装，并按常规方式保存备用，如以水溶液的形式，或者甚至更优选地以粉末形式或冷冻干燥状态保存。
一般来说，由于肽的相对稳定性，如果需要，它们可容易地在水溶液中保存相当长的时间，例如可达6个月或更长，实际上可在任何水溶液中保存而没有明显的降解或抗原活性丧失。但是，当打算长时间在水溶液中保存时，通常理想的是加入一些药剂，包括缓冲剂如Tris或磷酸盐缓冲液，以使维持大约7.0-7.5的pH。并且，理想的还可加入抑制微生物生长的药剂如叠氮钠或硫柳汞。为了以水溶液状态长时间保存，理想的是将此溶液保存在约4℃，或者更优选地是冷冻。当然，当这种肽以冷冻干燥状态或粉末状态保存时，它们实际上可无限期保存，例如按一定量的等分量保存，使用之前可用预定量的水(最好是蒸馏水)或缓冲液使之再水化。
2.11  作为杀虫剂的结晶蛋白组合物及其使用方法
本发明者设想，在此公开的结晶蛋白组合物将作为杀虫剂而具有特殊的用途，可局部和/或系统地用于大田作物，包括但不局限于水稻、小麦、玉米、大豆、烟草、番茄、马铃薯、大麦、油菜、苜蓿、黑麦、燕麦、棉花、向日葵；还可用于草地如牧草和草皮草；水果树、柑桔、坚果、浆果、树木、灌木和蔬菜；以及观赏植物，仙人掌和肉质植物等等。
所公开和要求专利保护的是一种包含杀虫有效量结晶蛋白成分的组合物。该组合物优选地包含如在此公开的CryET29氨基酸序列，或者其生物功能等效物。
该杀虫组合物还可能包含一种或几种本领域技术人员已知的另外的结晶蛋白，例如在此表1和表4中所述的那些结晶蛋白。
该杀虫剂包括表达一种或几种本发明新型结晶蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞，或这些细胞的培养物，或者一种或几种苏云金芽孢杆菌细胞的混合物。在某些情况下，理想的是制备包含多种结晶蛋白，天然的或修饰的结晶蛋白的组合物，用于防治一种或几种类型的敏感昆虫。
本发明人设想，本领域技术人员已知的任何制剂方法，都可以应用，用于将在此公开的蛋白质制备这种生物杀虫剂组合物。最好是配制细胞培养物(优选的细菌细胞培养物是例如在此所述的苏云金芽孢杆菌细胞培养物)的全细胞制剂，细胞提取物，细胞悬液，细胞匀浆，细胞溶胞产物，细胞上清液，细胞滤液，或细胞沉淀，这种细胞能表达一种或几种cryET29 DNA区段而产生所编码的一种或几种CryET29蛋白或肽。制备这些制剂的方法是本领域技术人员熟知的，包括例如将一种或几种细菌细胞培养物，如表3中所述的表达所需CryET29肽的苏云金芽孢杆菌细胞的培养物干燥，冷冻干燥，匀浆，提取，过滤，离心，沉淀，或浓缩。
在一个优选的实施方案中，这种生物杀虫组合物包括含有溶胞的或未溶胞的细菌细胞，芽孢或结晶的流动性油悬液，其中含有一种或几种在此公开的新型结晶蛋白。优选的细胞是苏云金芽孢杆菌细胞，但是，设想任何表达在此所公开的新型核酸区段，并产生结晶蛋白的宿主细菌细胞都是可用的，例如芽孢菌属种，包括巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，坚实芽孢杆菌，埃希氏菌属种，包括大肠杆菌；和/或假单胞菌属种，包括洋葱假单胞菌，绿脓假单胞菌和荧光假单胞菌。另一方面，这种流动性油悬液可以由一种或几种如下成分的组合物组成：溶胞的或未溶胞的细菌细胞、芽孢、结晶、和/或纯化的结晶蛋白。
在第二个优选的实施方案中，这种生物杀虫组合物包括水分散性颗粒或粉剂。这种颗粒或粉剂可能包含其中含有一种或几种在此公开的新型结晶蛋白的溶胞的或未溶胞的细菌细胞，芽孢，或结晶。这些组合物的来源优选地包括如苏云金芽孢杆菌的细胞，但是设想，已经用在此公开的DNA区段转化的，并能表达此结晶蛋白的芽孢杆菌属，埃希氏菌属和假单胞菌属的细菌也是可用的。另一方面，这种颗粒或粉剂可以由一种或几种如下成分的组合物组成：溶胞的或未溶胞的细菌细胞，芽孢，结晶和/或纯化的结晶蛋白。
在第三个重要的实施方案中，这种生物杀虫组合物包括可湿性粉剂、喷雾剂、乳剂、胶体、水溶液或有机溶液、粉末、沉淀或胶体浓缩物。这种组合物可能包含上述溶胞的或未溶胞的细菌细胞、芽孢、结晶，或者细胞提取物，其中含有一种或几种在此公开的新型结晶蛋白。优选的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌(苏云金芽孢杆菌)细胞，但是设想，用在此公开的DNA区段转化的，并能表达此结晶蛋白的细菌如巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，大肠杆菌，或假单胞菌属种的细胞，也是可用的。这种干燥形式的杀虫剂组合物可被配制成湿润时立即溶解的制剂，或者按另一种方式以控制释放的形式溶解，缓释，或以其它的时间依赖性方式释放的制剂。另一方面，这种组合物可由一种或几种如下成分的组合物组成：溶胞的或未溶胞的细菌细胞、芽孢、结晶，和/或纯化的结晶蛋白。
在第四个主要的实施方案中，该生物杀虫组合物包括，溶胞的或未溶胞的细菌细胞，芽孢，结晶的细胞培养物或水溶液或悬液，或者是溶胞的或未溶胞的细菌细胞、芽孢、和/或结晶的混合物，其中含有如上所述的一种或几种在此所公开的新型结晶蛋白。这种水溶液或悬液可以以浓缩贮备液的形式提供，在使用前稀释，或者按另一种选择，以可现成使用的稀释液形式提供。
对于这些包括使用细菌细胞的方法，可在任何方便的营养培养基中培养这种包含结晶蛋白基因的宿主细胞，在此由于提供选择性培养基，其DNA构建物具有选择性优势，以致使基本上所有的细胞保留着苏云金芽孢杆菌基因。然后可借助于常规方法收获这些细胞。另外，在收获之前，还对细胞进行处理。
当此杀虫组合物包括含有所需的修饰结晶蛋白的苏云金芽孢杆菌细胞，芽孢，和/或结晶时，可以用多种方法配制这种组合物。通过与各种惰性物质如无机矿物质(叶硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)，或植物物质(粉碎的玉米芯、稻壳、胡桃壳等)混合它们可以用作可湿性粉剂，颗粒或粉末。这些制剂还可包含分散-粘结佐剂，稳定剂，其它的灭害添加物或表面活性剂，液体制剂可以是水为基础的或非水性的，可以作为泡沫剂、悬液，或可乳化的浓缩物等而使用。这些成分可能包括变流剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合剂。
另外，借助于天然的或重组的细菌表达系统，可在体外制备新型CryET29来源的突变结晶蛋白，然后分离出用于农田。这种蛋白可以是粗制的细胞溶胞产物，悬液，胶体等，或者按另一种选择，在配制成活性杀虫剂制剂之前，可进行纯化、精制、缓冲剂，和/或进一步处理。同样，在某些情况下，最好是从表达此结晶蛋白的细菌培养物分离出结晶和/或芽孢，并以这种结晶和/或芽孢的溶液、悬液或胶体制剂用作活性生物杀虫组合物。
本发明的另一个主要方面，是一种防治对在此公开的新型组合物敏感的鞘翅类昆虫的方法。这种方法通常包括使这种昆虫或昆虫群，集群等，与杀虫有效剂量的CryET29结晶蛋白组合物接触。此方法可使用如在SEQ ID NO：2中公开的那种CryET29结晶蛋白，或者其生物功能等效物。
另一方面，此方法还可使用，由SEQ ID NO：1的核酸序列，或者由与SEQ ID NO：1序列在中等或较高度严格条件下杂交的一个或几个核酸序列编码的一种或几种CryET29结晶蛋白。用于鉴定在中等或较高度严格条件下与所公开序列杂交的序列的方法，是本领域技术人员熟知的，并在此有论述。
不论何种使用方法，此活性组合物的用量应是杀虫有效剂量，此剂量随如下多种因素改变，例如被防治的鞘翅类昆虫的种类、被处理的植物或作物的种类、环境条件，以及施用此杀虫活性组合物的方法，速率和用量。
可通过将细菌细胞，结晶和/或芽孢悬液，或者分离的蛋白成分与所需的农业许可的载体共同配制，来制备该杀虫组合物。可在施用之前以适当的方式配制这种组合物，例如冷冻真空干燥、冰冻干燥，或者在水溶性载体、基质或适当的稀释剂中，如生理盐水或其它缓冲液中。这种配制的组合物可以如下各种形式存在；粉末或颗粒状物质，或者是在油(植物油或矿物油)或水中的悬液，油/水乳状液，或者是可湿性粉剂，或者是与任何适合于农业使用的其它载体物质组合的形式。适合的农业载体可以是固体或液体，也是本领域熟知的。名词“农业许可的载体”包括普通用于杀虫制剂技术的所有佐剂，如惰性成分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等，这些都是杀虫剂配制专业人员所熟知的，这种制剂可与一种或几种固体或液体佐剂相混合，并用各种方法进行制备，例如通过应用常规的制剂技术，将此杀虫组合物与适合的佐剂共同匀浆混合，掺合和/或研磨。
本发明的杀虫组合物是通过常用的方法，优选的是喷雾，施用于靶标鞘翅类昆虫的生存环境中，一般是施用在需防护植物或作物的叶片上。施用杀虫剂的强度和持续时间据情况而定，取决于特定害虫的种类，作物的种类，以及特定的环境条件。活性成分与载体的比例自然取决于该杀虫组合物的化学性质，溶解度和稳定性，以及所设计的特定配制法。
其它施用技术也是可行的，例如涂抹、淋洒、浸泡、土壤注入、松土加入、种子包涂、秧苗包涂、喷雾、气雾吹给、熏烟、雾化等，并且在某些情况还可能要求这样施用，例如侵害根或茎的昆虫，或者是为了对脆弱的植物或观赏植物施用。这些施用方法也是本领域技术人员熟知的。
本发明的杀虫组合物还可以按本发明的方法，单独使用，或者与包括但不局限于此的其它杀虫剂化合物组合使用。本发明的方法也可结合其它处理剂共同使用，如表面活性剂、去垢剂、聚合物、或时间控制释放剂。本发明的杀虫组合物可以配制成内吸使用或局部使用。
用于环境、内吸或叶面给药的杀虫组合物的浓度，取决于特定制剂的性质，施用方法、环境条件，以及杀虫力强度，有较大的变化。通常在使用的制剂中，该生物杀虫组合物至少以按重量约1％的浓度存在，并可达到和包括约重量99％。干燥的组合物制剂按重量可以含大约1％-99％，或更多的组合物，而液体制剂一般按重量可含有大约1％-99％，或更多的活性成分。包括完整细菌细胞的制剂，一般含有大约104-1012个细胞/mg。
必要时，可按一种或几种施用方法，对特定植物或目标区域施用该杀虫组合物，每公顷典型的田野施用量范围是约1g-1kg、2kg、5kg，或更多的活性成分。
2.12  用于杀灭蚤类的药剂组合物和方法
因为本发明的新型结晶蛋白是第一个被发现对蚤类具有杀虫活性的这种苏云金芽孢杆菌δ-内毒素，所以本发明者还试图配制可作为对蚤类侵扰预防和/或治疗剂给予动物的药剂组合物，特别是防治栉头蚤属成员如猫栉头蚤(通常称为猫蚤)和犬栉头蚤(通常称为犬蚤)的侵扰。尽管这里只有管翅目的二个成员本发明的组合物证明对它们有杀虫活性，但是可以设想，此组合物对于处理通常攻击动物的其它相关昆虫也是有效的，也可以用在此公开的新型组合物防治这些昆虫。对这些昆虫在美国专利5,449,681已有详述，在此引入作为参考。其中特别包括Culex属、Culisete属、Bovicola属、Callitroga属、Chrysops属、Cimes属、Ctenocephalis属、Dermatophilus属、Dermetobia属和Damalinia属。
因此，本发明的一个方面包括含有在此公开的结晶蛋白的药剂组合物，用于对动物给药，以便防止或减少蚤类或相关昆虫的侵扰。在此还公开了一种减少这种蚤类对动物侵扰的方法，并申请专利保护。此方法主要包括对动物给予杀虫有效剂量的CryET29组合物，用于对动物给予这种杀虫组合物的方法，是本领域熟知的。美国专利5,416,102(特此引入作为参考)阐述了用杀虫组合物防止蚤类侵扰的方法和制剂。
取决于具体的应用，可以按多种方法给予这种抗管翅类昆虫兽用组合物。用于对动物给予杀虫组合物的方法范例，对本领域的技术人员是熟知的，包括例如防蚤颈圈，防蚤喷雾、浸洗、撒粉等。用于对动物提供这种组合物的方法是本领域技术人员熟知的，包括直接施用或被动施用，例如以在美国专利4,008,688中描述的装置，借助于宠物床组件用于施用杀虫剂。被处理的动物可以是任何对蚤攻击或侵扰敏感的或易感性动物，这种蚤是可被在此公开的CryET29组合物杀灭或抑制的。这些动物可以是猫、犬、马、猪、狼、牛、鼠，及其它等等，虽然本发明者设想，猫和犬是用在此公开的组合物处理的特别优选的动物。
进一步的设想是，除了局部给予所公开的药剂组合物之外，在某些情况下体内给药也是可取的或理想的。为了口服给药，该组合物可以同惰性稀释剂或可食用可吸收的载体一起配制，或者把它们包裹在硬或软壳的明胶胶囊内，或者被压制成片剂，或者也可直接掺入喂食的食物中。为了口服治疗给药，可将这些活性成分同赋形剂掺和，用于形成可吸收的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆和纸囊剂等，这类组合物和制剂应含有至少0.1％活性化合物。当然，这些组合物和制剂的这种百分比是可以改变的，合适的范围可能是约单位重量的2％-60％。在这种用于治疗的组合物中，活性化合物的含量应使之能达到适当的剂量。
为了口服预防蚤类，可将此结晶蛋白与赋形剂混合，以凝胶、糊状、粉剂、丸剂、片剂、胶囊剂或淤浆状使用，供给动物摄食。另一方面，在将此组合物作为宠物食品和治疗的添加剂来配制，或者配制成其它可食的制剂。当被配制成片剂或胶囊等时，该组合物还可包含如下成分：粘合剂如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；以及甜味剂蔗糖、乳糖或糖精，或者还可加入香味剂，使此组合物对被治疗的动物更好吃。用于对动物给予蚤预防药的这样一种方法，是一种如美国专利4,702,914中所述的调味品，此专利特此被引入作为参考。
当剂量单位形式是胶囊时，除了上述各种成分之外，它还可能包含液体载体。各种其它物质还可以作为包衣存在，或者用于改变剂量剂单位的物理形态。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用虫胶、糖、或者用此二者包衣。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质，都应该是药剂学纯的，并且在使用量是基本无毒的。此外，这种活性化合物还可配制成缓释制剂和剂型。
另一方面，在此公开的药剂组合物也可能非经肠道给药，肌肉注射，或者甚至腹膜内注射。可以在水中适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合，制备游离碱或药剂学允许的盐形式的活性化合物溶液。还可以在甘油，液态聚乙二醇，或在它们的混合物中，或者在油中制备分散体。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂还含有防腐剂，防止微生物生长。适合于注射用的药剂形式包括无菌的水溶液或分散体，以及用于临床时配制无菌注射液或分散体的无菌粉剂。在任何情况下这种剂型都必须无菌，并且必须是具有易注射性程度的液体。在生产和贮存条件下它必须是稳定的，并且必须对微生物如细菌和真菌的污染作用具有防腐性，载体可以是溶剂，或者是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)，它们的适当混合物，和/或植物油的分散体介质。通过如下措施可保持适当的流动性，例如使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下保持其所要求的颗粒大小，以及使用表面活性剂。借助于如下各种抗细菌剂和抗真菌剂，可达到对微生物作用的预防，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下，最好应包括等渗剂如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂如一硬脂酸铝和明胶，可达到使注射组合物延长吸收的目的。
当需要体内给药时，例如以水溶液非经肠道给药，如果必要，此溶液应该适当地被缓冲，并且首先要用足够的生理盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这种特定的水溶液特别适合于肌内注射，皮下注射和腹膜内注射给药。在这方面，按照此公开内容，本领域的技术人员应熟知可应用的无菌水溶液基质。根据被治疗动物的状况，大小和种类，必然会有某些剂量改变。负责给药的人无论如何也应确定用于单个对象的适当剂量。并且，对人给药时，制剂应该符合“食品药品管理局的生物制品标准”要求的无菌性，致热性，总体安全性和纯度标准。
无菌注射液的制备法是按需要量将活性化合物掺入到适当的溶剂中，需要时可加入各种上面列举的其它成分，随后进行过滤除菌。分散体的制备一般是将各种无菌活性成分掺入到含有基础分散介质和上面列举的所需其它成分的无菌赋形剂中。在需要制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选的制备法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，这种技术可制备含有活性成分加来自其原先无菌滤液的任何所需辅助成分的粉剂。
在此公开的组合物可按其天然形式或盐的形式配制。药剂学允许的盐包括与无机酸或有机酸形成的酸式加成盐(以蛋白质的游离氨基形成的)，无机酸包括例如盐酸、磷酸，有机酸包括如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羟基形成的盐，也可以是来源于无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及来源于有机碱如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。根据配制方法，溶液应按照与剂量配方一致的方式，例如以治疗有效量给药。这些制剂易于以各种剂型给药，如乳膏剂、洗剂、喷雾剂、浸洗剂、乳剂、胶体剂，或者按另一种方式，当需要体内给药时，则以可注射液和药物释放胶囊等剂型给药。
在此使用的“载体”包括随便什么溶剂，分散介质，赋形剂，包衣，稀释剂，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂，缓冲剂，载体溶液，悬液，胶体等等。这样一些介质和药剂对药物活性物质的用途是本领域熟知的。除去有任何常用的介质或药剂与该活性成分是不相容的之外，都可设法用于这种治疗组合物。还可以将一些补充的活性成分掺入该组合物中。
名词“药剂学允许的”指的是，对动物给药时不会引起过敏性反应或类似的不利反应的分子实体和组合物。本领域熟知制备含有蛋白质活性成分水溶性组合物的方法。这种组合物通常制备成可注射的，溶液或悬液，也可以制备成适合于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式，还可以将此制剂乳化。
本发明的另一方面包括用于对怀疑受管翅类昆虫侵扰的环境区域，防治和根除这种昆虫的方法和组合物。该方法主要包括，对怀疑存在这种昆虫的区域，施用在此公开的杀虫有效剂量CryET29组合物。本发明人还进一步试图应用本发明的蛋白质作为药剂组合物的活性成分，用于对动物身体给药，或者对动物的生活区和附近施用，以便防止，减轻或减少蚤类和相关昆虫在这些区域内的侵扰。应用兽用杀虫制剂领域技术人员已知的技术，可将这种结晶蛋白组合物配制成，适合于对动物身体给药，或者对这种动物的生活区域，草垫用品，房舍，庭院，狗窝，宠物居住设施等施用的粉剂、喷雾剂、气雾剂、颗粒剂、洗剂、洗发剂、防蚤颈圈、浸洗剂等等。在美国专利5,416,102的阐述中，可找到口服兽用杀虫制剂的范例。本发明者设想，鉴于在此公开的新型组合物，是第一个被鉴定具有这种理想的抗管翅类昆虫杀虫活性的结晶蛋白，因此将这种组合物用于预防或根除侵扰宠物如狗、猫、和其它毛皮动物的蚤类，可能是此领域的重要进展。
2.13  生物功能等效物
可以对本发明肽的结构，以及编码它们的DNA区段的结构进行修饰和改变，并且仍能得到编码具有理想特征蛋白质或肽的功能性分子。下面是基于改变蛋白质的氨基酸而产生等效，或者甚至改进的次生分子的论述。在本发明的特定实施方案中，设想突变的结晶蛋白对增加该蛋白质的杀虫活性是有用的，并且从而可增加植物细胞中重组转基因的杀虫活性和/或表达。通过根据表2中给出的密码子，改变DNA序列的密码子，可达到氨基酸改变的目的。
                                                                   表2
  氨基酸   密码子
  丙氨酸半胱氨酸天冬氨酸谷氨酸苯丙氨酸甘氨酸组氨酸异亮氨酸赖氨酸亮氨酸甲硫氨酸天冬酰胺脯氨酸谷氨酰胺精氨酸丝氨酸苏氨酸缬氨酸色氨酸酪氨酸   Ala    A    GCA  GCC  GCG  GCUCys    C    UGC  UGUAsp    D    GAC  GAUGlu    E    GAA  GAGPhe    F    UUC  UUUGly    G    GGA  GGC  GGG  GGUHis    H    CAC  CAUIle    I    AUA  AUC  AUULys    K    AAA  AAGLeu    L    UUA  UUG  CUA  CUC  CUG  CUUMet    M    AUGAsn    N    AAC  AAUPro    P    CCA  CCC  CCG  CCUGln    Q    CAA  CAGArg    R    AGA  AGG  CGA  CGC  CGG  CGUSer    S    AGC  AGU  UCA  UCC  UCG  UCUThr    T    ACA  ACC  ACG  ACUVal    V    GUA  GUC  GUG  GUUTrp    W    UGGTyr    Y    UAC  UAU
例如，在蛋白质结构中，某些氨基酸可以代替另一些氨基酸，而不会明显地失去与如下一些结构相互结合的能力，例如抗体的抗原结合区，或底物分子上的结合位点。因为正是蛋白质的这种相互作用能力和性质，确定了蛋白质的生物功能，所以在蛋白质序列中，当然，是在它基础的DNA编码序列中可以进行某些氨基酸序列的取代，而仍然可获得具有相同特性的蛋白质。因此，本发明者设想，在所公开组合物的肽序列中，或者在相应的编码此肽的DNA序列中，可进行多种改变，而不会明显地失去它的生物用途或活性。
在进行这些改变时，应考虑氨基酸的疏水指数(hydropathicindex)。本领域普遍理解氨基酸疏水指数对赋予蛋白质相互作用的生物功能的重要性(Kyte and Doolittle，1982，在此引入作为参考)。一般认为，氨基酸的相对疏水特性，有助于所生成蛋白质的二级结构，这种结构又限定了蛋白质与其它分子，如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
根据其疏水性和电荷特征，对每个氨基酸确定了一个疏水指数(Kyte and Doolittle，1982)，它们是：异亮氨酸(+4.5)，缬氨酸(+4.2)，亮氨酸(+3.8)，苯丙氨酸(+2.8)，半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)，甲硫氨酸(+1.9)，丙氨酸(+1.8)，甘氨酸(-0.4)，苏氨酸(-0.7)，丝氨酸(-0.8)，色氨酸(-0.9)，酪氨酸(-1.3)，脯氨酸(-1.6)，组氨酸(-3.2)，谷氨酸(-3.5)，谷氨酰胺(-3.5)，天冬氨酸(-3.5)，天冬酰胺(-3.5)，赖氨酸(-3.9)，和精氨酸(-4.5)。
本领域已知，用具有相似疏水指数或得分的另一些氨基酸取代某些氨基酸，仍然可获得具有相似生物活性的蛋白质，即仍然可获得生物功能等效的蛋白质，在进行这些改变时，其疏水指数在±2以内的氨基酸取代是优选的，其指数在±1内的特别优选，而在±0.5以内的更是特别优选。
本领域还理解到，可根据其亲水性，有效地进行类似氨基酸的取代。在此引入作为参考的美国专利4,554,101指出，由其相邻氨基酸亲水性所决定的蛋白质局部最大平均亲水性，与蛋白质的生物特性相关。
如在美国专利4,554,101中所详述的，对氨基酸残基赋予了如下亲水性值：精氨酸(+3.0)，赖氨酸(+3.0)，天冬氨酸(+3.0±1)，谷氨酸(+3.0±1)，丝氨酸(+0.3)，天冬酰胺(+0.2)，谷氨酰胺(+0.2)，甘氨酸(0)，苏氨酸(-0.4)，脯氨酸(-0.5±1)，丙氨酸(-0.5)，组氨酸(-0.5)，半胱氨酸(-1.0)，甲硫氨酸(-1.3)，缬氨酸(-1.5)，亮氨酸(-1.8)，异亮氨酸(-1.8)，酪氨酸(-2.3)，苯丙氨酸(-2.5)，色氨酸(-3.4)。
一般认为，用一个氨基酸取代另一个具有相似亲水性值的氨基酸，也可得到生物功能等效的，特别是免疫功能等效的蛋白质。在进行这些改变时，其亲水性值在±2以内的氨基酸取代是优选的，在±1以内的取代特别优选，而在±0.5以内的取代更是特别优选的。
如上面所概述的，氨基酸的取代一般是根据氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如它们的疏水性，亲水性，电荷，大小等。基于上述各种特征的范例性取代，是本领域技术人员熟知的，它们包括：精氨酸和赖氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，丝氨酸和苏氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
3.附图简述
下面的附图构成了本专利说明书的一部分，并被用于对本发明的某些方面作进一步说明。通过参照这二个附图，与在此提供的特定实施方案的详述相结合，可对本发明有更深的理解。
图1A和图1B显示cryET29基因的核酸序列(SEQ ID NO：1)，以及被推导的相应CryET29蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
4.对说明性实施方案的描述
本发明提供了一种新颖的δ-内毒素，被定名为CryET29，它对猫蚤，猫栉头蚤，以及对鞘翅类昆虫如南部和西部玉米食根虫、Colorado土豆甲虫、日本甲虫和红粉甲虫具有毒性。重要的是注意到，对通俗的名称猫栉头蚤有点误解，这种蚤不仅寄生于猫，而是对犬也是主要的寄生蚤(参见例如美国专利4,547,360，特此引入作为参考)。
4.1  cryET29DNA探针和引物
另一方面，本发明提供的DNA序列信息使之有可能制备，具有与在此公开的所选择的多核苷酸基因序列特异性杂交能力的相对短的DNA(或RNA)序列。关于这方面，基于对所选择的结晶蛋白基因序列，例如在SEQ ID NO：1中所示序列的考虑，制备了一些适当长度的核酸探针。这些核酸探针与结晶蛋白编码基因序列特异性杂交的能力，使它们在许多实施方案中特别有用。最重要的是，这些探针可在多种检测试验中应用，用于检测所给予的样品中互补序列的存在。
在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有益的。使用本发明的多核苷酸设计了这些引物序列，用于借助PCRTM技术，检测，扩增或突变来自苏云金芽孢杆菌的结晶蛋白基因的某一限定区段。应用这些引物，通过PCRTM也可扩增来自其它菌种的相关结晶蛋白基因的区段，
4.2  表达载体
本发明设计了一种包含本发明多核苷酸的表达载体。因此，在一个实施方案中，表达载体是分离出和纯化的DNA分子，它包含有效地连接于编码本发明多肽的编码区的启动子，此编码区又有效地连接于转录终止区，从而该启动子可驱动编码区的转录。
如在此使用的名词“有效地连接”，意指启动子以这样一种方式连接于编码区，以致于使该编码区的转录可受到此启动子的调控。将启动子有效地连接于编码区的方法是本领域熟知的。
在优选的实施方案中，编码本发明结晶蛋白的DNAs的重组表达，优选地是在芽孢杆菌属宿主细胞中。优选的宿主细胞包括苏云金芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和相关的芽孢杆菌，而以苏云金芽孢杆菌宿主细胞最优选。在细菌中具有功能作用的启动子是本领域熟知的。用于该芽孢杆菌结晶蛋白的范例性优选启动子包括任何已知的，包括cryET29基因启动子在内的结晶蛋白启动子，以及对苏云金芽孢杆菌Sigma因子如σE和σK特异性的启动子(见Banm和Malvar，1995的综述)。另一方面，还通过人工构建被诱变的或重组的结晶蛋白编码基因启动子，并用于启动在此公开的新型基因区段的表达。
在另一实施方案中，是应用转化的革兰氏阴性菌如大肠杆菌或假单胞菌属种宿主细胞，进行编码本发明结晶蛋白的DNAs重组表达。在大肠杆菌和其它革兰氏阴性宿主细胞中对靶多肽高水平表达发挥功能的启动子，也是本领域熟知的。
在本发明的表达载体是用于转化植物的情况下，应选择能驱动在植物中表达的启动子。在植物中发挥功能的启动子，也是本领域熟知的。可用于在植物中表达该多肽的启动子，是所述的可诱导性启动子，病毒启动子，合成的，和组成性启动子(Poszkowski et al，1989，Odellet al，1985)，以及时序调控的，空间调控的，和时空调控的启动子(Chau et al，1989)。
启动子的选择，还要根据它将转化植物细胞的，或转基因植物的转录活性，定向于该编码区的能力。在植物组织中，结构基因可被多种启动子驱动。这些启动子可以是精密组成的，如CaMV 35S启动子，或者是影响双子叶植物或单子叶植物的组织特异性启动子或发育特异性启动子。
在该启动子是精密组成的启动子如CaMV 35S的情况下，发现在多种转化的植物组织中(例如愈伤组织，叶，种子和根)多肽的表达增加了。另一方面，通过使用含有组织特异性启动子的植物整合载体，可以将这种转化作用定向于特定的植物组织。
范例性组织特异性启动子是外源凝集素启动子，它对种子组织具有特异性。大豆种子中的外源凝集素蛋白是由单一基因(Lel)编码的，此基因仅在种子成熟期间表达，它占种子总mRNA量的约2％-5％。对外源凝集素基因和种子特异性启动子的特征已进行了充分的描述，并且已在转基因烟草植物中用于定向种子特异性表达(Vodkin etal，1983，Lindstrom et al，1990)。
可构建含有编码所需多肽编码区的表达载体，使之置于外源凝集素启动子的控制之下，并可应用如原生质体转化法将此载体导入植物(Dhir et al，1991)。可将该多肽的表达特异性定向于转基因植物的种子。
可以使从用组织特异性启动子转化的植物细胞产生的本发明转基因植物，与另一从用不同组织特异性启动子转化的植物细胞发育成的转基因植物相杂交，以便产生在一种以上特定组织中显示转化作用的杂交转基因植物。
范例性组织特异性启动子有玉米蔗糖合成酶l(Yang et al，1990)，玉米醇脱氢酶l(Vogel et al，1989)，玉米捕光复合体(Light harvesting complex)(Simpson，1986)，玉米热激蛋白(Odell et al，1985)，豌豆小亚单位RuBP羧化酶(Poulsen etal，1986，Cashmore et al，1983)，Ti质粒甘露碱合成酶(Langridge et al，1989)，Ti质粒胭脂碱合成酶(Langridge etal，1989)，矮牵牛属植物查耳酮异构酶(Van Tunen et al，1988)，豆丰甘氨酸蛋白l(Keller et al，1989)，CaMV 35S转录物(Odell et al，1985)以及马铃薯糖蛋白(Wenzler etal，1989)的启动子。优选的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)启动子和S-E9小亚单位RuBP羧化酶启动子。
选择哪种表达载体，使肽编码区最终与哪种启动子有效地连接，都直接取决于所要求的功能特性，例如蛋白质表达的定位和定时性，以及待转化的宿主细胞。这些都是周知的，为构建重组DNA分子技术所固有的局限性。但是，用于实施本发明的载体，能够指导与它有效连接的肽编码区的表达。
用于在高等植物中基因表达的典型载体是本领域熟知的，包括来源于已被论述的根瘤土壤杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers etal，1987)。但是，已知还有其它几种植物整合载体系统在植物中起作用，其中包括已被描述的pCaMVCN转移控制载体(Fromm etal，1985)。质粒pCaMVCN(可从Pharmacie，Piscataway，NJ得到)中包含花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子。
在优选的实施方案中，用于表达该多肽的载体包含一个在植物细胞中有效的选择标记，优选地是药物抗性选择标记，一个优选的药物抗性标记是其表达将导致卡那霉素抗性的基因，即包含胭脂碱合成酶启动子，Tn5新霉素磷酸转移酶II(npt II)和胭脂碱合成酶3′非翻译区的嵌合基因(Rogers et al，1988)。
RNA聚合酶通过存在聚腺苷酸化的位点转录DNA编码序列。通常是位于聚腺苷酸化位点几百个碱基对下游的DNA序列，用来终止转录。这些DNA序列在此被称为转录终止区。为了使转录的信使RNA(mRNA)有效地聚腺苷酸化而需要这些区域。
制备表达载体的方法是本领域熟知的。在美国专利No.4,971,908；4,940,835；4,769,061和4,757,011中，描述了用于转化植物的表达(转化载体)和制备这些载体的方法，这些专利的公开内容在此均被引入作为参考。可以修饰这些载体，使之包含本发明的编码序列。
已建立了多种方法，用于通过互补的粘性末端或平端，使DNA有效地连接于载体。例如，可以将互补的同聚物片段加到待插入的DNA区段和载体DNA中。然后通过互补同聚物尾部之间的氢键，使载体和DNA区段连接，形成重组DNA分子。
能使细胞具有杀虫活性的多肽，其编码区优选的是苏云金芽孢杆菌CryET29结晶蛋白编码基因。在优选的实施方案中，这种多肽具有SEQID NO：2的氨基酸残基序列，或者具有此序列的功能等效序列。根据这些实施方案，包含SEQ ID NO：1的DNA序列的编码区也是优选的。
4.3  CryET29结晶蛋白的特征
本发明提供的新型多肽，确定为苏云金芽孢杆菌CryET29结晶蛋白的全部或一部分。
在优选的实施方案中，本发明公开了一个分离并纯化的CryET29蛋白，并且对它申请专利保护。此CryET29蛋白包含如SEQ ID NO：2中公开的氨基酸序列。CryET29具有计算的等电常数(pI)等于5.88。CryET29蛋白的氨基酸组成如表3中所示。
                                                    表3
                                             CryET29的氨基酸组成
  氨基酸   残基号   ％总量   氨基酸   残基号   ％总量
  AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIle   1871515115105320   7.73.06.46.40.46.44.32.11.28.6   LeuLysMetPheProSerThrTrpTyrVal   13164126161721026   5.66.91.75.12.56.97.30.84.311.2
  酸性碱性芳香族疏水性   (Asp+Glu)(Arg+Lys)(Phe+Trp+Tyr)(芳香族+Ile+Leu+Met+Val)   25232487   10.79.910.237.3
4.4  转化的或转基因植物细胞
已计划形成以本发明表达载体转化的细菌，酵母细胞，或者植物细胞或植物。还计划构建来源于这种转化或转基因细胞的转基因细菌，酵母细胞，植物细胞或植物。用于转化细菌和酵母细胞的方法是本领域熟知的。一般来说，这种转化方法类似于已知的用于转化其它细菌或酵母如大肠杆菌或酿酒酵母菌的方法。
用于植物细胞DNA转化的方法包括，土壤杆菌介导的植物转化，原生质体转化，将基因转移进花粉，注射进入生殖器官，注射进入未成熟的胚胎，以及粒子轰击法。这些方法都各有明显的优缺点。因此，一种将基因导入某一特定植物株的特定方法，对另一植物株就不一定是最有效的，但是已知道，对于某一特定植株哪种方法有效。
例如，Lundquist和Walters的美国专利5,538,880和5,538,877(特此引入作为参考)公开了用于产生可发育转基因玉米的基于微投射的方法。Clark et al的美国专利5,530,193(特此引入作为参考)，公开了产生病毒抗性转基因玉米的方法。在Barry et al的美国专利5,633,435中，公开了产生含有外源性DNAs(如除草剂抗性基因)的转基因植物的方法(特此引入作为参考)。Thomas和Townsend的美国专利5,563,055(特此引入作为参考)公开了应用土壤杆菌介导的转化产生转基因大豆的方法。在Beach et al的国际专利申请公开号WO9527068中(特此引入作为参考)，公开了用于产生已进行基因修饰而能表达预选蛋白质的植物种子的方法。Dhir和Widholm在国际专利申请公开号WO 9217598中(特此引入作为参考)，描述了通过对子叶来源的原生质体进行电穿孔而产生转基因大豆植株的方法。
土壤杆菌也已被Chee et al成功地用于转化未分化的萌发分生组织细胞或中胚轴细胞(美国专利5,169,770和5,376,543，以及WO8905859，特此均引入作为参考)。Brill et al的美国专利5,597,718，Maliyakal的美国专利5,521,078，以及Borton和Maliyakal的美国专利5,474,925(特此均引入作为参考)，公开了用于产生转基因棉花的多种方法。McBride et al的国际专利申请号WO 9640924(特此引入作为参考)中，描述了用于产生转基因棉花的DNA构建物。还描述了将子房特异性组织转录因子用于转化植物，使之在转基因植物中指导组织特异性产生异源性蛋白(Martineau和Martineau，1996年的国际专利申请公开号WO 9626639，特此引入作为参考)。
Chappell et al的美国专利5,349,126(特此引入作为参考)中，描述了产生具有增强抗昆虫性的转基因植物的方法，包括如蕃茄、苜蓿、大麦、胡萝卜和烟草等转基因植物。Fry和Zhou(美国专利5,631,152，特此引入作为参考)公开了一个用于获得可育性转化小麦的快速转化再生系统。Fry and Zhou(欧洲专利申请公开号EP 709462，1996，特此引入作为参考)还描述了通过用外来的DNA转化可再生组织或胚胎发生愈伤组织，产生转基因单子叶植物如小麦的方法。Arntzen和Lam的美国专利5,612,487(特此引入作为参考)描述了产生抗病毒转基因烟草的方法。Merikke et al(美国专利5,589,625，特此引入作为参考)描述了产生表达多病毒抗性的转基因植物(如烟草和马铃薯)的方法。此方法包括产生具有重组2，5-α合成酶活性的转基因植物。Fitzmaurice和Mirkov的美国专利5,422,108(特此引入作为参考)中，描述了产生如下病原菌抗性植物(包括转基因烟草)的方法：土壤杆菌属，假单胞菌属，黄单胞菌属，欧文氏菌属和棍状杆菌属。
Kauppinen et al(国际专利申请公开号WO 9526628，1995，特此引入作为参考)公开了一种用从小孢子分离的原生质体，产生可育性转基因大麦的方法。Chang et al (国际专利申请公开号WO9413822，1994，特此引入作为参考)描述了通过以DNA轰击小麦组织，产生稳定转化的可育性小麦，从而培育成高产，高营养和抗病的小麦品种，Eyal et al的国际专利申请公开号WO 9318168(1993，特此引入作为参考)中，公开了用DNA水溶液产生含有外源性DNA的转基因小麦的方法，是在受精之前，将此DNA水溶液施用于去雄植物小花的授粉柱头。美国专利5,405,765(特此引入作为参考)和Vasil和Vasil的国际专利申请公开号WO 9304178(1992，特此引入作为参考)，公开了应用将DNA投递给C型胚胎胼胝体的产生转基因小麦的方法，使之在转化的植物中能表达克隆基因(例如对除草剂抗性)。
尽管有许多将转化DNA区段导入细胞的方法，然而已表明，不是所有的方法都适合于对植物细胞传递DNA。但是据认为，适合的方法实际上包括任何能将DNA导入细胞的方法，例如通过土壤杆菌感染，借助于例如PEG-介导的原生质体转化定向传递DNA(Omirulleh etal，1993)，通过干燥/抑制介导的DNA摄入，通过电穿孔法，通过以碳化硅纤维搅拌，通过加速DNA包裹的微粒等等，在某些实施方案中，加速法是优选的，包括例如微投射轰击等。
本领域的技术人员熟知将DNA导入细胞的技术。对四种将基因导入细胞的一般性方法已有描述：(1)化学法(Graham and Van derEb，1973；Zatloukal et al，1992)；(2)物理方法如微注射(Capecchi，1980)，电穿孔法(Wong and Neumann，1982，Fromn et al，1985)和基因枪法(Johnston and Tang，1994，Fynan et al，1993)，(3)病毒载体法(Clapp，1993；Lu etal，1993；Eglitis and Anderson，1988a，1988b)，(4)受体介导机制(Curiel et al，1991，1992，Wagner et al，1992)。
4.4.1  电穿孔法
对多种动、植物细胞施加短暂的高压电脉冲，可导致在细胞质膜形成毫微米大小的小孔。通过这些小孔DNA可被直接摄入细胞质，或者作为伴随小孔关闭的膜成分重新分布的结果，DNA被摄入细胞质。电穿孔法可能十分有效，既可用于瞬时表达克隆基因，又可用于建立携带所需基因整合拷贝的细胞系。与磷酸钙介导的转染法和原生质融合法不同，电穿孔法常常会导致产生携带一个，或至多几个外源DNA整合拷贝的细胞系。
借助电穿孔导入DNA是本领域技术人员熟知的。在此方法中，可用某些细胞壁降解酶如果胶降解酶处理接受者靶细胞，使它对电穿孔转化比未处理的细胞更敏感。另外，还可通过机械损伤使接受细胞对转化更敏感。为了实现电穿孔转化，可使用易碎的组织如细胞悬浮培养物，或者胚胎愈伤组织，另外还可以直接转化未成熟的胚胎或其它结构组织。应该通过将所选择的细胞暴露于果胶降解酶(果胶酶)，或者以受控方式造成机械损伤，使其细胞壁部分降解。这样，这些细胞就成了电穿孔DNA转移的接受细胞，电穿孔DNA转移可在此阶段进行，然后，取决于新掺入DNA的性质，借助于适当的选择或筛选程序，可对转化细胞进行鉴定。
4.4.2  微投射轰击法
将转化DNA区段传递给植物细胞的另一种优选的方法是微投射轰击法。这种方法是用核酸包裹微粒，借助于推进力传递进细胞内。范例性微粒包括由钨、金、铂等组成的微粒。
微投射轰击法的优点，除了它是一种可重复性稳定转化单子叶植物的有效方法之外，它既不需要分离原生质体(Criston et al，1988)，也不需要具有对土壤杆菌感染的敏感性。在一个说明性实施方案中，用于通过加速作用将DNA传递进玉米细胞的方法是一个生物微粒传递系统(Biolistics Particle Dellivery System)，它可用于推动以DNA或细胞包裹的微粒，通过如不锈钢或Nytex屏，到达复盖悬浮培养的玉米细胞的滤纸表面。这种屏可分散微粒，以便使它们不会以大团粒的形式投向接受细胞。据认为，介于投射仪和待轰击细胞之间的屏，可使投射凝粒的体积减小，有助于提高转化率，减少由于太大凝粒的投射对接受细胞造成的损伤。
为便于轰击，优选的是将细胞悬液浓缩在滤纸表面或固体培养基上。另外，可将未成熟的胚胎或其它靶细胞安排在固体培养基上。将待轰击的细胞置于大投射粒终止屏下的适当距离。如果需要，也可在加速器和待轰击细胞之间安置一块或几块屏。通过应用在此所述的技术，可获得多达1000个以上瞬时表达标记基因的细胞灶。在轰击后48小时，细胞灶中表达外源性基因的细胞数目，通常有1-10个，平均1-3个。
在进行轰击转化时，可使轰击前的培养条件和轰击参数最优化，以便获得最大数量的稳定转化体。在此技术中，用于轰击的物理学和生物学参数都是重要的。物理因素是那些涉及控制DNA/微投射凝结物的因素或者那些影响大投射粒或微投射粒射程和速度的因素。生物因素包括在轰击前和轰击后立即处理细胞的所有步骤，有助于减轻与轰击有关的靶细胞创伤的渗透压调节，还包括转化DNA的性质例如是线性化的DNA或完整的超螺旋质粒。据认为，轰击前的控制因素对未成熟胚胎的成功转化特别重要。
因此设想，可能希望在小规模试验中调节各种轰击参数，使之处于完全最佳状态。特别有希望调节物理参数如间隔距离，射程距离，组织距离，以及氦气压力。还可以通过改变影响接受细胞生理状态，并因此可影响转化和整合效率的条件，使损伤性攻击因数(TRF)减到最小。例如，为了最佳转化，渗透压状况，组织水合作用，以及接受细胞的传代培养阶段或细胞周期都可以调节。根据本公开内容，本领域的技术人员还能进行其它的常规调节。
4.4.3  土壤杆菌介导的转移
土壤杆菌介导的转移，是用于将基因导入植物细胞的可广泛应用的系统，因为可将DNA导入全部植物组织，因此不需要从原生质体再生成完整的植株。应用土壤杆菌介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞，是本领域熟知的。可参见例如(Fraley et al，1985，Rogers etal，1987)所述的方法。并且，Ti-DNA整合是几乎不引起重排的相当精确的过程。待转移的DNA区由边缘序列限定，并且，间插的DNA通常是插入该植物的基因组，对此已有描述(Spielmann et al，1986，Jorgensen et al，1987)。
如所描述的，新型土壤杆菌转化载体可在大肠杆菌及土壤杆菌中复制，并便于控制(Klee et al，1985)。而且，当前对用于土壤杆菌介导的基因转移载体的技术进展，已改善了载体中基因和限制性位点的排列，有助于构建能表达多种多肽编码基因的载体。所述载体(Rogers et al，1987)具有方便的多接头区，启动子和聚腺苷酸化位点位于其两侧，可定向表达插入的多肽编码基因，适合于本发明的目的。此外，包含装备和未装备Ti基因的土壤杆菌都可用于这种转化。在那些土壤杆菌介导转化有效的植株中正选用了这种方法，因为容易获得明确的基因转移性质。
对叶片和其它组织如子叶和胚轴的土壤杆菌介导转化，似乎局限于土壤杆菌天然感染的植物。土壤杆菌介导转化对双子叶植物最有效。似乎没有几种单子叶植物是土壤杆菌的天然宿主，虽然用所述的土壤杆菌载体已对天门冬属产生了转基因植物(Bytebier et al，1987)。因此，重要的商品谷类植物如水稻、玉米和小麦，通常必须用其它方法转化。但是如上所述，用土壤杆菌转化天门冬属植物也能成功(见例如Bytebier et al，1987)。
用土壤杆菌转化法形成的转基因植物，一般是在一个染色体上含有单个基因。可把这种转基因植物看作是对加入的基因杂合性的。但是，因为使用名词“杂合性”，通常意味着在一对染色体的第二个染色体的相同基因座，存在一互补的基因，而在此含有一个外加基因的植物中，没有这种基因，据认为，对于这种植物更精确的名称是独立的分离子，因为在有丝分裂和减数分裂过程中，这种加入的外源性基因可独立地分离开。
更优选的是，转基因植物对加入的结构基因是纯合性的，也就是说，含有二个外加基因的转基因植物，一个基因位于染色体对的每个染色体上相同的基因座。通过如下步骤可获得纯合性转基因植物：使含有单一外加基因的独立分离子转基因植物有性接合(自花授粉)，再使所产生的一些种子萌发，然后对所产生的植物分析其相对于对照(天然的非转基因植物)或独立的分离子转基因植物，具有的更高羧化酶活性。
应理解的是，也可以使二种不同的转基因植物产生含有二种分开独立加入的外源性基因的后代。用适当的后代进行自花授粉，可产生对于二个加入的编码所需多肽的外源性基因纯合性的植株。也可以设计进行亲代植株回交以及同非转基因植物远交。
应用基于如下的方法可获得转化的植物原生质体：磷酸钙沉淀法，聚乙二醇处理，电穿孔法，以及这些处理的组合形式(见例如Potrykaset al，1985，Lorz et al，1985，Fromm et al，1985，Uchimiya et al，1986，Callis et al，1987，Marcotte et al，1988)。
这些系统对不同植株的应用，取决于它从原生质体再生特定植株的能力。对于从原生质体再生谷类植株的例证性方法已有描述(Fujimuraet al，1985，Foriyama et al，1986，Yamada et al，1986，Abdullach et al，1986)。
当不能从原生质体成功地再生成转化植株时，可应用其它方法将DNA导入完整的细胞或组织。例如可从未成熟的胚胎或外植体实现谷类植物的再生(Vasil，1988)。此外，还可应用“微粒枪”或高速微投射技术(Vasil，1992)。
应用最新的技术，可将DNA携带在微小金属颗粒的表面而透过细胞壁进入细胞质(Klein et al，1987，Klein et al，1988，McCabe et al，1988)。这种金属微粒可穿透几层细胞，因此可用于转化组织外植体中的细胞。
4.5  产生抗昆虫转基因植物的方法
通过以含有重组cryET29基因的区段转化适当的宿主细胞如植物细胞，所编码的结晶蛋白(即具有抗鞘翅类昆虫杀虫活性的细菌结晶蛋白或多肽)的表达，可导致形成抗昆虫的植物。
作为范例，采用如微粒轰击，将包裹在微投射颗粒上的DNA投入接受细胞的方法(Maddock et al，1991，Vasil et al，1992)，可使用含有苏云金芽孢杆菌结晶蛋白编码区和适当的可选择性标记的表达载体，转化如小麦或玉米植物胚细胞悬液。然后从表达杀虫蛋白的转化胚胎愈伤组织，再生形成转基因植物。
应用本领域已知的其它细胞转化方法如土壤杆菌介导的DNA转移，也可以实现形成转基因植物(Fraley et al，1983)。另外，通过将DNA直接转移进入花粉(Zhou et al，1983，Hess，1987，Luo et al，1988)，通过将DNA注入植物生殖器官(Pena et al，1987)，或者通过将DNA直接注射进入未成熟的胚胎细胞，随之使干燥的胚胎再水合(Neuhaus et al，1987，Benbrook et al，1986)，都可以将DNA导入植物。
从单个植物原生质体转化体，或者从各种转化的外植株，再生，发育和栽培植物的方法是本领域熟知的(Weissbach和Weissbach，1988)。这种再生和生长过程通常包括如下步骤：选择转化的细胞，培养那些通过了通常胚胎发育阶段的个体化细胞，使之达到有根小植物的阶段。用类似的方法可使转基因胚胎和种子再生。然后，将形成的转基因有根小苗种植在适当的植物生长培养基如土壤中。
借助于本领域熟知的方法，可达到培育或再生含有外来的外源性基因的植物的目的，这种外源性基因是通过土壤杆菌从叶外植体导入的，编码所需多肽的基因(如Horsch et al，1985所述)。在此过程中，是将转化体在有选择性成分并能诱导小苗再生成被转化植株的培养基中培育(如Fraley et al，1983所述)。
此程序通常可在2-4个月内产生幼苗，然后将这些幼苗转移至适当的诱根培养基中，此培养基含有选择性成分和防止细菌生长的抗菌素。然后，将在有选择性成分下生根形成小植物的幼苗，移植到能使之生根的土壤或其它培养基中。这些程序随所用的特定植株而改变，这些改变是本领域熟知的。
如上面所述，再生的植物优选地是自花传粉，以便形成纯合性转基因植物。另外，可用从这些再生植物得到的花粉同种子生长的植物，优选的是农业重要性的自交系杂交。相反地，也可用来自这些重要品系植物的花粉对再生的植物授粉。用本领域技术人员熟知的方法，可栽培本发明含有所需多肽的转基因植物。
因此，本发明的转基因植物，具有增加数量的编码所需Cry多肽的编码区(例如cry基因)。优选的转基因植物是独立分离子，并能将基因及其活性传递给它的后代。更优选的转基因植物是对此基因纯合性的，并能通过有性接合将此基因传递给它所有的后代。可以农田或温室内培育来自转基因植物的种子，将形成的性成熟转基因植物自花授粉，产生真正的繁殖植物。来自这些植物的后代是真正的繁殖品系，它们通过以下方法评定，例如，此繁殖品系在野外各种环境条件下，对鞘翅类昆虫和猫蚤幼虫具有增强的杀虫活性。本发明者预期，将发现本发明对创造如下具有经济意义的转基因植物特别有用：包括各种草皮草、小麦、玉米、水稻、大麦、燕麦，各种观赏植物和蔬菜，以及多种坚果树和水果树等。
4.6  CryET29的命名
本发明者已武断地将本发明的新型蛋白命名为CryET29，同样编码此多肽的新型核酸序列定名为cryET29。将由苏云金芽孢杆菌命名委员会根据结晶蛋白内毒素的修正命名原则(表1)，确定对该基因和蛋白质的正式命名，形成对苏云金芽孢杆菌结晶蛋白的系统分类。本发明者预期，本发明武断给予的名称，将被给予这些序列的正式命名代替。
4.7  说明
下面的单词和词组具有如下列举的意义。
a，an：按照由来已久的专利法公约，冠词a和an用于包括权利要求在内的本申请时，表示一种或几种。
广谱：意指昆虫种类的广泛范围。
广谱杀虫活性：对广泛种类的昆虫具有毒性。
表达：细胞内过程的组合，包括为产生多肽，编码DNA分子如结构基因经历的转录和翻译过程。
杀虫活性：对昆虫的毒性。
杀虫特异性：结晶蛋白表现出的对多种昆虫的毒性。
目内特异性：特定结晶蛋白对昆虫目内(例如鳞翅目)昆虫种类的毒性。
目间特异性：特定结晶蛋白对不同目(例如鳞翅目和双翅目)昆虫种类的毒性。
LC50：引起受处理昆虫50％死亡率的结晶蛋白致死浓度。
LC95：引起受处理昆虫95％死亡率的结晶蛋白致死浓度。
启动子：是DNA序列或DNA序列组上的一种识别位点，它对结构基因提供表达控制成分，RNA聚合酶特异性地与它结合，启动地这种基因的RNA合成(转录)。
再生：从植物细胞(例如植物原生质体或外植体)生长成植物的过程。
结构基因：表达产生多肽的基因。
转化：将外源性DNA序列(例如载体，重组DNA分子)导入细胞或原生质体的过程，在此过程中，外源性DNA被掺入进染色体，或者它能够自主复制。
转化细胞：通过将外源性DNA分子导入细胞，其DNA已发生改变的细胞。
转基因：一种外源性基因，当通过如转化作用，电穿孔，微粒轰击等方法被导入宿主细胞的基因组时，能被宿主细胞表达，并被整合进入细胞的基因组，以致使由此转基因表达产生的一种或几种性状，可被转化细胞的后代遗传。
转基因细胞：由转化的细胞产生或再生的，或者是来源于转基因细胞的任何一种细胞。范例性转基因细胞包括来源于转化植物细胞的植物愈伤组织，以及从转基因植物获得的特定细胞，如叶、根、茎等体细胞，或生殖细胞等。
转基因植物：来源于转化的植物细胞或原生质体的植物或其后代，在该植物的DNA中，包含在天然的非转基因的相同植株中原来不存在的被导入的外源性DNA分子。名词“转基因植物”和“转化的植物”，在本领域有时被用作同义的名词，定义其DNA中含有外源性DNA分子的植物。但是，更科学地修正应将从转化的植物细胞或原生质体获得的再生植物或愈伤组织称为转基因植物，此后将照此使用。
载体：能够在宿主细胞中复制的DNA分子，以及/或者另一DNA区段可同它有效地连接，以致使被连接的区段能复制。质粒是一种范例性载体。
5.  实施例
引入如下实施例以便对本发明的优选实施方案进行说明。本领域的技术人员应意识到，在这些实施例中公开的技术，可被认为是促成其实施的优选模式，因为这些实施例是按照本发明者发现的，在实施中充分发挥作用的代表性技术进行。但是，根据本公开内容本领域的技术人员应该理解到，在不偏离本发明的精髓和内容的条件下，可以对所公开的特定实施方案进行多方面改变，并仍能得到相同或类似的结果。
5.1  实施例1-苏云金芽孢杆菌EG4096的分离
农作物花粉样品从全美和国外多种来源获得，主要是谷物贮存机构。农作物花粉样品经处理后，散布在琼脂板上，以便分离出单个的芽孢杆菌型菌落(如Donoven et al，1993所述)。EG4096是从来自泰国的农作物花粉样品分离出的野生型苏云金芽孢杆菌株。用相差显微镜国视检测来自这种农作物花粉菌落的结晶形态，被定名为EG4096的菌落含有内生孢子和似短针的独特形态的结晶包涵体。天然株EG4096的质粒的排布也是独特的。
对这种野生型苏云金芽孢杆菌株的昆虫生物测定确定，它对鞘翅目幼虫具有杀虫活性，包括南方玉米食根虫、西部玉米食根虫，Colorado马铃薯甲虫，红粉甲虫和日本甲虫。EG4096还显示对猫蚤幼虫的杀虫活性。
对EG4096的鉴定包括，分析此菌株在孢子形成过程中产生的结晶蛋白，以及克隆并表达编码这种结晶蛋白的基因，此基因已被定名为cryET29。对野生型菌株和表达克隆的cryET29毒素基因的重组苏云金芽孢杆菌株的杀虫活性进行了测定。
5.2  实施例2-苏云金芽孢杆菌EG4096菌株的天然质粒
借助于由Gonzelez et al(1982)所述的修改的Eckhardt琼脂糖凝胶电泳，对包含在分离的苏云金芽孢杆菌EG4096菌株中的天然质粒进行了测定。天然质粒的形式同已知的典型血清变型的形式不一致(Carlton and Gonzalez，1985)。质粒的大小是5.0、7.2、6.0(开环)，39、80和100MDa。
5.3  实施例3-苏云金芽孢杆菌EG4096的结晶蛋白
将EG4096在DSM+葡萄糖孢子形成培养基〔0.8％(w/v)Difco营养液体培养基，0.5％(w/v)葡萄糖，10mM K2HPO4，10mMKH2PO4，1mM Ca(NO3)2，0.5mM MgSO4，10μM MnCl2，10μM  FeSO4〕中30℃培养3天，在培养过程中，培养物生长至静止期，形成孢子并溶胞，因而释放蛋白质包涵体至培养基中。通过离心收集培养物，孢子和结晶物被沉淀。在0.005％ Triton X-100，2mMEDTA的溶液中洗此沉淀，并再离心。将洗过的沉淀再悬浮在1/10初始体积的0.005％ Triton X-100，2mM EDTA中。
通过在溶解缓冲液〔0.14M Tris-HCl pH 8.2，2％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，5％(v/v)2-巯基乙醇，10％(v/v)甘油和0.1％溴酚兰〕中，100℃培育5分钟，将结晶蛋白从孢子-结晶悬浮物中溶解出。通过SDS-PAGE将溶解的结晶蛋白按大小进行分级分离。按大小分级分离之后，借助于考马斯亮蓝R-250染色，对此蛋白质显色。这种分析显示，EG4096孢子形成培养物中存在的主要结晶蛋白的大小约为25-kDa。此新型蛋白质被定名为CryET29。
为了对CryET29作进一步特征鉴定，对此蛋白质的NH2-末端氨基酸序列进行了测定。洗涤EG4096的孢子形成培养物，并使之再悬浮。将悬浮物溶解，并按照SDS-PEGE分析程序在丙烯酰胺凝胶上展开。电泳之后，按照标准的蛋白质印迹程序，将此蛋白质转移至BioRadPVDF膜。转移之后，在蒸馏水中漂洗此膜3次，并在Amido Black 1013染液中染洗1分钟(Sigma Chemical Co.，St.Louis.Mo)。此滤膜在5％乙酸中脱色1分钟之后，用蒸馏水漂洗3次。用剃须刀片切取包含约25-kDa蛋白带的滤膜部分。此步骤导致获得作为在PVDF膜(Biorad，Hercules，CA)上蛋白质印迹的纯CryET29形式。
在MA.波士顿Tufts Medical School，应用标准的自动化Edman降解程序，对固定化在膜上的纯CryET29的NH2-末端氨基酸序列进行了测定。经测定此NH2-末端序列为：
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15
MetPhePheAsnArgValIleThrLeuThrValProSerSerAsp  (SEQ ID NO：3)
应用计算机算法系统(Korn and Queen，1984)，将此CryET29蛋白的N-端序列，同本发明者知道的所有苏云金芽孢杆菌结晶蛋白氨基酸序列进行了比较，这些已知的结晶蛋白包括在科学文献，国际专利申请，或已公布的专利中已发表的所有苏云金芽孢杆菌结晶蛋白。其序列已公布的结晶蛋白一览表，连同其出处显示于在表4中。
                                                             表4
                                          在文献中论述过的苏云金芽孢杆菌结晶蛋白
  结晶蛋白   来源或文献
  Cry1A(a)Cry1A(b)Cry1A(c)Cry1BCry1CCry1CbCry1C(b)Cry1DCry1ECry1FCry1GCryVCry2ACry2BCry2CCry3ACry3BCry3B2Cry3B3   J.Biol.Chem.，260：6264-6272DNA，5：305-314Gene，36：289-300Nucl.Acids Res.，16：4168-4169Nucl.Acids Res.，16：6240Appl.Environ.Mico.，59：1131-1137Nucl.Acids Res.，18：7443Nucl.Acids Res.，18：5545EPO 358 557 A2J.Bacteriol.，173：3966-3976FEBS，293：25-28WO 90/13651J.Biol.Chem.，263：561-567J Bacteriol.，171：965-974FEMS Microbiol.Lett.，81：31-36Proc.Natl.Acad.Sc USA.84：7036-7040Nucl.Acids Res.，18：1305Appl.Environ.Microbiol.，58：3921-3927U.S.5,378,625
  结晶蛋白   来源或文献
  Cry3CCry3DCry4ACry4BCry4CCry4DCry5Cry33AkDCry33BkDCry34kDCry40kDCry201T635Cry517Crya7A021CryAB78ORF1CryAB780RF2CryAB78100kDCrybtpgs1208Crybtpgs1245Crybts02618ACryBuibuiCryET4CryET5CryGei87CryHD511CryHD867CryIPLCryMITSCryPS17ACryPS17BCryP16   Appl.Environ.Microbiol.，58：2536-2542Gene，110：131-132Nucl.Acids Res.，15：7195EPO 308,199J.Bacteriol.，166：801-811J.Bacteriol.，170：4732，1988Molec.Micro.，6：1211-1217WO 94/13785WO 94/13785J.Bacteriol.，174：549-557J.Bacteriol.，174：549-557WO 95/02693J. Gen.Micro.，138：55-62EPO 256,553 B1WO 94/21795WO 94/21795WO 94/21795EPO 382 990EPO 382 990WO 94/05771WO 93/03154U.S.5,322,687U.S.5,322,687EPO 238,441U.S.5,286,486U.S.6,286,486U.S.5,231,008JP 6000084WO 92/19739U.S.5,350,576 and 5,424,410WO 95/00639
  结晶蛋白   来源或文献
  CryP18CryP66CryPS33F2CryPS40D1CryPS43FCryPS 50CaCryPS 50CbCryps52A1CryPS63BCryPS69D1Cryps71M3CryPS80JJ1CryPS81IACryPS81IA2Cryps81A2CryPS81IBCryPS81IB2Cryps81fCryps81ggCryps81rr1Cryps86A1CryXCryXenA24CrycytA   WO 95/00639WO 95/00639WO 92/19739 and U.S.5,424,410U.S.5,273,746WO 93/04587WO 93/04587 and EPO 498,537 A2WO 93/15206U.S.4,849,217WO 92/19739U.S.5,424,410WO 95/02694WO 94/16079U.S.5,273,746EPO 405 810EPO 401 979WO 93/14641U.S.5,273,746U.S.5,045,469U.S.5,273,746EPO 401 979U.S.5,468,636FEBS Lett，336：79-82WO 95/00647Nucl.Acids Res.，13：8207-8217
未发现此CryET29蛋白的N-端序列，同表4中已知的已鉴定的任何一种苏云金芽孢杆菌结晶蛋白有同源性。
5.4实施例4-分离含有苏云金芽孢杆菌EG4096 cryET29基因的
            DNA片段
为了鉴别编码CryET29蛋白的基因，设计了一个对此蛋白质NH2-末端氨基酸序列特异性的寡核苷酸探针。使用在苏云金芽孢杆菌毒素基因中通常发现的密码子，借助于Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)合成了一个35核苷酸的寡核苷酸，并定名为wd270。wd270的序列是：
5′-ATGTTTTTTAATAGAGTAATTACATTAACAGTACC-3′(SEQ ID NO：4)
如下面所述，在DNA印迹研究中，用放射标记的wd270作探针，以便鉴别包含cryET29基因的DNA限制性片段。通过如下的程序从EG4096中提取出全部DNA。将营养细胞再悬浮于含有50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA和4mg/ml溶菌酶的溶胞缓冲液中。此悬液在37℃下温育1小时。温育之后，用等体积苯酚提取悬液，随之用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(50∶48∶2)抽提1次，再用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。通过加入1/10体积的3M乙酸钠，然后再加入2倍体积的100％乙醇，使DNA从水相中沉淀出。离心收集沉淀的DNA，用70％乙醇洗，并再悬浮于蒸馏水中。
然后，在不同的反应物中，以包括EcoRI在内的各种限制性内切酶消化所提取的DNA。借助于电泳，通过在1X TBF中的0.8％琼脂糖凝胶在2V/cm下电泳过夜，将消化的DNA按大小进行分级分离。按照Southern(1975)的方法，将分级分离的DNA片段转移至Immobilon-NC硝酸纤维素滤纸(Millipore Corp.Bedford，MA)上。通过在真空烘箱内80℃烘烤，使DNA固定在滤纸上。
为了鉴别含有编码CryET29蛋白NH2-末端序列的DNA片段(见实施例3)，将寡核苷酸wd270在5′末端作放射性标记，用作杂交探针。为了对此探针作放射性标记，将1-5pmoles wd270加到含如下成分的反应物中：〔γ32-P〕ATP(3000Ci/mmol的3μl，在20μl反应物体积中为10mCi/ml)，10×反应缓冲液(700mM Tris-HCl，pH7.8，100mM MgCl2，50mM DTT)，和10单位T4多核苷酸激酶(Promega Corporation，Madison，WI)。将此反应物在37℃温育20分钟，使放射性磷酸能转移至此寡核苷酸的5′末端，这样使它可用作杂交探针。
然后在3×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt’试剂(0.2％BSA，0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％ficoll)，0.2mg/ml肝素中，使标记探针与此硝酸纤维素滤膜在45℃共同温育过夜。温育之后，将滤膜在3×SSC，0.1％SDS中，45℃漂洗，换液几次。将此滤膜吸干，然后用DuPont Cronex Lightning Plus屏，使之在-70℃对Kodak X-OMAT AR X-射线胶片(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)曝光过夜。
然后，将标记的探针对硝酸纤维素滤膜共同温育，随后漂洗并对X-射线胶片曝光，得到放射自显影相片。
对此放射自显影相片的检测，发现了二个不同的与标记的wd270探针特异性杂交的EcoRI限制性片段，约5.0kb和7.0kb。此结果表明，EG4096菌株包含二个密切相关的，或者是相同的cryET29基因拷贝，它们二者都能与wd270寡核苷酸杂交。
5.5  实施例5-克隆苏云金芽孢杆菌EG4096的cryET29基因
为了分离含有cryET29基因的5.0和7.0kb EcoRI限制性片段。如实施例4中所述，从EG4096菌株中分离出了全基因组DNA。先将此DNA用EcoRI消化，再通过0.8％琼脂糖，1×TBE凝胶，以2V/cm凝胶长度电泳过夜。用溴化乙锭对凝胶染色，这样，当暴露于长波长紫外光时，可目视观察此消化的DNA。用剃须刀片将包含约5.0和7.0kbDNA片段的凝胶片切下，分别置于含有少量(1ml)10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA(TE)的透析袋中，将透析袋放入充满1×TBE的水平电泳槽中，施加100V电泳2小时，使DNA片段从凝胶片被洗脱进入TE缓冲液。这导致DNA片段从凝胶片中迁移出，进入TE缓冲液中。然后用苯酚：氯仿抽提含有洗脱片段的TE缓冲液，并用乙醇沉淀。
为了在大肠杆菌中创建一个含二组按大小选择的EcoRI限制性片段(约5.0和7.0kb)的文库，将这些片段连接进克隆载体pUC18中(Yanisch-Perron et al，1985)。此质粒DNA载体pUC18可在大肠杆菌中以高拷贝数复制，并携带有可用作选择标记的对抗菌素氨苄青霉素抗性的基因。将这二组片段分别在反应物中与EcoRI消化的pUC18混合，此pUC18已用细菌碱性磷酸酶(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)处理，从消化的质粒中除去了5′磷酸，以防载体本身再连接。将T4连接酶和连接缓冲液(Promega Corporation，Madison，WI)加入到含有已消化的pUC18和按大小选择的EcoRI片段的反应物中。在室温下温育1小时，使之将EcoRI片段插入并连接到pUC18载体DNA中。
按照制造商所述的程序，分别将上述连接混合物导入转化感受细胞大肠杆菌DH5αTM(购自GibcoBRL，Gaithersburg，MD)。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上以转化的大肠杆菌细胞作平板接种，37℃培育过夜。二个转化都产生了大约300个指示每个菌落细胞中存在重组质粒的氨苄青霉素抗性菌落。
为了分离出包藏着含克隆化cryET29基因序列的5.0和7.0kbEcoRI片段的菌落，首先要将此转化的大肠杆菌菌落转移到硝酸纤维素滤膜上，只需通过将园形滤膜(Millipore HATF 085 25，MilliporeCorp.Bedford，MA)直接放在包含有转化菌落的LB-氨苄青霉素琼脂板的上面，就可实现此目的。当从琼脂板上缓慢地剥下此滤膜时，菌落粘着在滤膜上，形成来自原有琼脂板的精确的菌落复印模型。每个菌落有足够的细胞遗留在琼脂板上，在37℃经5-6小时培养将使菌落恢复。此板可在4℃贮存备用。然后将带有转移菌落的硝酸纤维素滤膜，菌落面朝上置于新制的LB-氨苄青霉素琼脂板上，使之在37℃培养，直至菌落大小达到直径约1mm。
为了使来自重组大肠杆菌细胞的DNA释放在硝酸纤维素滤膜上，将此滤膜菌落面朝上，置于二张以0.5N NaOH，1.5M NaCl浸泡的Whatman 3mM Chr滤纸(Whatman International LTD，Maidstone，England)上持续15分钟。这种处理可使细胞溶解，并使释放的DNA变性而能粘附于硝酸纤维素滤膜。然后通过将此滤膜菌落面朝上，置于2张以1M乙酸铵，0.02M NaOH浸泡的Whatman滤纸上10分钟而中和此滤膜。随后在3×SSC中漂洗滤膜，空气干燥，并在真空烘箱内80℃烘烤1小时，准备用于杂交。
如上面所述，将对cryET29基因特异性的NH2-末端寡核苷酸wd270，在其5′末端以γ32P和T4多核苷酸激酶标记。将此标记探针加到在3×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt’s试剂(0.2％BSA，0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％ficoll)，0.2mg/ml肝素中的滤膜上，并在45℃温育过夜。所选择的这些条件，使标记的寡核苷酸能与在转化的大肠杆菌菌落硝酸纤维素印迹上存在的相关序列杂交。温育之后，滤膜在45℃用3×SSC，0.1％SDS洗几次。将滤膜吸干，然后用DuPontCronex Lightning Plus屏，使之在-70℃对Kodak X-OMAT ARX-射线胶片(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)曝光过夜。
使来自每种转化物(上述5.0和7.0kb连接反应的混合物)与wd270杂交。通过排列比较带有初始转化琼脂板上菌落的放射自显影相片上的信号，对这些菌落进行了鉴定。然后将分离的菌落在LB-氨苄青霉素液体培养基中培养，从中可获得细胞，并可借助于标准的碱裂解小量制备程序制备重组质粒(Maniatis et al，1982中所述)。用限制性酶EcoRI消化分离出的质粒，确定是否EG4096 DNA的克隆化片段具有预期的大小。来自5.0kb和7.0kb构建物的所有杂交质粒都具有预期大小的插入片段。如上所述，将来自这些质粒酶切消化物的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素滤膜上。然后，用在5′末端以γ32P和T4多核苷酸激酶放射性标记的寡核苷酸wd270，对印迹进行杂交，来自含有5.0kb插入片段的5种质粒中二种的EcoRI片段，可与证实在那些片段上存在cryET29基因的探针杂交。已将一种带有含cryET29基因的5.0插入片段的质粒定名为pEG1298。来自含有7.0kb插入片段的6种质粒中5种的EcoRI片段，可与证实在那些片段上存在cryET29基因的探针杂交。已将一种带有含cryET29基因的7.0kb插入片段的质粒定名为pEG1299。
已将含有pEG1298的大肠杆菌菌株定名为EG11513。在1996年9月18日已将EG11513保存于农业研究机构保藏中心，保藏号为NRRLB-21624。含有pEG1299的大肠杆菌菌株被定名为EG11514。
5.6  实施例6-对cryET29基因DNA序列的测定
按照以前建立的双脱氧链-终止DNA测序程序(Senger etal，1977)，对克隆在pEG1298和pEG1299上的基因部分DNA序列进行了测定。应用Qiagen质粒试剂盒(Qiagen Plasmid Kit)(Qiagen Inc.Chatsworth，CA)，按照制造者提供的程序，制备了双链质粒模板DNA。应用测序酶TM Version 2.0 DNA测序试剂盒(美国Biochemical/Amersham Life Science Inc.Cleveland.OH)，按照厂商的程序，并用35S-dATP作标记同位素(从DuPont NENResearch Products，Boston，MA)，进行了测序反应。在6％(w/v)丙烯酰胺，42％(w/v)尿素测序凝胶上，对反应物进行变性凝胶电泳。使此干燥的凝胶在室温下对Kodak X-OMAT AR X-射线胶片(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)曝光过夜。
用NH2-末端特异性寡核苷酸wd270作起始测序引物。部分DNA序列表明，质粒pEG1298和pEG1299含有相同或几乎相同的，苏云金芽孢杆菌EG4096菌株cryET29基因拷贝。应用上述程序，还完成了对二个质粒上cryET29拷贝完整DNA序列的测序。根据以前的几种测序反应资料，设计了用于引发测序反应的连续寡核苷酸。用这种方法，DNA测序是沿着cryET29基因的链上部和底部逐步进行。
cryET29(SEQ ID NO：1)基因的二种拷贝的DNA序列是相同的，被显示在图1中。cryET29基因的蛋白质编码区域由696个核苷酸组成，包括一个终止密码子。CryET29蛋白(SEQ ID NO：2)，如根据此DNA序列所推导的，是由231个氨基酸组成，具有预期的分子量26194道尔顿。
然后进行了数据库检索，以便确定所推导的CryET29蛋白的氨基酸序列与其它已知特性的蛋白质，特别是其它的杀虫毒素蛋白相比较，是否具有同一性。借助于全国生物技术信息中心(Bethesde，MD)提供的BLASTP程序(Altschul et al，1990)，进行了应用联机服务器(on-line servers)的数据库检索。以BLOSUM 62阵矩进行BLASTP检索。所检索的数据库由非丰余的GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR组成，
在这些数据库中发现只有4个蛋白质同CryET29具有显著的同一性。这4个蛋白是双翅类昆虫毒素CytB(55％同一性，Kone andEllar，1993)，鞘翅类/双翅类昆虫毒素CytA(44.2％同一性Ward etal，1984)，双翅类昆虫毒素PS201T6(41.1％同一性，国际专利申请公开号WO 95/02693)，和27-kDa的莫氏苏云金芽孢杆菌菌株双翅类昆虫毒素(44.2％同一性，Earp and Ellar，1987)。
5.7  实施例7-克隆化cryET29基因的表达
为了鉴定CryET29蛋白的特性，必须在结晶蛋白阴性的苏云金芽孢杆菌细胞(Cry-)中表达克隆化cryET29基因。将pEG1298和pEG1299上的克隆化EcoRI片段插入能在苏云金芽孢杆菌中复制的质粒载体，这样就可以表达克隆化基因。
分别用EcoRI消化pEG1298和pEG1299，以便除去克隆化5kb和7kb片段。在琼脂糖凝胶上对此消化的质粒进行电泳分辨，应用Bio101.Inc的GeneClean技术(Vista，CA)，从凝胶片上纯化获得所需的片段。分别将这些片段连接进入已用EcoRI消化过的，并用细菌碱性磷酸酶处理过的苏云金芽孢杆菌/大肠杆菌穿梭载体。通过将芽孢杆菌pNN101的3.1kb EcoRI片段(Norton et al，1985)连接进入NdeI消化的pUC18，组建了穿梭载体pEG1297。pEG2197能在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌中复制，并使大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性(Ampl)，使苏云金芽孢杆菌具有四环素(Tet)抗性(TetR)，借助于厂商提供的转化程序将这二个连接混合体首先导入进大肠杆菌DH5αTM细胞(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)，从Amp转化体制备了质粒DNA，并对它进行了限制性酶切分析，以便证实构建是否合适。将被插入pEG1297的由p1298 5kb EcoRI片段组成的质粒定名为pEG1302。将被插入进pEG1297的，由pEG1299 7kb EcoRI片段组成的质粒定名为pEG1303。
应用电穿孔法(Macaluso and Mettus，1991)，分别将pEG1302和pEG1303导入Cry-苏云金芽孢杆菌EG10368菌株。通过在含有10μg/ml四环素(Tet)的LB琼脂板上培育过夜，选择出被转化成四环素抗性的细胞。从每次转化中选择一个TetR菌落作进一步分析。重组菌株EG11494包含有pEG1302(NRRL B-21583)，重组菌株EG11502包含有pEG1303。
将EG11494和EG11502在含有10μg/ml四环素的C2孢子形成培养基中30℃培养3天，直至出现孢子形成和细胞溶胞。用显微镜检查孢子形成培养物，证明重组菌株正在产生小的结晶包涵体。这些结晶类似于野生型株EG4096产生的结晶，表明每种重组体中的cryET29基因是能够指导CryET29蛋白表达的功能性基因。
通过离心收集EG11494和EG11502的孢子形成培养物，洗涤后在1/10初始体积的0.005％ Triton X-100R中再悬浮。通过SDS-PAGE分析对悬液中的结晶蛋白进行鉴定，揭示EG11494和EG11502都产生了大约25-kDa的蛋白质。如通过在SDS凝胶上的迁移检测表明，重组菌株产生的25-kDa蛋白质，大小与EG4096的结晶蛋白相同。
为了用于昆虫生物测定，借助于SDS-PAGE对包含在特定样品中的毒素蛋白的含量进行了定量分析。在密度计上对考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶进行扫描，并同由含有已知量蛋白质如牛血清白蛋白在相同凝胶上制作的标准曲线相比较。
5.8  实施例8-CryET29对南部玉米食根虫幼虫的毒性
用野生型苏云金芽孢杆菌EG4096株，以及二个表达CryET29蛋白的重组菌株EG11494和EG11502，测定了它们对南部玉米食根虫(SCRW)幼虫(Diabrotica undecimpnnctata howardi)的毒性。
将EG4096，EG11494和EG11502在C2培养基中30℃培养3天，直至出现孢子形成和细胞溶解。离心收获培养物，在1×初始体积的0.005％ Triton X-100中洗2次，再悬浮于1/10初始培养物体积的0.005％ Triton X-100中。为了比较，以相同方式培养和收获了表达鞘翅类昆虫毒性蛋白Cry3Bb(Donovan et al，1992)的重组苏云金芽孢杆菌EG11535株。
通过沾染人工配制的食物表面，对SCRW幼虫进行生物测定，类似于Marrone et al(1985)的方法，但是不用甲醛液。每次生物测定由8种系列稀释的水溶液组成，以等分量施用于食物的表面，在稀释剂(0.005％ Triton X-100水溶液)干燥之后，将初龄幼虫放置在此食物上，并在28℃孵育。每个剂量测定了32只幼虫。7天后记录死亡率。汇集重复生物测定的数据进行概率分析(Daum，1970)，死亡率以只施用了稀释剂的对照组的死亡作校正(Abbot，1925)。结果以导致杀死50％测试昆虫的浓度，LC50的每孔中(175mm2食物表面积)CryET29结晶蛋白的含量表示，还报告了95％置信限(表5)
                                                                表5
                                                 CryET29蛋白对SCRW幼虫的杀虫活性
  样品   LC50(μg蛋白/孔)   95％置信限
  EG4096EG11494EG11502EG11535(Cry3Bb)   35.324.326.717.8   29-4320-3022-3214-23
表5中显示的结果证明，CryET29蛋白对南部玉米食根虫幼虫具有显著的杀虫活性。由二个重组菌株EG11494和EG11502产生的CryET29，也表现有显著的毒性、EG11494和EG11502产生的CryET29蛋白对SCRW的杀虫活性，与用Cry3Bb蛋白所见到杀虫活性相比较，前者稍低些，虽然95％置信限稍有重叠，表明这种差异可能没有显著性。
5.9  实施例9-CryET29对西部玉米食根虫幼虫的毒性
用野生型苏云金芽孢杆菌EG4096株，以及二个表达CryET29蛋白的重组菌株EG11494和EG11502，测定了它们对西部玉米食根虫(WCRW)幼虫(Diabortica virgifera virgifera)的毒性。
样品制备和生物测定方法基本上同实施例8中所述的对SCRW的测定。产生杀鞘翅类昆虫活性Cry3Bb蛋白的野生型苏云金芽孢杆菌EG4961株，也包括在此测定中作为阳性对照(表6)。
                                                                表6
                                               CryET29蛋白对SCRW幼虫的杀虫活性
  样品   LC50(μg蛋白/孔)   95％置信限
  EG4961(Cry3Bb)EG4096EG11494EG11502   73.812.98.713.9   44-2117-1104-199-29
表6中的结果证明，CryET29蛋白对WCRW幼虫具有显著的杀虫活性。而且，与鞘翅类昆虫活性苏云金芽孢杆菌EG4096961产生蛋白相比较，由重组菌株EG11494和EG11502产生的CryET29具有显著较高的杀虫活性(即LC50较低)。
5.10  实施例10-CryET29对Colorado马铃薯甲虫幼虫的毒性
用野生型苏云金芽孢杆菌EG4096株，以及表达CryET29蛋白的重组菌株EG11494，测定了它们对Colorado马铃薯甲虫(CPB)(Leptinotarsa decemlineata)幼虫的毒性。为了比较的目的，还培养了表达Cry3Bb蛋白的重组菌株EG7231。
应用类似于SCRW测定的技术对CPB幼虫进行了测定，不同的是用BioServe’s #9380昆虫食物(增加了马铃薯片)代替其人工配制的食物。在3天后记录死亡率而不是7天后，每个剂量用16个昆虫作此测定(表7)
                                                             表7
                                     以产生CryET29的菌株处理CPB幼虫引起的死亡百分率
  剂量(μg/孔)   EG4096   EG11494   EG7231(Cry3Bb)
  4.3758.759.37517.535   100100100100   68.75757593 100
表7中显示的结果表明，CryET29蛋白对CPB幼虫具有杀虫活性。
5.11  实施例11-苏云金芽孢杆菌EG4096对红粉甲虫幼虫的毒性
通过将EG4096菌株洗过的浓缩孢子形成培养物施用于人工配制的食物，并以此食物喂养幼虫，测定了EG4096对红粉甲虫幼虫(Tribolium casteneum)的毒性。在此试验中对16个幼虫作此处理，2周后记录死亡百分率。以EG4096悬浮物处理的幼虫显示出44％的死亡率，相比之下未处理的对照是13％。此外，以指示活性毒素亚致死剂量的EG4096处理幼虫，还表现出显著的生长发育障碍。未处理的对照组幼虫未表现出这种发育障碍。这些结果证明，产生CryET29蛋白的EG4096菌株对红粉甲虫有毒性。
5.12  实施例12-苏云金芽孢杆菌EG4096对日本甲虫幼虫的毒性
用产生CryET29蛋白的苏云金芽孢杆菌EG4096菌株测定了它对日本甲虫(JB)幼虫(Popillia japonica)的毒性。由洗过的EG4096浓缩孢子形成培养物制备成冷冻干燥的粉剂。借助SDS-PAGE和对考马斯蓝染色凝胶的定量密度分析，测定了样品中存在的CryET29蛋白含量。
将此冷冻干燥的粉剂再悬浮于含有0.005％ Triton X-100的稀释剂中，并掺入100ml热(50-60℃)液体人工配制食物(根据Ladd(1986)所述的昆虫食物)。使此混合物在培养皿中凝固，然后将直径19mm的凝固食物块放入5/8盎司的塑料杯中。每个小杯中放入1个JB幼虫，并加盖，维持25℃持续14天后记录幼虫的死亡率。
表8显示二次重复生物测定结果的平均值，每次试验用20只幼虫。剂量是基于样品中CryET29蛋白的含量。按照Abbott(1925)的方法对死亡百分率进行校正。
                                                        表8
                                           EG4096对日本甲虫幼虫的毒性
  CryET29含量(ppm)   ％死亡率
  250ppm500ppm1000ppm2000ppm   9699296
表8中显示的结果证明，EG4096菌株产生的CryET29蛋白对JB幼虫具有显著的杀虫活性。
5.13  实施例13-苏云金芽孢杆菌EG4096对猫蚤幼虫的毒性
用产生CryET29蛋白的苏云金芽孢杆菌EG4096菌株，测定了它对猫蚤(Ctenocephelides felis)幼虫的毒性。由洗过的EG4096浓缩孢子形成培养物制备成冷冻干燥的粉剂。借助于SDS-PAGE测定了存在于此样品中的CryET29蛋白含量。
为了进行生物测定，将含有1mg CryET29蛋白的一定量冷冻干燥的粉剂，与最后成1000ppm浓度的1克干牛血混合。将此混合物悬浮于0.1％ Triton X-100中，并注入培养皿中干燥。然后将干燥的样品研磨成细粉，均等地分配于32个生物测定小池中。每个小池放入1只猫蚤幼虫，并加盖和保持高湿度。7天后记录试验结果。
用EG4096粉剂作样品，按此方法进行了测定，结果显示在表9中。每个剂量用32个幼虫测定。在1天、4天和7天后记录死亡百分率。以不产生毒素蛋白的苏云金芽孢杆菌EG2205菌株用于测定对照死亡率。
                                                      表1
                                           EG4096对头龄猫蚤幼虫的毒性
                                            ％死亡率
  菌株   CryET29(ppm)   1天   4天   7天
  EG4096EG4096EG4096EG4096EG2205   5001000500010000无毒素   6.259.4046.9084.403.10   15.6034.4078.1093.7515.60   15.6043.7587.50100.0015.60
表9中显示的结果证明，苏云金芽孢杆菌EG4096菌株产生的CryET29蛋白，对猫蚤Ctenocephalides felis幼虫具有显著的杀虫活性。
通过以上述的方法测定其它一些苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白，证明CryET29毒素对猫蚤幼虫的活性具有独特性。对含有来自表达如下毒素蛋白的重组苏云金芽孢杆菌株的孢子和结晶样品进行了试验：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2S、Cry3A、Cry3B、Cry3B2和Cry3B3。Hofte et al(1989)对其它这些类型杀虫结晶蛋白的基因特征进行了描述。对Cry3毒素的详细论述参见美国专利5,187,091和5,264,364，特此引入作为参考。这些毒素中的任何一个都不显示对猫蚤幼虫有毒性，表明就其对猫蚤幼虫的毒性而言，在迄今已分离出的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白中CryET29毒素蛋白是独特的。
6.参考文献
下列参考文献鉴于它们对本说明书提供范例性技术或其它详细补充，特此引入作为参考。
美国专利4,008,688，授权日1977.2.22
美国专利4,196,265，授权日1980.4.1
美国专利4,237,224，
美国专利4,547,360，授权日1985.10.15
美国专利4,554,101，授权日1985.11.19
美国专利4,683,195，授权日1987.7.28
美国专利4,683,202，授权日1987.7.28
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美国专利5,176,995，授权日1991.10.15
美国专利5,187,091，授权日1993.2.16
美国专利5,225,341，授权日1993.7.6
美国专利5,264,364，授权日1993.11.4
美国专利5,276,269，授权日1994.1.4
美国专利5,349,126，
美国专利5,376,543，
美国专利5,384,253，授权日1995.1.24
美国专利5,416,102，授权日1995.5.16
美国专利5,422,108，
美国专利5,449,681，授权日1995.9.12
美国专利5,474,925，
美国专利5,482,852，授权日1996.1.9
美国专利5,508,468，授权日1996.4.16
美国专利5,521,078，
美国专利5,530,193，
美国专利5,538,877，
美国专利5,538,880，
美国专利5,550,318，授权日1996.8.27
美国专利5,563,055，
美国专利5,589,625，
美国专利5,597,718，
美国专利5,612,487，
美国专利5,631,152，
美国专利5,633,435，
欧洲专利申请公开号320,308，
欧洲专利申请公开号329,822，
欧洲专利申请公开号709,462，
英国专利申请号2,202,328，
国际专利申请公开号WO 88/10315
国际专利申请公开号WO 89/05859
国际专利申请公开号WO 89/06700
国际专利申请公开号WO 92/17598
国际专利申请公开号WO 94/13822
国际专利申请公开号WO 95/02693，1995.1.26公布
国际专利申请公开号WO 95/26628
国际专利申请公开号WO 95/27068
国际专利申请公开号WO 96/26639
国际专利申请公开号WO 96/40924
国际专利申请公开号PCT/US 89/01025
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Walker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1)：392-396，1992.
Ward.et al.，FEBS Lett.，175：377-382，1984.
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Yamada et al.，Plant Cell Rep.，4：85，1986.
Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4144-48，1990.
Yanisch-Perron et al.，Gene，33：103，1985.
Zatloukal，L.，Wagner，E.，Cotten，M.，Phillips，S.，Plank，C.，Steinlein，P.，Curiel，D.T.，and Birnstiel，M.L.，“转铁蛋白转染作用：一种在真核细胞中高效表达基因结构的方法”，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：136-153，1992.
Zhou et al.，酶学方法，101：433，1983.
7.序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：
  (A)名称：ECOGEN，INC.
  (B)街道：2005 Cabot Boulevard West.
  (C)城市：Langhorne
  (D)州：Pennsylvania
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：19047-3023
  (A)姓名：Mark J.Rupar
  (B)街道：42 Sturbridge Drive
  (C)城市：Wilmington
  (D)州：DE
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：19810
  (A)姓名：William P.Donovan
  (B)街道：36 Calicobush Rd.
  (C)城市：Levittown
  (D)州：PA
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：19057
  (A)姓名：Tan Yuping
  (B)街道：34188 O’Neil Terrace
  (C)城市：Fremont
  (D)州：CA
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：94555
  (A)姓名：Annette C.Slaney
  (B)街道：4 Donmoore Court South
  (C)城市：Hamilton Square
  (D)州：NJ
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：08690
  (ii)发明名称：对鞘翅类昆虫和栉头蚤属种昆虫有毒的苏云金芽孢杆菌CryET29组合物
  (iii)序列数：4
  (iv)计算机可读形式：
  (A)媒体类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本 #1.30(EPO)
  (vi)在先申请数据：
  (A)申请号：US08/721,259
  (B)申请日：1996年9月9日
(2)SEQ ID NO：1信息：
  (i)序列特征：
  (A)长度：693个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ix)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：1..693
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
ATG TTC TTT AAT CGC GTT ATT ACA TTA ACA GTA CCA TCT TCA GAT GTG      48
Met Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp Val
  1               5                  10                  15
GTT AAT TAT AGT GAA ATT TAT CAG GTA GCT CCA CAA TAT GTG AAT CAA      96
Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn Gln
             20                  25                  30
GCT CTT ACG CTA GCT AAA TAT TTC CAA GGA GCA ATT GAT GGT TCA ACA      144
Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser Thr
         35                  40                  45
TTA CGT TTT GAT TTT GAA AAA GCC TTA CAA ATT GCA AAT GAT ATT CCA      192
Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile Pro
     50                  55                  60
CAG GCA GCA GTG GTA AAC ACT TTA AAT CAA ACT GTG CAG CAA GGT ACA      240
Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly Thr
 65                  70                  75                  80
GTC CAA GTA TCA GTG ATG ATA GAC AAG ATT GTA GAC ATT ATG AAG AAT      288
Val Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys Asn
                 85                  90                  95
GTA TTA TCT ATT GTA ATT GAT AAC AAA AAG TTT TGG GAT CAG GTA ACA      336
Val Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val Thr
            100                 105                 110
GCT GCT ATT ACA AAT ACA TTC ACA AAT CTA AAT TCG CAA GAA AGC GAA      384
Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser Glu
        115                 120                 125
CGA TGG ATT TTT TAT TAC AAA GAA GAT GCA CAT AAA ACT AGT TAC TAT      432
Arg Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr Tyr
    130                 135                 140
TAT AAT ATC TTA TTT GCT ATA CAG GAT GAG GAA ACA GGT GGA GTA ATG      480
Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val Met
145                 150                 155                 160
GCG ACA TTA CCG ATT GCA TTT GAT ATT AGT GTA GAT ATT GAA AAA GAA      528
Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys Glu
                165                 170                 175
AAG GTT CTA TTT GTT ACT ATC AAG GAT ACT GAA AAT TAT GCG GTT ACA      576
Lys Val Lau Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val Thr
            180                 185                 190
GTA AAA GCT ATT AAT GTA GTA CAA GCA CTT CAA TCT TCC CGA TAT TCA      624
Val Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Tyr Ser
        195                 200                 205
AAA GTT GTA GAT GCT TTT AAA TCG CCA CGT CAC TTA CCT AGA AAA AGA      672
Lys Val Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys Arg
    210                 215                 220
CAT AAA ATT TGT AGT AAC TCT                                          693
His Lys Ile Cys Ser Asn Ser
225                 230
(2)SEQ ID NO：2信息：
  (i)序列特征：
  (A)长度：231个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Met Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp Val
  1               5                  10                  15
Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn Gln
             20                  25                  30
Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser Thr
         35                  40                  45
Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile Pro
     50                  55                  60
Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly Thr
 65                  70                  75                  80
Val Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys Asn
                 85                  90                  95
Val Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val Thr
            100                 105                 110
Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser Glu
        115                 120                 125
Arg Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr Tyr
    130                 135                 140
Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val Met
145                 150                 155                 160
Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys Glu
                165                 170                 175
Lys Val Leu Pne Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ale Val Thr
            180                 185                 190
Val Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Tyr Ser
        195                 200                 205
Lys Val Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys Arg
    210                 215                 220
His Lys Ile Cys Ser Asn Ser
225                 230
(2)SEQ ID NO：3信息：
  (i)序列特征：
  (A)长度：15个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：
  (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Met Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp
1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：4信息：
  (i)序列特征：
  (A)长度：34个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
ATGTTTTTTA ATAGAGTAAT TACATTAACA GTAC                                34

Claims (61)

1.一种分离的多肽，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽，它是由包含SEQ ID NO：1的多核苷酸编码的。
3.权利要求1或2的多肽，它显示对选自鞘翅目和蚤目的昆虫的杀虫活性。
4.权利要求3的多肽，其中鞘翅目昆虫选自南方玉米食根虫、西部玉米食根虫、Colorado马铃薯甲虫、日本甲虫和红粉甲虫，所述蚤目昆虫选自猫蚤和狗蚤。
5.一种组合物，其包含上述权利要求任何之一的多肽，并显示对选自鞘翅目和蚤目的昆虫的杀虫活性。
6.权利要求5的组合物，包含苏云金芽孢杆菌细胞的细胞提取物，细胞悬液，细胞匀浆，细胞裂解物，细胞上清液，细胞滤液或细胞沉淀。
7.权利要求5或6的组合物，其中该组合物是粉剂、粉末、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体、或溶液。
8.权利要求5或6的组合物，其中组合物是通过将苏云金芽孢杆菌细胞培养物干燥、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备。
9.权利要求8的组合物，其中所述干燥为冷冻干燥。
10.权利要求5或6的组合物，包含按重量计1％-50％的所述多肽。
11.权利要求10的组合物，包含按重量计5％-50％的所述多肽。
12.权利要求5或6的组合物，另外还包含药剂学允许的赋形剂。
13.权利要求5或6组合物，其被配制成喷雾剂、气雾剂、洗发剂或浸洗剂。
14.一种防蚤颈圈装置，包含权利要求1-4中任何之一的多肽，或者是权利要求5-13中任何之一的组合物。
15.一种治疗试剂盒，包括权利要求1-4中任何之一的多肽，或者是权利要求5-13中任何之一的组合物，以及药剂学允许的赋形剂。
16.一种纯化的抗体，它是用含有SEQ ID NO：2的多肽作为免疫原产生的。
17.权利要求16的抗体，它有效地附着在可检测性标记物上。
18.一种免疫检测试剂盒，包括权利要求16或17的抗体，以及免疫检测试剂。
19.一段分离的核酸区段，包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的序列区。
20.一段分离的核酸区段，包含SEQ ID NO：4。
21.权利要求19的核酸区段，其包含SEQ ID NO：1的序列，或其互补序列。
22.权利要求19或21的核酸区段，其中所述序列区有效地连接于一个能在转化的宿主细胞中表达该序列的启动子。
23.权利要求19-21中任何之一的核酸区段，其特征为是DNA区段。
24.权利要求1-4中任何之一的多肽，或权利要求5-13中任何之一的组合物在制备杀虫药剂中的应用。
25.权利要求1-4中任何之一的多肽，或权利要求5-13中任何之一的组合物在制备用于杀猫蚤的药剂中的应用。
26.权利要求19或21-22中任何之一的核酸区段在制备转基因植物中的应用。
27.一种载体，包含权利要求19或21-22中任何之一的核酸区段。
28.权利要求27的载体，其特征为是一种质粒、粘粒、酵母人工染色体或病毒载体。
29.权利要求27或28的载体，其中所述的序列区被有效地连接于一个启动子，该启动子能启动表达此序列区，产生所述SEQ ID NO：2的多肽。
30.一种转化的宿主细胞，包含权利要求29的载体的核酸区段。
31.一种转化的宿主细胞，包含权利要求19或21-22中任何之一的核酸区段，或者权利要求27-29中任何之一的载体。
32.权利要求31的宿主细胞，其特征为是一种原核细胞。
33.权利要求31或32的宿主细胞，其特征为是一种细菌细胞。
34.权利要求31或32的宿主细胞，其特征为是一种土壤杆菌属种细胞，埃希氏菌属种细胞，芽孢杆菌属种细胞或假单胞菌属种细胞。
35权利要求31或32的宿主细胞，其特征为是根瘤土壤杆菌细胞，大肠杆菌细胞，枯草芽孢杆菌细胞，巨大芽孢杆菌细胞，或苏云金芽孢杆菌细胞。
36.权利要求31的宿主细胞，其特征为是一种真核细胞。
37权利要求36的宿主细胞，其特征为是一种植物细胞。
38.权利要求36或37的宿主细胞，其特征为是下列植物的细胞：玉米、大麦、苜蓿、燕麦、黑麦、大豆、小麦、油菜、棉花、烟草、蕃茄、马铃薯、牧草、草皮草、蔬菜、观赏植物、坚果、浆果、柑桔或水果树。
39.权利要求36或37的宿主细胞，其特征为是下列植物的细胞：玉米，棉花，大豆，小麦，牧草或草皮草。
40.权利要求31或32的宿主细胞，其中所述的核酸区段是借助于载体被导入该细胞。
41.权利要求31或32的宿主细胞，其中所述的核酸区段是借助于质粒载体被导入该细胞。
42.权利要求31或32的宿主细胞，其中该宿主细胞表达所述核酸区段而产生一种杀虫多肽。
43.权利要求30-32中任何之一的宿主细胞，其中所述细胞被包含在一种转基因植物中。
44.一种制备多肽的方法，包括如下步骤：
(a)将包含编码一种多肽并有效地连接于启动子的核酸区段的载体导入宿主细胞，此多肽包含SEQ ID NO：2，
(b)在能有效地表达所编码多肽的条件下，培养该宿主细胞，
(c)从该细胞中收集被表达的多肽。
45.权利要求44的方法，其中多肽由SEQ ID NO：1编码。
46.一种用于检测样品中编码与SEQ ID NO：2有至少91％氨基酸序列一致性的杀虫多肽的核酸序列的方法，包括如下步骤：
(a)在能有效地使互补的核酸杂交的条件下，使该核酸样品与权利要求19或21-22中任何之一的核酸区段接触；
(b)检测由此形成的杂交的互补核酸；
(c)由杀虫活性筛选被编码的多肽。
47.权利要求46的方法，其中所述的核酸区段包含一个可检测性标记，通过检测此标记，可对杂交的互补核酸进行检测。
48.一种核酸检测试剂盒，包括权利要求19-21或23中任何之一的核酸区段，以及检测试剂。
49.一种用于检测生物样品中与SEQ ID NO：2有至少91％氨基酸序列一致性的杀虫多肽的方法，包括如下步骤：
(a)在能有效地形成免疫复合物的条件下，使所述生物样品与权利要求16或17中的抗体相接触；
(b)检测由此形成的复合物；
(c)由杀虫活性筛选被检测的多肽。
50.治疗有效剂量的权利要求1-4中任何之一的多肽，或权利要求5-13中任何之一的组合物，在制备用于治疗动物跳蚤侵袭的药物中的应用，所述多肽或组合物存在于药剂学允许的赋形剂中。
51.权利要求50的应用，其中的动物是猫或犬。
52.权利要求50或51的应用，其中所述的多肽或组合物是对动物局部给药或全身给药的。
53.一种可育性转基因植物的细胞，通过加入一个基因而改变了它的遗传组成，此基因编码包含SEQ ID NO：2的多肽，其中该基因赋子该植物细胞对鞘翅目昆虫侵袭的抗性。
54.一种杀虫多肽，是通过包括如下步骤的方法制备的：
(a)在能有效地产生杀虫多肽的条件下培养权利要求35中的苏云金芽孢杆菌，此杀虫多肽包含SEQ ID NO：2；
(b)从该细胞获得此杀虫多肽。
55.一种制备权利要求1-4中任何之一的多肽的方法，包括在能有效地产生该多肽的条件下，在适当的宿主细胞中表达权利要求19或21-23中任何之一的核酸区段，然后收集由该宿主细胞产生的多肽。
56.提高单子叶植物对鞘翅目昆虫的杀虫抗性的方法，包括向所述植物稳定地掺入编码SEQ ID NO：2的多肽的DNA区段。
57.权利要求56的方法，其中所述昆虫是玉米食根虫。
58.权利要求56或57的方法，其中单子叶植物是玉米。
59.提高双子叶植物对鞘翅目昆虫的杀虫抗性的方法，包括向所述植物掺入编码SEQ ID NO：2的多肽的转基因重组DNA区段。
60.一段分离的多肽，它与SEQ ID NO：2有至少99％的一致性。
61.一段分离的核酸区段，其由SEQ ID NO：1的核酸互补序列或编码杀虫活性蛋白的序列组成，所述编码杀虫活性蛋白的序列在包括从0.02M至0.15M NaCl和50℃至70℃的严格杂交条件下与SEQ ID NO：1的序列杂交。
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