JP2977903B2 - 鱗翅目および鞘翅目害虫に対し活性な新規バシラスチューリンゲンシス - Google Patents

鱗翅目および鞘翅目害虫に対し活性な新規バシラスチューリンゲンシス

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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明は、鱗翅目および鞘翅目害虫に対して活性な新
規な生物学的に純粋なバラシス・チューリンゲンシス
（Bacillus thuringiensis）（B.t.）菌株に関し、この
菌株は分子量約130,000ダルトンを有するデルタ−エン
ドトキシンから本質的に成る双ピラミッド（biopyramid
al）結晶および２個のデルタ−エンドトキシン（各々、
分子量約33,000ダルトンを有する）から本質的に成るひ
し形結晶を生成する。更に本発明は該菌株の胞子、結
晶、デルタ−エンドトキシンおよび／又は変異体に関す
る。本発明は又、それから得ることのできる殺虫剤組成
物に関する。本発明は更に鱗翅目および／又は鞘翅目か
らの昆虫害虫を駆除するための殺虫剤組成物の使用に関
する。本発明は又、デルタ−エンドトキシンをエンコー
ドする単離されたDNA配列にも関する。
2.発明の背景 食物、繊維および種々の家庭用植物を含めた世界の商
業的に重要な農業作物の重要部分は、毎年害虫のまん延
に至るまで失なわれ、数百万ドルの損失をもたらしてい
る。このような害虫を駆除するための種々の戦略が用い
られてきた。
一つの戦略は広域スペクトル殺虫剤、すなわち広範囲
の活性を有する化学的殺虫剤の使用である。しかし、そ
のような化学的殺虫剤を用いることには多数の欠点があ
る。特に、それらの広域スペクトル活性のため、これら
の殺虫剤は非目標生物、例えば有益な昆虫および有害な
害虫の寄生動物を駆除するかもしれない。加えて、これ
らの化学的殺虫剤はしばしば動物およびヒトに対し毒性
であり、そして目標にされた害虫は、そのような物質に
くり返し暴露されるとしばしば耐性が増大する。
別の戦略は、作物への昆虫、菌類および雑草のまん延
を駆除するための自然発生病原菌を利用する生物殺虫剤
の使用を含んでいる。生物殺虫剤は、毒素を生成する天
然に発生する生物であり、その毒素は化学的殺虫剤より
も全体として非目標生物および環境に対し一般により害
が少ない感染剤に対し毒性の物質である。
最も広く用いられている生物殺虫剤は、バラシス チ
ューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.）
である。B.t.は広く分布した、棒形状、好気性で胞子形
成微生物である。その胞子形成サイクル中に、B.t.は細
胞内に結晶状含有体を形成するデルタ−エンドトキシン
として知られているタンパク質を生産する。デルタ−エ
ンドトキシンは分子量27−140kDを有しそして摂取によ
り昆虫の幼虫を殺す。
デルタ−エンドトキシンは組換えDNA法により生産さ
れてきた（例えば、テラー等、1992,Molecular Microbi
ology6:1211−1217;毒素は鱗翅目および鞘翅目害虫に対
し活性である；ペイニ等、米国特許第5,045,469;毒素は
鱗翅目に対し活性である）。組換えDNA法によって生産
されたデルタ−エンドトキシンは結晶形であるかもしれ
ず、又はそうでないかもしれない。
多くのB.t.菌株は単離され、鱗翅目の昆虫害虫に対し
活性であることが見出された。B.t.subsp.クルスタキ
（kurstaki）HD−１は胞子形成中各細胞内に双ピラミッ
ドおよびひし形結晶を生産する（ルーシ等、in Microbi
al and Viral pesticides,E.クルスターク，マーセル
デッカー編、ニューヨーク、1982、35−74頁；双ピラミ
ッド結晶は３個のcry I A遺伝子によりエンコードされ
ることが見出された（アロンソン等、1986,Microbiol.R
ev.50:1−50）。B.t.subsp.クルスタキ（kurstaki）HD7
3は、Cry I A（ｃ）タンパク質を含む（アダンク等、19
85,Gene 36:289−300）。B.t.subsp.デンドロリムス（d
endrolimus）HD−７およびHD37は、cry I Aおよびcry I
Iタンパク質を含む;B.t.subsp.ソトー（sotto）は、正
基準標本Cry I A（ａ）とは24個のアミノ酸だけ異なる
アルカリ可溶性タンパク質である;B.t.サブトキカス（s
ubtoxicus）HD−10は、Cry I AおよびCry I Bタンパク
質を含有する;B.t.subsp.トルウォルチー（tolworthi）
HD−121は、Cry I AおよびCry II タンパク質を含有す
る；そしてB.t.subsp.アイザワ（aizawai）HD−68はCry
I Aタンパク質を含む（ホフテおよびワイテレー、198
9,Microbiol.Reviews53:242−255）。レニー（米国特許
第4,990,332号、1993年２月５日発行）はB.t.PS85AIの
単離物および単離物PS85AIの変異体を開示し、これらは
双方ともプルテラ キシロステラ（Pulutela xylostell
a）、鱗翅目に対して活性でありそして分子量130,000お
よび60,000ダルトンを有するアルカリ可溶性タンパク質
を生産する。レニー（米国特許第5,045,469号、1991年
９月３日発行）は、PS81Fと命名されたB.t.単離物を開
示し、これはまた分子量130,000および60,000ダルトン
を有するアルカリ可溶性タンパク質でありそしてスポド
プテラ エキグア（Spodoptera exigua）およびT.ニー
（ni）に対し活性を有する;PS81Fからの毒素遺伝子はB.
t.subsp.カルスタキ（kurstaki）HD−１からの毒素遺伝
子との相同性は少ないと思われる。ペニー（米国特許第
5,206,166号、1992年６月25日発行）は、B.t.単離物PS8
1A2およびPS81RR1を開示しており、これらは133,601お
よび133,367ダルトンのアルカリ可溶性タンパク質であ
り；双方ともトリコプルシア ニー（Trichoplusia n
i）、スポドプテラ エキグア（Spodoptera exigua）お
よびプルテラ キシロステラ（Plutella xylostella）
に対し活性でありそしてB.t.subsp.カルスタキ（kursta
ki）HD−１および他のB.t.単離物とは異なる。バーニー
ル等（米国特許第5,061,489号およびWO90/03434）は少
なくとも３個の遺伝子:6.6−,5.3−、および4.5−タイ
プ遺伝子（cry I A（ａ）,cry I b（ｂ）およびcry I A
（ｃ）によりエンコードされたデルタ−エンドトキシン
を生産する菌株A20を開示する。チェスチュキナ等（198
8,FEBS Lett.232:249−51）はB.t.subsp.ガレリエ（gal
leriae）が２個のデルタ−エンドトキシン（双方とも鱗
翅目に対し活性である）を生産することを開示する。他
の菌株、例えばバシラス チューリンゲンシス（Bacill
us thuringiensis）subsp.テネブリオニス（tenebrioni
s）（クリーク等、1988、米国特許第4,766,203号）は、
鞘翅目に対して特異的であることを見出した。他の鞘翅
目毒性バシラス チューリンゲンシスが1986年に報告さ
れた（ハーンスタット等、Bio/Technology vol.4,305−
308,1986、米国特許第4,764,372号、1988年）。「バシ
ラス チューリンゲンシスsubsp.サン ジエゴ（san di
ego）」、Ｍ−７と命名されたこの菌株は、寄託番号NRR
L B−15939のもとでノーザン レジオナル リサーチ
ラボラトリー（米国）に寄託された。しかし'372特許の
譲受人であるマイコーゲン社は、バシラス チューリン
ゲンシスsubsp.サン ジエゴは、バシラス チューリン
ゲンシスsubsp.テネブリオニス（tenebrionis）である
と公に認めた。他の単離された菌株は２種類の害虫に対
して活性であることが見出された。パジュラ（1990,Mic
robiol.Lett.66:257−262）は、２種のデルタ−エンド
トキシン、すなわち鱗翅目害虫に対して活性を有する14
4kDタンパク質および蚊に対して活性を有する66kDタン
パク質を含有する２種の変異体の単離を開示する。
ブラッドフッシュ等（米国特許第5,208,017号）は、
B.t.単離物PS86A1およびPS86Q3を開示しており、それら
はそれぞれ分子量58,000および45,000ダルトン並びに15
5,000,135,000,98,000,62,000および58,000ダルトンを
それぞれ有するアルカリ可溶性タンパク質を生産しそし
てそれらは鱗翅目および鞘翅目害虫に対して活性を有し
ている。PCT出願 WO 90/13651およびテラー（1992年、M
olecular Microbiology6:1211−1217）はB.t.菌株を開
示しており、これは鱗翅目および鞘翅目に対して毒性で
ありそして分子量81kDを有する毒素を生産する。
新規毒素を生産するためバシラス チューリンゲンシ
ス（Bacillus thuringiensis）の新規菌株を単離するこ
とが好都合でありその結果与えられる如何なる昆虫害虫
に対し広域スペクトルの生物殺虫剤が存在する。
3.発明の要約 本発明は、新規な生物学的に純粋なバシラス チュー
リンゲンシス（Bacillus thuringiensis）菌株又はその
胞子、結晶もしくは変異体に関しこの菌株又は変異体は
従来技術において開示されたB.t.菌株と異なり、鱗翅目
の昆虫害虫および鞘翅目の昆虫害虫に対し活性を有し、
約130,000ダルトンを有するデルタ−エンドトキシン
（以下、「130,000ダルトルのデルタ−エンドトキシ
ン」という）および双方が分子量約33,000を有する２種
のデルタ−エンドトキシン（以下、「33,000ダルトンの
デルタ−エンドトキシン」という）を生産する。33,000
ダルトンのデルタ−エンドトキシンの一方は、 のＮ−末端アミノ酸配列を有する。
もう一方の33,000ダルトンのデルタ−エンドトキシン
は、 のＮ−末端アミノ酸配列を有する。130,000および33,00
0ダルトンのデルタ−エンドトキシンは単独で鱗翅目害
虫に対し活性を有しそして一緒になって鱗翅目および鞘
翅目害虫に対し殺虫作用を有する。デルタ−エンドトキ
シンは、所望により結晶形であってよく;130,000ダルト
ンのデルタ−エンドトキシンは双ピラミッドでありそし
て33,000ダルトンのデルタ−エンドトキシンはひし形で
ある。
本発明の特異的態様において、本発明のチューリンゲ
ンシス（thuringiensis）菌株は、それぞれNRRL B−210
19およびNRRL B−21020の同定特性を有するEMCC0075お
よびEMCC0076である。
新規バシラス チューリンゲンシス菌株、胞子、変異
体又は結晶および又はデルタ−エンドトキシンは本発明
の範囲内であり各々殺虫剤組成物に製剤化できる。一つ
の態様において、菌株、胞子、変異体、結晶および／又
はデルタ−エンドトキシンは殺虫剤担体と共に組合わせ
てもよい。本発明の菌株又は変異体および／又はその胞
子および／又はその結晶を含んでなる殺虫剤組成物は、
害虫にそのような殺虫剤組成物の昆虫−駆除有効量を暴
らすことを含んでなる方法において、鱗翅目の昆虫害虫
および／又は鞘翅目の昆虫害虫の駆除のために使用でき
る。
4.図面の簡単な説明 図１は、アガロースゲル電気泳動によるcry I遺伝子
に対するバシラス チューリンゲンシスのPCR分析の結
果を示す。レーン１は分子量マーカー（1kbラダー（lad
der）、BRL−GIBSO）を示す。レーン２およびレーン３
は図１で示されるcry I Dオリゴヌクレオチドプライマ
ーによる菌株EMCC0075およびEMCC0076の分析を示す。レ
ーン４〜６はcry I Dプライマーによるバシラス チュ
ーリンゲンシスsubsp.テネブリオニス（telebrioni
s）、未知のバシラス チューリンゲンシス菌株および
バシラス チューリンゲンシスsubsp.アイザワ（aizawa
i）の分析を示す。バシラス チューリンゲンシスsubs
p.テネブリオニスはcry III A遺伝子のみを含有する；
未知のバシラス チューリンゲンシスはcry I D遺伝子
を含有しない；そしてバシラス チューリンゲンシスsu
bsp.アイザワはcry I Dを含む幾つかのcry I遺伝子を含
有する。
5.発明の詳細な記載 5.1.デルタ−エンドトキシンの入手 本発明の胞子および結晶は、本発明の菌株から得るこ
とができる。本発明の菌株は、当業者に公知の培地およ
び発酵技術（例えば、ロブコ等、1969,J.Invertebrate
Path.14:122−129;ダルマーゲ等.,1971,J.Invertebrate
Path.18:353−358;ダルマーゲ等.,in Microbial Contr
ol of Pests and Plant Diseases,H.D.バーゲス編.,Aca
demic Press,N.Y.,1980）を用いて培養できる。発酵サ
イクルの完了後、結晶および胞子は、当業者に周知の方
法により、例えば遠心分離によりB.t.胞子および結晶を
分離することにより集めることができる。胞子および結
晶はペレット内に含まれる。
上記第２節において示したように、結晶は本質的に
（１以上の）デルタ−エンドトキシンから成る。本発明
の菌株は、２種のタイプの結晶を生産する。一つは130,
000ダルトンのデルタ−エンドトキシンから本質的に成
る双ピラミッド結晶である。もう一つは２個の33,000ダ
ルトンのデルタ−エンドトキシンから本質的に成るひし
形結晶である。
結晶又はデルタ−エンドトキシンの精製は、密度勾配
遠心法、クロマトグラフィー法（例えばイオン交換、ア
フィニティクロマトグラフィー、疎水およびサイズ排除
クロマトグラフィー）、電気泳動法、分化溶解性又はタ
ンパク質の精製に対し他の標準技術を含めて（これらに
制限されないが）、当業者に公知の種々の手段により行
うことができる。
デルタ−エンドトキシンはまた組換えDNA発現系から
得ることもできる。特に、各毒素をエンコードするDNA
は適当なDNA発現ベクター内にクローン化される。
デルタ−エンドトキシンをエンコードする特異的DNA
断片の同定は、アガロース中での断片の電気泳動分離
（サザーン、1975,J.Mol.Biol.98:503）、ニトロセルロ
ース、ナイロン又は他の適当な支持媒質への分離された
DNA断片の移行および逐次的エデマン（Edman）分解によ
り測定される如きタンパク質のアミノ酸配列に基づく変
性したオリゴヌクレオチドプローブを用いた移行せしめ
られた断片のプローブすることを含めて（これらに限定
されない）、多くの方法で達成できる。択一的に、対象
のタンパク質と高い相同性を有すると考えられるタンパ
ク質の読み取り枠に相当するラベル化遺伝子断片を用い
てプローブし得る。対象の遺伝子の高い相同性は、一群
の関連タンパク質の整列およびエンコードするDNAセグ
メントにおける高度の保存領域の同定によって決定され
得る（例えば、グリブスコブ,K.,およびJ.デベレックス
編、in Sequence Analysis Primer、スックトン出版、
N.N.,1991）。明快でかつ信頼できる方法は対象のタン
パク質から酵素的又は化学的手段によって発生させた少
なくとも２種のペプチド断片のアミノ酸配列を決定する
こと、これらの領域をエンコードするDNAを認識するで
あろう縮重したオリゴヌクレオチドを設計し、そしてDN
Aの介在領域の完全な又はほゞ完全なコピーを増強する
ためポリメラーゼ鎖反応（PCR）技術を適用することで
ある。
一度同定すると、デルタ−エンドトキシン又はその一
部をエンコードする遺伝子を有するDNA断片は、pBR322,
pUC118,pACYC194およびpBCSKプラスミドおよび大腸菌内
での形質転換のためのそれらの変異体；又はpUB110,pBD
64,pBD16,pHP13,pE194,pC194、およびバシラスSPP内で
の形質転換のためのそれらの変異体を含めて（これらに
限定されないが）、適当なベクター内に、対象の遺伝子
を有させることが期待される断片のサイズ−選択ライブ
ラリーの結合によってクローン化され得る。バクテリオ
ファージベクター、例えばラムダ−およびその誘導体も
又E.コリー内に遺伝子をクローン化するため用いられ得
る。
商業的に有用なレベルでデルタ−エンドトキシン又は
その一部の生産は、プラスミドベクター内にエンコード
遺伝子をサブクローン化することによって達成でき、そ
のベクターは適当な宿主内で安定な発現および維持を許
容する。しばしば、許容できる発現が、デルタ−エンド
トキシンをエンコードするDNA断片上に存在する天然の
調節要素を用いて達成できる。しかし、転写調節シグナ
ル（プロモータ、開始スタート部位、オペレーター、活
性化領域、ターミネーター）並びに選択宿主細胞内でデ
ルタ−エンドトキシン遺伝子の増強されたか又はより調
節された発現のための転写調節シグナル（リボソーム結
合部位、開始コドン）を添加又は変更したいと望むであ
ろう。
プラスミドに加えて、デルタ−エンドトキシン遺伝子
および適当な調節要素がバシラス チューリンゲンシス
の天然プラスミドおよび／又は他の選択された宿主の一
つの内に、又は染色体DNA内に「遺伝子変換」（例え
ば、イグレシアスおよびトラウトナー、1983,Mol Gen.G
enet.189:73−76;ダンカン等、1978,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.75:3664−3665）又はベクターおよび宿主菌株
間の共有DNA相同性の部位での相同の組換え（例えば、
フェラリー等、1983,J.Bacteriol.154:1513−1515）を
介して導入され得る。有効な「２−プラスミド」システ
ムが相同組換えを介して遺伝子をバシラスに導入するた
めに使用できる（例えば、PCT特許 WO 91/09129参
照）。トランスポゾンも又cry遺伝子を選択された宿主
菌株に導入するため使用され得る。例えば、バシルスに
おいて、トランスポゾン例えばTn917およびその誘導体
が使用できる（ヤングマン等、1989,In Regulation of
Prokaryotic Development,I.スミス、R.スレペキー、お
よびP.セトロー編、American Society for Microbiolog
y、ワシントン,D.C.）。
バシラス チューリンゲンシス内に並びに他の生物内
にクローン化されたデルタ−エンドトキシン遺伝子の移
入は、細胞のプロトプラスト化すること（チャンおよび
コーヘン、Mol.Gen.Genet.168:111−115;クローフォワ
ード等、1987,J.Bacteriol.169:5423−5428）；エレク
トロポーレーション（electroporation）（例えば、シ
ュテル等、1989,Mol.Gen.Genet.218:177−181およびマ
カルソ等、1991,J.Bacteriol.173:1353−1356）；粒子
衝撃（例えばシァーク等、1991,Appl.Environ.Microbio
l.57:480−485）；細胞のシリコンカーバイト繊維−介
在形質転換（ケプラー等、1992,Theor.Appl.Genet.84:5
60−566）；共役（ゴンザレッツ等、1982,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.79:6951−6955）；又はバクテリオファー
ジによる形質導入を含めて（これらに制限されない
が）、多様の技術によって達成できる。形質導入された
コロニーは、結晶デルタ−エンドトキシンを生産するた
めの、該特異的デルタ−エンドトキシンに対して向けら
れた抗体を結合させるための又は敏感な害虫例えば節足
動物又は線虫をバイオアッセイにおいて殺すためのそれ
らの能力によって検出できる。
生産用の特定の宿主の選択に対する基準は、制限され
ないが、遺伝子を宿主に導入しやすさ、発現系の入手性
およびデルタ−エンドトキシンをエンコードする遺伝子
の安定維持性および発現を含む。宿主は微生物、例えば
バシラス チューリンゲンシスそれ自身、又はフィトス
フェア（phytosphere）、例えばフィロプレーン（phyll
oplane）（植物の表面）および／又は根圏（根物根の周
りの土壌）および／又は水生環境の棲息動物であってよ
くそして野生型微生物と特定の環境（作物および他の昆
虫の住地）内で競うことができるべきである。そのよう
な微生物の例は細菌に制限されないが、例えば属バシラ
ス（Bacillus）、シュドモナス（Pseudomonas）、エル
ウィニア（Erwinia）、セレイシア（Serratia）、クレ
ブシェラ（Klebsiella）、キサントモナス（Xanthomona
s）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、リゾビウ
ム（Rhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomo
nas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アガロ
バクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Ace
tobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アル
トバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotob
acter）、リューコノストック（Leuconostoc）、アルカ
リゲネス（Alcaligenes）、およびクロストリジウム（C
lostridium）；アルゲ（algae）、例えば科シナノフィ
セエ（Cyanophyceae）、プロクロロフィセエ（Prochlor
ophyceae）、ロドフィセエ（Rhodophyceae）、ジノフィ
セエ（Dinophyceae）、クリソフィセエ（Chrysophycea
e）、プリネシオフィセエ（Phymnesiophyceae）、キサ
ントフィセエ（Xanthophyceae）、ラフィドフィセエ（R
aphidophyceae）、バシラリオフィセエ（Bacillariophy
ceae）、エスティガマトフィセエ（Eustigmatophycea
e）、クリプトフィセエ（Cryptophyceae）、オイグレエ
ンフィセエ（Euglenophyceae）、プラシノフィセエ（Pr
asinophyceae）、およびグリロフィセエ（Chlorophycea
e）；および菌類、特に酵母、例えば属サッカロマイセ
ス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcu
s）、クルベロマイセス（Kluyveromyces）、スポロボロ
マイセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorul
a）、およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）が含
まれる。
本発明の（１以上の）エンドトキシン又はその一部を
エンコードする遺伝子は又、デルタ−エンドトキシンに
敏感な昆虫で寄生されることが知られている適当な植物
の染色体内にその後の導入のため適当なクローニングベ
クター内に挿入でき、あるいは又一方では直接殺虫剤と
して使用できる特異的バクロウィルス（baculoviruse
s）に挿入できる。
5.2.変異体 本発明は又親株よりもより多量のおよび／又はより大
きい結晶を生産する変異体B.t.菌株に関する。本発明に
おいて定義される「親株」は、突然変異前の原バシラス
チューリンゲンシス菌株である。
このような変異体を得るため、親株は例えば、化学的
手段例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン又はエチルメタンスルホネート、γ−射照、Ｘ
−線又はUV−射照による変異誘発要因によって処理され
得る。特に、バシラス チューリンゲンシス菌株を突然
変異させそしてそのような変異体を選択する一の方法に
おいて次の手順が用いられる。
ｉ）親菌株を変異誘発要因で処理し； ii）このようにして正常発生の変異体を変異体菌株の選
択に対して適当な培地内で増殖させ；次いで iii）変異体菌株を選択する。
本発明の好ましい態様によれば、選択されたコロニー
は通常の生産媒地中で増殖させ次いで増加せしめられる
デルタ−エンドトキシンの生産が可能な菌株に対しての
最終選択が行なわれる。
択一的に、変異体は当業者に公知の組換えDNA法を用
いて得ることができる。例えば、デルタ−エンドトキシ
ンをコードする遺伝子を有するDNA配列は、適当な発現
ベクター内に挿入され次いで引き続き当業者に公知の手
順を用い親株に導入される。択一的に、デルタ−エンド
トキシンをコードする遺伝子を含有するDNA配列は、ゲ
ノム内への組換えのためおよび引き続き増幅のため適当
なベクター内に挿入され得る。
5.3.バイオアッセイ 種々の昆虫害虫に対する本発明のB.t.菌株又はその胞
子、変異体、結晶又はエンドトキシンの活性は、当業者
に公知の手順、例えば人工的昆虫ダイエット混入分析、
人工的ダイエットオーバーレイ、葉彩色、葉浸漬および
葉状散布を用いて分析できる。このような分析の特異的
例は下記の６節で述べられる。
5.4.組成物 上記の本発明の菌株、胞子、結晶、デルタ−エンドト
キシン又は変異体は適当な担体と共に殺虫剤組成物、例
えば懸濁液、溶液、散布剤、分散性顆粒、水和剤、乳化
性コンセントレート、エアゾール又は含浸顆粒に製剤化
できる。
上記の如き組成物は、界面活性剤、不活性担体、防腐
剤、保湿剤、感覚刺激剤、誘引物質、封入剤、結合剤、
乳化剤、染料、紫外線保護剤、緩衝剤、流動化剤、又は
製品の取扱いおよび特定標的害虫に対する適用を促進す
るための他の成分の添加によって得ることができる。
適当な界面活性剤には、制限されないが、カルボキシ
レートの如きアニオン性化合物、例えば長鎖脂肪酸の金
属カルボキシレート;N−アシルサルコシネート；脂肪ア
ルコールエトキシレートとリン酸のモノ又はジ−エステ
ル又はそのようなエステルの塩；脂肪アルコールスルフ
ェート例えばナトリウムドデシルスルフェート、ナトリ
ウムオクタデシルスルフェートもしくはナトリウムセチ
ルスルフェート；エトキシル化脂肪アルコールスルフェ
ート；エトキシル化アルキルフェノールスルフェート；
リグニンスルフェート；石油スルフェート；アルキルア
リールスルホネート、例えばアルキル−ベンゼンスルホ
ネート又は低級アルキルナフタレンスルホネート、例え
ばブチル−ナフタレンスルホネート、スルホン化ナフタ
レン−ホルムアルデヒド縮合物の塩；又はより複雑なス
ルホネート例えばアミドスルホネート、例えばオレイン
酸およびＮ−メチルタウリンのスルホン化縮合生成物又
はジアルキルスルホネート例えばナトリウムスルホネー
ト又はジオクチルスクシネートが含まれる。非イオン性
試剤には、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、脂肪酸ア
ミド又は脂肪アルキル−もしくはアルケニル−置換フェ
ノールと酸化エチレンの縮合生成物、多価アルコールエ
ーテルの脂肪エステル、例えばソルビタン脂肪酸エステ
ル、そのようなエステルと酸化エチレンの縮合生成物、
例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、
酸化エチレンと酸化プロピレンのブロックコポリマー、
アセチレン性グリコール例えば2,4,7,9−テトラエチル
−５−デシン−4,7−ジオール、又はエトキシル化アセ
チレン性グリコールが含まれる。カチオン性界面活性剤
の例には、例えばアセテート、ナフテネート又はオレエ
ートとして脂肪族モノ−、ジ−又はポリアミン；酸素含
有アミン例えばポリオキシエチレンアミンの酸化アミ
ン；カルボン酸とジ−もしくはポリアミンの結合によっ
て得られるアミド−結合アミン；又は四級アンモニウム
塩が含まれる。
不活性物質の例には、制限されないが無機物質、例え
ばカオリン、フィロ珪酸塩、カーボネート、スルフェー
ト、ホスフェート又は植物学上の物質、例えばコルク、
粉末化とうもろこしの穂軸、ピーナッツ外皮、米外皮お
よびくるみの殻が含まれる。
本発明の組成物は直接適用に対して適当な形態で又は
適用前に適当量の水又は他の希釈剤による希釈を要求す
るコンセントレート又は一次粉末として存在し得る。殺
虫剤の濃度は特定の剤形の性質、特にそれがコンセント
レートであるか又は直接用いられるかによって変化する
であろう。組成物は１〜98％の固体又は液体の不活性担
体および０〜50％、好ましくは0.1〜50％の界面活性剤
を含有する。これらの組成物は商業製品に対してラベル
表示された割合で、好ましくは乾燥形の場合１エーカ当
たり0.01ポンド〜5.0ポンドでそして液体形の場合１エ
ーカ当たり0.01pts〜10ptsで適用されるであろう。
別の態様においては、本発明の菌株、胞子、結晶、デ
ルタ−エンドトキシン又は変異体は、前処理が結晶デル
タ−エンドトキシンに有害でない限り、目標害虫の環境
に施用する場合殺虫作用を持続させるため製剤化の前に
処理できる。そのような処理は処理が組成物の性質を有
害に影響しない限り物理的および／又は化学的手段によ
ってなされ得る。化学的試剤の例には、制限されないが
ハロゲン化剤；アルデヒド例えばホルムアルデヒドおよ
びグルタルアルデヒド；抗−感染剤、例えば塩化ゼピラ
ン；アルコール、例えばイソプロパノールおよびエタノ
ール；および組織学の固定液、例えばボーイン（Bouin'
s）固定液およびヘリー（Helly's）固定液（例えば、ヒ
ューアソン、Animal Tissue Techniques,W.H.Freeman a
nd Co.,1967参照）。
本発明の組成物は、害虫が植物上に出現する時に又は
害虫の出現前に保護手段として例えば散布又は散粉によ
り植物に直接施用できる。本発明の範囲内で保護される
べき植物には、制限されないが、穀物（小麦、大麦、ラ
イムギ、オートムギ、米、モコロシおよび関連作物）、
ビート（テンサイおよび飼料ビート）、核果、なし状果
および小果樹（リンゴ、西洋ナシ、プラム、もも、アー
モンド、さくらんぼ、ストロベリー、きいちごおよび黒
いちご）、マメ科植物（むらさきうまごやし、そら豆、
レンズ豆、えんどう豆、大豆）、油脂植物（西洋あぶら
な、からし、ポピー、オリーブ、ひまわり、ココナッ
ツ、とうごま植物、カカオ豆、落花生、きゅうり植物
（きゅうり、西洋カボチャ、メロン）、繊維植物（綿、
亜麻、麻、ジュート）、かんきつ類果実（オレンジ、レ
モン、グレープフルーツ、マンダリンみかん）、野菜
（ほうれんそう、レタス、アスパラガス、キャベツおよ
び他のアブラナ属植物、にんじん、たまねぎ、トマト、
じゃがいも、パプリカ）、クスノキ科（アボガド、シナ
モン、しょうのう）、落葉樹および針葉樹（例えば、ぼ
だいじゅの木、イチイ木、オークの木、はんの木、ポプ
ラ、かばの木、もみの木、からまつ、パイン）、又はと
うもろこしの如き植物、芝ふ植物、タバコ、ナッツ、コ
ーヒー、サトウキビ、茶、ワインのホップ、バナナおよ
び天然ゴム植物並びに観賞用植物が含まれる。大抵の場
合、好ましい施用の態様は葉面散布による。土壌害虫に
対する施用の好ましい態様はすきあと施用によるか又は
「レイバイ（lay−by）」施用による。植物成長の初期
段階で害虫の良好な駆除を得ることが一般に重要であ
る、何故ならこの時が植物の最大にひどく損なわれ得る
時期であるからである。スプレー又は粉剤はもしこれが
必要と考えられる場合、他の殺虫剤を好都合に含有でき
る。好ましい態様において、本発明の組成物は植物に直
接施用される。
本発明の組成物は、制限されないが次の害虫を含んだ
害虫に対して有効であろう：鱗翅目、例えばアキロイア
グリセラ（Achroia grisella）、アクレリス グロベ
ラナ（Acleris gloverana）、アクレリス バリアナ（A
cleris variana）、アドキソフィレス オラナ（Adoxop
hyes orana）、アゴロチス イプシロン（Agrotis ipsi
lon）、アラバマ アルギラセ（Alabama argillace
a）、アルソフィラ ポメタリア（Alsophila pometari
a）、アメロイス トランシテラ（Amyelois transitell
a）、アナガスタ クーニラ（Anagasta kuehniella）、
アナルシア リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニ
ソタ セナトリア（Anisota senatoria）、アンテレア
ペルニー（Antheraea pernyi）、アンチカルシア ゲ
マタリス（Anticarsia gemmatalis）、アルシプス（Arc
hips）sp.,アルグリロテニー（Argyrotaenia）sp.,アテ
チス ミンダラ（Athetis mindara）、ボムビー モリ
（Bombyx mori）、ブクラトリックス チューリンベリ
ラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ カルテラ
（Cadra cautella）、コリストニウラ（Choristoneur
a）sp.,コキラス ホスペス（Cochylls hospes）、コリ
アス オイレチーメ（Colias eurytheme）、コルシラ
セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シジラ ラチ
フェレナス（Cydia latiferreanus）、シジラ ポモネ
ラ（Cydia pomonella）、ダタナ インテグリマ（Datan
a integerrima）、デンドロリマス シベリカス（Dendr
olimus sibericus）、デスミア フネラリス（Desmia f
uneralis）、ジアファニア ハイアリナタ（Diaphania
hyalinata）、ジアファニア ニチダリス（Diaphania n
itidalis）、ジアトラセ グランジオセラ（Diatraea g
randiosella）、ジアトラセ サックラリス（Diatraea
saccharalis）、エンモス ザブシグナリア（Ennomos s
ubsignaria）、エレウマ ロフチニ（Eoreuma loftin
i）、エフェスチア エルテラ（Ephestia elutella）、
エラニス チラリア（Erannis tilaria）、エチゲメネ
アクレア（Estigmene acrea）、ユリア サルブリロ
ラ（Eulia salubricola）、ユポコリア アムビグラ（E
upocoellia ambiguella）、ユポシリア アムビグラ（E
upoecilia ambiguella）、ユポクチス シリスレア（Eu
proctis chrysorrhoea）、ユオア メソリア（Euxoa me
ssoria）、ガレリア メロネラ（Galleria mellonell
a）、グラフォリタ モレスタ（Grapholita molest
a）、ハリシナ アメリカナ（Harrisina americana）、
ヘリコベルパ スブフレカ（Helicoverpa subflexa）、
ヘリコベルパ ジー（Helicoverpa zea）、ヘリオチス
ビレネセンス（Heliothis virescens）、ヘミレウカ
オリビエ（Hemileuca oliviae）、ホモエソマ エレ
クテラム（Homoeosoma electellum）、ヒファントリア
クネー（Hyphantria cunea）、ケイフェリア ロイコ
ペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ラムジナ
フィセラリア フィセラリア（Lambdina fiscellaria f
iscellaria）、ラムジナ フィセラリア ルグブロサ
（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、リューコマ サ
リシス（Leucoma salicis）、ロベシア ボトラナ（Lob
esia botrana）、ロキソステジ スチクチカリス（Loxo
stege sticticalis）、リアントリア ジスパー（Lyman
tria dispar）、マカラ チュリシサリス（Macalla thy
rsisalis）、マラコソマ（Malacosoma）sp.,マメストラ
ブラシカエ（Mamestra brassicae）、マメストラ コ
ンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンジュカ
キンクマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンジ
ュカ セクタ（Manduca sexta）、マムカ テスチュラ
チス（Mrauca testulalis）、メランチカ ピクタ（Mel
anchra picta）、オペロフテラ グルマタ（Operophter
a brumata）、オグリア（Orgyia）sp.,オストリニア
ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、パレアクリタ ベ
ルナタ（Paleacrita vernata）、パピロ コレスホンテ
ス（Papilio cresphontes）、ペクチオオラ ゴスシピ
ラ（Pectinophora gossypiella）、フィリガニジア カ
リフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノ
リクター ブランカルデラ（Phyllonorycter blancarde
lla）、ピリス ナピ（Pieris napi）、ピリス レパ
（Pieris repae）、プラチペナ スカブラ（Plathypena
scabra）、プラチノタ フォエンダナ（Platynota flo
uendana）、プラチノタ スチュラタナ（Platynota stu
ltana）、プラチピチリア カルジダクチラ（Platyptil
ia carduidactyla）、プロジア インテルパンクテラ
（Plodia interpunctella）、プルテラ キシロステラ
（Plutella xylostella）、ポニチア プロトジセ（Pon
tia protodice）、シューダレチア ウニプンカ（Pseud
aletia unipuncta）、シュードプラシア インクルデン
ス（Pseudoplasia includens）、サブロデス エーグロ
タタ（Sabulodes aegrotate）、シズラ コンシナ（Sch
izura concinna）、シトトロガ セレアレラ（Sitotrog
a cerealella）、スピロノタ オセラナ（Spilonota oc
ellana）、スポドプテラ（Spodoptera）sp.,タウンスト
ポエ ピチカメパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネ
オラ ビセリラ（Tineola bisselliella）、トリコプル
シア ニー（Trichoplusia ni）、ウデア ムビガリス
（Udea rubigalis）、キシロマイゲス クリアリス（Xy
lomyges curialis）、ヨポノメウタ パデラ（Yponomeu
ta padella）および／又は鞘翅目の害虫、例えばレプチ
オタルサ（Leptinotarsa）sp.,アカントスセリデス オ
ブテクタス（Acanthoscelides obtectus）、カロソブル
チュース シネンシス（Callosobruchus chinensis）、
エピラカナ バリベスチス（Epilachna varivestis）、
ピハルタ ルテオラ（Pyrrhalta luteola）、クリラス
ホルミカリウス エレガンチュルス（Cylas formicar
ius elegantulus）、リストロノヌス オレゴネンシス
（Listronotus oregonensis）、シトフィラス（Sitophi
lus）sp.,シクロセファ ボレリス（Cyclocephala bore
alis）、シクロセファラ イマクラタ（Cyclocephala i
mmaculata）、マクロダクチルラス サブスビノサス（M
acrodactylus subspinosus）、ポピリ ジャポニカ（Po
pillia japonica）、リボトロガス マジァリス（Rhizo
trogus majalis）、アリフィトブラス ジアベリナス
（Alphitoblus diaperinus）、パロラス ラトゼベルギ
（Palorus ratzeburgi）、テネブリオ モリタ（Tenebr
io molitor）、テネブリオ オブスクルス（Tenebrio o
bscurus）、トリボリウム カスタネウム（Tribolium c
astaneum）、トリボリウム コンフスム（Tribolium co
nfusum）、トリボリムス デストムクトル（Tribolius
destructor）。
特異的態様において、130,000ダルトンのデルタ−エ
ンドトキシンおよび／又は２種の33,000ダルトンのデル
タ−エンドトキシンを含んでなる組成物は、鱗翅目害虫
に対して有効である。本発明の菌株および／又は胞子、
又は130,000ダルトンのデルタ−エンドトキシンおよび
２種の33,000ダルトンのデルタ−エンドトキシンを含ん
でなる組成物は鱗翅目および鞘翅目害虫に対して有効で
ある。
本発明は次の実施例により非制限的に説明する。
6.実施例 6.1.例1:B.t.菌株EMCC0075およびEMCC0076の培養 普通ブロス寒天斜面上で保持されたEMCC0075およびEM
CC0076の継代培養物を用い、下記の組成を有する50mlの
培地を含有する250mlのバッフル付振とうフラスコに接
種する： コーンスティープリカー 15g/ マルトリン（Maltrin）−100 40g/ じゃがいもデンプン 30g/ KH2PO4 1.77g/ K2HPO4 4.53g/ 培地のpHを、10NのNaOHを用いて7.0に調節する。
接種後、振とうフラスコを、回転振とう器上で30℃で
250rpmの振とうをもって72時間インキュベートする。上
記発酵において得られる、B.t.結晶を、ソルバール（So
rvall）RC−5B遠心機を用い、15,000rpmで15分間遠心分
離することによって回収する。
6.2.例2:B.t.菌株EMCC0075およびEMCC0076胞子および結
晶の試験 EMCC0075およびEMCC0076を上記例１で記載した如き振
とうフラスコ中で培養する。EMCC0075およびEMCC0076が
鱗翅目害虫に対して活性であるか否かを決定するため
に、培養ブロスの1:50希釈を作成する。このような希釈
培養ブロス5mlを、50mlのポリプロピレン遠心管に移
す。抗生物質を含有する20mlの人工昆虫ダイエット（di
et）を遠心管に加える。引き続き、混合物をバイオアッ
セイ用トレー内に分与する。ビート行列うじ（スポドプ
テラ エキギ（Spodoptere exigua））又はタバコ鱗翅
目昆虫の幼虫（へリオチス ビレスセンス（Heliothis
virescens））のいずれかの３〜６個の卵を、「ダイエ
ット」の表面上に適用する。マイラー（Mylar）をバイ
オアッセイ トレー上にかぶせ次いでトレーを28℃でイ
ンキュベートする。評価を７日および11日に行なう。
EMCC0075およびEMCC0076が鞘翅目の昆虫害虫に対して
活性であるか否かを測定するため、5mlの培養ブロスを
振とうフラスコから除きそして50mlのポリプロピレン遠
心管に直接移す。次いで（公知の抗生物質を含有する）
20mlの人工昆虫ダイエットに加え（最終試験濃度＝20％
w/w）次いで激しく混合する。とうもろこし根食い昆虫
の幼虫（ジアブロチカ ウンデシムパンクタタ（Diabro
tica undecimpunctata））の３〜６個の卵を「ダイエッ
ト」の表面に適用する。マイラーをバイオアッセイ ト
レー上にかぶせ次いでトレーを28℃でインキュベートす
る。評価を７日および11日に行う。
スポドプテラ エキギ（Spodoptere exigua）および
ジアブロチカ ウンデシムパンクタタ（Diabrotica und
ecimpunctata）に対するEMCC0075およびEMCC0076の生物
活性を、発育阻止点数（SS）を用いて表わす。発育阻止
点数はトレーを７日間インキュベーションした後測定す
る。このシステムにおいて、４＝現寸の幼虫（対照幼
虫）;3＝対照幼虫の3/4の大きさ、２＝対照幼虫の1/2の
大きさ;1＝対照幼虫の1/4の大きさ；そして０＝死亡。
数字が小さい程、B.t.活性は高い。結果を表Ｉに示す。
EMCC0075およびEMCC0076が鱗翅目および鞘翅目害虫に対
して活性を有していることは明らかである。
6.3.例3:EMCC0075およびEMCC0076に対するcry遺伝子プ
ロフィール EMCC0075およびEMCC0076に対するcry遺伝子プロフィ
ールを、パーキン エルマー シータス ジーンAmp
（商標）PCRレージェントキット文献に記載されたPCR法
を用いて測定する。二重鎖DNAを熱変性し次いでcry I A
（ａ）遺伝子（配列番号:3および配列番号:4としてそれ
ぞれ配列表中に記載）、cry I A（ｂ）遺伝子（配列番
号:5および配列番号:6としてそれぞれ配列表中に記
載）、cry I A（ｃ）遺伝子（配列番号:7および配列番
号:8としてそれぞれ配列表中に記載）、cry I D遺伝子
（配列番号:9および配列番号:10としてそれぞれ配列表
中に記載）、cyr III A遺伝子（配列番号:11および配列
番号:12としてそれぞれ配列表中に記載）、cry III B遺
伝子（配列番号:13および配列番号:14としてそれぞれ配
列表中に記載）、cry III C遺伝子（配列番号:15および
配列番号:16としてそれぞれ配列表中に記載）およびcry
III D遺伝子（配列番号:17および配列番号:18としてそ
れぞれ配列表中に記載）に対応する２種のオリゴヌクレ
オチドを低温度でアニールし次いで中間温度で伸長す
る。
PCR分析は両菌株がcry I D−様遺伝子を有することを
示した。cry I Dに特異的プローブは又、両菌株からの
制限遺伝子DNAのサザン（Southern）分析においてcry I
D−様遺伝子を検出した。cry I A（ａ）、cry I A
（ｂ）、cry I A（ｃ）を検出できるプローブを用いたE
MCC0075およびEMCC0076からの遺伝子DNAからの制限断片
のサザン分析は、cry I A−様分析の存在を確認した。
6.4.例4:EMCC0075双ピラミッドおよびひし形結晶の精製 普通ブロス寒天斜面上に保持されたEMCC0075の継代培
養物を用い、下記の例５で記載する組成と同じ組成を有
する500mlの培地を含有するバッフル付振とうフラスコ
に接種する。接種後、振とうフラスコを回転振とう器上
30℃で250rpmで72時間インキュベートする。結晶および
胞子を10,000rpmで30分間遠心分離する（ソルバルGSA回
転機）ことにより回収する。ペレットを脱イオン水で洗
い、15,000rpmで遠心し（ソルバルSS34回転機）、次い
で1ml当たり0.1gの湿量の濃度に音波処理により脱イオ
ン水に再懸濁させる。1gの湿量の粗製結晶を脱イオン水
で33.2mlに希釈し次いで250mlの分液ロート内に装入す
る。10mlの3M塩化ナトリウム、23.4mlの20％ポリエチレ
ングリコール8000、および33.4mlの20％ナトリウムデキ
ストランスルフェートを含んでなる底部相溶液を、250m
lの分液ロートに加え次いで混合し、次いで0.3gのナト
リウムデキストランスルフェート、70.3gのポリエチレ
ングリコール8000、および脱イオン水当たり17.5gの
塩化ナトリウムを含んでなる100mlのポリエチレングリ
コール上相溶液を加える。懸濁液を激しく振とうし、次
いで二相を室温で30分間分離せしめる。
多量の胞子を有する上相をピペットで除く。低相は結
晶および残留胞子を有する。上相が本質的に胞子を有し
なくなるまで、抽出を数回くりかえす。次いで低相を10
0mlの脱イオン水で希釈し、次いで10,000rpmで45分５℃
で遠心分離し（ソルバルGSA回転機）、結晶を回収す
る。回収した結晶を200mlの脱イオン水で洗いそして前
記の如く再度遠心分離する。上相からの胞子を、上記洗
浄手順を用いて回収する。
次いで、双ピラミッドおよびひし形結晶を、0.2Mトリ
ス−HClでpH2.5に調節した3.8mlの75％Ludox（商標）v/
v、3.8mlの50％Ludox（商標）v/vおよび3.8mlの38％Lud
ox（商標）v/vを含んでなる不連続Ludox（商標）HS−40
（デュポン）勾配を用い密度勾配遠心法により更に精製
する。100μｌの脱イオン水中の10mgの結晶を勾配の頂
部上に加層し、次いでベックマン超遠心機中10,000rpm
（ベックマン 41 Tiローター）で20℃で15分間遠心す
る。４個の分離したバンドが得られる。１つのバンドは
純粋なひし形結晶を有しそしてもう一つのバンドは双ピ
ラミッド結晶を有する。２つの他のバンドは２種の結晶
タイプの混合物を有する。純粋な結晶バンドを回収し、
脱イオン水で洗いそしてバイオアッセイに用いる。
6.5.例4:EMCC0075およびEMCC0076からのデルタ−エンド
トキシンのSDS−PAGE分析 普通ブロス寒天斜面上に保持されたEMCC0075及びEMCC
0076の継代培養物を用い、下記の組成を有する50mlの培
地を含有する250mlのバッフル付振とうフラスコに接種
する： グルコース 2.0 g/ KH2PO4 0.86 g/ K2HPO4 0.55 g/ クエン酸ナトリウム 2.0 g/ CaCl2 0.1 g/ MnCl2・4H2O 0.16 g/ MgCl2・6H2O 0.43 g/ ZnCl2 0.007g/ FeCl3 0.003g/ カザミノ酸 5 g/ 接種後、振とうフラスコを回転振とう器上で250rpmで
30℃で72時間インキュベートする。EMCC0075およびEMCC
0076の前記発酵中で得られたB.t.結晶を、10,000rpmで3
0分間遠心分離により（ソルバルGSAローター）回収す
る。次いで、前記例４で説明した如きナトリウムデキス
トランスルフェートおよびポリエチレングリコールを用
い二相抽出により精製する。
EMCC0075およびEMCC0076からのB.t.結晶製品をSDS−P
AGEにより分析する。特に、SDS−PAGEは、ファルマシア
のPhast System（商標）を用い10−15％公配ゲルについ
て行った。タンパク質バンドをファルマシアGelscan
（商標）ソフトウェアを用いファルマシアデンシトメー
ターで分析する。結果は、以下の内容を示す；すなわち
両菌株により生産された結晶は分子量約130,000ダルト
ンおよび33,000ダルトンを有する少なくとも２種のタン
パク質を有する。
6.6.例6:スポドプテラ エキギ（SPODOPTERA EXIGUA）
を用い、新規鱗翅目活性バシラス チューリンゲンシス
菌株の活性を測定するためのバイオアッセイ 精製された双ピラミッドおよびひし形結晶が、鱗翅目
害虫に対し活性であるかを測定するため、結晶をスポド
プテラ エキギ（Spodoptere exigua）に対してバイオ
アッセイを行う。結晶製品のサンプルを、ウェル当たり
500μｌの人工昆虫ダイエットを含有するゼリー状トレ
ーの各ウェルに適用する。種々のサンプルを含むトレー
を風乾する。２−４匹の第二齢又は初期第三齢のスポド
プテラ エキギ（Spodoptere exigua）を乾燥試験サン
プルを含有する各ウェルに加える。次いで、トレーを、
空気交換用の穴を有する穴あけされたマイラー（Myla
r）でシールする。次いで例２に記載した如く、発育阻
害の程度を記録する。
結果を表IIに示す。次の内容が明らかである；すなわ
ち、驚くべきことに双ピラミッド結晶およびひし形結晶
の双方ともスポドプテラ エキギ（Spodoptere exigu
a）に対し活性を有する。胞子は又スポドプテラ エキ
ギに対しても活性を示す。
6.7.例7:ジアブロチカ ウンデシムパンクタタ（DIABRO
TICA UNDECIMPUNCTATA）を用いるバイオアッセイ 精製した双ピラミッドおよびひし形結晶製品が鞘翅目
害虫に対して活性であるかどうかを測定するため、表面
加層分析を用い結晶を生物検定する。結晶製品のサンプ
ルをウェル当たり200μｌの固化人工昆虫ダイエットを
有するマイクロタイタープレートの各ウェルに適用す
る。ジアブロチカ ウンデシムパンクタタ（Diabrotica
undecimpunctata）の２〜４匹の新生児を、ペイントブ
ラッシを用い各ウェル内に静かに入れる。次いで、マイ
クロタイタープレートを、空気交換用の穴を有する穴あ
けしたマイラー（Mylar）を用いてシールし次いで30℃
でかつ80％の湿度でインキュベートする。死亡率％に対
する評価を５日目に行う。
結果を表IIIに示す。以下の内容が明らかである；す
なわち双ピラミッド結晶およびひし形結晶は、ジアブロ
チカ ウンデシムパンクタタに対し活性である。胞子の
みは又、ジアブロチカ ウンデシムパンクタタに対し活
性を有する。
6.8.例8:EMCCのひし形結晶タンパク質からのデルタ−エ
ンドトキシンのタンパク質配列決定 60μｌの50％三フッ化酢酸（TFA）を、25μｇのひし
形結晶に加える。混合物の15μｌアリコート４種を、バ
イオブレネコートしかつTFA予備処理されたミクロカー
トリッジガラス繊維フィルター上にスポット乾燥する。
Ｎ−末端配列決定は、アプライド バイオシステム社の
プロテイン シークエンサ モデル476Aで、オン−ライ
ンHPLCおよび液相TFAデリバリーを用いて行う。フェニ
ルチオヒダントイン−アミノ酸のHPLC測定は、プレミッ
クス緩衝系（ABI社）を用いて行うことによってなされ
る。データはABI's610データ分析ソフトウェアを用いマ
ッキントッシュII siに集められる。
二重配列が、約60/40比で認められる。データを分析
しそして配列を次の如く区別する： 6.9.例9:「MIVDL」および「MKHHK」タンパク質をエンコ
ードする遺伝子のクローニング 「MIVDL」タンパク質、MIVDLYRYLGGLAAVNAVLHFYEPRP
のために最初に決定されたアミノ酸配列は、配列ATG AT
H GTN GAY YTN TAY MGN TAY YTN GGN GGN YTN GCN GCN
GTN AAY GCN GTN YTN CAY TTY TAY GAR CCN MGN CCN
（配列番号:19）によってエンコードされる。この配列
に基づき71ntオリゴマーが設計され、ここで混合デオキ
シヌクレオチドが２−重レダンダント（redundant）部
位で用いられそしてデオキシイノシンがミスマッチでの
塩基識別および不正確塩基（マーチン,F.H.,およびM.M.
カストロ,1985,Nucleic Acids Res.13:892−8938）:ATG
ATI GTI GAY YTI TAY MGI TAY YTI GGI GGI YTI GCI G
CI GTI AAY GCI GTI YTI CAY TTY TAY GAR CC（配列番
号:20）で選択的に減少させるために用いられる。
「MKHHK」タンパク質、すなわちMKHHKNFDHIに対し決
定されたアミノ酸の配列は、２個以上のコドンにより特
定化されたアミノ酸不存在のため、より識別するプロー
ブの設計を許容する。更に、識別が次の仮定によって許
容される；すなわち、As又はTsはB.t.菌株の全体的低％
Ｇ＋Ｃ含量のため（約34モル％、クラウス,D.,およびR.
C.M.バーケリ1986,Genus Bacillus,p1112,InP.H.A.スエ
ース（編）、Bergey's manual of systematic bacterio
logy,v.z.The Williams and Wilkins Co.,ボルチモ
ア）、Gs又はCsに優先して暗号配列において使用される
であろう。次のプローブが合成される:ATG AAA CAT AAA
AAT TTT GAT CAT AT（配列番号21）。MIVDLおよびMKHH
Kプローブの双方に、製造者の指示（ベーリンガー マ
ンハイム ゲニナス システム（商標）ウセルス ガイ
ド、バージョン2.0）に従い、ジゴキシゲニソ−duTPを
末端につなぐ。
EMCC0075遺伝子DNAは、製造者により提供される緩衝
液中で一夜、EcoR I,EcoR V,Hind III,Pst I、又はこれ
らの酵素の組合せにより消化され、0.5×TBE中0.8％ア
ガロースを通して電気泳動され（TRIS−ボレート−EDTA
緩衝液；ザムブルック等、1989,in Molecular Cloning,
a Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press,C
old Spring Harbor,N.Y.）、10×のSSCを、10×のSSC中
のストラタゲン ポジブロッター（Stratagene Posiblo
tter）を用いたベーリング マンハイム ナイロン膜に
移し、次いで下記の如くプローブする。ハイブリッド形
成および48℃で0.5×のSSCによる堅縮洗浄後、MIVDLプ
ローブはEcoR VおよびPst I断片12kb又はそれ以上の大
きさ、約10kbのEcoR I断片および約3.5kbのHind III断
片を検出する。ハイブリッド形成および48℃で５×のSS
Cによる堅縮洗浄後、MKHHKプローブは、MIVDLプローブ
と同様に、同じ大きさのEcoR I,EcoR V、およびPst I断
片を検出した。この結果は２種の遺伝子が多分互いに極
めて近接して存在することを示す。追加的に、MKHHKプ
ローブは約6kbのHind III断片を検出した。
「MIVDL」および「MKHHK」タンパク質の少なくとも一
部をエンコードするHind III断片をクローン化するた
め、pUC118をHind IIIで消化し次いで５′末端を脱リン
酸化するため子ウシの腸のホスファターゼを用いて処理
し、このようにしてベクターのリゲートを防止する。制
限されかつホスファターゼ処理されたpUC118を次いでHi
nd IIIで予じめ完全に消化されたEMCC0075遺伝子DNAと
混合する。連結後、反応混合物を用いE.coli菌株XL1−B
lue MRF′（ストラタジーン社,La Jolla,CA）を形質転
換する。所望のDNA断片を有するコロニーを、サムブル
ック等（1989,Molecular Cloning,a Laboratory Manua
l,Cold Spring Laboratory Press,Cold Spring Harbor,
NY）によって記載される手順により、前記の「MIVDL」
および「MKHHK」プロープを用い「コロニーハイブリッ
ド形成」により検出する。
7.微生物の寄託 バシラス チューリンゲンシスの次の菌株を、アグリ
カルチュアル リサーチ サービス パテント カルチ
ュア コレクション（NRRL）（ノーザン レジオナル
リサーチ センター,1815 ユニバーシティストリー
ト，ペオリア，イリノイス,61604,米国）に寄託した。
菌 株 受 託 番 号 寄 託 日 EMCC0075 NRRL B−21019 1992年12月３日 EMCC0076 NRRL B−21020 1992年12月３日 菌株は次の条件で寄託された；すなわち37C.F.R.§1.
14および35U.S.C.§122のもとおよびブタペスト条約の
条件の下で特許庁長官により権利を付与すべきことが決
定された人に対し本特許出願の係属中、培養株への利用
機会が得られるであろう。寄託物は、各寄託された菌株
の生物学的に純粋な培養物を表わす。寄託物は、本出願
又はその分割出願の同等物が出願された国の外国特許法
の要求に従って入手できる。しかし、次のように理解さ
れるべきである；すなわち寄託物の入手容易性は、政府
の働きにより付与された特許権の信用低下において本発
明の実施のための契約を構成するものでない。
ここで記載されかつ権利要求された発明は、本明細書
で開示した特定の態様によりその範囲は制限されない；
何故ならこれらの態様は発明の幾つかの態様を説明する
ことを意図しているからである。等価の態様も本発明の
範囲内に入る。実際、本明細書で示しかつ記載した態様
に加えて発明の種々の態様は前記の記載から当業者に明
らかであろう。そのような変形も又添付の請求の範囲内
に含まれることが意図される。
種々の文献が本明細書において引用されたが、それら
の開示はそれを引用して本明細書に加えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ルフバロー，パトリシア エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，メイドゥ プレイス 3603 (72)発明者 トーマス，マイケル デビッド アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，ニューポート テラ ス 3175 (56)参考文献 特開 平１−50806（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/20 C07K 14/325 A01N 63/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（１）約33,000ダルトンの分子量を有し且
    つ次のＮ−末端アミノ酸配列:MIVDLYRYLGGLAAVNAVLHFYE
    PRP（配列番号:1）を有するデルタエンドトキシン、約3
    3,000ダルトンの分子量を有し且つ次のＮ−末端アミノ
    酸配列:MKHHKNFDHI（配列番号:2）を有するデルタ−エ
    ンドトキシン、及び約130,000ダルトンのデルタ−エン
    ドトキシンを生産することができ；そして （２）鱗翅目（Lepidoptera）の害虫及び鞘翅目（Coleo
    ptera）の害虫に対して殺虫活性を有する； NRRL B−21019として寄託されているバシラス・チュー
    リンゲンシスもしくはNRRL B−21020として寄託されて
    いるバシラス・チューリンゲンシス、又は前の性質
    （１）及び（２）を有する前記の菌株の変異株。
  2. 【請求項２】約33,000ダルトンの分子量及び次のＮ−末
    端アミノ酸配列:MIVDLYRYLGGLAAVNAVLHFYEPRP（配列番
    号:1）を有し、そしてNRRL B−21019として寄託されて
    いるバシラス・チューリンゲンシス株もしくはNRRL B−
    21020として寄託されているバシラス・チューリンゲン
    シス株又はこれらの株の胞子から得ることができるデル
    タ−エンドトキシン。
  3. 【請求項３】約33,000ダルトンの分子量及び次のＮ−末
    端アミノ酸配列:MKHHKNFDHI（配列番号:2）を有し、そ
    してNRRL B−21019として寄託されているバシラス・チ
    ューリンゲンシス株もしくはNRRL B−21020として寄託
    されているバシラス・チューリンゲンシス株又はこれら
    の株の胞子から得ることができるデルタ−エンドトキシ
    ン。
  4. 【請求項４】（１）バラシス・チューリンゲンシスの細
    胞、 （２）バラシス・チューリンゲンシスの胞子、 （３）バラシス・チューリンゲンシスから得られる単離
    されたデルタ−エンドトキシン、及び （４）バラシス・チューリンゲンシスから得られるデル
    タ−エンドトキシンを含んで成る結晶、 の内の少なくとも１種を含んで成る殺虫組成物におい
    て、前記バラシス・チューリンゲンシスが請求項１に記
    載の菌株又は変異株であることを特徴とする殺虫組成
    物。
  5. 【請求項５】請求項２に記載のデルタ−エンドトキシン
    を含んで成る殺虫組成物。
  6. 【請求項６】請求項３に記載のデルタ−エンドトキシン
    を含んで成る殺虫組成物。
  7. 【請求項７】請求項4,5又は６に記載の殺虫組成物に対
    して害虫を暴露することを特徴とする、鱗翅目の害虫の
    駆除又は抑制方法。
  8. 【請求項８】請求項4,5又は６に記載の殺虫組成物に対
    して害虫を暴露することを特徴とする、鞘翅目の害虫の
    駆除又は抑制方法。
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