JP2001523944A - Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙｅｔ３３及びｃｒｙｅｔ３４組成物及びこれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コクヌストモドキ幼虫（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）及びマメコガネ幼虫（Ｐａｐｉｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）を含む鞘し目（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）昆虫に対して殺虫活性を示す、新規結晶性タンパク質を含むＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株が開示されている。同様に、新規Ｂ.ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶毒素遺伝子であって、ｃｒｙＥＴ３３及びｃｒｙＥＴ３４と呼ばれるものが開示されている。これらは鞘し目毒性結晶性タンパク質、すなわちＣｒｙＥＴ３３（２９−ｋＤａ）結晶性タンパク質をコード化し、ｃｒｙＥＴ３４遺伝子は、１４−ｋＤａ ＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質をコード化する。ＣｒｙＥＴ３３及びＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質は、コクヌストモドキの幼虫及びマメコガネの幼虫に対して毒性がある。同様に、この発明の新規核酸配列を含む遺伝子導入細胞の製造及び使用方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＴＨＵＲＩＮＧＩＥＮＳＩＳ ＣＲＹＥＴ３３及びＣＲＹＥ Ｔ３４組成物及びこれらの使用 １．発明の背景 本発明は、１９９６年９月２４日に出順された米国特許出願番号第０８／７１ ８，９０５号に基づく一部継続出願であり、これの内容全体は、特に参照してそ の全体がここに組込まれる。 １．１発明の分野 本発明は一般に、分子生物学の分野に関する。より詳しくはいくつかの実施形 態は、ＤＮＡセグメント、及び細菌種に由来するタンパク質を含む方法及び組成 物に関している。より詳しくは本発明は、鞘し目毒性結晶性タンパク質をコード 化するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからの新規ｃｒｙＥＴ３ ３及びｃｒｙＥＴ３４遺伝子に関する。これらのＤＮＡセグメント、合成修飾さ れたＣｒｙタンパク質をコード化するＤＮＡセグメント、及び天然及び合成結晶 性タンパク質の様々な製造方法及び使用方法が開示されている。例えば診断用プ ローブとして、及びタンパク質産生用テンプレートとして のＤＮＡセグメントの使用、及び様々な免疫及び診断用の用途へタンパク質、融 合タンパク質キャリア、及びペプチドの使用である。同様に、ここに開示されて いるＤＮＡセグメントを含む遺伝子導入植物細胞の成長における核酸セグメント の製造及び使用方法も開示されている。 １．２関連技術に関する記載 １．２．１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶性タンパク質 Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの独特の特徴の１つは、昆虫のあるいくつか の目及び種に対して特異的に毒性のある、胞子形成中の結晶性タンパク質の産生 である。多くの様々なＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、殺虫性のある結 晶性タンパク質を産生することが証明されている。鱗し目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅ ｒａｎ）及び双し目（ｄｉｐｔｅｒａｎ）の昆虫に対する殺虫活性を有するタン パク質を産生するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株を含む組成物は、商品と して入手可能であり、環境にとって許容しうる殺虫剤として用いられている。そ の理由は、これらが特定の標的昆虫に対して非常に毒性が強いのに、植物及びそ の他の非標的生物にとって無害であるからで ある。 Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶性タンパク質の殺虫活性のメカニズムに ついて、過去十年間に広範な研究が行なわれた。結晶性タンパク質は、昆虫によ るタンパク質の摂取後にのみ昆虫に対して毒性があることが証明されている。昆 虫の中腸におけるアルカリｐＨ及びタンパク質分解酵素は、タンパク質を可溶性 化し、これによって、昆虫に対して毒性のある成分の放出が可能にされる。これ らの毒性成分は、中脳細胞を破壊し、昆虫に食物摂取を止めさせ、場合によって は昆虫の死をもたらす。このためＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、様々な病 害虫を処理する場合の効果的で環境に安全な殺虫剤であることが証明されている 。 Ｈｏｆｔｅら（１９８９年）が注目しているように、殺虫性Ｂ．ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ菌株の大部分は、鱗し目の昆虫、すなわち毛虫に対して活性があ る。その他のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、双し目の昆虫、すなわち ハエ、及びカに対して、あるいは鱗し目と双し目の両方の昆虫に対して殺虫活性 がある。近年、２〜３のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、鞘し目の昆虫 、すなわち甲虫に対して毒性がある 結晶性タンパク質を産生することが報告された（Ｋｒｉｅｇら、１９８３年；Ｓ ｉｃｋら、１９９０年；Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９２年）。 １．２．２ 結晶性タンパク質の遺伝学 結晶性タンパク質をコード化するいくつかの遺伝子が、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓのいくつかの菌株からクローンされた。Ｈｏｆｔｅら（１９８９年） による調査では、１９９０年以前にＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにおいて同 定された遺伝子及びタンパク質について考察しており、従来、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ遺伝子及びタンパク質に適用されていた命名法及び分類図を示し ている。ｃｒｙＩ遺伝子は、鱗し目毒性ＣｒｙＩタンパク質をコード化する。ｃ ｒｙＩＩ遺伝子は、鱗し目と双し目の両方に対して毒性のあるＣｒｙＩＩタンパ ク質をコード化する。ｃｒｙＩＩＩ遺伝子は、鞘し目毒性ＣｒｙＩＩＩタンパク 質をコード化し、一方ｃｒｙＩＶ遺伝子は、双し目毒性ＣｒｙＩＶタンパク質を コード化する。 最近、昆虫特異性に基づくのではなく、ＤＮＡ配列相同性に基づいてｃｒｙ遺 伝子を体系的に分類する新しい命名法が提案された。この分類図を表１に示す。 ^A次のアドレスから得られたもの：ｈｔｔｐ：／／ｅｐｕｎｉｘ．ｂｉｏｌ ｓ．ｓｕｓｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ １．２．３ 甲虫類昆虫に毒性である結晶タンパクの同定 甲虫類毒性Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株の最初の単離が報告されたと きに、殺虫剤としての細菌性結晶タンパクの 有用性が拡張された（Ｋｒｅｉｇら、１９８３年；１９８４年）。Ｂ．ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｔｅｍｅｂｒｉｏｎｉｓと表示されるこの菌株（ 米国特許第４，７６６，２０３号に記載、これを特にここで参考として取り入れ る）は、甲虫類昆虫Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ(青アルダー葉甲虫(ｂｌｕ ｅ ａｌｄｅｒ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ))およびＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドポテト甲虫（Ｃｏｌｏｒａｄｏ ｐｏｔａ ｔｏ ｂｅｅｔｌｅ））の幼虫に毒性であることが報告されている。 米国特許第４，７６６，２０３号（特にここで参考として取り入れる）は、Ｂ ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓにおいて確認された６ ５〜７０キロダルトン（ｋＤａ）の昆虫結晶タンパクに関する（Ｂｅｒｈｎａｒ ｄ、１９８６年も参照）。Ｓｅｋａｒら（１９８７年）は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからの甲虫類毒性結晶タンパクについて 遺伝子をクローニングし特徴付けることを報告している。ポリペプチドの予想（ 遺伝子配列から推定）される寸法は７３ｋＤａであるが、単離されたタンパクは 主に６５ｋＤａの成分からなる。Ｈｏｆｔｅら（１９８７年） は、遺伝子の配列においてＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｎｉｓからのクローン遺伝子についてのＤＮＡ配列が、Ｓｅｋａｒら（１９８７ 年）により報告されたものと同一であることも報告している。 ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９８８年）は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからクローンされた昆虫対照遺伝子についてのＤＮＡ配 列を開示しており；この配列はＳｅｋａｒら（１９８７年）により報告されたも のと同一であった。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞および、クローン遺伝子を含むＰｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞は、コロラドポテト甲虫の幼虫に毒 性であることが発見された。 １９９１年５月３０日付けの国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０７４８１は、 より低い収率で特許菌株により最初に得られた同じ殺虫タンパクの高収率を提供 するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの突然変異種を記載している。甲虫類毒性 Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ菌株の突然変異種が 開示されている。 Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｓａｎ ｄｉｅｇｏと表示される 甲虫類毒性菌株が、Ｐｙｒｒｈａｌｔａ ｌｕｔｅ ｏｌａ（ニレ葉甲虫（ｅｌｍ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ））；Ａｎｔｈｏｎａｍ ｕｓ ｇｒａｄｉｓ（ワタミハナゾウムシ）、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅ ｃｅｍｌｉｎｅａｔａ（コロラドポテト甲虫）、Ｏｓｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓ ｕｌｃａｔｕｓ（ブラックワインゾウムシ（ｂｌａｃｋ ｖｉｎｅ ｗｅｅｖｉ ｌ））、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ(黄色コナムシ(ｙｅｌｌｏｗ ｍｅ ａｌｗｏｒｍ))、Ｈａｌｔｉｃａ ｚｏｍｂａｃｉｎａ；およびＤｉａｂｒｏｔ ｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ（ ウエスタン斑点きゅうり甲虫（ｗｅｓｔｅｒｎ ｓｐｏｔｔｅｄｃｕｃｕｍｂｅ ｒ ｂｅｅｔｌｅ））を含む一部の甲虫類に毒性である６４ｋＤａ結晶タンパク を生成することがＨｅｒｎｓｔａｄｔら（１９８６年）により報告された。 Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｓａｎ ｄｉｅｇｏからの甲虫類 毒性遺伝子のＤＮＡ配列が、Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔら（１９８７年）により報告 され；米国特許第４，７７１，１３１号に開示されている。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｓａｎ ｄｉｅｇｏの毒性遺伝子の配列は、Ｂ．ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ のクローンされた甲虫類毒性遺伝子についてＳｅｋａｒら（１９８７年）により 報告されたものと同一である。Ｋｒｉｅｇら（１９８７年）は、種々の診断試験 に基づいて、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｓａｎ ｄｉｅｇｏが Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓと同一であることを 示した。 もう一つのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株であるＥＧ２１５８がＤｏｎ ｏｖａｎら（１９８８年）により報告され、米国特許第５，０２４，８３７号に 記載されている。ＥＧ２１５８は、甲虫類昆虫に殺虫性である７３ｋＤａのＣｒ ｙＣ結晶タンパクを生成する。そのＤＮＡ配列は、クローンされたＢ．ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ毒性遺伝子についてＳｅｋａｒら （１９８７年）により報告されたものと同一であった。この甲虫類毒性遺伝子は 、Ｈｏｆｔｅら（１９８９年）によりｃｒｙＴＩＩＡ遺伝子と呼ばれている。こ の菌株において３０ｋＤａおよび２９ｋＤａの二つの微量タンパクも観察された が、さらに特徴付けられはしなかった（Ｄｏｎｏｖａｎら、１９８８年）。 米国特許第５，０２４，８３７号は、鱗し類および甲虫類の 両方の昆虫に対して活性を示すハイブリッドＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｋｕｒｓｔａｋｉ菌株も記載している。米国特許第４，７９７，２７９ 号（ＥＰ０２２１０２４に対応）は、鱗し類毒性結晶タンパクコード化遺伝子を 含むＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｖａｒ ｋｕｒｓｔａｋｉからのプラス ミド、および甲虫類毒性結晶タンパクコード化遺伝子を含むＢ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからのプラスミドにより形質転換された ハイブリッドＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを開示している。ハイブリッドＢ ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｋｕ ｒｓｔａｋｉおよびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ の両方により得られるものに特徴的な結晶タンパクを生成する。米国特許第４， ９１０，０１６号（ＥＰ０３０３３７９に相当）は、甲虫類および鱗し類に対す る殺虫活性を有するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＭＴ １０４と確認され るＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物を開示している。 欧州特許出願公開番号０３１８１４３は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからの傷の無い部分 的変性遺伝子を開示しており、それを含む組換えベクターは、甲虫類昆虫への毒 性を有するタンパクを直接発現することができ、また欧州特許出願公開番号０３ ２４３５４は、コロラドポテト甲虫の幼虫、トウモロコシ根虫（ｃｏｒｎ ｒｏ ｏｔｗｏｒｍ）の幼虫およびワタミハナゾウムシを含む、甲虫類昆虫に対する殺 虫活性を有する菌株であるＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ａ３０を開示して いる。 米国特許第４，９９９，１９２号（ＥＰ０３２８３８３に相当）は、コロラド ポテト甲虫の幼虫に対する殺虫活性を有するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＰＳ４０Ｄ１を開示している。この菌株は、血清型分類により、ｓｅｒｏｖａｒ ８ａ８ｂ，ｍｏｒｒｉｓｏｎｉとも確認された。米国特許第５，００６，３３ ６号（ＥＰ０３４６１１４に相当）は、ｓｅｒｏｖａｒ ８ａ８ｂ，ｍｏｒｒｉ ｓｏｎｉと血清型分類され、コロラドボテト甲虫の幼虫に対する殺虫活性を示す ＰＳ１２２Ｄ３と表されるＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物を記載してい る。米国特許第４，９６６，７６５号（ＥＰ０３３０３４２に相当）は、コロラ ドポテト甲虫に対する殺虫活性を有するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株Ｐ Ｓ８６Ｂ１（血清型分類に よりｓｅｒｏｖａｒ ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ）を開示している。 ｃｒｙＩＴＩＢ遺伝子およびそのコード化された甲虫類毒性タンパクのヌクレ オチド配列が、Ｓｉｃｋら（１９９０年）により報告されているが、Ｂ．ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ原料菌株は、血清型分類によってのみ下位種ｔｏｌｗｏｒ ｔｈｉと確認される。Ｓｉｃｋらの１９９１年２月２６日付け米国特許第４，９ ６６，１５５号（ＥＰ０３３７６０４に対応）は、甲虫類活性Ｂ．ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ ４３Ｆから得られるＢ.ｔｈｕｒｉｎｇｌｅｎｓｉｓ毒素遺伝 子を開示しており、その遺伝子配列は、ｃｒｙＩＩ１Ｂ遺伝子に同一であるらし い。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ４３Ｆは、コロラドポテト甲虫およびＬ ｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｔｅｘａｎａに対して活性であると報告されている。 欧州特許出願公開番号０３８２９９０は、コロラドポテト甲虫の幼虫に対して 殺虫活性を示す、それぞれ７４ｋＤａおよび１２９ｋＤａの結晶タンパクを生成 する二つのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ｂｔＰＧＳ１２０８およびｂｔ ｐＧＳ１２４５を開示している。７４ｋＤａのタンパクを生成する毒素遺伝子に ついて報告されているＤＮＡ配列は、Ｓｉｃｋら（１ ９９０年）のｃｒｙＩＩＩＢ遺伝子の配列に相関しているようである。 ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１３６５１は、鱗し類および甲虫類の 両方の昆虫に毒性であると言われている８１ｋＤａタンパクをコードする毒素遺 伝子を含むＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株を開示している。米国特許第５ ，０５５，２９３号は、トウモロコシ根虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）昆虫の対照 のためにＢ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕｓの使用を開示している。 ２．発明の概要 従来技術とは明らかに対照的に、本発明の新規甲虫類活性ＣｒｙＥＴ３３およ びＣｒｙＥＴ３４結晶タンパク、およびそれらをコードする新規ＤＮＡ配列は、 新しいクラスのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパクを表し、前記文献 に記載されているいかなる菌株にも配列類似性を有さない。ここで開示され請求 の範囲に記載されているＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物は、甲虫類に毒 性であると第１のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｋｕｒｓｔａｋｉ菌株を表 している。本発明のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株は、Ｐｏｐｉｌｌｉａ およびＴｒｉｂｏｌｉｕｍ属の昆虫のような甲虫類に対する殺虫活性を有するタ ンパク毒素を発現する新規ｃｒｙ遺伝子を含む。 本発明の一つの局面は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されているヌクレオチド 塩基配列および推定されるアミノ酸配列を有する二つの甲虫類毒性δ内毒素遺伝 子を含む新規核酸セグメントに関する。以降、これらの遺伝子を、ｃｒｙＥＴ３ ３（配列番号１）およびｃｒｙＥＴ３４（配列番号２）と表す。ｃｒｙＥＴ３３ 遺伝子は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すヌクレオチド塩基１３６から９３９に 延びるコード領域を有し、ｃｒｙＥＴ３４遺伝子は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに 示すヌクレオチド塩基９６９から１３４９に延びるコード領域を有する。 本発明のもう一つの局面は、新規ｃｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４遺伝子 によりコードされる殺虫タンパクに関する。ヌクレオチド塩基１３６から９３９ へのｃｒｙＥＴ３３遺伝子によりコードされるＣｒｙＥＴ３３タンパク（配列番 号３）の推定されるアミノ酸配列を図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す。ヌクレオチ ド塩基９６９から１３４６へのｃｒｙＥＴ３４遺伝子によりコードされるＣｒｙ ＥＴ３４タンパク（配列番号４）の 推定されるアミノ酸配列を図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す。このタンパクは、甲 虫類の昆虫、特に、メキシコワタノミゾウムシ、赤小麦粉甲虫（ｒｅｄ ｆｌｏ ｕｒ ｂｅｅｔｌｅ）およひ日本甲虫（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ）に対 する殺虫活性を示す。 本発明のもう一つの局面は、受け入れ番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６５を有する 、農業調査培地コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），北部領域調査研究所（Ｎｏｒｔｈｅ ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＮＲＲＬ ）に１９９４年１２月１４日に寄託された天然産野生型Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓ細菌である菌株ＥＧ１０３２７の生物学的に純粋な培地に関する。Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＥＧ１０３２７は以下のセクション５．１〜５．３ に記載されている。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＥＧ１０３２７は、本発明 のｃｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４遺伝子に関係するまたは同一である遺伝 子を含む天然産Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株である。ＥＧ１０３２７は 、ここに開示のＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパクに関係す るまたは同一である２９ｋＤａおよび１４ｋＤａ殺虫性タンパクを生成する。 本発明のもう一つの局面は、新規ｃｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４遺伝子 の一方または両方を含む組換えベクター、そのような組換えベクターで形質転換 した組換え宿主細胞、およびそのような形質転換された組換え細菌の生物学的に 純粋な培地に関する。好ましい態様において、細菌は、好ましくは、実施例８に 記載の組換え菌株ＥＧ１１４０２（受け入れ番号Ｂ２１３６６のＮＲＲＬに１９ ９４年１２月１４日に寄託されたもの）および実施例７に記載の組換え菌株ＥＧ １１４０３（受け入れ番号Ｂ２１３６７のＮＲＲＬに１９９４年１２月１４日に 寄託されたもの）のようなＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓである。もう一つの 好ましい態様において、細菌は、好ましくは、組換え菌株ＥＧ１１４６０（受け 人れ番号Ｂ２１３６４のＮＲＲＬに１９９４年１２月１４日に寄託されたもの） のようなＥ．ｃｏｌｉである。ＮＲＲＬに寄託された全ての菌株は、ブダペスト 条約の下に特許培地コレクション（Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ）に寄託され、国際受領形式（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃ ｅｉｐｔ Ｆｏｒｍ）ＢＰ／４に従う生存可能性の陳述が得られている。 ２．１ ｃｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４ ＤＮＡセグメント 本発明は、実質的にいかなる原料からも単離することができ、全ゲノムＤＮＡ を含まず、ここに開示の新規ペプチドをコードする、ＤＮＡセグメントにも関す る。これらのペプチド種のコードするＤＮＡセグメントは、結晶タンパクに関連 するまたは他の非関連遺伝子産物のタンパク、ポリペプチド、サブユニット、機 能性領域などであることがわかる。さらに、これらのＤＮＡセグメントは、当業 者に良く知られている方法を用いて全く生体外で合成することができる。 ｃｒｙＥＴ３３は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すヌクレオチド塩基配列を有 する。ｃｒｙＥＴ３３遺伝子（配列番号１）は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す アミノ酸配列（配列番号３）を有する２９ｋＤａ ＣｒｙＥＴ３３タンパクをコ ードする。ｃｒｙＥＴ３４遺伝子（配列番号２）は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに 示すアミノ酸配列（配列番号４）を有する１４ｋＤａ ＣｒｙＥＴ３４タンパク をコードする。 ここで用いられる「ＤＮＡセグメント」という用語は、特定 の種の全ゲノムＤＮＡを有さないように単離されたＤＮＡ分子を意味する。従っ て、結晶タンパクまたはペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、この場合に はグラム陽性細菌属のＢａｃｉｌｌｕｓ、特に、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ ｓとして知られているＢａｃｉｌｌｕｓの属である、そこからＤＮＡセグメント が得られる種の全ゲノムＤＮＡから単離されたまたはそれを含まないように精製 された配列をコードする結晶タンパクを含むＤＮＡセグメントを意味する。「Ｄ ＮＡセグメント」という用語には、ＤＮＡセグメントおよびそのようなセグメン トのより小さいフラグメントを含み、および、例えばプラスミド、コスミド、フ ァージミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターも含む 同様に、単離されたまたは精製された結晶タンパクコード化遺伝子を含むＤＮ Ａセグメントは、配列をコードするペプチドに加えて、他の天然産遺伝子または タンパクコード化配列から実質的に単離された制御配列のような他の要素を含み 得るＤＮＡセグメントを意味する。この点において、「遺伝子」という用語は、 機能的タンパク、ポリペプチドまたはペプチドコード化単位を意味するように簡 略化されたものである。当業者に理 解されるように、この機能的用語は、タンパク、ポリペプチドまたはペプチドを 発現するまたは発現するように適合され得るゲノム配列、オペロン配列およびよ り小さい加工遣伝子配列を意味する。 「他のコード化配列から実質的に単離され」というのは、目的の遺伝子、この 場合には、細菌結晶タンパクをコードする遺伝子が、ＤＮＡセグメントのコード 領域のかなりの部分を形成すること、および大きな染色体フラグメントまたは他 の機能的遺伝子またはオペロンコード化領域のような、天然産コード化ＤＮＡの 大きな部分を、ＤＮＡフラグメントが含まないことを意味する。もちろん、これ は、最初に単離されたＤＮＡセグメントを意味し、遺伝子、組換え遺伝子、合成 リンカー、またはヒトの手により後でセグメントに添加されるコード化領域を排 除しない。 特別の態様において、本発明は、アミノ酸配列中に、本質的に配列番号３また は配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＣｒｙペプチド種をコードする、単離さ れたＤＮＡセグメントおよびＤＮＡセグメントを組み込む組換えベクターに関す る。 「本質的に配列番号３または配列番号４に示す配列」という 用語は、配列が、配列番号３または配列番号４のいずれかの配列の一部に実質的 に対応し、いかなるこれらの配列のアミノ酸にも同一でないまたは生物学的に機 能的に同等である比較的少ないアミノ酸を有することを意味する。「生物学的に 機能的に同等」という用語は、当該分野において良く理解されており、ここにさ らに詳細に定義する（例えば、実施形態）。すなわち、配列番号３または配列番 号４のアミノ酸に約７０％〜約８０％、より好ましくは約８１％〜約９０％、さ らに好ましくは約９１％〜約９９％のアミノ酸配列同一性または機能的同等性を 有する配列は、「本質的に配列番号３または配列番号４に示す」配列である。 アミノ酸および核酸が、その他のＮ−またはＣ−末端アミノ酸、あるいは５’ または３’配列などの付加的残留物を含むことと、タンパク質発現が関連する生 物学的タンパク質活性を含め、配列が上で示した基準を満たす限り、本発明で開 示した配列のいずれかで本質的に示すようであることも理解される。終結配列の 添加は、特に、たとえば、コード領域の５’または３’位のいずれかが剥離する 、種々の非コード領域を含むか、種々の内部配列、すなわち、遺伝子内で発生す ることが知られてい る介在配列を含む核酸配列に適用される。 本発明の核酸セグメントは、コード配列そのものとは関係なく、プロモータ、 ポリアデニル化信号、追加制限酵素部位、多回クローニング部位、他のコードセ グメントなど、他のＤＮＡ配列と結合することがあるため、その全長はかなり変 化する。したがって、ほぼすべての長さの核酸フラグメントを使用することが考 えられるが、目的とする組み換えＤＮＡ手順において容易に調製および使用する ために、全長を制限することが好ましい。たとえば、配列番号３または配列番号 ４で開示されたいずれかのペプチド配列をコード化する短い隣接ストレッチを含 むか、配列番号３または配列番号４で開示されたいずれかのペプチド配列をコー ド化するＤＮＡ配列、そして特に、配列番号１または配列番号２で開示されたこ れらのＤＮＡセグメントと等しい、またはこのＤＮＡ配列を相補する、核酸フラ グメントが調製できる。たとえば、約１８個のヌクレオチドで、長さが、約１０ ，０００ｂｐ（塩基対）まで、約５，０００ｂｐまで、約３，０００ｂｐまで、 約２，０００ｂｐまで、約１，０００ｂｐまで、約５００ｂｐまで、約２００ｂ ｐまで、約１００ｂｐまで、約５０ｂｐまで、約１４ｂｐであるＤＮＡ配列（す べ ての中間長を含む）も、有用と考えられる。 この文脈での”中間長”は、すなわち１８、１９、２０、２１、２２、２３な ど；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１ ０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３などと、２００−５００； ５００−１，０００；１，０００−２，０００；２，０００−３，０００；３， ０００−５，０００のすべての整数を含み、約５，２００個のヌクレオチドなど の配列を含む、引用した範囲内のすべての長さを意味することが、容易に理解さ れる。 本発明は、配列番号１または配列番号２で特に開示されるＤＮＡ配列を含め、 本発明のペプチドをコード化する、あるいは配列番号３または配列番号４のアミ ノ酸配列をコード化する特定の核酸配列に限定されない。そのため、組み換えベ クターおよび単離ＤＮＡセグメントは、ペプチドコード領域そのもの、基本コー ド領域が選択的に変化または修正されたコード領域を含むか、それでもやはりこ れらのペプチドコード領域を含むさらに大きなポリペプチドをコード化するか、 種々のアミノ酸配列を持つ、生物学上の機能が同等のタンパク質またはペプチド をコード化することがある。 本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的機能を備えた、等価のペプチドを含む 。このような配列は、核酸配列と、したがってコード化されるタンパク質内に自 然に発生することが知られているコドンの縮退および機能等価の結果として生じ る。あるいは、機能等価なタンパク質あるいはペプチドは、交換するアミノ酸の 性質を考慮して、タンパク質構造を変化させる組み換えＤＮＡ技術の応用によっ て生成される。人間が設計した変化は、たとえば、タンパク質の抗原性に改良を 加えたり、分子レベルでの活性を調査するために突然変異体を検査するなどの、 部位指示の変異誘発技術の応用によって導入される。 所望であれば、ペプチドコード領域を、精製または免疫検出のためなどの（た とえば、アフィニティークロマトグラフィーおよび酵素ラベルコード領域により それぞれ精製されるタンパタ質）、必要な機能を持つ他のタンパク質またはペプ チドを備えた同一発現単位内に配列した、融合タンパク質およびペプチドも調製 できる。 本発明のさらなる局面を形成しているのが、組み換えベクターである。特に有 効なベクターは、コード化を行うのが全長のタンパク質がさらに短いペプチドか にかかわらず、ＤＮＡセグ メントのコード化部分が、プロモータの制御下にあるベクターであると考えられ る。このプロモータは、本発明の遺伝子コード化ペプチドと自然に結合する形の プロモータであり、たとえば、本発明で開示する組成に関連して、組み換えクロ ーニング及び／又はＰＣＲ技術を用い、コード化セグメントの上流または構造配 列に位置する５’非コード化配列を単離することで得られる。 ２．２ ハイブリダイズプローブおよびプライマーとしてのＣＲＹＥＴ３３およ びＣＲＹＥＴ３４ ＤＮＡセグメント 本発明の結晶タンパク質またはペプチドの発現を発現させる以外に、ここで考 える核酸配列には、他のさまざまな用途もある。たとえば、核酸のハイブリダイ ズを実現するプローブあるいはプライマーとしても使用できる。そういうものと して、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１４個の長さの隣接ＤＮＡセ グメントと同じか、これを相補する、少なくともヌクレオチド１４個の長さの隣 接配列からなる配列領域を含む核酸セグメントは、特別の用途があると考えられ る。これより長い隣接した同一配列あるいは相補配列、たとえば、約２０、３０ 、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、 ５０００ｂｐなとの配列（すべての中間長と各数までの長さを含み、５２００塩 基対の全長配列も含む）も、ある実施形態において有用である。 このような核酸プローブは、特にハイブリダイズして結晶タンパク質コード化 配列を生成する機能により、与えられたサンプル中の相補配列の存在を検出する 場合に役立つ。しかし、突然変異種プライマーの調製のために配列情報を用いる ことや、他の遺伝子構造の調製に用いるプライマーを含め、他の用途が考えられ ている。 ヌクレオチドが１０−１４、１５−２０、３０、５０、あるいは１００−２０ ０個ほどの隣接ヌクレオチドストレッチから成る配列領域を持ち、配列番号１ま たは配列番号２のＤＮＡ配列と同一か、この配列を相補する核酸分子は特に、た とえば、サザンブロット法およびノースブロット法などで用いるハイブリダイズ プローブとして考えられる。これより短いフラグメントは、普通、ハイブリダイ ズ実施形態での用途がある。この場合、隣接相補領域の長さは、約１０−１４お よび約１００または２００ヌクレオチドの間などで変化するが、検出したい相補 配列の長さによって、さらに長い隣接相補ストレッチが用いら れることもある。 もちろん、フラグメントは、機械的剪断や制限酵素消化などの他の技術によっ ても得られる。短い核酸セグメントまたはフラクメントは、たとえば、自動化オ リゴヌクレオチド・シンセサイザを用いて普通ニ行われているような、化学的手 段による直接合成により、容易に調製できる。また、フラグメントは、米国特許 ４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号（それぞれ参照により、本発 明に取り込まれる）のＰＣＲ技術などの核酸再生技術の応用により、組み換え生 成のための、選択した配列の組み換えベクターへの導入により、そして、分子生 物学の専門家に一般に知られている他の組み換えＤＮＡ技術によっても得られる 。 したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補ストレ ッチを用いて、選択的に二重分子を生成する機能のために使用される。構想され た応用によって、ハイブリダイズ条件を変化させて、目的の配列に対する、程度 の異なるプローブ選択性を達成することができる。高い選択性が求められる応用 では、普通、ハイブリダイズには比較的厳重な条件が採用される。たとえば、約 ５０〜７０℃で０．０２〜０．０５ Ｍ ＮａＣＬというような、比較的低塩及び／又は高温の条件が選択される。こ のような選択的な条件は、プローブとテンプレートあるいは目的鎖間のミスマッ チに対して、ほとんど耐性がなく、特に、結晶タンパク質コード化ＤＮＡの単離 に適する。ハイブリタイズ化によるＤＮＡセグメントの検出は、技術者にはよく 知られており、米国特許４，９６５，１８８号および５，１７６，９９５号（そ れぞれ参照によりここに取り込まれる）の内容は、ハイブリダイズ分析の方法の 好例である。Ｍａｌｏｙら、１９９３；Ｓｅｇａｌ １９７６；Ｐｒｏｋｏｐ １９９１；Ｋｕｂｙ １９９１の文書に見られるこのような内容は、特に関連が ある。 もちろん一部の応用では、たとえば、基本テンプレートにハイブリダイズ化さ れた突然変異プライマー鎖を用いて突然変異体を調製する場合、または関連種、 機能等価物などから結晶タンパク質コード化配列を単離する場合、通常、ヘテロ 二重鎖を生成させるために、より厳密でないハイブリダイズ条件が必要になる。 このような条件下では、約２０〜５５℃の温度範囲で、塩濃度が０．１５〜０． ９Ｍという条件が採用される。そのため、クロスハイブリタイズは、ハイブリダ イズの制御に関する 明確なハイブリダイズ信号として、ただちに識別される。どのような場合でもホ ルムアミドの添加量が増加すると、条件がさらに厳密になるのは、通常理解され る。ホルムアミドは、温度の上昇と同じ方法で、ハイブリダイズ二重鎖を不安定 にする。そのため、ハイブリダイズ条件はすぐに操作でき、普通、必要な結果に 応じて選択する方法となる。 ある実施形態では、ハイブリダイズの判定する場合、ラベルのような適切な手 段と組み合わせて、本発明の核酸配列を用いるのは有利である。検出可能な信号 を付与できる蛍光、放射性、酵素あるいはアビジン／ビオチンなどのその他の配 位子を含め、幅広い適切な標識手段が、当技術界では既知である。好ましい実施 形態では、放射性や他の環境上望ましくない試薬の代わりに、蛍光ラベルや、ウ レアーゼ、アルカリ性フォスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素タグ を採用する。酵素タグの場合は、相補核酸を含むサンプルを用いた特定のハイブ リタイズを識別するため、人間の目や分光光度計に可視的手段を与えるために用 いる比色分析標識基質が知られている。 一般に、ここで説明するハイブリダイズブローブは、溶液ハイブリタイズの試 薬としてはもちろん、固体相を用いた実施形 態の試薬としても有効であると考えられる。固体相を含む実施形態で、テストＤ ＮＡ（またはＲＮＡ）を選択したマトリックスまたは表面に吸収させるか、そう でなければ固定させる。このように固定された単鎖核酸に対して、次に、望まし い条件下で選択したプローブを用いて、特定のハイブリダイズを行う。選択する 条件は、（たとえば、Ｃ＋Ｇの含有量、目的核酸の種類、核酸の源、ハイブリダ イズ化プローブの大きさによって）求められる特定の基準に基づく特定の環境に よって変わる。明確に結合していないプローブ分子を除去するためにハイブリダ イズ表面を洗浄した後、ラベルによって、特定のハイブリダイズを検出し、また は定量まで行う。 ２．３ 組み換えベクターおよび結晶タンパク質発現 他の実施形態では、組み換えまたは異種プロモータの制御下でコード化ＤＮＡ セグメントを位置決定することによって、ある種の利点が得られることが考えら れる。本発明で用いたように、組み換えまたは異種プロモータは、通常、自然環 境ではＤＮＡセグメントコード化により結晶タンパク質やペプチドと結合しない プロモータを呼ぶのに用いられる。このようなプロモータは、通常、他の遺伝子 と結合するプロモータ及び／又はバ クテリア、ウィルス、真核生物、植物の細胞から単離されたプロモータを含むこ とがある。もちろん、ＤＮＡセグメントを、発現のために選択した細胞の種類、 生物、あるいは動物にさえ、効果的に発現させるプロモータを用いるのは重要な こととなる。タンパク質発現のためにプロモータと細胞の種類の組み合わせを用 いることは、一般に、分子生物学の技術者には既知である。たとえば、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら、１９８９を参照すること。用いられるプロモータは構造性か、誘導 性であり、たとえば組み換えタンパク質またはペプチドの大規模生産に有利な、 導入されるＤＮＡセグメントを高レベルで発現させるのに適した条件下で用いら れる。高レベル発現での使用が検討されている適切なプロモータシステムは、限 定するものではないが、Ｐｉｎｃｈｉａ発現ベクターシステム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む。 発現の実施形態に関連して組み換えタンパク質とペプチドを調製するには、通 常、さらに長いＤＮＡセグメントを使用し、ペプチド配列全体をコード化するＤ ＮＡセグメントが最も好ましいと考えられる。しかし、非結晶タンパク質抗体の 生成に使用するなど、結晶ペプチドやエピトープコア領域を発現させる ために短いＤＮＡセグメントを使用することは、本発明の範囲内である。長さが 約８〜約５０アミノ酸、好ましくは長さが約８〜約３０アミノ酸、より好ましく は長さが約８〜２０アミノ酸のペプチド抗原ＤＮＡセグメントは、特に有用であ ると考えられる。このようなペプチドエピトープは、配列番号３または配列番号 ４による隣接アミノ酸配列を含むアミノ酸配列でもよい。 ２．４ 結晶タンパク質導入遺伝子および遺伝子導入植物 また別の局面において、本発明は、本発明の新規結晶タンパク質をコード化す る核酸セグメントを発現する遺伝子導入植物の生成方法を提供する。遺伝子導入 植物の生成過程は、当技術界ではよく知られている。一般に、この方法は、Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＣｒｙＥＴ３３またはＣｒｙＥＴ３４結晶タンパ ク質をコード化するコード領域に効果的に結合されたプロモータを含む、ＤＮＡ セクメントを持つ適切な宿主細胞の形質転換で構成される。このようなコード領 域は、通常、転写終結領域に結合されている。転写終結領域によって、プロモー タは、細胞内のコード領域の転写を推進できるようになるため、生体内で組み換 えタンパク質を生成する能力を細胞に与え ることができる。代わりに、ある遺伝子導入細胞で発現される特定の組み換え結 晶タンパク質の量を制御、調製または削減することが望ましい例において、本発 明は、結晶タンパク質アンチセンスｍＲＮＡの発現にも対応している。与えられ たタンパク質の量を制御または削減する手段としてアンチセンスｍＲＮＡを使用 するのは、当技術界ではよく知られている。 本発明の他の局面は、ここで開示する１種類以上の新規ポリペプチド組成をコ ード化する遺伝子または遺伝子セグメントを発現する遺伝子導入植物から成る。 本発明で用いるように、「遺伝子導入植物」という用詔は、通常はおそらく存在 しない遺伝子、ＲＮＡに通常転写されない、あるいはタンパク質に変換（「発現 」）されないＤＮＡ配列、あるいは、形質転換されていない植物に通常は存在す るが、遺伝子処理を行いたいか、発現を変更したい遺伝子など、形質転換されて いない植物に導入したいすべての遺伝子またはＤＮＡに限定しないが、これらを 含む、組み込みＤＮＡ配列を持つ植物を呼ぶことを目的としている。 一部の例では、本発明の遺伝子導入植物のゲノムを、未変性、人為的に改変し た、あるいは突然変異した１個以上のＣＲＹＥ Ｔ３３またはＣＲＹＥＴ３４導入遺伝子を安定に導入して増加させることが考え られる。ある例では、１個以上の導入遺伝子を、形質転換宿主植物細胞のゲノム に組み込む。これは、１個以上の結晶タンパク質コード化ＤＮＡセグメントを、 このような植物のゲノムに組み込む場合である。ある状況では、１、２、３、４ 個あるいはさらに多くのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶タンパク質（未変 性あるいは組み換え処理済みのいずれかの）が組み込まれ、形質転換された遺伝 子導入植物において安定に発現されることが望ましい。 導入される好ましい遺伝子としては、たとえば、バクテリア由来の結晶タンパ ク質コード化ＤＮＡ配列、特にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐより得られた、本発明 で説明する１種類以上の配列が挙けられる。特に好ましい核酸配列は、Ｂ．ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓより得られた配列か、このような形質転換宿主細胞にお ける結晶タンパク質の殺虫活性を低下あるいは上昇させる遺伝子処理を行ったこ れらの配列のいずれかである。 植物の形質転換手段および遺伝子導入細胞ラインの調製は、当技術界で既知で あり、本発明で説明する。このような細胞の形質転換に用いるベクター、プラス ミド、コスミド、ＹＡＣｓ （ｙｅａｒｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ、酵母人工染 色体）およびＤＮＡセグメントは、もちろん、通常、未変性あるいは人工的に得 られた、本発明のオペロン、遺伝子、あるいは遺伝子由来配列のいずれか、およ び特に、開示された結晶タンパク質をコード化する配列から成る。これらのＤＮ Ａ作成物には、さらに、プロモータ、エンハンサ、ポリリンカー、あるいは、必 要に応じて関心のある特定の遺伝子に対する正または負の調製活性を持つ遺伝子 配列さえも含めることができる。ＤＮＡセグメントまたは遺伝子は、未変性また は転換された結晶タンパク質をコード化できる。このような結晶タンパク質は、 結果として得られる組み換え細胞で発現され、および／または、再生植物の改良 済表現形を与える。 このような植物に、甲虫類の昆虫に対して毒性を持つ、１種類以上のＣｒｙＥ Ｔ３３及び／又はＣｒｙＥＴ３４結晶タンパク質をコード化する形質転換ＤＮＡ セグメントを組み込むことにより、このような形質転換植物は、単子葉あるいは 双子葉植物の殺虫耐性を高めるのに望ましいものとなる。特に好ましい植物とし て、芝生、小麦、野菜、観賞用植物、果樹などが挙げられる。 関連する局面において、本発明は、形質転換植物によって生成された種、この ような種による子孫、および元の遺伝子導入植物の子孫によって生成された種、 上記の過程にしたがって生成された種も含む。このような子孫および種は、その ゲノムに結晶タンパク質コード化導入遺伝子が安定に組み込まれており、このよ うな子孫の植物には、メンデルの方法による安定導入遺伝子の導入によって与え られる形質が遺伝する。１種類以上のＣｒｙＥＴ３３及び／又はＣｒｙＥＴ３４ 結晶タンパク質またはポリペプチドをコード化する遺伝子導入ＤＮＡセグメント がゲノムに組み込まれた、このような遺伝子導入植物すべてが、本発明の局面で ある。 ２．５ 部位特異的突然変異誘発 部位特異的突然変異誘発は、個別のペプチド、または生物学的な機能が同等の タンパク質またはペプチドを、そのもととなるＤＮＡの特異的な突然変異誘発に よって調製するときに有用な技術である。この技術は、さらに、ＤＮＡに一つ以 上の塩基配列の変更を導入することによって、例えば、前記で考察したことを一 つ以上取り入れた変異配列を調製してテストするための迅速な能力を提供する。 部位特異的突然変異誘発によって、 望ましい突然変異を起したＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド 配列と、それに隣接する、十分な数量のヌクレオチドとを使用して、交差した欠 失接合部の両側で、安定した二本鎖を形成するのに十分な大きさと配列の複雑さ をもつプライマー配列を提供するために、突然変異体を作出することができる。 典型的には、ヌクレオチドの長さが、約１３、または約１４、または約１６、ま たは約１７の、約１８、または約１９、または約２０、または約２１、２２、２ ３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０、４０、または約５０ 位までで、これらを含み、配列の接合点の両側の約５残基から１０残基が改変さ れたプライマーが好ましい。 一般的に、部位特異的突然変異誘発の技術は、さまざまな出版物によって具体 例が示されているように、当技術分野において周知である。評価されるように、 この技術は、典型的には、一本鎖の形でも二本鎖の形でも存在するファージベク ターを用いる。部位特異的突然変異誘発において有用な、典型的なベクターには 、Ｍ１３ファージのようなベクターが含まれる。これらのファージは、簡単に購 入することができ、それらの使用法は、当業者にとって周知である。目的の遺伝 子をプラスミドか らファージに移すステップを省く部位特異的突然変異誘発において、二本鎖プラ スミドも、日常的に用いられる。 一般的に、まず、一本鎖ベクターを得るか、または、望ましいペプチドをコー ドするＤＮＡ配列を、その配列の中に含む二本鎖ベクターの二本の鎖を融解して 解離させて、本明細書による部位特異的突然変異誘発が行われる。望ましい変異 配列をもつオリゴヌクレオチドプライマーを、一般的には、合成して調製する。 そして、このプライマーを、一本鎖ベクターとアニールさせ、変異をもつ鎖の合 成を完成させるために、（大腸菌）のポリメラーゼＩのクレノウ断片のようなＤ ＮＡ合成酵素を加える。このようにして、一方の鎖が本来の変異を起していない 配列をコードし、二番目の鎖が望ましい変異をもつヘテロ二本鎖が形成される。 次に、このヘテロ二本鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適当な細胞を形 質転換させてから、変異配列をもつ組換えベクターを含むクローンを選択する。 部位特異的突然変異誘発を用いた、ペプチドをコードする、選択されたＤＮＡ 分節の配列変異体の調製法が、有用な種となる可能性のあるものを作出する方法 として提供されているが、ペプチドの配列変異体と、それらをコードするＤＮＡ 配列が得 られる別の方法があるため、制限的な意味をもたない。例えば、ヒドロキシルア ミンなどの変異原性薬剤によって、望ましいペプチド配列をコードする組換えベ クターを処理することができる。 ２．６ ＣｒｙＥＴ３３とＣｒｙＥＴ３４抗体組成物と、その作製法 特定の実施形態において、本発明者らは、本明細書で開示されている結晶性タ ンパク質に結合する、モノクローナルかポリクローナルの抗体の使用を考えてい る。抗体を調製し、その特徴を調べるための方法は、当技術分野において、よく 知られている（例えば、参照してここに組み込まれる、抗体：実験マニュアル（ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド スプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ，１９８８）を参照のこと）。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を 作製するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と 同じ手順で始められる。簡単に言うと、本発明による免疫原組成物によって動物 を免疫して、ポリクローナル抗体を調製し、免疫した動物から抗血清を集める。 抗血清 を産生するために、広い範囲の動物種を用いることができる。典型的には、抗血 清を産生するために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ハムスター、モルモッ ト、またはヤギである。ウサギの血液量が比較的多いため、ポリクローナル抗体 を産生するためには、ウサギが好ましい選択対象である。 当技術分野において、よく知られているように、ある組成物の免疫原性は多様 である。したがって、宿主の免疫システムを強化することがしばしば必要である が、これは、ペプチドまたはポリペプチドの免疫原を担体に結合して行なうこと ができる。典型的で好ましい担体は、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニン（ＫＬＨ）と、ウシの血消アルブミン（ＢＳＡ） である。卵白アルブミン、マウス血消アルブミン、またはウサギ血清アルブミン など、その他のアルブミンも、担体として用いることができる。ポリペプチドを 担体タンパク質に結合させる方法は、当技術分野において周知であり、グルタル アルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスタシンイミドエステ ル、カルホジイミド、およびビス−ビアゾ化ベンジジンなどが含まれる。 また、これも当技術分野において周知であるように、アジュ バントとして知られている、免疫応答の非特異的な刺激細胞を利用することによ って、特定の免疫原組成物の免疫原性を強化することできる。典型的で好ましい アジュバントには、フロイントの完全アジュバント（死菌化したＭｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｓを含む、、免疫応答の非特異的な刺激細 胞）、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバン トなどが含まれる。 ポリクローナル抗体を産生するために用いられる免疫原組成物の量は、免疫に 用いられた動物だけでなく、免疫原の性質によってさまざまである。免疫原を投 与するために、さまざまな経路を用いることができる（皮下、筋肉内、皮内、静 脈内、および腹腔内）。免疫後のさまざまな時点で、免役した動物の血液を採集 することによって、ポリクローナル抗体の産生をモニターすることができる。追 加免疫として、２回目の注射を行なうこともできる。追加免疫と力価調査を繰り 返して、適当な力価を得る。望ましいレベルの免疫原性が得られたら、免役した 動物から採血して、血清を単離して、貯蔵し、及び／又は、ｍＡｂｓを作製する ためにその動物を用いることができる。 ｍＡｂｓは、参照してここに組み込まれる米国特許第４，１ ９６，２６５号で例示されているような周知の技術を用いて、容易に調製するこ とができる。典型的には、この技術には、例えば、精製された、または部分精製 された結晶性タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドなど、選択された免疫 原組成物によって、適当な動物を免疫することが含まれる。免疫組成物は、抗体 産生細胞を有効に刺激するような方法で投与される。マウスやラットのような齧 歯動物が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、またはカエルの細胞を使うこ とも可能である。ラットを使用することにも、一定の利点がある（Ｇｏｄｉｎｇ ，１９８６，ｐｐ．６０−６１）、マウスの方が好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウス が、最も日常的に用いられ、一般的に、安定して融合する比率が、より高いため に最も好ましい。 免疫後、抗体産生能をもつ体細胞、特異的には、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）を、ｍ Ａｂ作製プロトコールにおいて使用するために選択する。これらの細胞は、生検 した脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または、末梢血サンプルから得ること ができる。脾臓細胞と末梢血細胞が好ましいが、前者は、形質芽球の分裂段階に ある抗体産生細胞の豊富な供給源であるためで、また、後者は、末梢血が容易に 利用できるためである。しはしば、一 群の動物を免疫し、最も高い抗体力価をもつ動物の脾臓を取り出して、シリンジ で脾臓を破砕して脾臓のリンパ球が得られる。典型的には、免疫したマウスから 得た脾臓は、約５×１０⁷からおよそ５×１０⁸個のリンパ球を含んでいる。 次に、免疫した動物から採った抗体産生Ｂリンパ球を、一般的に、免疫された 動物と同じ生物種の一つである、不死のミエローマ細胞と融合させる。ハイブリ ドーマ産生融合処理において使用するのに適したミエローマ細胞系は、好ましく は、非抗体産生性で、高い融合効率をもち、望ましい融合細胞（ハイブリドーマ ）のみの生育を維持する、一定の選抜培地での生育を不可能にする酵素欠損をも っている。 当業者はよく分かっているように、多数のミエローマ細胞のいずれを用いても よい（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６，ｐｐ．６０−６１；Ｃａｍｐｅｌｌ，ｐｐ．７ ５−８３，１９８４）。例えば、免疫した動物がマウスのときには、Ｐ３−Ｘ６ ３／Ａｇ８、Ｘ６３／Ａｇ８．６５３、ＮＳ／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ １４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、およびＳ１ ９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌを用いることができ、ラットには、Ｒ２１０．ＲＣＹ３ 、Ｙ３ Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および４Ｂ２１０を用いることができ、Ｕ− ２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７ ２９−６が、ヒトの細胞融合に関しては有用である。 好ましいマウスミエローマ細胞の一つが、ＮＳ−１ミエローマ細胞系（Ｐ３− ＮＳ−１．Ａｇ４−１とも名付けられている）で、ＮＩＧＭＳヒト遺伝子変異細 胞寄託所（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌ１ Ｒｅｐｏｓｉ ｔｏｒｙ）に、寄託番号ＧＭ３５７３の細胞系を請求すれば、容易に入手するこ とができる。使用することができる別のマウスのミエローマ細胞系は、８−アザ グアニン−抵抗性マウスミエローマＳＰ２／０非産生細胞系である。 抗体産生脾臓、またはリンパ細胞系と、ミエローマ細胞との雑種を作製するた めの方法は、通常、細胞膜の融合を促進する（化学的、または電気的な）薬剤の 存在下で、体細胞とミエローマ細胞とを２：１の比率で混合することを含むが、 この比率は、それぞれ、約２０：１から約１：１まで変化させることができる。 センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉｖｉｒｕｓ）を用いた融合法（Ｋｏｈｌｅｒと Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５； １９７６）、および、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなどのポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）を用いた融合法（ｇｅｆｔｅｒら，１９７７）が説明されている。電気 的に誘導する融合法の利用も適当である（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６，ｐｐ．７１ −７４）。 融合処理によって、大抵、およそ１×１０^-6から１×１０^-8という低い頻度で 、生きた雑種細胞が産生される。しかし、生きた融合雑種細胞は、選抜培地で培 養することによって、親細胞である、融合しなかった細胞（特に、正常に無限に 分裂を繰り返す非融合のミエローマ細胞）から分化するため、これは問題にはな らない。選抜培地は、一般的に、組織培養培地の中で、ヌクレオチドのデノボ合 成を阻害する薬剤を含むものである。典型的で、好ましい薬剤は、アミノプテリ ン、メソトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンとメソトレキ セートは、プリンとピリミジンの両方のデノボ合成を阻害し、一方、アザセリン は、プリンの合成のみを阻害する。アミノプテリンとメソトレキセートを用いる ときには、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンとチミジンを培地に添加 する（ＨＡＴ培地）。アザセリンを用いるときには、ヒポキサンチンを培 地に添加する。 好ましい選抜培地はＨＡＴ培地である。ヌクレオチド救出経路を作動させるこ とができる細胞のみがＨＡＴ培地で生き残る。ミエローマ細胞は、この救出経路 の決定的酵素である、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラー ゼ（ＨＰＲＴ）を欠失しているために、生き残ることができない。Ｂ細胞は、こ の経路を作動させることができるが、培養すると長くは生きられないので、一般 的には、約２週間内には死んでしまう。したがって、選抜培地の中で生き残るこ とができる細胞のみが、ミエローマ細胞とＢ細胞から形成された雑種細胞である 。 この培養によって、特異的なハイブリドーマが選抜されるハイブリドーマの集 団が提供される。典型的には、微量滴定用プレートで単クローンを希釈して、細 胞を培養してから、望ましい反応性に関して、各クローンの上清を（およそ２週 間から３週間後）試験することによって、ハイブリドーマの選抜を行う。このア ッセイ法は、放射性免疫アッセイ法、酵素免疫アッセイ法、細胞毒性アッセイ法 、プラークアッセイ法、ドット免疫結合アッセイ法などのように、感度が高く、 簡単迅速でなければならない。 次に、選抜されたハイブリドーマを連続的に希釈して、各抗体産生細胞系にク ローニングし、このクローンを、ｍＡｂｓを提供するために無限に増殖させるこ とができる。この細胞系は、２つの基本的な方法で、ｍＡｂｓ産生を明らかにす ることができる。最初の融合に用いられた体細胞とミエローマ細胞を提供するた めに用いられたタイプと同じ組織親和性のある動物に、ハイブリドーマのサンプ ルを（しばしば、腹腔内に）注射することができる。注射された動物には、融合 した雑種細胞によって産生される、特異的なモノクローナル抗体を分泌する腫瘍 が発生する。そして、高濃度でｍＡｂｓを提供するために、血清、腹水など、動 物の体液を採ることができる。各細胞系は、インビトロで培養することもできる が、この場合には、高濃度で簡単に得ることができる培地の中に、ｍＡｂｓが天 然に分泌される。どちらかの方法で産生されたｍＡｂｓは、望ましければ、濾過 、遠心、および、ＨＰＬＣ、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、さ まざまなクロマトグラフィー法を用いて、さらに精製することができる。 ２．７ ＥＬＩＳＡと免疫沈殿 本発明とともに、ＥＬＩＳＡを用いることができる。ＥＬＩ ＳＡアッセイにおいて、結晶性タンパク質抗原の配列を取り込んでいるタンパク 質、またはペプチドを、選択した表面、好ましくは、微量滴定用プレートのウエ ルなどのタンパク質親和性を示す表面に固定する。不完全に吸着した材料を除く ために洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、またはミルク粉 末溶液など、試験する抗血清に関して、抗原的に中立なことが分かっている非特 異的なタンパク質を、アッセイ用プレートのウエルに結合させるか、被覆させる ことが望ましい。これによって、固定された表面の非特異的な吸着部位を遮断す ることができ、また、それによって、抗血清が表面に非特異的に結合することに よって起こるバックグランドが低減される。 ウエルに抗原材料を結合させ、バックグランドを抑えるために、非反応性物質 でコートし、さらに、結合しなかった材料を除去するために洗浄した後、固定さ れた表面を、免疫複合体（抗原／抗体）の形成を助けるようにして、試験すべき 抗血消、または、臨床的もしくは生物学的抽出物に接触させる。このような条件 には、好ましくは、ＢＳＡ、ウシのガンマグロブリン のような希釈剤で抗血消を希釈することが含まれる。これらを 加えた薬剤は、非特異的なバックグランドを抑える上で助けとなることが多い。 次に、上を覆った抗血清を、好ましくは、約２５℃から約２７℃の温度で、約２ 時間から約４時間インキュベートする。インキュベーション後、免疫複合体とな った材料でないものを除去するために、抗血清を結合した表面を洗浄す ウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することが含まれる。 試験サンプルと結合抗原との間に特異的免疫複合体を形成させ、続いて洗浄を 行った後、同じものを、一次抗体に特異的な二次抗体にかけることによって、免 疫複合体形成が起こったことと、さらに、その量も決定することができる。検出 方法を提供するために、二次抗体は、好ましくは、適当な発色物質とインキュベ ートすると、発色する酵素を結合させている。すなわち、例えば、一定の時間、 免疫複合体形成が生じるのに有利な条件の下で抗血清を結合した表面を、ウレア ーゼまたはパーオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧに接触させ、インキュベートしよ 溶液の中で、室温で２時間インキュベートする）。 酵素標識した二次抗体でインキュベートし、非結合の材料を 除くために洗浄した後、酵素標識がパーオキシダーゼであれば、ウレアおよびブ ロモクレゾールパープル、または２．２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズ チアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＳＴ）およびＨ₂Ｏ₂などの発色基質とイン キュベートすることによって、標識の量を定量する。そして、例えば、可視スペ クトルの分光光度計を用いて、発色程度を測定して定量を行なう。 本発明の抗結晶性タンパク質抗体は、免疫沈殿によって、他の結晶性タンパク 質抗原を単離するために、特に有用である。免疫沈殿には、複合体混合液から標 的抗原成分を分離することが含まれ、微量なタンパク質を分別または単離するた めにも用いられる。膜タンパク質を単離するためには、細胞を、界面活性剤のミ セルの中に可溶化しなければならない。胆汁酸塩などの、その他の薬剤は、酸性 ｐＨ、または二価性の陽イオン存在下で沈殿するため、非イオン性塩が好ましい 。 代わりの実施形態において、本発明の抗体は、二つの抗原の近接して並列した ものに対して有用である。これは、例えば、酵素−基質対のような、抗原の局所 的な濃度を上昇させるのに、特に有用である。 ２．８ ウエスタンブロット 本発明の組成物は、免疫ブロットまたはウエスタンブロット解析において、非 常に有用であることが分かるであろう。ニトロセルロース、ナイロン、またはそ れらを組み合わせたものなど、固体担体基質上に固定されたタンパク質を同定す るために、抗ペプチド抗体を、抗親和性の一次試薬として用いることができる。 免疫沈殿に続いてゲル電気泳動を行うと、これらは、それに対して、二次試薬が 、有害なバックグランドを生じる抗原を検出するのに用いられる抗原を検出する ときに用いるための一段階試薬として使用することができる。これは、調べられ ている抗原が、免疫グロブリン（バクテリアの細胞壁成分に結合する免疫グロブ リンの使用は除く）であるとき、調べられている抗原が、検出試薬と交差反応す るとき、または、交差反応シグナルと同じ相対的分子量で移動するときに、特に 有用である。 ウエスタンブロッティングとともに用いるための、免疫学に基づく検出方法に は、酵素による、放射標識による、または蛍光標識による、毒性部分に対する二 次抗体が、これに関しては、特に使用すべきものと考えられる。 ２．９ 結晶性タンパク質スクリーニングおよび検出キット 本発明は結晶性タンパク質ポリペプチドまたはタンパク質関連ポリペプチド、 またはこのようなタンパク質を産生する細胞を含んでいると思われる試料のスク リーニング用の方法およびキットを考慮に入れている。キットには本発明の抗体 を１種以上含んでもよく、本発明の試料と抗体間の相互作用を検出するための試 薬を含んでいてもよい。提供される試薬を放射線、蛍光または酵素でラベルする ことができる。キットは核酸または本発明の抗体と結合、または相互作用し得る 既知の放射線ラベル試薬を含有することができる。 キットの試薬は液状溶液、固体担体に付着または乾燥粉末として提供される。 試薬が液状溶液で提供される場合、好ましくはその液状溶液は水溶液である。提 供される試薬が固体担体に付着している場合、固体担体はクロマトグラフ媒体、 複数のウェルを有するテストプレート、または顕微鏡用スライドであることが好 ましい。提供される試薬が粉末である場合、その粉末を別途提供される適当な溶 剤で再構成することができる。 さらに別な実施形態では、本発明は免疫検出法とそれに関連するキットに関す る。本発明の結晶性タンパク質またはペプチドをそれとの反応性を有する抗体ま たは本発明により調製され た抗体の検出に利用し得ること、および結晶性タンパク質またはタンパク質に関 連するエピトープ含有ペプチドの検出に使用し得ることが提案されている。一般 的に言えば、これらの方法にはまずこの様なタンパク質、ペプチドまたは抗体を 含んでいることが予想される試料を得ること、場合によっては試料を免疫複合体 を生成させるに有効である条件下で本発明による抗体またはペプチドと接触させ 、次いで免疫複合体の存在を検出することが含まれる。 一般的に言えば、免疫複合体の生成の検出は公知であり、多数のアプローチを 用いて行い得る。例えば、本発明ではＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット（例え ばドットブロット）、間接免疫蛍光法等への応用が考えられる。一般に免疫複合 体の生成は放射線ラベルまたは酵素標識（アルカリフォスファターゼ、セイヨウ ワサビペルオキシターゼ等）等のラベルを用いて検出される。もちろん、公知の 如く２次抗体等の２次結合、またはビオチン／アビジンリガンド結合等を使用す ることがさらに有利であると思われる。 分析の目的のため、結晶性タンパク質またはペプチド、または結晶性タンパク 質関連ペプチド、または検出されると考えら れる抗体を含んでいると思われるどの様な試料でも実際上利用し得ることが提案 されている。この様な実施形態は抗原または抗体の力価測定、ハイブリドーマの 選択等に用途があると考えられている。関連する実施形態では、本発明は試料中 の結晶性タンパク質またはそれに関連するペプチド及び／又は抗体の存在の検出 に用いられるキットの調製が考えられている。試料には結晶性タンパク質または ペプチドを含んでいると思われる細胞、細胞上澄、細胞懸濁液、細胞抽出物、酵 素分画、タンパク質抽出物またはその他の無細胞組成物が含まれる。一般的に言 えば、本発明によるキットには適当な結晶性タンパク質、ペプチドまたはこの様 なタンパク質またはペプチドに対する抗体と共に、免疫測定試薬および抗体また は抗原および試薬でなる手段が含まれる。免疫測定試薬は典型的には抗体または 抗原、または２次結合リガンドに関連するラベルを包含する。代表的なリガンド には第一抗体または抗原に対する２次抗体、関連するラベルを有するビオチンま たはアビジン（またはストレプトアビジン）が含まれる。もちろん、上記の如く 多数の代表的なラベルが公知であり、この様なラベルはすべて本発明に関連して 用い得る。 一般的には容器には抗体、抗原または検出試薬を入れたバイアルが含まれ、好 ましくは適当量に分注されている。本発明のキットにはまた、典型的には市販用 にしっかり封をされた抗体、抗原、および試薬用容器を入れるための手段が含ま れる。この様な容器には、所定のバイアルが収納された射出または吹き出し成形 プラスチック容器が含まれる。 ２．１０ エピトープコア配列 また本発明の目的は、全細胞および他のペプチドを含まないタンパク質または ペプチド組成物であり、１種以上の抗結晶性タンパク質抗体と免疫的に交差反応 し得るエピトープを組み込んだ精製タンパク質またはペプチドが含まれる。特に 本発明はＣｒｙタンパク質またはペプチド由来のエピトープコア配列に関する。 本明細書で用いる「１種以上の抗結晶性タンパク質抗体と免疫的に交差反応し 得るエピトープを組み込む」という用語は、結晶性タンパク質またはポリペプチ ド内に位置するエピトープに類似の１次、２次または３次構造を含むペプチドま たはタンパク質抗原のことを言う。類似の程度とは一般的に、結晶性タンパク質 またはポリペプチドに対するモノクローンまたはポリ クローン抗体も交差反応性ペプチドまたはタンパク質抗原と結合、反応またはそ れを認識する様なものを言う。この様な抗体に関連して例えばウエスタンブロッ ティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等の様々な免疫分析法を用いることができ、それ らはすべて当業者に公知である。 ワクチンへの使用に適したＣｒｙ免疫優生エピトープ、及び／又はその機能等 価体の同定は比較的単純な問題である。例えば、本明細書に引用され、疎水性に 基づいてアミノ酸配列からエピトープの同定と調製を教示する米国特許第４，５ ５４，１０１号に記載のＨｏｐｐの方法が適用できる。その方法はいくつかの論 文に報告され、それに基づくソフトウエアプログラムもエピトープコア配列を同 定するために使用することができる（例えばＪａｍｅｎｓｅｎおよびＷｏｌｆ、 １９８８年；Ｗｏｌｆら、１９８８年；米国特許番号第４，５５４，１０１号参 照）。これらの「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成または 組み替え技術の応用によりペプチド中に容易に取り込まれる。 本発明中での使用に好ましいペプチドは一般に長さで約８〜２０アミノ酸、よ り好ましくは約８〜１５アミノ酸であること が提案されている。より短い抗原性結晶性蛋白由来のペプチドはある状況、例え ば免疫測定分析調合物では有利であることが提案されている。代表的な利点には 調合と精製の容易さ、比較的低コストおよび再現性の改善、有利な生体分布等が 含まれる。 本発明の特別な利点は、結晶性タンパク質に対する「汎用」エピトープが得ら れる変性及び／又は延長エピトープ／免疫原性コア配列、特にＣｒｙおよびＣｒ ｙ関連配列を含む合成ペプチドの調製で実現されることが提案されている。これ らのエピトープコア配列は本明細書において、特定のポリペプチド抗原の親水性 領域等の局面で同定される。これらの領域はＴ細胞およびＢ細胞刺激を増進する 領域を表し、従って特定の抗体産生を誘発することが提案されている。 本明細書で言うエピトープコア配列とは、本明細書で開示する抗結晶性タンパ ク質抗体上の抗原結合部位に対し「相補的」であり、従って抗原結合部位に結合 する、比較的短いアミノ酸配列である。さらに、またはエピトープコア配列とは 、本発明のペプチド成分に対する抗体と交差反応性である抗体を誘発するもので ある。本開示との関連において、「相補性」という言葉は相互に親和力を示すア ミノ酸またはペプチドを意味すると いうことが理解されよう。従って、本発明のあるエピトープコア配列は機能上、 所望のタンパク質抗原と対応する抗タンパク質抗血清との競合能、あるいは置換 能で定義される。 一般的にポリペプチト抗原の大きさは、それが同定された単数または複数のコ ア配列を有するに十分であれば、特に重要であるとは考えられない。本開示で予 測される有用な最小のコア配列は一般に長さで約８アミノ酸であり、１０〜２０ の配列がより好ましい。従って、このサイズは一般に本発明により調製される最 小のペプチド抗原に対応する。しかしながら、基本エピトープコア配列を含むか ぎり、抗原の長さは必要によりより長くても良い。 エピトープコア配列の同定は、例えば本明細書に参照により取り込まれ、疎水 性に基づいてアミノ酸配列からのエピトープの同定または調製を教示する米国特 許第４、５５４、１０１号に記載の通り当業者には公知である。さらに、タンパ ク質の抗原部予測用の多数のコンピュータープログラムが入手可能である（例え ばＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ、１９８８年；Ｗｏｌｆら、１９８８年参照） 。ペプチド配列解析コンピュータープロ 社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）も、本開示による合成ペプチドの設計に有用である 。 その配列内に抗原性エピトープを含むエピトープ配列、またはペプチドの合成 は、固相法等の従来の合成法を用いて（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａペプチド合成装置等の市販のペプチド合成装置により） 容易に行われる。この方法で合成されたペプチド抗原は所定の量に分注され、水 溶液中、より好ましくは粉末または凍結乾燥保存用として通常の方法で保管され る。 一般的に、ペプチドが比較的安定であるため、必要あれば水溶液でかなり長期 間、例えば６ヶ月以上、変性または抗原活性を失うことなく実質的にどのような 水溶液中でも容易に保存できる。しかしながら水溶液で長期間保存を行う場合は 、ｐＨを約７．０〜７．５に保つためトリスまたは燐酸塩緩衝液等の緩衝液を含 む試薬を加えることが一般に望ましい。さらに、ナトリウムアジドまたはメルチ オレート等の微生物の成長を阻害する試薬を加えることが望ましい。水溶液で長 期間保存するためには、溶液を約４℃で、より好ましくは凍結して保存すること が望ましい。もちろん、ペプチドを凍結乾燥または粉末状態で 保存する場合は実質的に無限に保存でき、使用前に所定の水（好ましくは蒸留水 ）または緩衝液を秤量した分注物で再度水和する。 ２．１１ 生物学的機能的等価物 本発明のペプチドの構造、もしくはそれをコードするＤＮＡ配列の修飾または 変更を行っても良く、後者の場合、所望の特製を有するタンパク質をコードする 機能性分子を得ることができる。タンパク質のアミノ酸を変更し等価な、もしく はより改善された第二世代の分子を製作することに関して、以下に議論する。本 発明の特定の実施形態において、突然変異した結晶性タンパク質はタンパク質の 殺虫活性を増大するのに有用であり、従って殺虫活性及び／又は植物細胞中での 組み替え導入遺伝子の発現を増加すると考えられる。アミノ酸の変化は表２に示 すコドンによるＤＮＡ配列のコドンを変更して行われる。 例えば、抗体の抗原結合領域、または基質分子上の結合部位等の構造との相互 作用結合能をほとんど失わず、タンパク質構造中であるアミノ酸を他のアミノ酸 に置換し得る。タンパク質の生化学機能を決定するのはタンパク質の相互作用能 と性質であるので、タンパク質配列においてあるアミノ酸配列 − 当然その下 に有るＤＮＡコード配列 − の置換を行い、かつ類似の性質のタンパク質を得 ることができる。その生物学的有用性または活性をほとんど失わず、開示された 組成を有するペプチド配列、またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配 列に様々な変更を加えることができると本発明者らは考えた。 この様な変更を行う場合、アミノ酸の水和性インデックスを考慮しなければな らない。タンパク質に相互作用生物活性を与える水和性アミノ酸インデックスの 重要性は、文献（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｅ、１９８２年、本明細書に参照 される）中で一般的に理解されている。アミノ酸の相対的疎水性は得られるタン パク質の２次構造に寄与し、一方でタンパク質の他の分子、例えば酵素、基質、 レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を決めるることが認められてい る。 疎水性と荷電特性に基づいて個々のアミノ酸に水和性インデ ックスが割り当てられる（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｅ、１９８２年）。これ らの値はイソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８ ）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチ オニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニ ン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン （−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸 塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、ア スパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、アルギニン（−４．５）である 。 あるアミノ酸を類似の水和性インデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸 で置換し、しかも類似の生物活性を有するタンパク質が得られる、即ち生物学的 に等価な機能が得られることは公知である。この様な変更を行う場合、水和性指 数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸が特に好ま しく、±．５以内のアミノ酸がさらに好ましい。 類似のアミノ酸の置換は水和性に基づいて行ない得ることは、当業界に公知で ある。本明細書に引用される米国特許第 ４、５５４、１０１号には、隣接アミノ酸の親水性に支配される、タンパク質の 最大局所平均親水性はタンパク質の生物学的性質と相関することが記載されてい る。 米国特許第４、５５４、１０１号に詳細に述べられる様に、以下の親水性値が アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３． ０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）、グルタミン酸塩（＋３．０±１）； セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グ リシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン （−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−０．１）；メチオニン （−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．９）；イソロイシン（− １．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトフ ァン（−３．４）。 アミノ酸を類似の親水性値を有する他のアミノ酸で置換し、かつ生物的に等価 な、特に免疫学的に等価なタンパク質が得られることは理解されている。この様 な変更では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のもの が特に好ましく、±０．５以内のものがさらに好ましい。 上記に概説した通り、アミノ酸置換は一般的にアミノ酸側鎖置換基の類似性、 例えばその疎水性、親水性、荷電、サイズ等に基づいている。上記の様々な特性 を考慮する代表的な置換は当業者に公知であり、アルギニンとリジン；グルタミ ン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン； およびロイシンとイソロイシンが含まれる。 ２．１２ 殺虫剤としての結晶性タンパク質組成物と使用法 本発明者らは、本明細書に開示される結晶性タンパク質組成は畑作、牧草、果 実および野菜、および鑑賞用植物に対する殺虫剤としての局所的及び／又は全体 的用途に有用であると考えている。好ましい実施形態では、生物殺虫剤組成物は 本明細書に開示する新規結晶性タンパク質を発現するバクテリア細胞のオイル流 動性懸濁液を包含する。細胞はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＥＧ１０３２ ７細胞であるであることが好ましいが、本明細書に開示され、結晶性タンパク質 を産生するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ等のこ の様などのバクテリア宿主細胞も有用であると考えられる。 他の重要な実施形態では、生物殺虫剤組成物は水分散性顆粒体を包含する。顆 粒体は本明細書で開示される新規結晶性タンパク質を発現するバクテリア細胞を 包含する。好ましいバクテリア細胞はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＥＧ１ ０３２７細胞であるが、本明細書で開示するＤＮＡ配列で形質転換され、結晶性 タンパク質を発現するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉ ｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓ ｐｐ等のバクテリアも有用と考えられる。 ３番目の重要な実施形態において、生物殺虫剤組成物は可湿性粉末、微粉、ペ レット、またはコロイド状濃縮液を包含する。この粉末は本明細書で開示される 新規結晶性タンパク質を発現するバクテリア細胞を包含する。好ましいバクテリ ア細胞はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＥＧ１０３２７細胞であるが、本明 細書で開示するＤＮＡ配列で形質転換され、結晶性タンパク質を発現するＢ．ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ等のバクテリアも有用と 考えられる。この様な乾燥した形の殺虫剤組成物は 水に加えると即座に溶解するように調合されるか、または制御放出、持続放出ま たはその他の時間依存法で調合される。 ４番目の重要な実施形態では、生物殺虫剤組成物は上記の結晶性タンパク質を 発現するバクテリア細胞の水懸濁液を包含する。このような水懸濁液は使用前に 希釈される濃縮液保存液、または即座に使用できる希釈液として提供される。 バクテリア細胞の応用に関するこれれの方法では、結晶性タンパク質遺伝子を 含む細胞宿主はどのような通常の栄養培地でも生長でき、ＤＮＡ構築により選択 の利点が与えられ、ほとんどすべて、またはすべての細胞はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ遺伝子を保持する。これらの細胞は通常の方法で収穫されるか、細 胞を収穫まえに処理することができる。 殺虫剤組成物が関心のあるタンパク質を発現する未変性のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ細胞を包含する場合、この様なバクテリアを様々な方法で調合する ことができる。それらは可湿性粉末、顆粒または微粉であり、無機鉱物（フィロ シリケート、カーボネート、サルフェート、ホスフェート等）の様々な不活性物 質、または植物性材料（粉末トウモロコシ穂軸、モミ殻、クルミの殻等）を混ぜ ることができる。調合にはスプレ ッダー・スティッカーアジュバント、安定剤、他の殺虫性添加剤または界面活性 剤等を含んでいてもよい。液体調合物は水系または非水系であり、発泡体、懸濁 液、乳化濃縮液液として用いられる。成分にはレオロジー剤、界面活性剤、乳化 剤、分散剤またはポリマーが含まれてもよい。 あるいは、新規ＣｒｙＥＴ３３及び／又はＣｒｙＥＴ３４タンパク質は未変性 または組み替えバクテリア発現系により生体外で調製され、その後単離して野外 散布に用いられる。この様なタンパク質は粗細胞溶解物、懸濁液、コロイド中で 使用、または活性差中組成物に調合する前に精製、成分調製、緩衝化及び／又は さらに加工することができる。同様に、ある状況では結晶性タンパク質を発現す るバクテリア培養物殻結晶及び／又は胞子を単離し、この様な結晶及び／又は胞 子の溶液、懸濁液またはコロイド調製物を活性生物殺虫剤組成物として使用する ことが望ましい。 使用法にかかわらず、活性成分の量は殺虫に有効な量が用いられ、それは例え ば制御すべき甲虫類昆虫の種、処置する植物または穀物の種、環境条件、および 殺虫活性組成物の散布法、速度および品質等の因子によって変化する。 本明細書に記載の殺虫剤組成物はバクテリア細胞、結晶及び／又は胞子懸濁液 、または所望の農業上許容されるキャリアを加えた単離タンパク質成分を調合し て作成される。組成物は透析、凍結乾燥、乾燥等の適当な手段で、食塩水または 他の緩衝液等の水溶性キャリア中に散布前に調合される。調合組成物は微粉また は顆粒物質、または油中件濁液(植物油または鉱物油)、または水または油／水エ マルジョンの形、または農業用途に適した他のキャリア材料との組み合せである 。適当な農業用キャリアは公知の土壌または液体である。「農業上許容されるキ ャリア」という用語は、殺虫剤調合技術で通常用いられる公知の不活性成分、分 散剤、界面活性剤、凝集剤、結合剤等のすべてのアジュバントを網羅する。これ らは殺虫剤調合技術の当業者に公知である。調合物は１種以上の固体または液体 アジュバントと混合することができ、通常の調合技術を用いて殺虫剤組成物を適 当なアジュバントと均一混合、ブレンド及び／又は摩砕することにより調製され る。 本発明の殺虫剤組成物は標的甲虫の環境、典型的には保護すべき植物または穀 物の葉の上に通常の方法、好ましくはスプレーにより散布される。殺虫剤散布の 強度と持続期間は処理すべ き害虫や穀物に特有の条件、および環境条件を考慮して設定される。キャリアに 対する活性成分の比率は殺虫組成物の化学的性質、溶解度および安定性の他、考 えられる特定の組成物に当然依存する。 微粉化、散布、浸漬、土壌注入、種子被覆、苗木被覆、スプレー、エアゾル化 、霧化、微粒子化等の他の散布技術も実施可能であり、根または茎に付く昆虫等 のある環境、または野菜または鑑賞用植物への散布では必要である。これらの散 布法はまた、当業者に公知である。 本発明の殺虫剤組成物は本発明の方法において、単体または他の殺虫剤を含む が、それらに制限されない他の化合物と組み合せて応用できる。本発明の方法は また界面活性剤、洗剤、ポリマーまたは徐放性調合物等のたの調剤と組み合せて 使用し得る。本殺虫剤組成物は全所的にあるいは局所的使用のために調合し得る 。 環境、全体またはホイル状散布に用いられる殺虫剤調合物の濃度は、特定の調 合物の性質、散布法、環境条件および殺虫活性の程度によって広い範囲で変わる 。典型的には、殺虫剤調合物は少なくとも約１重量％、および約９９重量％以下 で散布す る調合物中に存在する。組成物の乾燥調合物は約１重量％〜９９重量％以上であ り、液体調合物は一般に約重量％〜９９重量％以上の活性成分を含有する。未変 性バクテリア細胞壁を含む調合物は一般に約１０⁴〜１０⁷細胞／ｍｇを含む。 殺虫剤調合物を特定の植物または標的領域に一回以上散布して投与することが できるが、ヘクタール当たりの適当な散布割合は活性成分約５０ｇ〜５００ｇの 範囲であり、約５００ｇ〜１０００ｇ、または約１０００ｇ〜５０００ｇ以上で ある。 ３． 図面の簡単な説明 図面は本発明の特定の局面であり、本発明の特徴をさらに示すために提示され る。本明細書に示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合せて、これらの図 面を１つ以上参照することにより本発明はより理解される。 図１Ａ、図１Ｂおよび図１ＣはｃｒｙＥＴ３３遺伝子（配列番号１）、および ｃｒｙＥＴ３４遺伝子（配列番号２）のヌクレオチド塩基配列、およびＣｒｙＥ Ｔ３３タンパク質（配列番号３）およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質（配列番号４ ）の推定アミノ酸配列を示す。 図２はｐＥＧ２４６の制限地図を示す。ｃｒｙＥＴ３３遺伝子（配列番号１） 、およびｃｒｙＥＴ３４遺伝子（配列番号２）の位置と配向は矢印で示される。 ｐＥＧ２４６はｐＢＲ３２２由来でありアンピシリン耐性（Ａｍｐ^R）であるの で、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能を発揮する。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の記号 は以下の通りである：Ｒ＝ＥｃｏＲ１、Ｂ＝ＢａｍＨＩ。１キロ塩基（１ ｋｂ ）サイズのマーカーも図２に示される。 図２と並べられ同じスケールである図３はｐＥＧ１２４６の制限地図を示す。 ｃｒｙＥＴ３３遺伝子（配列番号１）、およびｃｒｙＥＴ３４遺伝子（配列番号 ２）の位置と配向は矢印で示される。ｐＥＧ１２４６はプラスミドｐＥＧ２４６ （図２）由来であり、ｐＥＧ２４６のＢａｍＨＩ部位に挿入されたＢａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｐｐプラスミドｐＮＮ１０１（クロラムフェニコール耐性［Ｃａｍ^R］ およびテトラサイクリン耐性［Ｔｅｔ^R］の双方を発現する）を含む。ｐＥＧ１ ２４６はＥ．ｃｏｌｉとＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ中で機能を発揮する。 略号は図２中のものと同じである。 ４． 実施形態の説明 ４．１ 本発明のいくつかの利点 B．thuringiensisＥＧ１０３２７は、メキシコワタミゾウムシ、赤色コクヌス ヒトモドキの幼虫（Tribolium castaneum）およびマメコガネの幼虫（Popillia japonica）を含む鞘翅類の昆虫に対して殺虫活性を示す天然株である。B．thuri ngiensisＥＧ２１５８は、ＥＧ１０３２７の結晶タンパク質遺伝子と同様なまた は同一の鞘翅類に対して毒性の結晶タンパク質遺伝子を含んでいる。ｃｒｙＥＴ ３３およびｃｒｙＥＴ３４と表す２つの新規な結晶毒素遺伝子はＥＧ２１５８か らクローニングした。ｃｒｙＥＴ３３遺伝子は２９ｋＤａのＣｒｙＥＴ３３結晶 タンパク質をコードし、ｃｒｙＥＴ３４遺伝子は１４ｋＤａのＣｒｙＥＴ３４結 晶タンパク質をコードする。ＣｒｙＥＴ３３結晶タンパク質およびＣｒｙＥＴ３ ４結晶タンパク質は、赤色コクヌスヒトモドキの幼虫、メキシコワタミゾウムシ の幼虫およびマメコガネの幼虫に対して毒性である。 ４．２ 定義 以下の用語および句は以下の意味を有する。 発現：ポリペプチドを産生するため構造遺伝子などのコーデ ィングＤＮＡ分子により実施される転写および翻訳を含む細胞内プロセスの組合 せ。 プロモーター：構造遺伝子のための発現調整因子を提供し、ＲＮＡポリメラー ゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始するＤＮＡ配列ま たはＤＮＡ配列群の識別部位。 再生：植物細胞（例えば、植物のプロトプラストまたはエクスプラスト）から 植物を生長させる過程。 構造遺伝子：ポリペプチドを産生するために発現される遺伝子。 形質転換：外来ＤＮＡ配列（例えば、ベクター、組換え体ＤＮＡ分子）を、そ の外来ＤＮＡをその染色体に取り込むまたはその外来ＤＮＡがそこで自己複製で きる細胞またはプロトプラストに導入する過程。 形質転換細胞：細胞に外来ＤＮＡ分子を導入することによりそのＤＮＡがすで に変化している細胞。 トランスジェニック細胞：形質転換細胞に由来するもしくは形質転換細胞から 再生されたまたはトランスジェニック細胞に由来するすべての細胞。典型的なト ランスジェニック細胞には、 形質転換した植物細胞およびトランスジェニック植物から得た葉、根、茎などの 特別な細胞、例えば体細胞または生殖（肝）細胞に由来する植物カルスが含まれ る。 トランスジェニック植物：形質転換した植物細胞またはプロトプラスト由来の 植物またはその子孫であって、植物ＤＮＡが、同じ種の天然の非トランスジェニ ック植物には本来存在しない、導入した外来ＤＮＡ分子を含有している植物又は その子孫。「トランスジェニック植物」および「形質転換植物」という用語は、 当技術分野で、そのＤＮＡが外来ＤＮＡ分子を含有する植物を定義する同義語と して使用されることもある。しかし、形質転換植物細胞から得た再生成植物また はカルスをトランスジェニック植物と呼ぶほうが科学的により正確であると思わ れるため、本明細書以下ではそのように使用する。 ベクター：宿主細胞中で複製できるＤＮＡ分子および／または別のＤＮＡセグ メントを機能的に結合して、結合したセグメントを複製させることができるＤＮ Ａ分子。プラスミドがベクターの例示である。 ４．３ プローブおよびプライマー 別の態様では、本発明により提供されたＤＮＡ配列情報によ り、本明細書で開示の選択したポリヌクレオチドの遺伝子配列に特異的にハイブ リダイズできる比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列を調製できる。これらの 態様では、選択した結晶タンパク質遺伝子配列、例えば配列番号１または配列番 号２で示される配列などを考慮して、適当な長さの核酸プローブを調製する。こ のようなＤＮＡおよび核酸プローブは、結晶タンパク質をコードする遺伝子配列 と特異的にハイブリダイズできるため、種々の実施形態で特に有用である。非常 に重要なことに、このプローブは所与のサンプル中の相補配列の存在を検出する ための種々のアッセイに使用できる。 ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを使用すると有利である。 このようなプライマーの配列は本発明のポリヌクレオチドを使用して設計され、 ＰＣＲ^TM技術を使用して、B．thuringiensisの結晶タンパク質遺伝子の規定のセ グメントの検出、増幅または突然変異に使用する。他の種からの関連した結晶タ ンパク質遺伝子のセグメントも、このようなプライマーを使用してＰＣＲ^TMで増 幅することができる。 本発明のある種の利点を得るための、ハイブリダイゼーション研究またはアッ セイで使用する好ましい核酸配列には、配列 番号１または配列番号２で示されるような結晶タンパク質をコードする配列の１ ４から約３０の長さのヌクレオチド範囲の少なくとも１つに相補的な配列が含ま れる。少なくとも１４ヌクレオチド長のサイズは、その断片が安定で、かつ選択 的な２本鎖分子を形成するのに十分な長さを確実に得るのに役立つ。しかし、ハ イブリッドの安定性および選択性を高め、その結果、得られた特異的なハイブリ ッド分子の質および程度を改善するためには、１４塩基長を超える範囲にわたる 相補配列を有する分子が一般に好ましい。一般に、１４から２０ヌクレオチド長 の遺伝子相補範囲を有する核酸分子、または、所望であれば、さらに長い核酸分 子を設計することが好ましい。このような断片は、例えば、化学的手段で断片を 直接合成することにより、参考として本明細書に含む米国特許第４，６８３，１ ９５号および第４，６８３，２０２号のＰＣＲ^TM技術などの核酸複製技術の適用 により、または、適当な挿入物および好適な制限部位を含む組換え体プラスミド から選択したＤＮＡ断片を切り取ることにより、容易に調製できる。 ４．４ 発現ベクター 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを 企図する。従って、１つの実施形態では、発現ベクターは、本発明のポリペプチ ドをコードするコーディング領域に機能的に結合するプロモーターを含む単離精 製されたＤＮＡ分子であり、このコーディング領域は転写終結領域に機能的に結 合しており、従って、このプロモーターはコーディング領域の転写を推進する。 本明細書では、「機能的に結合する」という用語は、プロモーターが、コーデ ィング領域の転写を調節および調整するように、コーディング領域に結合するこ とを意味する。プロモーターをコーディング領域に機能的に結合する手段は当業 界でよく知られている。 好ましい実施形態では、本発明の結晶タンパク質をコードするＤＮＡの組換え 体の発現はバチルス属（Bacillus）の宿主細胞で実施するのが好ましい。好まし い宿主細胞には、B．thuringiensis、B．megaterium、枯草菌（B．subtilis）お よび関連の桿菌が含まれ、B．thuringiensisの宿主細胞が非常に好ましい。細菌 中で機能するプロモーターは当技術分野でよく知られている。桿菌の結晶タンパ ク質のための例示の好ましいプロモーターには、ｃｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥ Ｔ３４遺伝子 プロモーターを含む公知の結晶タンパク質遺伝子プロモーターがすべて含まれる 。また、突然変異したまたは組換えした結晶タンパク質をコードする遺伝子のプ ロモーターも手動式にエンジニアリングし、本明細書に開示の新規な遺伝子セグ メントの発現を促進するのに使用できる。 別の実施形態では、本発明の結晶タンパク質をコードするＤＮＡの組換え体発 現は、形質転換した、大腸菌（E．coli）またはシュードモナス属などのグラム 陰性菌の宿主細胞を使用して実施する。大腸菌および他のグラム陰性菌宿主細胞 で標的ポリペプチドを高レベルに発現する機能を有するプロモーターも、当技術 分野でよく知られている。 本発明の発現ベクターを植物の形質転換に使用する場合、植物中で発現を推進 できるプロモーターを選択する。植物中で機能するプロモーターも当技術分野で よく知られている。植物中でポリペプチドを発現するのに有用なプロモーターは 、既述の誘導的プロモーター、ウィルスプロモーター、合成プロモーター、構成 的プロモーター（Poszkowski他、１９８９、Odell他、１９８５）および一時的 に調節されたプロモーター、空間的に調節されたプロモーターおよび空間的に一 時的に調節されたプ ロモーター（Chau他、１９８９）である。 プロモーターは、形質転換植物細胞またはトランスジェニック植物の転写活性 をコーディング領域に向ける能力についても選択する。構造遺伝子は、植物組織 の種々のプロモーターで推進することができる。プロモーターは、ＣａＭＶ３５ Ｓプロモーターなどのようにほぼ構成的であっても、ダイコット（ｄｉｃｏｔ） またはモノコット（ｍｏｎｏｃｏｔ）に影響を与える組織特異的または発達的に 特異的なプロモーターであってもよい。 プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓなどのほぼ構成的なプロモーターである場合に は、種々の形質転換植物組織（例えば、カルス、葉、種子および根）でポリペプ チド発現の増加が認められる。また、組織特異性プロモーターを含むベクターを 組み込んだ植物を使用することにより、形質転換の作用を特定の植物組織に向け ることができる。 典型的な組織特異性プロモーターは、レクチンプロモーターであり、これは種 子組織に特異的である。大豆種子中のレクチンタンパク質は、種子の成熟の間に のみ発現され、全種子ｍＲＮＡの約２％から約５％を占める１つの遺伝子（Ｌｅ ｌ ）でコ ードされる。レクチン遺伝子および種子特異性プロモーターは十分特性が決めら れており、トランスジェニックタバコ植物における種子特異性発現のために使用 されている（Vodkin他、１９８３、Lindstrom他、１９９０）。 当該ポリペプチドをコードするコーディング領域を含む発現ベクターはレクチ ンプロモーターで制御されるようにエンジニアリングされ、このベクターは、例 えばプロトプラスト形質転換法（Dhir他、１９９１）を使用して植物に導入する 。このポリペプチドの発現はトランスジェニック植物の種子に特異的に向けられ る。 組織特異性プロモーターを使用して形質転換した植物細胞から得られた本発明 のトランスジェニック植物は、別の組織特異性プロモーターで形質転換した植物 細胞から発生した２つ目のトランスジェニック植物と交配させて、１つより多く の特定の組織で形質転換の作用が示されるハイブリッドのトランスジェニック植 物を得ることができる。 典型的な組織特異性プロモーターには、トウモロコシ蔗糖合成酵素１（Yang他 、１９９０）、トウモロコシアルコール脱水素酵素１（Vogel他、１９８９）、 トウモロコシ光採取複合体 （Simpson、１９８６）、トウモロコシ熱ショックタンパク質（Odell他、１９８ ５）、エンドウ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Poulsen他、１９８ ６、Cashmore他、１９８３）、Ｔｉプラスミドマンノピンシンターゼ（Langridg e他、１９８９）、Ｔｉプラスミドノパリンシンターゼ（Langridge他、１９８９ ）、ぺチュニアカルコンイソメラーゼ（Van Tunen他、１９８８）、ビーン高グ リシンタンパク質１（Keller他、１９８９）、ＣａＭＶ３５ｓ転写体（Odell他 、１９８５）および馬鈴薯パタチン（Wenzler他、１９８９）がある。好ましい プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモータ ーおよびＳ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーターである 。 どの発現ベクターを、最終的にどのプロモーターにポリペプチドコーディング 領域を機能的に結合させるかの選択は、所望の機能特性、例えば、タンパク質発 現の場所と時間および形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。これらは、組換 え体ＤＮＡ分子を構築する技術分野に固有の、よく知られている限定要因である 。しかし、本発明の実施に有用なベクターは、ポリペプチドコーディング領域の 発現を、機能的に結合したところに 向けることができる。 より高級な植物での遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは当技術分野でよ く知られており、（Rogers他、１９８７）に記載のAgrobacterium tumefaciens の腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド由来のベクターが含まれる。しかし、他の数種の 植物組み込みベクター系が植物中で機能することが知られており、これには、ｐ ＣａＭＶＣＮトランスファー制御ベクター（Fromm他、１９８５）が含まれる。 プラスミドｐＣａＭＶＣＮ(ニュージャージー州、Piscataway、Pharmaciaから入 手できる)はカリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含ん でいる。 好ましい実施形態では、ポリペプチドの発現に使用するベクターが、植物細胞 中で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含んでいる。１つ の好ましい薬剤耐性マーカーは、発現されることによりカナマイシン耐性が生じ る遺伝子、すなわち、(Rogers他、１９８８)に記載のノパリンシンターゼプロモ ーター、Ｔｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）およ びノパリンシンターゼ３’非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。 ＲＮＡポリメラーゼはポリアデニル化が起こっている部位を介してコードＤＮ Ａ配列を転写する。一般に、ポリアデニル化部位の２００から３００塩基対下流 に位置するＤＮＡ配列が転写を終結させる。これらのＤＮＡ配列を本明細書では 転写終結領域と呼ぶ。これらの領域は転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ Ａ）の効率的なポリアデニル化に必要である。 発現ベクターを調製する手段は当技術分野でよく知られている。植物を形質転 換するために使用する発現（形質転換ベクター）およびこれらのベクターを作製 する方法は、米国特許第４，９７１，９０８号、第４，９４０，８３５号、第４ ，７６９，０６１号および第４，７５７，０１１号に記載されており、これらの 開示は参考として本明細書に含むものとする。本発明により、これらのベクター を修飾して、コード配列を含むようにすることができる。 相補的な粘着末端または平滑末端を介してＤＮＡをベクターに機能的に結合す る種々の方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマートラクトを、挿 入すべきＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに加えることができる。次いで 、相補的なホモポリマーテールの間の水素結合を介してベクターとＤＮ Ａセグメントを結合させて、組換えＤＮＡ分子を生成する。 細胞に殺虫活性を付与することができるポリペプチドをコードするコード領域 は、好ましくはＣｒｙＥＴ３３またはＣｒｙＥＴ３４のB．thuringiensis結晶タ ンパク質コード遺伝子である。好ましい実施形態では、このようなポリペプチド は、配列番号３または配列番号４のアミノ酸残基配列またはこれらの配列と機能 的に同等な配列を有する。このような実施形態によると、配列番号１のＤＮＡ配 列または配列番号２のＤＮＡ配列を含むコード領域も好ましい。 ４．５ 新規結晶タンパク質の特性付け 本発明は、B．thuringiensisのＣｒｙＥＴ３３またはＣｒｙＥＴ３４結晶タン パク質の全体または一部を規定する新規のポリペプチドを提供する。 好ましい実施形態では、本発明は、単離し、精製したＣｒｙＥＴ３３タンパク 質を開示し、請求項に記載する。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質は、２６７アミノ酸 の配列を含み、計算分子質量２９，２１６Ｄａを有する。ＣｒｙＥＴ３３の計算 当電点（ｐＩ）は４．７８である。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質のアミノ酸組成を 表３に示す。 別の実施形態では、本発明は、単離し、精製したＣｒｙＥＴ３４タンパク質を 開示し、請求項に記載する。ＣｒｙＥＴ３４タンパク質は、１２６アミノ酸の配 列を含み、計算分子質量 １４，１８２Ｄａを有する。ＣｒｙＥＴ３４の計算当電点（ｐＩ）は４．２６で ある。ＣｒｙＥＴ３４タンパク質のアミノ酸組成を表４に示す。４．６ 新規タンパク質の命名法 本発明者らは、本発明の新規タンパク質に任意にＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙ ＥＴ３４の名称を割り当てた。同様に、ｃｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４と いう任意の名称を、これらのポリペプチドをコードする新規核酸配列に各々割り 当てた。結晶タンパク質エンドトキシンの改訂された命名法（表１）に基づく正 式な遺伝子およびタンパク質の名称は、B．thuringiensis結晶タンパク質を系統 的に分類するために形成されたB．thuringiensis命名法委員会により割り当てら れるであろう。本発明者らは、本発明の任意に割り当てた名称が、これらの配列 に対し正式に割り当てられた名称で置き換えられることを企図している。 ４．７ 形質転換した宿主細胞およびトランスジェニック植物 細菌、酵母細胞、植物細胞および植物全体を、結晶タンパク質をコードする遺 伝子のセグメントを含む１つまたは複数の発現ベクターで形質転換するための方 法および組成物が本開示の別の態様である。このような形質転換プロセスで得ら れたトランスジェニックな細菌、酵母細胞、植物細胞または植物あるいはこれら のトランスジェニック植物の子孫および種子も本発明 の別の実施形態である。 細菌および酵母細胞を形質転換する手段は当技術分野でよく知られている。一 般に、形質転換手段は、大腸菌またはSaccharomyces cerevisiaeなどの他の細菌 または酵母の形質転換に使用されるよく知られている手段と同様てある。植物細 胞のＤＮＡ形質転換の方法には、Agrobacteriumを介した植物形質転換、プロト プラスト形質転換、花粉への遺伝子トランスファー、生殖器官への注入、未熟胚 への注入および流体ボンバードがある。これらの方法はそれぞれ明確な利点と欠 点を有している。従って、遺伝子を特定の植物種に導入する１つの特定の方法は 、別の植物種では必ずしも最も有効ではないことがあるが、特定の植物種にどの 方法が有用であるかはよく知られている。 形質転換ＤＮＡセグメントを細胞に導入する方法は多数あるが、すべてが植物 細胞にＤＮＡを分配するのに適しているわけではない。好適な方法には、例えば Agrobacterium感染、例えばプロトプラストのＰＥＧを介した形質転換(Omirulle h他、１９９３)によるＤＮＡの直接分配、乾燥／阻害を介したＤＮＡ取り込み、 電気穿孔、炭化珪素線維と共に撹拌、ＤＮＡ被覆粒 子のアクセリレーション等によるＤＮＡを細胞内に導入できる事実上すべての方 法が含まれるものと考えられる。ある種の実施形態では、アクセリレーション法 が好ましく、この方法には、例えば、マイクロプロジェクティブルボンバード等 が含まれる。 ＤＮＡを細胞に導入する技術は当業者にはよく知られている。遺伝子を細胞に 分配する４つの一般的な方法：（１）化学的方法(Grahamおよびvan der Eb、１ ９７３、Zatloukal他、１９９２）、（２）マイクロインジェクション（Capecch i、１９８０）、電子穿孔（WongおよびNeumann、１９８２、Fromm他、１９８５ 、米国特許第５，３８４，２５３号）および遺伝子銃（gene gun）(Johnstonお よびTang、１９９４、Fynan他、１９９３)等の物理的方法、（３）ウィルスベク ター（Clapp、１９９３、Lu他、１９９３、EglitisおよびAnderson、１９８８ａ 、１９８８ｂ）および（４）受容体を介した機構（Curiel他、１９９１、Wagner 他、１９９２）が記載されている。 ４．７．１ 電気穿孔法 種々の動物および植物細胞に短時間高電圧電気パルスをかけると、原形質膜に ナノメーターレベルの孔が形成される。これらの孔を通して、またはこれらの孔 を閉鎖する膜成分の再分配 の結果として、細胞の細胞質にＤＮＡを直接導入する。電気穿孔法は非常に効率 的でありえ、クローン遺伝子の一過性発現および当該遺伝子の組み込みコピーを 有する細胞系の樹立の両者に使用できる。リン酸カルシウムを介したトランスフ ェクションやプロトプラスト融合とは異なり、電気穿孔法では、１つまたは最も 多くても２〜３個の外来ＤＮＡの組み込みコピーを有する細胞系が得られること が多い。 電気穿孔法でＤＮＡを導入することは当業者にはよく知られている。この方法 では、未処理細胞と比べ、ペクチン分解酵素などのある種の細胞壁分解酵素を使 用することにより、標的のレシピエント細胞を電気穿孔法による形質転換をより 受けやすくする。また、レシピエント細胞は、機械的に傷つけることにより形質 転換をより受けやすくなる。電気穿孔により形質転換を実施するには、細胞の縣 濁培養物、肝形成カルスなどのもろい組織を使用するか、あるいは、未熟な肝ま たは他の組織化された組織を直接形質転換することができる。選択した細胞をペ クチン分解酵素（ペクトロラーゼ）に暴露するまたは調整された方法で機械的に 傷つけることによりこれらの細胞の細胞壁を部分的に分解する。次いで、このよ うな細胞は、電気穿孔によ るＤＮＡトランスファーのレシピエントとなり、電気穿孔はこの段階で実施する ことができる。次いで、新しく導入したＤＮＡの性質に応じた適切な選択または スクリーニングプロトコールにより、形質転換細胞を同定する。 ４．７．２ マイクロプロジェクティルボンバード 形質転換ＤＮＡセグメントを植物細胞に分配する別の有利な方法は、マイクロ プロジェクティルボンバードである。この方法では、粒子を核酸で被覆し、推進 力で細胞内に分配する。典型的な粒子には、タングステン、金、白金等からなる ものが含まれる。 マイクロプロジェクティルボンバードの利点は、再現性を持ってモノコットを 安定に形質転換するのに有効な手段であると共に、プロトプラストを単離する必 要がない（Cristou他、１９８８）だけではなく、Agrobacterium感染を受けやす い必要もない。アクセラレーションによりＤＮＡをトウモロコシ細胞に分配する 方法の説明的実施形態は、バイオリスティック粒子分配系（Biolistics Particl e Delivery System）であり、これはＤＮＡまたは細胞で被覆した粒子を、ステ ンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンなどのスクリーンを介して、縣濁液中で 培養したトウモロコシ細胞で覆ったフィルタ表面上に向けて推進するのに使用す ることができる。スクリーンは粒子を分散させるため、粒子はは大きな凝集体と してレシピエント細胞に分配されることはない。発射装置とボンバードされる細 胞との間を隔てるスクリーンにより、推進される凝集体の大きさが小さくなり、 大きすぎる推進物によりレシピエント細胞に生じる損傷が減少することにより、 形質転換頻度の上昇に寄与する可能性があると考えられている。 ボンバードでは、縣濁液中の細胞をフィルタまたは固体培地上で濃縮すること が好ましい。また、未熟な胚または他の標的細胞を固体培地上に配置することも できる。ボンバードすべき細胞をマクロプロジェクティル停止プレートの下に適 当な間隔を開けて置く。所望に応じて、１つまたは複数のスクリーンをアクセラ レーション装置とボンバードすべき細胞との間にも置く。本明細書に記載の技法 を使用することにより、マーカー遺伝子を一過性に発現する細胞の巣（focus） を１０００個以上得ることができる。１つの巣で、ボンバード後４８時間に外来 遺伝子産物を発現する細胞の数は、１〜１０個、平均１〜３個であることが多い 。 ボンバードによる形質転換では、ボンバード前の培養条件や、ボンバードのパ ラメータを最適化することにより、安定な形質転換体の数を最大にすることがで きる。ボンバードの物理パラメータおよび生物学的パラメータがこの技術に重要 である。物理的因子は、ＤＮＡ／マイクロプロジェクティルの沈殿の操作に関係 する因子またはマクロプロジェクティルまたはマイクロプロジェクティルの飛行 および速度に影響する因子である。生物学的因子には、ボンバード前または直後 の細胞操作に関するすべてのステップ、ボンバードに関連する外傷を緩和するの に役立つ標的細胞の浸透圧の調整、線状ＤＮＡまたは完全なスーパーコイル状プ ラスミドなどの形質転換ＤＮＡの性質が含まれる。未熟な胚の形質転換の成功に は、ボンバード前の操作が特に重要であると考えられている。 従って、小規模の試験でボンバードの種々のパラメータを調整して、条件を最 適化することを望むものと企図される。特に、間隙距離、飛行距離、組織距離、 ヘリウム圧などの物理的パラメータの調整が特に望まれる可能性がある。レシピ エント細胞の生理学的条件に影響を与え、その結果、形質転換および組み込み効 率に影響する可能性のある条件を変更することにより外 傷減少因子（ＴＲＦ）を最小化することができる。例えば、形質転換を最適なも のにするために、浸透圧状態、組織の水分状態、レシピエント細胞の継代培養の 段階または細胞周期を調節することができる。本発明の開示を考慮して、当業者 には他の日常的な調整の実施は明らかであろう。 ４．７．３ Agrobacteriumを介したトランスファー Agrobacteriumを介したトランスファーは、植物細胞に遺伝子を導入するため に広く利用できる系である。それは、ＤＮＡを植物組織全体に導入することがで き、そのため、プロトプラストから完全な植物を再生する必要がなくなるからで ある。Agrobacteriumを介して植物に組み込むためのベクターを使用して、ＤＮ Ａを植物細胞に導入することは当技術分野でよく知られている。例えば、（Fral ey他、１９８５、Rogers他、１９８７）に記載の方法を参照のこと。また、Ｔｉ −ＤＮＡの組み込みは比較的精密なプロセスであり、再配列はほとんど起こらな い。トランスファーすべきＤＮＡの領域を、ボーダー配列で規定し、（Spielman n他、１９８６、Jorgensen他、１９８７）に記載のように、通常、介在ＤＮＡを 植物ゲノムに挿入する。 最近のAgrobacterium形質転換ベクターはAgrobacteriumと 同様に大腸菌も複製できるため、（Klee他、１９８５）に記載のように、簡便な 手法となりうる。さらに、Agrobacteriumを介した遺伝子トランスファーのため のベクターの最近の技術の進歩により、遺伝子の配列およびベクターの制限部位 が改善され、種々のポリペプチドをコードする遺伝子を発現することのできるベ クターの構築が促進された。（Rogers他、１９８７）に記載のベクターは、挿入 されたポリペプチドをコードする遺伝子を直接発現するためのプロモーターおよ びポリアデニル化部位に隣接した簡便なマルチリンカー領域を有しており、本発 明の目的に適している。さらに、アームのあるＴｉ遺伝子とアームのないＴｉ遺 伝子の両者を有するAgrobacteriumを形質転換に使用することができる。Agrobac teriumを介した形質転換が効率的であるこれらの植物種では、遺伝子トランスフ ァーが容易で、その性質が画定されているため、この方法が第１選択である。 葉の円盤状組織および子葉および胚軸などの他の組織のAgrobacteriumを介し た形質転換は、天然でAgrobacteriumが感染する植物に限定されるようである。A grobacteriumを介した形質転換は双子葉植物で最も効率的である。ほとんどのモ ノ コットはAgrobacteriumの天然の宿主ではないように思われるが、(Bytebier他、 １９８７)に記載のAgrobacteriumベクターを使用してアスパラガスでトランスジ ェニック植物を得ている。従って、コメ、トウモロコシ、コムギなどの商業上重 要な穀物は通常別の方法で形質転換する必要がある。しかし、上記のように、Ag robacteriumを使用したアスパラガスの形質転換を実施することもできる（例え ば、Bytebier他、参照）。 Agrobacterium形質転換法を使用して形成したトランスジェニック植物は一般 に、１つの染色体上に１つの遺伝子を有している。このようなトランスジェニッ ク植物は、添加した遺伝子についてヘテロ接合性があるとすることができる。し かし、「ヘテロ接合性」という用語が一般に、一対の染色体の２番目の染色体の 同じ場所に相補的な遺伝子があることを意味し、ここで加えた１つの遺伝子を含 む植物中にこのような遺伝子がないため、このような植物のより正確な名称は、 独立分離体（segregant）であると考えられている。これは、加えた外来遺伝子 は有糸分裂および成熟分裂の間に独立して分離されるからである。 加えた構造遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニック 植物、すなわち、２つの添加した遺伝子を含み、１つの遺伝子が染色体対の各染 色体の同じ部位にあるトランスジェニック植物がより好ましい。１つの添加した 遺伝子を有する独立した分離体トランスジェニック植物を有性交配（自家受粉） させ、生成された種子の一部を発芽させ、得られた植物のカルボキシラーゼ活性 の上昇を対照（元の、非トランスジェニックな植物）または独立分離体トランス ジェニック植物と比較して分析することにより、ホモ接合性のトランスジェニッ ク植物を得ることができる。 ２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、添加した２つの独立した分 離体の外来遺伝子を含む子孫を得ることもできるものと理解されたい。適当な子 孫を自家受粉させることにより、添加した当該ポリペプチドをコードする外来遺 伝子の両方に対してホモ接合性の植物を得ることができる。親植物と戻し交配す ることおよび非トランスジェニック植物と外部交配させることも企図する。 ４．７．４ その他の形質転換方法 植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレング リコール処理、電子穿孔法およびこれらの処理 の組合せに基づく方法を使用して実施できる（例えば、potrykus他、１９８５,L orz他、１９８５、Fromm他、１９８６、Uchimiya他、１９８６、Callis他、１９ ８７、Marcotte他、１９８８参照)。 種々の植物種へのこれらの系の使用は、プロトプラストからその特定の植物種 が再生できる能力に依存する。プロトプラストから穀物を再生する説明的方法が 記載されている（Fujimura他、１９８５、Toriyamaほか、１９８６，Yamadaほか 、１９８６、Abdullah他、１９８６）。 プロトプラストからの再生に成功しない植物種を形質転換するためには、完全 な細胞または組織にＤＮＡを導入する別な方法を利用できる。たとえば、未熟な 胚またはエクスプラントからの穀物の再生は（Vasil、１９８８）に記載のよう に実施できる。さらに、「粒子銃」または高速マイクロプロジェクティル技術も 使用できる（Vasil、１９９２）。 後者の技術を使用すると、（Klein他、１９８７、Klein他、１９８８，McCabe 他、１９８８）に記載のように、小さな金属粒子表面上で、ＤＮＡは細胞壁を経 て、細胞内に運搬される。金属粒子は細胞の数層を通して浸透し、組織エキスプ ラント内 で細胞を形質転換することができる。 ４．８ 昆虫耐性トランスジェニック植物を作成するための方法 植物細胞などの適切な宿主細胞を、組換えｃｒｙＥＴ３３および／またはｃｒ ｙＥＴ３４遺伝子含有セグメントで形質転換することによって、コードされた結 晶タンパク質（即ち甲虫に対する殺虫活性を有する細菌性結晶タンパク質または ポリペプチド）が発現して昆虫耐性植物を形成することができる。 例を挙げると、B.thuringiensis結晶タンパク質用コード領域と、適切な選択 可能なマーカーとを含有する発現ベクターを利用することができ、マイクロプロ ジェクティルで被覆したＤＮＡを受容細胞に到達させる粒子ボンバード（Maddoc k他、１９９１年；Vasil他、１９９２年）などの方法を用いて、小麦またはトウ モロコシ細胞などの有肝植物細胞の懸濁液を形質転換することができる。次に、 殺虫性タンパク質を発現させる形質転換した有肝カリから、トランスジェニック 植物を再生する。 トランスジェニック植物の形成は、Agrobacteriumで媒介されるＤＮＡ形質変 換（Fraley他、１９８３年）などの当技術分 野で知られている細胞形質変換の、その他の方法を用いて達成することもできる 。代わりに、直接ＤＮＡを花粉に移すことによって（Zhou他、１９８３；Hess、 １９８７；Luo他、１９８８）、ＤＮＡを植物の再生器官細胞に注入することに よって（Pena他、１９８７）、あるいはＤＮＡを未発達の肝の細胞に直接注入し 、その後乾燥した肝を再水和することによって、ＤＮＡを植物に導入することが できる。（Neuhaus他、１９８７、Benbrook他、１９８６） 単一の植物原形質体の形質転換体から、または形質転換した様々な外植片から の、植物の再生、発育、および培養は、当技術分野ではよく知られている（Weis sbach and Weissbach、１９８８）。この再生および成長過程は、一般に形質変 換細胞を選択するステップを含み、根の付いた苗木の段階を通し、肝の発育の通 常の段階を通して、これらの個別化された細胞を培養する。トランスジェニック 胚および種子は、同様に再生される。この結果得られる、根がついたトランスジ ェニックな苗木は、その後、土などの適切な植物成長培地に植えられる。 Agrobacteriumによって葉外植片から導入され、関心が持たれているポリペプ チドをコードする、異質で外生の遺伝子を含 有する植物の発育または再生は、記述されるように(Horsch他、１９８５)当技術 分野でよく知られる方法によって達成される。この手順では、形質転換体は選択 試薬の存在下、培地で培養され、記述されるように（Fraley他、１９８３）、形 質転換する植物種の芽を再生させる。 一般にこの手順では２〜４カ月以内で芽が生じ、次いでこれらの芽を、選択試 薬を含有して細菌の成長を妨げる抗菌性を有する、適切な根を付けるための培地 に移し換える。次に、苗木を形成するための選択試薬の存在下で根がついた芽を 、土またはその他の培地に植え替えて根をはらせる。これらの手順は、使用され る特定の植物種によって変わり、そのような変化は当技術分野ではよく知られて いる。 以前議論したように、再生した植物は自家受粉して、同型接合のトランスジェ ニック植物をもたらすことが好ましい。そうでない場合は、再生した植物から得 られる花粉が耕種学的に重要な種子成長植物と交配し、好ましいのは同系繁殖系 であることである。逆に言えば、そのように重要な系統の植物からの花粉は、再 生した植物に受粉するために使用される。所望のポリペプチドを含有する本発明 のトランスジェニック植物は、当業 者によく知られる方法を用いて栽培される。 従って本発明のトランスジェニック植物では、関心が持たれているＣｒｙポリ ペプチドをコードするコード領域（例えばｃｒｙ遺伝子）の量が増加している。 好ましいトランスジェニック植物は独立した分離体であり、遺伝子とその活性を 後代に伝えることができる。より好ましいトランスジェニック植物は、遺伝子に 対して同型接合し、交配時にその遺伝子を子孫のすべてに伝える。トランスジェ ニック植物からの種子は、野外または温室で成長させることができ、その結果雌 雄別に十分に生長したトランスジェニック植物は自家受粉して、真の育種植物を 発生させる。これらの植物からの後代は真の育種系統になり、例えば、好ましく は野外で、環境的な条件の範囲のもとで、甲虫類の昆虫に対する殺虫能力が増大 したものと評価される。本発明者らは、様々な芝生、小麦、トウモロコシ、米、 大麦、オート、様々な観賞植物および野菜、ならびに多数のナッツや果実を持つ 木、植物を含んだ商業上の利益をもたらすトランスジェニック植物を生み出す際 に、本発明が特定の有用性を見出すと考えている。 ５． 実施例 以下の実施例は、本発明の好ましい実施の形態を説明するためのものである。 以下の実施例において開示される技術は、本発明者が見いだした、本発明の実施 において十分機能する技術であって、したがって、本発明を実施するための好ま しい形態を構成する技術であると見なすことができることを、当業者ならば良く 理解できよう。一方、本開示を見れば、本発明の精神および範囲を逸脱すること なく、本明細書に開示の特定の実施の形態に多くの変更を加えることができるこ と、また、それによって同様の結果を得ることができることを、当業者ならば理 解できよう。 ５．１ 例１ − B．thuringiensisＥＧ１０３２７菌株の単離 全米および海外の種々の供給源、典型的な場合、穀物貯蔵施設から、散布農薬 サンプルを得た。米国特許第５，２６４，３６４号に記載のように、散布農薬サ ンプルを処理した後、寒天プレート上に塗抹し、個々のBacillusタイプコロニー を隔離培養した。 コロニーハイブリッド形成法では、Donovan他の文献（１９８８）に記載の、 以前はB．thuringiensisＥＧ２１５８菌株の ｃｒｙＣ遺伝子として知られていたクローン化したｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子、およ びDonovan他の文献（１９９２）に記載の、以前はB．thuringiensisＥＧ４９６ １菌株のｃｒｙＩＩＩＣ遺伝子として知られていたクローン化したｃｒｙＩＩＩ Ｂ２遺伝子を、プローブとして用いた。ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子のプローブは、Do novan他の文献（１９８８）に記載の、放射線で標識された２．０ｋｂＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＸｂａｌＤＮＡ制限断片から成る。ｃｒｙＩＩＩＢ２遺伝子のプローブ は、Donovan他の文献（１９９２）に記載の、放射線で標識された２．４ｋｂＳ ｓｐＩＤＮＡ制限断片から成る。コロニーハイブリッド形成方法を、米国特許第 ５，２６４，３６４号に記載のように実施した。 様々な場所で採取した５４の散布農薬サンプルからの約４３，０００のBacill usタイプコロニーを、放射線で標識したＣｒｙＩＩＩＡおよびｃｒｙＩＩＩＢ２ のプローブを用いて調べた。ギリシャで採取された１つの散布農薬サンプルには 、ｃｒｙＩＩＩＡおよびｃｒｙＩＩＩＢ２のプローブと交雑した自然発生的Baci llusタイプコロニーが約１００含まれていた。これら自然発生的、野生型コロニ ーを分析すると、それらがB． thuringiensisコロニーと同一であることが示されたため、さらに調査するため にＥＧ１０３２７と呼ばれる１つのコロニーを選択した。B．thuringiensisＥＧ １０３２７菌株は、１９９４年１２月１４日、ブダペスト条約に基づいて登録番 号ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６５のもとにＮＲＲＬに寄託した。 引続き様々な場所で採取した１０５の散布農薬サンプルからの約８４，０００ のBacillusタイプコロニーを、放射線で標識したｃｒｙＩＩＩＡおよびｃｒｙＩ ＩＩＢ２のプローブを用いて検索したが、新規ｃｒｙＩＩＩ型遺伝子を含む他の 菌株を同定することはできなかった。 B．thuringiensisＥＧ１０３２７菌株は、鞘翅目の昆虫、特に、the red flou r beetle、メキシコワタミゾウムシ、マメコガネの幼虫に対して殺虫性を有する ことが判明した。使用した測定条件下では、ＥＧ１０３２７菌株のsouthern cor nrootwormまたはコロラドハムシに対する殺虫性は測定できなかった。「ｃｒｙ ＩＩＩＡ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ」と呼ばれる遺伝子をＥＧ１０３２７菌株から単 離し、そのヌクレオチドの塩基配列を決定した。ｃｒｙＩＩＩＡ−ｔｒｕｎｃａ ｔｅｄ遺伝子は、ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（１９８８年のDonovan他の文 献にはｃｒｙＣと記載されている）の最初の２／３と一致することが判明したが 、ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子の最後の１／３は含まれていなかった。ＥＧ１０３２７ 菌株のｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子は、殺虫性タンパク質を産生 するとしても非常に微量であって、それ以上の特性は有していなかった。 ５．２ 例２ − ＥＧ１０３２７菌株の鞭毛の血清型の評価 ＥＧ１０３２７菌株を特徴づけるために、幾つかの研究を行った。その１つは 、鞭毛の血清型を特徴づけるために行われた。そのデータを以下に示す。 ＥＧ１０３２７菌株の鞭毛の血清型は、仏国、パリ、パスツール研究所のDr． M．M．Lecadetの研究室で決定した。ＥＧ１０３２７菌株の血清型をH．de Barja c記載の方法（１９８１）によって決定したところ、Bacillus thuringiensis ku rstaki（Ｈ３ａ、３ｂ、３ｃ）であることが判明した。先に記述した、ｃｒｙＩ ＩＩ関連遺伝子を含むB．thuringiensis菌株は、morrisoni血清型（ｃｒｙＩＩ ＩＡを含むＥＧ２１５８菌株）、tolworthi血清型（ｃｒｙＩＩＩＢを含むＥＧ ２８３８菌株）およびkumamotoensis血清型（ｃｒｙＩＩＩＢ２を含むＥＧ４９ ６１菌株）であることが判明した。ＥＧ１０３２７菌株は、 鞘翅目の昆虫に対して毒性を示すことが明らかとなっている、第１のB．thuring iensis kurstakiである。 ５．３ 例３ − ＥＧ１０３２７菌株の結晶体タンパク質の評価 ＥＧ１０３２７菌株を、産生する結晶体タンパク質を特性づけることによって さらに評価した。これらの研究は、ＥＧ１０３２７菌株を、ＤＳＧ胞子形成培地 ［０．８％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）Difco栄養ブイヨン、０．５％（ｗｔ．／ｖｏ ｌ．）グルコース、１０ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭＣａ（Ｎ Ｏ₃₂）、０．５ｍＭＭｇＳＯ₄、１０μＭ ＭｎＣｌ₂、１０μＭ ＦｅＳＯ₄］ で増殖させて行った。次いで、胞子および結晶体タンパク質の両方を含む胞子形 成後の培地を遠心によって集菌し、脱イオン水中に懸濁させた。結晶体タンパク 質は、ＥＧ１０３２７菌株の胞子および結晶体の懸濁液を、１００℃の可溶化緩 衝液[０．１４Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２％（ｗｔ．／ｖｏｌ．）ラウリル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）２−メルカプトエタノ ール、１０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）グリセロールおよび０．１％（ｗｔ．／ｖ ｏｌ．）ブロモフェノールブルー］中で５分間培養して、 その懸濁液から可溶化した。 可溶化した結晶体タンパク質を、アクリルアミドゲルを支持体とする電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）によってサイズ分割した。サイズ分割終了後、タンパ ク質をクーマシー染色色素で染色し、視覚化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によっ て、胞子形成後のＥＧ１０３２７菌株の培地から、約２９ｋＤａの主要結晶体タ ンパク質、本明細書では以後ＣｒｙＥＴ３３タンパク質と呼ぶ、と約１４ｋＤａ の主要結晶体タンパク質、本明細書では以後ＣｒｙＥＴ３４タンパク質と呼ぶ、 が可溶化された。 ＥＧ１０３２７菌株２９−ｋＤａＣｒｙＥＴ３３タンパク質および１４−ｋＤ ａＣｒｙＥＴ３４タンパク質を、さらにそれらのＮＨ₂末端アミノ酸配列を以下 のように決定して特性づけた。胞子形成後のＥＧ１０３２７菌株の培地を可溶化 緩衝液で培養し、可溶化した結晶体タンパク質を、アクリルアミドゲルを支持体 とするＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってサイズ分割した。タンパク質を、標準的な エレクトロブロッティング技術によって、ゲルからニトロセルロースフィルタに 移した。フィルタにエレクトロブロッティングされたＣｒｙＥＴ３３タンパク質 およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質は、クーマシー染色色素でフィ ルタ染色して、視覚化した。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質およびＣｒｙＥＴ３４タ ンパク質を含めたフィルタ部分を、レーザーブレードで切り出した。このように して、ＣｒｙＥＴ３３タンパク質およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質を、別々のニ トロセルロースフィルタにブロッティングされたタンパク質として、純粋な状態 で得た。 各タンパク質のＮＨ₂末端アミノ酸配列を決めるために、ニトロセルロースフ ィルタ片に含まれる精製ＣｒｙＥＴ３３タンパク質およびＣｒｙＥＴ３４タンパ ク質を、標準的な自動エドマン分解法によって分解した。 ＥＧ１０３２７菌株のＣｒｙＥＴ３３タンパク質のＮＨ₂末端アミノ酸配列は 、 であることが判明した。 ＥＧ１０３２７菌株のＣｒｙＥＴ３４タンパク質のＮＨ₂末端アミノ酸配列は 、 であることが判明した。 ＣｒｙＥＴ３４タンパク質の配列の下の（ ）内のアミノ酸残基は、ＣｒｙＥ Ｔ３４タンパク質の指示した位置に存在し得る潜在代替アミノ酸である。代替ア ミノ酸は、タンパク質アミノ酸配列の決定に自動エドマン分解法を使用する際に 現れる、本来備わっているあいまい性が原因で生じることがある。 コンピュータアルゴリズム（KornとQueen、１９８４）を使用して、ＣｒｙＥ Ｔ３３タンパク質およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、科 学文献、国際特許出願または発行済み特許に公開されているすべてのB．thuring iensis結晶体タンパク質を含めて、本発明者等が気が付く範囲のすべてのB.thur ingiensis結晶体タンパク質のアミノ酸配列と比較した。配列が公開されている 結晶体タンパク質を、その公開元と併せて表５に示す。 ＥＧ１０３２７菌株のＣｒｙＥＴ３４タンパク質のＮ末端アミノ酸配列が、表 ５で確認した知られているB.thuringiensis結晶体タンパク質のいずれとも相同 でないことが判明した。 ５．４ 例４ − ＥＧ２１５９菌株のＣｒｙＥＴ３３結晶体タンパク質の特性 づけ ＥＧ２１５９菌株の６８−ｋＤａのＣｒｙＩＩＩＡタンパク質（Donovan他の １９８８年の文献ではＣｒｙＣタンパク質と呼ばれている）がコロラドハムシに 対して毒性であることは、以前より決定されているが、同菌株内の鱗翅目または 双翅目の昆虫に対して活性であるタンパク質はまだ同定されていなかった。 ＥＧ２１５９菌株を、B．thuringiensisＥＧ２１５８菌株から、ＥＧ２１５８ 菌株の１５０−ＭＤａプラスミド除去（Donovan他の１９８８年の文献に記載） によって得た。ＥＧ２１５８菌株に存在する１５０−ＭＤａプラスミドがＥＧ２ １５９菌株に存在しないことを除けば、ＥＧ２１５９菌株はＥＧ２１５８菌株と まったく同じである。ＥＧ２１５９菌株が産生する２種類の結晶体タンパク質の うちの１つ、６８−ｋＤａＣｒｙＩＩＩＡタンパク質を単離し、そのタンパク質 をコードす る遺伝子をクローン化して配列を決定した。この結果は、本発明者等によってす でに記述済みである（Donovan他、１９８８年）。微量（minor）タンパク質種、 ＥＧ２１５９菌株の２９−ｋＤａタンパク質については、それ以上の特性づけは できなかった。 本例は、B．thuringiensisＥＧ２１５９菌株のこの２９−ｋＤａＣｒｙＥＴ３ ３結晶体タンパク質の特性づけについて説明するものである。 ５．４．１ ＥＧ２１５９菌株からの結晶体タンパク質の単離 ＥＧ２１５９菌株の結晶体タンパク質を、胞子および結晶体タンパク質を含む ＥＧ２１５９菌株の胞子形成培地を８０℃のタンパク質可溶化緩衝液に３分間懸 濁させて、可溶化した。可溶化した結晶体タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ てサイズ分割し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をクーマシー染色色素で 染色して、視覚化した。２９−ｋＤａタンパク質を含むゲル切片をレーザーブレ ードを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル切片から切り出し、標準的な電気溶離法でゲ ル切片から分離した。本研究によって、B．thuringiensisＥＧ２１５９菌株のＣ ｒｙＥＴ３３タンパク質が、精製製剤として得られた。 ５．４．２ ２９−ｋＤａタンパク質のＮＨ₂末端配列 精製ＣｒｙＥＴ３３タンパク質のＮＨ₂末端アミノ酸配列を、自動エドマン分 解法で決定した。２９−ｋＤａタンパク質のＮＨ₂末端アミノ酸配列は、 １２位のダッシュ記号は、ＥＧ２１５９菌株のＣｒｙＥＴ３３タンパク質の場合 、この位置のアミノ酸残基が決定できなかったことを表している。 ５．４．３ 結果 ＥＧ１０３２７菌株のＣｒｙＥＴ３３タンパク質の配列（配 列番号：５）と、以前は特性付けできなかった２９−ｋＤａタンパク質（Donova n他、１９８８年）の、ＥＧ２１５９菌株に観察されるＮＨ₂末端アミノ酸配列（ 配列番号：７、配列番号：８）との比較によって、ＥＧ２１５９菌株のＣｒｙＥ Ｔ３３タンパク質では１位にメチオニン（Ｍｅｔ）が存在する点を除き、ＥＧ２ １５９菌株の２９−ｋＤａタンパク質のＮＨ₂末端はＥＧ１０３２７菌株のＣｒ ｙＥＴ３３タン パク質の末端と全く同じであることが示唆された。 ５．５ 実施例５ − ＥＧ２１５８菌株のｃｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙ ＥＴ３４遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離 前述したように、ＥＧ２１５８菌株からＥＧ２１５９菌株を得た。したがって 、ＥＧ２１５８菌株は、ＥＧ２１５９菌株と全く同じＣｒｙＥＴ３３タンパク質 の遺伝子を含んでいることになる。本明細書では、以後このＣｒｙＥＴ３３の遺 伝子をｃｒｙＥＴ３３遺伝子と呼ぶ。ｃｒｙＥＴ３３遺伝子をクローン化するた めに、逆方向の遺伝反応を使用した。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質のＮＨ₂末端の 、１位から１１位のアミノ酸をコードする３３量体オリゴヌクレオチドプローブ （ＷＤ６８で示される）を合成した。ＷＤ６８の配列は、である。 ２９−ｋＤａＣｒｙＥＴ３３タンパク質のＣｒｙＥＴ３３遺伝子を含む、ＥＧ ２１５８菌株のＤＮＡ断片を同定することを試みて、後述するように、サザンハ イブリッド形成研究におい てＷＤ６８をプローブとして使用した。標準的なリゾチーム／フェノール法によ って、ＥＧ２１５８菌株から総ＤＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡを、ＤＮＡ制限酵 素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後、その消化ＤＮＡを、アガロー スゲルを支持体とする電気泳動によってサイズ分割した。先述した方法（Southe rn、１９７５年）を用いて、ゲルからニトロセルロースフィルタにＤＮＡ断片を ブロットし、そのフィルタを、Ｔ４キナーゼおよび［Υ^-32Ｐ］ＡＴＰで放射線 標識したオリゴヌクレオチドＷＤ６８を用いて培養した。ＷＤ６８プローブが特 異的に交雑する、ＥＧ２１５８菌株のユニークなＤＮＡ制限断片は見いだされな かった。 次いで、ＣｒｙＥＴ３３遺伝子を含むＤＮＡ制限断片を同定するための別の方 法を使用した。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質のＮＨ₂末端の、１位から１９位のア ミノ酸をコードする５６量体オリゴヌクレオチドプローブ（ＷＤ７３で示される ）を合成した。ＷＤ７３の配列は、 であり、上記配列において、ＷＤ７３の１２位のアミノ酸に対応する３個のＮは 、３個のイノシンヌクレオチドである。この位置にイノシン残基を使用して、Ｃ ｒｙＥＴ３３タンパク質のＮＨ₂末端配列の１２位にある、対応する未知のアミ ノ酸をコードした。イノシンは中性のヌクレオチドであると考えられており、Ｄ ＮＡ鎖の結合を促進することもなければ妨げることもない。ＷＤ７３をＴ４キナ ーゼおよび［Υ^-32Ｐ］ＡＴＰで放射線標識した後、それを用いて、サイズ分割 された、ＥＧ２１５８菌株の総ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限断 片を含んだ、ニトロセルロースフィルタをプローブした。ＷＤ７３は、ＥＧ２１ ５８菌株のＤＮＡの、約７．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片および約５．２ｋｂの ＥｃｏＲＩ断片と特異的に交雑した。 ５．６ 実施例６ − ＥＧ２１５８菌株のＣｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙ ＥＴ３４遺伝子のクローン化 先の実施例に記述の５．２−ｋｂ ＥｃｏＲＩ断 片を単離するために、ＥＧ２１５８菌株のサイズ選択されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ 制限断片を、E．coliベクタ−ｐＢＲ３２２に連結させて、ＥＧ２１５８菌株の プラスミドライブラリーを構築した。この方法には、 先ず細胞の溶菌によってＥＧ２１５８菌株の総ＤＮＡを得る段階、そのＤＮＡを フェノール抽出する段階、次いで総ＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化する段階 、消化されたＤＮＡをアガロースゲルを支持体として電気泳動させる段階、Ｅｃ ｏＲＩ ＤＮＡ断片を含むゲル切片を約４．０〜６．０ｋｂの範囲の大きさに切 り出す段階、およびサイス選択されたＥｃｏＲＩ制限断片をアガロースゲル切片 から電気溶離する段階が含まれる。これらの断片を、やはりＥｃｏＲＩで消化済 みのE．coliプラスミドベクタ−ｐＢＲ３２２と混合した。ｐＢＲ３２２ベクタ ーはＡｍｐ^Rの遺伝子を運搬し、E.coliでレプリカされる。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ およびＡＴＰを、ＥＧ２１５８菌株のＤＮＡのサイズ選択された制限断片と、消 化済みのｐＢＲ３２２ベクタ−の混合物に加え、ｐＢＲ３２２ベクタ−がＥＧ２ １５８菌株の制限断片と連結できるようにした。 次いでプラスミドライブラリーを、問題のｃｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙ ＥＴ３４遺伝子が欠損している宿主生物であるE．coli細胞に、以下のようにし て形質転換させた。連結終了後、ＤＮＡ混合物を、標準的なＣａＣｌ₂法を用い てコンピテントにしたＡｍｐ^R E.coli宿主株、ＨＢ１０１で培養した。 E．coliＨＢ１０１は組換えプラスミドで容易に形質転換すること、また、ＨＢ １０１は天然の状態ではB．thuringiensis結晶体タンパク質の遺伝子を含有して いないことから、宿主株としてE.coliＨＢ１０１を使用した。ｐＢＲ３２２はＡ ｍｐ^Rを発現することから、組換えプラスミドを獲得した宿主細胞はすべてＡｍ ｐ^Rであった。組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換した後、細胞を、Ａｍｐ を含有する寒天培地に塗沫した。３７℃で１晩培養すると、Ａｍｐ含有寒天培地 には数千のE．coliのコロニーが増殖していた。次いで、引続き行うプローブ用 に、これらのコロニーをニトロセルロースフィルタ上にブロットした。 次いで、放射線で標識したオリゴヌクレオチドＷＤ７３を、プローブが、ＥＧ ２１５８菌株の５．２ｋｂＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を含む形質転換した宿主コロ ニーと特異的に結合できるような条件下で、ＤＮＡプローブとして使用した。幾 つかのE．coliのコロニーがＷＤ７３プローブと特異的に交雑した。E．coliＥＧ １１４６０で示される１つのＷＤ７３交雑コロニーについてさらに調べた。E.co liＥＧ１１４６０は、ｐＢＲ３２２と、約５．２ｋｂの、ＥＧ２１５８菌株ＤＮ Ａの挿入ＥｃｏＲ Ｉ制限断片とから成る、ｐＥＧ２４６で示される組換えプラスミドを含んでいた 。ｐＥＧ２４６の制限酵素地図を第２図に示す。ｐＥＧ２４６を含んでいるE.co liＥＧ１１４６０菌株は、ブダペスト条約に基づき、登録番号ＮＲＲＬ Ｂ−２ １３６４のもとに、Agricultural Research Culture Collection、Northern Reg ional Research Laboratory（ＮＲＲＬ）に寄託してある。 ｐＥＧ２４６のクローン化した５．２−ｋｂＥｃｏＲＩ断片の約１／３のヌク レオチド塩基配列を、標準的なサンガーのジデオキシ法を用いて決定した。配列 決定によって、５．２−ｋｂ断片が、タンパク質、特に２つの新規結晶体毒素遺 伝子をコードする２つの隣接する空の読み取り枠を含んでいることが明らかにな った。ｃｒｙＥＴ３３で示される空の上流読み取り枠が、そのＮＨ₂末端配列が 、ＥＧ２１５９菌株およびＥＧ１０３２７菌株の２９−ｋＤａＣｒｙＥＴ３３タ ンパク質のＮＨ₂末端配列に匹敵するようなタンパク質をコードしていた。Ｃｒ ｙＥＴ３４で示される下流遺伝子は、そのアミノ酸配列が、ＥＧ１０３２７菌株 の１４−ｋＤａＣｒｙＥＴ３４タンパク質で決定したＮＨ₂末端アミノ酸配列に 匹敵するようなタンパク質 をコードしていた。これら新規遺伝子のＤＮＡ配列は、表５に記載の、B.thurin giensisの既知の結晶体毒素遺伝子の配列とは有意に異なっている。 ｃｒｙＥＴ３３遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：１）およびｃｒｙＥＴ３３遺 伝子によってコードされるｃｒｙＥＴ３３タンパク質の推定アミノ酸配列（配列 番号：３）を、第１Ａ図、第１Ｂ図および第１Ｃ図に示す。ｃｒｙＥＴ３３遺伝 子のタンパク質コード部分（配列番号：１）は、１３６位から始まり９３６位で 終るヌクレオチドによって画定される。ｃｒｙＥＴ３３遺伝子（配列番号：１） から推定されるｃｒｙＥＴ３３タンパク質（配列番号：３）のサイズは２９，２ １６Ｄａ（２６７個のアミノ酸）である。また、ｃｒｙＥＴ３４遺伝子のＤＮＡ 配列（配列番号：２）およびｃｒｙＥＴ３４遺伝子によってコードされるＣｒｙ ＥＴ３４タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号：４）を、第１Ａ図、第１Ｂ 図および第１Ｃ図に示す。ｃｒｙＥＴ３４遺伝子のタンパク質コード部分（配列 番号：２）は、９６９位から始まり１３４６位で終るヌクレオチドによって画定 される。ｃｒｙＥＴ３４遺伝子（配列番号：２）から推定されるＣｒｙＥＴ３４ タンパク質（配列番号：４）のサイズ は１４，１８２Ｄａ（１２６個のアミノ酸）である。 コンピュータアルゴリズム（KornおよびQueen、１９８４年、Altschulら、１ ９９０年）を用いて、ｃｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙＥＴ３４遺伝子のＤＮ Ａ配列、ならびにＣｒｙＥＴ３３タンパク質およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質の 推定アミノ酸配列を、本発明者等が気が付く範囲のB.thuringiensisの全ｃｒｙ 遺伝子および結晶体タンパク質（実施例３の５．３項および表５に記載）および ゲノム配列データベース（ニューメキシコ州、サンタフェのNational Center fo r Genome Resources）と比較した。ＣｒｙＥＴ３４遺伝子の配列（配列番号：２ ）およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質の推定配列（配列番号：４）はそれぞれ、既 知のいずれの遺伝子またはタンパク質とも関連が見いだされなかった。ＣｒｙＥ Ｔ３３遺伝子の配列(配列番号：１)は、既知のタンパク質の１つとだけ配列が同 一であることが判明し、その配列同一性は非常に低かった。ｃｒｙＥＴ３３遺伝 子の配列（ヌクレオチド８０１個）は、ＢｒｏｗｎとＷｈｉｔｅｌｅｙの文献に 記載（１９９２）のB.thuringiensisの亜種thompsoniの遺伝子の配列（ヌクレオ チド１，０２０個）とは３８％同一であった。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質の推定 配 列（配列番号：３）は、既知の遺伝子の１つとだけ配列が同一であることが判明 し、その配列同一性は非常に低かった。ＣｒｙＥＴ３３タンパク質の完全アミノ 酸配列（アミノ酸２６７個）は、BrownとWhiteleyの１９９２の文献に記載のイ モムシに対して毒性のタンパク質、B.thuringiensisの亜種thompsoniの結晶体タ ンパク質の完全アミノ酸配列（アミノ酸３４０個）とは２７％同一であった。 ｃｒｙＥＴ３３遺伝子のすぐ上流のＤＮＡ配列（第１Ａ図、第１Ｂ図および第 １Ｃ図、ヌクレオチド１〜１３５個）の、既知の結晶体タンパク質遺伝子すべて の上流ＤＮＡ配列およびゲノム配列データベースの既知の遺伝子すべて（表５） のＤＮＡ配列との相同性を探索した。遺伝子コード領域のすぐ上流のＤＮＡ配列 は、対応する遺伝子発現プロモーターを含んでいることが多い。この探索の結果 、相同性は見いだされなかった。 ５．７ 実施例７ − 組換えＣｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙＥＴ３４遺伝 子の発現 クローン化したB.thuringiensisの結晶体毒素遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中では あまり 発現しないが、組換えB.thuringiensis菌株中では高度に発現することが実験に よって明らかになっている。ＣｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙＥＴ３４遺伝子 （第２図）を有するｐＥＧ２４６は、Ｅ．ｃｏｌｉ中ではレプリカできるが、B. thuringiensis菌株中ではできない。ｃｒｙＥＴ３３遺伝子およびｃｒｙＥＴ３ ４遺伝子を含み、かつB.thuringiensis菌株中でレプリカできるプラスミドを得 るために、後述のようにしてBacillus種のプラスミドをｐＥＧ２４６に挿入した 。 B.thuringiensis菌株中でレプリカでき、かつクロラムフェニコール耐性（Ｃ ａｍ^R）およびテトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^R）を付与することができるBacill us種のプラスミドｐＮＮ１０１（Norton他、１９８５年）をＢａｍＨＩで消化し た後、その消化済みプラスミドを、ＢａｍＨＩで消化済みのプラスミドｐＥＧ２ ４６と混合した。２つのプラスミドを、Ｔ４リガーゼおよびＡＴＰで連結した。 次いで、連結混合物を用いて、コンペテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α細胞を形質転 換した。プラスミド混合物で培養した後、細胞を、Ｔｅｔを含有する寒天平板に プレートした。ｐＥＧ２４６と連結されたｐＮＮ１０１から なるプラスミドを吸収した細胞はＴｅｔ^Rであることが予想された。約２０時間 の培養の後、Ｔｅｔを有する寒天平板上ではＴｅｔ^RＥ．ｃｏｌｉのコロニーが 増殖していた。 プラスミドＤＮＡを１つのＴｅｔ^Rコロニーから単離した。そのプラスミドを ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲルを支持体として電気泳動を行った。ｐ ＥＧ１２４６で示されるプラスミドは、それぞれプラスミドｐＮＮ１０１および プラスミドｐＥＧ２４６に対応する、５．８ｋｂおよび９．６ｋｂの２つのＢａ ｍＨＩ ＤＮＡ断片から成っていた。ｐＥＧ１２４６の制限酵素地図を第３図に 示す。 次いで、B.thuringiensisＥＧ１０３６８菌株を、ｐＥＧ１２４６を用い、先 述した方法(MacalusoとMettus、１９９１年)によって電気穿孔して形質転換した 。ＥＧ１０３６８菌株の形質転換しなかった宿主細胞は、非結晶体(crystal neg ative)でありＣａｍ^Rである。電気穿孔終了後、形質転換混合物をＣａｍを含有 する寒天培地上に塗沫し、３０℃で約１６時間培養した。ｐＥＧ１２４６形質転 換細胞は、Ｃａｍ^Rであろう。B.thuringiensisＥＧ１１４０３菌株で示される、 １つのＣａｍ^Rのコロニーは、制限パターンがｐＥＧ１２４６と全く同じ であるプラスミドを有していた。 ＥＧ１１４０３菌株の細胞を、温度２２℃〜２５℃にて、Ｃａｍを含有するＤ ＳＧ胞子形成培地で、胞子形成および細胞溶菌が現れるまで（４〜５日間）増殖 させた。顕微鏡による検査では、ＥＧ１１４０３菌株の胞子形成後の培地は、胞 子、および浮漂する小さいスピンドル形および不定形の結晶体を含有していた。 この結晶体は、ＥＧ１０３２７菌株の胞子形成後の培地で観察されたものと似て いた。 ＥＧ１１４０３菌株の胞子形成後の培地から、胞子、結晶体および細胞の残骸 を遠心によって集菌した。遠心ペレットを脱イオン水で一回洗浄した後、脱イオ ン水中に懸濁させた。 ＥＧ１１４０３菌株の懸濁液中の結晶体タンパク質を、可溶化し、ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ分析して特性付けを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＥＧ１１４ ０３菌株が２９ｋＤａおよび１４ｋＤａの二種類の主要なタンパク質を産生する ことが明らかになった。予想したように、ＥＧ１１４０３菌株の２９ｋＤａのタ ンパク質および１４ｋＤａのタンパク質はそれぞれ、ＥＧ１０３２７菌株が産生 する２９−ｋＤａ ＣｒｙＥＴ３３タンパク質および１４−ｋＤａ ＣｒｙＥＴ ３４タンパク質と サイズにおいて全く同じであった。ＥＧ１１４０３菌株は１９９４年１２月１４ 日、ブダペスト条約に基づき、登録番号ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６７のもとに、Ag ricultural Research Culture Colletion、Northern Regional Research Labova tory（ＮＲＲＬ）に寄託してある。 ＥＧ１１４０３菌株の２９ｋＤａＣｒｙＥＴ３３タンパク質をコードする遺伝 子はｃｒｙＥＴ３３遺伝子であり、ＥＧ１１４０３菌株の１４ｋＤａＣｒｙＥＴ ３４タンパク質をコードする遺伝子はｃｒｙＥＴ３４遺伝子である。B.thuringi ensisＥＧ１１４０３菌株およびＥＧ１０３２７菌株は、ほぼ同量のＣｒｙＥＴ ３３タンパク質を産生した。対照的に、B.thuringiensisＥＧ２１５８菌株は、 ＥＧ１１４０３菌株またはＥＧ１０３２７菌株のいずれかが産生するＣｒｙＥＴ ３３タンパク質量の約１／１０しか産生しなかった。 ５．８ 実施例８ − ＣＲＹＩＩＩＢ３、ＣＲＹＥＴ３３およびＣＲＹＥＴ３ ４を含有するB．THURINGIENSISＥＧ１１４０２ ＣｒｙＩＩＩＢ３と指定されたB.thuringiensis結晶タンパク質がマメコガネ の幼虫に有毒であることは、以前示した（米国特許５，２６４，３６４）。以下 の実施例では、ＣｒｙＥＴ ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質がメキシコワタミゾウムシ、およびマメコ ガネの幼虫に有毒であることが見出された。Ｃｒｙ３Ｂ３タンパク質は、Ｃｒｙ ＥＴ３３タンパク質またはＣｒｙＥＴ３４タンパク質のいずれともアミノ酸配列 相同を共有しない。マメコガネ毒性が強められた株を産生しようとする試みでは 、Ｃｒｙ３Ｂ３遺伝子、ＣｒｙＥＴ３３遺伝子、およびＣｒｙＥＴ３４遺伝子を 、以下のように１つの株に結合させた。 株ＥＧ１０３６４は、ＣｒｙＩＩＩＢ３遺伝子を含有する野生型のB.thuringi ensis株である。ＥＧ１０３６４は、マメコガネの幼虫に有毒なＣｒｙ３Ｂ３タ ンパク質を産生する。ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４遺伝子を含有するｐ ＥＧ１２４６（第３図）は、ＥＧ１０３６４を電気穿孔法により形質転換して株 ＥＧ１１４０２を生じさせるために使用した。ＥＧ１１４０２は、ＥＧ１１４０ ２がｐＥＧ１２４６も含有する他は（クローニングされたＣｒｙＥＴ３３および ＣｒｙＥＴ３４遺伝子を持っている）ＥＧ１０３６４と同一であり、その結果、 ｃａｍ^Rである。 株ＥＧ１１４０２を、胞子形成および細胞溶解が起こるまで （４〜５日）、Ｃａｍを加えたＤＳＧ胞子形成培地で室温で成長させた。胞子形 成したＥＧ１１４０２培養組織から結晶タンパク質を溶解させ、溶解したタンパ ク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分別した。この分析によれば、株ＥＧ１１４０ ２が３種類の結晶タンパク質、即ちＣｒｙＩＩＩＢ３タンパク質に対応する７０ −ｋＤａ結晶タンパク質、ＣｒｙＥＴ３３タンパク質に対応する２９−ｋＤａ結 晶タンパク質、およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質に対応する１４−ｋＤａ結晶タ ンパク質を産生することが明らかにされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、ク ロラムフェニコールを用いないこと以外はＥＧ１１４０２と同一の方法で成長さ せた株ＥＧ１０３６４が、ＥＧ１１４０２と同量の７０−ｋＤａＣｒｙＩＩＩＢ ３タンパク質を産生することが示された。株ＥＧ１１４０２は、１９９４年１２ 月１４日にブダペスト条約の条項の下、Accession No．NRRL B-21366を有するth e Agricultural Research Culture Collection，Northern Regional Research L aboratory(NRRL)に寄託された。 ５．９ 実施例９ − マメコガネの幼虫に対するＣＲＹＥＴ３３およびＣＲＹ ＥＴ３４の毒性 マメコガネの幼虫（Popillia japonica）に対する毒性を、３ 種類のB.thuringiensis株、即ち（１）ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４結 晶タンパク質を産生する株ＥＧ１０３２７、（２）Ｃｒｙ３Ｂ３結晶タンパク質 を産生する株ＥＧ１０３６４、（３）ＣｒｙＥＴ３３、ＣｒｙＥＴ３４、および Ｃｒｙ３Ｂ３結晶タンパク質を産生する株ＥＧ１１４０２について決定した。 株ＥＧ１０３２７、ＥＧ１０３６４、およびＥＧ１１４０２を、胞子形成およ び細胞溶解が起こるまで（４〜５日）ＤＳＧ胞子形成培地で室温（２０〜２３℃ ）で成長させた。ＥＧ１１４０２の場合、培地は５μｇ／ｍｌのＣａｍを含有し た。発酵ブイヨンを遠心によって濃縮し、胞子、結晶タンパク質、および細胞砕 片を含有するペレットを凍結乾燥して粉末を得るか、または脱イオン水に再懸濁 させて水性懸濁液を得た。凍結乾燥した粉末中および懸濁液中のＣｒｙ３Ｂ３お よびＣｒｙＥＴ３３結晶タンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの技術、および標 準として精製されかつ計量済みのＣｒｙ３Ａタンパク質でクーマシー染色された ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを追跡する濃度計を用いて計量した。ＣｒｙＥＴ３４タン パク質の量は、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの視覚検査によって 判断した。 この検査によって、ＣｒｙＥＴ３４タンパク質の量は、株ＥＧ１０３２７および ＥＧ１１４０２中のＣｒｙＥＴ３４タンパク質の量とおおよそ等しいことが示さ れた。 マメコガネの幼虫に対する生物検定手順を以下のように実施した。即ち、試験 を行う各株の凍結乾燥した粉末を希釈液（Ｔ 懸濁させ、前述の昆虫用食餌（Ladd、１９８６年）を主成分とする熱い(５０〜 ６０℃)液体人工食餌１００ｍｌに混合した。混合物をペトリ皿で凝固させ、次 いで凝固した食餌の直径１９ｍｍのプラグを５／８オンス（約１８ｃｃ）のプラ スチック製カップの中に置いた。各カップに１匹のマメコガネの幼虫を導き、そ のカップを蓋で覆い、２５℃で１４日間保持した後、幼虫の死亡率を評価した。 この研究では、幼虫１６匹ごとに２回試験を繰り返した。 この毒性試験の結果を下記の表６に示す。ここでは、殺虫活性が死亡した幼虫 のパーセンテージとして報告されており、この死亡率パーセントは対照での死亡 で補正されている。この対照は、食餌プラグに混合されただけの希釈液である。 表６に示す結果は、ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質がマメコ ガネの幼虫に対して著しい毒性を有していることを明示している。ＣｒｙＥＴ３ ３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質を産生するＥＧ１０３２７は、マメコガネの 幼虫に対して有毒である。Ｃｒｙ３Ｂ３タンパク質を産生するＥＧ１０３６４も 、マメコガネの幼虫に対して有毒である。ｃｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４ 遺伝子をＥＧ１０３６４に添加すると、Ｃｒｙ３Ｂ３タンパク質に加えてＣｒｙ ＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質を産生するＥＧ１１４０２が生じ、マ メコガネの幼虫に対する毒性が高められたことがわかった。 ５．１０ 実施例１０ − 赤色コクヌスヒトモドキの幼虫に対するＣｒｙＥＴ ３３およびＣｒｙＥＴ３４の毒性 赤色コクヌスヒトモドキの幼虫（Tribolium castaneum）に対する毒性を、４ 種類のB.thuringiensis株、即ち（１）ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４結 晶タンパク質を産生するＥＧ１０３２７、（２）Ｃｒｙ３Ｂ３結晶タンパク質を 産生するＥＧ１０３６４、（３）ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４結晶タン パク質を産生するＥＧ１１４０３、（４）Ｃｒｙ３Ｂ３、ＣｒｙＥＴ３３、およ びＣｒｙＥＴ３４結晶タンパク質を産生するＥＧ１１４０２について決定した。 ４種類の株を、ＤＳＧ培地で胞子形成および細胞溶解が起こるまで成長させ、水 性懸濁液または凍結乾燥した粉末を、実施例９に述べるように調製した。各株の 調製物の既知の量を人工食餌に塗り、その食餌を赤色コクヌスヒトモドキの幼虫 に与えることによって、赤色コクヌスヒトモドキの幼虫に対する各株の毒性を決 定した。 この毒性試験の結果を表７に示す。ここでは、殺虫活性が昆虫死亡率パーセン テージとして報告されており、その死亡率は対照での死亡により補正されたもの である。この対照は、食餌に混合されただけの希釈液である。 表７に示す結果は、ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質が、赤色 コクヌスヒトモドキの幼虫に対して著しいレベルの毒性を有していることを明ら かにしている。ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質を産生する、自 然に発生する株ＥＧ１０３２７は、赤色コクヌスヒトモドキの幼虫に対する毒性 が高い。Ｃｒｙ３Ｂ３タンパク質を産生するＥＧ１０３６４は、赤色コクヌスヒ トモドキの幼虫に対して有毒である。ｃｒｙＥＴ３３およびｃｒｙＥＴ３４タン パク質を産生するＥＧ１１４０３は、赤色コクヌスヒトモドキの幼虫に対して有 毒である。ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４遺伝子をＥＧ１ ０３６４に添加するとＥＧ１１４０２が生じ、得られた株がＣｒｙＥＴ３３、Ｃ ｒｙＥＴ３４、およびＣｒｙ３Ｂ３タンパク質を産生することから赤色コクヌス ヒトモドキの幼虫に対する毒性が強められたことがわかった。 ５．１１ 実施例１１ − メキシコワタミゾウムシの幼虫に対するＣＲＹＥＴ ３３およびＣＲＹＥＴ３４の毒性 ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質を産生するＥＧ１１４０３を 、述べたように成長させた。タンパク質結晶を洗浄し、炭酸緩衝液に溶解させ、 透析して、０．２Ｕアクロディスクを通してろ過した。次に、タンパク質の既知 の量を人工食餌に添加し、メキシコワタミゾウムシの幼虫に与えることによって 、溶解したタンパク質の毒性を決定した。この毒性試験の結果を以下に示す。こ こで、殺虫活性は、（１）緩衝対照を使用して対照の死亡で補正した、死亡率の パーセントとして、または（２）緩衝対照を使用した対照の死亡で再度補正した 、死亡率のパーセント＋第１齢を越えて発育しなかった幼虫のパーセントとして 報告されている。 表８および表９の結果は、ＣｒｙＥＴ３３およびＣｒｙＥＴ３４タンパク質が 、メキシコワタミゾウムシの幼虫に対して著 しいレベルの毒性を持っていることを示す。 本明細書に開示され請求される組成物および方法のすべては、本発明の開示に 照らして過度の実験を行うことなく形成し、実行することができる。本発明の組 成物および方法を、好ましい実施形態について述べてきたが、本明細書で述べた 組成物、方法、およびその方法における複数のステップまたは一連のステップに 対し、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく変形を加えること ができることは、当業者には明らかで あろう。より詳細には、同様または類似の結果が得られる限り、本明細書で述べ た薬品を、化学的かつ生理的に関係する一定の薬品に置き換えられることが明ら かであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換えおよび修正のすべては、 添付したクレームに定義されるように、本発明の精神、範囲、および概念の範囲 内にあると考えられる。従って、特許が付与されるよう求められている排他的権 利は、以下のクレームに述べられるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:11） Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:11） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スレイニー，アネツト・シー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08690、ハミルトン・スクエア、ダンムー ア・コート・サウス・４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離及び精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｃｒ ｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質。 ２．配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパ ク質。 ３．ボールゾウムシ（ｂｏｌｌ ｗｅｅｖｉｌ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉ ａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、又はコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓ ｔａｎｅｕｍ）に対して殺虫活性を有する単離及び精製されたＣｒｙＥＴ３３又 はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質。 ４．前記結晶性タンパク質が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＥＧ１０３２７、ＥＧ２１５８、ＥＧ２１５９、又はＥＧ１１４０３から単離 される、請求項３に記載のタンパク質。 ５．前記結晶性タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された場合、約２ ９Ｄａ又は約１４Ｄａである、請求項４に記載のタンパク質。 ６．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質をコード化する、精製 された核酸セグメント。 ７．前記セグメントが、ボールゾウムシ、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａ ｐｏｎｉｃａ）、又はコタヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏ１ｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅ ｕｍ）に対して殺虫活性を有するδエンドトキシンをコードする、請求項６に記 載の核酸セグメント。 ８．さらに、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコー ドするものとして定義される、請求項７に記載の核酸セグメント。 ９．さらに、配列番号１の核酸配列又はその相補体、又は配列番号１の配列にハ イブリダイズする配列、又は配列番号２の核酸配列、又はその相補体、又は配列 番号２の配列にハイブリダイズする配列を含むものとして定義される、請求項８ に記載の核酸セグメント。 １０．さらに、ＲＮＡセグメントとして定義される、請求項７に記載の核酸セグ メント。 １１．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｌｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙＥＴ３３遺伝子 を含む単離及び精製されたＤＮＡセグメント。 １２．配列番号３からの５つのアミノ酸連続配列を含む結晶性タンパク質又はペ プチドをコード化するｃｒｙＥＴ３３遺伝子を含む、請求項１１に記載のＤＮＡ セグメント。 １３．図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃの１３６位と９３９位との間にある１８塩基 対連続核酸配列を含むｃｒｙＥＴ３３遺伝子を含む、請求項１１に記載のＤＮＡ セグメント。 １４．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｃｒｙＥＴ３４遺伝子 を含む単離及び精製されたＤＮＡセグメント。 １５．配列番号４からの５つのアミノ酸連続配列を含む結晶性タンパク質又はペ プチドをコードするｃｒｙＥＴ３４遺伝子を含む、請求項１４に記載のＤＮＡセ グメント。 １６．図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃの９６９位と１３４９位との間にある１８塩 基対連続核酸配列を含むｃｒｙＥＴ３４遺伝子を含む、請求項１４に記載のＤＮ Ａセグメント。 １７．長さが約１８〜約１００のアミノ酸の結晶性タンパク質又はペプチドをコ ードするｃｒｙＥＴ３３又はｃｒｙＥＴ３４遺伝子の一部を含む、請求項１１又 は１４に記載のＤＮＡセグメント。 １８．長さが約１００〜約２００のアミノ酸の結晶性タンパク 質又はペプチドをコードするｃｒｙＥＴ３３又はｃｒｙＥＴ３４遺伝子の一部を 含む、請求項１７に記載のＤＮＡセグメント。 １９．長さが約２６７のアミノ酸の結晶性タンパク質又はペプチドをコードする ｃｒｙＥＴ３３遺伝子、又は長さが約１２６のアミノ酸の結晶性タンパク質又は ペプチドをコードするｃｒｙＥＴ３４遺伝子を含む、請求項１８に記載のＤＮＡ セグメント。 ２０．さらに、組換えベクターを含んでいる、請求項１１又は１４に記載のＤＮ Ａセグメント。 ２１．さらに、ｐＥＧ２４６又はｐＥＧ１２４６を含んでいる、請求項２０に記 載のＤＮＡセグメント。 ２２．前記ＤＮＡセグメントが、作動的にプロモーターにリンクされ、前記プロ モーターが前記ＤＮＡセグメントを発現する、請求項２０に記載のＤＮＡセグメ ント。 ２３．請求項２０に記載のＤＮＡセグメントを含む組換え宿主細胞。 ２４．さらに、原核細胞として定義される、請求項２３に記載の組換え宿主細胞 。 ２５．さらに、細菌細胞として定義される、請求項２４に記載 の組換え宿主細胞。 ２６．前記細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．細胞である、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。 ２７．前記細菌細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６４、Ｂ．ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６５、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６６、又はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｎ ＲＲＬ Ｂ−２１３６７である、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。 ２８．さらに、真核細胞として定義される、請求項２３に記載の組換え宿主細胞 。 ２９．さらに、植物細胞として定義される、請求項２８に記載の組換え宿主細胞 。 ３０．前記植物細胞が、トウモロコシ、小麦、芝生、野菜、果樹、あるいは鑑賞 植物細胞である、請求項２９に記載の組換え宿主細胞。 ３１．前記ＤＮＡセグメントが、組換えベクターによって細胞中に導入される、 請求項２３に記載の組換え宿主細胞。 ３２．前記宿主細胞が、ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又 はペプチドを産生するＤＮＡセグメントを発現する、請求項２３に記載の組換え 宿主細胞。 ３３．前記ＣｒｙＥＴ３３結晶性タンパク質又はペプチドが、配列番号３からの ５つのアミノ酸連続配列を含む、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。 ３４．前記ＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチドが、配列番号４からの ５つのアミノ酸連続配列を含む、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。 ３５．前記ＣｒｙＥＴ３３結晶性タンパク質又はペプチドが、配列番号１からの １８塩基対連続核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでいる、請求 項３２に記載の組換え宿主細胞。 ３６．前記ＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチドが、配列番号２からの １８塩基対連続核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでいる、請求 項３２に記載の組換え宿主細胞。 ３７．（ａ）Ｃｒ−ｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチ ドをコードするＤＮＡセグメントが、プロモー ターの制御下に配置されている組換えベクターを調製する工程； （ｂ）前記組換えベクターを宿主細胞に導入する工程； （ｃ）コードされたＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペ プチドの発現を可能にするのに効果的な条件下において前記宿主細胞を培養する 工程；及び （ｄ）前記の発現された結晶性タンパク質又はペプチドを収集する工程、 を含む、ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチドを コードするＤＮＡセグメントの使用方法。 ３８．前記組換えベクターが、ｐＥＧ２４６又はｐＥＧ１２４６である、請求項 ３７に記載の方法。 ３９．（ａ）配列番号１又は配列番号２の１８連続ヌクレオチドと同じ配列を有 するか、又はこれに相補的な少なくとも１８の連続ヌクレオチドから成る配列部 位を含む核酸セグメント；又は （ｂ）標準的ハイブリダイゼーション条件下における、配列番号１又は配列番号 ２の核酸セグメントにハイブリダイズする、長さが１８〜約５２００のヌクレオ チドの核酸セグメント、あ るいはこれの相補体、 としての特徴を有する単離された核酸セグメント。 ４０．さらに、配列番号１又は配列番号２の１８連続ヌクレオチドと同じ配列を 有するか、又はこれと相補的な少なくとも１８の連続ヌクレオチドから成る配列 部位を含むものとして定義される、請求項３９に記載の核酸セグメント。 ４１．さらに、標準的ハイブリダイゼーション条件下における、配列番号１又は 配列番号２の核酸セグメントにハイブリダイズする、長さが１８〜約５２００の ヌクレオチドの核酸セグメント、あるいはこれの相補体を含むものとして定義さ れる、請求項３９に記載の核酸セグメント。 ４２．（ａ）ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質をコードする ものと推測されるサンプル核酸を得る工程； （ｂ）実質的に相補的な核酸のハイブリダイズを可能にするのに効果的な条件下 において前記結晶性タンパク質をコードする単離された核酸セグメントと、前記 サンプル核酸とを接触させる工程；及び （ｃ）このようにして形成されたハイブリダイズした相補的核酸を検出する工程 、 を含む、ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質をコードする核 酸配列の検出方法。 ４３．前記ＣｒｙＥＴ３３結晶性タンパク質が、配列番号３の少なくとも５つの 連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。 ４４．前記ＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質が、配列番号４の少なくとも５つの 連続アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。 ４５．前記ＣｒｙＥＴ３３結晶性タンパク質が、配列番号１の１８塩基対連続核 酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。 ４６．前記ＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質が、配列番号２の１８塩基対連続核 酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。 ４７．核酸セグメントをコードする単離されたＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３ ４結晶性タンパク質が、検出可能なラベルを含んでおり、ハイブリダイズした相 補的核酸が、前記ラベルを検出することによって検出される、請求項４２に記載 の方法。 ４８．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を コードする核酸セグメント及び検出試薬を適切な容器手段に含んでいる、核酸検 出キット。 ４９．配列番号３又は配列番号４からの５つのアミノ酸連続配列を含んでいる、 ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を含むペプチド組成物。 ５０．配列番号３又は配列番号４からの５〜約５０のアミノ酸長の配列を含んで いるペプチドを含む、請求項４９に記載の組成物。 ５１．配列番号３又は配列番号４からの５〜約１５０のアミノ酸長の配列を含ん でいるペプチドを含む、請求項５０に記載の組成物。 ５２．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチドに結合 する精製された抗体。 ５３．（ａ）ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチド を含んでいるものと推測される生物サンプルを得る工程； （ｂ）複合体の形成を可能にするのに効果的な条件下において、前記結晶性タン パク質又はペプチドに結合する抗体と前記サンプルとを接触させる工程；及び （ｃ）このように形成された複合体を検出する工程、 を含む、生物サンプルにおけるＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タン パク質又はペプチドの検出方法。 ５４．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチドに結合 する抗体及び免疫検出試薬を適切な容器手段に含んでいる、免疫検出キット。 ５５．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質又はペプチドをコー ドする導入遺伝子をそのゲノム中に組込んでいるトランスジェニック植物。 ５６．前記導入遺伝子が、ｃｒｙＥＴ３３又はｃｒｙＥＴ３４導入遺伝子を含ん でいる、請求項５５に記載のトランスジェニック植物。 ５７．請求項５５に記載の植物の子孫。 ５８．請求項５５に記載の植物の種子。 ５９．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を産生するＢａｃｉ ｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞。 ６０．前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６６、又はＮＲＲＬ Ｂ−２１３６７細 胞である、請求項５９に記載 の組成物。 ６１．ＮＲＲＬ受入れ番号Ｂ−２１３６５を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞。 ６２．ＮＲＲＬ受入れ番号Ｂ−２１３６６を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞。 ６３．ＮＲＲＬ受入れ番号Ｂ−２１３６７を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞。 ６４．ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質約１重量％〜約５０ 重量％を含む組成物。 ６５．（ａ）ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を産生するの に効果的な条件下において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６６、又はＮＲＲＬ Ｂ−２ １３６７細胞を培養する工程；及び （ｂ）前記細胞から前記ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を 得る工程、 を含むプロセスによって調製されたＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性 タンパク質を含む組成物。 ６６．工程ｂがさらに、前記ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４ を、約１重量％〜約５０重量％の量で得ることを含んでいる、請求項６５に記載 の組成物。 ６７．（ａ）ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を産生するの に効果的な条件下において、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｎ ＲＲＬ Ｂ−２１３６５、ＮＲＲＬ Ｂ−２１３６６、又はＮＲＲＬ Ｂ−２１ ３６７細胞を培養する工程；及び （ｂ）前記細胞から前記ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質を 得る工程、 を含む、ＣｒｙＥＴ３３又はＣｒｙＥＴ３４結晶性タンパク質の調製方法。 ６８．請求項６７に記載の方法によって調製された、請求項６４に記載の組成物 。