JPH01104177A - ２種の殺虫蛋白の同時発現 - Google Patents
２種の殺虫蛋白の同時発現Info
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- JPH01104177A JPH01104177A JP31928887A JP31928887A JPH01104177A JP H01104177 A JPH01104177 A JP H01104177A JP 31928887 A JP31928887 A JP 31928887A JP 31928887 A JP31928887 A JP 31928887A JP H01104177 A JPH01104177 A JP H01104177A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
皮栗上生科里分互
本発明は、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白遺伝子を含みこれを宿主内で
同時に発現させる発現プラスミド、該プラスミドを保持
しバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ株
の殺虫蛋白を生産する微生物および該微生物を培養する
ことを特徴とする殺虫蛋白の製造方法に関する。
ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白遺伝子を含みこれを宿主内で
同時に発現させる発現プラスミド、該プラスミドを保持
しバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ株
の殺虫蛋白を生産する微生物および該微生物を培養する
ことを特徴とする殺虫蛋白の製造方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、バチラス・チュリンゲンシ
ス・アイザワイ ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白遺伝子のう
ち特に鱗翅目昆虫であるコナガ、ハスモンヨトウに対し
強い殺虫活性を示す第１図記載のアミノ酸配列で特定さ
れる殺虫蛋白および特にカイコに対し強い殺虫活性を示
す第２図に記載のアミノ酸配列で特定される殺虫蛋白を
コードする遺伝子を直列に同方向に接続した遺伝子を含
みこれを宿主内で発現させる発現プラスミド、該プラス
ミドを保持しバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の殺虫蛋白を生産する微生物および該微生物
を培養することを特徴とする殺虫蛋白の製造方法に関す
る。
ス・アイザワイ ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白遺伝子のう
ち特に鱗翅目昆虫であるコナガ、ハスモンヨトウに対し
強い殺虫活性を示す第１図記載のアミノ酸配列で特定さ
れる殺虫蛋白および特にカイコに対し強い殺虫活性を示
す第２図に記載のアミノ酸配列で特定される殺虫蛋白を
コードする遺伝子を直列に同方向に接続した遺伝子を含
みこれを宿主内で発現させる発現プラスミド、該プラス
ミドを保持しバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の殺虫蛋白を生産する微生物および該微生物
を培養することを特徴とする殺虫蛋白の製造方法に関す
る。
ｌ米及五
バチラス・チュリンゲンシスの各種菌株は、胞子形成期
に殺虫蛋白からなる１〜２μｍに及ぶ結晶を形成し、こ
の結晶蛋白を摂食した鱗翅目害虫は、摂食活動を停止し
、腸管破裂等ののち、死に至ることが知られている。バ
チラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原やエステラー
ゼ活性などにより２９亜種に分類されており、各々の菌
株は特異的、かつそれぞれ異なる殺虫活性を示す。各種
菌株の中から防除目的の害虫に対して最も有効な菌株を
選定し、それを培養することによって国体内に殺虫蛋白
を作らせ、殺虫蛋白、胞子及び菌体残渣を含む懸濁液に
タルク等を混合することにより製剤を調製し、それを殺
虫剤として用いる。
に殺虫蛋白からなる１〜２μｍに及ぶ結晶を形成し、こ
の結晶蛋白を摂食した鱗翅目害虫は、摂食活動を停止し
、腸管破裂等ののち、死に至ることが知られている。バ
チラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原やエステラー
ゼ活性などにより２９亜種に分類されており、各々の菌
株は特異的、かつそれぞれ異なる殺虫活性を示す。各種
菌株の中から防除目的の害虫に対して最も有効な菌株を
選定し、それを培養することによって国体内に殺虫蛋白
を作らせ、殺虫蛋白、胞子及び菌体残渣を含む懸濁液に
タルク等を混合することにより製剤を調製し、それを殺
虫剤として用いる。
皿題五犬東玉役
本発明者らは、遺伝子工学的手法を用いて殺虫スペクト
ルの広いバチラス・チュリンゲンシス殺虫蛋白製剤を生
産することを目的とし、公知の菌バチラス・チュリンゲ
ンシス・アイザワイ ＩＰＬ株の保持する２種の異なる
殺虫活性を有する殺虫蛋白遺伝子について研究を重ねた
結果、特にコナガ。
ルの広いバチラス・チュリンゲンシス殺虫蛋白製剤を生
産することを目的とし、公知の菌バチラス・チュリンゲ
ンシス・アイザワイ ＩＰＬ株の保持する２種の異なる
殺虫活性を有する殺虫蛋白遺伝子について研究を重ねた
結果、特にコナガ。
ハスモンヨトウに対し強い殺虫活性を示す１３０ＫＤａ
の殺虫蛋白（以下１３０ＫＤａ殺虫蛋白と呼ぶ）及びカ
イコに対し強い殺虫活性を示す１３５ＫＤａの殺虫蛋白
（以下１３５ＫＤａ殺虫蛋白と呼ぶ）の両殺虫蛋白遺伝
子を微生物菌体内で同時に発現させる発現用プラスミド
及び該プラスミドを保持し両殺虫蛋白を生産する微生物
を創製し、この微生物を培養することにより、異なる殺
虫活性を有する２つの殺虫蛋白を同時に、大量生産する
製造方法を完成した。
の殺虫蛋白（以下１３０ＫＤａ殺虫蛋白と呼ぶ）及びカ
イコに対し強い殺虫活性を示す１３５ＫＤａの殺虫蛋白
（以下１３５ＫＤａ殺虫蛋白と呼ぶ）の両殺虫蛋白遺伝
子を微生物菌体内で同時に発現させる発現用プラスミド
及び該プラスミドを保持し両殺虫蛋白を生産する微生物
を創製し、この微生物を培養することにより、異なる殺
虫活性を有する２つの殺虫蛋白を同時に、大量生産する
製造方法を完成した。
本発明に用いる殺虫蛋白遺伝子は特にコナガ、ノ＼スモ
ンヨトウに対し強い殺虫活性を示す１３０ＫＤａ殺虫蛋
白遺伝子（特開昭６２−１００２９２）及びカイコに対
し強い殺虫活性を示す１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子（特
願昭６ｌ−１９３４８３）である。本発明の２種の殺虫
蛋白同時発現用プラスミドは、プロモーター及びクーミ
ネーターを保持する一方の殺虫蛋白遺伝子カートリッジ
の構造遺伝子の上流または下流に他の殺虫蛋白遺伝子を
直列に同方向に挿入し、接続することにより製造するこ
とができる。ここで挿入する方の殺虫蛋白遺伝子は殺虫
蛋白構造遺伝子のみの場合、上流にプロモーターおよび
ＳＤ領領域有する遺伝子の場合あるいは上流に５ＤＳＩ
域を有する遺伝子の場合のいずれでもよい。さらに、２
種の殺虫蛋白につき、各々プロモーター及びターミネー
タ−を保持する殺虫蛋白遺伝子カートリッジを製造し、
カートリッジとカートリッジを直列に同方向に接続する
ことによっても製造できる。この例として、バチラス・
チュリンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ株の１３５ＫＤ
ａ殺虫蛋白遺伝子カートリツジを含む発現プラスミドｐ
ＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）に１３０ＫＤａ殺虫蛋白
遺伝子を同方向に挿入し接続することにより得られた２
種殺虫蛋白同時発現プラスミドｐＫＣＢ １を挙げるこ
とができる。
ンヨトウに対し強い殺虫活性を示す１３０ＫＤａ殺虫蛋
白遺伝子（特開昭６２−１００２９２）及びカイコに対
し強い殺虫活性を示す１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子（特
願昭６ｌ−１９３４８３）である。本発明の２種の殺虫
蛋白同時発現用プラスミドは、プロモーター及びクーミ
ネーターを保持する一方の殺虫蛋白遺伝子カートリッジ
の構造遺伝子の上流または下流に他の殺虫蛋白遺伝子を
直列に同方向に挿入し、接続することにより製造するこ
とができる。ここで挿入する方の殺虫蛋白遺伝子は殺虫
蛋白構造遺伝子のみの場合、上流にプロモーターおよび
ＳＤ領領域有する遺伝子の場合あるいは上流に５ＤＳＩ
域を有する遺伝子の場合のいずれでもよい。さらに、２
種の殺虫蛋白につき、各々プロモーター及びターミネー
タ−を保持する殺虫蛋白遺伝子カートリッジを製造し、
カートリッジとカートリッジを直列に同方向に接続する
ことによっても製造できる。この例として、バチラス・
チュリンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ株の１３５ＫＤ
ａ殺虫蛋白遺伝子カートリツジを含む発現プラスミドｐ
ＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）に１３０ＫＤａ殺虫蛋白
遺伝子を同方向に挿入し接続することにより得られた２
種殺虫蛋白同時発現プラスミドｐＫＣＢ １を挙げるこ
とができる。
また、構造遺伝子の前後にプロモーター及びターミネー
タ−を保持する２種の殺虫蛋白遺伝子カートリッジの接
続による２種の殺虫蛋白同時発現用プラスミドの例とし
て、発現プラスミドｐＴＢ１ （特開昭６２−１８１７
８４に従い、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ Ｎｏ、７株（ＦＥＲＭＢＰ−１１５０）より
構築できる ）由来の１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子カー
トリツジと発現プラスミドｐＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８
７）由来の１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子カートリツジの
接続により得られた発現プラスミドｐＴＢＫｃ５を挙げ
ることができる。
タ−を保持する２種の殺虫蛋白遺伝子カートリッジの接
続による２種の殺虫蛋白同時発現用プラスミドの例とし
て、発現プラスミドｐＴＢ１ （特開昭６２−１８１７
８４に従い、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ Ｎｏ、７株（ＦＥＲＭＢＰ−１１５０）より
構築できる ）由来の１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子カー
トリツジと発現プラスミドｐＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８
７）由来の１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子カートリツジの
接続により得られた発現プラスミドｐＴＢＫｃ５を挙げ
ることができる。
該技術を用い同一の殺虫蛋白遺伝子を直列に接続し、プ
ラスミド上の殺虫蛋白遺伝子のコピー数を倍化すること
ができ、このことにより殺虫蛋白の生産を増大させるこ
とも可能である。
ラスミド上の殺虫蛋白遺伝子のコピー数を倍化すること
ができ、このことにより殺虫蛋白の生産を増大させるこ
とも可能である。
遺伝子組換え技術によれば基本となるＯＮへの特定の部
位に、該ＤＮＡがコードする蛋白の基本的な特性を変化
させることなく、あるいは改善するように、人為的に変
異をおこすことができる。本発明により提供される、天
然の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡあるいは天然のもの
とは異なる塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡに関しても同
様に人為的に塩基の欠失、付加、置換などを行うことに
より天然の遺伝子と同等あるいは改善された特性とする
ことが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも
含むものである。
位に、該ＤＮＡがコードする蛋白の基本的な特性を変化
させることなく、あるいは改善するように、人為的に変
異をおこすことができる。本発明により提供される、天
然の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡあるいは天然のもの
とは異なる塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡに関しても同
様に人為的に塩基の欠失、付加、置換などを行うことに
より天然の遺伝子と同等あるいは改善された特性とする
ことが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも
含むものである。
本発明のバチラス・チュリンゲンシスの直列に接続され
た２種の殺虫蛋白遺伝子の発現のプロモーターおよびタ
ーミネータ−としては、発現ベクターｐＵｃ１Ｂ（ファ
ルマ゛シア社）のｌａｃプロモーター。
た２種の殺虫蛋白遺伝子の発現のプロモーターおよびタ
ーミネータ−としては、発現ベクターｐＵｃ１Ｂ（ファ
ルマ゛シア社）のｌａｃプロモーター。
発現ベクターｐＫＫ２２３−４（特願昭６Ｏ−２４２５
２８）のｔａｃプロモーター＋ ｒｒｎＢリボリームＲ
Ｎ＾ターミネータ−９発現ベクターｐＤＲ７２０（ファ
ルマシア社）の ゛□Ｌｒｐプロモーターあるいは
誘導可能な発現ベクターｐＰＬ、１ａｎｂｄａ （ファ
ルマシア社）のＰＬプロモータ−などを用いることがで
きる。
２８）のｔａｃプロモーター＋ ｒｒｎＢリボリームＲ
Ｎ＾ターミネータ−９発現ベクターｐＤＲ７２０（ファ
ルマシア社）の ゛□Ｌｒｐプロモーターあるいは
誘導可能な発現ベクターｐＰＬ、１ａｎｂｄａ （ファ
ルマシア社）のＰＬプロモータ−などを用いることがで
きる。
本発明の２種殺虫蛋白の同時発現プラスミドを、例えば
大腸菌ＪＭ１０９株（ファルマシア社）等の宿主微生物
へ導入することにより菌体内で２種の殺虫蛋白を同時発
現する微生物を得ることができる。
大腸菌ＪＭ１０９株（ファルマシア社）等の宿主微生物
へ導入することにより菌体内で２種の殺虫蛋白を同時発
現する微生物を得ることができる。
この様にして製造された形質転換微生物を、適当な培地
１条件で培養することにより、２種の殺虫蛋白を同時生
産することが可能である。培養後の殺虫蛍白の単離は、
例えば菌体を超音波で破砕し、遠心分離を行って、該殺
虫蛋白の凝集体を容易に濃縮１回収することにより行う
ことができる。
１条件で培養することにより、２種の殺虫蛋白を同時生
産することが可能である。培養後の殺虫蛍白の単離は、
例えば菌体を超音波で破砕し、遠心分離を行って、該殺
虫蛋白の凝集体を容易に濃縮１回収することにより行う
ことができる。
また、大腸菌の宿主−ベクター系のみならず、枯草菌、
酵母、シェードモナス菌、あるいは放線菌等の宿主−ベ
クター系も利用可能であり、それぞれの宿主−ベクター
系の特徴を生かした殺虫蛋白の大量生産が行える。
酵母、シェードモナス菌、あるいは放線菌等の宿主−ベ
クター系も利用可能であり、それぞれの宿主−ベクター
系の特徴を生かした殺虫蛋白の大量生産が行える。
以下に実施例を挙げ本発明の詳細な説明する。
本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく
、本発明の技術分野における通常の変更をすることがで
きる。
、本発明の技術分野における通常の変更をすることがで
きる。
スＪ側媚ｌ。
１．２種の殺虫蛋白の同時発現用プラスミドｐＫＣＢｌ
の構築 ステップ１；プラスミド９Ａ旧１の構築約５μｇの１３
０ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子発現用プラスミドｐＡｎｓ
（特開昭６２−１８１７８４）に２０ユニツトの制限酵
素Ｎｄｅ Ｉを加え、２００．ｃ＋ｊ！のＩｌｉｇｈ反
応液〔５０ＩＩＩＭトリス・塩酸（ｐＨ７，５）、１０
０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭＭｇＣｈ、 １ｍＭジチオ
スレイトール〕中で３７℃１時間反応後、反応液に等量
のクロロホルム・フェノール（１： １）混液を加え、
混合し、１０．０００μｌｍで５分間遠心した。上層を
分取した後、１１５０容の５ＭＮａＣｌ及び２容のエタ
ノールを加えて一８０°Ｃに１５分間放置することによ
りＤＮＡをエタノール沈澱した後、１０．００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心してＯＮ八を回収し、１０μ２の滅菌蒸
留水に懸濁した。以下、反応後の１）ＮＡの回収は上述
の方法に従い、実施した。得られた［ｌＮＡ溶液５μｌ
に１０ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー
断片を加え、２０μｌのポリメラーゼ反応液（５ＯＮＭ
リン酸カルシウム＋５ｍＭＭｇＣ１ｇ＋ １ ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５０μ！ｌ ｄＡＴＰ、
５０μ阿ｄＣＴＰ、 ５０１ＩＭ ｄＧＴｐ、
５０μＭ ＴＴＰ ）中３７℃で６０分間反応した
０反応後、常法に従い、クロロホルム−フェノール処理
、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し、ｌＯμ２の滅
菌蒸留水に懸濁した。得られたＤＮＡ溶液５μｌに、ハ
Ｌ旧リンカ−（宝酒造）１μ！を加え、ＤＮＡライゲー
ションキット （宝酒造）Ａ液４０μ！及び同Ｂ液を加
えて撹拌し、１６°Ｃ１時間反応した。その後、Ｃｏｈ
ｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡ、 ６９．２１１０−２１１４）に従
い、反応液を大腸菌ＪＭ１０３株（ファルマシア社）に
形質転換した。出現したアンピリジン耐性のコロニーを
培養し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋１．１５１３−１５２３）に従
いプラスミドＤＮ＾を調製した。約１７７ｇのプラスミ
ドＤＮＡに、３ユニツトの制限酵素Ｂａａ旧を加え、２
０μ２のＨｉ反応液（前述）中で３７°Ｃ１１時間反応
し、・ アガロースゲル電気泳動で分析した。約
２．４Ｋｂ及び３．８Ｋｂの２本のＢａａ ＨＩ断片を
持つプラスミドを選択し、これをｐＡＡｌ１した。（第
４図）ステップ２：２種の殺虫蛋白の同時発現用プラス
ミドｐＫＣＢ１の構築 １３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の発現用プラスミドｐＫＣ
６（特願昭６１−１９３４８３にかかる寄託微生物Ｅ、
ｃｏｌｉＪＭ１０３／ｐＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）
から得られる）の約５μｇに対し、２０ユニツトの制限
酵素Ｒａｍ Ｈｌを加え、２００μｌの旧ｇｈ反応液中
で３７℃、１時間反応し、常法に従いＤＮＡを回収し、
１０ｕ！！、の滅菌蒸留水に懸濁した。 １０μｌのＤ
ＮＡ溶液に５ユニツトのアルカリホスファターゼ（宝酒
造）を加え、ホスファターゼ反応液中で６０℃１時間反
応後、常法のフェノール−クロロホルム処理を２回行っ
た後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し、１ｏｔ
ｔｅの滅菌蒸留水に懸濁した。つぎに、約５μｇのブラ
スミＦ ＰＡＩＩＩＩニ制限酵素１１ａｍ ＩＩを加え
、２００ ｔｔ ｌ Ｈｉｇｈの反応液中で３７°Ｃ，
１時間反応後、反応後を常法に従い臭化エチジウムを含
む０．８％の低融点アガロースゲルに供し、電気泳動を
行った。常法に従い、紫外線ランプ下で、３．８Ｋｂの
ＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、ゲルを融解し
た。さらにフェノール処理を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱により回収し、１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。
の構築 ステップ１；プラスミド９Ａ旧１の構築約５μｇの１３
０ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子発現用プラスミドｐＡｎｓ
（特開昭６２−１８１７８４）に２０ユニツトの制限酵
素Ｎｄｅ Ｉを加え、２００．ｃ＋ｊ！のＩｌｉｇｈ反
応液〔５０ＩＩＩＭトリス・塩酸（ｐＨ７，５）、１０
０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭＭｇＣｈ、 １ｍＭジチオ
スレイトール〕中で３７℃１時間反応後、反応液に等量
のクロロホルム・フェノール（１： １）混液を加え、
混合し、１０．０００μｌｍで５分間遠心した。上層を
分取した後、１１５０容の５ＭＮａＣｌ及び２容のエタ
ノールを加えて一８０°Ｃに１５分間放置することによ
りＤＮＡをエタノール沈澱した後、１０．００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心してＯＮ八を回収し、１０μ２の滅菌蒸
留水に懸濁した。以下、反応後の１）ＮＡの回収は上述
の方法に従い、実施した。得られた［ｌＮＡ溶液５μｌ
に１０ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー
断片を加え、２０μｌのポリメラーゼ反応液（５ＯＮＭ
リン酸カルシウム＋５ｍＭＭｇＣ１ｇ＋ １ ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５０μ！ｌ ｄＡＴＰ、
５０μ阿ｄＣＴＰ、 ５０１ＩＭ ｄＧＴｐ、
５０μＭ ＴＴＰ ）中３７℃で６０分間反応した
０反応後、常法に従い、クロロホルム−フェノール処理
、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し、ｌＯμ２の滅
菌蒸留水に懸濁した。得られたＤＮＡ溶液５μｌに、ハ
Ｌ旧リンカ−（宝酒造）１μ！を加え、ＤＮＡライゲー
ションキット （宝酒造）Ａ液４０μ！及び同Ｂ液を加
えて撹拌し、１６°Ｃ１時間反応した。その後、Ｃｏｈ
ｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ、 ＵＳＡ、 ６９．２１１０−２１１４）に従
い、反応液を大腸菌ＪＭ１０３株（ファルマシア社）に
形質転換した。出現したアンピリジン耐性のコロニーを
培養し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋１．１５１３−１５２３）に従
いプラスミドＤＮ＾を調製した。約１７７ｇのプラスミ
ドＤＮＡに、３ユニツトの制限酵素Ｂａａ旧を加え、２
０μ２のＨｉ反応液（前述）中で３７°Ｃ１１時間反応
し、・ アガロースゲル電気泳動で分析した。約
２．４Ｋｂ及び３．８Ｋｂの２本のＢａａ ＨＩ断片を
持つプラスミドを選択し、これをｐＡＡｌ１した。（第
４図）ステップ２：２種の殺虫蛋白の同時発現用プラス
ミドｐＫＣＢ１の構築 １３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の発現用プラスミドｐＫＣ
６（特願昭６１−１９３４８３にかかる寄託微生物Ｅ、
ｃｏｌｉＪＭ１０３／ｐＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）
から得られる）の約５μｇに対し、２０ユニツトの制限
酵素Ｒａｍ Ｈｌを加え、２００μｌの旧ｇｈ反応液中
で３７℃、１時間反応し、常法に従いＤＮＡを回収し、
１０ｕ！！、の滅菌蒸留水に懸濁した。 １０μｌのＤ
ＮＡ溶液に５ユニツトのアルカリホスファターゼ（宝酒
造）を加え、ホスファターゼ反応液中で６０℃１時間反
応後、常法のフェノール−クロロホルム処理を２回行っ
た後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し、１ｏｔ
ｔｅの滅菌蒸留水に懸濁した。つぎに、約５μｇのブラ
スミＦ ＰＡＩＩＩＩニ制限酵素１１ａｍ ＩＩを加え
、２００ ｔｔ ｌ Ｈｉｇｈの反応液中で３７°Ｃ，
１時間反応後、反応後を常法に従い臭化エチジウムを含
む０．８％の低融点アガロースゲルに供し、電気泳動を
行った。常法に従い、紫外線ランプ下で、３．８Ｋｂの
ＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、ゲルを融解し
た。さらにフェノール処理を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱により回収し、１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。
このようにして調製した約１μｇのＢａｎ ＩＩＩ切断
済みのプラスミドｐＫＣ６と約１μｇの３．８Ｋｂの旦
ｍＨＩＤＮＡ断片を混合し、全容１０μ２とし、ＤＮＡ
ライゲージ式ンキンキット宝酒造）Ａ液４０μｌ及び同
Ｂ液５μｌを加えて撹拌し、１６°Ｃで１時間反応した
。
済みのプラスミドｐＫＣ６と約１μｇの３．８Ｋｂの旦
ｍＨＩＤＮＡ断片を混合し、全容１０μ２とし、ＤＮＡ
ライゲージ式ンキンキット宝酒造）Ａ液４０μｌ及び同
Ｂ液５μｌを加えて撹拌し、１６°Ｃで１時間反応した
。
その後、反応液５μ！を大腸菌ＪＭ１０９株コンピーテ
ントセル（宝酒造）１００μｌと混合後、０℃３０分放
置した後４２°Ｃで２分間熱処理した。この溶液に９０
０μ２のＬブロス培地〔１２の蒸留水に対し、Ｌｏｇの
トリプトン（デイフコ社）、５ｇのイーストエキストラ
クト（デイフコ社）、５ｇのＮａＣ１を含む培地）を加
え、３７°Ｃ１時間インキュベート後、５０μ５７ｍ１
のアンピシリンを含むＬプロス寒天培地（Ｌプロス液体
培地１Ｎに対して１２ｇの寒天を含む。）にプレートし
た。出現したアンピシリン耐性のコロニーを培養し、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｎらの方法に従いプラスミドＤＮＡを調製
した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの制限
酵素Ｂａｎ Ｉｌｌを加え、２０μｌのＩｌｉｇｈ反応
液中で３７”Ｃ，１時間反応し、アガロースゲル電気泳
動で分析した。インサートＤＮＡとして３．８ＫｂのＢ
ａｎ Ｈ１断片を持つプラスミドを選択し、これをｐＫ
ＣＢＩとした。（第４図）■、大腸菌での殺虫蛋白の生
産 構築した発現プラスミドｐＫＣＢ１をＣｏｈｅｎ らの
方法に従い、大腸曹ＪＭ１０９株へ導入した。得られた
大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１が生産するバチ
ラス・チュリンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ株の殺虫
蛋白の同定・分析を以下の如く行った。大腸菌Ｊ旧０９
／ｐＫＣＢ１株を最終濃度５０ａｇ／ｙｄのアンピシリ
ンを含むしブロス液体培地中で一夜培養する。
ントセル（宝酒造）１００μｌと混合後、０℃３０分放
置した後４２°Ｃで２分間熱処理した。この溶液に９０
０μ２のＬブロス培地〔１２の蒸留水に対し、Ｌｏｇの
トリプトン（デイフコ社）、５ｇのイーストエキストラ
クト（デイフコ社）、５ｇのＮａＣ１を含む培地）を加
え、３７°Ｃ１時間インキュベート後、５０μ５７ｍ１
のアンピシリンを含むＬプロス寒天培地（Ｌプロス液体
培地１Ｎに対して１２ｇの寒天を含む。）にプレートし
た。出現したアンピシリン耐性のコロニーを培養し、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｎらの方法に従いプラスミドＤＮＡを調製
した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの制限
酵素Ｂａｎ Ｉｌｌを加え、２０μｌのＩｌｉｇｈ反応
液中で３７”Ｃ，１時間反応し、アガロースゲル電気泳
動で分析した。インサートＤＮＡとして３．８ＫｂのＢ
ａｎ Ｈ１断片を持つプラスミドを選択し、これをｐＫ
ＣＢＩとした。（第４図）■、大腸菌での殺虫蛋白の生
産 構築した発現プラスミドｐＫＣＢ１をＣｏｈｅｎ らの
方法に従い、大腸曹ＪＭ１０９株へ導入した。得られた
大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１が生産するバチ
ラス・チュリンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ株の殺虫
蛋白の同定・分析を以下の如く行った。大腸菌Ｊ旧０９
／ｐＫＣＢ１株を最終濃度５０ａｇ／ｙｄのアンピシリ
ンを含むしブロス液体培地中で一夜培養する。
０．３ｍｌの終夜培養液を分取し、遠心操作（１０゜０
００ｒｐｔｍ、 ２分間）により集菌し、１００μｆ
のサンプル緩衝液（６２，５ｇＭ ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，８）、 ２％（ｗ／ｖ） ドデシル硫酸ナトリ
ウム、５％（ｖ／ｖ） ２−メルカプトエタノール、
１０％（Ｖ／Ｖ）グリセノール。
００ｒｐｔｍ、 ２分間）により集菌し、１００μｆ
のサンプル緩衝液（６２，５ｇＭ ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ８，８）、 ２％（ｗ／ｖ） ドデシル硫酸ナトリ
ウム、５％（ｖ／ｖ） ２−メルカプトエタノール、
１０％（Ｖ／Ｖ）グリセノール。
０．０１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー）に懸濁
後、１００″Ｃで５分間熱処理した。１０．０ＯＯｒｐ
−で５分間遠心し上清を分取した後、その２０μｌをＬ
ａｅＩＩＩＩＩｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７．
６８０−６８５）に従ってＳＯＳポリアクリルアミド電
気泳動にかけた。泳動後、ゲルをクマジーブリリアント
プルーで染色し、脱気乾燥してろ紙に固定した。その結
果、発現プラスミドｐＫＣＢ Ｉを含む大腸菌ＪＭ１０
９株では、分子量１３０ＫＤａと１３５にＤａの２種の
殺虫蛋白バンドが検出された。ゲル上の両蛋白バンドを
デンシトメーターで測定したところ、大腸菌ＪＭ１０９
／ｐＫＣＢ１株はそれぞれ全菌体蛋白あたり５％の１３
０ＫＤａおよび３．５％の１３５ＫＤａ殺虫蛋白を同時
生産していた。従って、大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐ
ＫＣＢ Ｉは、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワ
イ ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白である１３０ＫＤａおよ
び１３５ＫＤａ殺虫蛋白を効率よく同時生産しているこ
とが明らかとなった。
後、１００″Ｃで５分間熱処理した。１０．０ＯＯｒｐ
−で５分間遠心し上清を分取した後、その２０μｌをＬ
ａｅＩＩＩＩＩｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７．
６８０−６８５）に従ってＳＯＳポリアクリルアミド電
気泳動にかけた。泳動後、ゲルをクマジーブリリアント
プルーで染色し、脱気乾燥してろ紙に固定した。その結
果、発現プラスミドｐＫＣＢ Ｉを含む大腸菌ＪＭ１０
９株では、分子量１３０ＫＤａと１３５にＤａの２種の
殺虫蛋白バンドが検出された。ゲル上の両蛋白バンドを
デンシトメーターで測定したところ、大腸菌ＪＭ１０９
／ｐＫＣＢ１株はそれぞれ全菌体蛋白あたり５％の１３
０ＫＤａおよび３．５％の１３５ＫＤａ殺虫蛋白を同時
生産していた。従って、大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐ
ＫＣＢ Ｉは、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワ
イ ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白である１３０ＫＤａおよ
び１３５ＫＤａ殺虫蛋白を効率よく同時生産しているこ
とが明らかとなった。
■、大腸菌で生産された殺虫蛋白の調製法大腸菌組換え
体ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１株を、Ｌブロス液体培地中で
一夜培養した後、そのＯ，ｌｄｔを１０１ｄのＬプロス
培地に移し、３７℃で２０時間培養した。培養液５−を
分取し、６．０ＯＯｒｐ１５分間遠心して菌を集め、−
８０℃で凍結させた後、室温で融解させた。この操作を
３回くり返した後、２ｄのＴＥｉ衝液（１０ｗｍｏｌ
Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ （ＰＨ７，５）／ １ｍｍｏｌ Ｅ
ＤＴＡ）に懸濁し３０秒づつ５回の超音波処理を行った
。つぎに、この粗抽出液を７ 、０００ｒｐｎ＋で５分
間遠心し沈澱を集めた。調製した沈澱画分を５ＯＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、含ま
れる全蛋白の少なくとも８５％が殺虫蛋白であった。
体ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１株を、Ｌブロス液体培地中で
一夜培養した後、そのＯ，ｌｄｔを１０１ｄのＬプロス
培地に移し、３７℃で２０時間培養した。培養液５−を
分取し、６．０ＯＯｒｐ１５分間遠心して菌を集め、−
８０℃で凍結させた後、室温で融解させた。この操作を
３回くり返した後、２ｄのＴＥｉ衝液（１０ｗｍｏｌ
Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ （ＰＨ７，５）／ １ｍｍｏｌ Ｅ
ＤＴＡ）に懸濁し３０秒づつ５回の超音波処理を行った
。つぎに、この粗抽出液を７ 、０００ｒｐｎ＋で５分
間遠心し沈澱を集めた。調製した沈澱画分を５ＯＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、含ま
れる全蛋白の少なくとも８５％が殺虫蛋白であった。
従って、上記調製法を用いることにより、容易に効率良
く殺虫蛋白を調製できることが明らかとなった。なお、
この調製法は、大量の培養液についてもを効であること
を確認している。ＩＩ！、培養液あたり約２７０ｍｇの
殺虫蛋白が生産された− １３０ＫＤａと１３５ＫＤａ
蛋白の量比はほぼｌ：１であった。
く殺虫蛋白を調製できることが明らかとなった。なお、
この調製法は、大量の培養液についてもを効であること
を確認している。ＩＩ！、培養液あたり約２７０ｍｇの
殺虫蛋白が生産された− １３０ＫＤａと１３５ＫＤａ
蛋白の量比はほぼｌ：１であった。
■、大腸菌で生産された殺虫蛋白の殺虫活性■に記載し
た方法で、大腸菌組換え体 ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ １株からＢＴ殺虫蛋白を調製し
た。 １０ｇの鱗翅目幼虫用人工飼料を準備し、これに
調製した殺虫蛋白懸濁液を加えた。処理した後、風乾し
、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ １ｉＬｕｒ
ａ）あるいはカイコ（Ｂｏｗ旦ｘ ５ｏｒｔ）の４令幼
虫をそれぞれｌＯ匹放飼した。放飼後、摂食３日間行わ
せた後、死亡した幼虫数を調査した。対照としては、大
腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＴＢ１ （特開昭６２−１
８１７８４）および大腸菌、組換え体ＪＭ１０９／ｐＫ
Ｃ６（ＡＴＣＣ６７４８７）からそれぞれ調製した１３
０にＤａ殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白を用いた
。カイコに対し各種殺虫蛋白１０μｇを人工飼料に処理
した場合、１３５ＫＤａ殺虫蛋白および１３０ＫＤａ殺
虫蛋白では、各々１０匹ウニ０匹およびｌＯ匹ウニ匹の
死亡が認められた。このとき、ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１
株由来の１３０ＫＤａ、 １３５ＫＤａ混合殺虫蛋白で
は、１０匹ウニ匹の死亡が認められた。一方、分類学上
、カイコと異なるハスモンヨトウに対し、各種殺虫蛋白
２００ｔＩｇを人工飼料に処理した場合、１３０にＤａ
殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白では、各々１０匹
ウニ０匹およびｌＯ匹ウニ匹の死亡が認められた。この
とき、ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１株由来の１３０ＫＤａ、
１３５ＫＤａ混合殺虫蛋白では、１０匹中子匹の死亡
が認められた。従って、本発明の大腸菌組換え体ＪＭ１
０９／ｐＫＣＢ １株のつくる殺虫蛋白は、上記の両昆
虫に対しを効な殺虫蛋白であることが判明した。
た方法で、大腸菌組換え体 ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ １株からＢＴ殺虫蛋白を調製し
た。 １０ｇの鱗翅目幼虫用人工飼料を準備し、これに
調製した殺虫蛋白懸濁液を加えた。処理した後、風乾し
、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ １ｉＬｕｒ
ａ）あるいはカイコ（Ｂｏｗ旦ｘ ５ｏｒｔ）の４令幼
虫をそれぞれｌＯ匹放飼した。放飼後、摂食３日間行わ
せた後、死亡した幼虫数を調査した。対照としては、大
腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＴＢ１ （特開昭６２−１
８１７８４）および大腸菌、組換え体ＪＭ１０９／ｐＫ
Ｃ６（ＡＴＣＣ６７４８７）からそれぞれ調製した１３
０にＤａ殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白を用いた
。カイコに対し各種殺虫蛋白１０μｇを人工飼料に処理
した場合、１３５ＫＤａ殺虫蛋白および１３０ＫＤａ殺
虫蛋白では、各々１０匹ウニ０匹およびｌＯ匹ウニ匹の
死亡が認められた。このとき、ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１
株由来の１３０ＫＤａ、 １３５ＫＤａ混合殺虫蛋白で
は、１０匹ウニ匹の死亡が認められた。一方、分類学上
、カイコと異なるハスモンヨトウに対し、各種殺虫蛋白
２００ｔＩｇを人工飼料に処理した場合、１３０にＤａ
殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白では、各々１０匹
ウニ０匹およびｌＯ匹ウニ匹の死亡が認められた。この
とき、ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ１株由来の１３０ＫＤａ、
１３５ＫＤａ混合殺虫蛋白では、１０匹中子匹の死亡
が認められた。従って、本発明の大腸菌組換え体ＪＭ１
０９／ｐＫＣＢ １株のつくる殺虫蛋白は、上記の両昆
虫に対しを効な殺虫蛋白であることが判明した。
実施例２
１．２種の殺虫蛋白の同時発現用プラスミド９７ＢＫＣ
５の構築 ステップｌニブラスミドｐＴＢＩｓの構築約５μｇの１
３０にＤａの殺虫蛋白遺伝子発現用プラスミドｐＴＢＩ
（特開昭６２−１８１７８４に従い、バチラス・チュ
リンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ Ｎｏ、７株（ＦＥ
Ｉ？Ｍ ＢＰ−１１５０）より構築できる ）に２０ユ
ニツトの制限酵素Ｎｄｅｌを加え、２００μｌの旧ｇｈ
反応液〔５０ＩＩＩＭトリス、塩酸（Ｐ Ｈ７，５）
、１００ｍＭ Ｎａｃｌ。
５の構築 ステップｌニブラスミドｐＴＢＩｓの構築約５μｇの１
３０にＤａの殺虫蛋白遺伝子発現用プラスミドｐＴＢＩ
（特開昭６２−１８１７８４に従い、バチラス・チュ
リンゲンシス・アイザワイ ＩＰＬ Ｎｏ、７株（ＦＥ
Ｉ？Ｍ ＢＰ−１１５０）より構築できる ）に２０ユ
ニツトの制限酵素Ｎｄｅｌを加え、２００μｌの旧ｇｈ
反応液〔５０ＩＩＩＭトリス、塩酸（Ｐ Ｈ７，５）
、１００ｍＭ Ｎａｃｌ。
１０ｍＭ Ｍｇｃｈ＋ ｌａ＋Ｍジチオスレイトール
〕中で３７℃１時間反応後、反応液に等量のクロロホル
ム・フェノール（１：１）混液を加え、混合し、１０゜
００Ｏｒｐｍで５分間遠心した。実施例１の■−ステッ
プ１に従いＤＮＡを回収し、１０μ２の滅菌蒸留水に懸
濁した。得られたＤＮＡ溶液５μＥに１０ユニツトの大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片を加え、２０ｔ
ｔｌｌのポリメラーゼ反応液〔５０１μｌＭリン酸カル
シウム、５＋ｗ？ｌ Ｍｇｃｌｚ、１ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、５０ｕＭｄＡＴＰ、 ５０ｕＭｄＧＴＰ
、 ５０ｕ ＭｄＴＴＰ ）中３７℃で６０分間反応し
た０反応後、常法に従い、クロロホルム・フェノール処
理、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し、１０μｌの
減面蒸留水にｇ濁した。得られたＤＮＡ溶液５μｌに、
Ｌ旦ｌ工！リンカ−（宝酒造）１〃（を加え、ＤＮＡラ
イゲージロンキット（宝酒造）Ａ液４ｏＩＩＩ！、及び
同Ｂ液５μｉを加えて撹拌し、１６°ＣＳ １時間反応
した。その後、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ。
〕中で３７℃１時間反応後、反応液に等量のクロロホル
ム・フェノール（１：１）混液を加え、混合し、１０゜
００Ｏｒｐｍで５分間遠心した。実施例１の■−ステッ
プ１に従いＤＮＡを回収し、１０μ２の滅菌蒸留水に懸
濁した。得られたＤＮＡ溶液５μＥに１０ユニツトの大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片を加え、２０ｔ
ｔｌｌのポリメラーゼ反応液〔５０１μｌＭリン酸カル
シウム、５＋ｗ？ｌ Ｍｇｃｌｚ、１ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、５０ｕＭｄＡＴＰ、 ５０ｕＭｄＧＴＰ
、 ５０ｕ ＭｄＴＴＰ ）中３７℃で６０分間反応し
た０反応後、常法に従い、クロロホルム・フェノール処
理、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し、１０μｌの
減面蒸留水にｇ濁した。得られたＤＮＡ溶液５μｌに、
Ｌ旦ｌ工！リンカ−（宝酒造）１〃（を加え、ＤＮＡラ
イゲージロンキット（宝酒造）Ａ液４ｏＩＩＩ！、及び
同Ｂ液５μｉを加えて撹拌し、１６°ＣＳ １時間反応
した。その後、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ。
Ａｃａｄ Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 ６９．２１１０−２
１１４）に従い、反応液を大腸菌ＪＭ １０９株（ファ
ルマシア社）に形質転換した。出現したアンピシリン耐
性のコロニーをＬブロス培地にて培養し、Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍらの方法（ＮｕｃＪｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ
、＞ ７．１５１３−１５２３）に従い、プラスミドＤ
ＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに、３ユ
ニツトの制限酵素Ｓａｊ！Ｉを加え、２０μ２の旧ｇｈ
反応液（前述）中で３７℃、１時間反応し、アガロース
ゲル電気泳動で分析した。
１１４）に従い、反応液を大腸菌ＪＭ １０９株（ファ
ルマシア社）に形質転換した。出現したアンピシリン耐
性のコロニーをＬブロス培地にて培養し、Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍらの方法（ＮｕｃＪｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅｓ
、＞ ７．１５１３−１５２３）に従い、プラスミドＤ
ＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに、３ユ
ニツトの制限酵素Ｓａｊ！Ｉを加え、２０μ２の旧ｇｈ
反応液（前述）中で３７℃、１時間反応し、アガロース
ゲル電気泳動で分析した。
約１．６Ｋｂおよび６．６Ｋｂの２本のΣｌ工■断片を
持つプラスミドを選択し、これをｐＴＢＩ−１２とした
。
持つプラスミドを選択し、これをｐＴＢＩ−１２とした
。
さらにｐＴＢＩ−１２の盈エエ■切断混液５．ｆｆｉに
ＤＮＡライゲージタンキットＡ液４０ａｌｔ、Ｂ液μｌ
を加え、３７°Ｃで１時間反応し、大腸菌ＪＭ １０９
株に形質転換した。得られたコロニーから前述のように
プラスミドＤＮＡを調製し、６．６ＫｂのΣａｊ！ｒ断
片のみを生じるクローンを選択し、そのプラスミドをｐ
ＴＢＩｓとした。
ＤＮＡライゲージタンキットＡ液４０ａｌｔ、Ｂ液μｌ
を加え、３７°Ｃで１時間反応し、大腸菌ＪＭ １０９
株に形質転換した。得られたコロニーから前述のように
プラスミドＤＮＡを調製し、６．６ＫｂのΣａｊ！ｒ断
片のみを生じるクローンを選択し、そのプラスミドをｐ
ＴＢＩｓとした。
ステップ２ ： １３５ＫＤａ蛋白遺伝子を含む５Ｋｂ
Ｓａｊ２Ｉカートリツジの作製 約５μｇの１３５ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子発現用プラス
ミドｐＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）に１０ユニツトの
制限酵素Ｎ ｒ ｕ Ｉ （バイオ・ラボ社）を加え
、２００μｌのＮｒｕ Ｉ反応液Ｉ ５０１１Ｍ トリ
ト・塩酸（ｐＨ７゜５ ） 、５０ｅｓＨＮａｃｌ、
５抛Ｍ ＫＣｌ、 １０ｗＭ ＭｇＣｈ ）中で３７°
Ｃｔ時間反応後、常法に従い臭化エチジウムを含む０．
８％のアガロース電気泳動により、ＤＮＡが１カ所切断
が行われていることを確認した。引きつづき、フェノー
ル処理及びエタノール沈澱を行ない、ＤＮＡを回収しｌ
Ｏμｌの滅菌蒸留水に懸濁した。このようにして調製し
たＤＮＡ溶液５μｉに５ＪＩｆｆｉの制限酵素Ｓｃａ
ｌを加え、１００ＩＩＮのＳｃａ Ｉ反応液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （Ｐ Ｈ８，０）、２０ｗＭＫ
ｃ１ 、７ｍＭ Ｍｇｃｌｔ 、 ７ｍＭ ２−ＭｅＯ
Ｈ）中で３７℃１時間反応後、常法に従いフェノール抽
出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し、１０μｌ
の滅菌蒸留水に懸濁した。
Ｓａｊ２Ｉカートリツジの作製 約５μｇの１３５ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子発現用プラス
ミドｐＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）に１０ユニツトの
制限酵素Ｎ ｒ ｕ Ｉ （バイオ・ラボ社）を加え
、２００μｌのＮｒｕ Ｉ反応液Ｉ ５０１１Ｍ トリ
ト・塩酸（ｐＨ７゜５ ） 、５０ｅｓＨＮａｃｌ、
５抛Ｍ ＫＣｌ、 １０ｗＭ ＭｇＣｈ ）中で３７°
Ｃｔ時間反応後、常法に従い臭化エチジウムを含む０．
８％のアガロース電気泳動により、ＤＮＡが１カ所切断
が行われていることを確認した。引きつづき、フェノー
ル処理及びエタノール沈澱を行ない、ＤＮＡを回収しｌ
Ｏμｌの滅菌蒸留水に懸濁した。このようにして調製し
たＤＮＡ溶液５μｉに５ＪＩｆｆｉの制限酵素Ｓｃａ
ｌを加え、１００ＩＩＮのＳｃａ Ｉ反応液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （Ｐ Ｈ８，０）、２０ｗＭＫ
ｃ１ 、７ｍＭ Ｍｇｃｌｔ 、 ７ｍＭ ２−ＭｅＯ
Ｈ）中で３７℃１時間反応後、常法に従いフェノール抽
出、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し、１０μｌ
の滅菌蒸留水に懸濁した。
一方、５ｇｇのクローニングベクターｐＵｃ１８（ファ
ルマシア社）に対し、５ユニツトの制限酵素Ｓｍａｌ（
全酒造）を加え、Ｓｍａ Ｉ反応液（１０ｍＭ トリス
・塩酸（Ｐ Ｈ７，５） 、２０ａ＋Ｍ ＫＣＩ ７ｍ
ＭＭｇｃｌｚ＋ ７ｍＭ ２−ＭｅＯＨ）中で３０°Ｃ
，１時間反応し、常法に従いＤＮＡを回収し、ｌＯμｌ
の滅菌蒸留水に懸濁した。１０μｌのＤＮＡ溶液に５ユ
ニツトのアルカリホスファターゼ（全酒造）を加え、ホ
スファターゼ反応液（１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８゜
０ ） 、１００ｍＭ ＭＣ１，１％Ｍｇ５Ｏ４）中で
６５℃１時間反応後、常法のフェノール・クロロホルム
処理を２回行った後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを
回収し、１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。このように
して調製した約１μｇのＳＣａ Ｔ切断済みのプラスミ
ドｐｔｌｃ１８と先に調製した約１μｇの５．０Ｋｂの
Ｓｍａ Ｉ−Ｎ二ｕｌＤＮＡ断片を混合し、全容１０μ
ｌとし、ＤＮＡライゲーションキット（全酒造）Ａ液４
０Ｉ！ｊ！及びＢ液５μ！を加えて撹拌し、１６°Ｃで
１時間反応した。その後、反応液５μｌを大腸菌ＪＭ
１０９株コンピーテントセル（全酒造）１００μ２と混
合し、形質転換を行った。形質転換体を最終濃度２１Ｉ
ＩＭのイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ Ｐ
Ｔ Ｇ ） ０．０５ｍＭｘ−ｇａｌ、および５０ｇ
ｇ／−のアンピシリンを含むレブロス平板培地（ｌＮの
蒸留水に対し、１０ｇのトリプトン（デイフコ社）、５
ｇのＮａｃｌ （牛丼化学）、５ｇのイーストエキスト
ラクト（デイフコ社）を加え、さらに１２ｇの寒天を加
え固化した培地）にプレートした。出現したアンピシリ
ン耐性の白色コロニーを培着し、プラスミドＤＮＡを調
製した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの制
限酵素５ａ１１を加え、２０μｌの旧ｇｈ反応液中で３
７°Ｃ，１時間反応し、アガロース電気泳動で分析した
。インサートＤＮＡとして５．ＯＫｂの５ａｆｆｉｌ断
片をもつプラスミドを選択し、これをｐＫ０５８とした
。１０ｇｇのプラスミドｐＫ０５８に対し１０ユニツト
の制限酵素）ユ」」を加えて、３７℃１時間反応後、反
応液を臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロー
スゲルに供し、電気泳動を行った。常法に従い、紫外線
ランプ下で５．ＯＫｂのＤＮＡ断片に相当するバンドを
切り出し、ゲルを融解した。さらにフェノール処理を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、１０μにの
滅菌蒸留水に懸濁した。
ルマシア社）に対し、５ユニツトの制限酵素Ｓｍａｌ（
全酒造）を加え、Ｓｍａ Ｉ反応液（１０ｍＭ トリス
・塩酸（Ｐ Ｈ７，５） 、２０ａ＋Ｍ ＫＣＩ ７ｍ
ＭＭｇｃｌｚ＋ ７ｍＭ ２−ＭｅＯＨ）中で３０°Ｃ
，１時間反応し、常法に従いＤＮＡを回収し、ｌＯμｌ
の滅菌蒸留水に懸濁した。１０μｌのＤＮＡ溶液に５ユ
ニツトのアルカリホスファターゼ（全酒造）を加え、ホ
スファターゼ反応液（１０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８゜
０ ） 、１００ｍＭ ＭＣ１，１％Ｍｇ５Ｏ４）中で
６５℃１時間反応後、常法のフェノール・クロロホルム
処理を２回行った後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを
回収し、１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。このように
して調製した約１μｇのＳＣａ Ｔ切断済みのプラスミ
ドｐｔｌｃ１８と先に調製した約１μｇの５．０Ｋｂの
Ｓｍａ Ｉ−Ｎ二ｕｌＤＮＡ断片を混合し、全容１０μ
ｌとし、ＤＮＡライゲーションキット（全酒造）Ａ液４
０Ｉ！ｊ！及びＢ液５μ！を加えて撹拌し、１６°Ｃで
１時間反応した。その後、反応液５μｌを大腸菌ＪＭ
１０９株コンピーテントセル（全酒造）１００μ２と混
合し、形質転換を行った。形質転換体を最終濃度２１Ｉ
ＩＭのイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｉ Ｐ
Ｔ Ｇ ） ０．０５ｍＭｘ−ｇａｌ、および５０ｇ
ｇ／−のアンピシリンを含むレブロス平板培地（ｌＮの
蒸留水に対し、１０ｇのトリプトン（デイフコ社）、５
ｇのＮａｃｌ （牛丼化学）、５ｇのイーストエキスト
ラクト（デイフコ社）を加え、さらに１２ｇの寒天を加
え固化した培地）にプレートした。出現したアンピシリ
ン耐性の白色コロニーを培着し、プラスミドＤＮＡを調
製した。約１μｇのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの制
限酵素５ａ１１を加え、２０μｌの旧ｇｈ反応液中で３
７°Ｃ，１時間反応し、アガロース電気泳動で分析した
。インサートＤＮＡとして５．ＯＫｂの５ａｆｆｉｌ断
片をもつプラスミドを選択し、これをｐＫ０５８とした
。１０ｇｇのプラスミドｐＫ０５８に対し１０ユニツト
の制限酵素）ユ」」を加えて、３７℃１時間反応後、反
応液を臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロー
スゲルに供し、電気泳動を行った。常法に従い、紫外線
ランプ下で５．ＯＫｂのＤＮＡ断片に相当するバンドを
切り出し、ゲルを融解した。さらにフェノール処理を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、１０μにの
滅菌蒸留水に懸濁した。
ステップ３：発現プラスミドｐＴＢＫＣ５の構築的５μ
ｇのプラスミド９７ＢＩＳに１０ユニツトの制限酵素Σ
ａ１ｇを加え、１００ｔＩＩｌの旧ｇｈ反応液中で、３
７°Ｃ１時間反応後、常法に従い、クロロホルム・フェ
ノール処理およびエタノール沈澱を行いＤＮＡを回収１
０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。得られた１０μｌのＤ
ＮＡ溶液に５ユニツトのアルカリホスファターゼ（全酒
造）を加え、ホスファターゼ反応液（前述）中で３７°
Ｃ１時間反応後、常法のフェノール・クロロホルム処理
を２回行った後、エタノール沈澱し、ＤＮＡを回収し、
１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。このようにして調製
した一ミーェエＩ切断済みＤＮＡの５μ２に対し、ステ
ップ２で調製した５Ｋｂ旦土工■カートリツジ５μｌを
加え、常法に従いリガーゼ反応を行った。この反応液を
大腸菌ＪＭ １０９株に形質転換し、アンピシリン耐性
コロニーを選択した。常法に従いプラスミドＤＮＡを調
製後、制限酵素５ａｆｒ切断を行い、６．６Ｋｂおよび
５．ＯＫｂの断片を生じるコロニーを選択し、さらに制
限酵素ＢａｍＨＩの切断により６゜６にす、５．ＯＫｂ
の断片を生じるクローンｐＴＢＫ（：５を得た。このプ
ラスミドは、 ｔａｅプロモーターとｒｒｎＢターミネ
ータ−を含む１３０ＫＤａ蛋白遺伝子カートリツジとｔ
ａｃプロモーターとｒｒｎＢターミネータを含む、１３
５ＫＤａ蛋白遺伝子カートリツジが正方向に並んでいる
クローンであることが確認された。
ｇのプラスミド９７ＢＩＳに１０ユニツトの制限酵素Σ
ａ１ｇを加え、１００ｔＩＩｌの旧ｇｈ反応液中で、３
７°Ｃ１時間反応後、常法に従い、クロロホルム・フェ
ノール処理およびエタノール沈澱を行いＤＮＡを回収１
０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。得られた１０μｌのＤ
ＮＡ溶液に５ユニツトのアルカリホスファターゼ（全酒
造）を加え、ホスファターゼ反応液（前述）中で３７°
Ｃ１時間反応後、常法のフェノール・クロロホルム処理
を２回行った後、エタノール沈澱し、ＤＮＡを回収し、
１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。このようにして調製
した一ミーェエＩ切断済みＤＮＡの５μ２に対し、ステ
ップ２で調製した５Ｋｂ旦土工■カートリツジ５μｌを
加え、常法に従いリガーゼ反応を行った。この反応液を
大腸菌ＪＭ １０９株に形質転換し、アンピシリン耐性
コロニーを選択した。常法に従いプラスミドＤＮＡを調
製後、制限酵素５ａｆｒ切断を行い、６．６Ｋｂおよび
５．ＯＫｂの断片を生じるコロニーを選択し、さらに制
限酵素ＢａｍＨＩの切断により６゜６にす、５．ＯＫｂ
の断片を生じるクローンｐＴＢＫ（：５を得た。このプ
ラスミドは、 ｔａｅプロモーターとｒｒｎＢターミネ
ータ−を含む１３０ＫＤａ蛋白遺伝子カートリツジとｔ
ａｃプロモーターとｒｒｎＢターミネータを含む、１３
５ＫＤａ蛋白遺伝子カートリツジが正方向に並んでいる
クローンであることが確認された。
■、大腸菌での殺虫蛋白の生産
得られた大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ｐＴＢＫｃ５が
生産するバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の殺虫蛋白の同定・分析を実施例１の■に従い行っ
た。その結果、発現プラスミドｐＴＢＫＣ５を含む大腸
菌ＪＭ １０９株では、分子量１３０ＫＤａと１３５Ｋ
Ｄａの２種の殺虫蛋白バンドが検出された。ゲル上の両
蛋白バンドをデンシトメーターで測定したところ、大腸
菌ＪＭ １０９／ｐＴＢＫＣ５株はそれぞれ全菌体蛋白
あたり１２％の１３０ＫＤａおよび１２％の１３５ＫＤ
ａ殺虫蛋白を同時生産していた。従って、大腸菌組換え
体ＪＭ １０９／ ｐＴＢＫｃ５は、バチラス・チュリ
ンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白であ
る１３０ＫＤａおよび１３５ＫＤａ殺虫蛋白を効率よく
同時生産していることが明らかとなった。
生産するバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の殺虫蛋白の同定・分析を実施例１の■に従い行っ
た。その結果、発現プラスミドｐＴＢＫＣ５を含む大腸
菌ＪＭ １０９株では、分子量１３０ＫＤａと１３５Ｋ
Ｄａの２種の殺虫蛋白バンドが検出された。ゲル上の両
蛋白バンドをデンシトメーターで測定したところ、大腸
菌ＪＭ １０９／ｐＴＢＫＣ５株はそれぞれ全菌体蛋白
あたり１２％の１３０ＫＤａおよび１２％の１３５ＫＤ
ａ殺虫蛋白を同時生産していた。従って、大腸菌組換え
体ＪＭ １０９／ ｐＴＢＫｃ５は、バチラス・チュリ
ンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白であ
る１３０ＫＤａおよび１３５ＫＤａ殺虫蛋白を効率よく
同時生産していることが明らかとなった。
■、大腸菌で生産された殺虫蛋白の調製法大腸菌組換え
体ＪＭ １０９／ｐＴＢＫｃ５株から実施例１の■に従
い殺虫蛋白を調整した。調製した沈Ｒ＠分を５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、含ま
れる全蛋白の少な（とも９０％が殺虫蛋白であった。１
１の培養液あたり約３８０ｍｇの殺虫蛋白が生産された
。１３０にＤａと１３５ＫＤａの蛋白の量比は１：１で
あった。
体ＪＭ １０９／ｐＴＢＫｃ５株から実施例１の■に従
い殺虫蛋白を調整した。調製した沈Ｒ＠分を５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、含ま
れる全蛋白の少な（とも９０％が殺虫蛋白であった。１
１の培養液あたり約３８０ｍｇの殺虫蛋白が生産された
。１３０にＤａと１３５ＫＤａの蛋白の量比は１：１で
あった。
■、大腸苗で生産された殺虫蛋白の殺虫活性■に記載し
た方法で、大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ｐＴＢＫＣ５
株からＢＴ殺虫蛋白を調製した。１０ｇの鱗翅目幼虫用
人工飼料をに１ζ備し、これに■で調製した殺虫蛋白懸
濁液を以下の割合で加えた。処理した後、風乾し、ハス
モンヨトウ（ 鉢閃翌旦胆旦旦■）あるいハカイコ（動刃■Ｌ虻）の４
令幼虫をそれぞれ６匹放飼した。放飼後、ハスモンヨト
ウについては６日間、カイコについては３日間摂食させ
た後、死亡した幼虫数を調査した。対照としては、大腸
菌組換え体ＪＭ １０９／ρＴＢＩ （特開昭６２−１
８１７８４ ）および大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ｐ
ＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）からそれぞれ調製した１
３０ＫＤａ殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白を用い
た。カイコに対し各種殺虫蛋白５０μｇを人工飼料に処
理した場合、１３５ＫＤａ殺虫蛋白および１３０ＫＤａ
殺虫蛋白では、各々１００匹中８およびｌＯ匹中２匹の
死亡が認められた。このとき、ＪＭ １０９／ρＴＢＫ
Ｃ５株山来の１３０にＤａ、１３５ＫＤａ混合殺虫蛋白
では、１００匹中４の死亡が認められた。一方、分類学
上、カイコと異なるハスモンヨトウに対し、各種殺虫蛋
白５４０μｇを人工飼料に処理した場合、１３０ＫＤａ
殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白では、各々６匹中
２匹および６ウニＯ匹の死亡が認められた。なお、前者
ではさらに成育不良固体が２匹認められた。このとき、
ＪＭ １０９／ ｐＴＢＫｃ５株由来の１３０ＫＤａ、
１３５ＫＤａ混合蛋白では、６匹中２匹の死亡が認め
られた。
た方法で、大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ｐＴＢＫＣ５
株からＢＴ殺虫蛋白を調製した。１０ｇの鱗翅目幼虫用
人工飼料をに１ζ備し、これに■で調製した殺虫蛋白懸
濁液を以下の割合で加えた。処理した後、風乾し、ハス
モンヨトウ（ 鉢閃翌旦胆旦旦■）あるいハカイコ（動刃■Ｌ虻）の４
令幼虫をそれぞれ６匹放飼した。放飼後、ハスモンヨト
ウについては６日間、カイコについては３日間摂食させ
た後、死亡した幼虫数を調査した。対照としては、大腸
菌組換え体ＪＭ １０９／ρＴＢＩ （特開昭６２−１
８１７８４ ）および大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ｐ
ＫＣ６（ＡＴＣＣ６７４８７）からそれぞれ調製した１
３０ＫＤａ殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白を用い
た。カイコに対し各種殺虫蛋白５０μｇを人工飼料に処
理した場合、１３５ＫＤａ殺虫蛋白および１３０ＫＤａ
殺虫蛋白では、各々１００匹中８およびｌＯ匹中２匹の
死亡が認められた。このとき、ＪＭ １０９／ρＴＢＫ
Ｃ５株山来の１３０にＤａ、１３５ＫＤａ混合殺虫蛋白
では、１００匹中４の死亡が認められた。一方、分類学
上、カイコと異なるハスモンヨトウに対し、各種殺虫蛋
白５４０μｇを人工飼料に処理した場合、１３０ＫＤａ
殺虫蛋白および１３５ＫＤａ殺虫蛋白では、各々６匹中
２匹および６ウニＯ匹の死亡が認められた。なお、前者
ではさらに成育不良固体が２匹認められた。このとき、
ＪＭ １０９／ ｐＴＢＫｃ５株由来の１３０ＫＤａ、
１３５ＫＤａ混合蛋白では、６匹中２匹の死亡が認め
られた。
このときの飼料植物の食害の程度は、１３０ＫＤａ殺虫
蛋白、１３０にＤａおよび１３５ＫＤａ混合殺虫蛋白、
１３５ＫＤａ殺虫蛋白の順に大きかった。従って、本発
明の大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ ｐＴＢＫｃ５株の
つくる殺虫蛋白は、上記の両昆虫に対し十分に有効な殺
虫蛋白であることが判明した。
蛋白、１３０にＤａおよび１３５ＫＤａ混合殺虫蛋白、
１３５ＫＤａ殺虫蛋白の順に大きかった。従って、本発
明の大腸菌組換え体ＪＭ １０９／ ｐＴＢＫｃ５株の
つくる殺虫蛋白は、上記の両昆虫に対し十分に有効な殺
虫蛋白であることが判明した。
第１図は、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株のプラスミドＤＮＡからクローン化した１３０
ＫＤａ殺虫蛋白構造遺伝子の塩基配列および塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を示している。 第２図は、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の染色体［ＩＮＡからクローン化した１３５Ｋ
Ｄａ殺虫蛋白構造遺伝子の塩基配列および塩基配列から
推定されたアミノ酸配列を示している。 第３図は、プラスミドｐＫＣＢ １の１３０ＫＤａ殺虫
蛋白遺伝子および１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の接続部
位を示している。塩基配列およびボックスの下は各遺伝
子の由来部域を示している。塩基配列およびボックスの
上の矢印は制限酵素部位を、−３５および−１０は各々
１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の大腸菌プロモーター・コ
ンセンサス−３５領域、−１０ｅｌ域ヲ、ＳＤはＳｈｉ
ｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列を示している。 ム；勿１１１． ハ；」■。 釦／ ［１１１：勿ＩＩＩと勿Ｈ１の結合部位Ｈｃ／Ａ
ｈ： １ｌｉｎｃ ＩＩとＡｈａ Ｉ［１部位の結合部
位ＥＶ２２３−Ｉｆ発現ベクターｐＫＫ２２３−４Ｖ１
８Ｌ； ベクターｐＵｃ１８ （７）リンカ一部分１３
０ＫＤａ （５°）；１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の５
′末端部分１３０ＫＯａ；１３０ＫＤａ殺虫蛋白構造遺
伝子１３０ＫＤａ（３°）；１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝
子の３′末端部分１０塩基 １３０ＫＤａ（３’）と１３５にＤａ （５’ ）の間
に位置するＶ１８Ｌ；ベクターｐＵｃ１Ｂのリンカ一部
分２４塩基とそれに続＜２１０塩基 １・３５ＫＤａ（５’）；１３５にＤａ殺虫蛋白遺伝子
の５°末端部分１３！５ＫＤａ；１３５ＫＤａ殺虫蛋白
構造遺伝子１３５ＫＤａ（３’）；１３５ＫＤａ殺虫蛋
白遺伝子の３°末端部分ｔａｃ；ｔａｃプロモーター。 ｒｒｎＢ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；リポソームＲＮＡ遺
伝子のターミネータ− 黒色部分、白色部分はそれぞれ殺虫蛋白構造遺伝子およ
びその３°末端、５°末端部分を示す。 第４図は、１３０ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子をＢａｍＨＩ
カートリッジとして保有するプラスミドル＾旧１の構築
および１３０ＫＤａ、 １３５ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子
を同時発現するためのプラスミドｐＫＣＢ ｆの構築を
示している。 ｐａｌ Ｔ ： ＤＮＡポリメラーゼ［、Ｎｄ ：
Ｎｄｅ Ｉ 、 Ｂｍ ：抛ＩＩ Ｉ 、紅：」匹Ｉ
、ハデーハ１ｌＪｌｉ、ハ：」旦■。 虱： ｔａｃプロモーター、 ｒｒｎＢ （Ｔ）
：リポソームＲＮＡ遺伝子のターミネータ−を各々示す
。 白色部分、黒色部、およびドツト部分はそれぞれ奥プロ
モーター、殺虫蛋白遺伝子部分およびリボゾームＲＮＡ
遺伝子ターミネータ−を示している。 第５図は、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ １株で同時生
産された１３０ＫＤａおよび１３５ＫＤａ殺虫蛋白のＳ
ＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのデンシ
トメータースキャンを示している。 第６図は、１３０にＤａ、１３５ＫＤａの殺虫蛋白遺伝
子を同時に発現するためのプラスミドｐＴＢＫｃ５の構
築を示している。 ｐ ｏ ｌ ｒ ： ＤＮＡポリメラーゼ■、Ｂｍ：旦
ａｍ Ｈｌ、Ｋ ｐ −（ＬユＩ 。 Ｓｍ ： Ｓｍａ Ｉ、 Ｎｒ／５ｒｒｚＮｒ且Ｉζジ匹土■の結合部位Ｓｃ／Ｓ
ｍ：旦且土■と）ユニＩの結合部位白色部分、黒色部分
、およびドツト部分は各々、ｔａｃプロモーター、殺虫
蛋白遺伝子、およびリボゾームＲＮＡ遺伝子ターミネー
タ−を示している。 第７図は、大腸菌ＪＭ １０９／Ｉ）ＴＢＫＣ５株で同
時生産された１３０ＫＤａおよび１３５ＫＤａ殺虫蛋白
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのデ
ンシトメータースキャンを示している。 ○ビー ○−６３ ０−ｓｅｅ ６４蘭 ○イー 〇
−ωｏｏ ｏｏ−Ｉ＜＜ ｏ＞ ｃｚｏ
＜Ｃ／）ＯＥｘＣ： ０ＣＪＣ： ０Ｅ−４ｔ
Ｑ ＯＥ−＋Ｏ） Ｏｆ−＋Ｌ ０Ｄ２０く哨
−＜ｔｎ のく・−り←−トく飄 ロ←０のくく φ
くく ■０：！： Ｏ＜ｍｓ −Ｅ−← へ←−←
−＜Ｌ、ｌ−１句 −Ｈ−−←づ −く−く＞ Ｑ二
ＣＪ−１ａｐ ＣＪ−（：）ＬＩＥ−４Ｅ−４
＜＋ Ｃ：）＜ ＣＪ＜ ａ＜ ｖ＜
＜ｂｏ ＋ｈ Ｅ−Ｑｌ ＜に ←Ｑ
←のＱｌ、、、 ＜＞ ＜ψ く− ←二
く・−＜＜ Ｅ−← ａ＜ ＣＪＣＤ
Ｆ−Ｑ、 ｏｘ＜６Ｊ ←ｃｕ ａｐ
＜ｃ＝ ＜づ ←−ｏＥ−ＩＰ−Ｉｏ←−
００Ｊ： Ｏ＜−０＜−＋ ０ＣＤ（Ｄのく−０く
− へ＜Ｅ−Ｉ 寸ＱＯロ００ φくηＣ０ＩｊＱ＋
ａｏ＜ｐ ■＋−〇＜Ｏ−＜Ｑ ％ヒ００Ｌ、
＋＜、−１＜＞ ｐ−＋Ｑ−、−１１ＪＪＩＩ：
、−ＩＦ−、Ｃ←ト ００ ト← ０出 く←
←良←へ く閣 （Ｊ（ＬＩ Ｅ−司
Ｏｘ く３くΦ ０− ←−０−ａ −ａ −ａ
＜ ＜＜ ＜−ａ＜ ｏｏ ａａ＜ｂ
ｏ ＜１−、 （ＪＬ、 ＜句 ｏｃｂ
＜口０− 〇二 〇二 ＣＪ−＜ψ く
−０＜＜ Ｏ＜Ｅ−＠ Ｏ＜Ｅ−ＯＣ：）＜ ＯＣ
：）＜ ０ＩＪ（：１トＥ−１−■くり −（（Ｌ）
Ｃ’ｌ←α 唖←ロ トＯ頗ｕ）Ｑｃ トヒ０ ■←−
０くの −←Φ ■〇−←の ←−＜＋−＋ −＜
＜ Ｐ−１０１Ｊ Ｐ−１＜＜Ｅ−Ｉ偽 くα
トー＜ト ←−←０７１’ ｔｓ ａｆ−門
ｌｌＩＣ”５−ｍ −ｃ ＯＱ６七 ６０
≧６ ６０ Φ〉 ０口０口 〇−
Ｑｃ ０− ←−く口Ｃ）Ｌ、 （）Φ く
ψ ヒ（ＩＪ Ｕ（Ｌ） Ｑ−〇良 ←ω
＜＜＜Σ ←の ０良０＜＞ ０Ｆ−ａ−０
←ａＯ←−０＜ｄ ＯＣ：） −ｃＯＣ：）−００１
句 Ω吋♀ シψＦ ！肘円 巽た！○ｆ）ｋ
０１ｍ ５Ｎ ○ べｒ ゴ〇−ｍ ○【つ
５ ○イＩ−Ｉ ＾ｄ−０−哨 ○イー −〇ｔ”ｌづ ○−００ｃｍ１へ ＾ｄ−○！１１１３
０／＋＋ ○ｃ−１１０ｍｚ−Ｍ／ｌ−Ｍｕし１―
−ｄｅ ｔｎ ｆ−＋ ａ
（３ｄｌ （ｅ め昧
くΣ ビ ａａ ＣＪ良Ｆ−４で
−ｄ Ｏ−くΦ −：＜−？−１ヒ リリ ヒ
ー 一一 −一一一０＜諷 １０″ Ｏｈｅ ＯＣ：）’：ｊ ０ＩＪＬ。 −〇〇 寸くφ （０＜、−１ａ）（Ｊ二Ｃ’） ｌ−
＋ ＄−＋ へくく の００ ザく←くｈ のく−
のく−のくク ト← ←ａｌＩｏｐ ＜− く飄 ａ＞ ＜＜ ａａ ”’ Ｅ−１１−、＜ｂｏ ＜＞Ｃ：Ｉ Ｃ：
′□ ｇ ＜：） Ｓ−Ｃ：ｌ −０ロ く←
０く ００ ０く″ ｈｐ ＜＞ Ｅ−Φ””００＜＞
００− ０＄ − 一〇′ｎ の←← 膿ａａ ト＜− の＜：′ へ←１ のト１ ！０り く− のくの のくＷ のく− ” ｏ＜ Ｃ：＋＜、 ｏＯ＜＞トζ く
− ←Φ ←← くψ （ＪＪ： ←− ” ＜＜ ＜← く− Ｑ２ ←ψ ｈｐ ａｒ−ｂ ＯＱ＜Ｃ：）＞ ＜＞ Ｃ：ｊＩ−１ｏ＜’
ｏＨｏ ｏｔ−← ０←トー〇二 へ０− ！０−
ロく− のく← ｃＪ○Ｊ： のＱＯマ←句 一 ８句 のくト の←力 のＱ〉 ＜−＜ｔｎ Ｃ：）の ０＞ ８ｍ ＜＞ ＜＞ ト￥ Ｏ＞ ＜、Ｊ ＜：ＪＯＬ ロー
くり ８口 Ｑ＜ （ＪＪ：＜−＜φ ０トロ く← ００ ０く ■ト０ ｏＯα ｏくり ｏＱ− ””−＋（ｖＪＣｖ）＜ｘ ｔｏｕ、ｃ” ” ｌ
３Ｊａ ＜ （ｅ１５ ｊ’３ ［”＋ ？
＜ １−＋特開平１−１０４１７７ （ｊ５） 第４図 Ｂｍ ｒｒｎＢ（Ｔ） 第５図 第７図 第６図 Ｓｃ
ＩＰＬ株のプラスミドＤＮＡからクローン化した１３０
ＫＤａ殺虫蛋白構造遺伝子の塩基配列および塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を示している。 第２図は、バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の染色体［ＩＮＡからクローン化した１３５Ｋ
Ｄａ殺虫蛋白構造遺伝子の塩基配列および塩基配列から
推定されたアミノ酸配列を示している。 第３図は、プラスミドｐＫＣＢ １の１３０ＫＤａ殺虫
蛋白遺伝子および１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の接続部
位を示している。塩基配列およびボックスの下は各遺伝
子の由来部域を示している。塩基配列およびボックスの
上の矢印は制限酵素部位を、−３５および−１０は各々
１３５ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の大腸菌プロモーター・コ
ンセンサス−３５領域、−１０ｅｌ域ヲ、ＳＤはＳｈｉ
ｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列を示している。 ム；勿１１１． ハ；」■。 釦／ ［１１１：勿ＩＩＩと勿Ｈ１の結合部位Ｈｃ／Ａ
ｈ： １ｌｉｎｃ ＩＩとＡｈａ Ｉ［１部位の結合部
位ＥＶ２２３−Ｉｆ発現ベクターｐＫＫ２２３−４Ｖ１
８Ｌ； ベクターｐＵｃ１８ （７）リンカ一部分１３
０ＫＤａ （５°）；１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝子の５
′末端部分１３０ＫＯａ；１３０ＫＤａ殺虫蛋白構造遺
伝子１３０ＫＤａ（３°）；１３０ＫＤａ殺虫蛋白遺伝
子の３′末端部分１０塩基 １３０ＫＤａ（３’）と１３５にＤａ （５’ ）の間
に位置するＶ１８Ｌ；ベクターｐＵｃ１Ｂのリンカ一部
分２４塩基とそれに続＜２１０塩基 １・３５ＫＤａ（５’）；１３５にＤａ殺虫蛋白遺伝子
の５°末端部分１３！５ＫＤａ；１３５ＫＤａ殺虫蛋白
構造遺伝子１３５ＫＤａ（３’）；１３５ＫＤａ殺虫蛋
白遺伝子の３°末端部分ｔａｃ；ｔａｃプロモーター。 ｒｒｎＢ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；リポソームＲＮＡ遺
伝子のターミネータ− 黒色部分、白色部分はそれぞれ殺虫蛋白構造遺伝子およ
びその３°末端、５°末端部分を示す。 第４図は、１３０ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子をＢａｍＨＩ
カートリッジとして保有するプラスミドル＾旧１の構築
および１３０ＫＤａ、 １３５ＫＤａの殺虫蛋白遺伝子
を同時発現するためのプラスミドｐＫＣＢ ｆの構築を
示している。 ｐａｌ Ｔ ： ＤＮＡポリメラーゼ［、Ｎｄ ：
Ｎｄｅ Ｉ 、 Ｂｍ ：抛ＩＩ Ｉ 、紅：」匹Ｉ
、ハデーハ１ｌＪｌｉ、ハ：」旦■。 虱： ｔａｃプロモーター、 ｒｒｎＢ （Ｔ）
：リポソームＲＮＡ遺伝子のターミネータ−を各々示す
。 白色部分、黒色部、およびドツト部分はそれぞれ奥プロ
モーター、殺虫蛋白遺伝子部分およびリボゾームＲＮＡ
遺伝子ターミネータ−を示している。 第５図は、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＣＢ １株で同時生
産された１３０ＫＤａおよび１３５ＫＤａ殺虫蛋白のＳ
ＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのデンシ
トメータースキャンを示している。 第６図は、１３０にＤａ、１３５ＫＤａの殺虫蛋白遺伝
子を同時に発現するためのプラスミドｐＴＢＫｃ５の構
築を示している。 ｐ ｏ ｌ ｒ ： ＤＮＡポリメラーゼ■、Ｂｍ：旦
ａｍ Ｈｌ、Ｋ ｐ −（ＬユＩ 。 Ｓｍ ： Ｓｍａ Ｉ、 Ｎｒ／５ｒｒｚＮｒ且Ｉζジ匹土■の結合部位Ｓｃ／Ｓ
ｍ：旦且土■と）ユニＩの結合部位白色部分、黒色部分
、およびドツト部分は各々、ｔａｃプロモーター、殺虫
蛋白遺伝子、およびリボゾームＲＮＡ遺伝子ターミネー
タ−を示している。 第７図は、大腸菌ＪＭ １０９／Ｉ）ＴＢＫＣ５株で同
時生産された１３０ＫＤａおよび１３５ＫＤａ殺虫蛋白
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのデ
ンシトメータースキャンを示している。 ○ビー ○−６３ ０−ｓｅｅ ６４蘭 ○イー 〇
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≧６ ６０ Φ〉 ０口０口 〇−
Ｑｃ ０− ←−く口Ｃ）Ｌ、 （）Φ く
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←ａＯ←−０＜ｄ ＯＣ：） −ｃＯＣ：）−００１
句 Ω吋♀ シψＦ ！肘円 巽た！○ｆ）ｋ
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−ｄｅ ｔｎ ｆ−＋ ａ
（３ｄｌ （ｅ め昧
くΣ ビ ａａ ＣＪ良Ｆ−４で
−ｄ Ｏ−くΦ −：＜−？−１ヒ リリ ヒ
ー 一一 −一一一０＜諷 １０″ Ｏｈｅ ＯＣ：）’：ｊ ０ＩＪＬ。 −〇〇 寸くφ （０＜、−１ａ）（Ｊ二Ｃ’） ｌ−
＋ ＄−＋ へくく の００ ザく←くｈ のく−
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ｏＨｏ ｏｔ−← ０←トー〇二 へ０− ！０−
ロく− のく← ｃＪ○Ｊ： のＱＯマ←句 一 ８句 のくト の←力 のＱ〉 ＜−＜ｔｎ Ｃ：）の ０＞ ８ｍ ＜＞ ＜＞ ト￥ Ｏ＞ ＜、Ｊ ＜：ＪＯＬ ロー
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３Ｊａ ＜ （ｅ１５ ｊ’３ ［”＋ ？
＜ １−＋特開平１−１０４１７７ （ｊ５） 第４図 Ｂｍ ｒｒｎＢ（Ｔ） 第５図 第７図 第６図 Ｓｃ
Claims (15)
- （１）第１図及び第２図に記載のアミノ酸配列で特定さ
れるバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株
の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子を直列に同方
向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現さ
せる発現プラスミド - （２）第１図記載の塩基配列（塩基番号１〜３４６５）
及び第２図に記載の塩基配列（塩基番号１〜３５２８）
で特定されるバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子を直
列に同方向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌体内
で発現させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の発現プラスミド - （３）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子の各々の５
’及び３’末端側にそれぞれｔａｃプロモーターおよび
ｒｒｎＢターミネーターを保持する遺伝子カートリッジ
を直列に同方向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌
体内で発現させることを特徴とする特許請求の範囲第１
項および第２項記載の発現プラスミド。 - （４）発現プラスミドｐＫＣＢ１で特定される特許請求
の範囲第１項記載の発現プラスミド - （５）発現プラスミドｐＴＢＫＣ５で特定される特許請
求の範囲第３項記載の発現プラスミド - （６）第１図及び第２図に記載のアミノ酸配列で特定さ
れるバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株
の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子を直列に同方
向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現さ
せる発現プラスミドにより形質転換され殺虫蛋白を生産
する微生物 - （７）第１図記載の塩基配列（塩基番号１〜３４６５）
及び第２図に記載の塩基配列（塩基番号１〜３５２８）
で特定されるバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子を直
列に同方向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌体内
で発現させる発現プラスミドにより形質転換され殺虫蛋
白を生産することを特徴とする特許請求の範囲第６項記
載の微生物 - （８）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子の各々の５
’及び３’末端側にそれぞれｔａｃプロモーターおよび
ｒｒｎＢターミネーターを保持する遺伝子カートリッジ
を直列に同方向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌
体内で発現させる発現プラスミドにより形質転換され殺
虫蛋白を生産することを特徴とする特許請求の範囲第６
項および第７項記載の微生物。 - （９）発現プラスミドｐＫＣＢ１を保持する特許請求の
範囲第６項記載の微生物 - （１０）発現プラスミドｐＴＢＫＣ５を保持する特許請
求の範囲第８項記載の微生物。 - （１１）第１図及び第２図に記載のアミノ酸配列で特定
されるバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子を直列に同
方向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌体内で発現
させる発現プラスミドにより形質転換され殺虫蛋白を生
産する微生物を培養することを特徴とする殺虫蛋白の製
造方法 - （１２）遺伝子が第１図記載の塩基配列（塩基番号１〜
３４６５）及び第２図に記載の塩基配列（塩基番号１〜
３５２８）で特定されるバチラス・チュリンゲンシス・
アイザワイＩＰＬ株の２種の殺虫蛋白をコードする構造
遺伝子を直列に同方向に接続した遺伝子を含みこれを微
生物１体内で発現させる発現プラスミドにより形質転換
され殺虫蛋白を生産する微生物を培養することを特徴と
する特許請求の範囲第１１項記載の殺虫蛋白の製造方法 - （１３）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の２種の殺虫蛋白をコードする構造遺伝子の各々の
５’及び３’末端側にそれぞれｔａｃプロモーター及び
ｒｒｎＢターミネーターを保持する遺伝子カートリッジ
を直列に同方向に接続した遺伝子を含みこれを微生物菌
体内で発現させる発現プラスミドにより形質転換され殺
虫蛋白を生産する微生物を培養することを特徴とする特
許請求の範囲第１１項および第１２項記載の殺虫蛋白の
製造方法。 - （１４）発現プラスミドｐＫＣＢ１を保持する微生物を
培養することを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載
の製造方法 - （１５）発現プラスミドｐＴＢＫＣ５を保持する微生物
を培養することを特徴とする特許請求の範囲第１３項記
載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31928887A JPH01104177A (ja) | 1987-07-08 | 1987-12-16 | ２種の殺虫蛋白の同時発現 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-171913 | 1987-07-08 | ||
| JP17191387 | 1987-07-08 | ||
| JP31928887A JPH01104177A (ja) | 1987-07-08 | 1987-12-16 | ２種の殺虫蛋白の同時発現 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01104177A true JPH01104177A (ja) | 1989-04-21 |
Family
ID=26494470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31928887A Pending JPH01104177A (ja) | 1987-07-08 | 1987-12-16 | ２種の殺虫蛋白の同時発現 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01104177A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990015139A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Plant Genetic Systems N.V. | Prevention of bt resistance development |
| US5556784A (en) * | 1992-11-24 | 1996-09-17 | Novo Nordisk Entotech, Inc. | Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests |
-
1987
- 1987-12-16 JP JP31928887A patent/JPH01104177A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990015139A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-13 | Plant Genetic Systems N.V. | Prevention of bt resistance development |
| US5556784A (en) * | 1992-11-24 | 1996-09-17 | Novo Nordisk Entotech, Inc. | Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests |
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