JPS63133999A - 誘導発現による蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、枯草菌による殺虫蛋白質の生産に関する。本
発明は特に、枯草菌を用いて任意な時期に誘導により、
殺虫蛋白質を生産させる蛋白質製造法に関するものであ
る。

この　日の卒業上の１１用ゝ野 近年２合成農薬に代わり１人畜魚貝に対して無害な生物
農薬への関心が高まりつつあり、なかでも、ＢＴ剤は、
農業用殺虫剤として欧米で広く用いられてきている。

ＢＴ剤は、バチルス　チュリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、以後Ｂ、　ｔ、と
略す）の産生ずる殺虫蛋白質を有効成分とする微生物殺
虫剤であり、特に鱗翅目昆虫に対し強力な毒性を有する
。

本発明は生物農薬の優れた製造法として広く利用される
ものである。

従来の　′打とこの　Ｈが解′　しようとする！。照点 従来のＢＴ剤は殺虫蛋白質のほかに、　Ｂ、ｔ、の細胞
や胞子を含む生菌剤が主であったため３日本では該ＢＴ
剤散布が養蚕業に及ぼす影響が懸念された。かかる観点
から、熱処理、化学薬品処理などによりＢＴ剤中の生細
胞、胞子の殺菌が行われてきたが、激しい殺菌条件を用
いる必要があり殺虫蛋白質の変性による殺虫活性の低下
が避けられず。

また工業的に繁雑な処理工程のために製造コストの上昇
をきたした。また殺虫蛋白質を生産するためには長時間
の培養が必要であり、産生量を一定レベルに保持するこ
とも容易ではなかった。

最近、増殖状態にあるＢ、　ｔ、の栄養細胞が産生ずる
水溶性毒素が食中毒起因性バチルス　セレウス（Ｂｃｉ
ｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）の産生ずる毒素と共通性を有
することが確認され（本田武司、芝敦子、三輪谷俊夫：
日本細菌学雑誌、４０　２４０　（１９８５）またＢ、
　ｔ、による眼球炎の症例（Ｊ、Ｒ，Ｓａｍｐｌｅｓａ
ｎｄ　Ｈ，Ｂｕｅｔｔｎｅｒ　：Ａｍ、Ｊ、Ｏｐｔｈａ
ｌｍｏｌ、＋　９５　２５８（１９８３）も報告されて
いることから、生菌剤の散布が人畜に対して必ずしも安
全とはいえないことが示唆され、殺虫蛋白質のみによる
製剤化の必要性が認識されつつある。

このような従来品ＢＴ剤の欠点を克服するため。

本発明者らはすでに遺伝子組換えの手法により殺虫蛋白
質遺伝子を導入したプラスミドを用い、親株であるＢ、
　ｔ、よりも多く殺虫蛋白質を産生ずる枯草菌菌株を造
成した。

しかし、該遺伝子のプロモーターの構造は枯草菌の　胞
子形成に関与する遺伝子のプロモーターと非常によく似
ているものであり（Ｓｃｈｎｅｐｆ　、　Ｈ，Ｅ、　。

ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、ＨｏＲ，：”Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ’ｐ、　２０９　　（１
９８５））、ＩＪＩ換えプラスミドを枯草菌に導入して
も該殺虫蛋白質遺伝子の発現時期は親株であるＢ、ｔ。

と同様胞子形成期以降に限定されるものであった。

従ってこの改良法においても、胞子の混入を除去するた
めには胞子欠損株を宿主とすることが必要であり１また
十分量の殺虫蛋白質を産生せしめるには、長時間培養す
ることが必要であった。このことは余計な用役コストを
必要とする。

これに対して８本発明においては後述するように殺虫蛋
白質遺伝子を任意な時期１則ち培養のいかなる時期にお
いても誘導により発現させ、かつ大量に殺虫蛋白質を生
産せしめることに成功した。

誘導発現系は、任意な時期に遺伝子の発現を誘導できる
ため９例えば、宿主菌の増殖の初期から殺虫蛍白質をコ
ードする遺伝子を発現させ殺虫蛋白質を産生せしめるこ
とが出来る。このような殺虫蛋白質の生産方法は、短期
間に多量に殺虫蛋白質を蓄積させることが出来、従来法
の持つ欠点を克服したものといえる。

オｍ戊 本発明者らは、　Ｂ、ｔ、由来の殺虫蛋白質をコードす
る遺伝子をグルコン酸存在下で発現が誘導される枯草菌
のグルコン酸オペロンのプロモーターを用いて発現させ
ることにより培養のいかなる時期においても殺虫蛋白質
を生産させることができることを見出し、これを用いた
殺虫蛋白質の誘導発現による製造法を発明し特許請求の
範囲に記載の本発明を完成した。

実施例に示した本発明の効果を要約して述べると本発明
は殺虫蛋白質遺伝子発現の誘導にグルコースから容易に
得られる安価なグルコン酸を用い１宿主菌の増殖に何ら
影響を及ぼさずに増殖初期に発現を誘導することが出来
るものであり、生産性の大幅な向上、コストの低下を実
現した優れたＢＴ剤製造法といえるものである。

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明で用いられるＢ、　ｔ、の菌体内殺虫蛋白質遺伝
子とはＢ、　ｔ、が菌体内で産生ずる殺虫蛋白質のアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子であり、　Ｂ、ｔ、の種々
の亜種由来の遺伝子が使用可能である。

例えばバチルス　チュリンゲンシス　クルスターキー（
アメリカン　タイプカルチャー　コレクション（以後Ａ
ＴＣＣと略す）保存株、保存番号３３６７９）　、バチ
ルス　チュリンゲンシス　ソット−（ＡＴＣＣ１９２７
０）　、バチルス　チュリンゲンシスアイザワイ（オハ
イオ大学バチルス　ジエネティック　ストックセンター
（以後ＢＧＳＣと略す）保存株、保存番号４Ｊ１）等の
菌体内殺虫蛋白質遺伝子が挙げられる。

これらの殺虫蛋白質遺伝子は１例えば制限酵素等で、該
遺伝子が未来前するプロモーターを除去し、使用する。

一方、殺虫蛋白質を結合するベクターは、枯草菌の誘導
発現に関与するプロモーターを含み、枯草菌で複製可能
なものであれば何れでも用いることが出来るが、従来知
られている枯草菌系の誘導発現に関与するプロモーター
は、抗生物質により発現が８Ｍ　Ｈされるものが殆どで
あり、これらの場合、誘導物質として高価な抗生物質を
使用しなければならない点、また最終的に目的とする物
質から抗生物質を除去する工程を要する点に大きな問題
がある。更に、この場合は抗生物質耐性遺伝子従って、
誘導物質として安価な宿主の増殖を抑制しない物質を利
用できるプロモーターを含むＤＮＡ断片を導入したプラ
スミドで、枯草菌において増殖可能なものがベクターと
し、て望ましい。

このようなものとして、安価なグルコン酸を誘導物質と
して用いることが出来る枯草菌のグルコン酸オペロンの
プロモーター及びリプレッサーを含むＤＮＡ断片を有す
るプラスミドが、該殺虫蛋白質の誘導発現に極めて前動
であることが本発明者等により見出された。

本発明でいうグルコン酸オペロン及びプロモーターとは
、グルコン酸を資化するのに必要な酵素であるグルコン
酸キナーゼ及びグルコン酸パーミアーゼをコードする遺
伝子を含む一つの転写単位及び、その転写単位のｍＲＮ
Ａ合成のためのＲＮＡポリメラーゼ結合部位を意味する
。

このグルコン酸オペロンのプロモーターは、培地中に糖
源がある場合にプロモーターの働きが抑えられ、その結
果、遺伝子の発現が抑制されるカタボライトリプレッシ
ョンを厳密に受けるが、グルコン酸を培地に添加するこ
とにより発現が強く誘導される。

このようなベクターの例としてはプラスミドｐｌｓ２１
を挙げることが出来る。

殺虫蛋白質遺伝子はプロモーターを除去した後。

グルコン酸プロモーターの下流で適当な制限酵素で切断
したベクターにＤＮＡ結合酵素を用いて結合される。こ
の結合は通常の遺伝子組換えの方法で実施可能である。

次に結合により得られた組換え体ＤＮＡ分子を枯草菌に
導入して１組換え体ＤＮＡ分子を含む枯草菌形質転換株
を得る。組換え体ＤＮＡ分子の枯草菌への導入は通常、
プロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、　、　ａｎｄＣ
ｏｈｅｎ、Ｓ、：Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１６８
１１１（１９７８））或いは。

コンピテント細胞法（Ａｎｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、
Ｃ，、ａｎｄＳｐｉｚｉｚｅｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、８１７８１（１９６１））により行われる。

形質転換株の選択はベクターに含まれるマーカー（例え
ば抗生′８７１質耐性等）により、容易に実施可能であ
る。

このようにして得られた形質転換株を微生物の目的に応
じて枯草菌の種々の変異株を選択することができる。例
えば自然界で増殖出来ず、すみやかに死滅する枯草菌由
来の殺虫蛋白質からなる殺虫剤の製造には枯草凹の栄養
要求性変異株（ＡＴＣＣ３３６０８）　、または胞子欠
損株（ＢＧＳＣ１５１）、または二つの性質を有する変
異株（ＡＴＣＣ３５１４８）などが用いられる。

これらの枯草菌変異株を用いて培養し、増殖の初期から
グルコン酸を添加すれば胞子形成に入る前に殺虫蛋白質
が産生される。菌体は集菌し、リゾチーム処理または、
細胞破砕等で簡単に殺虫蛋白質が得られる。従って、精
製時のロスが少なく。

高活性を有し、安全で低コストの殺虫剤が製造できる。

組換え体ＤＮＡ分子を含む形質転換株が、殺虫蛋白質を
産生ずることは、後述するようにＢ、　ｔ、由来の菌体
内殺虫蛋白質に対する抗体を用いた免疫二重拡散試験法
により明確に示されるが、特に注目すべきことは、従来
は菌体内殺虫蛋白質が産生されるのに３旧以上の培養が
必要だったことに対し。

グルコン酸による誘導発現では、培養開始後６時間で菌
体内殺虫蛋白質が産生されたことである。

このことは１本発明の製造法が殺虫製剤の製造にとって
極めて有用であることを示すものである。

以下に実施例を示す。

実ｊｉＨ１１１（バチルス　チュリンゲンシス　ソット
ーの菌体　ｍ虫　白　遺伝子を４む組換え体朴入光ｌ！
Ｂ町讐） バチルス　チュリンゲンシス　ソソト−（ＡＴＣＣ１９
２７０）をペンアッセイブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）２０
Ｉ！、を用いて３０°Ｃで１５時間培養した後、集菌し
、　）Ｉａｎｓｅｎ等の方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、　１３５２２７（１９７８））に従いプラスミドを調
製した。

このプラスミド５０可を制限酵素Ｐｓｔｌ（宝酒造製）
５０単位を用い３７°Ｃで２時間インキュベートするこ
とにより切断した。反応系の組成は、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、
　５（ＬｎＭＮａＣＩ　、　　１ｍＭジチオスレイトー
ルである。

本反応により切断されたＤＮ＾断片は常法に従いフェノ
ール抽出およびエーテル抽出により精製し。

エタノール沈殿により回収した。

得られたＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片（供与ＤＮＡ断片）は
１次に制限酵素ＰｓｔＩで完全に切断した後、大腸菌ア
ルカリ性ホスファターゼで末端リン酸エステルヲ加水分
解したプラスミド ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）に結合した。結合
にはＴ４リガーゼを用いた。反応には供与ＤＮＡ断片２
ｏＩＬｇ。

ｐＢＲ３２２１０ｑを使用した。反応系の組成はＴ４リ
ガーゼ（宝酒造製）１０単位、６．６ｍＭ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６）、６．６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰである。反応は
４°Ｃで１５時間行った。

反応後９反応液から０．１４ＤＮＡに相当する量を抜取
り、０．７％アガロースゲル電気泳動を行った結果、ベ
クターであるｐＢＲ３２２と供与ＤＮＡ断片が結合し２
組換え体ＤＮＡ分子となっていることが認められた。

このようにして得られた組換え体ＤＮＡ分子を大腸菌Ｈ
Ｂ　１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）にカルシウム処理
コンピテント細胞法（Ｍａｎ［’ｅｌ＋Ｍ＋　ａｎｄ　
Ｈｚ３ａ＋Ａ、：１ＥｆＯＩ。

５３１５９（１９７０））に従って導入した。

得られた形質転換株はすべてバチルス　チュリンゲンシ
ス　ソットーの殺虫蛋白質の抗体を用いたラジオイムノ
検定（Ｅｈｒｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、：Ｃｅ１ｌ　１３
６８１　（１９７８）　）により選別し、陽性となった
株のうち１株（＃８０１）を選び底置に記載される方法
じＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ”　ｐ８６　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）に従いプラスミドを調製した。

得られたプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、
０．７％アガロースゲル電気泳動で調べた結果。

該プラスミド（ｐＳＰ　８０１と命名）はベクターであ
るｐＢＲ３２２のＰｓｔＩの切断部位にサイズ約６．８
Ｋｂの供与ＤＮＡ断片が挿入された組換え体ＤＮＡ分子
であることが判明した。

プラスミドｐｓＰ８０１　（１１Ｋｂ）にはＨｐａ　Ｉ
切断部位が２ケ所ある。そこでｐｓＰ８０１１ｐａ　ｒ
分解物を得た後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる方法で、
これを再結合し、殺虫蛋白質遺伝子を含む更に小型の組
換えプラスミド（１０Ｋｂ）を構築した。

再結合して作成したプラスミドは前述のカルシウム処理
コンピテント細胞法で大腸菌ＨＢ　１０１株に導入し、
得られた形質転換株よりプラスミドを前述の常法により
調製したところｐｓＰ８０１由来のサイズ約５．６Ｋｂ
の断片が挿入されたプラスミドｐＨＰ　１を得た。この
プラスミド（ｐＨＰｌ）　２００４を制御＠酵素Ｐｓｔ
ｌを用いて前述の反応条件下で切断した後。

０．７％アガロースゲル電気泳動により４０Ｖで５Ｂ′
！ｆ間泳動した。泳動後、５．６Ｋｂ部分のゲルを切り
出し、フェノール抽出及びエーテル抽出により精製し、
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。

該回収ＤＮＡを更に制限酵素ｏｒａｌ（宝酒造製）２０
単位を用いて３７°Ｃで２時間インキユヘートすること
により切断した。反応系の組成及び反応条件は、前述の
Ｐｓｔｌ切断と同様に行った。

ＤＮＡを完全に切断した後１％アガロースゲル電気泳動
により４０Ｖで５時間泳動した。泳動後、約２．８　Ｋ
ｂ部分のゲルを切り出し、フェノール抽出及びエーテル
抽出により精製し、エタノール沈殿によりＤＮ八を回収
した。

該回収ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液５０ハに溶解し、そのうち
ＤＮＡ　０．１ｑ相当量を抜取り、１％アガロースゲル
電気泳動により該回収ＤＮＡがサイズ約２．８Ｋｂの断
片として精製されたことを確認し、供与ＤＮＡ断片とし
て、以下の実験に供した。

枯草菌グルコン酸オペロンを有するヘクタープラスミド
ｐｌｓ２１は枯草菌ｌ５２１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−７８３
２）より調製した。プラスミドの調製はｌ５２１株を最
終濃度５ｇ烏となるようにカナマイシンを加えたペンア
ッセイ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）１ｊ２を用いて３７°Ｃ
で１５時間培養後、集菌し、集菌菌体を５０ｍＭ　）　
’）スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ
、５０ｍＭ　ＮａＣ１で洗浄した後、アルカリ法（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，、ａｎｄ　Ｐｏ１ｙ、Ｊ、：Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、７１５１３（１９７
９））に従って行った。得られたプラスミド５０趨を制
限酵素Ｐｓｔｌにより切断し、フェノール抽出及びエー
テル抽出により精製しエタノール沈殿により回収した。

該回収ＤＮＡ断片は１次に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノーフラグメント（宝酒造製）１０単位を用い、
３０°Ｃで３０分の反応で平滑末端化した。反応系の組
成は０．１ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ニックトランスレーショ
ン緩衝液（５０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
２）。

１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０，１ｍＭジチオスレイトール
、５ｍｍウシ血清アルブミン）である。

上記反応による生成物はフェノール抽出及びエーテル抽
出により精製しエタノール沈殿により回収した。

該回収ＤＮＡ断片は１次に大腸菌アルカリ性ホスファタ
ーゼで末端リン酸エステルを加水分解し。

抽出、精製を行った後２回収した。

該回収プラスミドρｌ５２１に実施例１で得られた供与
ＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。

反応には供与ＤＮＡ断片２０ｐｇ、Ｐｓロ切断プラスミ
ドｐＩｓ２１１０４を使用した。

得られた組換え体ＤＮＡ分子による形質転換はＣｈａｎ
ｇ等のプロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、　、　ａ
ｎｄＣｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、：Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ
ｔ、１６８１１１（１９７８））に従って実施した。

プロトプラストの再生培地にはカナマイシンを最終濃度
１５０１１ｇＡＡとなるように加えた。

クローニングの宿主菌には栄養要求性枯草菌ｌＡ３１０
株（ＢＧＳＣ保存株）及び胞子欠損栄養要求性枯草菌Ｍ
Ｔ−５Ｐ３１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０３４）を用いた
。

形質転換により得られたカナマイシン耐性株の全てより
プラスミドを調製した。プラスミドの調製ハ、カナマイ
シン耐性株をペンアッセイ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）２０
ｍｉ！を用いて３７°Ｃで１５時間培養後。

集菌し、集菌菌体を５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
）Ｉ７．５）、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１で洗浄した後、前述のアルカリ法に従って行った
。

得られたプラスミドを制限酵素Ｂｃｌ　Ｉ　、Ｃ１ａ　
Ｉ　。

ＥｃｏＲＶ、　Ｈｉ＾ｄＩＩＩ、Ｋｐｎｌ、Ｐｖｕｌｌ
、５ａｃｌ、ＸｂａＩを用いて切断し、供与ＤＮＡ断片
の挿入の有無を調べた。

次に供与ＤＮＡ断片が挿入されていることが確認された
プラスミドを有する株の菌体内殺虫蛋白質の産生の有無
を免疫二重拡散試験法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ。

Ｏｅ、、ａｎｄ　　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｌ、Ａ、：”Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ″（ｅｄ、Ｗｅｉｒ、　Ｄ、Ｍ、）ｐ
。

１（１９７３））により８周べた。

対象としてプラスミドｐＩｓ２１を導入した宿主菌ＬＡ
５１０株、ＭＴ−ＳＰ３１株及びＤＮＡ供与株であるバ
チルス　チュリンゲンシス　ソットーを用いた。培養に
は、　　ＧＹＳ培地（０，２χ（ＮＨ４）　２５０４，
０．２χＹｅａｓ　ｔｅｘｔｒａｃｔ＋ｏ、ｏ０５χＫ
ｚＨＰＯｎ１０．ＩＺ　Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．０３χＭ
ｇＳＯ４，０，０Ｏ１３Ｘ　ＣａＣ１ｚ、０．００５Ｘ
　ＭｎＳＯ４，ｐＨ７，３）を用いた。この時、枯草菌
宿主及び形質転換株の培地にはカナマイシンを最終濃度
５河胸となるよう加えた。培養条件はバチルスチュリン
ゲンシス　ソントーは３０”Ｃで３日間の振盪培養を行
い、枯草菌宿主及び形質転換株は３７°Ｃで１０時間振
盪培養した後、グルコン酸を最終濃度０．５Ｘとなるよ
う加え更に２時間培養した。

培養後、それぞれの株を遠心により集菌し、集菌菌体を
リゾチームによる溶菌及びＬＭ−ＮａＣ１による洗浄を
行い遠心し、沈殿物を回収した。得られ１こ沈殿物は、
　１５ｍＭ　ＮａＯＨに懸濁し、２５’Ｃで１０時間イ
ンキュベートした後、遠心し、上清を回収した。

得られた上清を供試サンプルとし、バチルスチュリンゲ
ンシス　ソソトーの菌体内殺虫蛋白質に対する抗血清を
用いて前述した方法により免疫二重拡散試験を行った。

その結果、得られた形質転換株はバチルス　チュリンゲ
ンシス　ソットー型の殺虫蛋白質を産生じていることが
明らかとなった。

また、この形質転換株を走査型電子顕微鏡で観察するこ
とにより、殺虫蛋白質の結晶の存在が認められた。

以上の結果から、得られた栄養要求性枯草菌形質転換株
及び胞子欠損栄養要求性枯草菌形質転換株はハ゛チルス
　チュリンゲンシス　ソットーと同様の殺虫蛋白質を産
生ずることが認められた。

また、これら形質転換株より調製したプラスミドは制限
酵素を用いた解析によりすべて同一のプラスミドである
ことが確認され、このグルコン酸による菌体内殺虫蛋白
質の誘導発現プラスミドをＰＧＢＨ１７と命名した。

実施例２で得られた枯草菌形質転換株をペンアッセイ培
地１を用いて３７°Ｃで４時間培養した後。

グルコン酸を最終濃度０．５χとなるよう加え、更に２
時間振盪培養した。その後遠心して集菌し、集菌菌体を
１？ＩのＮａＣ１で数回洗浄した後、　２０ｍ１！の蒸
留水に懸濁し、超音波を用いて細胞破砕を行った。

その後遠心して沈殿物を回収し、蒸留水に懸濁して凍結
乾燥した。

該凍結乾燥物は再び蒸留水に懸濁し、前述の方法で殺虫
蛋白質を溶解し免疫二重拡散試験法により検定した結果
、該凍結乾燥物はバチルス　チュリンゲンシス　ソント
ーと同様の殺虫蛋白質であることが認められた。

この時、該凍結乾燥物の重量は、親株であるへチルス　
チュリンゲンシス　ソントーで１ｍｇ、ｉｉ導全発現系
枯草菌形質転換株５０ｍｇ得られた。また。

４時間の培養では胞子形成も認められなかった。

以上の結果から、誘導発現による殺虫蛋白質の製造は、
従来技術より、早期に回収出来、また調製が簡便である
ことは明らかである。

【図面の簡単な説明】

図は本発明で構築したｐＧＢＴ　１７の図である。 特許出願人　工業技術院長　飯塚幸三 図　　酌 づ と ′七 汽

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）宿主細菌で発現を所望する蛋白質の遺伝子を任意な
   時期に誘導により発現させ、かつ蛋白質を生産せしめる
   蛋白質の製造法。 ２）宿主細菌が枯草菌であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の蛋白質の製造法。 ３）発現を所望する蛋白質遺伝子とそれを発現させる発
   現ベクターからなる組換えプラスミドを用いることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の蛋白質の製造法。 ４）誘導による発現に関与するＤＮＡ断片を含む、枯草
   菌で複製可能なものであることを特徴とする特許請求の
   範囲第３項記載の発現ベクター。 ５）ＤＮＡ断片が、枯草菌のグルコン酸オペロンの転写
   を支配するプロモーターおよびその支配下にありカタボ
   ライトリプレッションによりその転写が調節されるグル
   コン酸オペロンを含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第４項記載の発現ベクター。 ６）片方の鎖が以下に示す塩基配列の１部または全部で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のＤ
   ＮＡ断片。 【遺伝子配列があります】 ７）発現を所望する蛋白質の遺伝子がバチルスチュリン
   ゲンシスの菌体内殺虫蛋白質遺伝子であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の蛋白質の製造法。