JP2019122270A - タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1)Cryタンパク質をコードする遺伝子とσA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むCryタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において80%以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。
2)バチルス属細菌内でCryタンパク質を発現するための発現プラスミドであって、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において80%以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、Cryタンパク質をコードする遺伝子とσA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結されてなる発現プラスミド。
Cry5Bタンパク質は、土壌伝播蠕虫症に対して有効であることが知られている殺線虫タンパク質である(Cappello M et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103:15154-15159, Hu Y et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 4:e614)。Cry5Bのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号2で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号1で示される。
Cry4Aaのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号4で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号3で示される。
Cry4Baのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号6で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号5で示される。
Cry11Aaのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号8で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号7で示される。
よって、本発明のCryタンパク質には、表1に示されるCryタンパク質の他に当該タンパク質を構成するアミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸残基が付加又は置換、或いは1ないし数個のアミノ酸残基が欠失したものであって、同様の殺虫活性を有する、当該Cryタンパク質の変異体も包含される。
(A)配列番号2、4、6又は8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号2、4、6又は8に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質
(C)配列番号2、4、6又は8に示すアミノ酸配列と80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質
(a)配列番号1、3、5又は7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号1、3、5又は7に示すヌクレオチド配列と80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号1、3、5又は7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号2、4、6又は8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号2、4、6又は8に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
pHY300PLKは、Escherichia coli とBacillus subtilisの両方へDNAを形質転換できるシャトルベクターで、E.coliのプラスミドpACYC177とStreptococcus faecalisのプラスミドpAMα1由来のDNAより構築され、pAMα1の複製領域にはRepBが含まれる。
ここで、「制御領域と作動可能に連結された遺伝子」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されている遺伝子をいう。
ここで、プロモーターとは、所定の遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、RNAポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義される。より具体的には、プロモーターとは、所定の遺伝子におけるコーディング領域の上流200〜600塩基程度の領域を意味する。
また、プロモーターを含む制御領域としては、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が挙げられる。当該制御領域は、好ましくは、宿主内における下流の遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する。
σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、Cryタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる制御領域、から選択されることが好ましい。
σA因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、枯草菌ファージSP01プロモーター(Proc. Natl. Acd. Sci. USA. (1984) 81:439-443.)、veg遺伝子、amyE(アミラーゼ)遺伝子、aprE(ズブチリシン)遺伝子及びS237(S237セルラーゼ、特開2000−210081号公報)遺伝子のプロモーターを挙げることができる。σH因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、citG遺伝子、spoVS遺伝子及びspoVG(Proc. Natl. Acd. Sci. USA. (1986) 83:9438-9442.)遺伝子のプロモーターが挙げられる。
本発明においては、σA因子依存性プロモーターとしてはBacllus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子のプロモーターがより好ましく、σH因子依存性プロモーターとしては枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)のspoVG遺伝子(BG10112)のプロモーターがより好ましい。
ここで、「σA因子依存性プロモーターとして機能する」とは、RNAポリメラーゼであるσA因子によって特異的に転写制御されることを意味する。この特異性は、評価対象となるポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を結合し、σA因子存在下及び不存在下でのレポーター遺伝子の発現を観察することによって評価することができる。
野生型のバチルス属細菌としては、例えば枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)が挙げられ、枯草菌変異株としては、Cryタンパク質の製造に適するものであれば特に限定されないが、例えば枯草菌野生株のゲノム上に生存、増殖やタンパク質生産にとって不必要な領域が欠失した枯草菌株、特定のプロテアーゼ遺伝子が欠失した枯草菌株、胞子形成期特異的なσ因子遺伝子が欠失した枯草菌株、或いはこれらの変異を組み合わせた枯草菌株等が挙げられる。
Cryタンパク質の生産の点から、上記MGB874株に対してsigFを欠失させたMGB874ΔsigF変異株、及び上記Dpr9株に対してsigFを欠失させたDpr9ΔsigF変異株を用いるのより好ましい。
<1>Cryタンパク質をコードする遺伝子とσA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むCryタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。
<2>σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、Cryタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる<1>の方法。
<3>σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、spoVG遺伝子の制御領域又はBacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域である<1>又は<2>の方法。
<4>Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である<3>の方法。
<5>バチルス属細菌が、枯草菌、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)又はバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)である<1>〜<4>のいずれかの方法。
<6>バチルス属細菌が、枯草菌である<1>〜<4>のいずれかの方法。
<7>枯草菌が、枯草菌168株である<6>の方法。
<8>枯草菌が、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である<6>又は<7>の方法。
<9>枯草菌が、aprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの各遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた枯草菌株である<6>〜<8>のいずれかの方法。
<10>枯草菌が、sigE、sigF、sigGから選ばれる遺伝子を欠損させた枯草菌株である<6>〜<8>のいずれかの方法。
<11>枯草菌が、sigE、sigFから選ばれる遺伝子を欠損させた枯草菌株である<6>〜<8>のいずれかの方法。
<12>枯草菌が、sigF遺伝子を欠損させた枯草菌株である<6>〜<8>のいずれかの方法。
<13>枯草菌が、枯草菌168株、MGB874株及びDpr9株から選ばれる枯草菌株又はこれに対してsigF遺伝子を欠損させた枯草菌株である<12>の方法。
<14>枯草菌が、枯草菌MGB874株に対して、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌変異株である<6>〜<8>のいずれかの方法。
<15>Cryタンパク質が、Cry5Bである<1>〜<14>のいずれかの方法。
<16>Cryタンパク質が、Cry5Btである<1>〜<14>のいずれかの方法。
<17>Cryタンパク質が、Cry4Aa、Cry4Ba及びCry11Aaから選ばれる殺蚊タンパク質である<1>〜<14>のいずれかの方法。
<19>σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、Cryタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる<18>の発現プラスミド。
<20>σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、spoVG遺伝子の制御領域又はBacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を含む<18>又<19>の発現プラスミド。
<21>Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である<20>の発現プラスミド。
<22>Cryタンパク質が、Cry5Bである<18>〜<21>のいずれか1項記載の発現プラスミド。
<23>Cryタンパク質が、Cry5Btである<18>〜<21>のいずれか1項記載の発現プラスミド。
<24>Cryタンパク質が、Cry4Aa、Cry4Ba及びCry11Aaから選ばれる殺蚊タンパク質である<18>〜<21>のいずれか1項記載の発現プラスミド。
<26><25>のバチルス属細菌が、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)又はバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)である。
<27><26>の枯草菌が、枯草菌168株である。
<28><26>又は<27>の枯草菌がprophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である。
<29><26>〜<28>のいずれか1項記載の枯草菌がprophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である。
<30><26>〜<29>のいずれか1項記載の枯草菌が、aprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAから選択される1以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
<31><26>〜<30>のいずれか1項記載の枯草菌が、aprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprA遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
<32><26>〜<31>のいずれか1項記載の枯草菌が、sigE、sigF、sigGから選ばれる1以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
<33><26>〜<32>のいずれか1項記載の枯草菌が、sigF遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
<34><26>〜<33>のいずれか1項記載の枯草菌が、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌である。
<36>Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が配列番号10で示される塩基配列に対して80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の同一性を有しており、且つσA因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列である、<35>記載の発現プラスミド又は枯草菌。
<37>σH因子依存性プロモーターを含む制御領が、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)のspoVG遺伝子の制御領域である、<18>〜<34>のいずれか1項記載の発現プラスミド又は枯草菌。
<38>spoVG遺伝子の制御領域が、配列番号12で示される塩基配列に対して80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらにより好ましくは98%以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つσH因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列である、<37>の発現プラスミド又は枯草菌。
1.人工遺伝子の合成
Bacillus thuringiensis YBT−1518由来の殺虫タンパク質遺伝子cry5B(GenBank:CP005935.1、配列番号1)をGenScript社(アメリカ)により人工合成した。合成した遺伝子の3738 bpはpUC57のKpnIとHindIIIサイトにクローニングし、pUC57−cry5Bを得た。
全ての発現プラスミドの構築において、ベクターとしてpHY300PLK(タカラバイオ)、およびターミネターとしてS237セルラーゼ遺伝子由来配列を用いた。プロモーターはS237セルラーゼ遺伝子[Hakamada et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (2000), 2281-2289]あるいは枯草菌168株のspoVG遺伝子由来、シグナル配列はS237セルラーゼ由来あるいは無し、cry5B遺伝子は全長(cry5B)あるいは短縮型(cry5Bt)の組み合わせで、8種のプラスミドの作製を行った(図1−A〜D)。cry5B遺伝子の全長(3738bp)は、配列番号1で示されるが、塩基番号2095−3738番の塩基配列は線虫の腸内において分解される領域で、塩基番号1−2094番の塩基配列は分解された後の活性化Crystal toxinをコードする配列[Hui et al, 2012, Biochemistry, vol 11, p 9911-21]であり、全長型は全配列(1−3738番)、短縮型は塩基番号1−2094番の配列である。
表2に示すvect+psFとvect+tRのプライマーセットを用いて、pHYS237 DNAを鋳型にS237のプロモーター、シグナル及びターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、pUC57−cry5B DNAを鋳型にcry5BpssFとcry5BtR(あるいはT237−cry5BatRN)のプライマーセットを用いてcry5B遺伝子全長(あるいは短縮型)のインサートをPCRで増幅した。続いて、In−Fusion(登録商標) HD EcoDryTM Cloning Kit(Clontech社)を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌HB101コンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーPCRにより確認し、pPsScry5B(あるいはpPsScry5Bt)と命名した(図1−A)。抽出したプラスミドについて、さらにPCR確認、また、制限酵素EcoRI、SpeIとXbaIを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
表2に示すvect+pFとvect+tRのプライマーセットを用いて、pHYS237 DNAを鋳型にS237のプロモーター、及びターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、pUC57−cry5B DNAを鋳型にcry5BpFとcry5BtR(あるいはT237−cry5BatRN)のプライマーセットを用いてcry5B遺伝子全長(あるいは短縮型)のインサートをPCRで増幅した。続いて、In−Fusion(登録商標) HD EcoDryTM Cloning Kit(Clontech社)を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌HB101コンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーPCRにより確認し、pPscry5B(あるいはpPscry5Bt)と命名した(図1−B)。抽出したプラスミドについて、さらにPCR確認、また、制限酵素EcoRI、SpeIとXbaIを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
表2に示すvectRとvect+tRのプライマーセットを用いて、pHYS237 DNAを鋳型にS237のターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、pUC57−cry5B DNAを鋳型にcry5BaFとcry5BtR(あるいはT237−cry5BatRN)のプライマーセットを用いてcry5B遺伝子全長(あるいは短縮型)のインサートをPCRで増幅した。また、Vect−PvgFとcry5Ba−PvgRのプライマーセットを用いて、枯草菌168株のゲノムDNAを鋳型にspoVG遺伝子のプロモーター領域を2つ目のインサートとして増幅した。続いて、In−Fusion(登録商標) HD EcoDryTM Cloning Kit(Clontech社)を用いてベクターと2つのインサートを連結した後、大腸菌HB101コンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーPCRにより確認し、pPvcry5B(あるいはpPvcry5Bt)と命名した(図1−C)。抽出したプラスミドについて、さらにPCR確認、また、制限酵素EcoRI、SpeIとXbaIを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
表2に示すvectRとvect+tRのプライマーセットを用いて、pHYS237 DNAを鋳型にS237のターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、pPsScry5B DNAを鋳型にS237Fとcry5BtR(あるいはT237−cry5BatRN)のプライマーセットを用いてS237のシグナル配列が連結したcry5B遺伝子全長(あるいは短縮型)のインサートをPCRで増幅した。また、Vect−PvgFとS237−PvgRのプライマーセットを用いて、枯草菌168株のゲノムDNAを鋳型にspoVG遺伝子のプロモーター領域を2つ目のインサートとして増幅した。続いて、In−Fusion(登録商標) HD EcoDryTM Cloning Kit(Clontech社)を用いてベクターと2つのインサートを連結した後、大腸菌HB101コンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーPCRにより確認し、pPvScry5B(あるいはpPvScry5Bt)と命名した(図1−D)。抽出したプラスミドについて、さらにPCR確認、また、制限酵素EcoRI、SpeIとXbaIを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
構築した8種のプラスミドについてシーケンス確認を行った。シーケンスの鋳型をPCRにより調製し、全長cry5Bの4種のプラスミドは、表2示したfrag1−Fとfrag1−Rまたは frag2−Fとfrag2−Rのプライマーを用いてそれぞれ5’側と3’側の断片を調製した。短縮型cry5Bの4種のプラスミドは、表2示したfrag1−Fとfrag2−Rのプライマーを用いて断片の調製を行った。それらのPCR産物について表2に示したSEQ−P1〜SEQ−P10の10個のプライマーを用いたシーケンス解析を行った。解析の結果、すべてのプラスミドについて、変異がなかったことから、全てのプラスミドが設計通りに構築できたことが確認された。
構築した4種の分泌シグナルを持つプラスミド(図1−A、D)を、トリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌168株(168T株)(特開2017−79640号公報)に形質転換し、得られた形質転換体をテトラサイクリン含有2xL/mal培地(バクトトリプトン2%(w/v)、酵母エキス1.0%(w/v)、塩化ナトリウム1.0%(w/v)、硫酸マンガン五水和物(和光純薬工業株式会社製)0.00075%(w/v)、マルトース一水和物(和光純薬工業株式会社製)7.5%(w/v)、テトラサイクリン塩酸塩0.0015%(w/v))で3日間、30℃、250rpm振盪培養した。培養液1mLを15000rpm、4℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。調製した培養上清のCry5Bの発現についてSDS−PAGEで確認を行った結果、Cry5Bのバンドが認められなかった(図2)。
構築した分泌シグナルを持たないプラスミド(図1−B、C)のうち、Cry5Bタンパク質を発現するための2種類のプラスミド<5>、<6>(図3)を、トリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌168株(168T株)に形質転換し、得られた形質転換体を、2xL/mal培地で3日間、30℃、250rpm振盪培養した。培養液1mLを15000rpm、4℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。細胞ペレットは1xPBSを用いて洗浄した後、1mL 1xPBSに懸濁し、1mg/mLリゾチームを添加して、37℃で1hr保温した。続いて、BIORUPTOR(Cosmo Bio)を用いて、30秒x20回ソニケーションにより細胞破砕を行った後に、15000rpm、4℃で30分遠心分離し、上清を捨てて沈殿を1mL 1xPBSに懸濁し、細胞破砕液とした。調製した細胞破砕液のCry5Bの発現についてSDS−PAGEで確認を行った結果、pHY−Pscry5B(<5>)およびpHY−Pvcry5B(<6>)による高発現が確認された。pHY−Pscry5BとpHY−Pvcry5Bは全長型の140kDで、いずれも推定サイズと一致した(図3)。
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株(MGB874株;特許4955358)、プロテアーゼの9重欠失株(Dpr9株;特許4485341)、sigF欠失株(ΔsigF株;特許4336082)、MGB874ΔsigF株、Dpr9ΔsigF株を宿主にそれぞれpHY−Pscry5Bの形質転換を行った。MGB874ΔsigF株とDpr9ΔsigF株、MGB874abrB*ΔkinA株(特開2017−79639号公報)は、ΔsigF株の構築と同様な方法で、MGB874とDpr9株をベースにそれぞれsigFを削除することにより作成した。上記4と同様に2xL/mal培地で培養し、調製した細胞破砕液のCry5B発現をSDS−PAGEで解析した。その結果、野生株の168T株に比べ、MGB874株、Dpr9株、sigF欠失株、MGB874ΔsigF株、Dpr9ΔsigF株で発現したCry5Bのバンドが明らかに太いことが分かった(図4−A)。
sigE欠失株(ΔsigE株;特許4336082)を宿主にpHY−Pscry5Bの形質転換を行った。上記4と同様に、2xL/mal培地で培養し、調製した細胞破砕液のCry5B発現をSDS−PAGEで解析した。その結果、sigE欠失株においてもCry5Bのバンドが明らかに太いことが分かった(図4−B)。
Cry5Bタンパク質を発現するためのプラスミドpHY−Pscry5Bを、プロトプラスト法によってBacillus megaterium ATCC 14581株(以下14581株)に導入した。得られた組換え株を実施例1の5と同様に、2xL/mal培地で培養し、調製した細胞破砕液のCry5B発現をSDS−PAGEで解析した。その結果、pHY−Pscry5Bを導入した形質転換体において、Cry5Bの太いバンドを確認した。
米国国立衛生研究所(National Institute of Health, NIH)が開発した画像ソフトImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)を用いてSDS−PAGE上のバンドの定量を行った。標準タンパク質としてのウシ血清アルブミン(BSA)(和光純薬工業株式会社製)およびpHY−Pscry5B形質転換体で発現したCry5BのSDS−PAGEを行い、Bio-SafeTM Coomassie (BIO-RAD)で1時間振盪しながら染色した。イオン交換水にて脱色後、ゲルの撮影を行った。ImageJを用いてSDS−PAGEの画像に対して各バンドの輝度を解析し、BSAの検量線を作成した。この検量線からCry5Bタンパク質量を計算した(表3、表4、表5)。表3に示すように、枯草菌野生株でのCry5B生産性が1.1g/Lであり、組換え生産の文献値(75mg/L)より15倍高いことが分かった。MGB874ΔsigF株を用いることにより生産性が更に2倍以上向上した。
10.1 抱卵成虫の調製
大腸菌(E.coli OP50−1)溶液(1g湿重/6mL S培地)750μL,ストレプトマイシン(1mg/mL)溶液100μL、L1幼虫(Caenorhabditis elegans)1000頭を含んだ液をNGMプレートに滴下し、これを20℃のインキュベーター内で3〜4日培養し、抱卵成虫を得た。
線虫を培養しておいたNGMプレート(表6)をS basalで3回ほど洗い、全て15mL遠心管に移した。上澄みを捨て、沈殿している線虫を1.5mLエッペンチューブに移した。しばらく放置した後,1mLまで上澄みを除き,そこへ4M NaOH 250μL,次亜塩素酸ナトリウム溶液(Wako)250μLを加え,軽く撹拌した。3分静置した後、卓上ミニ遠心分離機で30秒程度スピンダウンを行った。沈殿物を残して上澄みを取り除き、1.5mLまでS basalを加え、軽く撹拌した後30秒程度スピンダウンを行った。この操作を3回繰り返した。これにより得られた卵の沈殿全量を35mm径シャーレに移し、20℃で約24時間培養し、ふ化した第一期幼虫(L1幼虫)を得た。
Bischofらの方法(Methods in Molecular Biology, vol. 331, pp139-154, C. elegans: Methods and applications, Edited by: K. Strange, Humana Press)に従い、L1 growthアッセイを行った。48穴平底プレートを用い、各ウェルに1g/35mLの大腸菌溶液を20μL、1mg/mLストレプトマイシンを20μL、L1幼虫10匹、枯草菌で発現したCry5Bタンパク質を適量、S培地(表7)で総量を200μLに調整した。Cry5Bのタンパク質量は1.25、2.5、5μg/mLを使用した。コントロールはベクター(pHY300PLK)を導入した枯草菌を使用した。20℃で3日間培養した後、各ウェルの線虫の様子をカメラで撮影した(図5)。撮影した画像をImage Jを用いて、線虫の輪郭を書き、面積を計算した。その結果を図6に示した。Cry5Bを使用することにより、線虫の生育が顕著に抑制され、コントロールに比べ1.25μg/mLの濃度でも生育が約80%抑制された。この結果から、枯草菌で発現したCry5Bが線虫に対する毒性を有することを証明した。
(1)NGM:
分泌シグナルを持たない短縮型Cry5B(Cry5Bt)のプラスミドpHY−Pscry5Bt<7>を、トリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌168株(168T株)に形質転換し、得られた形質転換体を2xL/mal培地で3日間、30℃、250rpm振盪培養した。培養液1mLを15000rpm、4℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。細胞ペレットは1xPBSを用いて洗浄した後、1mL 1xPBSに懸濁し、1mg/mLリゾチームを添加して、37℃で1hr保温した。続いて、Biorupter(Cosmo Bio)を用いて、30秒x20回ソニケーションにより細胞破砕を行った後に、15000rpm、4℃で30分遠心分離し、上清を捨てて沈殿を1mL 1xPBSに懸濁し、細胞破砕液とした。調製した細胞破砕液のCry5Btの発現についてSDS−PAGEを行った(図7)。その結果、pHY−Pscry5Btによる高発現が確認された。蛋白質バンドのサイズは79kDであり、短縮型Cry5Bの推定サイズと一致した。
1.人工遺伝子の合成
Bacillus thuringiensis serovar israelensis由来の殺虫タンパク質遺伝子cry4Aa(GenBank: YP_001573833、配列番号3)、cry4Ba(GenBank: NC_010076、配列番号5)およびcry11Aa(GenBank: NC_010076、配列番号7)をGenScript社(アメリカ)により人工合成した。合成した遺伝子はpUC57のKpnIとHindIIIサイトにクローニングし、それぞれpUC57−cry4Aa、pUC57−cry4BaとpUC57−cry11Aaのプラスミドを得た。
全ての発現プラスミドの構築において、ベクターとしてpHY300PLK、およびターミネターとしてS237セルラーゼ遺伝子由来配列を用いた。プロモーターは当研究室で実績のあるS237セルラーゼ遺伝子[Hakamada et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (2000), 2281-2289]あるいは枯草菌168株のspoVG遺伝子由来、cry4Aa、cry4Ba、cry11Aaの3つの遺伝子との組み合わせで、図8に示した6種のプラスミドの作製を行った。pHY−Pscry4Aa、pHY−Pscry4Ba、pHY−Pscry4AaはS237セルラーゼ遺伝子のプロモーター、pHY−Pvcry4Aa、pHY−Pvcry4Ba、pHY−Pvcry4Aaは枯草菌168株のspoVG遺伝子のプロモーターを使用した。構築方法はIn−Fusion(R) HD EcoDryTM Cloning Kitのプロトコールに従った。
表8に示すvect+pFとvect+tRのプライマーセットを用いて、pHYS237 DNAを鋳型にS237のプロモーター、及びターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、pUC57−cry4Aa DNAを鋳型にcry4AFPSとcry4ARTのプライマーセットを用いてcry4Aa遺伝子のインサートをPCRで増幅した。続いて、In−Fusion(登録商標) HD EcoDryTM Cloning Kit(Clontech社)を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌HB101コンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーPCRにより確認し、pHY−Pscry4Aaと命名した。抽出したプラスミドについて、さらにPCR確認、また、制限酵素を用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
上記と同様に、pUC57−cry4Ba DNAを鋳型にcry4BFPSとcry4BRTのプライマーセットを用いてcry4Ba遺伝子、pUC57−cry11Aa DNAを鋳型にcry11AFPSとcry11ARTのプライマーセットを用いてcry11Aa遺伝子のインサートをそれぞれPCRで増幅し、pHY−Pscry4BaとpHY−Pscry11Aaの構築を行った。
表8に示すvect+pvgFとvect+tRのプライマーセットを用いて、pHY−Pscry5B(Cry5Bの実施例参考)を鋳型にspoVG遺伝子のプロモーター、及びS237セルラーゼ遺伝子のターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、pUC57−cry4Aa DNAを鋳型にcry4AFPVとcry4ARTのプライマーセットを用いてcry4Aa遺伝子のインサートをPCRで増幅した。続いて、In−Fusion(登録商標) HD EcoDryTM Cloning Kit(Clontech社)を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌HB101コンピテントセル(タカラバイオ)に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーPCRにより確認し、pHY−Pvcry4Aaと命名した。抽出したプラスミドについて、さらにPCR確認、また、制限酵素を用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
構築した6種のプラスミド(図8)をトリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌168株(168T株)に形質転換し、得られた形質転換体を2xL/mal培地で3日間、30℃、250rpm振盪培養した。培養液1mLを15000rpm、4℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。細胞ペレットは1xPBSを用いて洗浄した後、1mL 1xPBSに懸濁し、1mg/mLリゾチームを添加して、37℃で1hr保温した。続いて、Biorupter(Cosmo Bio)を用いて、30秒x20回ソニケーションにより細胞破砕を行った後に、15000rpm、4℃で30分遠心分離し、上清を捨てて沈殿を1mL 1xPBSに懸濁し、細胞破砕液とした。調製した細胞破砕液中のタンパク質の発現についてSDS−PAGEで確認を行った。結果は図9に示したように、すべてのプラスミドにおいて、高発現が認められた。
米国国立衛生研究所(National Institute of Health, NIH)が開発した画像ソフトImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)を用いてSDS−PAGE上のバンドの定量を行った。標準タンパク質としてのウシ血清アルブミン(BSA)を使用した。ImageJを用いてSDS−PAGEの画像に対して各バンドの輝度を解析し、BSAの検量線を作成した。この検量線から各殺蚊タンパク質の量を計算した。表9に示すように、0.6−0.7g/Lの生産性が確認された。
5.1 ボウフラの調製
ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)は住化テクノサービス株式会社より購入した卵を孵化させたものを使用した。プラスチックパンに水を1cm程度張り、卵が産みつけられているろ紙を入れた。毎日孵化後のボウフラ用餌として熱帯魚用のエサ(テトラミンベビー)を与えた。孵化後5日目のボウフラを活性評価に用いた。
Leetachewaらの方法(BMB reports, 47 (2014), 546-551)に従い、枯草菌で発現したCry4Aa、Cry4BaとCry11Aaの殺蚊活性評価を行った。24穴平底プレートを用い、各ウェルに5日齢ボウフラ10匹、殺蚊タンパク質濃度は50μg/mL、水で総量を1mLに調整した。25℃で24h放置した後、死滅したボウフラの数を数え、死亡率を算出した。その結果は表10に示した。対照の死亡率が0%に対して、Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aaはそれぞれ93.3%、93.3%と76.7%を示した。この結果から、枯草菌で発現した殺蚊タンパク質は高い殺蚊効果が認められた。
Claims (33)
- Cryタンパク質をコードする遺伝子とσA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むCryタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において80%以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。
- σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、Cryタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる請求項1記載の方法。
- σA依存性プロモーターを含む制御領域が、Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域である請求項1又は2記載の方法。
- σH依存性プロモーターを含む制御領域が、spoVG遺伝子の制御領域である請求項1又は2記載の方法。
- Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項3記載の方法。
- spoVG遺伝子の制御領域が、当該spoVG遺伝子遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項4記載の方法。
- バチルス属細菌が、枯草菌、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)又はバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)である請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- バチルス属細菌が、枯草菌、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)である請求項1〜6のいずれか1項記載の方法
- バチルス属細菌が、枯草菌である請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、枯草菌168株である請求項7〜9のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である請求項7〜10記載の方法。
- 枯草菌が、MGB874株である請求項11記載の方法。
- 枯草菌が、aprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAから選択される遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項7〜12のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、aprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr及びwprAの各遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項7〜13のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、sigE、sigF、sigGから選ばれる遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項7〜14のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、sigE、sigFから選ばれる遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項7〜15のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、sigF遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項7〜16のいずれか1項記載の方法。
- 枯草菌が、枯草菌MGB874株に対して、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌変異株である請求項12記載の方法。
- Cryタンパク質が、Cry5Bである請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
- Cryタンパク質が、Cry5Btである請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
- Cryタンパク質が、Cry4Aa、Cry4Ba及びCry11Aaから選ばれる殺蚊タンパク質である請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
- バチルス属細菌内でCryタンパク質を発現するための発現プラスミドであって、配列番号9で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において80%以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、Cryタンパク質をコードする遺伝子とσA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結されてなる、発現プラスミド。
- σA依存性プロモーター又はσH依存性プロモーターを含む制御領域が、Cryタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる請求項22記載の発現プラスミド。
- σA依存性プロモーターを含む制御領域が、Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を含む請求項22又は23記載の発現プラスミド。
- σH依存性プロモーターを含む制御領域が、spoVG遺伝子の制御領域を含む請求項求項22又は23記載の発現プラスミド。
- Bacillus sp.KSM−S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項24記載の発現プラスミド。
- spoVG遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項25記載の発現プラスミド。
- Cryタンパク質が、Cry5Bである請求項22〜27のいずれか1項記載の発現プラスミド。
- Cryタンパク質が、Cry5Btである請求項22〜27のいずれか1項記載の発現プラスミド。
- Cryタンパク質が、Cry4Aa、Cry4Ba及びCry11Aaから選ばれる殺蚊タンパク質である請求項22〜27のいずれか1項記載の発現プラスミド。
- 請求項22〜30のいずれか1項記載の発現プラスミドを含有するバチルス属細菌。
- 枯草菌、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)又はバチルス・ブレビス(Bacillus brevis)である、請求項31記載のバチルス属細菌。
- 枯草菌である、請求項31又は32記載のバチルス属細菌。
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