JP2017079639A - 枯草菌変異株及びその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】野生株に対してゲノムの大領域が欠失し、目的遺伝子産物を高生産することができる枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた目的遺伝子産物の製造方法の提供。【解決手段】枯草菌変異株であって、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。【選択図】なし

Description

本発明は、新規な枯草菌変異株及び利用に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。

近年、枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が生育に必須であることが指摘されている（非特許文献１）。また、枯草菌等の胞子形成初期に関わる遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁或いは細胞膜中のテイコ酸へのＤ−アラニン付加に関わる遺伝子、更にはサーファクチンの生合成或いは分泌に関わる遺伝子を単独に欠失又は不活性化した菌株が構築されている（特許文献１〜８参照）。

枯草菌についてはまた、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株の網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。この研究で得られた枯草菌変異株の１つであるＭＧＢ８７４株は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）に由来し、そのゲノムの合計８７４ｋｂが削除された変異株であるが、野生株である１６８株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上することが報告されている（特許文献９）。また、最近では、当該ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株を用いて、バイオポリマーとして注目されているポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）や、生分解性の高い天然のキレート剤として知られているジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸、ＤＰＡ）を効率よく製造する方法が報告されている（特許文献１０、特許文献１１）。
斯様に枯草菌は、有用物質の生産に極めて重要な微生物であり、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物から合成される目的生産物の工業的生産のために、生産性がより向上した枯草菌変異株が求められている。

一方、枯草菌ＡｂｒＢは、対数増殖期から定常期へと移行する間の遷移期、および定常期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得などに関与する様々な遺伝子発現の制御に重要な役割を果たす転写因子であり（非特許文献２及び３）、例えば、ＡｂｒＢ制御下の遺伝子として死滅因子（ｋｉｌｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）をコードするｓｋｆ遺伝子を含むｓｋｆオペロン（ｓｋｆＡ−Ｈ）などが負に制御されることが報告されている（非特許文献４）。また、ａｂｒＢ遺伝子を欠失させた枯草菌株では、アミラーゼやプロテアーゼの生産性が向上することが報告されている（特許文献１２）。
しかしながら、ＡｂｒＢを恒常的に発現させた枯草菌変異株については全く報告されていない。
他方、枯草菌ＫｉｎＡは細胞質内に存在し、胞子形成初期に関与する多成分制御系のヒスチジンキナーゼで、自身のリン酸化を経て、リン酸基をＳｐｏ０Ｆに転移し、Ｓｐｏ０Ｆ〜Ｐを生じるとされている。ＫｉｎＡ変異株では胞子形成能が野生型に比較して１〜３０％に減少するとされている（非特許文献５）。また、ＫｉｎＡ変異株ではアルカリセルラーゼ分泌生産性が向上することが認められている（特許文献１３）。

特開昭５８−１９０３９０号公報 特開昭６１−１３８１号公報 国際公開第８９／０４８６６号 特表平１１−５０９０９６号公報 特許第３２１０３１５号公報 特表２００１−５２７４０１号公報 特表２００２−５２００１７号公報 特表２００１−５０３６４１号公報 特開２００７−１３００１３号公報 特開２０１３−２５２１１５号公報 特開２０１４−０４５６９２号公報 特開２００７−７４９３４号公報 特開２００６−２９６２６８号公報

K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003 M. A. Strauch, et al., Mol. Microbiol., 1993, 7:337-342 Z. E. V. Phillips, et al., Cell Mol. Life Sci., 2002, 59:392-402 M. Fujita, et al., J. Bacteriol., 2005, 187:1357-1368 日本細菌学雑誌、1996,51：789-801

本発明は、野生株に対してゲノムの大領域が欠失し、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物を高生産することができる枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた有用物質の製造方法を提供することに関する。

本発明者らは、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）に由来し、１６８株のゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株において、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物の生産性を更に向上させるべく検討した結果、遷移期および定常期に特異的に発現する遺伝子群を抑制する枯草菌転写因子であるＡｂｒＢを恒常的に発現させると共に、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活化することにより、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物の生産性が向上した枯草菌変異株を取得できることを見出した。

すなわち本発明は、以下の（１）〜（７）に係るものである。
（１）枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
（２）上記（１）の枯草菌変異株において、目的遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
（３）枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、及びｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる工程を含む、方法。
（４）組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる工程、及び目的遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
（５）上記（２）の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体から目的遺伝子産物を回収する工程を含む、目的遺伝子産物の製造方法。
（６）上記（２）の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
（７）上記（２）の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からジピコリン酸を回収する工程を含む、ジピコリン酸の製造方法。

本発明によれば、目的遺伝子産物又は当該遺伝子産物を用いて合成される目的生産物の生産性に優れた枯草菌変異株が提供される。当該枯草菌変異株を用いることによって、目的遺伝子産物である目的タンパク質又はポリペプチド、又は遺伝子産物を用いて合成されるＰＧＡ、ＤＰＡといった有用な目的生産物の効率的生産が実現できる。

枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。 枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。 ｍａｚＦ遺伝子融合カセットを使用したマーカーフリー欠失法の手順を示す模式図。 βガラクトシダーゼ活性測定の図。

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ Ｖｅｒ．１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」の「数個」とは、例えば、対象となるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の総アミノ酸残基数又は総ヌクレオチド数の２０％以下の最大整数、好ましくは同じく１０％に当たる最大整数、より好ましくは同じく５％に当たる最大整数、さらに好ましくは同じく４％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく３％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく２％以下の最大整数、さらにより好ましくは同じく１％以下の最大整数を意味する。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。

本明細書において、別途定義されない限り、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上、好ましくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、又は、６×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、６×ＳＳＣ、６５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。

本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域を基点とした、５’側及び３’側に続く領域を示す。

本明細書において、遺伝子の制御領域とは、該領域の下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。

本明細書において、目的遺伝子と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。

本明細書において、「転写因子」（「転写制御因子」）とは、ＤＮＡ上の転写開始制御領域などに結合し、ＤＮＡからＲＮＡへの転写過程を促進或いは抑制するタンパク質を意味する。
また、本明細書において、「遷移期」とは細菌の増殖において、対数増殖期又は指数増殖期から定常期又は静止期へと移行する間を意味する。

本明細書において、「目的遺伝子産物」とは、本発明の枯草菌変異株を用いて生産される目的の遺伝子生産物（タンパク質又はポリペプチド）を意味し、「目的生産物」とは、当該遺伝子産物を用いて生産される目的の生産物（ＰＧＡ、ＤＰＡ等）を意味し、「目的遺伝子」とは、上記目的遺伝子産物又は目的生産物を生産するための遺伝子を意味する。

[１．枯草菌変異株の構築]
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、枯草菌ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されており、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。
本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、枯草菌ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現させる遺伝子改変と、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる改変とを加えることによって作製することができる。

[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失している。
ここで、例えばｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域の欠失とは、ｙｏａＶ遺伝子及びｙｏｂＯ遺伝子の両遺伝子を含む、両遺伝子に挟まれる領域をゲノムから削除することを意味している。

好ましくは、当該枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している枯草菌ＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）や、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域からなる群より選択される領域の全てを欠失しているＯＡ１０５株が挙げられる。

ＯＡ１０５株は、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域を欠失した株（ＭＧＢ４６９株）に対して、後記実施例５に記載のｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域をさらに欠失することにより、調製される。
なお、本明細書記載のＭＧＢ８７４株の欠失領域であるｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域及びｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域は、隣接した領域であり、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域と同じ領域である。
ＭＧＢ４６９株及びＭＧＢ８７４株は国立遺伝学研究所ＮＢＲＰ（ナショナルバイオリソースプロジェクト）より分譲可能となっている（http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do）。

上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、例えば、１６８株等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌１６８株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（[www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。

あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１に記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。

ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。

まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ'の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ'の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。

次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ'、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ'を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。

上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。

上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。

次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。

次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。

ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてｃｈｐＡ（ｍａｚＦ）遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報を参照）。

以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が一部又は全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。

[１−２．ａｂｒＢ遺伝子の恒常的発現]
本発明の枯草菌変異株においては、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されている。
枯草菌において、ａｂｒＢ遺伝子は転写因子ＡｂｒＢをコードする遺伝子であり、対数増殖期に発現するが、定常期へと移行する間の遷移期およびその後の定常期において発現が抑制される。本転写因子ＡｂｒＢは対数増殖期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得等に関する多数の遺伝子を直接的あるいは間接的に発現抑制する。遷移期および定常期においては、ＡｂｒＢによる発現抑制が解除され、上述の多数の遺伝子が発現誘導される。
枯草菌ａｂｒＢ遺伝子は、遺伝子番号：ＢＧ１０２０４として特定され、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＡｂｒＢをコードする。

ａｂｒＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属に属する微生物のａｂｒＢ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ等のバチルス属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌ａｂｒＢに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとし、ストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物におけるａｂｒＢに相当する遺伝子を同定することができる。

例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ７株のａｂｒＢ遺伝子（配列番号１２、１３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のａｂｒＢ遺伝子（配列番号１４、１５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＭＳ３１９株のａｂｒＢ遺伝子（配列番号１６，１７）は、枯草菌１６８株のａｂｒＢ遺伝子との配列同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９１％、８８％、８０％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９８％、９４％、８５％である。これらは、ａｂｒＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。

したがって、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｂｒＢと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様に遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

本発明において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築するとは、微生物が生存している間、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が常に発現するように遺伝子構築すること、すなわち当該遺伝子が通常では発現しない対数増殖期以降の定常期においても発現するように遺伝子構築することを意味する。ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築としては、例えば、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することが挙げられる。ここで、「抑制性制御因子」とは、遺伝子上の転写の制御に関わる特定の塩基配列に結合し、転写を抑制的に制御するタンパク質を意味する。ａｂｒＢ遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域の一例としては、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該配列と相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号５に示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、配列番号５に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる塩基配列が挙げられる。

上記制御領域において、抑制性制御因子の結合部位としては、例えば、配列番号５に示される塩基配列において、２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域が挙げられる。
ここで、配列番号５に示される塩基配列において２０〜４９番目の塩基からなる領域又は７３〜８９番目の塩基からなる領域に相当する領域としては、上述した配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡと相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するＤＮＡにおいて、配列番号５に示される塩基配列と比較した場合に当該領域に相当する領域であって、抑制性制御因子の結合部位として機能するものが挙げられる。
上記部位を不活性化する手段としては、該部位のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該部位の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。ここで、一部とは、１〜４０個、好ましくは５〜３０個、又は１０〜１７個の塩基からなる部分配列が挙げられる。このうち、好ましくは、配列番号５に示される塩基配列において、２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することが挙げられ、より好ましくは７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することである。上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。

また、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築の他の手段としては、ゲノム上の枯草菌ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子に、定常期において該遺伝子の発現を強化できる制御領域（強発現制御領域）を作動可能に連結すること、強発現制御領域と作動可能に連結された枯草菌ａｂｒＢ遺伝子又それに相当する遺伝子を細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することが挙げられる。斯かる強発現制御領域としては、例えば、枯草菌ｒｐｌＫ遺伝子、ｆｕｓ遺伝子若しくはａｔｐＩ遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が挙げられる。

[１−３．ｋｉｎＡ遺伝子の欠失又は不活性化]
本発明の枯草菌変異株においては、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている。ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築がなされた枯草菌変異株において、ｋｉｎＡ遺伝子の欠失又は不活性化により、培地中での溶菌現象を抑制することが見出された。
ｋｉｎＡ遺伝子は、遺伝子番号：ＢＧ１０２０４（配列番号３）として特定され、斯かる遺伝子がコードするタンパク質は、胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼ（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｅｎｓｏｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ）であるとされている。

枯草菌のｋｉｎＡ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したＢＳＯＲＦ ＤＢにて確認することができる。

[２．組換え枯草菌の構築]
本発明の組換え枯草菌は、上述したａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化され、さらに目的遺伝子が発現可能なように強化又は導入されたものが好ましい。
当該組換え枯草菌は、最終的に得られた微生物において、上述したゲノムの大領域の欠失、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化、目的遺伝子が発現可能なように強化又は導入が達成されていればよく、それぞれの遺伝子改変・導入工程の順序は特に限定されないが、好ましくは、ゲノムの大領域が欠失したゲノム欠失株に対して、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化された枯草菌変異株を親株とし、これに目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入することにより製造できる。

[２−１．目的遺伝子の発現可能な強化又は導入]
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するとは、本発明の枯草菌変異株において、目的遺伝子が少なくとも発現可能な状態に置かれることを意味している。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入する手段としては、例えば、親株のゲノム上で、野生型に比較し発現を強化できる制御領域（強制御領域）と目的遺伝子とを作動可能に連結して配置すること；及び、制御領域、好ましくは強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を、親株細胞のゲノム中若しくはプラスミド中に導入すること、などが挙げられる。例えば、親株のゲノム上の目的遺伝子の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、適切な位置に目的遺伝子が組み込まれた発現ベクターや、制御領域、好ましくは強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを、一般的な形質転換法を用いて親株に取り込ませることが挙げられる。
また、制御領域には、発現させる遺伝子産物に応じて、転写及び翻訳に関わる制御領域の他、分泌に関わる制御領域（例えば、分泌シグナルペプチド領域）を包含させることができる。
なお、上記に例示したような、細胞へ遺伝子を発現可能に導入するための種々の手法は、当業者に周知である。すなわち、ベクターによって導入する場合、その上流に「当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域」が適正な形で結合されている目的遺伝子を含むベクターを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の適当な形質転換法により導入すればよい。ここで、ベクターとしては、目的遺伝子を宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な運搬体核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、ＹＡＣ，ＢＡＣなどの人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドが挙げられ、プラスミドとしては例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＨＹ３００ＰＬＫが挙げられる。

また、ゲノムへの挿入は、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、目的遺伝子に導入を起こさせる染色体領域の一部を結合したＤＮＡ断片を、微生物細胞内に取り込ませ、当該染色体領域の一部領域における相同組換えを起こさせることによって、ゲノムに組み込ませることができる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。

一態様において、本発明の枯草菌変異株に導入される目的遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域と作動可能に連結されていることが挙げられる。好ましくは、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、更に好ましくは、分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的遺伝子の上流に作動可能に連結されているものが挙げられる。

例えば、本発明の枯草菌変異株に導入される目的遺伝子の一例として挙げられるセルラーゼ遺伝子は、その構造遺伝子が、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）、又はＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が作動可能に連結されていることが望ましい。より具体的には、配列番号６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号８で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列からなるＤＮＡ断片、当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなり且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片が、目的遺伝子の構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部、好ましくは数個（例えば、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）の塩基を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片を意味する。

またここで言うストリンジェントな条件とは、例えば[Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）]に記載の条件等が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、又は、６×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、６×ＳＳＣ、６５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。

本発明において、目的遺伝子としては特に限定されず、内在性の遺伝子であっても、外来遺伝子（異種遺伝子）であってもよい。目的遺伝子としては、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断、研究などの各種分野において有用なあらゆるタンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素、生理活性ペプチド、マーカー、シグナル伝達物質、構造タンパク質、各種調節因子などをコードする遺伝子が挙げられる。また、上記酵素としては、機能別に列挙すると、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ／Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等が挙げられるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素、ＰＧＡ合成酵素やＤＰＡシンターゼ等の合成酵素が挙げられる。

ここで、セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２８０， ３０９， １９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセルラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ、又は、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は配列番号７又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。

α−アミラーゼとしては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来の液化型アミラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼ、又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。

プロテアーゼとしては、微生物由来、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ Ｋ−１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３７６）由来のアルカリセリンプロテアーゼ、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセリンプロテアーゼが挙げられる。

本発明の枯草菌変異株は、ＰＧＡやＤＰＡの効率的な生産に好適に用いられる。この場合の目的遺伝子は、内在性の遺伝子である、ポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）の生産に関わる遺伝子（例えば、ＰＧＡ合成酵素遺伝子、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子）や、ジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸、ＤＰＡ）の生産に関わる遺伝子（例えば、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子）であり、本発明の枯草菌変異株に対して、当該ＰＧＡの生産に関わる遺伝子又はＤＰＡの生産に関わる遺伝子を発現可能に強化又は導入することにより、ＰＧＡやＤＰＡの効率的な生産が可能となる。
以下に、ＰＧＡ及びＤＰＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入について述べる。

[２−２．ＰＧＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
[２−２−１．ＰＧＡ合成酵素遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ（配列番号１８）、ｐｇｓＣ（配列番号２０）、ｐｇｓＡ（配列番号２２）及びｐｇｓＥ（配列番号２４）、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が挙げられ、好ましくは、少なくとも枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。

枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１８に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１９に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１９に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％、例えば、５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'）配列番号２０に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号２０に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％、例えば、５９％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号２０に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号２１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号２１に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％、例えば、４８％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号２３に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号２３に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'''）配列番号２４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号２４に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号２４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号２５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号２５に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％、例えば、３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

上記において、タンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸、及びＡＴＰ又はＧＴＰを基質とし、これに塩化マンガンを加えた反応溶液中におけるＰＧＡの生成を検出することにより測定することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００２，１８４：３３７−３４３）。また、上述の枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子を、上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とともに枯草菌又はその変異株に導入した際に、当該株におけるＰＧＡの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。
所定の微生物におけるＰＧＡ生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するＰＧＡ生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＧＡを検出する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，６０：２５５−２５８）；酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：１６８４−１６８７）；培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２６３：６−１２）；ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７：１２１２−１２１３）等によって行うことができる。

また、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ、及びｐｇｓＥの各遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ合成に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、ＰＧＡ生産性微生物であってもＰＧＡ非生産性微生物であってもよく、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ等のバチルス属微生物、及びＮａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１８、２０、２２又は２４で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１８、２０、２２又は２４で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子を同定することができる。

例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｓＣ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０１遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＢ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９９．９％、７８％、８１％及び６２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９９．７％、８９％、９３％及び５５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｔＡ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０２遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＣ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ１００％、７８％、８３％及び５９％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ１００％、８９％、９３％及び５１％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｔＢ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ２９１７遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＡ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ１００％、６８％、７５％及び４８％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ１００％、６７％、７８％及び３０％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＥ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｐｇｓＥ遺伝子、及びＢａｃｉｌｌｓｕ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｈ９４０１株のｃａｐＥ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＥ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ６３％、７６％及び５１％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ４７％、７２％及び３５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。

枯草菌遺伝子ｐｇｓＢＣＡＥに相当するバチルス属又は他の属に属する微生物の遺伝子の具体的な例としては、下記表２に示す遺伝子が挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）、（ａ'）〜（ｆ'）、（ａ''）〜（ｆ''）及び（ａ'''）〜（ｆ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、少なくとも上記（ａ）〜（ｆ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ａ'）〜（ｆ'）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせを含む。また好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、少なくとも上記（ａ）で表した遺伝子と、（ａ'）で表した遺伝子との組み合わせを含む。さらに好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）及び（ａ'）で表した遺伝子の組み合わせであるか、又は上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子の組み合わせである。

別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば配列番号１８、２０、２２、２４並びに２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０及び６２のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つが挙げられ、好ましくは、少なくとも配列番号１８、２８、３４、４２、５０及び５６のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号２０、３０、３６、４４、５２及び５８のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせを含む。より好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、配列番号１８、２８、３４、４２、５０及び５６のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号２０、３０、３６、４４、５２及び５８のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号２２、３２、３８、４６、５４及び６０のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号２４、４０、４８及び６２のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせである。

[２−２−２．ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌においては、さらにＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子が発現可能に強化又は導入されるのが好ましい。微生物がＰＧＡを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やＰＧＡの生産性に悪影響が及ぶ場合がある。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が発現可能に強化又は導入されることで、低分子化されたＰＧＡが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、ＰＧＡの高生産に伴う上記課題を解決することができる。
したがって、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子（配列番号２６）又はそれに相当する遺伝子が挙げられる。

枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：（ｇ）配列番号２６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２６に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２７に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％、例えば、５７％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ分解に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号２６で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号６４）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号６６）が挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の組換え枯草菌において発現可能なように強化又は導入される枯草菌ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、上記（ｇ）〜（ｌ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、上記（ｇ）で表した遺伝子である。

別の好ましい実施形態において、枯草菌ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、配列番号２６、６４及び６６のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つである。

斯かるＰＧＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入は、親株のゲノム上の目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって成すことができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により成すこともできる。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するための手順の一例を以下に記載する。

（１）目的遺伝子が制御領域と作動可能に連結され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片を構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ｒｒｎＯオペロン制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。次いで、このＤＮＡ断片を親株に導入すれば、親株ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。

（２）制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７のセルラーゼ遺伝子の制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子）の順で配置したＤＮＡを含むベクターを調製する。次いで、このベクターを親株に導入すれば、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。

ここで、目的遺伝子の発現に使用され得る制御領域は、好ましくは、宿主内において下流の目的遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流の目的遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域である。また好ましくは、目的遺伝子の野生型の制御領域と比較して、目的遺伝子の発現を強化することができる制御領域（強制御領域）である。

ＰＧＡ合成酵素遺伝子、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現に使用され得る制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域、ｔｕｆＡ遺伝子制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が挙げられる。

好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流０．４〜１．０ｋｂ領域（配列番号６８）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が、ｒｒｎＯオペロンの１６ＳｒＲＮＡの上流０．２〜1.０ｋｂ領域（配列番号２０８）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が、ｔｕｆＡ遺伝子の翻訳開始点の上流から１ｋｂの領域（配列番号２０９）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が挙げられる。

好ましくは、ＰＧＡ合成酵素遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子）又はその相当遺伝子に対しては上記ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子の制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群全て（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）又はその相当遺伝子群全てに対してはｒｒｎＯオペロン制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はその相当遺伝子に対してはｔｕｆＡ遺伝子制御領域が使用される。

目的遺伝子又は制御領域の親株への導入に使用されるベクターは、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターであればよい。ベクターの種類は、適宜選択することができるが、親株内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が親株のゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下であれば良く、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下であれば良い。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

目的遺伝子又は制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的遺伝子及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、目的遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、目的遺伝子の断片の順で連結されているようにする。

ＰＧＡ合成酵素遺伝子がｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせの場合は、親株に導入するＤＮＡ断片やベクター上において、上流から制御領域断片、ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子の断片、次いでｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにするとよい。

親株へのＤＮＡ断片又はベクターの導入は、例えばプロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）やコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６３，８６：３９２−４００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）などの通常の手法に従って行うことができる。

[２−３．ＤＰＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
枯草菌におけるＤＰＡシンターゼ遺伝子は、ＤＰＡシンターゼ・サブユニットＡをコードするｓｐｏＶＦＡと、ＤＰＡシンターゼ・サブユニットＢをコードするｓｐｏＶＦＢとから構成されている。枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子のヌクレオチド配列及び当該ｓｐｏＶＦＡ遺伝子によりコードされるＤＰＡシンターゼ・サブユニットＡのアミノ酸をそれぞれ配列番号６９及び７０に示す。また、枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子のヌクレオチド配列及び当該ｓｐｏＶＦＢ遺伝子によりコードされるＤＰＡシンターゼ・サブユニットＢのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７１及び７２に示す。なお、野生型の枯草菌において、ｓｐｏＶＦＡ及びｓｐｏＶＦＢはこの順で配置されてオペロンを形成しており、共にσＫ因子依存性プロモーターにより転写制御されている。したがって、野生型の枯草菌において、ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子は枯草菌胞子形成過程におけるスポアコートタンパク沈着期に発現し、内生胞子中にジピコリン酸が蓄積することとなる。

したがって、ＤＰＡシンターゼ遺伝子の例としては、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせが挙げられる。
（ｉ）以下のいずれかである枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子：
ｉａ）配列番号６９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｉｂ）配列番号６９に示すヌクレオチド配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ｉｃ）配列番号６９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｉｄ）配列番号７０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｉｅ）配列番号７０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、
ｉｆ）配列番号７０に示すアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ii）以下のいずれかである枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子：
ｉｉａ）配列番号７１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｉｉｂ）配列番号７１に示すヌクレオチド配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ｉｉｃ）配列番号７１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｉｉｄ）配列番号７２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｉｉｅ）配列番号７２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び、
ｉｉｆ）配列番号７２に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つ枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＤＰＡシンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

さらに、上記枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子に相当する遺伝子の例としては、枯草菌以外の微生物由来のＤＰＡシンターゼ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物に由来するＤＰＡシンターゼ遺伝子の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号７３、７４）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号７５、７６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号７７、７８）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号７９、８０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のＣｔｈｅＤＲＡＦＴ＿２１７０（配列番号８１、８２）及びＣＴＨＥＤＲＡＦＴ＿２１７１（配列番号８３、８４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号８５、８６）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号８７、８８）、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号８９、９０）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号９１、９２）等を挙げることができる。本方法においては、上述した如何なる微生物由来のＤＰＡシンターゼ遺伝子をも使用することができる。

上述したＤＰＡシンターゼ遺伝子は、当該遺伝子の発現量を高めるプロモーター、例えば、上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターと作動可能に連結されることにより、その発現が強化されることから好適である。
具体的には、（１）上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター及び上記ＤＰＡシンターゼ遺伝子が、当該プロモーターの制御下に当該遺伝子が発現されるように配置され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片として構築され得る。このＤＮＡ断片を上述した枯草菌変異株（親株）に導入すれば、親株ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。形質転換法としては、親株となる微生物に応じて適切な、且つ一般的な方法を採用することができる。例えば、上流から、上述したプロモーター、ｓｐｏＶＦＡ、ｓｐｏＶＦＢの順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。得られたＤＮＡ断片を用いて親株を形質転換する。

あるいは、（２）上記胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーター及び上記ＤＰＡシンターゼ遺伝子が、当該プロモーターの制御下に当該遺伝子が発現されるように所望のベクターに組み込まれ得る。例えば、上述したプロモーター領域、ｓｐｏＶＦＡ遺伝子、及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子の断片をＰＣＲ等によって増幅し、次いで当該断片を制限酵素法等の通常の方法によってベクターに挿入し、連結すればよい。その際、ベクター上で、上流から当該プロモーター断片、ｓｐｏＶＦＡ断片、ｓｐｏＶＦＢ断片の順で連結されているようにする。得られた組換えベクターを用いて通常の方法に従い親株を形質転換することができる。

ここで、使用されるベクターは、ＰＧＡ合成酵素遺伝子の発現において記載したものと同様のものが使用でき、また、当該ベクターを用いた親株の形質転換方法についても、前記と同様の方法を用いることができる。

ここで、枯草菌の場合、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターとしては、σＡ因子依存性プロモーター、σＨ因子依存性プロモーター、σＥ因子依存性プロモーター及びσＦ因子依存性プロモーターが挙げられる。構成的に作用するプロモーターを使用することが好ましく、より好ましい例としては、σＡ依存性プロモーター及びσＨ依存性プロモーターが挙げられる。また、環境ストレスに応じて発現するσＢ因子依存性プロモーターや、ＥＣＦ（ｅｘｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）σ因子依存性プロモーター（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１４，２２０（１），１５５−６０，２００３）を使用することもできる。

σＡ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、枯草菌ファージＳＰ０１プロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，４３９−４４３，１９８４）、ｖｅｇ遺伝子、ａｍｙＥ（アミラーゼ）遺伝子、ａｐｒＥ（ズブチリシン）遺伝子及びＳ２３７（Ｓ２３７セルラーゼ、特開２０００−２１００８１号公報）遺伝子のプロモーターを挙げることができる。σＨ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、ｃｉｔＧ遺伝子、ｓｐｏＶＳ遺伝子及びｓｐｏＶＧ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． （１９８６） ８３：９４３８−９４４２．）遺伝子のプロモーターが挙げられる。σＥ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、ｃｏｔＥ遺伝子及びｓｐｏＩＶＡ遺伝子のプロモーターが挙げられる。本方法においては、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｙｏｅＢ遺伝子のプロモーター、及びＳ２３７セルラーゼ遺伝子のプロモーターが望ましい。

[３．目的遺伝子産物の製造、ＰＧＡ及びＤＰＡの製造]

斯くして得られた本発明の枯草菌変異株は、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株と比べて、目的遺伝子産物や目的生産物の生産能が向上している。したがって、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、タンパク質又はポリペプチドといった目的遺伝産物を効率よく生産することが可能になり、また、ＰＧＡ、ＤＰＡといった有用な目的生産物を効率よく生産することが可能になる。
本発明の組換え枯草菌を用いた目的遺伝子産物の生産は、当該菌株をグリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する培地に接種し、通常の微生物培養法（振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養など）にて培養し、培養終了後、当該培養物又は菌体から、目的遺伝子産物を、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、等電点沈殿等の手法を用いて回収・採取し、及び必要に応じて精製することにより行うことができる。

ＰＧＡの製造においては、ＰＧＡの生産性をより向上させるために、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養するのが好ましい。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、ＰＧＡの生産性向上の点から、０．００５ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度６００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
この場合の、培養条件として、至適温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、より好ましくは５〜８である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは１〜１０日間であり、より好ましくは１〜５日間である。
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた菌体と分離する必要がある。ＰＧＡを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。

また、ＤＰＡの製造においては、培地のｐＨは６．０〜８．０に調節することが適当であり、ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養条件は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜４日間振盪、又は通気撹拌培養することが挙げられる。なお、上記のように培養した微生物を、アスパラギン酸及び/又はピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させることで、該水溶液中にＤＰＡを産生させることも可能である。この時、エネルギー源として上記培地に添加されるような物質を共存させることでさらに効率よくＤＰＡを産生させることが可能である。
上記培養上清又は反応上清液からのＤＰＡの単離は、公知の方法、例えば、イオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理による不純物の除去等、又はそれらを組み合わせることで実施することができる。この方法により、容易にジピコリン酸の結晶又は沈殿を得ることができる。
上記イオン交換樹脂処理などによって得られたＤＰＡを含有する溶液に、目的に応じた量のアルカリを添加することで、ＤＰＡの塩を得ることができる。具体的には、ＮａＯＨを添加することにより、ジピコリン酸ナトリウム塩を得ることができる。

本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
枯草菌のａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
＜２＞ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域及びｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ-ｙｒａＫ）を欠失したゲノムを有する、＜１＞の枯草菌変異株。
＜３＞ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する、＜１＞の枯草菌変異株。
＜４＞ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することである、＜１＞〜＜３＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜５＞ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号５に示される塩基配列において、２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である、＜１＞〜＜３＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜６＞ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、配列番号５に示される塩基配列において７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、＜５＞の枯草菌変異株。
＜７＞ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜６＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞ｋｉｎＡ遺伝子が、下記の（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜７＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜９＞＜１＞〜＜８＞のいずれかの枯草菌変異株において、目的遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
＜１０＞目的遺伝子が、セルラーゼ遺伝子である＜９＞の組換え枯草菌。
＜１１＞目的遺伝子が、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子である＜９＞の組換え枯草菌。
＜１２＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である＜１０＞の組換え枯草菌。
＜１３＞目的遺伝子が、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子である＜９＞の組換え枯草菌。
＜１４＞ジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子が、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子である＜１３＞の組換え枯草菌。
＜１５＞枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、及びｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる工程を含む、方法。
＜１６＞組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる工程、及び目的遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
＜１７＞＜９＞の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体から目的遺伝子産物を回収する工程を含む、目的遺伝子産物の製造方法。
＜１８＞＜１０＞の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からセルラーゼを回収する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
＜１９＞＜１１＞又は＜１２＞の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
＜２０＞グルタミン酸又はその塩を０．００５〜６００ｇ／Ｌ含有する培地を用いる＜１９＞記載の、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
＜２１＞＜１３＞又は＜１４＞の組換え枯草菌を培養し、培養物からジピコリン酸を回収する工程を含む、ジピコリン酸の製造方法。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）菌株の構築
（１−１）トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特開２００７−１３００１３号公報）におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の元株である枯草菌１６８株は、遺伝子型としてｔｒｐＣ２を所持している。つまり１６８株はトリプトファン合成に関与するインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードするｔｒｐＣ遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株はトリプトファン非要求性であることが知られている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５（Ｐｔ１２）：３３１９−３３２０）。枯草菌１６８株とＡＴＣＣ６０５１Ｔ株のｔｒｐＣ遺伝子を比較したところ、３２８番目から３３０番目のヌクレオチドＡＴＴが枯草菌１６８株では存在しないことがわかった。そこで、ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株ゲノムを鋳型とし、表３記載のｔｒｐＣ＿Ｆ１及びｔｒｐＣ＿Ｒ１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を構築した。このＰＣＲ産物を用いて枯草菌野生株１６８株及び枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株をコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）でそれぞれ形質転換し、トリプトファン非添加のＳＭＡ寒天培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素２カリウム、０．６％リン酸２水素カリウム、０．１％クエン酸３ナトリウム-２水和物、０．５％グルコース、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性の枯草菌変異株１６８Ｔ及び枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株をそれぞれ得た。

（１−２）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入された枯草菌変異株（１６８＿ａｂｒＢ＊株）の構築
ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入を行った。枯草菌野生株１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＲを用いて、ａｂｒＢ遺伝子上流領域断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表４記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＰＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＰＲを用いて、ａｂｒＢ遺伝子上流領域断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、表４記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＲを用いて、ａｂｒＢ遺伝子上流域・中流領域断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子保有のプラスミドｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表４記載のプライマーｒＰＣＲ−ＣｍＦ２及びｒＰＣＲ−ＣｍＲ２を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）及び断片（Ｄ）を表４記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＦ及びｒＰＣＲ−ＣｍＲ２を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、断片（Ｂ）及び断片（Ｃ）を表４記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＰＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させた。最後に、断片（Ａ＋Ｄ）及び断片（Ｂ＋Ｃ）を表４記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｄ＋Ｂ＋Ｃ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌野生株１６８株で形質転換し、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊＿Ｃｍ株を得た。

次に、薬剤耐性遺伝子置換用プラスミドｐＣｍ：：Ｅｍ（Ｌｅｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０１３，１９５：１６９７−１７０５）を用いて枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊＿Ｃｍ株で形質転換し、クロラムフェニコール耐性遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子に置換された枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊を構築した。

得られた枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。

（１−３）ｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（１６８＿ΔｋｉｎＡ株）の構築
ｋｉｎＡ遺伝子の欠失変異導入を行った。枯草菌野生株１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４記載のプライマーｋｉｎＡ−ｕＦ１及びｋｉｎＡ−ｕＲ１を用いて、ｋｉｎＡ遺伝子上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表４記載のプライマーｋｉｎＡ−ｄＦ１及びｋｉｎＡ−ｄＲ１を用いて、ｋｉｎＡ遺伝子下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣＫ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，７：６９）を鋳型とし、表４記載のプライマーｒＰＣＲ−ＫｍＦ及びｒＰＣＲ−ＫｍＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、カナマイシン耐性遺伝子の断片（Ｃ）をＰＣＲ増幅した。

次に、断片（Ａ）、断片（Ｃ）及び断片（Ｂ）をこの順になるように表４記載のプライマーｋｉｎＡ−ｕＦ１及びｋｉｎＡ−ｄＲ１を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｃ＋Ｂ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌野生株１６８株で形質転換し、枯草菌変異株１６８＿ΔｋｉｎＡ株を得た。

得られた枯草菌変異株１６８＿ΔｋｉｎＡ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が欠失していることを確認した。

（１−４）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入及びｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株）の構築
枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株１６８＿ΔｋｉｎＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株として構築した。

得られた枯草菌変のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（１−５）ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株）の構築
始めに、枯草菌が本来ゲノム上に有するＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。

実施例（１−１）にて構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、断片（Ａ）増幅には表５記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表５記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ２及びｐｇｓ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表５記載のプライマーｐｇｓ−ＩＦ及びｐｇｓ−ＩＲを、それぞれ使用した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）を鋳型とし、表５記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｃ）をこの順となる様に表５記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。構築した最終ＰＣＲ産物を枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株で形質転換した。得られた形質転換体（枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株）のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。本実施例でのｍａｚＦ遺伝子カセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築したＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子欠失方法を図３に示した。

次いで、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−１ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表５記載のプライマーｔｕｆＡ−２ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーＢＳｐｇｄＳ−Ｆ及びＢＳｐｇｄＳ−Ｒを用いて、ｐｇｄＳ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣ２１３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表５記載のプライマーｓｐｃ−Ｆ及びｓｐｃ−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｃ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｂ）をこの順となるように表５記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて上述した枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を得た。

得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。

次いで、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及び表５記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＲを用いて、ａｍｙＥ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。ｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）で枯草菌野生株１６８を形質転換した変異株を鋳型とし、表５記載のプライマーｃａｔ−Ｆ及び表５記載のプライマーａｍｙＥ−ＤＲを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｍｙＥ下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＲＩＫ３５６株（Ｎａｔｏｒｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００９，１９１：４５５５−４５６１）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーａｍｙＥ／ＰｒｒｎＯ−Ｆ及びＰｒｒｎＯ／ｂｓ−ｐｇｓＲを用いて、ｒｒｎＯオペロンの制御領域の断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーｂｓ−ｐｇｓＦ及びｂｓ−ｐｇｓ／ｃａｔＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子群の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｃ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｂ）をこの順となる様に表５記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及びａｍｙＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いてＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株を得た。

得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。

（１−６）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入され、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株）の構築
始めに、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊株、及びカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔｋｉｎＡ株としてそれぞれ構築した。

次に、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔｋｉｎＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株として構築した。

得られた枯草菌変のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（実施例２）ＰＧＡ生産性評価
実施例１にて得られた枯草菌変異株を５ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）に１ｍＬ（約３％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。ＰＧＡ生産量は、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株におけるＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。

結果を表６に示す。ａｂｒＢ遺伝子を恒常発現させた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊株は、培養１日目で、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡと比較してＰＧＡ生産量が高かった。また、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔｋｉｎＡ株は、培養１日目で、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡと比較してＰＧＡ生産量が高かった。さらに、ａｂｒＢ遺伝子を恒常発現及びｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株は、培養１日目で、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡと比較してＰＧＡ生産量が最も高かった。

＜ＰＧＡの定量分析及び分子量分析＞
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＰＧＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０^７）及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０^６）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムＴＳＫ ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。溶離液には０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度は５０℃、溶出ピークの検出波長は２１０ｎｍを用いた。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり５０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量８０万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。

（実施例３）菌株の構築
（３−１）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入及びｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株）の構築
・ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株
始めに、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊株を構築した。
また、上記（１−３）と同様な方法で表７に示したプライマーを用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔのゲノム上のｋｉｎＡ遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｐＣＵ１９４由来（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ Ｓ．ａｎｄ Ｂ． Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８２，１５０：８１５−８２５））に置換された枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｋｉｎＡ株を構築した。

次に、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｋｉｎＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株として構築した。

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（３−２）ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株）の構築
・ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株
上記で構築したＭＧＢ８７４Ｔ株を宿主として、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株）の構築を行った。枯草菌野生株１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−ｓ１及びＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−１ｒ（配列番号１７８）を用いて、断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。この断片（Ａ）はｓｐｏＶＦＡ遺伝子のプロモーターの上流に隣接する領域である。また、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−２ｆ及びＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−ｓ２を用いて、断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。この断片（Ｂ）は、ｓｐｏＶＦＡ遺伝子の開始コドンから下流の領域である。さらに、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーＰ−ｙｏｅＢ−Ｆ及びＰ−ｙｏｅＢ−Ｒを用いて、ｙｏｅＢ制御領域配列を含む断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、プラスミドｐＪＬ６２（ＬｅＤｅａｕｘ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：１６６−１７５）を鋳型とし、表７記載のプライマーｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＲ及びｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＦを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）及び断片（Ｄ）を鋳型に、表７記載のプライマーＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−ｓ１及びｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＦを用いて、断片（Ａ）と断片（Ｄ）を連結した断片（Ａ＋Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。また、得られた断片（Ｃ）及び断片（Ｂ）を鋳型に、表７記載のプライマーＰ−ｙｏｅＢ−Ｆ及びＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−ｓ２を用いて、断片（Ｃ）と断片（Ｂ）を連結した断片（Ｃ＋Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。

最後に、得られた断片（Ａ＋Ｄ）及び（Ｃ＋Ｂ）を鋳型に、表７記載のプライマーＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−１ｆ及びＰｓｕｂ−ｓｐｏＶＦＡＢ−２ｒをもちいて、断片（Ａ＋Ｄ）及び断片（Ｃ＋Ｂ）を連結したＤＮＡ断片を増幅した。
得られたＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ株の形質転換を行い、スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した（以下、分離した形質転換体をＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と称する）。ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株は、ｓｐｏＶＦＡＢ遺伝子のプロモーターをｙｏｅＢ遺伝子のプロモーターに置換され、ｓｐｏＶＦＡＢ遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株である。

ＰＣＲ及びそれに続くサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７４：５４６３−５４６７）によるシークエンシングによって、構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株のゲノム上のｓｐｏＶＦＡ制御領域とｓｐｏＶＦＡ遺伝子の間に、スペクチノマイシン耐性遺伝子及びｙｏｅＢ遺伝子制御領域が挿入されていることを確認した。

（３−３）ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株にジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株）の構築
上記（３−２）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株を宿主として、ｋｉｎＡ遺伝子を削除された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢΔｋｉｎＡ）の構築を行った。上記（３−１）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株から抽出したゲノムＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した（以下、分離した形質転換体をＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と称する）。

次に、得られた形質転換体ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢを宿主として、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入変異体ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株の構築を行った。上記（３−１）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株から抽出したゲノムＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した（以下、分離した形質転換体をＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と称する）。

ＰＣＲ及びそれに続くサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７４：５４６３−５４６７）によるシークエンシングによって、構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株のゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること及び欠失されていることを確認した。

（実施例４）ＤＰＡ生産性評価
実施例３で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株を、５ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５．０％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、）で３７℃において８〜１０時間振盪培養を行い、得られた培養液を、５％グルコースＭ改変培地（５．０％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）３０ｍＬに接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで２日間、振盪培養を行った。
培養終了後、下記参考例に示す分析条件にてＤＰＡ生産量を測定し、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株の生産量を１００％とした場合の相対値を求めた。

ａｂｒＢ恒常発現及びｋｉｎＡ欠失変異を導入した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株は、これらの変異を導入していない株であるＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｙｏｅＢ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と比較して、ＤＰＡ生産量が顕著に高かった（表８）。

＜ＤＰＡの定量＞
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＤＰＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析を行った。ＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続したものを用いた。分析カラムは、Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ ６０（Å）４μｍ ４．６×２５０ｍｍ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｂｏｎｄｅｄ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。溶離液としては、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む水を濃リン酸でｐＨ３．４に合わせた水溶液とアセトニトリル溶液とを１：１に混合した溶液を用いた。測定条件は、検出波長を２７０ｎｍとし、流速を１ｍＬ／分とした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くため、ＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過により前処理した。濃度検定は、２，６−Ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｌｉｃ ａｃｉｄ：ＤＰＡ，９９％（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いて作成した検量線に基づいて行った。

（実施例５）菌株の構築
（５−１）枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ株の作製
枯草菌野生株１６８株のゲノム上に存在する２つの溶原化ファージ領域（ＳＰβ、ＰＢＳＸ）、１つの潜在性溶原化ファージ残遺物領域（ｓｋｉｎ）、７つのプロファージ様領域（ｐｒｏｐｈａｇｅ１−７）、２つの抗菌性物質ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ及びｂａｃｉｌｌａｅｎｅの合成遺伝子（ｐｐｓ及びｐｋｓ）を欠失し、更にトリプトファン要求性を解除した枯草菌変異株を構築した。
始めに、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ-ｙｒａＫ）領域の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、実施例（１−５）にて記載したマーカーフリーの欠失方法にて構築した。

始めに、枯草菌野生株１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９記載のプライマーｐｒｏ７−ＤＦ１及びｐｒｏ７−ＤＲ１.２（ｎｅｗ）を用いて、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域の上流である断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９記載のプライマーｐｒｏ７−ＤＦ２.２（ｎｅｗ）及びｐｒｏ７−ＤＲ２を用いて、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域の下流である断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９記載のプライマーｐｒｏ７−ＩＦ２及びｐｒｏ７−ＩＲを用いて、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域内と相同領域である断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）を鋳型とし、表５記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｃ）をこの順となる様に表９のプライマーｐｒｏ７−ＤＦ１及びｐｒｏ７−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ４６９株（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．，２００８，１５：７３−８１）の形質転換を行い、ＩＰＴＧを含まずスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。本株は、ＳＰβ、ＰＢＳＸ、ｐｒｏｐｈａｇｅ１−６領域、ｐｐｓ及びｐｋｓを欠失し、ｕｐｐ遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子が導入された変異（ｕｐｐ：：ｅｒｍ）を有し、更にｐｒｏｐｈａｇｅ７：：ｍａｚＦカセットが導入された枯草菌変異株である（以下、ＭＧＢ４６９＿ｐｒｏ７株と称する）。

次に、ｍａｚＦ遺伝子カセットを除くため、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上で培養し、生育したコロニーを選択した。得られた変異株は、断片（Ｂ）において細胞内相同組換えによりｍａｚＦカセットが除去された変異株となる（以下、ＭＧＢ１２株と称する）。

次に、枯草菌変異株ＭＧＢ１２株のトリプトファン要求性解除株の構築を行った。
実施例（１−１）と同様の手法を用いて、トリプトファン要求性が解除された枯草菌変異株ＭＧＢ１２Ｔ株の構築をした。

最後に、枯草菌変異株ＭＧＢ１２Ｔ株のｕｐｐ：：ｅｒｍ変異の除去を行った。

実施例（１−１）にて構築した枯草菌変異株１６８Ｔ株及び枯草菌変異株ＭＧＢ４６９＿ｐｒｏ７株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ１２＿Ｔ株の形質転換を行い、スペクチノマイシン耐性且つエリスロマイシン感受性の形質転換体を選択した。次いで、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを選択し、目的とした枯草菌野生株１６８株のゲノム上に存在する２つの溶原化ファージ領域（ＳＰβ、ＰＢＳＸ）、１つの潜在性溶原化ファージ残遺物領域（ｓｋｉｎ）、７つのプロファージ様領域（ｐｒｏｐｈａｇｅ１−７）、２つの抗菌性物質ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ及びｂａｃｉｌｌａｅｎｅの合成遺伝子（ｐｐｓ及びｐｋｓ）を欠失し、更にトリプトファン要求性を解除した枯草菌変異株を構築した（以下、枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ株と称する）。

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（５−２）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入された枯草菌変異株（ＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊株）の構築
始めに、実施例（１−４）にて構築した枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊株として構築した。

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。

（５−３）ｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（ＯＡ１０５Ｔ＿ΔｋｉｎＡ株）の構築
実施例（１−４）にて構築した枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ株の形質転換を行い、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ＿ΔｋｉｎＡ株として構築した。

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が欠失されていることを確認した。

（５−４）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入、及びｋｉｎＡ遺伝子が欠失された枯草菌変異株（ＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株）の構築

実施例（１−４）にて構築した枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ＿ΔｋｉｎＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株として構築した。

得られた枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（５−５）アルカリセルラーゼ生産用ベクター（ｐＨＹ−Ｓ２３７）の構築
バチルス属細菌 ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号６）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号６の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表１０に示されるプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆ及びプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築した。

（５−６）アルカリセルラーゼ生産用ベクター（ｐＨＹ−Ｓ２３７）が導入された組換え枯草菌変異株の作製
上記（５−２）〜（５−４）で作製した枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ株、枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊株、枯草菌変異株ＭＯＡ１０５Ｔ＿ΔｋｉｎＡ株及び枯草菌変異株ＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株を宿主とした。
上記（５−５）で作製したアルカリセルラーゼ生産用ベクター（ｐＨＹ−Ｓ２３７）を用いて、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）により各宿主を形質転換した。テトラサイクリン−塩酸塩５０ｐｐｍを添加したＤＭ３プロトプラスト再生培地（０．５Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．３５％ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．１５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）、１％バクト寒天（ディフコ社製））上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。

（実施例６）セルラーゼ生産性評価
実施例５にて得られた形質転換体を、１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ）で、３０℃で１５時間振盪培養し、更にこの培養液０．６ｍＬを１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％ トリプトン、１％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム、７．５％ マルトース、７．５ｐｐｍ 硫酸マンガン４−５水和物）に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を算出した。
生産性の比較は、親株の生産性を１００％とする相対値により行った。この結果、親株としてＯＡ１０５Ｔ株を用いた場合、ａｂｒＢを恒常的に発現させ、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失したＯＡ１０５Ｔ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株では、高いアルカリセルラーゼの分泌生産量が確認された（表１１）。

＜アルカリセルラーゼの活性測定＞
セルラーゼ活性測定は、１／７．５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４ 和光純薬工業社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ添加して混合し、３０℃にて反応させた際に遊離するｐ−ニトロフェノールの量を、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量することにより行った。セルラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして定義した。

参考例 ａｂｒＢ遺伝子恒常発現の確認
ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異によりａｂｒＢ遺伝子が恒常的に発現されていることを確認するために、ｌａｃＺ遺伝子とその直前にプロモーター領域を導入した変異株を構築し、βガラクトシダーゼアッセイを行った。
（１−１）ｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株（ＯＣ−０１４株）の構築
まず、枯草菌ａｍｙＥ遺伝子領域にｌａｃＺ遺伝子の導入を行った。ｐＤＬ２プラスミド（Ｆｕｋｕｃｈｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，１４６：１５７３-１５８３）を用いて枯草菌野生株１６８株を形質転換し、ａｍｙＥ遺伝子領域にｌａｃＺ遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ枯草菌変異株ＯＣ−０１４株を構築した。

（１−２）野生型ａｂｒＢプロモーター領域又はａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域とｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株（ＯＡ−０２１株及びＯＡ−０２２株）の構築

枯草菌変異株ＯＣ−０１４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１２記載のプライマーｌａｃＺ−ＦＦ及びｌａｃＺ−ＦＲを用いて、ａｍｙＥ遺伝子下流領域を含むｌａｃＺ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表１２記載のプライマーｌａｃＺ−ＢＦ及びｌａｃＺ−ＢＲを用いて、ｌａｃＺ遺伝子のＳＤ配列を含むｌａｃＺ遺伝子中流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、枯草菌野生株１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１２記載のプライマーａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｆ及びａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｒを用いて、野生型ａｂｒＢプロモーター領域の断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＪＬ６２（ＬｅＤｅａｕｘ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：１６６−１７５）を鋳型とし、表１２記載のプライマーｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＦ及びｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）及び断片（Ｄ）を表１２記載のプライマーｌａｃＺ−ＦＦ及びｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＦを用いてＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、断片（Ｃ）及び断片（Ｂ）を表１２記載のプライマーａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｆ及びｌａｃＺ−ＢＲを用いてＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させた。最後に、断片（Ａ＋Ｄ）及び断片（Ｃ＋Ｂ）を表１２記載のプライマーｌａｃＺ−ＦＦ及びｌａｃＺ−ＢＲを用いてＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｄ＋Ｃ＋Ｂ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＯＣ−０１４株を形質転換し、クロラムフェニコール感受性且つスペクチノマイシン耐性の形質転換体を取得し、野生型ａｂｒＢプロモーター領域とｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株ＯＡ−０２１株を得た。

次に、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊＿Ｃｍ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１２記載のプライマーａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｆ及びａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｒを用いて、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域の断片（Ｅ）をＰＣＲにより増幅した。上記手法と同様にして、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｂ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＯＣ−０１４株を形質転換し、クロラムフェニコール感受性且つスペクチノマイシン耐性の形質転換体を取得し、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域とｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株ＯＡ−０２２株を得た。

得られたそれぞれの枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。

（１−３） βガラクトシダーゼアッセイ
（１−２）にて構築した枯草菌変異株ＯＡ−０２１株及び枯草菌変異株ＯＡ−０２２をスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に画線塗布し、得られたコロニーをＳ７（５０）培地（Ｊａａｃｋｓ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，１７１：４１２１−４１２９）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集菌し、得られた菌体を用いてβガラクトシダーの活性を測定した。

その結果、野生型ａｂｒＢプロモーター領域を有する枯草菌変異株ＯＡ−０２１株の場合、定常期に入ると転写抑制が認められるが、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域を有する枯草菌変異株ＯＡ−０２２株の場合には、定常期でも高い転写活性を示した（図４）。以上のことから、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異株では、ａｂｒＢ遺伝子が恒常的に発現していることが示唆された。

＜βガラクトシダーゼの活性測定＞
βガラクトシダーゼ活性測定は、集菌した菌体を１ｍＬのＺバッファー（６０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、４０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ及び１ｍＭ ＤＴＴ）にて懸濁し、得られたサンプル溶液１０μＬを０．６３ｍＬのＺバッファーと混合した。次いで、得られた混合溶液にＺバッファーに溶解したリゾチーム・ＤＮａｓｅＩ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム及び０．０５ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ）０．１６ｍＬを添加し、３７℃で５分間保温した。次いで、８μＬの１０％ Ｔｒｉｔｉｏｎ−Ｘ１００を加え攪拌し、氷上に静置した。調製した最終サンプル溶液を３０℃で３分間保温し、Ｚバッファーに溶解したＯＮＰＧ溶液（４．０ｍｇ／ｍＬ ｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＯＮＰＧ））０．２ｍＬを加え混合し、黄色く呈色するまで保温した。最後に０．４ｍＬのＮａ_２ＣＯ_３溶液を加え反応を停止させ、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）を測定し、以下の式（１）より算出される活性値を求めた。

式（１）
Miller unit = (1000×OD420nm) / (T× V ×OD600 unit of cell)

ＯＤ６００ ｕｎｉｔ ｏｆ ｃｅｌｌ：集菌時の濁度（ＯＤ６００ ｎｍ）
Ｔ：反応時間（ｍｉｎ）
Ｖ：活性測定に使用した培養液量（ｍＬ）

Claims (20)

1. 枯草菌変異株であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
   ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
2. ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域及びｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ-ｙｒａＫ）を欠失したゲノムを有する、請求項１記載の枯草菌変異株。
3. ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する、請求項１記載の枯草菌変異株。
4. ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することである、請求項１〜３のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
5. ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号５に示される塩基配列において、２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である、請求項１〜３のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
6. ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、配列番号５に示される塩基配列において７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、請求項５項記載の枯草菌変異株。
7. ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
   （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期および定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
8. ｋｉｎＡ遺伝子が、下記の（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
   （ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
9. 請求項１〜８のいずれか１項記載の枯草菌変異株において、目的遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
10. 目的遺伝子が、セルラーゼ遺伝子である請求項９記載の組換え枯草菌。
11. 目的遺伝子が、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子である請求項９記載の組換え枯草菌。
12. ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である請求項１１記載の組換え枯草菌。
13. 目的遺伝子が、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子である請求項９記載の組換え枯草菌。
14. ジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子が、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ又はそれに相当する遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ又はそれに相当する遺伝子である請求項１３記載の組換え枯草菌。
15. 枯草菌変異株の製造方法であって、
    ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、及びｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる工程を含む、方法。
16. 組換え枯草菌の製造方法であって、
    ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる工程、及び目的遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
17. 請求項９記載の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体から目的遺伝子産物を回収する工程を含む、目的遺伝子産物の製造方法。
18. 請求項１０記載の組換え枯草菌を培養し、培養物又は菌体からセルラーゼを回収する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
19. 請求項１１又は１２記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
20. 請求項１３又は１４記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からジピコリン酸を回収する工程を含む、ジピコリン酸の製造方法。