JPS6317687A - 抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）発明の目的 「産業上の利用分野」 本発明の枯草菌は農薬として有効な鱗翅目昆虫（ガやチ
ョウの類）の幼虫に対して極めて優れた殺虫効果を示す
結晶毒素を芽胞を形成せずに産生ずるため農薬製造工業
において非常に有効に利用されるものであり、ひいては
芽胞を形成しないということＫより安全な農薬として農
業分野における貢献度も極めて太きいものである。

「従来の技術Ｊ バチルス・チューリンゲンシスの生活環中、胞子形成期
中にこれと同調して形成される細胞内封入体は結晶毒素
と称され、多（の鱗翅目昆虫の幼虫に対して毒性を示す
ことから農薬として広く用いられている。結晶毒素を有
効成分とする微生物農薬の製造は、主としてバチルス・
チューリンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１株ＨＤ−１
）を培養し、その発酵産物である結晶毒素とこれに混在
せる生芽胞とを分離することなくそのまま製剤化するこ
とによりなされている。

「発明が解決しようとする問題Ｊ 微生物農薬の製造に広く用いられるバチルス・チューリ
ンゲンシスの産生する結晶毒素は、害虫のみならず蚕に
も強い毒性を示すことから、我国の様な養蚕国において
繁殖能力をもつ生菌や生芽胞を含む製剤を使用すること
はきわめて危険なことと考えられる。即ち、生菌や化学
薬品あるいは熱等に対して強い抵抗性を有する生芽胞を
含む製剤を散布した場合、それらが発芽・増殖して養蚕
に大きな被害をもたらすであろうことは容易に推測され
る。

さらに、バチルス・チーーリンゲンシスは人や家畜に対
して病原性を持つことが知られているバチルス・セレウ
、ｘ、　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）と病理
学的に同一の病原性を発揮することが明らかとされ（秋
山武久仙北里医学１４，２３６−２４７．１９８４．大
沢伸孝他北里医学１４゜３２０−３２９．１９８４）、
また、バチルス・チーーリンゲンシスの産生ずる溶血毒
は、バチルス・セレウスの産生する毒素と同一の性状を
示すこと、並びに、バチルス・チューリンゲンシスが何
らかの下痢原因毒素を産生する可能性も示唆されたこと
（本田武司他日本細菌学会誌４０，２４０．１９８５）
からも、生菌や生芽胞を含む形での本菌製剤の散布が人
畜に対する高い危険性を含んでいることが容易に推測で
きる、事実、生きた芽胞を含んだ本菌製剤が散布してい
る農夫の目に入って角膜潰瘍をもたらしたという報告も
ある（Ｓａｍｐｌｅｓ、Ｊ、Ｒｏａｎｄ　　Ｂｕｅｔｔ
ｎｅｒ、）ｊ＋、Ａｍ、Ｊ、Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、。

９５、　２５８−２６０．　１９８５）。

以上のことから判断される様Ｋ、バチルス・チューリン
ゲンシスの産生する結晶毒素に生菌あるいは生芽胞が混
在したまま製剤された農薬を自然界に散布することは養
蚕の上からも公衆衛生の面からみてもきわめて危険なこ
とといえるものである。

本発明者等は上記結晶毒素を含有する農薬の製造におい
て生菌や生芽胞を含まない製剤の方法について種々検討
してきたが、それを−歩進めて芽胞を生成せずに結晶毒
素を産生させる方法について鋭意検討を行った。

（ロ）発明の構成 「問題点を解決するだめの手段」 本発明者等は上記問題点の生ずることのない結晶毒素の
産生方法について種々検討し、バチルス・チューリンゲ
ンシスの結晶毒素遺伝子の導入された枯草菌が芽胞を形
成せずに結晶毒素を産生ずることを見出して本発明を完
成した。

さらに詳細に説明すれば、本発明等がバチルス・チュー
リンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素遺伝子
を枯草菌ベクター又は大腸菌プラスミドと枯草菌プラス
ミドのシャトルベクターに連結し結晶毒素遺伝子発現プ
ラスミドを作製し、それを枯草菌に導入したところ、安
定にプラスミドを保持する形質転換体が得られた。この
形質転換体を適当な培地に接種し、好気培養条件下で３
０〜３７℃の温度で培養したところ、この培養液は蚕に
対して強い殺虫活性を有しており、農薬原料として非常
に有効であることが判明したのみならず、この培養液中
にはおどろくべきこと罠は芽胞が殆んど含まれず、従来
の問題点を一挙に解決しうるものであることを本発明等
は見出し本発明を完成したのである。

すなわち、本発明はバチルス・チューリンゲンシスの結
晶毒素遺伝子の導入された抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌に
関するものである。

Ｏ枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）本
発明で結晶毒素遺伝子を導入すべき菌としられているが
、それは下記に示す論文等でも裏付けられるものである
。

党閥等（Ｍｉｔｓｕｏｋａ　Ｔ、他Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉ
ｄｔｉｎｆｏｒｍｉｅｒｔ　２／７３　２５．２３−４
１．１９７３）によると、種々の動物の糞中の枯草菌を
調べたところ、草食動物に多く雑食動物には中程度認め
られるか存在せず、肉食動物には全（存在しないことが
報告されている。また存在が認められる例でも餌料に混
入していた枯草菌由来であり、腸内に定着することはな
（、一過性であることが認められている。

さらに板目（遺伝子組換え実用化技術第−集フジテクノ
システム）は、枯草菌と分類学的に同じものと知られて
いる納豆菌を利用して作られる納豆による中毒が報告さ
れておらず、枯草菌が人畜に対して非病原性であるとし
ている。

０結晶毒素遺伝子発現プラスミド（ｐＢＴＫ−１）の作
製 結晶毒素遺伝子発現プラスミド（ｐＢＴＫ−１）は大腸
菌プラスミド（ｐＵｃ９）と枯草菌プラスミド（１）Ｕ
Ｂｌｌｏ）のシャトルベクターにバチルス・チューリン
ゲンシス・クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素遺伝子を連
結することにより作製することができ、その構造は第１
図に示されるものであった。

またプラスミドとしてはｐＵｃ９とｐＵＢｌｌｏに限定
されるものでな（、大腸菌プラスミドの場合ｐＢＲ３２
２等、枯草菌プラスミドの場合ｐＣ１９４等の利用も可
能であり、シャトルベクターを用いる必要もな（、枯草
菌ベクターを用いてもよい。

０培養 結晶毒素遺伝子を保持する形質転換体は、５〜１０μｇ
／ｌのカナマイシンを含む２　ＸＳＧ培地（Ｌｅｉｇｈ
ｔｏｎ、　Ｔ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｄｏｉ、　Ｒ，Ｈ，Ｊ
、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４６３１８９−３１９５．１９７１）等の
培地で３０〜６７℃の温度で好気培養条件下で培養され
る。

０毒素蛋白の産生 毒素蛋白の産生は、バチルス・チューリンゲンシス・ク
ルスタキＨＤ−１株と異なり、上記培養によって菌の増
殖が定常期に入った細胞中ですでになされていたが、第
２図に示されるように２４〜４８時間後に最大となった
。

「作用」 本発明者らは、バチルス・チューリンゲンシスの結晶毒
素を枯草菌を用いて産生させることに成功したがさらに
、発酵液中には本来枯草菌により形成されるべき芽胞が
ほとんど含ま−れていないことを見出した。

従って、バチルス・チューリンゲンシスの結晶毒素をコ
ードする結晶毒素遺伝子を尋人した枯草菌は、芽胞を生
成させずに結晶毒素を産生させうるという優れた作用を
有し、芽胞を含有しないきわめて安全な微生物農薬を提
供できるものである。

以下に詳細な実施例を示すが、本発明による方法は実施
例だけに限定するものではない。

〔実施例〕

１）バチルス・チューリンゲンシス結晶毒素遺伝子発現
ベクターの作製 ｃｒｙ−１−１は田村らが作製したプラスミドであり（
微工研菌寄第８４８２号）バチルス・チューリンゲンシ
ス結晶毒素遺伝子を大腸菌ベクターｐＵＣ９のＥｃｏＲ
Ｉ部位へ連結したものである。

ｃｒｙ−１−１を制限酵素ＢａｍＨＩで、６７℃、２時
間消化し、次いで、アルカリホスファターゼで６７℃、
１時間処理する。一方、枯草菌プラスミドｐＵ　Ｂ　１
１０　（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ、他Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏ１．１５４　３１Ｂ−３２９，１９７８）を制
限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、２時間消化する。

これらのｃｒｙ　−１−１８ＢｍＨＩ　消化物とｐ（Ｊ
Ｂｌ　１０　　ＢａｍＨＩ消化物を、Ｔ４リガーゼで４
°Ｃ１１５時間反応させて連結し、環状化した。これを
Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓらの定める方法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって大腸菌ＨＢ１０１を形質
転換した。形質転換体は４０μｙ／ｄのアンピシリンを
含むＬＢ−寒天培地（バクトドリプトン１０！ｉ、バク
トイ−ストエキストラクト５ｙ、塩化ナトリウム５ｙ、
寒天１５ｇ、蒸留水１℃）で選択した。得られた形質転
換体より公知の方法であるアルカリ−８ＤＳ法により、
プラスミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドをＢ
ａｍＨＩで消化し、ｐＵＢｌｌｏ　　に相当する４、５
ｋｂのＤＮＡ断片とｃｒｙ−１−１に相当する９、７ｋ
ｂのＤＮＡ断片を有する組換えプラスミドｐＢＴＫ−１
を得た（第１図）。

２）　　ｐＢ　Ｔ　Ｋ−１の枯草菌への導入大腸菌より
単離したｐＢＴＫ−１を用いてＣｈａｎｇ、　Ｓ、ａｎ
ｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、　（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、１６８，１１１−１１５．１９７９）の定
めるプロトプラスト法によって枯草菌ＰＳＬ１　（０ｓ
ｔｒｏｆｆ、Ｇ、Ｒ，ａｎｄ　Ｐｅｎｅ、　Ｊ、　Ｊ、
、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５６．　９３４−９３６．１９
８３）を形質転換した。

得られた形質転換体より１５個のコロニーを選出し大腸
菌の場合と同じアルカＩＪ−８ＤＳ法によりプラスミド
ＤＮＡを分離した。次に、これらのプラスミドを常法に
従いアガロースゲル電気泳動にかげ大腸菌より単離した
ｐＢＴＫ　　１と同じ泳動圧りを示すものを３個取得し
た。残りのプラスミドは枯草菌中で欠失を起こしプラス
ミドが小型化していた。さらにこの６つのプラスミドを
ＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＢｉｌｏに相当する４、５ｋ
ｂのＤＮＡ断片とｃｒｙ−１−ＩＫ相当する９、７ｋｂ
のＤＮＡ断片を有することを確認した。これらのｐＢＴ
Ｋ　１を安定に保持する３株の枯草菌組換え体のうち１
株をＩＡＡ−１（ＡＴＣＣ第６７１３６号）と命名した
。

３）ＩＡＡ−１によるバチルス・チューリンゲンシス結
晶毒素の生産 ＩＡＡ−１を５μｆｉ／ｒｕｔのカナマイシンを含むペ
ナッセイ培地（Ｄｉｆｃｏ製、　アンティバイオティッ
クメジウム３）に接種し、３７℃で１２〜１５時間振と
う培養する。この発酵液の内５−を５μ夕／１のカナマ
イシンを含む２×ＳＧ培地に接種し、３７℃にて振とう
培養した。

枯草菌中で結晶毒素遺伝子が発現していることの確認は
、培養菌体の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
、並びに、顕微鏡観察により確認した。即ち、６．８．
　１０．　１２．２４゜！ｔｏ、　　４８時間培養液各
１０１Ｒ１を遠心集菌し、２ｍｌのろＱｍＭ）リス塩酸
（ｐ）４８．０　）　−１Ｃ１ｍＭエチレンジアミン四
酢酸−５０ｍＭ塩化ナトリウム液に懸濁し、１１１ｇ／
ａ／になる様にリゾチームを加え、３７℃で２時間静置
した。次に、−８０℃と室温での凍結融解を４回くり返
ＵＲ−２０ＰＫて、３０秒５回超音波処理した。

メルカプトエタノールに懸濁し電気泳動試料とした。電
気泳動は５ｔｓポリアクリルアミドゲルに培養液０．１
１１１７に相当する試料をのせ行なった。

また、同時にバチルス・チューリンゲンシス・クルスタ
キＨＤ−１株より単離した結晶毒素蛋白を泳動した。

顕微鏡観察は、２４時間培養液について２０００倍の倍
率で行なった。

第２図より明らかな様に、結晶毒素遺伝子を導入した枯
草菌ＩＡＡ−１はバチルス・チェーリンゲンシス・クル
スタキ・ＨＤ−１株と同じ約１３０，０００の分子量の
蛋白即ち、結晶毒素蛋白を産生じていた。なお、この蛋
白はｐＵＢｌｌｏのみを保持する枯草菌には認められな
かった。また、結晶毒素蛋白はバチルス・チューリンゲ
ンシス・クルスタキＨＤ−１株と異なり枯草菌中では菌
の増殖が定常期に入った直後の細胞（ＴＯ）でもすでに
産生されていたが、培養後２４〜４８時間で最大量とな
った。

また、第６図より明らかな様に枯草菌でもノ（テルス・
チューリンゲンシス令りルスタキＨＤ−１と同じ両雄結
晶状蛋白質粒子が形成された。

４）生物試験 上記方法で得たＩＡＡ−１の４８時間培養液の原液並び
に希釈液（蒸留水にて希釈）０．５１Ｌｌを協同飼料社
製の人工飼料に混合後、９αφのシャーレに広げた。一
枚のシャーレにつき４令まで飼育した蚕幼虫１０頭を移
し、６７℃で７２２時間静置た後、シャーレ中の死虫数
を測定した。殺虫力の表記はノ・ワード・ダルメージら
がＪ、ｏｆ　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈｏ
ｌｏｇｙ　１８゜２４０．１９７１に述べた方法に従っ
た。

ＩＡＡ−１により産生された結晶毒素並びにバチルス・
チェーリンゲンシス・クルスタキＨＤ−ＩＫより産生さ
れた結晶毒素の殺虫活性は表１に示した。

表１ ことを利用して行なった。即ち、上記培養液の適当希釈
液を８０℃の温浴中にて３０分間靜装する。処理後冷却
して栄養寒天培地で生存細胞数を求める。

芽胞数測定の結果は表２に示した。

表　２ （ハ）発明の効果 本発明によれば、枯草菌を利用して芽胞を含まない結晶
毒素を製造することが可能であり、その結果、人畜に対
してきわめて安全で、かつ、蚕に対する影響の少ない微
生物農薬を提供でき、農薬工業及び一般農家に与える効
果は測り知れないものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、枯草菌中でバチルス・チューリンゲンシス・
クルスタキＨＤ−１株の結晶毒素を産生させるためのプ
ラスミドの構築方法を示す。図中の制限酵素作用部位は
、ＢがＢａｍＨＩ、ＥがＥｃｏＲＩを表わす。また、細
線はｐＵＣ９、白ぬき太線はｐＵＢ　１１０、黒太線は
バチルス・チューリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株
由来の結晶毒素遺伝子を含むＤＮＡ断片を示す。 第２図は、ＩＡＡ−１培養菌体抽出物の５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動像を表わす。 図中の番号は、１〜７までがＩＡＡ−１の各々６時間、
８時間、１０時間、１２時間、２４時間、３０時間及び
４８時間培養菌体抽出物の泳動像、８がバチルス・チュ
ーリンゲンシス・クルスタキＨＤ−１株より単離した結
晶毒素蛋白質の泳動像を表わす。また矢印は分子量１５
０，０００に相当する結晶毒素蛋白質を表わす。 第３図は、ＩＡＡ−１によって産生された結晶毒素の顕
微鏡写真を表わす。図中の矢印は結晶毒素を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、バチルス・チューリンゲンシス（￥Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓ￥￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥）の結晶毒素遺伝
   子の導入された抗昆虫蛋白毒素産生枯草菌。