JPS62294080A - 殺虫蛋白質産生枯草菌及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は遺伝子組換えの手法により造成された、病原性
および自然界での増殖能を有せず、高い殺虫活性を有す
る蛋白質を産生ずる枯草菌形質転換株とその菌体の製造
法に関する。

バチルス　チュリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ
ｕｒ−暉す士すュ鰭−１以後ＢＴと略す）の芽胞嚢中に
形成される結晶性殺虫蛍白質は鱗翅目昆虫に対して強力
な殺虫作用を有し、しかもヒトを含む動物および植物に
対して無害であることから、農園芸用殺虫剤として欧米
で広く用いられてきた。

しかし、殺虫蛋白質を有効成分とする殺虫剤（以後、Ｂ
Ｔ剤と称す）は、ＢＴの細胞や胞子を含むため、日本で
は殺虫剤の散布後にＢＴ菌が増殖し、養蚕に大きな被害
を与えることが懸念された。

この被害を防止するため、熱処理、化学薬品処理等によ
り、ＢＴ剤中の生細胞、胞子の殺菌が行われてきたが、
激しい段面条件を用いる必要があり、殺虫蛋白質の変性
による殺虫活性の低下がさけられず、また殺虫活性を保
持させるためには、加熱処理と化学薬品処理等の組み合
わせが必要となり、工業的に煩雑な処理工程のために製
造コストの上昇をきたした。

さらにＢＴ菌自身はヒトに対して病原性を有するバチル
ス　セレウスと極めて近縁であるといわれている（蛋白
質・核酸／酵素　２９巻４４４頁１９８４年）。

このような事情かられが国においては、ＢＴ菌そのもの
又はその製剤を殺虫蛍白質として用いることは好ましい
こととは考えられない。

しかるに近年、遺伝子組換の手法が発達し、所望の有用
な性質を有する微生物を育種することが可能となってき
た。

本発明者等は、先に述べたＢＴ殺虫蛋白質を含む殺虫剤
の種々の欠点を克服するために遺伝子組換えの手法によ
り殺虫蛋白質を産生ずる枯草菌菌株の造成を試み、後述
するように高い活性を有する殺虫性を有する枯草菌株を
造成し、本発明を完成した。

また、この形質転換株および親株であるＢＴソットー株
を培養して得た菌体を殺虫効果試験に供試した結果、該
形質転換株はＢＴ菌に比し優れた殺虫効果を示し、本発
明の有効性を立証した。

枯草菌は、古来、納豆の製造に用いられてきたことから
明らかなようにヒトに対する病原性がな（、アミノ酸、
核酸、酵素等の製造にも用いられてきたので工業用微生
物としての使用経験も長い。

また枯草菌は大腸菌についでその遺伝的性質が明らかに
され、種々の変異株も造成されている。

従って、ＢＴ調製剤問題とされた蚕に対する毒性や胞子
殺菌については、胞子欠損枯草菌や栄養要求性を有する
枯草菌を用いて殺虫蛋白質をつくらせることにより容易
に克服可能である。例えば、殺虫蛋白質を産生ずる胞子
欠損枯草菌は高熱で殺菌処理する必要がないので殺虫活
性の低下をまねくことはない。

また殺虫蛋白質を産生ずる栄養要求性枯草菌は殺菌処理
をしなくても、自然界には要求する栄養源が枯草菌に利
用し得る形態ではほとんど存在し得ないので、自然界に
散布しても増殖することは出来ず、速やかに死滅する。

従って本発明の成果は、今後の微生物殺虫剤の用途拡大
という面から極めて大きな意義を有する。

以下に本発明について詳細に説明する。

本発明で用いられるＢＴ菌の菌体内殺虫蛋白質遺伝子と
は、ＢＴ凹が産生ずる菌体内殺虫蛋白質のアミノ酸配列
をコードする領域とプロモーター領域から成る遺伝子で
あり、ＢＴ菌の種々の亜種由来の遺伝子が使用可能であ
る。

例エバ、バチルス　チュリンゲンシス　クルスターキー
（アメリカン　タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣ
Ｃと略す）保存番号３３６７９）　、バチルス　チュリ
ンゲンシス　ソフト−（ＡＴＣＣ１９２７０）、バチル
ス　チュリンゲンシス　アイザワイ（オハイオ大学　バ
チルス　ジエネテソク　ストックセンター（以後ＢＧＳ
Ｃと略す）保存番号４Ｊ１）等の菌体内殺虫蛋白質遺伝
子が挙げられる。

これらの菌体内殺虫蛋白質遺伝子を結合するベクターは
枯草菌で増殖可能なベクターであればいずれのものも使
用可能であるけれど、構造が良く知られ、広く用いられ
る等の理由によりプラスミドｐＵＢ１１０が使用に便利
である。

菌体内殺虫蛋白質遺伝子は適当な制限酵素で切断したベ
クターにＤＮＡ結合酵素を用いて結合される。この結合
方法は、通常の遺伝子組換えの方法で全く支障はない。

次に、得られた組換えＤＮＡ分子を枯草菌に導入して、
組換えプラスミドを含む枯草菌形質転換株を得る。

組換えＤＮＡ分子の枯草菌への導入は、通常、プロトプ
ラスト法（Ｃｈａｎｇ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ
、Ｎ、：　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１６８１１１（１９７８））　
、あるいはコンピテント細胞法（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐ
ｏｕｌｏｓ、Ｃ，、ａｎｄ　５ｐｉｚｉｚｅｎ。

Ｊ、　：Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、８１．７４１　（１９
６１））により行われる。

形質転換株の選択は、ベクターに含まれるマーカー（例
えば、抗生物質耐性等）により容易に実施可能である。

このようにして得られた形質転換株を微生物の培養に用
いられる通常の培地で培養することにより、殺虫蛍白質
を産生ずる枯草菌が容易に得られる。

組換えＤＮＡ分子を導入する枯草菌は使用目的に応じて
枯草菌の種々の変異株を選択することが出来る。例えば
自然界で増殖出来ず、速やかに死滅する枯草菌由来の殺
虫蛋白質から成る殺虫剤の製造には枯草菌の栄養要求性
変異株（ＡＴＣＣ３３６０８）、または胞子欠損株（Ｂ
ＧＳＣ１５１）または二つの性質を有する変異株（ＡＴ
ＣＣ３５１４８）等が用いられる。

これらの枯草菌変異株を用いることによれば、殺虫蛋白
質を含む菌体を加熱処理、化学薬品処理する必要がない
ので高い活性と安全性を有し、しかもコストの低い微生
物殺虫剤が得られる。

組換えＤＮＡ分子を含む形質転換株が殺虫蛋白質を産生
ずることは、後述するようにＢＴ菌由来の菌体内殺虫蛋
白質に対する抗体を用いた免疫二重拡散試験法により、
また鱗翅目昆虫の幼虫を用いた殺虫活性試験により明確
に示される。

特に注目すべき点は、遺伝子組換えの手法により造成さ
れた殺虫蛋白質を産生ずる枯草菌が、殺虫蛋白質遺伝子
が由来した親株のＢＴ菌よりも強い殺虫活性を示したこ
とである（第一〜三表）。

このことは本発明によって得られた殺虫蛋白質を産生ず
る枯草菌が殺虫剤の有効成分として極めて有用であるこ
とを示すものである。

以下に実施例と試験例を示す。

実施例１（バチルス・チュリンゲンシス・ソノトーの菌
体内殺虫蛋白質遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子の調製） バチルス・チュリンゲンシス・ソフト−（ＡＴＣＣ１９
２７０株）をペンアッセイブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）２
０１を用いて３０℃で１５時間培養した後、集面し、Ｈ
ａｎｓｅｎの方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３５
．２２７（１９７８））に従いプラスミドを調製した。

このプラスミド５０Ｋを制限酵素Ｐｓｔｌ（宝酒造製）
５０単位を用い３７℃で２時間インキエベートすること
により切断した。反応系の組成は１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭジチオスレイトールである。

本反応により切断されたＤＮＡ断片は、常法に従いフェ
ノール抽出およびエーテル抽出により精製し、エタノー
ル沈澱により回収した。

得られたＰｓｔ　Ｉ切断ＤＮＡ断片（供与ＤＮＡ断片）
は、次ぎに制限酵素Ｐｓｔｌで完全に切断した後、大腸
菌アルカリ性ホスファターゼで末端リン酸エステルを加
水分解したプラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１
７）に結合した。

結合にはＴ４リガーゼを用い反応には供与ＤＮＡ断片２
ＯＮ、ｐＢＲ３２２１０１１ｇを使用した。反応系の組
成はＴ４リガーゼ（宝酒造製）１０単位、６．６ｍＭ　
　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）　、６．６ｍＭ　
ＭｇＣ１ｚ　、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　
ＡＴＰである。反応は４℃で１５時間行った。

反応後、反応液から０．１ｐｇ　ＤＮＡに相当する量を
抜き取り、０．７％アガロース電気泳動を行った結果、
ベクターであるｐＢＲ３２２と供与ＤＮＡ断片が結合し
、組換体ＤＮＡ分子となっていることが認められた。

このようにして得られた組換体ＤＮＡ分子を大腸菌ＨＢ
　１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）にカルシウム処理コ
ンピテント細胞法（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、＋ａｎｄ　Ｈｉ
ｇａ＋Ａ＋：　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　５３１５９（１９７０））に従って導入し
た。

得られた形質転換株は全て、バチルス・チュリンゲンシ
ス　ソットーの殺虫蛋白質の抗体を用いたラジオイムノ
検定（Ｅｈｒｌｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、：　Ｃｅ１ｌ　１
３゜６８１　（１９７８）　）により選別し陽性となっ
た株のうち１株（＃８０１）を選び成書に記載される方
法（”Ｍｏ１ｅｃｕ−１ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　ｐ８
６．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏ−ｒａ　ｔｏｒｙ）に従いプラスミドを調製した
。

得られたプラスミドを制限酵素Ｐｓｔｌで切断した後、
０．７ｚアガロースゲル電気泳動で調べた結果、該プラ
スミド（ρ５Ｐ８０１と命名）はベクターであるｐＢＲ
３２２のＰｓｔＩの切断部位にサイズ約６．６にｂの供
与ＤＮＡ断片が挿入された組換体ＤＮＡ分子であること
が判明した。

プラスミドｐｓＰ８０１にはＨｐａ　ｌ切断部位が２ケ
所ある。そこで、ｐｓＰ８０１　Ｈｐａ　Ｉ分解物を得
た後、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを用いる方法でこれを再結
合し、殺虫蓋白質遺伝子を含むさらに小型の組換プラス
ミドを構築した。

再結合して作成したプラスミドは前述のカルシウム処理
コンピテント細胞法で大腸菌８８１０１株に導入し、得
られた形質転換株よりプラスミドを前述の常法により調
製したところｐｓＰ８０１由来のサイズ約５．６Ｋｂの
断片が挿入されたプラスミドｐＨＰ　１を得た。

このプラスミドｐＨＰ　１　１１００ｐを制限酵素Ｐｓ
ｔｌを用いて前述の反応条件で切断した後、０．７χア
ガロースゲル電気泳動により４０ｖ５時間泳動した。

泳動後、５．６Ｋｂ部分のゲルを切り出し、フェノール
抽出及びエーテル抽出により精製し、エタノール沈澱に
よりＤＮＡを回収した。

該回収ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　１００パに
溶解し、そのうちＤＮＡ０．１ｇ相当量を抜き取り、０
．７χアガロース電気泳動により、該回収ＤＮＡがサイ
ズ約５．６Ｋｂの断片として精製されたことを確認し、
供与ＤＮＡ断片として、以下の実験に供した。

実施例２（ベクター　プラスミドと供与ＤＮＡ断片の結
合および枯草菌への形質転換による栄養要求性形質転換
株の取得） 実施例１で得られた供与ＤＮＡ断片５０メを大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント１０単位を用
い、３０℃３０分の反応で平滑末端化した。

反応系の組成は０．１ｎＭ　ｄＮＴＰｓ　、ニックトラ
ンスレーション緩衝液（５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，２＝）、１０ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４．０．１ｍＭ
ジチオスレイトール、５　Ｈ／ｒａ　１　　ウシ血清ア
ルブミン）である。

上記反応による生成物は、フェノール抽出及びエーテル
抽出により精製し、エタノール沈澱により回収した。

該回収ＤＮＡ断片は、次ぎに制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで完
全に切断し、大腸面アルカリ性ホスファターゼで末端リ
ン酸エステルを加水分解したプラスミドｐＵＢ１１０（
ＡＴＣＣ３７０１５）ニＴ＊　ＤＮＡリガーゼを用いて
結合した。反応には回収ＤＮＡ　（供与ＤＮＡ断片）２
０超、ｐＵＢｌｌｏ　　１０肩を使用した。

得られた組換え体ＤＮＡ分子による形質転換は、Ｃｈａ
ｎｇ等のプロトプラスト法（Ｃｈａｎｇ、Ｓ、、ａｎｄ
　Ｃｏｈ−ｅｎ、Ｓ、Ｎ、：　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、　　１６８１１１（１９７８））に従って実施し
た。プロトプラストの再生培地には、カナマイシンを最
終濃度１５０ｐｇ／ｍｌとなるように加えた。クローニ
ングの宿主菌には栄養要求性枯草菌ＩＡ　５１０株（Ｂ
ＧＳＣ保存株）を用いた。

形質転換により得られたカナマイシン耐性株の全てより
プラスミドを調製した。

プラスミドの調製は、カナマイシン耐性株をペンアッセ
イ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）　２０ｍ１を用いて３７℃１
５時間培養後、集菌し、集菌菌体を５０ｍＭ　トリス−
塩酸緩衝？ｔ￥（ｐｌ！７．５）　、５ｎ＋Ｍ　ＥＤＴ
Ａ、　５０ｍＭ　ＮａＣ１で洗浄した後、アルカリ法（
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，、ａｎｄ　Ｐｏ１ｙ。

Ｊ、：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　７１５１
３（１９７９））に従って行った。

得られたプラスミドを制限酵素Ｂｃｌ　Ｉ、Ｃ１ａ　Ｉ
、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄｌＩ［、Ｋｐｎ　Ｉ　、　Ｐｖ
ｕ　Ｉ［、Ｓａｃ　ＩおよびＸｂａ　　Ｉをもちいて切
断し、供与ＤＮＡ１！７ｒ片の挿入の有無を調べた。

次ぎに供与ＤＮＡ断片が挿入されていることが確認され
たプラスミドを有する株の菌体内殺虫蛋白質の産生の有
無を免疫二重拡散試験法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ−ｏｎｙ＋
Ｏｅ、、ａｎｄ　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｌ、Ａ、”Ｈａｎｄ
　ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒ−ｉｍｅｎｔａｌ　１ｍ
ｍｕｎｏ１ｃｇｙ（ｅｄ、Ｗｅｉｒ、Ｐ、Ｍ、）ｐｌ（
１９７３））により調べた。

対象としてｐＵＢｌｌｏを存する宿主菌ＩＡ　５１０株
およびＤＮＡ供与株であるバチルス　チュリンゲンシス
ソットーを用いた。

培養には、枯草菌宿主株および形質転換株は胞子形成培
地（０，８％ニュートリエンドブロス（Ｄｉｆｃ。

社製）　、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１３，４ｍＭ　ＫＣＩ
、　０．０１ｍＭ　ＭｎＣ１ｚ、１０−ｂＭ　Ｆｅ５Ｏ
ａ　、１０−Ｍ　Ｃａ（ＮＯｚ）ｚ）を用い、バチルス
　チュリンゲンシス　ソフト−は　ＧＹＳ培地（０，２
χ（ＮＨ４）ｚｓＯｔ、０．２！　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔ
ｒａｃｔｓ　　Ｏ，０５％に！ＨＰＯ，，０，１χ　Ｇ
ｌｕｃｏｓｅ　、　０．０３２　ＭｇＳＯ４，０，００
８ＺＣａＣＩｚ　、０．００５χＭｎＳＯ４，ｐＨ７，
３）を用い、３０℃３日間の振とう培養を行った。

この時、枯草菌の胞子形成培地にはカナマイシンを最終
濃度５　ｐｇ　／　ｍ　１となるよう加えた。培養後、
それぞれの株の胞子形成を確認した後、遠心により集菌
し、集菌菌体をリゾチームによる溶菌およびＬＭ　Ｎａ
Ｃ１による洗浄を行い遠心し沈澱物を回収した。得られ
た沈澱物は１５ｍＭ　ＮａＯＨに懸濁し、２５℃、１０
時間インキュベートした後、遠心し胞子を除いた上清を
回収した。

６゛　得られた上清を供試サンプルとし、バチルスチュ
リンゲンシス　ソントーの凹体内殺虫蛋白質に対する抗
血清を用いて前述した方法により免疫二重拡散試験を行
った。

その結果、この枯草菌形質転換株はバチルスチュリンゲ
ンシス　ソフト−型の殺虫蛋白質を産生じていることが
明らかとなった。

また、この形質転換株を位相差電子顕微鏡で観察するこ
とにより結晶性蛋白質の存在が認められた。

以上の結果から栄養要求性枯草菌形質転換株はバチルス
　チュリンゲンシス　ソントーと同様の殺虫蛋白質を産
生ずることが認められた。そこでこの形質転換体をＦＩ
ＢＴＩと命名した。

実施例３（殺虫蛍白質産住枯草茫栄養要求性胞子欠損形
質転換株の取得） 実施例２で得られたＨＢＴ　１株よりプラスミド（ｐＨ
ＢＴｌと命名）を精製し枯草菌栄養要求性胞子欠損株Ｍ
Ｔ−ＳＰ　３１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０３４）への導
入を行った。

プラスミドｐＨＢ７１　５０μｇを用いて枯草菌−Ｔ−
５Ｐ　３１株の形質転換をコンピテント法（Ａｎａｇｎ
ｏｓ　ｔ−ｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃ，＋ａｎｄ　５ｐｉｚｉ
ｚｅｎ、Ｊ、；Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、　８１＋７４
１　（１９６１）に従って行なった。

プラスミド取込み後の培養液（１ｍ１）は５　ｐｇ　／
　ｍ　１カナマイシン含有ＴＢＡＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社
製）に１００　ｐｉずつブレーティングした。

得られたカナマイシン耐性株の全てよりプラスミドを調
製し、制限酵素Ｂｃｌ　Ｉ　、　　Ｃ１ａ　ｌ　５Ｅｃ
ｏＲＶ、旧ｎｄｌｌｌ、Ｋｐｎ　Ｉ、Ｐｖｕ　ＩＩ、Ｓ
ａｃ　ｒ　、、Ｘｂａ　Ｉを用いて切断し、電気泳動を
行い、同様に切断したプラスミドｐＨＢＴ　１の切断パ
ターンと比較した。

その結果ｐＨＢＴ　１と切断パターンが一致したプラス
ミドを有する株が得られた。

この形質転換株を前述の方法に従いバチルスチュリンゲ
ンシス　ソフト−の菌体内殺虫蛋白質の抗血清を用いた
免疫二重拡散試験に供し、陽性となった本株を５ＰＢ７
１と命名した。

この株を前述の胞子形成培地で培養し、得られた菌体を
実施例２、試験例１の方法により検定した結果、殺虫活
性を有する蛋白質を産生じているが、胞子形成能は欠損
していることを確認した。

試験例１（実施例２で得られた枯草菌形質転換株菌体の
殺虫活性） 実施例２と同様に枯草菌には胞子形成培地を、バチルス
　チュリンゲンシス　ソフト−にはＧＹＳ培地を用いて
　バチルス　ズブチリスＨＢＴ　１　、バ、チルス　チ
ュリンゲンシス　ソソトー、バチルス：゛ズブチリスｌ
Ａ３１０（ｐＵＢＩＩＯ）を３０℃３日間培養して遠心
により集菌し、得られた菌体を培地と同量の住理食塩水
に懸濁し洗浄後、再度遠心し、沈澱画分を凍結乾燥した
。

この凍結乾燥標品を供試サンプルとして、コナガ幼虫、
アオムシ幼虫、クマナギンウワバ幼虫に対する殺虫効果
を試験した。試験法は土山の方法（日本応用動物昆虫学
会誌　第２２巻第４号：２３４〜２３７頁（１９７８）
）によった。すなわち、供試サンプル２００ａ＋ｇを脱
イオン水１００ｍ１に浮遊させホモジナイズした後、脱
イオン水で希釈して所定濃度の菌液を調製した。この菌
液０゜４ｍｌを人工試料４ｇと均一に混合した後、検定
昆虫の幼虫に摂食させ死亡率を澗ぺた。

致死率ば、サン７／ｌ、（先爪４日弦の死王双に恭へ。

以上の結果から遺（！換えの手法によってえられた殺虫
蛋白質産生枯草菌は親株の　バチルス　チュリンゲンシ
ス　ソフト−より高い殺虫・活性を示したこと番よ明ら
かである。

【図面の簡単な説明】

図面は、実施例に示した枯草菌形質転換株を得る手順を
図示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス　チュリンゲンシスの菌体内殺虫蛋白質遺
   伝子を枯草菌で増殖可能なベクターに結合した後、枯草
   菌に導入して得られる殺虫蛋白質を産生する枯草菌形質
   転換株。 ２、殺虫蛋白質遺伝子がバチルス　チュリンゲンシス　
   ソットーの殺虫蛋白質遺伝子であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の枯草菌形質転換株。 ３、枯草菌が胞子欠損株であることを特徴とする特許請
   求の範囲第２項記載の枯草菌形質転換株。 ４、枯草菌が栄養要求性株であることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項記載の枯草菌形質転換株。 ５、枯草菌が栄養要求性胞子欠損株であることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項記載の枯草菌形質転換株。 ６、殺虫蛋白質遺伝子を枯草菌で増殖可能なベクターに
   結合した後、枯草菌に導入して得られた形質転換株を培
   養することを特徴とする殺虫蛋白質を産生する枯草菌菌
   体の製造法。