KR100443889B1

KR100443889B1 - 그람양성세균의 포자형성 조절방법

Info

Publication number: KR100443889B1
Application number: KR10-2001-0019174A
Authority: KR
Inventors: 박승환; 최수근; 김지현; 이현희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2004-08-09
Also published as: KR20020080066A

Abstract

본 발명은 포자를 형성하는 그람양성세균의 포자형성 조절방법에 관한 것으로, 구체적으로 염색체 상에서 서로 겹쳐져 있거나 50 염기 쌍 이내로 근접해 있으며 포자형성 조절기능을 가진 단백질을 암호화하는 유전자 쌍에 있어서 (1) 상기 2개의 유전자 중 한 개 또는 두 개 유전자의 발현수준을 조절하거나 (2) 상기 2개의 유전자 중 후방 유전자에 의해 생성되는 단백질의 전체 또는 일부분을 그람양성세균이 접종된 배지에 첨가하는 것을 포함하는 포자형성 조절방법에 관한 것이다. 본 발명의 그람양성세균의 포자형성 조절방법은 포자형성 시기에 생성되는 단백질의 발현수준 및 생산성을 효과적으로 조절하여 바실러스 츄린겐시스의 독소 단백질과 같은 목적 단백질의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

그람양성세균의 포자형성 조절방법{METHOD FOR REGULATION OF SPORULATION IN GRAM POSITIVE BACTERIA}

본 발명은 포자를 형성하는 그람양성세균의 포자형성 조절방법에 관한 것으로, 구체적으로 염색체 상에서 서로 겹쳐져 있거나 50 염기 쌍 이내로 근접해 있으며 포자형성 조절기능을 가진 단백질을 암호화하는 유전자 쌍에 있어서 (1) 상기 2개의 유전자 중 한 개 또는 두 개 유전자의 발현수준을 조절하거나 (2) 상기 2개의 유전자 중 후방 유전자에 의해 생성되는 단백질의 전체 또는 일부분을 그람양성세균이 접종된 배지에 첨가하는 것을 포함하는 포자형성 조절방법에 관한 것이다.

미생물 살충제로서 상업화가 되어 있는 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis)는 포자를 형성하는 그람 양성균으로 포자형성과 함께 특정 곤충에 치사효과가 있는 내독소를 생성한다. 상기 독소 단백질은 곤충의 중장 내에 있는 단백질 분해 효소에 의해 활성화된 후 특정한 수용체에 결합하여 살충작용을 일으키게 되는데, 바실러스 츄린겐시스에 의해 생성되는 독소 단백질은 이에 대한 특정 수용체를 가지고 있지 않은 인간이나 동·식물 및 어류 등에는 무해하여 자연 생태계에도 안전한 미래형 농약으로 알려져 있다 (Schnepf et al.,Microbial Mol. Biol., 62:775-806, 1998). 현재까지 많은 종류의 바실러스 츄린겐시스 균주가 토양, 죽은 곤충, 먼지, 식물 등에서 분리되었으며 이들 균주로부터 약 120여 종에 이르는 독소 단백질 유전자 (cry genes)가 분리되어 그 염기서열이 밝혀졌다 (Crickmore et al.,Microbial Mol. Biol. Rev., 29:477-508, 1998). 이들 독소 단백질은 나비목, 파리목, 딱정벌레목 등 다양한 곤충에 선택적 독성을 가지는 것으로 잘 알려져 있으며 이들의 아미노산 서열의 상동성에 따라 Cry1에서 Cry28의 Cry 단백질과 Cyt 단백질로 분류되어 있다.

바실러스 츄린겐시스는 세포의 성장이 끝난 후 적절한 시점에서 독소 단백질을 생산하는데, 바실러스 츄린겐시스가 독소 단백질을 생산하는 이러한 기작에 대하여 다양한 연구가 이루어져 왔다. 웡 등 (Wong et al.,J. Biol. Chem.,258:1960-1967, 1983)은 cry1A 유전자가 두 가지 프로모터, 즉 BtⅠ과 BtⅡ에 의해 대수 증식기 이후에 연속적으로 전사가 이루어진다는 사실을 밝혔으며, 브라운 (Brown)과 화이틀리 (Whiteley)는 상기 두 가지 프로모터가 바실러스 서브틸리스의 시그마펙타 E (σ^E) 및 시그마펙타 K (σ^K)와 상동성을 지닌 σ³⁵및 σ²⁸에 의해서 전사된다는 사실을 보고하였다 (Brown and Whiteley,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4166-4170, 1988). 전술한 바와 같이 cry3A 유전자를 제외한 대부분의 독소 단백질 유전자는 유사한 프로모터 구조를 가지고 있는데, 이러한 프로모터 구조는 포자형성 중기부터 말기까지 지속적으로 단백질을 발현할 수 있는 능력을 함유하고 있어 바실러스 츄린겐시스의 독소 단백질 생산은 포자형성 시기에 이루어지게 된다.

상기 서술한 바에 의하면 바실러스 츄린겐시스의 독소 단백질 생산은 시그마펙타 E 및 K에 의해 이루어지고 이 시그마펙타들은 바실러스 균주의 포자형성 기작에 필수적인 요소들로 작용한다 (Grossman,Annu. Rev. Genet., 29:477-508, 1995). 바실러스 츄린겐시스 균주를 일반적인 포자형성 배지에 배양하게 되면 일정한 비율의 균주만이 포자를 형성하고 나머지 균주들은 포자를 형성하지 못하는데, 이렇게 포자를 형성하지 못한 균주는 독소 단백질도 생산하지 못하게 된다. 더우기 산업배지를 이용하여 독소 단백질을 대량으로 생산하는 경우에는 이러한 포자 형성률이 더욱 감소하는 추세를 보이고 있다. 따라서, 독소 단백질의 생산은 포자형성 기작에 의존적이기 때문에 바실러스 츄린겐시스 균주 배양시 포자형성률이 높을수록 독소 단백질의 생산성이 높아진다는 것을 알 수 있다.

한편, 포자를 형성하는 그람양성세균 중 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis)는 전체 유전자의 염기서열이 알려져 있고 (Kunst et al.,Nature,390:249-256, 1997) 그의 포자형성 기작 또한 비교적 잘 알려져 있다 (Grossman,Annu. Rev. Genet., 29:477-508, 1995). 바실러스 서브틸러스의 포자형성은 그 신호가 인산기의 전달에 의해서 이루어지는데, 외부로부터 포자형성에 관련된 신호가 세포에 전해지면 히스티딘 키나아제 (histidine kinase)로 알려진 KinA, KinB 및 KinC 등이 먼저 자가인산화 (autophosphorylation) 된다. 그 후 이 인산기는 Spo0F 및 Spo0B를 거쳐서 Spo0A로 전해지는데 이 Spo0A가 인산화되어 포자형성 과정이 시작되는 것이다. 인산화된 Spo0A는 전사 조절인자 (transcription factor)로써 포자형성에 관련된 유전자의 프로모터에 결합하여 전사를 조절하게 되고 이때 조절받는 유전자 중에 RNA 중합효소 (RNA polymerase)의 일부분인 시그마펙타도 포함되어 있다. 포자형성 과정이 시작되면 4가지 시그마펙타, σ^F, σ^E, σ^G및 σ^K가 순차적으로 활성화되어 포자형성과 관련된 각종 유전자들을 발현시키는데, σ^E및 σ^K는 모세포 (mother cell)에서만 활성화가 되고 σ^F및 σ^G는 포어스포아 (forespore)에서만 활성화가 된다.

이러한 포자형성 과정의 시작을 조절하는 주요 조절인자로 Rap 포스파타아제 (Rap phosphatase)가 잘 알려져 있는데 바실러스 서브틸러스에는 RapA, RapB, RapC, RapD, RapE, RapF, RapG, RapH, RapI, RapJ 및 RapK 등이 동일한 그룹으로분류될 수 있다 (Perego,Trends Microbiol., 6:366-370, 1999). Rap 포스파타아제의 포자형성 조절기작을 RapA를 예를 들어 설명하면, RapA는 포자형성 초기에 일어나는 인산기의 전달과정을 저해하는 것으로 상기 서술된 Spo0F와 반응하여 Spo0F로부터 인산기를 떼어버리는 역할을 함으로써 포자형성을 저해한다. 이 RapA의 활성은 PhrA가 RapA와 결합하여 RapA의 탈인산화 활성을 저해함으로써 PhrA에 의해서 조절을 받게 된다. 결국 PhrA는 RapA의 활성을 억제하여 포자형성을 촉진하는 기능을 가지고 있다. 이러한 PhrA 유전자는 RapA 유전자의 C 말단에 존재하는데 두 유전자는 서로 겹쳐져 있어서 RapA가 발현되면 PhrA도 동시에 발현된다. 또한, 44개의 아미노산으로 구성된 PhrA는 N 말단에 분비신호 (secretion signal)를 가지고 있어서 C 말단의 19개 아미노산으로 구성된 단백질을 세포 외로 분비시키는데, 이렇게 세포 외로 분비된 단백질은 다시 5개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 분해된다. 이 작은 펩타이드가 포자형성 시기가 되면 세포 내로 다시 들어와 RapA와 결합함으로써 RapA의 활성을 방해하여 포자형성을 촉진하게 되는 것이다 (Perego, American Society for Microbiology, 1998).

이러한 Rap-Phr 조절 시스템은 바실러스 서브틸러스 이외에서는 아직 발견된 적이 없기 때문에 이러한 조절 시스템이 일반적이라고 예측하기는 어렵다. 뿐만 아니라 Rap 포스파타아제와 상동성이 있는 유전자가 클로스트리디움 (Chlostridium sp.)에서 발견되었으나 (Perego,Trends Microbiol., 6:366-370, 1998) 상기 유전자는 Rap 포스파타아제와 약 20% 정도의 낮은 상동성을 가지고 있기 때문에 이들 유전자가 서로 유사한 기능을 가지고 있으리라고 예측하는 것 역시 힘들다. 또한,바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 락토바실러스 (Lactobacillus) 및 코리네박테리움 에퀴 (Corynebacterium equii)에서도 RapA와 유사한 유전자가 있다는 보고가 있으나 (Reizer et al.,Microb. Comp. Genomics,2:103-111, 1997) 이들 역시 20% 내외의 낮은 상동성을 보이므로 동일한 작용기작을 가지고 있으리라고 추측하기 어려울 뿐 아니라 이들 유전자 뒤에 바실러스 서브틸리스의 Rap-Phr 조절 시스템과 같이 Phr과 유사한 유전자가 존재한다는 것 역시 보고된 바 없다. 상기 균주들 이외에 바실러스 츄린겐시스 균주에서도 바실러스 서브틸리스의 Rap-Phr 조절 시스템과 같은 포자형성 조절기작에 대해서 지금까지 알려진 바가 전혀 없다.

한편, 전술한 바에 의하면 바실러스 츄린겐시스 독소 단백질의 생산은 시그마펙타 E 및 K에 의존하여 포자형성 과정에 의존적이므로 포자형성 과정을 조절하여 포자 형성률을 향상시키면 독소 단백질의 생산성을 증대시킬 수 있을 것이다. 또한, 다른 포자형성 그람양성세균의 포자형성이 조절되면 포자형성 시기에 생성되는 단백질의 발현수준 및 생산성을 조절할 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 고유의 포자형성 조절기작을 가지는 바실러스 서브틸러스 이외에 바실러스 츄린겐시스를 포함한 포자형성 그람양성세균에서 포자형성 과정을 조절하는 유전자를 찾기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 바실러스 츄린겐시스 균주에서 포자형성을 조절하는 기능을 가진 신규한 유전자 쌍을 분리하였고 이들 유전자의 발현수준을 조절함으로써 포자 형성률을 증가 또는 감소시킬 수 있다는 사실과 상기 유전자 쌍 중 한 유전자 산물의 전체 또는 일부를 배양액 속에 첨가하여도 포자 형성률이 증가된다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 포자형성 시기에 생성되는 단백질의 발현수준 및 생산성을 효과적으로 조절하여 목적 단백질을 대량으로 생산하기 위하여, 바실러스 서브틸러스를 제외한 포자형성 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 포자형성 조절 유전자인 orf4의 구조를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 포자형성 조절 유전자인 orf50 및 orf4를 모두 포함하는 플라스미드의 제한효소 지도를 나타낸 것이고,

도 3a 및 3b는 본 발명의 포자형성 조절 유전자인 orf50 및 orf4의 유전자 구조 및 아미노산 서열을 이와 유사한 유전자들과 비교한 결과이고,

도 4는 본 발명에서 배지에 첨가된 Orf4의 일부가 바실러스 츄린겐시스의 포자형성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서브틸리스를 제외한 포자형성 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 유전자들 및 그의 산물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 포자형성 조절 유전자들을 포함하는 미생물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 포자형성 조절 유전자 및 그의 산물을 이용하여 바실러스 서브틸리스를 제외한 포자형성 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 바실러스 서브틸리스를 제외한 포자형성 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 유전자들 및 그의 산물을 제공한다.

본 발명은 바실러스 서브틸러스를 제외한 그람양성세균에서 포자형성을 조절하는 방법에 있어서 포자형성을 조절하는 기능을 가진 유전자의 발현을 조절함으로써 포자형성을 조절하여 포자형성 시기에 발현되는 유용 단백질의 생산성을 증가시키는 것을 목적으로 하고 있다. 이를 위하여, 본 발명자들은 바실러스 츄린겐시스로부터 포자형성을 조절하는 기능을 가진 신규한 유전자 쌍을 클로닝하고 이들의 발현수준을 조절함으로써 바실러스 츄린겐시스의 포자 형성률을 조절하는 방법을 구현하였다.

본 발명에서 바실러스 츄린겐시스로부터 분리된 포자형성 조절 유전자 쌍은 425개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 전방 유전자와 그 뒤에 43개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 후방 유전자가 겹쳐져 존재하고 있으며, 본 발명자들은 전방에 위치한 유전자를 orf50, 후방에 위치한 유전자를 orf4라 명명하였다. 염기서열 분석 결과에 따르면, orf50은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지고 있으며 이로부터 생산된 단백질의 추정 아미노산 서열은 서열번호 5로 기재된 서열로 구성되어 있고, orf4는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지고 있으며 이로부터 생산된 추정 아미노산 서열은 서열번호 6으로 기재된 서열로 구성되어 있다. 특히, orf4 조절 유전자는 바실러스 서브틸리스의 Rap-Phr 조절 시스템의 Phr 유전자와 같이 N 말단에 분비신호 서열을 가지고 있다.

본 발명에서 분리된 바실러스 츄린겐시스의 Orf50-Orf4 구조는 기존에 공지된 바실러스 서브틸러스의 Rap-Phr 조절 시스템과 유사한 구조를 보이는데 (Perego,Trends Microbiol., 6:366-370, 1998), 상기 Orf50은 바실러스 츄린겐시스의 포자형성을 억제하는 기능을 수행하며 Orf4는 포자형성을 촉진하는 기능을 수행한다. 또한, Orf4는 분비신호 즉, N 말단에 양이온성 아미노산과 소수성 도메인을 가지고 있어서 세포 외로 분비된다 (도 1 참조).

바실러스 서브틸러스에서 포자형성 기작을 조절하는 것으로 알려진 Rap 포스파타아제 및 Phr 단백질과 상동성을 가지고 rap-phr 유전자처럼 유전자 쌍이 서로 겹쳐져 있거나 가까이 위치하고 있는 구조를 가진 유전자는 바실러스 서브틸리스 이외의 포자형성 그람양성세균에서는 아직까지 발견된 적이 없다. 그러나, 바실러스 서브틸리스에서 알려진 포자형성 조절기작과 유사한 기작이 다른 포자형성 그람양성세균에도 존재하리라는 것은 예측가능한 일이 아니다.

본 발명자들은 플라스미드 orf50-orf4 조절 유전자 모두를 포함하는 pBP58이 형질전환된 바실러스 츄린겐시스를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 2월 9일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0951BP).

본 발명은 또한 상기 포자형성 조절 유전자 및 그의 산물을 이용하여 바실러스 서브틸리스를 제외한 포자형성 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스를 제외한 포자형성 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 방법은 염색체 상에서 서로 겹쳐져 있거나 혹은 50 염기 쌍 이내로 근접해 있는 특징을 가지고 있는 포자형성 조절기능을 가진 단백질을 코딩하는 유전자 쌍에 있어서,

1) 상기 2개의 유전자 중 한 개 또는 두 개 유전자의 발현수준을 조절하거나,

2) 상기 2개의 유전자 중 후방 유전자에 의해 생성되는 단백질의 전체 또는 일부분을 그람양성세균이 접종된 배지에 첨가하는 것을 포함한다.

상기 그람양성세균은 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 시리우스, 바실러스 안스라시스를 포함하는 바실러스 속이며, 더욱 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 근접한 2개의 유전자 중 후방 유전자가 코딩하는 단백질은 분비신호를 가지고 있어서 세포 외로 분비되는 특징을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 포자형성 조절방법에 있어서 상기 (1)에 의하여 포자형성이 조절되는 것은 포자형성이 촉진되거나 포자형성이 억제되는 것을 포함할 수 있는데, 상기 근접한 2개의 유전자 중 전방 유전자의 발현을 저해하거나 혹은 후방 유전자의 발현을 증가시킴으로써 포자형성을 촉진시킬 수 있다. 이때 후방 유전자의 발현이 증가하는 것은 세포 내 해당 유전자의 수를 증가시킴으로써 이루어질 수 있다. 반면, 상기 근접한 2개의 유전자 중 후방 유전자의 발현을 저해하거나 혹은 전방 유전자의 발현을 증가시킴으로써 포자형성이 억제될 수 있다. 이때 전방 유전자의 발현이 증가하는 것은 세포 내 해당 유전자의 수를 증가시킴으로써 이루어질 수 있다.

이러한 목적으로 사용될 수 있는 바람직한 유전자 쌍으로 본 발명에서 바실러스 츄린겐시스로부터 분리한 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 orf50 전방 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 orf4 후방 유전자가 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 방법에서 상기 (2)에 의해 근접한 2개의 유전자 중 후방 유전자에 의해 생성되는 단백질의 전체 또는 일부분을 그람양성세균이 접종된 배지에 첨가하는 경우, 첨가되는 단백질은 이를 암호화하는 유전자에 의해 적절한 숙주세포 내에서 발현된 것이나 세포 외로 분비된 것을 순수분리하여 또는 순수분리하지 않은 상태로도 사용할 수 있다. 이때 배지에 첨가되는 단백질은 화학적으로 합성된 것을 사용할 수도 있다. 이러한 목적으로 본 발명에서는 바실러스 츄린겐시스로부터 분리한 서열번호 3의 orf50 전방 유전자로부터 암호화되는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 전체 또는 그 일부분, 및 서열번호 4의 orf4 후방 유전자로부터 암호화되는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 전제 또는 그 일부분이 사용될 수 있다.

본 발명의 그람양성세균의 포자형성 조절방법은 포자형성 시기에 생성되는 단백질의 발현수준 및 생산성을 효과적으로 조절하여 바실러스 츄린겐시스의 독소 단백질과 같은 목적 단백질의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 포자형성 조절 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석

바실러스 서브틸리스를 제외한 그람양성세균에서 포자형성을 조절하는 기능을 가진 유전자의 발현을 조절함으로써 포자형성을 조절하는 방법을 개발하기 위하여, 먼저 바실러스 츄린겐시스 아종 피니티무스 (Bacillus thuringiensis subsp.finitimus) HD3 (이하 'Bt HD3'이라 약칭함)으로부터 포자형성 조절 유전자를 클로닝하였다. 본 발명에서 사용한 Bt HD3 균주는 BGSC (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio, USA)로부터 분양받았다.

우선, Bt HD3의 DNA를 칼만 등의 방법 (Kalman et al.,Appl. Environ. Microbiol., 59:1131-1137, 1993)으로 분리한 후 제한효소 HindIII로 절단하고 이를 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 후 아가로즈 겔 속에 있는 DNA를 호퍼사 (Hoefer Scientific Instruments, USA)의 트랜스백 (TransVac^TM)을 사용하여 양이온성 나일론 막 (positive charged nylon membrane, Boehringer Mannheim Biochemicals, Germany)으로 옮겼다. 상기 막에 포자형성 유전자의 인접부위에 특이적으로 결합하도록 고안된 탐침 (probe)을 이용하여 샘브룩 등이 기술한 방법 (Sambrook et al., Moluecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989)으로 서던 혼성화 반응 (Southern hybridization)을 실시하였다. 이때 탐침으로는 BGSC로부터 얻은 바실러스 츄린겐시스 아종 쿠스타키 HD1의 DNA를 상기와 동일한 방법으로 분리하여 이를 주형으로 하고 서열번호 1로 기재되는 nprA1 및 서열번호 2로 기재되는 nprA2를 시발체 (primer)로 하여 PCR DIG 라벨링 키트 (PCR DIG labelling kit, Boehringer Mannheim Biochemicals. Germany)를 이용하여 라벨링한 것을 사용하였다.

서던 혼성화 반응 결과, 3.4 kb의 HindIII 절편에서 시그널이 검출되었으며 상기 HindIII 절편을 DIG 핵산 검출 키트 (nucleic acid detection kit,Boehringer Mannheim Biochemicals, Germany)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 콜로니 혼성화 반응 (colony hybridization)을 수행하였다. 이를 위해 먼저 Bt HD3의 DNA를 제한효소 HindIII로 절단하고 2-5 kb의 DNA 절편을 샘브룩 등이 기술한 방법 (Sambrook et al.,Moluecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989)으로 아가로즈 겔로부터 분리하여 동일한 제한효소가 처리된 플라스미드 pUC19 (Gene, 33: 103-119, 1985)의 동일부위에 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 대장균에 도입한 후 콜로니 혼성화 반응으로 포자형성 조절 유전자로 여겨지는 3.4 kb HindIII DNA 단편을 포함한 콜로니를 분리하였고 이로부터 상기 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 pBP1을 분리하였다.

이와 같이 분리된 플라스미드 pBP1의 3.4 kb DNA 절편으로부터 Erase-a-Base^?System (Promega Co. USA)을 사용하여 다양한 길이의 DNA 절편을 얻은 후 딕 표지 DNA 시퀀싱 키트 (DIG taq DNA sequencing kit, Boehringer Mannheim Biochemicals, Germany)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 425개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 유전자와 그 뒤에 43개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 유전자가 겹쳐져 존재하고 있음을 확인하였으며 전방에 위치한 유전자를 orf50, 후방에 위치한 유전자를 orf4라 명명하였다. orf50은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지고 있으며 이로부터 생산된 단백질의 추정 아미노산 서열은 서열번호 5로 기재된 서열로 구성되어 있다. 또한, orf4는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지고 있으며 이로부터 생산된추정 아미노산 서열은 서열번호 6으로 기재된 서열로 구성되어 있다. 특히, orf4 조절 유전자는 바실러스 서브틸리스의 Rap-Phr 조절 시스템의 Phr 유전자와 같이 N 말단에 분비신호 서열을 가지고 있다.

<실시예 2> 바실러스 츄린겐시스의 포자형성에 대한 Orf50 및 Orf4의 영향

상기 실시예 1에서 밝혀진 바실러스 츄린겐시스의 Orf50-Orf4 구조는 바실러스 서브틸러스의 Rap-Phr 구조와 유사한데, RapA는 바실러스 서브틸러스의 포자형성을 억제하는 기능을 수행하며 PhrA은 포자형성을 촉진하는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Perego,Trends Microbiol., 6:366-370, 1998). 또한, PhrA는 분비신호 즉, N 말단에 양이온성 아미노산과 소수성 도메인을 가지고 있어서 세포 외로 분비되는데, 본 발명의 Orf4 역시 이와 유사한 구조를 가지고 있다 (도 1). 따라서, 상기 실시예 1의 Orf50 및 Orf4가 바실러스 츄린겐시스의 포자형성을 조절하는 조절 유전자일 것임을 입증하기 위하여 상기 유전자들 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 세가지 플라스미드 pBP58, pBP59 및 pBP60을 제작하였다.

<2-1> 플라스미드 pBP58, pBP59 및 pBP60의 제작

orf50과 orf4 유전자를 모두 포함하고 있는 플라스미드 pBP58, orf50 유전자만을 포함하고 있는 플라스미드 pBP59, orf4 유전자만을 포함하고 있는 플라스미드 pBP60를 하기와 같이 제작하였다 (도 2).

먼저 플라스미드 pBP58을 제작하기 위하여, 상기 실시예 1의 플라스미드 pBP1을 주형으로 하고 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 시발체 쌍 Btact9 및 Btpro1을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분동안 변성시킨 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반응을 수행하였다. 이로부터 얻은 PCR 산물을 pGemT-easy 벡터 (Promega)에 클로닝한 후 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 얻은 DNA 단편을 플라스미드 pHPS9 (Haima et al.,Gene, 29:477-508, 1990)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 플라스미드 pBP58을 완성하였다. 또한, orf50 유전자만을 포함하는 플라스미드는 상기 플라스미드 pBP58을 제한효소 ScaI과 SpeI으로 절단하여 얻은 DNA 단편에 클레나우 (Klenow) 효소를 처리하여 블런트 엔드 (blunt end)를 만든 후 다시 리가아제 (ligase)로 결합하여 플라스미드 pBP59를 완성하였다. 한편, orf4 유전자만을 포함하는 플라스미드는 상기 플라스미드 pBP58을 제한효소 SnaBI과 AviII로 절단한 후 리가아제 (ligase)로 결합하여 플라스미드 pBP60을 제작하였다.

상기에서 제작된 플라스미드들로 바실러스 츄린겐시스 균주를 형질전환시켰으며, 플라스미드 orf50-orf4 조절 유전자 모두를 포함하는 pBP58이 형질전환된 바실러스 츄린겐시스를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 2월 9일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0951BP).

<2-2> 포자 형성률 측정

orf50 및 orf4 조절 유전자 쌍이 바실러스 츄린겐시스의 포자형성을 조절함을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 제작된 세 가지 플라스미드들과 대조군 플라스미드 pHPS9를 최 등의 방법 (Choi, et al., Kor. J. Appl. Microbial. Biotechnol. 25: 566-570, 1997)으로 BGSC (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio, USA)로부터 분양받은 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스 (Bacillusthuringiensis subsp. israelensis) 4Q7 및 바실러스 츄린겐시스 아종 쿠스타키 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki) 4D11에 형질전환한 후, 신 등의 방법 (Shin, et al., J. Biochem. 126: 333-339, 1999)으로 포자 형성률을 조사하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

플라스미드	삽입된 유전자	바실러스 츄린겐시스 균주의 포자 형성률 (%)^a
플라스미드	삽입된 유전자	이스라엘렌시스	쿠스타키
pHPS9	대조군	60.7 (65.8)	76.0 (61.3)
pBP58	orf50-orf4	64.5 (54.4)	79.6 (56.0)
pBP59	orf50	5.3 (3.9)	3.0 (3.8)
pBP60	orf4	94.4 (89.3)	91.1 (79.3)
^a괄호 안은 독립적인 반복실험 결과임.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 먼저 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스의 경우에 orf50과 orf4 모두를 가지고 있는 플라스미드 pBP58로 형질전환된 세포의 포자 형성률은 대조군으로 사용한 플라스미드 pHPS9로 형질전환된 세포의 포자 형성률과 비슷한 64.5%였다. 그러나, orf50 조절 유전자만 가지고 있는 플라스미드 pBP59로 형질전환된 세포의 포자 형성률은 5.3%로서 대조군에 비하여 포자 형성률이 현저히 감소함을 관찰할 수 있는데, 이러한 결과는 orf50이 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스의 포자형성을 억제하는 기능을 가지고 있음을 나타내는 것이다. 반면, orf4 조절 유전자만 가지고 있는 플라스미드 pBP60으로 형질전환된 세포의 포자 형성률은 94.4%로서 대조군에 비하여 포자 형성률이 현저히 증가함을 관찰할 수 있는데, 이러한 결과는 orf4가 바실러스 츄린겐시스 아종 이스라엘렌시스의 포자형성을 촉진하는 기능을 가지고 있음을 나타내는 것이다. 바실러스 츄린겐시스 아종 쿠스타키의 경우에도 이와 유사한 결과를 확인하였다.

상기 결과로부터 바실러스 츄린겐시스 Orf50-Orf4의 조절 시스템에서 orf50의 발현수준을 낮추거나 orf4의 발현수준을 높임으로써 바실러스 츄린겐시스 균주의 포자형성을 촉진시킬 수 있으며 orf4의 발현수준을 높이는 것은 해당 유전자의 수를 증가시킴으로써 이루어질 수 있음을 알 수 있다. 또한, orf50의 발현수준을 높이거나 orf4의 발현수준을 낮춤으로써 바실러스 츄린겐시스 균주의 포자형성을 억제할 수 있는데, Orf50의 발현수준을 높이는 것은 해당유전자의 수를 증가시킴으로써 이루어질 수 있다.

아울러, 바실러스 츄린겐시스, 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus) 및 바실러스 안스라시스 (Bacillus anthrasis)는 서로 동일한 종으로 여겨질 만큼 유전적으로 유사한 종으로 알려져 있으므로 (Helgason, et al., Appl. Environ. Microbiol. 66: 2627-2630, 2000) 본 발명의 Orf50 및 Orf4가 바실러스 시리우스 및 바실러스 안스라시스의 포자형성을 조절할 수 있으리라는 것 역시 예측가능한 일이다.

한편, 바실러스 안스라시스 및 바실러스 스테아로써모필러스 (B. stearothermophilus) (Nishiya and Imanaka,J. Bacteriol., 172:4861-4869, 1990)에서도 본 발명의 Orf50-Orf4와 유사한 구조가 발견되는데, 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이 이들 단백질들은 orf50 및 orf4의 구조와 유사성을 가지고 있다. 도 3a에서 (a)는 바실러스 츄린겐시스, (b)는 락토바실러스 속, (c)는 바실러스 스테아로써모필러스, (d)는 바실러스 안스라시스를 나타내고, 도 3b에서 + 기호는 양이온성 아미노산을, 밑줄친 도메인은 소수성 도메인을 의미하며 별표는 시그널 펩티다아제 (signal peptidase)에 의해 절단되는 부위를 나타낸다. 따라서, 바실러스 츄린겐시스 이외에도 본 발명의 Orf50-Orf4와 유사한 기능을 가지고 있는 유전자 군이 널리 존재하며 이들의 발현조절을 통해 해당 균주의 포자형성을 조절할 수 있을 것으로 예상된다.

<실시예 3> Orf4를 이용한 바실러스 츄린겐시스의 포자형성 조절

Orf4는 분비신호 즉, N 말단에 양이온성 아미노산과 소수성 도메인을 가지고 있어서 세포 외로 분비되는 것으로 여겨진다 (도 1). 따라서, 상기 실시예 <2-1>에서 Orf4가 포자형성을 조절하는 것은 세포 외로 분비된 Orf4의 일부가 다시 세포 내로 들어와서 세포의 포자형성을 조절한 것으로 가정할 수 있다. 이러한 가능성을 확인하기 위하여, 화학적으로 합성된 Orf4의 일부를 바실러스 츄린겐시스 4Q7의 배양액에 첨가하여 포자형성이 조절되는지를 조사하였다.

먼저, 주식회사 펩트론 (한국)에 의뢰하여 서열번호 9로 기재되는 Orf4의 C 말단의 19개 아미노산 펩타이드를 화학적으로 합성하였다. 다음으로 orf50 유전자를 포함한 플라스미드 pBP59로 형질전환된 바실러스 츄린겐시스 4Q7 균주를 DS 배지 (Shaeffer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,54:704-711, 1965)에서 배양하면서 성장정지기에 들어선지 30분 후에 상기 펩타이드를 배지에 첨가하고 다시 48시간을 배양한 뒤 신 등의 방법 (Shin, et al., J. Biochem. 126: 333-339, 1999)으로 포자 형성률을 조사하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 Orf4를 첨가하지 않은 대조군에 비하여 Orf4가 첨가된 바실러스 츄린겐시스 균주의 포자 형성률이 점차적으로 증가하여 Orf4 펩타이드의 농도가 10 μM일 경우에 포자 형성률이 약 40% 정도 증가하였다. 따라서, Orf4를 배양액 중에 첨가하면 orf50 유전자를 포함한 바실러스 츄린겐시스 균주의 포자 형성률이 증가함을 확인하였다.

상기 결과로부터 본 발명의 Orf4 또는 그 일부분을 배양액에 첨가함으로써 바실러스 츄린겐시스의 포자 형성률을 조절할 수 있으며 이러한 Orf4 또는 그 일부분은 화학적으로 합성한 것을 사용할 수도 있고 이를 코딩하는 유전자에 의해 적절한 숙주세포 내에서 발현되어진 것이나 세포 외로 분비되어진 것을 순수분리하여 또는 순수분리하지 않은 상태로도 사용할 수 있다.

본 발명의 바실러스 서브틸러스를 제외한 포자를 형성하는 그람양성세균의 포자형성을 조절하는 방법은 그람양성세균의 포자형성을 조절함으로써 포자형성 시기에 생성되는 단백질의 발현수준 및 생산성을 조절하여 바실러스 츄린겐시스 독소 단백질과 같은 목적 단백질의 대량생산에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for regulation of sporulation in Gram positive bacteria <130> FPD/200103-0001 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer nprA1 <400> 1 ggagggacag gctctgcgtt t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer nprA2 <400> 2 agtacgcctt taccagttcc t 21 <210> 3 <211> 1278 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis orf50 <400> 3 atgcaacaaa cattagaaaa aataggcaaa caagtctttt ataaacggct acagcaaaaa 60 atgacacaag aagaattatg tcagggcatt tgttctgtct catacttaag taaaatcgaa 120 aatggaaaga tcgaagcatc agaagagatt ctacaattgc tctgcgcaag attagaaatt 180 gccgtgacgg atttgaggga tgtagaagaa gatgtgaagg ggaagctgga tgaatggtta 240 aatgcactaa tccgtttgga gaaggtgcaa gttgaacgta tctataatga attgcaagag 300 gatatgcaac acgttttaga ttttgaaatt ataaattatt ataaactact taatatacgt 360 tatttactga tgaaaaggga tttgccggta attgcagaag aattagagca gcttaagaag 420 gcatataaga aattctcgcc ttttcagaag ttgttgtata cgtatagtag aggattatta 480 tgctgtttac aatataagtg gaaacaggga ttaagttatt tattagagac agaggttatg 540 gcaaaagagt tagggtatca tgagacagga atttattata atattgctct tacttatagt 600 catttggaaa tccaacatct tacgttacac tttgcaaata ttgcactaga ggcatttaga 660 aatgagtata aatttcggaa cgtgataaac tgtcaaattc ttattgcatt aagttatgcg 720 gaacaagggc aatatgaaga agctctagaa atgtatgaga gcatactgcg ggaatcagag 780 gcttttgcgg ataaagacgt tctaaaagct attactttaa gtaatattgg gaatatatac 840 tataaaaaga aaaaatataa tcaagcaaaa gattattatt tagagagttt acaacttcaa 900 aaacaaatag atttaaatta tatagacaca ttatatgaaa tggcattagc ttgtattaaa 960 ttagatcagt ttgaagaagc aagagaatgg attgataaag gtattgttgc tgccaaacgt 1020 gaagagagat ttaatacaaa attatattta ctactcatgc ttcgaaataa gtattttgaa 1080 gaggcgcgag agtataagca atttttggaa ttagaagcta ttccgtttta taaatcagca 1140 ggtaataaga tagaactaaa gaaagtatat atggagcttg cggaatactt ttctaaatca 1200 ctgaactttg agcaaagtaa tcactactat aagctagtta ttgaaatgtt agaaagctat 1260 aaggaggatg aaaaatga 1278 <210> 4 <211> 129 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis orf4 <400> 4 atgaaaaaag cattagctgg aattttagca gttgcagtag tacttacaat tgtcggtgga 60 gtacagtata cgagtaaacc agatacttat ggattagatt ctagtgtgtc acaaactgta 120 aatgtgtaa 129 <210> 5 <211> 425 <212> PRT <213> Bacillus subtilis orf50 <400> 5 Met Gln Gln Thr Leu Glu Lys Ile Gly Lys Gln Val Phe Tyr Lys Arg 1 5 10 15 Leu Gln Gln Lys Met Thr Gln Glu Glu Leu Cys Gln Gly Ile Cys Ser 20 25 30 Val Ser Tyr Leu Ser Lys Ile Glu Asn Gly Lys Ile Glu Ala Ser Glu 35 40 45 Glu Ile Leu Gln Leu Leu Cys Ala Arg Leu Glu Ile Ala Val Thr Asp 50 55 60 Leu Arg Asp Val Glu Glu Asp Val Lys Gly Lys Leu Asp Glu Trp Leu 65 70 75 80 Asn Ala Leu Ile Arg Leu Glu Lys Val Gln Val Glu Arg Ile Tyr Asn 85 90 95 Glu Leu Gln Glu Asp Met Gln His Val Leu Asp Phe Glu Ile Ile Asn 100 105 110 Tyr Tyr Lys Leu Leu Asn Ile Arg Tyr Leu Leu Met Lys Arg Asp Leu 115 120 125 Pro Val Ile Ala Glu Glu Leu Glu Gln Leu Lys Lys Ala Tyr Lys Lys 130 135 140 Phe Ser Pro Phe Gln Lys Leu Leu Tyr Thr Tyr Ser Arg Gly Leu Leu 145 150 155 160 Cys Cys Leu Gln Tyr Lys Trp Lys Gln Gly Leu Ser Tyr Leu Leu Glu 165 170 175 Thr Glu Val Met Ala Lys Glu Leu Gly Tyr His Glu Thr Gly Ile Tyr 180 185 190 Tyr Asn Ile Ala Leu Thr Tyr Ser His Leu Glu Ile Gln His Leu Thr 195 200 205 Leu His Phe Ala Asn Ile Ala Leu Glu Ala Phe Arg Asn Glu Tyr Lys 210 215 220 Phe Arg Asn Val Ile Asn Cys Gln Ile Leu Ile Ala Leu Ser Tyr Ala 225 230 235 240 Glu Gln Gly Gln Tyr Glu Glu Ala Leu Glu Met Tyr Glu Ser Ile Leu 245 250 255 Arg Glu Ser Glu Ala Phe Ala Asp Lys Asp Val Leu Lys Ala Ile Thr 260 265 270 Leu Ser Asn Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Lys Lys Lys Lys Tyr Asn Gln 275 280 285 Ala Lys Asp Tyr Tyr Leu Glu Ser Leu Gln Leu Gln Lys Gln Ile Asp 290 295 300 Leu Asn Tyr Ile Asp Thr Leu Tyr Glu Met Ala Leu Ala Cys Ile Lys 305 310 315 320 Leu Asp Gln Phe Glu Glu Ala Arg Glu Trp Ile Asp Lys Gly Ile Val 325 330 335 Ala Ala Lys Arg Glu Glu Arg Phe Asn Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Leu 340 345 350 Met Leu Arg Asn Lys Tyr Phe Glu Glu Ala Arg Glu Tyr Lys Gln Phe 355 360 365 Leu Glu Leu Glu Ala Ile Pro Phe Tyr Lys Ser Ala Gly Asn Lys Ile 370 375 380 Glu Leu Lys Lys Val Tyr Met Glu Leu Ala Glu Tyr Phe Ser Lys Ser 385 390 395 400 Leu Asn Phe Glu Gln Ser Asn His Tyr Tyr Lys Leu Val Ile Glu Met 405 410 415 Leu Glu Ser Tyr Lys Glu Asp Glu Lys 420 425 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis orf4 <400> 6 Met Lys Lys Ala Leu Ala Gly Ile Leu Ala Val Ala Val Val Leu Thr 1 5 10 15 Ile Val Gly Gly Val Gln Tyr Thr Ser Lys Pro Asp Thr Tyr Gly Leu 20 25 30 Asp Ser Ser Val Ser Gln Thr Val Asn Val 35 40 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Btact9 <400> 7 gaagcttatg agaatggagg aggacaatg 29 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Btpro1 <400> 8 agagagcaca tttttagaat cc 22 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> 19 amino acids of Bacillus thuringiensis Orf4 C-terminal <400> 9 Thr Ser Lys Pro Asp Thr Tyr Gly Leu Asp Ser Ser Val Ser Gln Thr 1 5 10 15 Val Asn Val

Claims

염색체 상에서 서로 겹쳐져 있거나 또는 50 염기 쌍 이내로 근접해 있는 특징을 가지고 있는 포자형성 조절기능을 가진 단백질을 코딩하는 유전자쌍에 있어서, (1) 상기 유전자쌍 중 전방 유전자의 발현을 저해시키거나 후방 유전자의 발현을 증가시킴으로써; 전방 유전자의 발현을 저해시킴과 동시에 후방 유전자의 발현을 증가시킴으로써; 후방 유전자의 발현을 저해시키거나 전방 유전자의 발현을 증가시킴으로써; 또는 후방 유전자의 발현을 저해시킴과 동시에 전방 유전자의 발현을 증가시킴으로써 유전자의 발현수준을 조절하거나, (2) 상기 유전자쌍 중 후방 유전자에 의해 생성되는 단백질을 그람양성세균이 접종된 배지에 첨가하는 것을 포함하는, 바실러스 서브틸러스를 제외한 포자를 형성하는 그람양성세균의 포자형성 조절방법.
제 1항에 있어서,

그람양성세균은 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thuringiensis), 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus), 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus) 및 바실러스 안스라시스 (Bacillus anthrasis)로 구성된 바실러스속에서 선택되는 것을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
제 1 항에 있어서,

유전자쌍 중 후방 유전자에 의해 생성되는 단백질은 분비신호 (secretion signal)를 가지는 것을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
제 1항에 있어서,

포자형성의 조절이 포자형성의 촉진 또는 억제임을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
삭제
제 1 항에 있어서,

유전자의 발현을 증가시키는 것은 세포 내 해당 유전자의 수를 증가시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,

(2)에서 후방유전자에 의해 생성되는 단백질이 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 적절한 숙주세포를 이용함으로써 생산되거나 또는 화학적으로 합성된 것임을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
제 1 항에 있어서,

(2)에서 후방유전자에 의해 생성되는 단백질이 서열번호 6 또는 서열번호 9로 표시되는 단백질임을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
제 1항에 있어서,

유전자 쌍은 서열번호 3으로 기재되는 전방 유전자와 서열번호 4로 기재되는 후방 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
제 1항에 있어서,

유전자 쌍은 서열번호 5로 기재되는 단백질을 암호화하는 전방 유전자와 서열번호 6으로 기재되는 단백질을 암호화하는 후방 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 포자형성 조절방법.
서열번호 3으로 기재되는 포자형성 조절기능을 갖는 유전자.
제 13항의 유전자로부터 암호화되고 서열번호 5로 기재되는 포자형성 조절기능을 갖는 단백질.
서열번호 4로 기재되는 포자형성 조절기능을 갖는 유전자.
제 15 항의 유전자로부터 암호화되고 서열번호 6으로 기재되는 포자형성 조절기능을 갖는 단백질.
제 13 항의 유전자, 제 15 항의 유전자 또는 이들 유전자 모두를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 미생물.
제 17 항에 있어서,

제 13 항의 유전자 및 제 15 항의 유전자 모두를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 바실러스 츄린겐시스 BSK179(수탁번호 : KCTC 0951BP).