JPH04278092A - 組換えベクター、形質転換枯草菌及び結晶毒素蛋白の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、鱗翅目昆虫（ガやチョ
ウの類）の幼虫に対して、優れた殺虫効果を示し、農薬
として有効な結晶毒素蛋白を人畜に無害な枯草菌を宿主
として抗生物質を含有しない培養液で安定かつ大量生産
する方法に関するものであり、又、それに使用される組
換えベクター及び形質転換枯草菌に関するものであり、
農業、農薬業界で有効に利用されるものであり。

【０００２】

【従来の技術】バチルス・チューリンゲンシスの生活環
中、胞子形成期にこれと同調して形成される細胞内封入
体は、結晶毒素蛋白と称され、多くの鱗翅目昆虫の幼虫
に対して毒性を示すことから農薬として広く用いられて
いる。

【０００３】結晶毒素蛋白を有効成分とする微生物農薬
の製造方法としては、主としてバチルス・チューリンゲ
ンシス変種クルスタキＨＤ−１株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖａｒ．　ｋｕｒｓｔａｋ
ｉ　　ＨＤ−１）を培養し、その発酵産物である結晶毒
素蛋白を、これに混在する生胞子とを分離することなく
そのまま製剤化するという方法が採用されている。

【０００４】一方、近年の遺伝子組換え技術の進歩に伴
ない結晶毒素蛋白をコードする遺伝子をクローニングし
、大腸菌や枯草菌等の異種微生物に導入し結晶毒素蛋白
を生産させようとする試みがなされている。

【０００５】アナパージーシバクマー等（特開昭６２−
１８１７７７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６、１９
４、１９８６）はバチルス・チューリンゲンシス変種ク
ルスタキＨＤ−１−ダイペル（Ｄｉｐｅｌ）の結晶毒素
蛋白をコードする遺伝子を枯草菌において複製（増殖）
しうるプラスミドに連結し、枯草菌に導入することによ
りバイピラミダル（ｂｉｐｙｒａｍｉｄａｌ）構造の結
晶体を産生させたことを報告している。

【０００６】古屋等（特開昭６２−２９４０８０）は、
バチルス・チューリンゲンシス変種ソットーの結晶毒素
蛋白をコードする遺伝子を枯草菌で増殖可能なベクター
に連結した後、枯草菌に導入して結晶毒素蛋白を発現さ
せ、親株のバチルス・チューリンゲンシス変種ソットー
より高い殺虫活性を示すものを得たことを報告している
。

【０００７】さらに、ジョン・ダブリュ・クリスマン等
（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５
５、２３０２、１９８９）は、バチルス・チューリンゲ
ンシス・変種クルスタキの結晶毒素蛋白をコードする遺
伝子を枯草菌で複製可能な低コピープラスミドｐＳＹ２
２８に連結した後、枯草菌に導入して　ｓｐｏＶＧプロ
モーター制御下結晶毒素を全菌体蛋白の２５％以上生産
させることに成功した。

【０００８】しかしながら、枯草菌で生産された結晶毒
素蛋白の殺虫活性はバチルス・チューリンゲンシスで生
産されたそれに比べると低く、プラスミドの安定性も満
足いくものではなかった。

【０００９】更に、上に述べた結晶毒素蛋白の枯草菌で
の生産の例は、全て結晶毒素蛋白をコードする遺伝子を
枯草菌で複製可能なベクターに連結し枯草菌へ導入して
おり組換えプラスミドを有する枯草菌形質転換体は、抗
生物質を含有する培地で培養されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】枯草菌はヒトに対する
毒性がないこと、遺伝子性質が詳細に調べられ種々の変
異体が得られていること、及び、菌体外に蛋白質を効率
よく分泌することから遺伝子組換えの宿主として前記し
た様に広く利用されている。

【００１１】しかし、枯草菌を宿主とした遺伝子組換え
技術による物質生産は以下の点に大きな問題を有してい
る。

【００１２】即ち、以下の２つに分類される枯草菌内に
おけるプラスミドベクターの不安定性という大きな問題
がある（Ｓ．Ｂｒｏｎ　ａｎｄ　Ｅ．Ｌｕｘｅｎ　Ｐｌ
ａｓｍｉｄ　１４、２３５、１９８５）。

【００１３】まず、プラスミドの脱落の問題がある。こ
れは、プラスミドを保有する枯草菌が細胞分裂の際、娘
細胞に均等に分配されず、その結果プラスミドを保持し
ない細胞が出現する現象である。

【００１４】この問題は、フラスコレベルの実験では、
プラスミドに抗生物質耐性等のマーカー遺伝子を付与し
ておき、前記した様に培地へ抗生物質を添加することに
より、プラスミドの脱落株の増殖を制御するということ
で解決可能である。しかし、工業的レベルでは、高価な
抗生物質を大量に使用しなければならない点、及び、添
加した抗生物質が短時間に不活化される点から、上記方
法では満足し得ず、工業的な生産において、プラスミド
の脱落を防止するということは非常に重要な問題である
（小林猛、昭和６３年度農芸化学会講演要旨集、ｐ４４
９）。

【００１５】さらに、プラスミドの欠失の問題がある。 これはプラスミドを構成するＤＮＡ断片の一部が消失（
欠失）し、プラスミドが小型化する現象である。

【００１６】この問題を解決するためには、プラスミド
が欠失しにくい変異枯草菌が分離されているが、その性
能は充分なものといえる状態にはない。

【００１７】上記したプラスミドの不安定性は、枯草菌
を宿主にして遺伝子組換えにより有用物質を生産する際
の解決されねばならない大きな問題点である。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点の生ずることのない結晶毒素蛋白の生産方法について
種々検討し、バチルス・チューリンゲンシスの結晶毒素
蛋白をコードする遺伝子が染色体に組込まれた枯草菌が
、抗生物質を含有しない培地でも安定かつ大量に結晶毒
素蛋白を生産することを見出して本発明を完成したので
ある。

【００１９】さらに、上記の点を詳細に説明すれば、ま
ず本発明者らは、大腸菌プラスミドｐＵＣ１９、枯草菌
で発現されるクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子
（ＣＡＴ遺伝子）及び枯草菌の胞子形成に関与する　ｓ
ｐｏＶＧ遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡ断片より構
成される組込み発現プラスミドベクターを作成した。次
にこのプラスミドベクターに結晶毒素蛋白をコードする
遺伝子を連結し枯草菌に導入すると、染色体に当該遺伝
子が組込まれた形質転換体が得られることを見出した。 そして、この形質転換体をＣｍ　を含有するもしくはＣ
ｍ　を含有しない適当な培地に接種し、好気培養条件下
で３０〜３７℃の温度で培養したところ、この培養液は
コナガに対して親株のバチルス・チューリンゲンシスと
同等以上の殺虫活性を有しており、農薬原料として非常
に有効のみならず、Ｃｍ　を含有しない培養液でも該遺
伝子が安定に保持されることを見出し本発明を完成した
のである。

【００２０】即ち、本発明は、大腸菌で複製可能なベク
ターに枯草菌の　ｓｐｏＶＧ遺伝子プロモーターを含む
ＤＮＡ断片、枯草菌で発現し得る抗生物質耐性遺伝子及
び結晶毒素蛋白をコードする遺伝子が連結されているこ
とを特徴とする組換えベクター、該ベクターを染色体中
に有することを特徴とする形質転換枯草菌及び該形質転
換枯草菌を抗生物質非存在下に培養して結晶毒素蛋白を
産生させることを特徴とする結晶毒素蛋白の製造方法に
関するものである。

【００２１】○大腸菌で複製可能なベクター大腸菌で複
製可能なベクターとしては、大腸菌プラスミド　ｐＵＣ
１９、ｐＵＣ９、　ｐＢＲ３２２等の大腸菌で複製でき
るものを挙げることができ、大腸菌で複製できるもので
あれば特に限定されるものではない。

【００２２】○枯草菌で発現し得る抗生物質耐性遺伝子
枯草菌で発現し得る抗生物質耐性遺伝子（抗生物質耐性
マーカー）としては、ｐＺＬ２０７由来のＣｍ　耐性遺
伝子や　ｐＵＢ１１０由来のカナマイシン耐性遺伝子等
の枯草菌で発現できるものを挙げることができ、枯草菌
で発現できるものであれば特に限定されるものではない
。

【００２３】○結晶毒素遺伝子組込み発現プラスミドの
作成 結晶毒素遺伝子を枯草菌染色体へ組込み発現させるため
のプラスミド（　ｐＶＧ１）としては、例えば、大腸菌
プラスミド　ｐＵＣ１９、抗生物質耐性マーカーとして
　ｐＺＬ２０７由来のＣｍ　耐性遺伝子、及び、同じく
　ｐＺＬ２０７由来の枯草菌の胞子形成遺伝子である　
ｓｐｏＶＧのプロモーターを含有するＤＮＡ断片より構
成され、その構築方法と構造は図１に示されるものであ
る。

【００２４】結晶毒素遺伝子は　ｓｐｏＶＧ遺伝子プロ
モーターの下流に存在する唯一の制限酵素切断部位Ｂａ
ｍＨＩあるいはＰｓｔＩに連結することにより　ｓｐｏ
ＶＧプロモーターの制御下枯草菌中で発現させることが
できる。

【００２５】○結晶毒素蛋白をコードする遺伝子結晶毒
素蛋白をコードする遺伝子（結晶毒素遺伝子）としては
、　ｃｒｙ−１−１（微工研菌寄第８４８２号）並びに
、　ｃｒｙ−１−２（微工研菌寄第８４８３号）を挙げ
ることができ、これらは田村らが作成したプラスミドで
あり、バチルス・チューリンゲンシス変種ＨＤ−１の結
晶毒素遺伝子を各々大腸菌ベクター　ｐＵＣ９のＥｃｏ
ＲＩ部位並びに　ｐＵＣ９のＢａｍＨＩ部位へ連結した
ものであり、それらの制限酵素地図は図２に示すもので
ある。

【００２６】○培養 結晶毒素遺伝子が染色体に組込まれた形質転換枯草菌は
、抗生物質Ｃｍ　を含有しない２×ＳＧ培地（Ｌｅｉｇ
ｈｔｏｎ、Ｔ．Ｊ．ａｎｄ　Ｄｏｉ　、Ｒ．Ｈ．；Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６　　３１８９、１９７１）
、ＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ、イーストエキス
トラクト５ｇ、食塩５ｇ、蒸留水１Ｌ）、あるいは、コ
ーンスティープリカーを主成分とするＣＳＬ培地等の培
地で２５〜３７℃の温度で好気培養条件下で培養される
。

【００２７】○結晶毒素蛋白の生産 結晶毒素蛋白の発現は形質転換枯草菌の培養菌体抽出物
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動することに
より、分子量約１３万のバンドの有無により確認できる
。

【００２８】

【作用】本発明者らは、バチルス・チューリンゲンシス
変種クルスタキＨＤ−１の結晶毒素遺伝子を枯草菌染色
体に組込み、　ｓｐｏＶＧプロモーターにより結晶毒素
を大量に発現させることに成功したが、この方法によれ
ば抗生物質を含有しない培養液でも安定に結晶毒素を生
産でき、それは本発明者らが遺伝子組み換えにより製造
した組換えベクターによる独特の作用に基づくものであ
る。

【００２９】以下に詳細な実施例を示すが、本発明によ
る方法は実施例だけに限定されるものではない。

【００３０】

【実施例１】１）組込み発現ベクターの作成ＳａｌＩ−
ＳｍａＩアダプター（５’−ＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ−３
’；宝酒造）とｐＳｍａＩリンカー（５’ＣＣＣＧＧＧ
−３’；宝酒造）を等モルずつ混合し、７０℃１０分間
加熱したのち徐冷することによりアニールさせる。 この２本鎖オリゴヌクレオチドと、あらかじろ制限酵素
ＳｍａＩで完全に切断した大腸菌ベクターｐＵＣ１９を
ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用い連結し、
　ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に新たにＳａｌＩ突出末端
を導入した。

【００３１】一方、　ｐＺＬ２０７（米国、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより入手した）を
ＳａｌＩで完全に消化後、アガロースゲル電気泳動し、
Ｃｍ　耐性遺伝子及び　ｓｐｏＶＧ遺伝子プロモータを
組む枯草菌染色体ＤＮＡ断片より成る約３．１ｋｂ部分
のゲルを切り出し、ＤＮＡ　　ＰＲＥＰ（旭ガラス）を
用いＤＮＡを回収した。

【００３２】このＤＮＡ断片と上述のＳａｌＩ突出末端
を導入した　ｐＵＣ１９をＤＮＡライゲーションキット
を用い連結し、環状化した。これをマニアティスらの定
める方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって大腸菌ＨＢ１０１を形質
転換した。形質転換体は５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ−寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ、イー
ストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１
５ｇ、蒸留水１Ｌ）で選択した。得られた形質転換体よ
り公知の方法であるアルカリ−ＳＤＳ法により、プラス
ミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドをＳａｌＩ
で消化し、　ｐＵＣ１９に相当する約２．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片とＣｍ　耐性遺伝子及び　ｓｐｏＶＧプロモータ
ーを含む約３．１ｋｂのＤＮＡ断片を有するプラスミド
を選出した。次に、それらのプラスミドをＨｉｎｄＩＩ
Ｉで完全に消化し、約０．２ｋｂと約５．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片が生ずる組換えプラスミドを選出し、それらの中
の１つを　ｐＶＧ１と命名した。

【００３３】２）組込み発現ベクター　ｐＶＧ１への結
晶毒素遺伝子のクローニング ｃｒｙ−１−１及び　ｃｒｙ−１−２をＡｈａＩＩＩ　
で完全に消化し、アガロースゲル電気泳動した。泳動後
、各々約３．６ｋｂ及び３．５ｋｂ部分のゲルを切り出
し、ＤＮＡＰＲＥＰを用いＤＮＡを回収した。 一方、前記１）で作成した　ｐＶＧをＢａｍＨＩにより
完全に消化した後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒
造）を用い、ＢａｍＨＩ部位を平滑化した。

【００３４】このＢａｍＨＩ部位を平滑化した　ｐＶＧ
１と上述の　ｃｒｙ−１−１及び　ｃｒｙ−１−２のＡ
ｈａＩＩＩ　ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット
を用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得
られた形質転換体よりアルカリーＳＤＳ法によりプラス
ミドを単離し、　ｐＶＧ１と共にアガロースゲル電気泳
動に供した。アガロースゲル電気泳動の結果、　ｐＶＧ
１より分子量の大きなプラスミドを選択し、ＥｃｏＲＩ
で完全に消化することにより、クローン化された各結晶
毒素遺伝子の挿入方向を決定し、　ｓｐｏＶＧプロモー
ターの転写方向と順方向に各結晶毒素遺伝子が挿入され
た組換えプラスミドを得た。そして、　ｐＶＧ１に　ｃ
ｒｙ−１−１の結晶毒素遺伝子がクローン化された組換
え体を　ｐＶＧＣＲＹ１、同じく　ｃｒｙ−１−２の結
晶毒素遺伝子がクローン化された組換え体を　ｐＶＧＣ
ＲＹ２と命名した。なおこれらのプラスミドをそれぞれ
大腸菌に導入しＨＢ１０１（　ｐＶＧＣＲＹ１）、ＨＢ
１０１（　ｐＶＧＣＲＹ２）として工業技術院微生物工
業技術研究所に委託した（微工研百寄第１２０４７号及
び微工研菌寄第１２０４８号）。

【００３５】３）　ｐＶＧＣＲＹ１の枯草菌への導入と
染色体上での多コピー化 大腸菌より単離した　ｐＶＧＣＲＹ１を用いて「生物学
実験講座７原核生物学（丸善株式会社）」に記載されて
いる方法に従って枯草菌１Ａ９６（本菌株は米国オハイ
オ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔ
ｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　より入手した）を形質転換した
。形質転換体は５μｇ／ｍｌのＣｍ　を含むＬＢ−寒天
培地で選択した。得られた形質転換体より、サイトウ及
びミウラの定める方法（Ｓａｉｔｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｍｉ
ｕｒａ　Ｋ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａ
ｃｔａ　　７２、６１２、１９６３）に従がい染色体Ｄ
ＮＡを分離した。これらの染色体ＤＮＡ約１０μｇをＥ
ｃｏＲＩで完全に消化し、アガロースゲル電気泳動を行
った。泳動されたＤＮＡ断片をサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ　Ｅ．　Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　　９８、５
０３、１９７５）、枯草菌の形質転換に用いた　ｐＶＧ
ＣＲＹ１をニックトランスレーションキット（日本ジー
ン）を用い〔α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。

【００３６】この標識されたｐＧＣＲＹ１とニトロセル
ロース膜へ転写されたＤＮＡを「遺伝子操作実験マニュ
アル（高木康敬編、講談社サイエンティフィク）」の方
法に従がいハイブリダイズした。

【００３７】ハイブリダイゼーションの結果、　ｐＶＧ
ＣＲＹ１をＥｃｏＲＩで完全に消化した時に生ずるバン
ドと同じバンドが検出された形質転換体の１つを１Ａ９
６／　ｐＶＧＣＲＹ１−５と命名した。

【００３８】組込まれた　ｃｒｙ−１−１結晶毒素遺伝
子の多コピー化は以下の方法で行なった。１Ａ９６／　
ｐＶＧＣＲＹ１−５を５μｇ／ｍｌのＣｍ　を含むＬＢ
液体培地に接種し、３７℃で１０〜１２時間振とう培養
する。この培養液の内５０μＬを１０μｇ／ｍｌのＣｍ
　を含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１０〜１２時
間振とう培養する。以下同様にＣｍ　を２０μｇ／ｍｌ
、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ及び８０μｇ／ｍｌ
含むＬＢ液体培地で植継ぎを行ない、最終的に８０μｇ
／ｍｌのＣｍ　に耐性の菌株を得、１Ａ９６／　ｐＶＧ
ＣＲＹ１−８０（微工研菌寄第１２０４９号）と命名し
た。

【００３９】４）　ｐＶＧＣＲＹ２の枯草菌への導入と
染色体上での多コピー化 大腸菌より単離した　ｐＶＧＣＲＹ２を用いて、前記３
）の方法に従がい枯草菌１Ａ９６、胞子欠損株１Ｓ６８
（本菌株は米国オハイオ州立大学のＢａｃｉｌｌｕｓ　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　より入手
した）及びプロテアーゼ欠損株ＫＮ２（本菌株は東京大
学農学部魚住武司教授より入手した）を形質転換した。 形質転換体は、５μｇ／ｍｌのＣｍ　を含むＬＢ−寒天
培地で選択した。得られた形質転換体より上述のサイト
ウ及びミウラの方法により染色体ＤＮＡを分離し、Ｅｃ
ｏＲＩで完全に消化後、アガロースゲル電気泳動した。 そして上述の方法に従がいＥｃｏＲＩで消化されたＤＮ
Ａをニトロセルロース膜へ転写し、〔α−３２Ｐ］ｄＣ
ＴＰで標識した　ｐＶＧＣＲＹ２とハイブリダイズした
。

【００４０】ハイブリダイゼーションの結果、　ｐＶＧ
ＣＲＹ２をＥｃｏＲＩで消化した時に生ずるバンドと同
じバンドが検出された形質転換体を各々１Ａ９６／　ｐ
ＶＧＣＲＹ２−５、１Ｓ６８／　ｐＶＧＣＲＹ２−５及
びＫＮ２／　ｐＶＧＣＲＹ２−５と命名した。

【００４１】組込まれた　ｃｒｙ−１−２結晶毒素遺伝
子の多コピー化は、上述の方法と同様に各形質転換体を
５μｇ／ｍｌ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ／ｍｌ及
び６０μｇ／ｍｌのＣｍ　を含むＬＢ液体培地で順次植
継ぎを行ない、最終的に６０μｇ／ｍｌのＣｍ　に耐性
の菌株を得、各々１Ａ９６／　ｐＶＧＣＲＹ２−６０（
微工研菌寄第１２０５０号）、１Ｓ６８／　ｐＶＧＣＲ
Ｙ２−６０（微工研菌寄第１２０５２号）及びＫＮ２／
　ｐＶＧＣＲＹ２−６０（微工研菌寄第１２０５１号）
と命名した。

【００４２】５）枯草菌での各結晶毒素蛋白の生産各結
晶毒素遺伝子が組込まれた枯草菌形質転換体１Ａ９６／
　ｐＶＧＣＲＹ１−８０、１Ａ９６／　ｐＶＧＣＲＹ２
−６０、１Ｓ６８／　ｐＶＧＣＲＹ２−６０、及びＫＮ
２／　ｐＶＧＣＲＹ２−６０による結晶毒素蛋白の生産
の確認は以下の如く行った。

【００４３】１Ａ９６／　ｐＶＧＣＲＹ１−８０につい
ては８０μｇ／ｍｌのＣｍ　を含むＬＢ液体培地、その
他の形質転換体については６０μｇ／ｍｌのＣｍ　を含
むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２〜１５時間振と
う培養する。これらの培養液の内１ｍｌを５０ｍｌの２
×ＳＧ培地に接種し、３０℃〜３７℃にて振とう培養す
る。培養開始後、４、６、７、８、９、１０、１１、１
２、２４、３６、４８及び７２時間目に培養液１ｍｌを
分取し遠心集菌後、１　ｍＭエチレンジアミン四酢酸、
２　ｍＭフェニルメチルスルフォニルフロライド水溶液
に懸濁し、超音波処理を行い菌体を破さいした。この超
音波破さい物を等量の２×サンプル緩衝液（１２５　ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（　ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ
、１０％２−メルカプトエタノール、２０％グリセロー
ル、０．０２％ブロモフェノールブルー）と混合し、５
分間煮沸し、冷却後遠心した。この上清をレムリの方法
（Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｎａｔｕｒｅ、２２７
、６８０、１９７０）に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ゲルをクーマジー
ブリリアントブルーで染色し、余分な染色液を脱色した
後、蛋白バンドを観察した。

【００４４】その結果、全ての枯草菌形質転体は、培養
開始後、４時間目、つまり、対数増殖期から、結晶毒素
蛋白に相当する分子量約１３０ｋのバンドが検出され、
この蛋白バンドは、抗結晶毒素蛋白抗体と特異的に反応
した。結晶毒素蛋白の生産量をデンシトメーターで測定
したところ、各枯草菌形質転換体で全菌体蛋白の２０〜
２５％に相当する結晶毒素蛋白を生産していた。

【００４５】６）枯草菌染色体に組込まれた結晶毒素遺
伝子の安定性 枯草菌染色体に組込まれた結晶毒素遺伝子の安定性は、
形質転換枯草菌をＣｍを含有しないＬＢ液体培地で１２
時間毎に継代培養し、その培養菌体をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、結晶毒素蛋白に相当す
る分子量約１３０Ｋのバンドの濃淡で分子量を表わし遺
伝子の安定性の指標とした。

【００４６】その結果、Ｃｍ　を含まない培地で５回植
続ぎを重ねても結晶毒素蛋白の生産量にほとんど差はな
く、枯草菌染色体に組込まれた遺伝子は安定に保持され
ていることが示唆された。

【００４７】７）殺虫試験 枯草菌形質転換体１Ａ９６／　ｐＶＧＣＲＹ２−６０を
６０μｇ／ｍｌのＣｍ　を含むＬＢ液体培地で３７℃で
一夜培養した後その１ｍｌを５０ｍｌのＣＳＬ培地（２
％コーンスティーフリカー、１％グルコース）に接種し
３０℃で４８時間培養した。この培養液を０．０３％の
トリトン−Ｘ水溶液にて希釈し、各希釈液５０ｍｌにキ
ャベツ葉を浸した後風乾し、３令のコナガ幼虫１０匹に
摂食させ、死虫数を測定し、培養液のＬＣ５０値（ｐｐ
ｍ）を算出した。同様の実験をバチルス・チューリンゲ
ンシス変種クルスタキＨＤ−１でも行なった。

【００４８】その結果、１Ａ９６／　ｐＶＧＣＲＹ２−
６０培養液のＬＣ５０値は５２０ｐｐｍ　、バチルス・
チューリンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１のＬＣ５０
値は５５０ｐｐｍと算出され、枯草菌で親株であるバチ
ルス・チューリンゲンシス変種クルスタキＨＤ−１以上
の結晶毒素蛋白の生産に成功したことが明らかになった
。

【００４９】

【発明の効果】本発明によれば、人畜に無害な枯草菌に
より、抗生物質を用いずに、安定に且つ大量に、殺虫剤
として有効な結晶毒素蛋白を製造することができ、農薬
業界に与える効果は大なるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は組込み発現ベクター　ｐＶＧ１の構築方
法と構造を示す。図中の制限酵素作用部位は、ＢがＢａ
ｍＨＩ、ＥがＥｃｏＲＩ、ＰがＰｓｔＩ、ＳがＳａｌＩ
、Ｓｍ　がＳｍａＩを表わす。また、白ぬきにＣＡＴは
Ｃｍ　耐性遺伝子、斜線は　ｓｐｏＶＧプロモーター上
流の枯草菌染色体ＤＮＡ断片、黒い太線は　ｓｐｏＶＧ
プロモーターを示す。

【図２】図２は、　ｃｒｙ−１−１及び　ｃｒｙ−１−
２の制限酵素地図を示す。図中の制限酵素作用部位は、
ＡがＡｈａＩＩＩ　、ＥがＥｃｏＲＩ、ＫがＫｐｎＩを
表わす。また、細線は大腸菌プラスミドの　ｐＵＣ９、
白ぬき及びドットのボックスは各々　ｃｒｙ−１−１及
び　ｃｒｙ−１−２結晶毒素遺伝子を示す。

【図３】図３は、結晶毒素遺伝子組込み発現ベクターの
構築方法と構造を示す。図中の制限酵素作用部位は、Ｅ
がＥＣＯＲＩ、ＫがＫｐｎＩ、ＳがＳａｌＩを表わす。 また、細線は大腸菌プラスミド　ｐＣＵ１９、白ぬきに
ＣＡＴはＣｍ　耐性遺伝子、斜線はｓｐｏＶＧプロモー
ター上流の枯草菌染色体ＤＮＡ断片、黒い太線は　ｓｐ
ｏＶＧプロモーター、白ぬき及びドットのボックスは各
々　ｃｒｙ−１−１及び　ｃｒｙ−１−２結晶毒素遺伝
子を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　　　大腸菌で複製可能なベクターに枯
   草菌の　ｓｐｏＶＧ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ断
   片、枯草菌で発現し得る抗生物質耐性遺伝子及び結晶毒
   素蛋白をコードする遺伝子が連結されていることを特徴
   とする組換えベクター。
2. 【請求項２】　　　　請求項１記載の組換えベクターを
   染色体中に有することを特徴とする形質転換枯草菌。
3. 【請求項３】　　　　請求項２記載の形質転換枯草菌を
   抗生物質非存在下に培養して結晶毒素蛋白を産生させる
   ことを特徴とする結晶毒素蛋白の製造方法。