JPH01502475A - 農薬生産性内共生微生物およびその製法および使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １０４、前記農薬生産性細菌が抗菌剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１０５、前記抗菌剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス（鉦 匹匹■匹■）属の細菌である、請求の範囲第１０４項記載の安定な融合ハイブリ ッド細菌。

１０６、前記農薬生産性細菌が抗ウィルス剤を生産する能力を有している細菌で ある、請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１０７、前記農薬生産性細菌が殺虫剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリフト細菌。

１０８、前記殺虫剤を生産する能力を有している細菌がバシラス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）　ｉｉまたはストレプトマイセス（呂ユ且■匹■）属の細菌である、請求 の範囲第１０７項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１０９、前記農薬生産性細菌が線虫駆除剤を生産する能力を有している細菌であ る、請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１１０、前記線虫駆除剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス （鉦匹ｕ叩且旦）属の細菌である、請求の範囲第１０９項記載の安定な融合ハイ プリント細菌。

１１１、前記細菌がダニ駆除剤を生産する能力を有している、請求の範囲第１０ ０項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１１２、前記ダニ駆除剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス （鉦匹匹」践競）属の細菌である、請求の範囲第１１１項記載の安定な融合ハイ ブリッド細菌。

１１３、前記農薬生産性細菌が除草剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１１４、前記農薬生産性細菌が結合リン酸塩を可溶化する能力を有している細菌 である、請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１１５、前記農薬生産性細菌が植物成長ｔＪ４節物質を生産する能力を有してい る細菌である、請求の範囲第１０６項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１１６、前記農薬生産性細菌が芳香物質およびアンチフィーディング剤からなる 群より選ばれる化学物質を生産する能力を有している細菌である、請求の範囲第 １００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。

１１７、請求の範囲第７５項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１１８、請求の範囲第７７項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１１９、請求の範囲第８５項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２０、請求の範囲第８６項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイプリ ント微生物。

１２１、請求の範囲第８７項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２２、請求の範囲第８８項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２３、請求の範囲第８９項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２４、請求の範囲第９０項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２５、請求の範囲第９１項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２６、請求の範囲第９２項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２７、請求の範囲第９３項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。

１２８、作物植物種子、該種子上に被覆された生物分解性の栄養素担体材料、お よび農薬を生産することができかつ前記担体材料と関係して前記作物植物との非 病原性の内共生関係に入いることができる能力を有している安定なハイブリフト 微生物を含んでなる農業用種子製品。

１２９、農薬を生産することができかつ作物植物との非病原性の内共生関係に入 いることができる能力を有している安定なハイブリッド微生物によって感染され た前記作物植物の種子を含んでなる農業用製品。

１３０、水と、農薬を生産することができかつ植物宿主との非病原性の内共生関 係に入いることができる能力を有している安定なハイブリッド微生物との混合物 を含んでなる農業用土壌水剤。

１３１、農薬を生産することができかつ植物宿主中への注射に適した園芸学的に 許容され得る担体により植物宿主との非病原性の内共生関係に入いることができ る能力を有している安定なハイブリッド微生物を含んでなる農業用製品。

明　細　書 丑　′　およびその制゛および　２ 本願は、１９８３年４月１３日出願の出願番号第４８４．５６０号の一部継続出 願である１９８３年９月２０日出願の出願番号第５３４．０７１号の一部継続出 願である。

本発明は農薬生産性微生物、とりわけ農薬生産性細菌であって宿主植物との内共 生関係に入いることができそれによって植物の農薬的要件の一部または全部を提 供することができる細菌に関する。

１里■宣見 現代の営利的農業は、植物の能力を高めるため農薬の使用に依存しているところ が大きい、最も明白には、化学肥料、とりわけ固定窒素肥料は作物生産性におい て最も共通した限定栄養素でありそしてしばしば農家にとって最も高価な１回の みの投入である。植物の害虫を殺し、病気を阻止し、または植物の生育環境を改 善するために他の農薬が多大な支出で広（使用されている。さらに他の農薬を栽 培植物（ｇｒｏｗｉｎｇｐｌａｎｔｓ）または収穫作物（ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　 ｃｒｏｐｓ）に添加して、本来の性質を減少させもしくは高めまたは植物もしく は作物の外観もしくは怒覚的魅力を変えもしくは改善することができる。農薬は さらに、ホルモン等を含む天然または合成の植物成長調節物質を含んでいる。こ れらの化学物質は農業分野において通常の技術を有している人によく知られてお りそして本明細書中では一般に「農薬」という。

微生物、例えば、細菌、菌類および藻類は農薬の天然の供給源である０例えば、 マメ科植物、例えば、ダイズ、アルファルファおよびクローバ−は、リゾビウム （」江赳旦践搬−属の細菌との共生関係を通して自らの窒素固定要件の一部を得 ている。リゾビラ・ム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の特定の種はマメ科植物の根に感 染して、その細菌が酸素から保護されおよび炭水化物栄養素の提供を受ける結節 を形成する。この嫌気的プロセスにおいて、根粒菌は大気中の窒素を固定する。

この固定された窒素は植物による使用に対して利用可能である。

微生物は、人によって合成または製造されそして噴霧等によって野外（ｆｉｅｌ ｄｓ）、栽培植物または収穫作物上に通用される農薬の供給源にもなってきた。

殺菌性（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ）抗生物質、抗菌性（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａ ｌ）抗生物質および殺虫性抗生物質は、例えば、種々の細菌によって生産されて きた。殺菌性抗生物質は、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲネス（Ｓｔｒ ｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　ｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏ　ｅｎｅｓによって生産されるプ ラスチシジン５（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ　Ｓ）　、ストレプトマイセス・カス ガニニス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　ｈ朋ｖ二ｎ）によって生産されるカスガ マイシン（Ｋａｉｕｇａｍｙｃｉｎ）およびストレプトマイセス・カカオイ・変 種アソエンシス（釘…旺」匹匹ｃａｃａｏｉ　ｖａｒ。

ａｓｏｅｎｓ量Ｓ）によって生産されるポリオキシン（ｐｏｌｙｏｘｉｎ）を含 んでいる。抗菌性抗生物質は、ストレプトマイセス・クリセウス（鉦匹且」匹且 　７によって生産されるストレプトマイシンおよびストレプトマイセス・ビリジ ファシェンス（釘匹且組匹■　對１違■シ匹お狙搬−によって生産されるテトラ サイクリンを含んでいる。殺虫性抗生物質はストレプトマイセス・アウレウス（ Ｓｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　ａｕｒｅｕｓ）株Ｓ−３４６６によって生産される テトラナクチン（ｔｅｔｒａｎａｃｔｉｎ）およびバシラス・チュリンギエンシ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈμｍ邦違１厄」−によって生産されるベーターエキ ソトキシンおよびデルタ−エンドトキシンを含んでいる。参考までに特にここで 引用するアドバンシズ・イン・アグリカルチュラル・マイクロバイオロジーＡｄ ｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　）エ ヌ、ニス。

ニス、ラオ（Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｒａｏ）　＃ｘ集（１９８２年）における、ケー、ア イサワ（Ｋ、Ａｉｚａ＠ａ）、ｒマイクロバイアル・コントロール・オヴ・イン セクト・ペスツ０５ｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔＰ ｅｓｔｓ）　Ｊおよびティー、ミサト（τ、Ｍｉｓａｔｏ）およびケー・ヨネヤ マ（Ｋ、Ｙｏｎｅｙａｍａ）、「アグリカルチュラル・アンチバイオティクス（ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）Ｊを参照されたい。

同様に、微生物は除草剤用途に対する抗生物質の供給源になってきた０例えば、 ストレプトマイセス・クリセウス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｓ＋　ｃｅｓ　７によって生 産されるシクロへキシミドおよびストレプトマイセス・サガノエンシス（鎚匹匹 虹粒聾ＬＪ」ｌ四旦すュＶ−によって生産されるバービシジン（ｈｅｒｂｉｃｉ ｄｉｎ）　ＡおよびＢは除草剤活性を示す、参考までに特にここで引用する、ペ スティサイド・ケミストリー（Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ並」江豆戸、ジェイ、ミャモ ト（Ｊ、Ｍｉｙａｍｏｔｏ）およびピー・シー・カーネイ（Ｐ、Ｃ，Ｋｅａｒｎ ｅｙ）　ｔｉｌＡ　（１９８３年）におけるワイ、セキザワ（Ｙ、Ｓｅｋｉｚａ ｗａ）およびティー、タケマ・ン（丁、Ｔａｋｅｍａｔｓｕ）、「ハウ・トウ・ ディスカヴアー・二ニー・アンチバイオティクス・フォー・ハービサイダル・ユ ース（Ｈｏｗ　ｔｏ　ＤｉｓｃｏｖｅｒＮｅｗ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｆｏ ｒ　Ｈｅｒｂｉｃｉｄａｌ　Ｕｓｅ）　Ｊを参照されたい。

さらに、微生物は植物成長調節物質、例えば、種々のビタミン、オーキシン、サ イトカイニン、ジベレリン様物質および他の刺激または抑制物質を生産すること が知られている。

ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）は、以下で引用の「シード・アンド・ルート・バタテリ ゼイション（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ｒｏｏｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）　Ｊ に関する彼女の研究の中で、このような物質の生産がバシラス・メガテリウム■ 」■ｄおよびバシラス・サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）を含むアゾトバク タ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種に由来するとしている。

細菌は、多数の無を椎動物、例えば、植物病原性線虫に対して活性な剤を生産す ることが見い出された。これらの剤の１つはストレプトマイセス・アヴエルミチ リス套↓■且鰭ジ１朋−ａｖｅｒｓｉｉｔｉｌｉｓ）が生産するアヴエルメクチ ン（ａｖｅｒ＋＋＋ｅｃｔｉｎ）である、ストレプトマイセス・アベルミチリス （Ｓ、ａｖｅｒ＋＋＋１ｔｉｌｉｓ）およびそれが生産する駆虫性の化合物は、 特にここで参考までに引用する米国特許第４．３１０．５１９号、第４，４２９ ．０４２号および第４．４６９，６８２号に記載されている。

微生物は、ストレプトマイセス・ラベンジュラエ遷旦肚居−シエ張−１ａｖｅｎ ｄｕｌａｅ）から単離されたラウルシン（ｌａｕｒｕｓｉｎ）およびストレプト マイセス・ミハルエンシス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ凪ｈａｒ凹７から単離さ れたミハラマイシン（ｍｉｈａｒａｍｙｃｉｎ）を含む抗ウイルス性抗生物質を 生産することも見い出されている。参考までに特にここで引用する、アドバンシ ズ・イン・アプライド・マイクロバイオロジー」戯肚■ａ閃Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏ　）　、Ｖｏｌ、２１　（１９７７年）のティー、ミサト（Ｔ、Ｍｉｓａｔｏ ）、ケー、コ（Ｋ、Ｋｏ）およびアイ、ヤマグチ（１，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）　 ％　ｒユース・オヴ・アンチバイオティクス・アンド・イン・アグリカルチ＋− （Ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｌｎ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕ ｒｅ）　Ｊを参照されたい。

植物にとって他の方法では利用することができないリン酸塩を可溶し得る能力を 有している他のタイプの細菌が知られている。これらの細菌はバシラス（Ｂａｃ ｉ　］　１ｕｓ）属およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ■ｏｎａｓ）属に属す る細菌を含んでいる。細菌を種子または植物に接種することによってこれらの細 菌の前記能力を利用しようとする試みは矛盾する結果をもたらした。

参考までに特にここで引用する、アドバンシズ・イン・アグリカルチュラル・マ イクロバイオロジーＣＡｄｖａｎ組しｎ」紅辷ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏ　）、エフ。ニス、ニス、ラオ（Ｎ、Ｓ、Ｓ。

Ｒａｏ）編（１９８２年）におけるエフ。ニス、ニス、ラオ、「ホスフェート・ ソルビリゼイシッン・パイ・フィル・マイクロオーガニズムス（Ｐｈｏｓｐｈａ ｔｅ　５ｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　５ｏｉｌ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａ ｎｉｓｍｓ）　Ｊを参照されたい。

農薬生産性微生物と主要作物種、例えば、小麦およびトウモロコシとの間に共生 的結合がほとんどないことが、科学文献に記載されている。このような微生物種 と種々の作物との間の共生関係の発達は、農薬の人工合成および通用よりも多く の好都合を有していることができよう、このような結合の好都合は殺虫剤および 固定窒素肥料の領域においてとりわけ明白である。これに関しては、本発明の実 施を通して得ることができる好都合の例として以下で詳細に説明する。しかしな がら、殺虫剤および固定窒素肥料の細菌による生産に関して本明細書中に含まれ ている教示は、細菌または微生物によって生産される農薬、例えば、上述した農 薬に対して当業者によって推定することができるということを理解されたい。

本発明の特別な好都合は、所定の農薬が植物上に噴霧される場合にお１するよう な表面上への適用よりむしろ、農薬が植物体の全体または部分内に導入されるこ とにある０例えば、植物体上に噴霧されそして植物体内に浸透しない殺虫剤は、 植物体内に穴をあける虫に対しては効果がないかまたはごく限られた効力しかな いことがある。しかしながら、殺虫剤は、本発明の内共生ハイプリント微生物と して適用された場合に有効であることができる。

マメ科でない作物植物の固定窒素要件の小部分、例えば、１０〜２０％さえ提供 することができる主要作物種と窒素固定細菌との間の共生関係の発達は、窒素肥 料の生産のために現在消費されている化石燃料エネルギーに対して経済的に重要 な代用である光合成によって得られるエネルギーを生産し得るであろうと評価さ れている。現在、マメ科でない実用作用植物に対する固定窒素の主要な供給源は 人工の製品、例えば、無水アンモニア、無機窒素塩および合成有機化合物である 。

米国における窒素肥料の現在の年間消費量は１．２００万トンであると見積られ ている。このような窒素肥料の大部分は、大気中の窒素をアンモニアに転換する ためのエネルギー集中方法によって製造されている。

近年の窒素固定化研究の主たる方向は、植物体自体の遺伝学的変形による根粒菌 および他の窒素固定細菌由来の窒素固定遺伝子の単離、特徴づけ、形質転換およ び植物体内での発現に向けられてきた。この技術は、これから先１０〜１５年ま たはそれ以上であると見積られている窒素固定の遺伝学および生化学の完全な理 解を必要としている。参考までに特にここで引用する、アドバンシズ・イン・ア グリカルチュラル・マイクロバイオロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａ　ｒｉ ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−ｍ）　、エヌ、　ニス、　エフ！、、ラ オ（Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｒａｏ）　ｋＭ　（１９８２年）のジェイ、イー、ベリニガー （Ｊ、Ｅ、Ｂｅｒ３ｎｉｇｅｒ）　、ｒ　？イクロバイアル・ジェネテイクス・ アンド・バイオロジカル・ナイトロジェン・フィクセイション（Ｍｉｃｒｏｂｉ ａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆ ｉｘａｔｉｏｎ）１％およびジー・ピー・ロバーツ（Ｇ、Ｐ、Ｒｏｂｅｒｔｓ） 等、「ジエネテイクス・アンド・レギュレーシヨン・オヴ・ナイトロジェン・フ ィクセイション（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎ ｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ）Ｊ　、アン。

レグ。マイクロパイオル、　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、３５ ：２０７〜３５頁（１９８１年）を参照されたい。

大気中の窒素を固定化する能力を有する、リゾビウム皿−ム１状犯り一以外の他 のタイプの細菌が知られている。その例として、好気的に窒素を固定するアゾト バクタ−（Ａｚｏｔｏｂａ■肛り属、アゾモナス（Ａｚｏｍｏｎａｓ）属、デル キシア」肛旺紅属およびペイジェリンキア］囮ユ虹崩」住娃属に属する細菌１． およびリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ＋ｓ）のように嫌気的に窒素を固定するク レブシェラー儲１ゆ互口１υσ属に属する細菌を挙げることができる。

文献には、これらの細菌とマメ科でない植物との間の、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ ｂｉｕｍ）−マメ科植物関係と同様の共生関係を開発することに失敗した試みの 報告があふれている。

１９４０年代の初めには、例えば、ソ連および他の場所において、窒素固定細菌 を土壌接種材料として用いてマメ科でない作物植物の固定窒素要件の一部または 全部を提供することができるという提寡がなされた。実際に、このような接種に 関連した作物収率増大の要求が広まった。しかしながら、初期の収率結果の臨界 分析は、陽性の有意な効果が試験の約１／３のみで生じたことを示した。アゾト バクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）の種を用いた接種を含む、微生物接種に関 連した収率増加は、主として、根圏微生物集団の変化、接種材料による病気の抑 制、植物成長促進物質の生産および土壌リン酸塩の鉱化作用（ｓｉｎｅｒａｌｉ ｚａｔｉｏｎ）によるものであるということが後に確証された。マメ科でない植 物において窒素固定細菌との結合の共生関係を形成する能力は示されなかった。

参考までに特にここで引用する、エム、イー、ブラウン（Ｍ、Ｅ、Ｂｒｏｗｎ） 　、ｒシード・アンド・ルート・バタテリゼイシッン（Ｓｅｅｄ　ａｎｄ　Ｒｏ ｏｔＢａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）　Ｊ−、アニュアル・レヴユー・オヴ・フィ トパソロジー（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｂ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ 　）　、１２　：　１８１〜１９７頁（１９７４年）を参照されたい。

マメ科でない植物の！織培養細胞と好気的窒素固定細菌、例えば、アゾトバクタ −・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａ−ｎｄｉｉ）との間に 去Ｕ共生をつくり出すことができるという栽培植物との間の共生結合をつくり出 すことができる技術を提供しなかった。参考までに特にここで引用する、ビー、 ニス、カールソン（Ｐ、Ｓ、Ｃａｒｌｓｏｎ）等、「フォースト・アソシェーシ ッン・ビトウィーン・バイヤー・プラント・アンド・バクチリアル・セルズ・イ ンヴイトロ（Ｆｏｒｃｅｄ　ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＢｅｔｗｅｅｎ　Ｈ５ｇｈ ｅｒ　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ ｏ）Ｊ、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖｏｌ、２５２．　Ｎ１５４８２，３９ ３〜３９５頁（１９７４年）を参照されたい。

自らの窒素を固定することができる高等生物をつくるための別の努力は、例えば 、窒素固定能を有する下等型（ｌｏｗｅｒｆｏｒ■）の生物の同様な強制的結合 によって高等生物中に新たなオルガネラをつくるという試みを含んでいた。既知 のオルガネラの理論上の生物学的発達に平行するこのような努力は、例えば、植 物細胞による窒素固定グロエカプサ種、仔カ狙９Σ徂匠藍色植物の取込みを誘導 するバーボーン（Ｂｕｒｇｏｏｎ）およびボテイノ（Ｂｏｔｔｉｎｏ）の努力、 植物細胞中への窒素固定リゾビウム種（Ｒｂｉｚｏｂｉｕ園　ｍｌ細菌の取込み を誘導するディヴイ−（Ｄａｖｅｙ）およびクツキング（Ｃｏｃｋｉｎｇ）の努 力、および外画根性Ｎ類による窒素固定アゾトバクタ−・ビネランジ（Ａｚｏｔ ｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）細菌の取込みを誘導するギルス（Ｇ ｉｌｅｓ）の努力を含んでいた。ニー、シー、バーボーン（Ａ、Ｃ，Ｂｕｒｇｏ ｏｎ）およびビー、ジェイ、ボテイノ（Ｐ、Ｊ、Ｂｏｔｔｉｎｏ）　、ジャーナ ル。

オウ・ヒアディティー且匹■虹ｏｆ　Ｈｅ胆虹旦）、νｏ１．６７．２２３〜２ ２６頁（１９７２年）：エム、アール、ディヴイ−（Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ）およ びイー、シー、クツキング（Ｅ、Ｃ，Ｃｏｃｋｉｎｇ）　、ネイチャー（Ｎａ　 ｔｕｒｅ）、Ｖｏｌ、２３９．４５５〜４５６頁（１９７２年）；およびケー。

エル、ギルス（ｌ［、Ｌ、Ｇ１１ｅｓ）　、ｒザ・トランスファー・オヴ・ナイ トロジェンーフィキシング・アビリティ−・トウ・ノンレギュミナス・ブラソフ （Ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ＦｉｘｉｎｇＡｂｉｌ ｉｔｙ　ｔｏ　Ｎｏｎｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ　Ｐｌａｎｔｓ）Ｊ　、プラント・ セル・アンド・ティシュ−・カルチャー・プリンシプルズ・アンド・アプリケイ シッンズ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐ ｒ１ｎ−ｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ａ　１ｉｃａｔｉｏｎｓ）、ダブり二一、アー ル、シャープ（Ｗ、Ｒ，５ｈａｒｐ）等ｖ８（１９７９年）を参照されたい、バ ーボーンおよびボテイノの研究およびディヴイーおよびクツキングの研究のいず れも、窒素固定高等生物を生じさせるのには成功しなかった。ギルスの仕事が成 功していたとしても（このことは決定的には確証されていない）、せいぜい、主 要作物植物と内共生的に生活するよりむしろ森林種の根の外側でしか生活するこ とができない窒素を固定することができるオルガネジ様構造体を持ったＮ類を得 たであろうに過ぎない。

窒素固定細菌とマメ科でない植物との間に共生関係をつくろうという別の試みは 、土壌中で好気性の固定細菌、例えば、アゾトバクタ−・ビネランジ（Ａｚｏｔ ｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）と共生することができる一部の植物変 種を特定しようという努力下での植物ハイブリッドのスクリーニングおよび選択 を含んでいた。しかしながら、この努力によって得られたのは、商業的に有用で あるとは思われない根粒菌を接種したダイズ植物の活性の約０．５％に過ぎない 植物種の特定であった。参考までに特にここで引用する、ニス、ダブり二一、エ ラ（Ｓ、％ｌｉ。

Ｅｌａ）等、「スクリーニング・アンド・セレクシッン・オヴ・メイズ・トウ・ エンハンス・アソシエイティヴ・バクチリアル・ナトトロジエン・フィクセイシ ッン（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｉｚｅ　ｔ ｏ　Ｅｎｈａｎｃｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｖｅ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＮｉｔｒｏ ｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ）Ｊ　、プラント・フィシオル、　（ＰｌａｎｔＬ１ 慢１１工）フＯ：　１５６４〜１５６７頁（１９８２年）を参照されたい。

窒素固定細菌とマメ科でない植物との間に結合共生関係をつくろうとする多数の 失敗した試みによって遺伝学的操作および分析についての多゛数の技術が発達し た。これらの試みはまた、窒素固定細菌、例えば、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏ ｂａｃｔｅｒ）の遺伝学的性質（ｍａｋｅｕｐ）を比較的広範囲にわたって特徴 付けした１例えば、窒素固定遺伝子を欠いているアゾトバクタ−・ビネランジ（ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）の変異株は、リゾビウム（Ｒ ｈｉｚ旦垣！リ一種からの遺伝学的材料を導入することによって窒素固定能を有 する細菌に形質転換できることが見い出された。ジー、ビー、ロバーツ（Ｇ、Ｐ 、Ｒｏｂｅｒｔｓ）　、ｒジェネティクス・アンド・レギエレイシッン・オヴ・ ナイトロジェン。

フィクセイシッン（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ＮｉｔｒｏｇｅｎＦｉｘａｔｉｏｎ）　Ｊ　、アン、レグ。マイクロパイオル、 　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　、ｊ３：　２０７〜３５頁（１９８１年）を参照され たい。

さらに、細胞壁が除去された２種の異なる細胞を融合することによる程内の遺伝 子組換えのプロモーシランを含む、プロトプラスト融合の新技術は、基礎をなす 遺伝学の理解を必要としないで商業的目的に対して新規の株を製造するための潜 在的に魅力的な技術を提供するものとしてｖｌ識された。しかしながら、プロト プラスト融合がグラム陰性の窒素固定細菌の遺伝学的研究に対して使用できるか どうかについてはまだ結論が得られていないということが科学文献において認め られた。ジエイ、イー、ベリング＋　−（Ｊ、Ｅ、Ｂｅｒｉｎｇｅｒ）、「マイ クロバイアル・ジェネティクス・アンド・バイオロジカル・ナイトロジェン・フ ィクセイシッン（１’１ｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄ　Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ）　Ｊ　、アドバンシズ・ イン・アグリカルチュラル・マイクロバイオロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ａ 　ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｂｂｉｏｌｏ　）　、エフ。ニス、ニス、ラ オ（Ｎ、　Ｓ、Ｓ、Ｒａｏ）纒（１９８２年）１３を参照されたい。

実際に、本発明前の、窒素固定細菌のプロトプラスト融合に関連した実験は、窒 素固定細菌の融合生成物と高等植物との間の非病原性の内共生関係が形成され得 るという証拠を示すことができなかった０例えば、参考までに特にここで引用す る、アゾトバクタ−・クロオコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｃｈｒｏｏｃｏ ｃｃｕｍ）（Ｐｅｎ”　＋Ｎｉｆ”　）およびアグロバクテリウム°ツメファシ ェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｐｅｎ’　 、　Ｔｉ）の親株間のプロトプラスト融合を実施する試みが記載されている、デ ュ・キアンーヨウ（Ｄｕ　Ｑｉａｎ−ｙｏｕ）およびファン・チェシーイン（Ｆ ａｎ　Ｃｈｅｎｇ−ｙｉｎｇ）　％　ｒア・プレリミナリー・しボート・オン・ ディ・エスタブリッシェメント・オヴ・ナイトロジェン・フィクセイシッン・シ ステム・イン・ザ・クラウン・ゴール・オヴ・トマト・プラント（Ａ　Ｐｒｅｌ ｉｍｉｎａｒｙＲｅｐｏｒｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏ ｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｒｏ ｗｎ　Ｇａ１ｌ　ｏｆ　Ｔｏｖａａｔｏ　Ｐｌａｎｔ）Ｊ　、アクタ・ボンタニ カ・シニカＡｃｔａ　Ｂｏｎｔａｎｉｃａ　５ｉｎｉｃａ）　、ＶＯｌ、２３． 　Ｎ１６（１９８１年）。

窒素固定およびペニシリン耐性についてバイブリフトを選択し、次いでこのハイ ブリッドをトマト植物の茎に接種した。

この接種はクラウンゴールまたは腫瘍を生じた。このクラウンゴールまたは腫瘍 は、アセチレン還元試験により好気的条件下でニトロゲナーゼ活性を有している ことが見い出された。

この実験の融合生成物は宿主植物内に病原性応答を引き起こした。そしてこの融 合生成物は植物との内共生関係に入いり得ることは示されなかった。とりわけ、 腫瘍の近傍において生産される固定窒素が窒素供給源として植物によって利用さ れるかどうかは確認され得なかった。結局、観察されたニトロゲナーゼ活性が病 原性ハイブリッドの結果であるのかまたは混合接種材料中に残留していたアゾト バクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）のペニシリン耐性変異株の結果であるのか について結論を出すには至らなかった。さらに、今や、ハイブリッド中に腫瘍形 成性Ｔｉプラスミドを内在的に包含させることによってリゾビウム（Ｒｈｉｚｏ ｂｉｕｍ）−マメ科植物相互作用の小結節形成機構をまねようというデュ・キア ンーヨウ（Ｄｕ　Ｑｉａｎ−ｙｏｕ）等の試みは、植物宿主との十分な内共生関 係に入いることができるハイブリッド細菌をつくるために必要な方向とは正反応 の方向に向けられていたことが見い出された。

窒素固定リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種の範囲を広げようとする他の失敗 した試みは、アグロバクテリウム・ツメファシェンス］上工堕ｃｔｅｒｉｕｍ　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのＴｉプラスミドを選ばれたりゾビウム（Ｒｈｉ ｚｏｂｉｕｓ＋）株に挿入することを含んでいる。参考のために特にここで引用 する、ピー、ジエイ、ジェイ、ホーイカス（Ｐ、Ｊ、Ｊ、Ｈｏｏｙｋａｓｓ）等 、ジエイ、ジエン、マイクロパイ、（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ、）　、９８ ：４７７〜４８４頁（１９７７年）を参照されたい、これらの研究は、その植物 自体には天然に存在しない好気的条件でのみ窒素を固定する、マメ科でない双子 葉植物上にｍｍを形成することができるリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）株を もたらした。先行する段落で概説した評論もこの研究に適用する。

そのように行おうとする実質的な経済的動機にもかかわらず、従来技術では、マ メ科でない植物宿主との内共生関係に入いることができる窒素固定ハイブリッド 細菌または植物宿主との内共生関係に入いることができる他の農薬生産性バイブ リフト微生物のいかなるものをも製造することができなか植物宿主との内共生関 係に入いることができる農薬生産性バイブリフト微生物の製法であって、農薬生 産性微生物の遺伝学的材料および植物宿主を感染する植物感染性徴生物（本明細 中で以下「感染性微生物」ということがある）を結合してハイブリッド微生物を 形成する工程およびこれらのハイブリッド微生物から、農薬を生産することがで き、植物宿主との内共生関係に入いることができかつ植物宿主に病気の発現を引 き起こすことがないハイブリッド微生物を選択する工程を含んでなる製法が見い 出された。

ハイブリッド微生物は、農薬生産性微生物の遺伝学的材料の一部または全部およ び感染性微生物を結合することによって形成される。この遺伝学的材料は、種々 の技術、例えば、組換え体ＤＮＡ、組換え体ＲＮＡ、細胞融合、接合、プラスミ ドトランスファー、形質転換、トランスフェクションおよび微量注射法を使用す ることによって結合する。

本発明の方法から得られた微生物は、注射を含む種々の手段によって作物植物体 内に導入することができ、および該微生物を用いて農業種子を被覆し、農業種子 を感染し、土壌水剤（ｓｏｉｌ　ｄｒｅｎｃｈ）を調製する等が可能である０本 発明のハイブリッド微生物は、作物植物との結合後、植物の農薬の要求の一部ま たは全部を供給することができる０本発明に従ってハイブリッド細菌によって生 産され得る農薬は肥料、とりわけ、固定窒素肥料；抗菌剤（ａｎｔｉｂａｃｔｅ ｒｉａｌ　ａｇｅｎｔ）、抗ウィルス剤、殺菌剤（ａｎｔｉｆｕＢａｌ　ａｇｅ ｎｔ）、殺虫剤、線虫駆除剤、ダニ駆除剤および除草剤を含む抗生物質；植物ホ ルモンを含む植物成長調節物質等を含んでいる。

好ましい態様において、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法であって、（Ａ）任意の好都合な順序で、 （１）植物宿主を特定する工程、 （２）該植物宿主を感染する感染性微生物を特定する工程、（３）宿主を感染す る能力に加えて１種またはそれ以上の選択可能な特性を有する感染性微生物の変 異体を選択する工程、および （４）１種またはそれ以上の選択可能な特性を有する農薬生産性微生物を選択す る工程、 （Ｂ）前記感染性微生物と農薬生産性微生物との融合ハイブリッドを形成する工 程、 （Ｃ）先行して実施した工程または副工程の生成物から連続的におよび任意の好 都合な順序で、 （１）前記農薬生産性微生物の選択可能な特性の少なくとも１種および前記感染 性微生物の選択可能な特性の少なくとも１種の両方を有するハイブリッドを含ん でなるサブグループ、 （２）前記感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相（ｉｎｉｔｉａｌ 　ｐｈａｓｅ）の間に植物ｋＩｉｍと相互作用する仕方で植物組織と相互作用し 得る能力を示すハイブリッドを含んでなるサブグループ （３）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッドを含んで なるサブグループ、および（４）先に選択されていない場合には前記農薬を生産 する能力を有しているハイブリッドを含んでなるサブグループ を選択する工程、 （Ｄ）植物宿主の能力が該植物宿主への農薬または農薬生産性微生物の直接適用 によって改善され得るような条件下に前記植物宿主の能力を改善し得るハイブリ ッド微生物を工退（Ｃ）（１）〜（Ｃ）（４）の最後に実施した工程の生成物か ら選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生 産性ハイブリッド微生物を選択する工程 を含んでなる製法が見い出された。

とりわけ好ましい態様において、ハイブリッド微生物は、ゲノム染色に対して同 じ反応を示す感染性細菌のプロトプラストまたはスフ二ロプラスト融合によって 製造されたハイブリッド細菌である。所定のグラム陽性細菌、とりわけバシラス （Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏ＠ｃｅｓ）属 およびタラビバクター（Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ）　３１のものが、好ましいハ イブリッド細菌の形成にとりわけ有用である。

別の好ましい態様において、植物との内共生関係に入いることができる本発明の 農薬生産性ハイブリッド微生物は、（Ａ）任意の好都合な順序で、 （１）植物宿主を特定する工程、および（２）植物宿主を感染する感染性微生物 を特定する工程、（Ｂ）前記感染性微生物中に移すことができそして該微生物中 で複製することができるベクターを調製する工程、（Ｃ）前記感染性微生物によ る農薬の生産を指令することができる発現モジュールを調製する工程、（Ｄ）前 記ベクター中に発現モジュールを入れて、前記感染性微生物中に移すことができ そして該微生物中で複製することができる発現ベクターを造成する工程、該発現 ベクターは前記感染性微生物による農薬の生産を指令することができる、 （Ｅ）前記発現ベクターを用いて感染性微生物を形質転換してハイブリッド微生 物を製造する工程、（Ｆ）ハイブリッド微生物を選択する工程、（Ｇ）選択され たハイブリッド微生物から連続的におよび任意の好都合な順序で、 （１）前記感染性微生物が前記植物宿主中での感染の初期相の間に植物組織と相 互作用する仕方で植物組織と相互作用し得る能力を示すハイブリッド微生物を含 んでなるサブグループ、 （２）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッド微生物を 含んでなるサブグループ、および（３）先に選択されていない場合には前記農薬 を生産する能力を有しているハイブリッド微生物を含んでなるサブグループ を選択する工程、および （Ｈ）前記植物宿主の能力が該植物宿主への農薬または農薬生産性微生物の直接 通用によって改善され得るような条件下に前記植物宿主の能力を改善することが できるハイブリッド微生物を工程（Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）の最後に実施した 工程の生成物から選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いること ができる農薬生産性ハイブリッド微生物を選択する工程 を含んでなる製法によってつ（られる。

とりわけ好ましい態様において、植物宿主との内共生関係に入いることができる 農薬生産性ハイブリッド微生物は、（Ａ）任意の好都合な順序で （１）植物宿主を特定する工程、および（２）該植物宿主を感染する感染性微生 物を特定する工程、（Ｂ）＆ｌ込み配列を含んでおりかつ前記感染性微生物のゲ ノム中に組込み可能である組込みベクターを調製する工程、（Ｃ）前記感染性微 生物による農薬の生産を指令することができる発現モジュールを調製する工程、 （Ｄ）前記組込みベクターの組込み配列内に前記発現モジュールを入れ、それに よって前記感染性微生物のゲノム内に組込むことができおよび前記感染性微生物 による農薬の生産を指令することができる変形された組込みベクターを製造する 工程、 （Ｅ）前記変形された組込みベクターを用いて前記感染性微生物を形質転換して ハイブリッド微生物を製造する工程、（Ｆ）前記ハイブリッド微生物を選択する 工程、（Ｇ）選択されたハイブリッド微生物から連続的におよび任意の好都合な 順序で （１）前記感染性微生物が植物宿主内での感染の初期相の間に植物ＭＥ襟と相互 作用する仕方で植物組織と相互作用し得る能力を示すハイブリッド微生物を含ん でなるサブグループ、 （２）宿主への適用後、病気の発現を引き起こさな０ノ＼イブリフト微生物を含 んでなるサブグループ、および（３）先に選択されていない場合には、農薬を生 産する能力を有しているハイブリッド微生物を含んでなるサブグループ を選択する工程、および （Ｈ）前記植物宿主の能力が該植物宿主への農薬また番よ農薬生産性微生物の直 接適用によって改善され得るような条件下に植物宿主の能力を改善することがで きるノ＼イブ１ノンド微生物を工程（Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）の最後に実施し た工程の生成物から選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いるこ とができる農薬生産性ハイブリフト微生物を選択する工程 を含んでなる製法によってつくられる。

これらの方法は、単子葉植物および双子葉植物の１１ずれとも内共生関係に入い ることができる農薬生産性微生物を製造することができる。双子葉植物に対して は、アグロノくクチＩＪウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ）　ＭＥの細菌が好 ましく、アグロノイクテ・ＩＪウム・ツメファシェンス」■１ｈ」μｍ堕　還μ ７０）　株がとりわけ好ましい、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属の種、例え ば、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）も 用いることができ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ）属の種、例えば 、シュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｓｏｎａｓｓｏｌａｎａｃ ｅａｒｕ＋ｓ）およびシュードモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｈａｓ 　ｕムユ憇）　、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｓｏｎａｓ）属の種、例えば、サ ントモ。ナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　■肚虹１江１リー１ およびストレプトマイセス困旦肚旦肚組■　属の種−例えば、ストレプトマイセ ス・インホモエア（Ｓ、ｉｓ　ｏｍｏｅａも用いることができる。単子葉植物に 対しては、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属の種、例えば、エルウィニア・ス テヮルチ（Ｅｒｅｓｉｎｉａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）が好ましい感染性細菌であ る。ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｓｏｎａｓ）属の種、例えば、ザントモナス・ カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｓｏｎａｓ　」肚且江ｎ）　、アゾスビリラム旦 ｕ肚江旦１ｕｍ）属の種、例えば、アゾスピリラム・リポフィラム（Ａｚｏｓ　 １ｒｉｌｌｕｓ　ｌｉ匹ｆｅｒｕｓｎ）およびアゾスビリラム・ブラシレンス（ Ａｚｏｓ　１ｒｉｌｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）　、およびシュードモナス μ’５ｅｕｄｏ＊ｏｎａｓ−属の種、例えば、シュードモナス・シリンガニ（Ｐ ｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ｕ杜■匹）も有用であると考えられる。シェードモナス ・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏｎａｓ　鼓ム■憇）は、温帯性禾穀類および イネを含む禾穀類に適用可能な融合生成物の形成のための感染性細菌としてとり わけ有用であると考えられる。タラビバクター（Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ）種、 例えば、タラビバクター、キシリ旦■旦亘亜種キシリ立■Ｕおよびタラビバクタ ー、キシリ（Ｃ，ｘ■Ｕ亜種シノドンティスμ７は、イネ科植物、例えば、トウ モロコシおよびモロコシ等に対してとりわけ有用である。

好ましい農薬生産性微生物および化学物質および／または該微生物の代謝産物が 有用である適用を下記第１表に示し、そしてそこには固定窒素およびリン酸塩を 可溶化し得る化学物質を含む肥料、抗菌性化合物、殺菌性化合物、抗ウイルス性 化合物、殺虫剤、線虫駆除剤、ダニ駆除剤および除草剤を含む抗生物質、および 植物成長調節物質を生産する能力を有する生物が含まれている。さらに、芳香物 質（ｆｒａｇｒａｎｃｅ）およびアンチフィーディング（ａｎｔｉｆｅｅｄｉｎ ｇ）剤等を含む上記定義した他の農薬を生産する有用な生物を選択しまたは変形 することができる。

本発明の方法により、１種またはそれ以上の農薬を生産しかつ植物宿主との内共 生関係に入いることができる能力を育する新規で安定なハイブリッド微生物が得 られる０本発明の窒素固定ハイブリッド細菌が例えば低固定窒素条件下で生育す るマメ科でない作物植物の収率を１０〜１８０％の量まで向上感染性ｌＩＩ菌の ハイブリッドと植物宿主との内共生関係の間に該ハイブリッドによって生産され た固定窒素によるものと思われる。

本発明の追加の目的および好都合は、以下の記載において部分的に示され、そし てその記載からある程度明らかとなるであろうし、または本発明の実施によつて 知ることができる。

この目的および好都合は、とりわけ請求の範囲において記載した手段および組合 わせによって理解されおよび達成され得る。

上述した方法によって製造された農薬生産性ハイブリッド微生物は自然のまたは 人為的な遺伝学的技術によってさらに変形して、植物宿主に対する農薬の供給源 としての該微生物の能力を向上させることができる。このような変形によって、 例えば、他の供給源からの適当量の農薬の存在下でさえ該農薬を排出し得る能力 を含む、農薬、例えば、固定窒素を排出し得る能力；低温に対するハイブリッド の耐性の低下（すなわち、意図していない毎年毎年のハイブリッドの増殖を防止 するため）；早ばつ、病気または他の生理的ストレスに抵抗するハイブリッドの 能力の増大；追加の農薬生産機能の導入：または植物宿主の外側では増殖できな いようにするハイブリッドの変形を得ることができる。

上述した方法の工程は任意の好都合な順序で実施することができるが、農薬生産 能、および感染性微生物が宿主植物における感染の初期相の間植物組織と相互作 用する仕方で植物組織と相互作用する能力についての選択工程を、植物宿主中で 病気の徴候を示さないハイブリッドの選択に関する工程の前に２回またはそれ以 上実施することが望ましい。

感染性微生物に関連した選択可能な特性は、抗生物質耐性、特定の栄養素補充に 対する要求性（栄養要求性）および毒素に対する耐性等であることができる。農 薬生産性微生物に関連した選択可能な特性は、農薬を単独でまたは感染性微生物 に関して前述した特性の１種またはそれ以上と組合わせて生産し得る能力である ことができる。上述した方法によってスクリーニングされる植物組織との相互作 用は、例えば、植物＆１１１１！に結合する能力または植物の維管束系を通って 広がり得る能力等であることができる。感染の初期相に関連した相互作用が植物 細胞への結合である場合、植物宿主を通って最も容易に広がるハイブリッドを含 んでなる、上述した方法による一層のスクリーニングに対する微生物サブグルー プの選択によって、最終から２番目の工程から得られた微生物サブグループをさ らに限定するのが望ましい。

感染性微生物を適当に選択することによって、以下に列挙する植物宿主との内共 生関係に入いることができるハイブリッドを得ることができる：禾穀類、例えば 、小麦、ライ小麦、大麦、ライ麦、イネおよびオート麦；イネ科植物、例えば、 ブロームグラス（イネ科スズメノチャヒキ属植物）、イチゴツナギ、トールフィ スキューグラス（イネ科つシノケグサ属植物）、ファインフィスキューグラス（ イネ科つシノケグサ属植物）、ライグラスおよびギツウギシバ；熱帯性イネ科植 物、例えば、サトウキビ、トウモロコシ、キビおよびモロコシ；ナス科植物、例 えば、ジャガイモ、トマト、タバコ、ナスおよびトウガラシ；アブラナ科植物、 例えば、カリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ケールおよびコールラビー； 他の野菜、例えば、ニンジンおよびパセリ；他の農業的栽培植物、例えば、サト ウダイコン、ワタ、果樹、成果植物およびブドウ；および経済的に重要な木の種 類、例えば、マツ、トウヒ、モミおよびヤマナラシ０本発明の方法および得られ た微生物を、例えば、マメ科植物の根のｍ瘤に共生しているリゾビウム（Ｒｈｉ ｚｏｂｉｏｓ）の種によって提供される固定窒素に対する、補充として用いるこ とにより、マメ科植物、例えば、ダイズ、アルファルファ、クローバ−、フィー ルドビーンズ（ｆｉｅｌｄ　ｂｅａｎｓ）　、ヤエナリ（ｓｕｎｇ　ｂｅａｎｓ ）、エントウおよび他の豆類の固定窒素要件または他の農薬要件の一部または全 部を満たすこともできる。

量！目ｉ医 本明細書の一部を構成し本明細書中に含められる添付の図面は、本発明の詳細な 説明し、そして記載と共に本発明の詳細な説明するのに役立つものである。

第１図は、プラスミドｐｃＧ３０００部分制限地図を示す図である。

第２図は、ｐｃＧ３００から誘導されたプラスミドｐｃＧ３０６０部分制限地図 を示す図である。

第３図は、プラスミドｐＣＧ６の部分制限地図を示す図である。

第４図は、ベクター■ＢＴＫ６５中のカナマイシン耐性遺伝子に融合した切断さ れた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）バシラス、チュリンギエンシス（Ｂ、ｔｂｕｒｉｎ 　１ｅｎｓｉｓ）デルタエンドトキシン遺伝子を示す図である。

第５図は、カナマイシン耐性遺伝子に融合した切断されたバシラス、チュリンギ エンシス（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　ｉμ臣匡）デルタエンドトキシン遺伝子のｐＣＧ ６　Ｎｅｏ’中への挿入およびこれらの遺伝子を含有する発現モジュールのｐｃ Ｇ３００中への挿入を示す図である。

しい　の− ここで本発明の好ましい態様について詳細に言及する。これは以下の例と共に本 発明の詳細な説明するのに役立つ。

前記のように、本発明は、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生 産性ハイブリッド微生物の製法であって、農薬生産性微生物からの遺伝学的材料 および植物宿主を感染する感染性微生物を結合してハイブリッド微生物を形成す る工程、およびこれらのハイブリッド微生物から、農薬を生産することができ、 植物宿主に病気の発現を引き起こすことがなく、かつ植物宿主との内共生関係に 入いることができるハイブリッド微生物を選択する工程を含んでなる製法に関す る。好ましくは、この農薬生産性ハイブリッド微生物は、植物宿主の能力が該植 物宿主への農薬または農薬生産性微生物の直接通用によって向上され得るような 条件下に植物宿主の能力を向上させることができる。最も好ましくは、Ｒ薬生産 性微生物および感染性微生物は細菌である０本明細書中で用いる「直接通用」と は、全身性適用または部分的全身性適用を含む、植物体全体または植物体の一部 への適用をいう。

本明細書中で用いる「微生物」とは細菌、菌類（酵母を含む）およびＮ類をいう ０本明細書中で用いる「細菌」とは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌および放 線菌等を含む、細菌、細菌様生物およびそれらの同等物を含んでいる０本発明に 従って用いられる微生物の分類学上の分類における唯一の限定は、それらの微生 物の遺伝学的材料の一部または全部が、本明細書中でより十分に記載されるよう に両親の形質特性を発現する生存可能なハイブリッド生物を製造するために用い ることができるということにある。

本明細書中で用いる「感染性微生物ｊとは、植物体内に入いって生活し通常に病 気の徴候を引き起こす微生物だけでなく植物体内に入いって共生的または片利共 生、的に生活する微生物もいう、実際に、本発明に従って用いられる感染性微生 物のあるものは、通常に一部の植物宿主において病原性反応を引き起こすが、す べての植物宿主において通常にこのような反応を引き起こすわけではない。

能力は、多数の因子の任意の１種またはそれ以上を考慮することによって当業者 により測定および評価され得るものである。これらの因子として、１）環境的ス トレス、例えば、準ばつ、高塩分、害虫および有害な化学物質に対する耐性、２ ）収率の増加、３）成熟の促進、４）添加栄養素への低依存性、および５）注目 している植物生産の質の向上が挙げら成される。遺伝学的材料は、組換え体ＤＮ Ａ、組換え体ＲＮＡ、細胞融合、接合およびプラスミドトランスファー、形質転 換、トランスフェクション、形質導入および微量注射法の技法によって結合され る。これらの技法の一部は、参考までに特にここで引用する、マニアナス。エフ 、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆ、）、イー、エフ、フリフチ（Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓ ｃｈ）およびジェイ、サムブルフク（Ｊ、Ｓａ■ｂｒｏｏｋ）　、モレキュラー ・クローニング、ア・う（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ）　１９８２年）およびミラー。

ジェイ、エイチ、　（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ｈ，）　、エクスペリメンツ・イン・ モレキュラー・ジエネティクスＥＸ　ｅｒｉｓｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）　（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　１９７２年 〕に記載されている０本発明のハイブリッド微生物を形成することができる技法 の選択は、一般に、上記引用した科学文献および本明細書中に開示した教示に基 づき当業者の行ない得る範囲内にある。

好ましい態様において、植物宿主との内共生関係に入いることができる本発明の 農薬生産性微生物は、（Ａ）任意の好都合な順序で、 （１）植物宿主を特定する工程、 （２）前記植物宿主を感染する感染性微生物を特定する工程、 （３）植物宿主を感染する能力に加えて１種またはそれ以上の選択可能な特性を 有する感染性微生物の変異体を選択する工程、および （４）１種またはそれ以上の選択可能な特性を有する農薬生産性微生物を選択す る工程、 （Ｂ）前記感染性微生物と農薬生産性微生物との融合ハイブリッドを形成する工 程、 （Ｃ）先行して実施した工程または副工程の生成物から連続的におよび任意の好 都合な順序で、 （１）前記農薬生産性微生物の選択可能な特性の少なくとも１種および前記感染 性微生物の選択可能な特性の少なくとも１種の両方を有するハイブリッドを含ん でなるサブグループ、 （２）前記感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相の間に植物組織と 相互作用する仕方で植物組織と相互作用し得る能力を示すハイブリッドを含んで なるサブグループ、 （３）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッドを含んで なるサブグループ、および（４）先に選択されていない場合には、農薬を生産す る能力を有しているハイブリッドを含んでなるサブグループを選択する工程、お よび （Ｄ）植物宿主の能力が該植物宿主への前記農薬または農薬生産性微生物の直接 通用によって向上され得るような条件下に前記植物宿主の能力を向上させ得るハ イプリント微生物を工程（Ｃ）（１）〜（Ｃ）（４）の最後に実施した工程の生 成物から選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いることができる 農薬生産性ハイブリッド微生物を選択する工程 を含んでなる製法によって製造することができる。

上記工程で用いた「選択」とは、所望の微生物をその生存能力によってまたはそ の独自の特性によって認知し得るような介在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）また は介在の組合わせをいう。

前記のように、方法の各工程は任意の好都合な順序で実施することができる。好 ましくは、これらの工程は、画定窒素生産性細菌の場合と同様に、問題としてい る農薬を生産するハイブリッドの能力を含んで、工程（Ｃ）（１）においてスク リーニングされた農薬生産性微生物の選択可能な特性について記載された順序で 実施する０問題としている農薬の生産能についてのスクリーニングを最初のスク リーニング工程で行なわない場合には、このようなスクリーニング〔工程Ｃ（４ ））を、工程（Ｃ）（２）および（Ｃ）（３）によって意図される植物宿主にお けるスクリーニングと共に行なう前に実施するのが好ましい、記載した順序で実 施する場合には、感染性細菌に関連した選択可能な特性を構成する抗生物質耐性 マーカー等は引き続きのスクリーニング手順において残存している必要はない。

本発明の方法から得られる安定なハイブリッド微生物は、農薬を生産する能力お よび植物宿主との内共生関係に入いることができる能力の両方を有していること において従来の公知微生物とは区別される。ここでいう内共生関係とは、生物が 実際に植物宿主の全体または一部の中に存在しおよび広がり、病原性反応を引き 起こすことなく、植物宿主によって生産された炭水化物および他の材料から自ら のエネルギー要件の一部または全部を引き出しおよび植物宿主によって使用され 得る農薬を提供して他の方法で利用可能なものを補充する関係のことである。

本発明の微生物が内共生関係を形成し得る植物宿主は実質的に全ての経済的に重 要な植物を含んでいることができる。

さらに、いかなる特定のハイブリッド微生物も特定の種の植物宿主に限定される 必要はない、その宿主範囲は、バイブリフト微生物を誘導する感染性微生物を含 む多くの因子に依存している。同時に、ハイブリッド微生物を誘導する感染性微 生物の遺伝学的材料によって制御される形質特性は、ハイブリッド生物中に特別 に入れられる他の特性と同様に、その宿主範囲に制限を加える。

本発明の方法は、農薬を生産する能力を有しかつ単子葉および双子葉の両方の植 物宿主との内共生関係に入いることができる安定なハイブリッド微生物を製造し 得ることが示された０本発明の生成物が内弁生性農薬生産性微生物として働くこ とができる植物宿主のとりわけ重要な群は、温帯性床ａ類、例えば、小麦、ライ 小麦、大麦、ライ麦、イネおよびオート麦を含む禾穀類である０本発明に従って つくられた内弁生性農薬生産性微生物は、経済的に重要である芝地および飼料用 のイネ科植物、例えば、ブロームグラス（イネ科スズメノチャヒキ属植物）、イ チゴツナギ、トールフェスキューグラス（イネ科つシノケグサ属植物）およびギ ツウギシバの要求、固定窒素を含む、農薬を補充するのにも有用であることがで きる。同様に、本発明の生物は熱帯性イネ科植物、例えば、サトウキビ、トウモ ロコシ、キビおよびモロコシの収率を上げる、証明済の能力を有している。ナス 科植物、例えば、ジャガイモ、トマト、タバコ、ナスおよびトウガラシは、本発 明の生物を適用することができる適当な植物宿主である。アブラナ科植物、例え ば、カリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ケールおよびコールラビーも同様 である０種々の野菜、例えば、ニンジンおよびパセリ：他の農業的栽培植物、例 えば、サトウダイコン、ワタ、果樹、成果植物およびブドウ；および経済的に重 要な木の種、例えば、マツ、トウヒ、モミおよびヤマナラシも本発明の生物に対 する植物宿主として用いることができる。

たとえ、植物が農薬を生産する微生物との共生関係をもつことができるとしても 、例えば、根庸中で嫌気的に大気窒素を固定するりゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍ）属の細菌と共生関係をもち得るマメ科植物の場合であっても、これらの植物 は、施肥または他の方法によって補充的農薬供給源を与えられた場合農薬（固定 窒素を含む）を生産することができかつこれらのマメ科植物との内共生関係に入 いることができる本発明に従うてつくられた微生物によって、補充的固定窒素を 含む補充的ＩＩＮを提供し得るものと考えられる。

本発明において用いられる農薬生産性微生物は、農薬または注目している化学作 用を生ずるいかなる微生物であってもよい０本発明において用いることができる 農薬生産性微生物は抗生物質、殺菌剤、抗ウィルス剤、殺虫剤、線虫駆除剤、ダ ニ駆除剤、除草剤、植物成長調節化合物、固定窒素以外の肥料物質、芳香物質、 感覚増大物質（ｓｅｎｓｏｒｙ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およ びアンチフィーディング剤等を生産することができる微生物である。このような 農薬生産性微生物の選択は、本明細書中の教示および説明を考慮して当業者の能 力の範囲内にある。

一態様において、農薬生産性微生物は好気的に大気窒素を固定することができる 細菌である。このような細菌はとりわけ、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔ ｅｒ）属、アゾモナス旦り匹ｎ旦属、ペイジェリンキア（Ｂｅｉ’ｅｒｉｎｃｋ ｉａ属およびデルキシア（Ｄｅｒ■Ｕ属から選択することができる。好ましい群 の窒素固定細菌は、アゾトバクタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）　属から選ばれ るもの、例えば、アゾトバクタ−・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎ ｅｌａｎｄｉｉ）　、アゾトバクタ−・パスパリ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｄ１ アゾトバクタ−・ベイジエリンキア（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ血且肛ｎ■ｎ）お よびアゾトバクタ−・クロオコンカム旦鉦旦匝ｌ肛並■匹匹匹畦である。アゾト バクタ−・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）がと りわけ好ましい、なぜならば、その遺伝学的特質および窒素固定の調節は十分に 研究されているからでありそして他の細菌属からの遺伝学的材料を受容し発現す る証明済の能力を有しているからである。

ジー、ピー、ロバーツ（Ｇ、Ｐ、Ｒｏｂｅｒｔｓ）等、「ジェネティクス・アン ド・レギュレーシヨン・オヴ・ナイトロジェン・フィクセイシッン（Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆｉｘａｔ ｉｏｎ）Ｊ、アン、レグ。マイクロパイオル、（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ、）　、３５：２０７〜３５　（１９８１年）を参照されたい、アゾトバ クタ−（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）および他の有意な好気性窒素固定細菌は一般 にグラム陰性細菌であるが、本発明の技法はグラム陽性細菌およびグラム陰性細 菌のいずれにも通用し得るものであることを理解されたい。

本発明に従って有用であると考えられる典型的な農薬生産性細菌およびそれらが 生産する農薬または化学的作用の表を第１表に示す。

第１表 群　属　種　仁１五五月 ノカルジア　ＳＰ、　ミオマイシン（ｍｙＯＩＩｙｃｉｎ）を生仝匹虹但祉　産 する ダニ駆除剤　ストレプトマイセス　アウレウス　テトラナクチン（ｔｅｔｒａｎ ａｃｔｉω套勺！ｌ笠３旦σ　漁肛凱註Ｓ−３４６６を生産するΣｔ、　ビアラ ホス（ｂｉａｌａｐｂｏｓ）を生産する 玉、　ア二シマイシン（ａｎｉｓｙｍｙｃｉｎ）を生産する 本発明に用いられる植物宿主を感染することができる感染性微生物は、考慮して いる植物宿主を感染する広範囲の細菌種のいかなるものであってもよい。感染性 微生物は感染の初期相の間植物宿主との既知の相互作用方法を有しているのが好 ましい、５！染性徽生物は、潜在性病原体を含む病原体または内共生種のいずれ であってもよい。病原体の場合、病原体がそれに関連した目で認められる病気の 発現を引き起こすのが好ましい、典型的な病原体はアグロバクテリウム旦肛並匹 −ｔｅｒｉｕｍ）　ａおよびエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）　Ｈの種を含んで いる。典型的な内共生種はアゾスピリラム（Ａｚｏｓ　ｉｒｉｌｌｕｍ）、コリ ネバクテリウムμ工ｌ吐血屡μｍ聾）およびクラビバクター（Ｃ１ａｖｉｂａｃ ｔｅｒ）の種を含んでいる。アゾスビリラムーＱμｖ叫二ｒｉｌｌｕｓ）の種は 、病気の発現を引き起こすことなく、熱帯性イネ科植物、例えば、サトウキビ、 および温帯性イネ科植物、例えば、コムギの根の中で生活することが知られてい る。コリネバクテリウム（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓｅ）のある種はコム ギおよびトウモロコシ中で生活している。タラビバクター（Ｃ１ａｖｉｂａ一旦 肛）の種はトウモロコシ中で生活していることが見い出された。

最も好ましくは、感染性微生物は、本発明のハイブリッド微生物を内共生関係に 入れようとしている対象の植物以外の植物に対して該ハイブリッド微生物の拡散 の潜在能力を制限するために、問題としている特定の作物植物宿主に対して特異 的であるかまたはほぼ特異的である株である。多くの植物感染性微生物およびそ れら微生物の植物宿主との相互作用方法は科学的文献に記載されている。これに 関しては、特にここに参考までに引用する、エム、ニス、マウント（Ｍ、Ｓ、Ｍ ｏｕｎｔ）等、フィトバソジェニフク・プロカリオーツ（Ｐｈ　ｔｏ　ａｔｈｏ 　ｅｎｉｃｈ亘口Ｄ！印」り１Ｖｏ１．１およびＩＩ　（１９８２年）にその言 及がなされている。さらに、木部限定性（ｘｙｌｅｗ−１ｉ簡ｉ　ｔｅｄ）細菌 、例えば、ピアース病を引き起こす細菌およびＣ−４イネ科植物、例えば、ギテ ウギシバに住む細菌が本発明の実施に有用である。このような細菌は、参考まで にここに引用する、ウェルズ（Ｗｅｌ　Ｉｓ）等、フィトバソロジ−（Ｐｈ　ｔ ｏ　ａｔｈｏｌｏ　）　７１：１１５６〜１１６１　（１９８１年）およびラジ ｘ　（Ｒａｊｕ）等、アム、ジエイ、エノル、ヴイチク、（Ａｍ、Ｊ、Ｅｎｏｌ 、Ｖｉｔｉｃ、）　３１：１７〜２１　（１９８０年）に記載されている。

多くの病原性微生物は、特定の植物宿主に対する該微生物の選好性以外は本質的 に互いに未分化である株を形成することが知られている。このような宿主に特異 的な病原体株は、関係している植物宿主に対する病原変種（ｐａｔｈｏｖａｒ） として知られている０本発明は、問題としている特定の宿主に対する病原変種を 用いた場合とりわけ有用であると考えられる。これらの病原変種として、アグロ バクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ−）属の病原変種、とりわけアグロバ クテリウム・ツメファシェンス、（ｈ」Ｌ［Ｓす：＋ａｃｔｅｒｉｕｓ　ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）：　エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属の病原変種、とりわ けエルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａｓｔｅｗａｒｔｉｉ）およびエル ウィニア・カルトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒ−ｔｏｖｏｒａ）　：シュード モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の病原変種−とりわけシュードモナス・ソ ラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａ−ｃｅａｒｕｍ）および シュードモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ肛ム…並）；　ザントモ ナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の病原変種、とりわけザントモナス・カンペ ストリス（Ｘａｎｔｈｏｓｏｎａｓ　■肚■−ｔｒｒｓ）：および同様の細菌を 挙げることができる。

とりわけ好ましい非病原性の共生体としては、アゾスピリラム、Ｑμ脛且辻上Ｕ μへ属の種、とりわけアゾスピリラム・リポフェラム（ハ匹紅■旦憇　且匹ハ■ 畦およびアゾスピリラム。

ブラシレンス（ハ匹紅杜ｕ憇　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）　％アクレモニウム（Ａ ｃｒｅｏ＋ｏｎｉｕｓ＋）ＩＩの種、とりわけアクレモニウム・チフィナム（Ａ ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　立勧江」）およびアクレモニウム・コエノフイアラム（Ａ ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　匹弘肚ｕ紅■）、およびバランシア（Ｂａｌａｎｓｉａ） ＭＥの種を挙げることができる０本発明に従って使用するのに適当であると考え られる感染性微生物は第■表に挙げたものを含んでいる。

第ｎ！ｌ　喝　′ え乙ズ　Ｍ　種 グラム陰性細菌　シェードモナス　アガリシ会融旦虱）、アンドロボコニス仝聞 四匹セ鮭蛙、好気性桿菌および　（Ｐｓｅｕｄｏｅｏｎａｓ）　アベナエ会胆凹 畦、カリカハハイエμ虹＆並卯藍畦、球菌（ｄｏｄｄｉ）　カリオフィリ套虹匹 凶匹旦）　％シンコリ（ｅｉｅｈｏｒｉｉ）、シンコリ（ｃｉｓｓｉｃｏｌａ） 　、グラジオリｄｚグルマエ血油！畦、マルギナリスｈ肛紅坦■蝮、シェードア ルカリゲネス（ｅｕｄｏ８１ｃａｌｉゎ６）、亜種シトルリ玄ｎユ■ｕ、ルプリ リネアンス立曲ｒｉｌｉｎｅａｎ校、ルフリスハルビカンス（ｒｕｂｒｉｓｕｈ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ソラナセアラム（ｓｏｌａ卯ｇ囮！畦、シリンカニ会芝１ 部甜α、トラアシ（ｔｏｌａａｓｉｉ）、ビリシフラバ（ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖ ａ）ザントモナス　アルビリネアンス（ａｌｂｉｌｉｎｗｎｓ）　％アンペリナ 屋−α翻を−ｓ）　肋畦、アクソノボディス血圧四四虹蛙、カンペストリス怠− と経は症、フラカリアエ豆蝕駐ｄ鱈り。

アグロバクテリウム　リゾゲネス立■７、ルビ慮、ツメファシェμｍゴ、」、知 １　ンス（ｔｕｍｆａｃｉｅｎｓ）遭性嫌熾性桿菌　エルウィニア　アミロボラ 会町に毀］）、アナナス血凹凹症、カンセ套匡釦釦）　ロゲナ漁使笠四駐始）、 カルネキエアナ怠但コ１鋤仙ρ、カロトボラ血虹配笠虹畦亜種アトロセプチカ血 紅竺印−ｕ９）、カロトボラ（ｃａｒｏｔｏ四【υ１１カロトボラ（ｃａｒｏｔ ｏｖｏｒａ）、クリサンセミμ担ヱ蝕Ｉ胎−σ、シプリペディ立花ｄ匹東ｕ、デ ィソルヘンスμ力徂蛙３匹ａ１ハービコラ仝肛鼠臼蝕）、マロチボラ珈１脱史！ す、ミレチアエ（ｍｉｌｌｅｔｉａｅ）　％ニグリフルエンスＷ−ｕｅｎｓ）　 、ニミプレスラリスｂ江山工竺朋Ｖ山組）、グエステワルチ（ｓｔＳＭｔｉｉ） 、トラケイフィラ（ｔｒａｃｈｅｉ−Ｐ！！ＬＬＬ！１％ウレドボラ（ｕｒｅｄ ｏｖｏｒａ）グラム陰性紺菌　アゾスピリラム　リボフォラム７）　、ブラシレ ンス（ｂｒａｓｉｌｅ−漁民扛江■和畦　ｍｌ ダラム陽性［１コリネバクテリウム　ベタエ（ｂｅｔａｅ）　、ベチコ５　（ｂ ｅｔｉｃｏｌａ）、ファシアンス放ｍおよび　（Ｃｏｒｖｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ ｌＩ）　（ｆａｃｉａｎｓ）　％フランカムファシェンス（ｆｌａｃｃ＋ｍｆａ ｃｉｅｎｓ）A 関連生物　イリシス旦且は症、インシディオサム豆旺民蝕赳畦、ミシガネンス会 由九江印！臣吐、ネブラスケンス会仲■−５ｋｅｎｓｅ）　、オオルチ（■ｒｔ ｉｉ）、ボインセティアエ会！堕煕ｙｊ四）、セヘトニカム会コと金１９男）タ ラビバクター　゛　キシリ（ｘｖｌｉ）（Ｃ１ａｖｉｈａｃｔｅｒ） ストレプトマイセス　イボモニア立四四４）、スカビエス（ｓｃａｂｉａ）５に 蛇致町聾校 菌類　アクレモニウム　チフィナムＩｍ虫ｎ凹り、コエノフィアラムμ笠蛇吐膓 −μ肛惣包籏畦　裁畦 農薬を生産することができかつ双子葉植物宿主との内共生関係に入いることがで きる安定なハイブリッドの形成に対して、アグロバクテリウム・ツメファシェン ス旦肛並ａｃｔｅｒｉ憇旦ｖｈｅｆａ旦弘ｕの病原変種がとりわけ好ましい、ア グロバクテリウム・ツメファシェンス■μ工■」μｍ■　■μｌ赳違匪吐は、植 物細胞組織と結合することにおいて感染の初期相の間植物との十分に特定された 相互作用を有している。試験管内的に植物細胞組織に結合するアグロバクテリウ ム・ツメファシェンス、Ｑ１１拍浅復「お１　お１旦す旦口旦Ｖ、の能力が証明 されそしてアグロバクテリウム・ツメファシェンス］■＝■Ｃμｍ駐ｔｕｍｅｆ ａ■ｅ５３１による生体内的腫瘍形成に匹敵する宿主範囲であることが示された 。特に参考までにここで引用する、ニー。

ジー、マチイセ（Ａ、Ｇ、Ｍａｔｔｈｙｓｓｅ）等、「プラント・セル・レンジ ・フォー・アタッチメント・オヴ・アグロバクテリウム・ツメファシェンス・ト ウ・ティシェー・カルチャー・セルズ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒａｎｇ＠ｆｏ ｒ　Ａｔｔａｃｂｓｅｎｔ　ｏｆ　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔａ＊ｅｆａｃ ｉｅｎｓ　ｔｏ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｅ１ｌｓ）　Ｊ−マイジオ ロジカル・プラント・パソロジ−（Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｐｌａｎｔ　 Ｐａｔｂｏ−ｎ■）　、　ｆｉ：３８１〜３Ｂ？（１９８２年）：！−−、ジー 、　？ティー！！（Ａ、Ｇ。

Ｍａｔｔｂｙｓｓｅ）等、ｒバインディング・オヴ・アグロバクテリウム・ツメ ファシェンス・トウ・キ中ロフト・プロトプラスト（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　Ａ 　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔａｓｅｆａｃｉｅｎｓ　ｔｏ　ＣａｒｒｏｔＰｒ ｏｔｏｐｌａｓｔ）　Ｊ　、マイジオロジカル・プラント・パソロジーＰｂ　５ ｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｐｌａｎｔ　ｂｌ曵ｂｌ吐２０：　２７〜３３　（１９８ ２年）を参照されたい。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｓｅ ｆａ■弘ｕは、農薬を生産することができかつ以下に列挙する植物との内共生関 係に入いることができる安全なハイブリッドを形成するにおいて使用するのに好 ましい感染性微生物である：ナス科植物、例えば、ジャガイモ、トマト、タバコ °、ナスおよびトウガラシ；アブラナ科植物、例えば、カリフラワー、ブロッコ リー、キャベツ、ケールおよびコールラビー；野菜、例えば、ニンジンおよびパ セリおよび他の農業的に栽培される植物、例えば、サトウダイコン、ワタ、果樹 、成果植物およびブドウ、双子葉植物との内共生関係に入いることができる農薬 生産性微生物を製造するために、本発明に従って使用するのに適した他の感染性 微生物としてエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｌ ａ）　、シュードモナス・ソラナセアラムＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｏｌａｎ ａｃｅａｒｕ−）　、シュードモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　 扛ム…鯨）およびザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｓｏｎａｓ　９ 肚■江ｎ）を挙げることができる。

感染性微生物、例えば、シェードモナス・シリンガニ（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ 　ｓＢ：■鯨）、およびザントモナス・カンペストリス０［ａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ　９肚■ｋｎ）は、農薬を生産することができかつ以下に列挙する植物との内 共生関係に入いることができる安定なハイブリッド微生物を形成する際にとりわ け有用であると考えられる二阜子葉禾穀類作物、例えば、コムギ、オオムギ、ラ イムギ、イネおよびオート麦、そしてさらにイネ科植物、例えば、ブロームグラ ス（イネ科スズメノチャヒキ属植物）、イチゴツナギ、トールフォスキューグラ ス（イネ科つシノケグサ属植物）およびギツウギシバ。

コリネバクテリウムμｄμｍｕｓ）種およびタラビバクター（Ｃ１ａｖｉｂａｃ ｔｅｒ）種はイネ科植物、コムギ、トウモロコシおよびモロコシのような単子葉 植物に対する感染性微生物として有用である。

エルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｔｅｉｎｉａ　７−およびタラビバクター・キ シリ（Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ　ｎ旦）亜種シノドンティス（ｃ　ｎｏｄｏｎｔ ｉｓ）または亜種キシリ旦■ｕは、農薬を生産することができかつ単子葉植物、 例えば、熱帯性イネ科植物、例えば、サトウキビ、トウモロコシ、キビおよびモ ロコシ、および小穀粒、例えば、イネと内共生関係に入いることができる安定な ハイブリッド微生物を形成するにおいて有用な感染性微生物として特に好ましい 、シュードモナス・シリンガニ（ＰｓｅｕｄｏＩｌｌｏｎａｓ　■亘■耗）およ びザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏ＋ｎｏｎａｓ　ｃａ見凹コＬ１ ）の株もこれらの通用に有用であると考えられる。

アゾスビリラムμμ臣吐亘」！畦の上記特定した株は、とりわけ熱帯性および温 帯性イネ科植物、例えば、サトウキビおよびコムギを含む単子葉植物において有 用であると考えられる。

バランシア（Ｂａｌａｎｓｉａ）属およびアクレモニウム（Ａｃｒｅ＋ｅｏｎｉ ｕ＋ｓ）藁の種、とりわけアクレモニウム・チフィナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｓ 立辻ｎ憇）およびアクレモニウム・コエノフィアラム（Ａｃｒｅ−ｍｏｎｉｕｍ 　ｃｏｅｎｏ　ｈｉａｌｕｍ）は、イネ科植物および飼料（ｆｏｒａｇｅ）、例 えば、トールフェスキュー、ファインフエスキューおよびライグラスに対する感 染性微生物として有用である。

ストレプトマイセスμ勺！ｕ叩ハ旦註種は、需根作物および塊茎作物、例えば、 サツマイモ、ジャガイモ、サトウキビおよび他のビート、およびハツカダイコン （ｒａｄｉｓｈ）の感染性微生物として有用である。

本発明に従うて用いられる特定の植物感染性微生物および特定の農薬生産性微生 物の選択は、本明細書中に含まれている教示および本発明の開示から論理的に引 き出される推論を考慮すればルーチンの実験を行なうことにより当業者の能力の 範囲内にある０本発明の方法において農薬生産性微生物または感染性微生物とし て有用であると考えられる微生物の特性は、ルーチン実験によってまたは標準的 大要、例えば、パージエイズ・マニュアル・オヴ・デターミネイティブ・バクテ リオロジー（Ｂｅｒ　ｅ　’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ ｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ユ皿註等を参照することにより決定することができる。

本発明における使用に対して、問題としている植物宿主を感染する能力に加えて １種またはそれ以上の選択可能な特性を有する所望の感染性微生物の変異体を選 択するのが好ましい、特に、試験管内的に選択可能である特性を有する感染性微 生物の変異体を選択すべきである。かかる特性は抗生物質耐性、特定の栄養素補 充に対する要求性（栄養要求性）、毒素、例えば、重金属に対する耐性およびこ れらの組合わせ等を含んでおり、このような特性は変異体感染性微生物からの遺 伝学的材料を含有するハイブリ、ド微生物を特定するための試験管内でのハイブ リッド微生物の迅速なスクリーニングを可能とする０選択可能な特性が存在しな い場合には、一方または両方の親を殺すがハイブリッドは生かすことができる物 理的手段を用いることができる。このような物理的手段は紫外線および加熱を含 んでいる。

抗生物質耐性は好ましい選択可能な特性であり、選択される感染性変異体微生物 は少な（とも２種の抗生物質に対する耐性を有していることがとりわけ好ましい 、二重の抗生物質耐性、または他の選択可能な特性の余剰は、ハイブリッドの最 初のスクリーニングが農薬生産性微生物および選択された感染性変異体微生物の 両方からの遺伝学的材料を有するもののみを特定し、そして農薬生産性微生物の 変異体抗生物質耐性株の生存または形成の機会を減することを保証する。このこ とは融合ハイブリッドの場合にとりわけ有用でありそしてクローン化遺伝子を用 いる場合にはあまりまたは全く重要でない０例えば、固定窒素を生産することが できおよび単子葉植物との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリ ッドの形成においては、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンの両方に対 して耐性を有するエルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｔｅｗａｒｔ ｉｉ）の株が好ましい、固定窒素を生産することができかつ双子葉植物との内共 生関係に入いることができるハイブリッドの形成においては、ストレプトマイシ ン耐性かつカナマイシン耐性であるアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ 　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ＠ｅｆａｃｉｅｎｓ）の株が好ましい、このよ うな植物感染性微生物の変異体株は米国メリーランド州ロンクヴイル（Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ）在のアメリカン・タイプ・カルチ＋−−：７レクシツン（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ）のような微生 物保存機関から入手することができ、または当業者に周知の技法によって野生型 から発止させることがてきる。

農薬生産性微生物のハイブリッドを問題としている農薬を生産する能力について 最初にスクリーニングしない場合には、農薬生産性微生物は１種またはそれ以上 の追加の選択可能な特性、好ましくは試験管内的に選択可能な特性、例えば、感 染性微生物に関して上記した特性を有する変異体であることができる。従って、 例えば、注目している農薬が殺虫剤、線虫駆除剤等である場合には、農薬生産性 微生物は、選択可能な抗生物質耐性または感受性または特定の栄養素補充に対す る選択可能な要求性を有する変異体であることができる。

明らかに、これらの特性は感染性微生物の選択可能な特性と同一であるべきでは ない、なぜならば、最初のスクリーニングは他の方法では非ハイブリッド生物を 除去することができないであろうからである。最初のスクリーニング手順の生成 物において農薬生産能からこのような追加の選択可能な特性のハイブリッドが存 在する場合、次のスクリーニングにおいて農薬生産能を有する真のハイブリッド 生物による集団を十分に富ませることができる。

とりわけ好ましい態様において、本発明のへイブリフトは、従来の技術において 一般に用いられる技法のアウトラインに従って細菌のプロトプラストまたはスフ ェロプラスト融合によって形成される。公知のプロトプラストおよびスフ二ロプ ラスト融合技法は、参考までに特にここで引用するディー。

ニー、ホンプウッド（Ｄ、Ａ、１１ｏｐｗｏｏｄ）　、ｒジェネティフク・スタ ディーズ・ウィズ・バクテリアループロトプラスト（Ｇｅｎｅ−ｔｉｃ　５ｔｕ ｄｉｅｓ％１ｌｉｔｈ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）Ｊ　、ア ン、レヴ。

マイクロパイオル、　（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、３５： ２３７〜７２（１９８１年）、およびアール、エル、ウニイス（Ｒ，Ｌ、Ｗｅｉ ｓｓ）、ジェイ、バタテリオル、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、１２Ｂ　： ６６８〜’７０（１９７６年）に記載されている。このＢ様において、必要なこ とではないが、使用される感染性細菌および農薬生産性細菌はダラム染色に対し て同じ応答を示すのが好ましい。

一般に、融合手順は、農薬生産性細菌および感染性細菌の両方からの細胞壁の除 去、融合誘導培地、例えば、ポリエチレングリコール中での感染性細菌と農薬生 産性細菌との融合、および感染性細菌および農薬生産性細菌の両方からの遺伝学 的材料を含有する融合ハイブリッドの周囲の細胞壁の再生を含んでいる。融合お よび細胞壁の再生は、発現可能な遺伝学的組換えの率が新たに形成されたハイブ リッド中の遺伝学的材料の酵素分解の率に対して有利となるような低温において 実施する。

融合ハイブリッドの初期形成の後、細菌集団の遺伝学的構成は２〜３日間比較的 不安定であり、その間に多くの遺伝学的組換えが明白に起こる。この期間に、農 薬生産性細菌に関連した１種またはそれ以上の選択可能な特性を示すことができ かつ感染性細菌に関連した１種またはそれ以上の選択可能な特性を示すことがで きる安定な融合ハイブリッドを選択する。この工程の間に農薬生産特性について も選択することがとりわけ好ましい０例えば、ストレプトマイシンおよびテトラ サイクリン耐性であるエルウィニア・ステヮルチ（Ｅｒｓｖｉｎｉａｓｔｅｗａ ｒｔｉｉ）の株から形成されたエルウィニア・ステヮルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓ ｔｅｗａｒｔｉｉ）とアゾトバクタ−・ビネランジ（Ａｚｏｔｏ−ｂａｃｔｅｒ 　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）との融合生成物を、ストレプトマイシンおよびテトラ サイクリンの両方を含有する窒素不合培地中で増殖させる。従って、アゾトバク タ−・ビネランジ（Ａｚｏｔｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）からの 窒素固定に関連した遺伝学的材料およびエルウィニア・ステヮルチ（Ｅｒｅｍｉ ｎｉａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）からのストレプトマイシンおよびテトラサイクリ ン耐性に関連した遺伝学的材料の両方を含有する生物のみが２〜３日間のインキ ュベーション期間で生き残る。

次いで、農薬生産性細菌に関連した選択可能な特性および感染性細菌に関連した 選択可能な特性の両方の特性を示す生き残った融合ハイブリッドは、感染性細菌 が植物宿主の感染の初期相の間植物組織と相互作用するような仕方で植物組織と 相互作用する能力についてスクリーニングすることができる。上記のように、ア グロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕＦｅ ｆａｃｉｅｎｓ）に関連した感染の初期相は植物組繊細胞への結合であり、上記 文献に記載されている従来の技法によっておよび下記の例に記載の技法によって 試験管内的に調べることができる。

他の感染性細菌、例えば、エルウィニア・ステヮルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｔｅ ｗａｒｔｉｉ）は、植物の病気応答系によって検知および破壊されずに植物の維 管束系を通って広がることにより感染後最初に植物組織と相互作用する。この性 質は文献において、感染性微生物を植物の正常な防御反応から逃すことを可能と する、該感染性微生物によって生産される細胞外多糖によるものであると考えら れている。この方法で植物の維管束系を通って広がる融合ハイブリッドの能力は 、任意の常法によって調べることができる。１つの好ましいスクリーニングに、 植物を、植物体の縦軸に沿って配置された複数の横断面に解剖することができる 。各部分に含まれる細菌から細胞培養物を再生させることができる。初期感染の 部位から最も遠くに移動した細菌含有部分は、植物の維管束系を通って最もよく 分散することができる融合ハイブリッドを含んでおり、それによってこの能力を 有しているハイブリッドの選択が可能となる。

この植物組織との初期相互作用についてのスクリーニングを行なうための他の技 法は、本明細書中に含まれている技法を考慮すれば当業者が考え得るものである ことが理解されよう、さらに、特定の感染性細菌と特定の植物宿主との間の初期 相互作用の他の機構は、本明細書中に含まれている技法および感染性細菌と植物 宿主との間の既知の相互作用に照らしてみて当業者に明白であろう方法によって 測定しスクリーニングすることができる。

植物の維管束系を遣って広がる能力は、植物細胞組織との初期相互作用が他の機 構、例えば、ｍｉ２！結合によるものである感染性細菌から形成された融合ハイ ブリッドの場合でさえも望ましい性質である。従って、さらに、農薬を生産する 能力、および感染性細菌が感染の初期相の間植物宿主と相互作用する仕方で植物 細胞組織と相互作用する能力の両方を有することが見い出された融合ハイブリッ ドをスクリーニングして、本発明に係る一層のスクリーニングのために、植物の 維管束系を通って迅速に分散することもできるハイプリントのサブグループを選 択することが好ましい。

さらに、本発明のこの態様の実施において、農薬を生産する能力、および感染性 細菌が感染の初期相の間植物細胞組織と相互作用する仕方で植物細胞組織と相互 作用する能力の両方を有することが見い出された融合ハイブリッドをこれらの能 力について２回またはそれ以上の回数でスクリーニングすることが好ましい、こ のような繰り返しのスクリーニングは融合ハイブリッド株の安定性を確実にする 傾向を存し、そしてさらにこれら２つの面で最大の能力を有する扱いやすい数の 融合ハイブリッドの一層のスクリーニングに対する選択を可能にする。

上述のように、農薬生産性細菌の選択可能な特性および植物組織との相互作用能 の両方を示す安定な融合ハイブリッドは次に個々のコロニーとして増殖させるこ とができ、窒素を固定する農薬生産性細菌の場合には、好ましくは窒素を含まな い培地で増殖させることができる０次いで、得られた各培養物を適当な方法によ って、例えば、注射によって問題としている植物宿主の実生に適用することがで きる。適当なインキュベーション期間、例えば２〜３週間の後、宿主植物実生中 に目で認められるいかなる病気の発現をも引き起こさない融合ハイブリッドを一 層のスクリーニングに対して選ぶことができる、：＆験が示すところによれば、 ２５〜３０の最良の融合ハイブリッドのスクリーニングは通常、問題としている 宿主植物中に目で認められる病気の徴候、例えば、もとの感染性細菌に関連した 病気の徴候を示さない５〜７の融合ハイブリッドを与えるのに十分である。

好ましくは、植物の維管束系を通しての最大範囲の広がりないことが示され、お よび窒素を固定する農薬生産性細菌の場合には窒素を含まない培地中で最も活発 な増殖を示す安定な融合ハイブリッドを一層のスクリーニングに対して選択する 。

本発明の一部の融合生成物は胞子を形成することも観察された０本発明に従って 形成された胞子を形成する内共生性細菌の選択は植物宿主への適用時に細菌の適 用および生存を容易にする。なぜならば、胞子は一般に増殖性細菌細胞よりスト レスに対して耐性だからである。

別の好ましい態様において、植物宿主との内共生関係に入いることができる本発 明の農薬生産性微生物は、下記の工程：（Ａ）任意の好都合な順序で （１）植物宿主を特定する工程、および（２）前記植物宿主を感染する感染性微 生物を特定する工程〜 （Ｂ）前記感染性微生物中に移すことができかつ該微生物内で複製することがで きるベクターを調製する工程、（Ｃ）前記感染性微生物による農薬の生産を指令 することができる発現モジエールを調製する工程、（Ｄ）前記ベクター中に発現 モジエールを入れて、前記感染性微生物中に移すことができかつ該微生物内で複 製することができる発現ベクターを造成する工程、該発現ベクターは前記感染性 微生物における農薬の生産を指令することができる、 （Ｅ）前記発現ベクターを用いて前記感染性微生物を形質転換してハイブリッド 微生物を製造する工程、（Ｆ）前記ハイブリッド微生物を選択する工程、（Ｇ） 前記選択されたハイブリッド微生物から連続的におよび任意の好都合な順序で、 （１）前記感染性微生物が植物宿主内での感染の初期相の間に植物組織と相互作 用する仕方で植物＆ｌ織と相互作用し得る能力を示すパイプリフト微生物を含ん でなるサブグループ、 （２）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッド微生物を 含んでなるサブグループ、および（３）先に選択されていない場合には、農薬を 生産する能力を有しているハイブリッド微生物を含んでなるサブグループ を選択する工程、および （Ｈ）前記植物宿主の能力が該植物宿主への農薬または農薬生産性微生物の直接 適用によって改善され得るような条件下に植物宿主の能力を改善し得るハイブリ ッド微生物を工程（Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）の最後に実施した工程の生成物か ら選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生 産性ハイブリッド微生物を選択する工程 を含んでなる製法によって形成する。

上記工程で用いた「選択」とは、所望の微生物をその生存能力によってまたはそ の独自の性質によって認識し得るような介在または介在の組合わせをいう。

感染性微生物内に移すことができかつ該微生物内で複製することができるベクタ ーは、本発明の教示から考慮して当業者によって製造可能である０本明細書中で 用いる「調製された（ｐｒｅｐａｒｅｄ）　Ｊとは、所望の性質を有することが 知られている現存のベクターを得ることを含んでいる。

発現モジュールは当業者に公知の技法を用いて調製される。

本明細書中で用いる「発現モジュール」とは、細胞による生産物の生産、この場 合には感染性微生物による農薬の生産、を指令することができるＤＮＡ配列をい う、この発現モジュールは転写および翻訳制御要素および農薬の生産に対する１ 個または複数個の構造遺伝子を含んでいるポータプルＤＮＡ配列を含んでなる。

そして、この＠御要素は感染性微生物中で作動可能である０発現モジュールは感 染性微生物中で選択可能な特性をコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい、こ の配列は前記した転写および翻訳制御要素によって制御され得るか、または該配 列は感染性微生物中で作動可能であるそれ自体の転写制御要素を有していること ができる０選択可能な特性は抗生物質耐性であることが好ましい。

本明細書中で用いる「ポータプルＤＮＡ配列」とは、合成的につ（られたヌクレ オチド配列または天然に存在するＤＮＡ配列の制限フラグメントをいう、この配 列は前述した農薬生産性微生物から得られる。このような配列を得る方法は、本 発明の教示および公知の方法から当業者に明らかであろう。

このような方法の例は、参考までに特にここで引用する、マニアチス、ティー、 　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラト リ−・マニュアル（１’１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎＡＬ互垣υｌ蝕工Ｌ ＬＬ！Ｌ！互リー〔コールド・スプリング・八−バー・ラボラトリ−（ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　１９８２年〕に見い 出すことができる。

発現モジュールをつくる１つの好ましい方法は以下の通りである。農薬に対する １個または複数個の構造遺伝子を含有するポータプルＤＮＡ配列を調製する０次 いで、このポータプル配列を、該ポータプルＤＮＡ配列に対する転写および翻訳 制御要素を含有するベクターにクローニングする。これらの制御要素は感染性微 生物内で作動可能である。ポータプルＤＮＡ配列および制御要素が当業者に公知 の技法によって正しく整列されるならば、発現モジュールはこのベクター中につ くられる０発現モジュールは、感染性微生物にＭ！薬を生産するように指令する ことができる０次いで、このモジュールを公知の技法によって回収する。

発現モジュールを製造する別の方法がある０例えば、ポータプルＤＮＡ配列をベ クターにクローニングする前に制御配列の一部または全部をポータプルＤＮＡ配 列に結合させてもよい、この場合、ベクターは制御要素を含んでいる必要はない 。

転写および翻訳制御要素は、本明細書中で記載のように、最低１個のプロモータ ー、最低１個のリポソーム結合部位、最低１個の翻訳開始コドンおよび最低１個 の翻訳終結コドンを含んでいる。これらの要素は、安定性を高める配列、および ベクターＤＮＡの適当な転写および引き続きの翻訳に対して必要なまたは好まし い任意の他の配列を含んでいてもよい。

これらの要素は合成りＮＡ、天然ＤＮＡ配列の一部、または試験管内的突然変異 誘発の生成物を含んでいることができる。

導入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のために選ばれる特定の制御要素は、しば しば経験的に決定される基準によって選ばれる。すなわち、異なる配置の制御要 素、例えば、リポソーム結合部位およびそのフランク配列は、十分満足な配置が 明白となるまで直接に発現時の効果について試験される。このような経験的な決 定は当業者に公知の技法を含んでいる。

発現モジュールを調製した後、該発現モジュールを、感染性微生物中に移すこと ができかつ該微生物内で複製することができるベクター中に入れて、発現ベクタ ーをつくる。この発現ベクターは、感染性微生物中の複製内に移すことができお よび該感染性微生物による農薬の生産を指令することができる。

本発明の教示から見て当業者に公知の技法によって、このベクターを感染性微生 物内に移してハイブリッド微生物をつくる。すべての感染性微生物がこのベクタ ーによって形質転換されるとはかぎらない、従って、ハイブリッド微生物を選択 することが必要となる。このような選択技法は、本発明の教示に照らして当業者 に明白であろう、好ましい選択技法の１つは、感染性微生物中で選択可能な特性 をコードする、任意の必要な転写および翻訳制御要素をもったＤＮＡ配列を、か かる配列がまだ発現モジュールに存在していない場合に、発現ベクター中に導入 することを含んでいる。

ハイブリッド微生物を選択した後、植物宿主との内共生関係に入いることができ る農薬生産性ハイブリッド微生物であるものを選択することが必要である。これ は、上記したように工程（Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）および（Ｈ）に従って実施 する。

とりわけ好ましいＢ様において、農薬生産性ＤＮＡ配列を、感染性微生物のゲノ ム中に組込み可能である組込みベクターにクローニングする。このような組込み ベクターの使用は、プラスミド伝達によるクローン化ＤＮＡ配列の他の微生物へ の伝達を阻止する。

とりわけ、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッ ド微生物の本製法は、（Ａ）任意の好都合な順序で、 （１）植物宿主を感染する感染性微生物を特定する工程、（２）植物宿主を感染 する感染性微生物を特定する工程、（Ｂ）組込み配列を含有しかつ前記感染性微 生物のゲノム中に組込み可能である組込みベクターを調製する工程、（Ｃ）前記 感染性微生物による農薬の生産を指令することができる発現モジュールをｌｉ製 する工程、（Ｄ）前記組込みベクターの組込み配列内に発現モジュールを入れ、 それによって前記感染性微生物のゲノム内に組込むことができおよび前記感染性 微生物による農薬の生産を指令することができる変形された組込みベクターを製 造する工程、 （Ｅ）前記変形された組込みベクターを用いて感染性微生物を形質転換してハイ ブリッド微生物を製造する工程、（Ｆ）前記ハイプリント微生物を選択する工程 、（Ｇ）選択されたハイブリッド微生物から連続的におよび任意の好都合な順序 で、 （１）感染性微生物が植物宿主内での感染の初期相の間植物＆！織と相互作用す る仕方で植物組織と相互作用する能力を示すハイブリッド微生物を含んでなるサ ブグループ、（２）植物宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリ ッド微生物を含んでなるサブグループ、および（３）先に選択されていない場合 には、農薬を生産する能力を有しているハイブリッド微生物を含んでなるサブグ ループ を選択する工程、および （Ｈ）植物宿主の能力が該植物宿主への農薬または農薬生産性微生物の直接適用 によって改善され得るような条件下に植物宿主の能力を改善することができるバ イブリフト微生物を工程（Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）の最後に実施した工程の生 成物から選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いることができる 農薬生産性ハイブリッド微生物を選択する工程 を含んでなる。

上記工程で用いた「選択」とは、所望の微生物をその生存能力によってまたはそ の独自の性質によって認識し得るような介在または介在の組合わせをいう。

組込みベクターは当業者に公知の技法によって調製することができる０組込みベ クターは、ゲノムが組込み標的となっている生物由来の天然のＤＮＡ配列と相同 であるＤＮＡ配列を有していなければならない、この配列は組込み配列として知 られている。とりわけ好ましい態様において、組込みベクターはｐｃＧ３００で あり、このベクターは、米国メリーランド州２０８５２　、ロフクヴイル、パー クローンドライヴ（ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ）　１２３０１在のアメリカン ・カルチャー・コレクシラン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ）に寄託され寄託番号第５３３２９号が与えられている。

発現モジュールは前述したようにまたは当業者に公知の他の技法によって調製す ることができる。なお、選択可能な特性は発現モジュール中に存在している必要 はない、この特性は組込みベクター内のどこかに存在していることができるが、 本発明内において好ましくは、発現モジュールはｌ）感染性微生物中で作動可能 であるプロモーターを含有するベクターを調製する工程、 ２）感染性微生物中で作動可能である、プロモーター以外の転写および翻訳制御 要素を含有しおよび農薬の生産に対する１個または複数個の構造遺伝子を含有す るポータプルＤＮＡ配列をベクター内に入れて、感染性微生物内で作動可能であ る発現モジュールを含有する発現ベクターを製造する工程、および ３）該発現ベクターから発現モジュールを回収する工程によって調製するのが好 ましい。

前記のように、制御要素、およびポータプルＤ　Ｎ　Ａ配列は、作動性発現モジ ュールをつくるために、当業者に公知の技法によって正しく位置づけされること が必要である。

前段落の第１工程によって調製されたベクターはしばしばプロモーターベクター と呼ばれる。このようなプロモーターベクターは、発現モジュールの製造に対し て感染性微生物からプロモーターを動かすのに有用である。とりわけ好ましいプ ロモーターベクターはプラスミドｐＣＧ６であり、このプラスミドは米国メリー ランド州２０８５２　、ロフクヴイル、パークローンドライヴ１２３０１在のア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されそして寄託番号第５３３２ ８号が与えられている。

前記のように、本明細書中の教示に照らして当業者に明らかである、本発明の実 施において有用である発現モジュールの別の製法がある。さらに、転写および翻 訳制御要素はい（つかの方法によって得ることができる。それらは、ポータプル ＤＮＡ配列中の１個または複数個の構造遺伝子と関連付けられていてもよく、ま たは合成的にまたは座位特異的変異誘発によってつくることもできる。

所望の発現モジュールを製造する場合、該発現モジュールを取り出しそして組込 みベクター中に、好ましくは組込み配列内にクローニングする。この目的は、二 重交差事象を介して発現モジュール、組込みベクターのその部分だけを感染性微 生物のゲノム中にフランキングすることにある０発現モジュールが組込み配列の 外側にクローニングされた事象において、組込みベクター全体を組込むことがで きる。いずれの事象においても、変形された組込みベクターは、感染性微生物に よる農薬の生産を指令することができる。

次いで、変形された組込みベクターを用いて感染性微生物を形質転換しハイプリ ント微生物を製造する。感染性微生物の一部だけが形質転換されるので、このよ うなハイブリッド微生物を選択することが必要である。多くのこのような選択技 法が当業者に知られている。好ましい選択技法は、ハイブリッド微生物中のマー カーまたは特性、例えば、抗生物質耐性について選択することである。

前記ハイブリッド微生物を選択した後、前記のように連続的に、工程（Ｇ）（１ ）〜（Ｇ）（３）において特定されたハイブリッド微生物のサブグループを選択 する０次いで、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブ リッド微生物を、本明細書中で記載のように植物宿主の能力が該植物宿主への農 薬または農薬生産性微生物の直接適用によって改善され得るような条件下に植物 宿主の能力を改善することができるハイブリッド微生物を選択することによって 選ぶ。

組換え体ＤＮＡ技法の使用を含む本発明の態様に対して、ハイブリッド微生物が 内共生関係をつくることができる植物宿主、感染性微生物８、および１個または 複数個の農薬生産性遺伝子の供給源である微生物は、前記のものすべてを含んで いる。しかしながら、１個または複数個の農薬生産性遺伝子の微生物供給源およ び感染性微生物は細菌であることが好ましい、最も好ましくは、感染性細菌はコ リネバクテリウム（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＊）＠またはタラビバクタ− （Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ属の種である。クラとバクテリア・キング　（Ｃ１ａ ｖｉｂａｃｔｅｒｉａｎ旦）亜種シノドンティス（■ｎｏｄｏｎｔｉｓ）および タラビバクター・キング（Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ　亜）亜種キング　（肚旦） が特に好ましい、感染性微生物がタラビバクター（Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ）属 の種である場合、植物宿主はイネ科の植物であることが好ましい、この場合、特 に好ましい宿主はギョウギシバ、サトウキビ、モロコシおよびトウモロコシを含 んでいる。

好ましい農薬はバシラス・チュリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ ■７のデルタ−エンドトキシンである０種々のバシラス・チュリンギエンシス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉ■１ｅｎｓｉｓ）デルタ−エンドトキシン遺伝子 は、例えば、参考までに特にここで引用する、クリエル、ニー、（Ｋｌｉｅｒ、 　Ａ、）等、ディ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）　 、？　＝　７９１〜７９９（１９８２年）およびシュネフ、エイチ、イー、　（ Ｓｃｈｎｅｐｈ、　Ｂ、Ｅ、）、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニー （Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、υＳＡ）　、５　：　２８９３〜２８９７　（１９８１年 ）に記載されている。デルタ・エンドトキシンに対する遺伝子の好ましい供給糎 は、米国メリーランド州２０，８５２　、ロックヴイル、パークローンドライヴ １２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託番号第５３３ ２６号で寄託されているＭ１３ベクター■ＢＴＫ６５である。

このベクターは、殺虫活性およびカナマイシン耐性の両方が発現されるような仕 方でカナマイシン耐性遺伝子に融合された切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）バシラス ・チュリンギエンシス（Ｂ、ｔｂｕ−杜■且匹ｎ）デルタエンドトキシン遺伝子 を含んでいる。

ハイブリッド微生物の最初のスクリーニングにおいて実施されなかった場合は、 ハイブリッド微生物はおそかれはやかれ注目している農薬を生産する能力につい て直接にスクリーニングされなければならない、好ましくは、このスクリーニン グは工程の最も早い実施時点で行なわれなければならず、工程の任意の特定の段 階において生存しているハイブリッド微生物の数、および混合接種材料から農薬 生産性ハイブリッドを特定するために注目の農薬の生産についてのスクリーニン グに対して用いられる技法の力によって決定される。

本発明に従って使用される特定の農薬生産特性についてのスクリーニングは、本 発明の開示から論理的に引き出される通常の推論を実施することにより、当業者 の行ない得る範囲内にあることが理解されよう、農薬生産能についてのスクリー ニングにおいてを用であると考えられる技法は標準的な大要を参照して決定する ことができる。

−ａに、これらのスクリーニング手順は４つのカテゴリーの中のいずれかに人い る。それらは次の（１）〜（４）である、すなわち、（１）生存スクリーニング ；生産される農薬がハイブリッドの生存に必須のものでありかつ増殖培地によっ て提供されない場合、（２）生産される農薬の存在についての分析化学的スクリ ーニング、（３）生産される農薬または化学物質に関連した生物学的活性の発現 についての生物学的スクリーニング、および（４）特定の農薬を生産する生物ま たは生物の群が問題としている化学物質に特異的である抗体との相互作用によっ て特定されるイムノアッセイスクリーニング。特定のスクリーニング技法または 技法の組合わせの適合性は問題としている農薬によって決められる。従って、生 存スクリーニングは、窒素が不足した培地上での生存によって自らの固定窒素を 生産することができるハイブリッド微生物を特定することにおいてとりわけ有用 である。生物学的スクリーニングは、抗菌剤または殺菌剤を生産することができ るハイブリッド微生物を特定する場合にとりわけ有用である。この種類のとりわ け好ましいスクリーニング技法は、ハイブリッド微生物によって生産された抗生 物質に感受性の生物の培養物をハイブリッドの混合培養物上に重層しそして一層 のスクリーニングのために感受性生物が増殖できない領域から抗生物質を生産す るハイブリッドまたはハイブリッドの群を特定して取り出すことを含んでいる。

イムノアッセイ技法は、注目している農薬が高分子、例えば、ポリペプチドであ る場合にとりわけ適当である。いずれの場合においても、問題としている農薬の 既知の作用に対する生物学的スクリーニングは、ハイブリッド微生物の個々の培 養物を用いて、該培養物の数を、農薬生産性微生物に関連した他の選択可能な特 性に対して予備的なスクリーニングを行なうことによって扱いやすいレベル、例 えば、１０”〜１０３の培養物までしぼった後に行なうことができる。従って、 殺虫性化合物を生産するハイブリッドは、例えば、感受性の昆虫がハイブリッド の培養物上で生存できないことによって特定することはできない、このようなス クリーニングは多数のコロニーのスクリーニングを必要としおよび結果がわかる まで長時間（期間）を必要とする不都合を有しているが、それにもかかわらず、 注目しているＭ薬を生産する能力をもったハイブリッドを特定することができる 。

スクリーニング法を適当に変えることによって、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍ）において行なわれるように、または極少量の酸素の存在において微好気性細 菌によって行なわれるように、嫌気的に窒素を固定することができるハイブリッ ドを本発明に従って調製することができる。特に、窒素固定能についてのスクリ ーニングの間は、窒素を含まない増殖培地において酸素を最小にするかまたは除 去しなければならない。

このような嫌気性の窒素固定ハイブリッドを植物宿主との内共生関係に入れよう とする場合、ハイブリッドは、作物植物中に通常には見い出されない、酸素を含 まないまたは低酸素量の環境を植物宿主につくらせる遺伝学的材料、例えば、リ ゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種の中に含まれている遺伝学的材料も含んで いなければならない、この理由のため、好気性窒素固定細菌の使用が好ましい。

ハイブリッド微生物の最終グループの中のどれが植物宿主との内共生関係に入い ることができそれによってハイブリッドによって生産された農薬が他の方法で獲 得可能な農薬に対する補充として植物に利用され得るかを決定するために、通常 、予備的な収量増加についてのスクリーニング等を行なうことが必要である。細 胞融合によって製造された窒素固定ハイブリッド細菌に対しては、例えば、農薬 、例えば、固定窒素が不足した環境中で宿主植物を栽培し、そして適当な期間、 例えば、６週間の栽培後の範型を、前述した方法によって選ばれた安定な融合ハ イブリッド細菌に例えば注射によって感染された同じ環境の同じ植物の範型と比 較することによってこのようなスクリーニングを達成する。窒素を固定する農薬 生産性細菌の場合、経験が示すところによれば、５〜７の最良の融合ハイブリッ ドを試験することにより、安定な融合ハイブリッドの好気的に大気中の窒素を固 定する能力および宿主植物との内共生関係に入いる能力によるものと考えられる 、窒素不足土壌で生育する宿主植物における統計的に有意な収量増加を生じ、さ せ得る３〜４の安定な融合ハイブリッドが特定される。

本発明に従って形成される内弁生性農薬生産性微生物は、自然または人工の遺伝 学的技法によってさらに変形して、植物宿主に対する農薬の供給源としてのその 能力を向上させることができる。とりわけ、微生物は低温に対するその耐性を減 少させるように変形することができ、それによって意図しない毎年に及ぶハイブ リッド微生物の増殖を阻止することができる。同様に、本発明に従って形成され た内弁生性ハイブリッド微生物は、阜ばつ、病気または他の生理学的ストレスに 対するその安定性を高めるように変形することができる。

これに関して、ストレス条件下でのハイブリッドの安定性、および病原状態への 自然のまたは強制的な復帰の可能性を最小にする能力が商業的微生物製品におい て望ましい、さらに、ハイブリッド微生物は農薬を排出するように変形すること ができる。理想的には、本発明に従って形成された微生物は、例えば、問題とし ている植物宿主によって特異的にまたはほぼ特異的に生産される栄養上の補充を 要求する変異体を選択することによって、植物宿主体外では増殖できないように 変形しなければならない０株、例えば、アゾトバクタ−（紅■７の株に対する遺 伝学的操作および変異体選択の技法は当業者に熟知されており、本発明に従って 形成された安定なハイブリッドの上記したおよび同様の遺伝学的操作を行なうの に適当であると考えられる。

本発明に従って形成された、農薬を生産する能力および植物宿主との内共生関係 に入いる能力を有する安定なハイブリッド微生物を用いて多くの方法で農薬を調 製することができる０例えば、本発明に従って形成されたハイブリッドは実生中 に注射することができ、または該ハイブリッドを用いて、種子上に被覆される生 分解性栄養素担体材料とバイブリフトとを結合させることによって問題としてい る植物宿主の被覆種子を形成することができる。同様に、本発明に従って形成さ れたハイブリッドを用いて、宿主植物の種子に微生物を直接に適用することによ って、感染された種子製品を形成することができる。また、噴霧等による栽培宿 主植物の葉、茎および根および周囲の土壌への適用に対して、本発明に従って形 成された微生物を水および他の適当な水剤（ｄｒｅｎｃｈ）成分と混合すること により農業用土壌水剤を調製することができる。

特定の問題または環境に対する本発明の教示の通用は本明細書に含まれている教 示に照らして当業者が行ない得る範囲内にあることが理解されよう。本発明の範 囲内にある方法の例示およびそれによって得られる微生物生成物は以下の例によ り明らかとなる。

■−よ −の　、′・に　ることがで　かっトウモロコシ　ルチ（Ｅｒｖｉｎｉａ　Ｓｔ ｅｗａｒｔｉｉ）か゛の　ムハイブリッド１坐星製 好気的に窒素を固定し得ることが知られている種アゾトバクタ−・ビネランジ（ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）の細菌約１０１個を選んだ、 ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンの両方に耐性であることが知られて いるエルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　５ｔｅｓｅａｒｔｉｉ）変異 体の株の細菌約１０”個も選んだ、これら２つのタイプの細菌の融合ハイブリッ ドを、上記で引用したウニイス（Ｗｅｉｓｓ）の方法の変法によって形成した。

中間対数相（ｍｉｄ−１ｏｇ　ｐｂａｓｅ）にある増殖中の細菌を、１ミリモル 濃度のＥＤＴＡを含みｐＨ７を有しそして１２％のスクロースが添加された培地 中で１００マイクログラム／ミリリツトル濃度のリソ゛チームおよび５マイクロ グラム／ミリリンドル濃度のＤＮＡ−アーゼを用いて処理した。１０分後、初め の細菌のプロトプラストおよびスフ二ロプラストが形成された。

次いで、温度を０℃まで下げそしてプロトプラスト形成溶液を洗い流した。得ら れたプロトプラストを０℃の１２％スクロース溶液中に入れた０次いで、この溶 液に約６，０００の分子量のポリエチレングリコール４０％を補充して、１０〜 １５分間にねたうてプロトプラストおよびスフ二ロプラスト融合を誘導した。こ の融合細菌を遠心分離によって回転させて落としそして１２％スクロースを加え た完全増殖培地中に０℃で４時間再懸濁した。次いで、温度を３０℃まで上げそ してこの温度に２時間保ち、その後このハイブリッド融合生成物を、追加のスク ロースを含まない完全増殖培地に２時間移した。

このハイブリッド融合生成物を、カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）　等、「フォー スト・アソシエイション・ビトゥウィーン・バイヤー・プラント・アンド・バク チリアル・セルズ・イン・ヴイトロ（Ｆｏｒｃｅｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　 Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｅ １ｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）　Ｊ　、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖｏｌ、 ２２　、　Ｎａ５４８２．３９３〜３９５頁（１９７４年）に記載ノパーク（Ｂ ｕｒｋｅ）の窒素不合培地器こ移しそこで増殖させた。この培地は窒素を含んで おらずそして添加された１００マイクログラム／ミリメートル濃度のストレプト マイシンおよび５０マイクログラム／ミリリットル濃度のテトラサイクリンを含 んでいた。好気的に大気中の窒素を固定する能力および最初に導入されたエルウ ィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）株に関連したスト レプトマイシンおよびテトラサイクリン耐性の両方を示す融合生成物のみが約３ 日間の増殖期間後この培地上に生存していた。

この培養物からの混合融合ハイブリッドの試料を用いて、高さ約３〜４フイート （０，９〜１．２ｍ）のトウモロコシ実生の茎組織の第１節と第２節との間に注 射することによってこの実生を感染させた。４日後、このトウモロコシ植物体を 横断面に解剖して植物体の前方（頂部）に移動した細菌を回収した。なぜならば 、エルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａｓｔｅｗ肛旦Ｕは、植物の病気応 答系によって認識および破壊されることなく植物の維管束系を通って広がること によって感染の初期相の間植物組織と相互作用するからである。トウモロコシ植 物の維管束系を通って広がる最大の能力を有する融合ハイブリッドは一般に第５ 節と第６節の間に見出された。

トウモロコシ植物体の第５節と第６節との間に見い出された融合ハイブリッド細 菌を、前掲のカールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）等によって記載のパーク（Ｂｕｒｋ ｅ）の窒素不合培地で３日間培養した。３日後、この窒素不合培地からの混合接 種材料を再度用いて、高さ約３〜４フイート（０，９〜１．２ｍ）のトウモロコ シ実生の茎組織の第１節と第２節との間に注射することによってこの実生を感染 させた。約３日後、植物を前述のように横断面に解剖して植物体の前方まで移動 した細菌を回収した。再度、広がる最大の能力を有する融合ハイブリッドが第５ 節と第６節との間に見出された。

次いで、トウモロコシ植物体のこの部分から回収した融合ハイブリッド細菌を、 パーク（Ｂｕｒｋｅ）の窒素不含培地上で独立したコロニーとして増殖させた。

２５の最も活発なコロニーを選択し、その各々を用いて注射によって２５のトウ モロコシ植物体を感染させた。３週間後、感染したトウモロコシ植物体において いかなる病気の徴候も目で認められなかったコロニーを選択した。これらのコロ ニーの中から、窒素不含培地上での最も活発な増殖、植物体を通しての最大域の 広がりおよび病気の徴候の最小の発現を示した７つのコロニーを、予備的な収量 試験に対して選択しそして融合体＃１〜＃７とした。

予備的な収量試験において、１０ｃｍのパーライト上に１５０の洗浄滅菌砂を含 む平地（３０ｅｓａ　ｘ　４６ａ＋１）に均一な間隔で２４個のトウモロコシの 種子を播種した。この平地を温室内に（約２２〜２７℃で）保ちそして１日に２ 回脱イオン水で水やりをした。１０日目に出発して（種子窒素を使い尽くすよう に）、実生に１週間に３回栄養溶液を与えた。１ｆｆｉの溶液は、その唯一の窒 素源として６マイクロモル濃度の硝酸イオンを含んでいる変形ロングアシュトン （Ｌｏｎｇ　Ａｓｈｔｏｎ）ミックスであった。このロングアシュトンミックス は６ミリモル濃度およびＯミリモルＱの硝酸イオンを含むようにさらに変形して それぞれ以下の比較試験ＡおよびＣに用いた。実験を６週間実施し、その時点で 植物体の地上部を収穫し乾燥した。惑染植物を含めるために、細菌株を１０日目 に（施肥開始と同時に）注射によって導入した。各分析は３連（各処理について ２４植物体の平地３つ）で実施した。データは統計的分析に付した。７種の異な る細菌融合体を上述のようにエルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｔ ｅｗａｒｔｉｉ）およびアゾトバクタ−・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ 　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）との間の複数のスクリーニングによって選択しく融合 体＃１〜＃７）、これらをこの実験に用いた。各平地当りの実際の範型収量デー タ（３つの平地の平均）は以下の通りである。

Ａ、なし　６ミリモル　１１６．．８　−Ｂ、なしく対照値）　６ミリモル　３ ４．８　−Ｃ０なし　なし　１９．２　− 融合体＃１　６ミリモル　４４．８　２９融合体＃２　６ミリモル　３９．６　 １４融合体＃３　６ミリモル　７２．４　１０８融合体＃４　６ミリモル　３３ ．２　−５融合体＃５　６ミリモル　５４．８　５７融合体＃６　６ミリモル　 ２５．２　−２８融合体＃７　６ミリモル　５６．８　６３融合体番号１，３． ５および７についての結果は統計的に有意であった。

接種を行なわなかった比較試験Ａはロングアシュトン栄養溶液中最適量の硝酸塩 を含んでおり、十分に窒素が与えられた土壌で生育したトウモロコシの場合に予 期される結果を示している。硝酸塩を添加しなかった比較試験Ｃは、トウモロコ シの種子に含まれていた残留硝酸塩にのみ基づいて予想され得る収量を示してい る。約６マイクロモルの量の窒素を含をする対照値を示す比較試験Ｂは、不十分 な窒素が与えられた土壌において予想される成長を示している。融合生成物番号 ６に関する範型の減少は、たとえいずれの植物体にも目で認められる病気の徴候 が示されなかったとしても、明らかに目で認められない病原性作用によるもので ある。融合生成物番号４の結果は統計学的に有意ではない、融合生成物１，３゜ ５および７の結果は次のことを示している。すなわち、本発明の方法は、好気的 に大気中の窒素を固定することができかつトウモロコシとの内共生関係に入いる ことができる少なくとも４種の安定な融合ハイプリント生成物を製造することが できた。そしてそれによって本発明の融合生成物と共に窒素ストレス条件下で生 育するトウモロコシは、本発明に従って形成された細菌を用いなかった対照より ２９％〜１０８％多い収量を生み出した。

■−１ の　−−に　−る゛　４　゛９サトウ　゛イコンとの　丑　、に　いることがで 　る、アシドバク、ユニよＪミ乞Ｚジニ堕胚違１匹上王」暉徂ハμ■Ｕ−江よで コ宸−−ペクーｉウム・ラメ７　シエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓか°の融合ハイブリッド　の°制 アゾトバクター・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ ）種の細菌約１０”個を選んだ、ストレプトマイシンおよびカナマイシンの両方 に耐性であるアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｗｅｆａｃｉｅｎｓ）変異体の株の細菌約１０１個を選んだ０例１と 同様にして、これらの細菌の間でプロトプラスト融合を行なった。融合したプロ トプラストを、１００マイクログラム／ミリリンドル濃度のストレプトマイシン および５０マイクログラム／ミリリンドル濃度のカナマイシンが補充された例１ に記載したと同様のパーク（Ｂｕｒｋｅ）の窒素不含培地に移した。３日後、好 気的に大気中の窒素を固定することができかつストレプトマイシンおよびカナマ イシン耐性に関連した病原性細菌からの遺伝学的材料を有していることができる 安定な融合ハイブリッドのみが生存していた。

この培養物からの混合接種材料を、参考までに特にここで引用するニー、ジー、 マチイセ（Ａ、Ｇ、Ｍａｔｔｈｙｓｓｅ）等によるマイジオロジカル・プラント ・パソロジ−ＣＰｈ　５ｉｏｌｏ　１ｃａｌ形１１」獲す遼ヨ四は）、皿、２７ 〜３３および２１．３８１〜３８７　（１９８２年）に記載の方法によってニン ジン組繊細胞の悲濁培養物中に導入した。約３時間後、感染の初期相の間アグロ バクテリウム・ツメファシェンス］左ｌ堕弓μｍ四　■μ江鱈力１吐と植物組繊 細胞との初期相互作用と同様な方法でニンジン細胞に結合することができる融合 ハイブリッドおよびニンジン細胞を、滅菌蒸留水で３回洗浄することによって結 合していない細菌から分離した。付着性のハイブリッド細菌を有するニンジン細 胞を隼離しそして再度洗浄した。得られた懸濁液を遠心分離によって回転で落と し、細胞壁および付着性ハイブリッド細菌からなる得られたベレットをパーク（ Ｂｕｒｋｅ）の窒素不含培地上に３日装置いた。

上述のような細胞結合法を繰り返しそしてこのようにして選択した融合ハイブリ ッドを独立した個々のコロニーとして窒素不含培地上で増殖させた。増殖の３日 後、２５の最も活発なコロニーを選択した。

各コロニーを用いて、このコロニーにつけておいたビンを植物体と根との間の胚 軸の領域に挿入することによって、高さ８〜１０インチ（２００〜２５（ｂｍ） のサトウダイコン実生２５個体を感染した。３週間後にサトウダイコン実生に痩 瘤または腫瘍を形成しなかったハイプリントコロニーを一層のスクリーニングに 対して選択した。

３週間後に目で認められるいかなる病気の徴候をも示さなかった各感染サトウダ イコンの根を多数の横断面に解剖した。

ハイブリッド細菌が広がった植物体の根の下方への距離を記録した。２５の安定 な融合ハイブリッドの中から５つを、窒素不合培地上での増殖の活発性、植物体 への注射に関連した病気の目で認められる徴候の不存在、および植物組織を通っ て広がり得る能力に基づいて、予備的な収量試験に対して選択した。融合体＃１ 〜社合体＃５と名付けたこれらの５つの融合ハイブリッドを以下のように予備的 収量試験に付した。

１０３のパーライト上に１５ｃｍの洗浄滅菌砂を含む平地（３００１Ｘ　４６ｃ ｍ）に２４の発芽したサトウダイコン種子を均一な間隔で植えた。平地は温室内 に（約２２〜２７℃に）保ち、１日に２回脱イオン水で水やりした。１０日目に 出発して（種子窒素を使い尽くすように）、実生に１週間に３回栄養溶液を与え た。Ｈの溶液を適用しそして排水した。ロングアシュトンミックスはさらに、６ ミリモルおよびＯミリモルの濃度の硝酸イオンを含むように変形して、それぞれ 下記の比較試験ＡおよびＣに用いた。

実験を６週間行なった。その時点で、植物体を収穫し９５℃で１週間乾燥した０ 次いで、範型データを集めた。感染植物を含む平地に対して、１０日目に（施肥 開始と同時に）注射によって細菌株を導入した。各分析を３連（各処理について ２４の植物体の平地３つ）で行ない、そして各データを統計学的分析に付した。

５種の異なる細菌融合体を上述のようにアグロバクテリウム・ツメファシェンス （Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびアゾトバク タ−・ビネランジ（Ａｚｏｔｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）の間の 複数のスクリーニングによって選択しこの実験に用いた。各平地当りの実際の範 型収量データ（３つの平地の平均）は以下の通りである。

Ａ、なし　６ミリモル　４４．７　− Ｂ、なしく対照値）　６ミリモル　８．８−Ｃ８なし　なし　５．２− 融合体＃１　６ミリモル　８．０　−９融合体＃２　６ミリモル　１２．４　４ １融合体＃３　６ミリモル　６．９　−２２融合体＃４　６ミリモル　２４．６ 　１８０融合体＃５　６ミリモル　１４．９　６９融合体番号２．３．４および ５に関する結果は統計的に有意である。

接種を行なわなかった比較試験Ａ、ＢおよびＣは、前記例１の非接種比較試験Ａ 、ＢおよびＣと同じ意味を有している。

融合生成物＃３は、たとえいずれの植物体においても目で認められる病気の徴候 が見られなかったとしても、目で認められない病原性作用を生じたものと思われ る。この予備的収量データにより次のことが確められた。すなわち、本発明の方 法は、好気的に大気中の窒素を固定することができかつす「ウダイコンとの内共 生関係に入いることができる最低３種の安定なハイブリッド細菌（融合体＃２． ４および５）を製造することができ、それによって窒素ストレス条件下で生育し たサトウダイコンは接種を受けなかったサトウダイコンについて得られた収量よ り４１〜１８０％多い収量を生Ｂた。

上［ 最適の窒素施肥に関連した濃度、６ミリモル濃度で硝酸塩の形の窒素を受容する サトウダイコンに融合生成物を適用したという点を除いては例２を繰り返した。

接種を受けなかった比較試験Ａによって達成された場合より有意な収量増加は接 種を受けたサトウダイコンにおいて観察されなかった。これらの結果は、例２に おける融合生成物に関連した収量増加が、植物宿主によって使用される、融合生 成物との間の内共生関係によるものであったことを確認している０例２に報告さ れた収量増加が融合生成物によって提供された成長調節物質またはホルモンの結 果であったとすれば、同様の増加が例３において観察されたはずである。

宿主との内共生関係の一層の証拠は、感染植物からの（維持された抗生物質耐性 マーカーの発現による）細菌の形再単離Ｃｆｏｒｍ　ｒｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ） およびダラム染色を用いて光学顕微鏡によって提供される。さらに、ハイブリッ ド細菌は植物体の全体にわたって見い出すことができる。その所在は感染部位に 限定されない、植物組織中のハイブリッド細菌の数は、低濃度の硝酸塩条件下で 生育したトウモロコシ植物体においてＩｇ（範型）当り約１０５であった。

五−玉 サツマイモにおいて　るための＄−”’７．ｔ−る融合ハイブリッドの制′告 ストレプトマイシート　ニス、イボモニア（７は、モーニンググローリー（熱帯 アメリカ原産ヒルガオ科イボメア属）およびサツマイモ〔イボ舌エア・バタタ（ ｎ匹匹Ｌｂａｔａｔａ）　）を含むイボモニア（Ｌ僚μ徂り一種の病原体である 。

この生物は、後者の線維根および肉質根（ｆｌｅｓｈｌｙ　ｒｏｏｔ）の両方に 侵入するものであり、そして適当な農薬生産性細菌と融合し得る候補の内部寄生 性植物である。このような相手はニス、アヴエルミチリス（Ｓ、ａｖｅｒｖｉｔ ｉｌｉｓ）であり、この細菌は、種々の昆虫病原体、例えば、線虫、ダニおよび 昆虫に対して有効であるアヴエルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）と呼ばれる 化合物の系列を生産する。キャンベル、ダブり二一、シー。

（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｗ、Ｃ，）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２１　： 　８２３〜８２８（１９８３年）、プロトプラスト融合の技法を用いて、サツマ イモ組織と結合しかつアヴエルメクチンを生産することができる、ニス、イボモ ニア（７とニス、アヴエルミチリス（Ｓ、ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）とのハイプ リントを製造した。

米国メリーランド州２０８５２　、ロフクヴイル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パー クローンドライヴ１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ンに寄託番号第５３３１９号で寄託されているニス、アヴエルミチリス（Ｓ、ａ ｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）株Ｓ　Ａ　−５（ｎｉｃ）の胞子（１０”）および米国 メリーランド州２０８５２　、ロンクツィル、バークローンドライヴ１２３０１ 在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号第５５３２０号 で寄託されているニス、イボモニア（７野生型５Ｉ−１をそれぞれ３０Ｍ１のＹ ＳＧＩおよびＹＳＧ２ブロス（１４％スクロースおよび０．２％グリシンを有す る変形ＹＳＧＩ）に接種した。　ＹＳＧＩは、参考までに特にここで引用するチ ャーター、グー。エフ。

（Ｃｈａｒｔｅｒ＋に、Ｆ、）等の方法、タル、ドブ、マイクロ、バイオ。

イムツル（Ｃｕｔ、Ｔｏ　、Ｍｉｃｒｏ、Ｂｉｏ、Ｉｍｓ＋ｕｎｏ１．）　９６ 　：　６９〜９５　（１９８２年）に従って調製した０両方の培養物を３０°に おいて勢いよく通気しながら（２４０ｒｐ＋ｓ）　２４時間インキュベーション した。プロトプラストを両方の株から調製し、そして参考までに特にここで引用 するホープウッド、ディー、ニー、　（Ｈｏｐｗ−ｏｏｄ、Ｄ、Ａ−）等、モル 、ジエン、ジエネフト、　（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１６２　：　３０ ７〜３１７　（１９７８年）に記載のようにプロトプラスト緩衝培地（ｂｕｆｆ ｅｒ　ｗｅｄ）　Ｐ中に懸濁した。５ｌ−１プロトプラストに２５４１−の紫外 線〔モデル（Ｍｏｄｅｌ）ＵＶＧＬ−５８ミネラライトランプ０１ｉｎｅｒａｌ ｉｇｈｔ　Ｌａｍｐ）　、Ｕ　Ｖ　Ｐ社（ＵＶＰ　Ｉｎｃ、）　、カリフォルニ ア州サンガブリエル（Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ）在〕を照射源から８１の距離で ２分間照射して１％の細胞生存を与えた。

ＵＶ照射を受けた５ｌ−１プロトプラスト（１０″Ｔ）を１０′の５Ａ−５１０ ドブラストと混合し、４℃において５分間６０００ｒｐ−の遠心分離〔ソーヴア ル（Ｓｏｒｖａ　］　１）　ＳＳ　−３４０−ター〕を行なうことによってこれ を沈殿させた。沈殿したプロトプラストを０．１−のｗｅｄ　Ｐ中に穏やかに再 懸濁し、そしてｌ１ｌｅｄＰ中４０％（ｗｔ／Ｖｏｌ）　ＰＥＧ　８０００　［ シグマ（ＳｉｇＩＩ＋ａ））　０．９　ｔｌを添加し穏やかに混合した。２５℃ で３分間インキュベージクンを行なった後、ＰＥＧ処理したプロトプラストをｗ ｅｄ　Ｐで１０倍に稀釈し、遠心分離しそして前述のように＋１ｌｅｄＰ２−中 に懸濁した。融合プロトプラストの試料（０，１ｄ）を３０℃においてプロトプ ラスト再生プレート（ＲＭ１６：酵母抽出物０．２％、カザミノ酸（ｃａｓａｍ ｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）　０．０１％、スクロース１５％、グルコース１％、オー トミール０．３％、Ｌ−プロリン０．１％、’ＡｇＣ１ｔ　−２Ｈｚ０　１％、 ＮａｚＳ８４０．０２５％、寒天２％、微量元素〔前記引用のホープウッド、デ ィー、工＋、（Ｈｏｐｅｗｏｏｄ＋Ｄ、Ａ、））　０．２％）上に置いた。オー トクレーブを行なった後、次の滅菌溶液を添加した：　ＣａＣｊ２２０＋＋＋Ｍ ；ＫＨｚＰＯｉ　５　ｍＭ、ＭＥＳ　（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン は〕、緩衝液（ｐＨ６，５）　、２５ｍＭ、再生したコロニーを、最小寒天ＨＭ Ｍプレート〔ホープウッド・ディー、ニー。

（Ｈｏｐｗｏｏｄ　Ｄ、Ａ、）　％バクチリアル・レヴ、（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ 　Ｒｅｖ、）、３１：３７３〜４０３　（１９６７年）〕上でセルロースアセテ ート膜フィルター〔孔径０．４５μ、直径８２ｍ、マイクロ・フィルトレージョ ン・システム（Ｍｉｃｒｏ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）、日本〕に よってレプリカ培養して原栄養株をスクリーニングした。この後者を引き続いて ＹＤＣプレート（酵母抽出物０．４％、麦芽エキス１％、デキストロース０．４ ％、マルトース０．４％、寒天１．５％）上にパッチング（ｐａｔｃｈ）　した 、オートクレーブに付した後、ＭｇＳＯ４（１０ｎＭ）およびＣａＣｉｔ　ｚ　 ６．２５ｍＭを添加した。

細胞が胞子を形成するまでこのプレートを７日間インキュベーションし、５ｌ− １コロニーの形態を有しかつＹＤＣプレート上でメラニンを生産できないものを 、新たに卵からかえったブラインシュリンプを用いた毒性試験によってアヴエル メクチン活性に対してさらにスクリーニングした。コロニーの１ｍ”片を９６ウ エｌしのマイクロタイターディツシュ（ｎｕｎｃ）のウェルに入れ、０．０１ｍ １のメタノールを添加した。ブラインシュリンプ（０，１−当り約１０）を添加 し、そして麻痺の時間を記録し対照と比較した０株５Ａ−５は２２℃において１ ５分間内に完全な麻痺を引き起こした。

１０’の再生したコロニーの中で、２７０はＳｌコロニーの形態を示した。後者 の１０％はアヴエルメクチン活性（１時間以内の麻痺）を示した。そしてこれら の陽性のクローンの中の６つをさらにサツマイモ１片上に接種して植物組織中で の結合能および増殖能についてアッセイを行なった。モーヤー、ジェイ、ダブリ ュー、（Ｍｏｙｅｒ＊Ｊ、Ｗ、）等、フイトパソロジ−（ハム並紅胚旦■’）　 、７４：　４９４〜４９７（１９８４年）、これら６つともすべてサツマイモ薄 片上で増殖した。植物Ｍｉ織から回収したこれらの中の２つはアヴエルメクチン 活性を保持しえ　ＤＮＡ　いた　バイブＩ　゛イゼーシッン 細菌種タラビバクター・キンリ（Ｃ１ａｖｉｂａｃｔｅｒ　ｘ２１旦）亜種シノ ドンティス（ｎ肚鼓１ｎ）（Ｃｘｃ）および亜種キンリ　（粒旦）（ＣＸＸ）は それぞれギョウギシバおよびサトウキビの維管束居住体（ｉｎｈａｂｉ　ｔｏｒ ）である、参考までに特にここでデイヴイス。

エム、ジェイ、　（Ｄａｖｉｓ、Ｍ、Ｊ、）等、インド、ジエイ、シスト。

バタテリオル、　（Ｔｎｔ、Ｊ、Ｓ　ｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、３４　 ：　１０７〜１１７（１９８４年）を引用する。これらの細菌は、他の商業的に 有用な作物、例えば、モロコシ中で増殖することができる。参考までに特にここ でリアオ、シー、エイチ、　（Ｌｉａｏ、Ｃ，Ｈ，）等、フィトパソロジ−（Ｐ ｈ　ｔｏ　ａｔｈｏｌｏ　）　、７１　：　１３０３〜１３０６（１９８１年） を引用する。ＣｘｃおよびＣｘｘは野外（ｆｉｅｌｄ）およびせ味種トウモロコ シ（スウィートコーン）においても病原性の作用なしに増殖し得ることが見い出 された。以下の例は、どのようにして生物Ｃｘｃを、野外およびスウィートコー ンの害虫である鱗翅目の昆虫、例えば、オオバコガの幼虫〔ヘリオザス・ズイー （肋旦ｄ）およびアワツメイガ〔ピララスタ・ヌビラリア（ｈ組旺頃ｎｕｂｉｌ ａｌｉａ）　）　ニ対して活性である殺虫性タンパク質、バシラス・チュリンギ エンシス変種りルスタキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ’　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｅｓｉｓ 　ｖａｒ。

１（ｕｒｓｔａｋｉ）　ＨＤ−７３のデルタエンドトキシンを生産するように変 形し得るかを示している。

入みベタ　−の８１ 農薬に対する遺伝子は好ましくは、プラスミド伝達によるクローン化遺伝子の他 の生物への伝達を防ぐようにＣｘｃに対する組込みベクター上に保持されている ０組込みベクターは、そのゲノムが組込み標的となっている生物からのＤＮＡの 天然配列中にまたは該配列の隣近に挿入される外来遺伝子配列を有している。サ ウンダ−、シー、ダブり二一、　（Ｓａｕｎ−ｄｅｒ、ＣＪ、）等、ジェイ、バ タテリオル、　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１５７：７１８〜？２６（１９ ８４年）を参照されたい０組込みベクターは通常に許容宿主、例えば、イー、コ リ　（Ｅ、Ｃｏ１１）またはビー、サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｔｌｉｓ）中で増 殖させる。

外来農薬遺伝子配列の操作はイー、コリ　（Ｅ、Ｃｏ１１）またはビー、サブチ リス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）中で、これらの宿主に対する複製ベクターを用い て行なう、所望の遺伝子配置が製造されたら、その配置を取り出してＣｘｃクロ ーン化ＤＮＡセグメントに隣接したまたは該セグメント内のＣｘｃ組込みベクタ ーにクローニングし、そしてこの組込みベクターを許容宿主中で増殖させる。次 いで、精製した組込みベクターを用いて所望のＣｘｃ宿主を形質転換し、外来遺 伝子配置中に保持されているマーカー、例えば、薬剤耐性について選択する。

ベクターはＣｘｃにおける増殖のための複製起点を保持していないので、ベクタ ーはＣｘｃ中で存続するためにＣｘｃ染色体と組換えしなければならない０組換 えは、組込みベクター上のＣｘｃ相同配列によって容易となる。次いで、安定な 耐薬剤性の形質転換体を、農薬遺伝子生産物、例えば、ビー。

チュリンゲネシス（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　ｅｎμ＋ｉｓ）エンドトキシンの生産に ついてスクリーニングする。

廷換久生旦Σ人珪 以下の方法で使用する制限酵素、Ｔ３ＤＮＡリガーゼおよび子ウシ腸アルカリホ スファターゼを、ニューイングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　ＢｉｏＬａｂｓ）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはベーリンガー・マンハ イム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｗ＋）がら購入した０反応条件は 製造業者の推奨に従った。

ＴＢＩＡ　Ｄ旦Ω員呈 タラビバクター・キンリ　（Ｃａｖｉｂａｃｔｅｒ　ｘ　ｌｉ）亜種シノドンテ ィス（す１式旦■Ｓ）　（ＴＢＩＡ、米国メリーランド州２０８５２　、ロンク ヴイル、バークローンドライヴ１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクシシンに寄託番号第３３９７３号で寄託されている〕の３１培養液を８ ８培地〔デイヴイス、エム、ジェイ、（Ｄａｖｉｓ、？１．Ｊ、）等、サイエン ス（を１Ｍ匹搬−２１０＝１３６５〜１３６７　（１９８０年）〕中で好気的に ２８℃において中間指数段階まで増殖させ、その時点でグルコースおよびグリシ ンをそれぞれ２％および０．１％の最終濃度まで添加した。１７時間の増殖後、 細胞を遠心分離し、溶解緩衝液［５０ｍＰｌグルコース、２５＋ｓＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣｆ　（ｐＨ８，０）　、ｍＭ　ＥＤＴＡ　）を用いて洗浄しそして同緩衝 液ｚｗＡｌ中に再悲濁した。次いで、塩酸グアニジンおよびザルコシル（ｓａｒ ｋｏｓｙｌ）をそれぞれ７Ｍおよび４％の最終濃度まで、およびＴｒｉｓ−ＣＩ ！（ｐＨ８，０）を２０ｓ＋Ｍまで、およびＥＤＴＡを２０ｗ＋Ｍまで添加する ことによって細胞を溶解した。参考までに特にここで、サング、エム、ティー、 　（Ｓｕｎｇ。

阿０丁、）等、ジェネテインク・エンジニアリング・イン・ザ・グランド・サイ エンシス（む朋復旦上吐江朋旦」」工」■Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　、 エヌ、ジェイ、パラブーロス（Ｎ、Ｊ。

Ｐａｒａｐｏｕｌｏｓ）（ｍ）　、３９〜６２頁〔ブレガー・サイエンティフィ フク・プレス（Ｐｒａｅｇｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　１９８ １年〕を引用する。最終容量は２０ａｆであった。５０℃で一夜間のインキュベ ーションの後、この溶解懸濁液に４−の蒸留水を添加し、この混合物を５Ｓ３４ ベフクマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ローターで２０℃において１０分間１２．００Ｏ ｒｐｍで回転した。この操作は上澄に残存する核酸から細胞壁および膜片を分離 するために行なつた。

上澄液をエチジウムプロミド（最終濃度６００Ｒ／＠ｌに等しい）と混合し、こ れを、２段塩化セシウム勾配に付してペックマンＳ−２７０−ターにより２０℃ において２６００Ｏｒｐｍで２４時間遠心分離した。上段は最終密度１．５５に 対して４．４２Ｍ　Ｃ５Ｃｊ！、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ　（ｐＨ８，０）お よび１６Ｍ　ＥＤＴＡからなり、下段は最終密度１．７に対して５．７　Ｍ　Ｃ ｓＣ１および０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｆ（ｐＨ８，０）からなっていた、ＤＮ Ａバンドを抽出し標準的技法によって精製した。参考までに特にここで、マニア チス。

ティー、（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ）等、モレキュラー・クローニング。

ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａ ｂ−ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ）　（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ ラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１ ９８２年〕を引用する。

丁ＢＩＡ　フラグメント ＴＢＩＡ染色体ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａ１を用いて部分消化し、約１ｋｂ〜 ２５ｋｂの範囲にあるＤＮＡフラグメントを得た（０．７％アガロースゲル電気 泳動によって示された）。約１０ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＴＢＩＡ　ＤＮ Ａの部分５ａｕ３Ａ１消化物をスクロース勾配によって遠心分離することにより 単離した。エム、アール、イーエル−ゲラエリ−ＣＭ、Ｒ，Ｅ１−Ｇｅｗｅｌｙ ）およびアール、ビー、ヘリング（Ｒ，Ｂ、Ｈｅｌｌｉｎｇ）、アナル、バイオ ケム、（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１０２：　４２３〜４２８（１９８０ 年）。

ＴＢＩＡ　ＤＮＡヱ立久ｊ７上■久旦二三ヱ五クローニングベクターｐＵｃ１９ 　にニューイングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ）１９８５〜Ｂ６力タログ９０〜９１頁〕を制限酵素Ｂａ５Ｈｒを用いて消 化し、付着端を有する線状プラスミドをつくった。自己再連結を防ぐために、子 ウシ腸アルカリホスファターゼで末端を処理した。上記引用のマニアチス、ティ ＋、　（？１ａｎｉａｔｉｓ、丁、）等０次いで約１０ｋｂの５ａｕ３Ａ１消化 ＴＢＩＡフラグメント　（上記方法により単離）をＴ４−　ＤＮ＾リガーゼを用 いてｐυＣ１９の特有のＢａｍＨ１部位に連結した。正確な環状造成物を得るた めに用いたベクター（ｐＵｃ１９）および挿入物（Ｓａｕ３Ａ１消化ＴＢＩＡフ ラグメント）の濃度はそれぞれ連結混合物１マイクロリアトル当り０．００４４ ｇおよび０．０１５６ｇであった。ドゥガイクジク、ニー、　（Ｄｕｇａｉｃｚ ｙｋ、Ａ、）等、ジェイ１モル、パイオル、　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　９ ６　：　１７１（１９７５年）：ヘルツマン。

ディー、エム、　０１ｅｌｆｍａｎ、Ｄ、Ｍ、）等、フォーカス（Ｆｏｃｕｓ） 　Ｖｏｌ。

６、嵐１　〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１９８４年〕、連結は、連結混合物１マ イクロリットル当り０．０５単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて１４℃で４８ 時間行なった９次いで、この連結混合物を、塩化カルシウム法を用いて、コンピ テントイー、コリ　（Ｅ、Ｃｏ１１）Ｊｌ’１１０９　ｍ胞〔米国メリーランド 州２０８５２　、ロンクヴイル、パークローンドライヴ１２３０１在のアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号第５３３２３号で寄託されて いる〕中に形質転換した。上記引用したマニアチス、ティー。

（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等、挿入物を有する形質転換体を、Ｘｇａ　ｌの存 在においてアンピシリン耐性の白色コロニーとして同定した。

ヴイエイラ、ジェイ、　（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、）およびメフシング、ジエイ。

（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、ヴイエイラ、ジェイ。

（Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、）およびメンシング、ジェイ、　（？１ｅｓｓｉＢ、Ｊ、 ）、ジノ　−　のスフ１−ニング 陽性の形質転換体（アンピシリン耐性白色コロニー）を、挿入部の中央または近 くに独自の制限部位を含んでいる大きなＴＢＩＡ　ＤＮＡ挿入部（１０ｋｂに等 しいかまたはそれより大きい）についてスクリーニングした。形質転換体を、ア ルカリ溶解プラスミドＤＮＡ微量調製法（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ　ｍｅｔｈｏｄ） 　［上記引用のマニアチス、ティー、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等〕によっ て溶解し制限酵素消化に付した。このスクリーニングから得られた好ましいプラ スミドはｐｃＧ３００　［米国メリーランド州２０８５２、ロックヴイル、バー クローン・ドライヴ１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョンに寄託番号第５３３２９号で寄託されている〕であった、このｐｃＧ３００ は、挿入部の中央付近に１個のＥｃｏＲ１部位をもった１　３　ｋｂ　ＴＢＩＡ 　ＤＮＡ挿入物を含んでいる（第１図）。

カ　マイシン　゛　−のクローニング ｐｃＧ３００のＴＢＩＡ挿入物のＥｃｏＲ１部位が臨界ＴＢＩＡ遺伝子中に位置 していないことを調べるために、カナマイシン耐性カセット〔ファーマシア（Ｐ ｈａｒａ＋ａｃｉａ）　１９８４カタログ、モレキュラー・バイオロジカルズ、 ケミカルズ・アンド・エキンプメント・フォー・モレキュラー・バイオロジー（ Ｍｏｌｅ■ｌａｒ　Ｂｉｏｌ■二ｃａｌｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｅ　 ｕｉ　ｌ１ｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　）７４頁〕をこ の部位にクローニングしそしてこのＤＮＡをＴＢＩＡ中に形質転換し、カナマイ シン耐性組込み体について選択した０組換え体プラスミドｐｃＧ３００を制限酵 素ＥｃｏＲＩを用いて部分消化し、そしてＴｎ９０３からのカナマイシン耐性遺 伝子を含有するＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメントと（Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用 いて）連結した。ドウガイクジク、ニー、　（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ、Ａ、）等、 ジェイ８モル、パイオル、　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　９６　：　１７０１ ９７５年）：ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　１９８４カタログ、モレキ ュラー・バイオロジカルズ、ケミカルズ・アンド・エキフプメント・フォー・モ レキュラー・バイオロジー（ル江ぢ画１Ｌ影Ａ江幻工ｊ１ヨｃｈｅｍｉｃａｌｓ 　ａｎｄ　Ｅ　ｕｉ　ｗｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　７ ４頁。

連結混合物を１４℃で７２時間インキュベーションした０次いで、この連結混合 物をコンピテントイー、コリ　（Ｅ、Ｃｏ１１）株５Ｋ２２６７　［米国メリー ランド州２０８５２　、ロンクヴイル、バークローン・ドライヴ１２３０１　、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号第５３３２４号で寄 託されている〕に形質転換した。この形質転換体を、カナマイシン硫酸塩（５０ Ｊ４／ｄ）を含有するプレート上で選択した。カナマイシン耐性形質転換体を好 ましい造成物としてスクリーニングした（カナマイシン遺伝子はｐＣＧ３ＱＱの ＴＢＩＡ　ＤＮＡ挿入部中に見い出されるＥｃｏＲ１部位にクローニングされて いる）０次いで、この新たなプラスミドｐｃＧ３０６　（第２図）を用いてＴＢ ＩＡ細胞を形質転換して、カナマイシン耐性について選択した。安定な形質転換 体の発見は、ＥｃｏＲ１部位を、ＴＢＩＡの増殖に影響を及ぼすことなく農薬遺 伝子の組込みに使用し得ることを示して外来遺伝子がＴＢＩＡ中で発現されるこ とを保証するために、外来遺伝子配列への融合に対してＴＢＩＡからの調節配列 をクロ一二ソグすることが好ましい。

ＴＢＩＡ染色体ＤＮＡの部分制限消化からの５ａｕ３Ａ１フラグメント（上記参 照）を、ｐＰＬ６０３から誘導されたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモータ ークローニングプラスミドｐＰＬ７０３　［米国メリーラン１（２０８５２、ロ ックヴイル、バークローンドライヴ１２３０１、アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションに寄託番号第５３３２７号で寄託されている〕のＢａ−〇１部 位にクローニングした〔マニアチス、ティー＊　（１’１ａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、 ）等、上記で引用〕。

ウィリアムス、ディー、（ドｉｌｌｉａｍｓ　Ｄ、）等、ジェイ、バタテリオル 、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１４６　：１１６２〜１１６５　（１９８１ 年）、このプラスミド（第３図）は、プロモーターが欠如している場合には発現 されないクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する 構造遺伝子を含んでいる０組換え体プラスミドをコンビチンドパシラス・サブチ リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）６２０３７　（ｒｅｃＥ）　（米 国メリーランド州２０８５２　、ロソクヴイル、バークローンドライヴ１２３０ １　、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号第５３３２５ 号で寄託されている）に形質転換した。クロラムフェニコール耐性コロニーを選 択することによって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの発現 をプロモートする制限フラグメントが特定された。そのクロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ活性を測定した。シャウ。

ダブリュー、ヴイー、（Ｓｈａｗ　Ｗ、Ｖ、）、メソッズ・イン・エンザイモル 、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｓｏｌ、）４３：　７３７〜７５５　（ア カデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）１９７５年〕、この形質 転換体は、０．４〜２キロベースの範囲にあるＴＢＩＡ　ＤＮＡ挿入部および４ ９〜１０２１０２６ｎ／ａｉｎ　／■タンパク質の範囲にあるクロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ活性を有する組換え体プラスミドを含んでいた 。プラスミドｐＣＧ６　（第３図）〔米国メリーランド州２０８５２　、ロンク ヴイル、バークローンドライヴ１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクションに寄託番号第５３３２８号で寄託されている〕はクロラムフェニ コールアセチルトランスフェラーゼに対する最高のプロモーター活性を有してお り、そして所望の農薬タンパク質、例えば、バシラス・チュリンギエンシス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ■並旦旦殺虫性エンドトキシンのＴＢＩＡ中での 発現に対する調節シグナルの好ましい供給源である。

Ｃｘｃプロモー　−か゛のビー、チェ１ンギエンシス（Ｂ。

ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）　−”ル　−エンドトキシンのＭ１３ヘクター＋ ＋＋ＢＴ１６５　（米国メＩＪ−−２７ド州２ｏ８５２、ロンクヴイル、バーク ローンドライヴ１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション に蚕託番号第５３３２６号で寄託されている〕は、カナマイシン耐性遺伝子に融 合された、切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ビー、チュリンギュンシス（Ｂ、 　ｔｈｕ−ｒｉユ１ｅｎｓｉｓ）デルタ−エンドトキシン遺伝子を含んでおり、 これらの殺虫活性およびカナマイシンは両方とも発現されるようになっている。

この融合配列は、シャインーダルガルノ（リポソーム結合部位）配列に対して５ −プライムのＢｇｌＩｒ部位およびカナマイシン耐性遺伝子に対して３−プライ ムのＨｉｎｄ　ｎ部位によって結合されている（第４図）、この融合ハイブリフ ト配列は（ｐＣＧ６の場合と同様に）Ｃｘｃプロモーターに３−プライムに連結 してＣｘｃ制御下で両方の活性の発現をもたらすことができる。この手順は以下 の通りである。

ファージｄＴＫ６５複製型分子（ＲＦ）ＤＮＡを標準的方法によってＡＴＣＣｍ ５３３２６から調製する。バーンズ、ダブユリ−、エム。

（Ｂｕｒｎｅｓ、Ｗ、Ｍ、）等、メソンズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　）、１０１　：　９８〜１２２　（アカデミ ツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　１９８３年〕、精製したＤＮ Ａを、制限酵素Ｂｇ１ｍおよびＨｉｎｄＩ［［を用いて連続的に切断して２．６ ４ｋｂフラグメントを遊離させる。これを上記引用したマニアチス。

ティー、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等において記載のように分離用アガロー ス電気泳動によって単離精製する０次いで、この精製したフラグメントを、上記 引用したマニアナス。ティー。

（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等において記載のようにＤＮＡポリメラーゼのフレ ノウフラグメントを用いて処理することによってプラントにする。

デルタエンドトキシン−カナマイシン耐性の融合遺伝子の翻訳を最適にするため に、ｐＣＧＣ６のプロモーターセグメントをエキソヌクレアーゼＢａｄ−３１を 用いて処理し、遺伝子融合のシャインーダルガルノ配列に対する融合のための多 数の３−プライム末端を生じさせる。ロバーツ、ティー、エム。

（Ｒｏｂｅｒｔｓ、丁１Ｍ、）等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスニ ー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、７６：　７６０〜７ ６４（１９７９年）：ディーンズ、アール、　（Ｄｅａｎｓ、Ｒ，）等、レコン ビナントＤＮＡテクニクス（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉ　 ｕｅｓ）　、２　：　２〜６（ザ・ユニバージティー・オヴ・ミラガフ１９８１ 年）、融合ハイブリッドによって生じたカナマイシン耐性を選択するために、ｐ ＣＧ６にすでに存在しているネオマイシン（カナマイシン）耐性要素を失活させ ることが必要である。これは、ネオマイシン耐性遺伝子内で切断するＢｇｌＩＩ エンドヌクレアーゼを用いてｐＣＧ６を切断することによってなされる０次いで 、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて８ｇｌｎ末端をフィルイ ンし、プラントされたベクターをＴ４リガーゼで再び環状にする。上記引用した 、マニアナス。ティー、　（ＭａｎｉａｔｉｓＴ、）等、連結したＤＮＡを前述 のようにビー、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌ　ｉｓ）株６２０３７に形質転 換し、クロラムフェニコール耐性を選びそしてカナマイシン怒受性についてスク リーニングすると、フレームシフトがネオマイシン耐性要素を失活させたことが 示される。このプラスミドはｐＣＧ６　Ｎｅｏ”と呼ばれる。５ａｌＩによるｐ ＣＧ６Ｎｅｏ”の消化後、ＤＮＡを上述〔上記引用したディーンズ、アール、　 （Ｄｅａｎｓ、Ｒ，））のようにＢａ１−３１に付しく第５図）欠失の系列（ｆ ａｍｉｌｙ）を生じさせる。

そのパターンをゲル電気泳動によってモニターする０次いで、異種プラスミドフ ラグメント集団を上記のようにプラントされたＢａ１ＩＩ　ＨｉｎｄＩ［ｌフラ グメントと連結する。連結したＤＮＡをビー、サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉ１ｉ ｓ）６２０３７（ｒｅｃＥ）に形質転換し、カナマイシン耐性について選択する 。遺伝子融合物中でのカナマイシン耐性の発現は５−プライムデルタ−エンドト キシン遺伝子の転写および翻訳に依存しているので、好ましい配置のプロモータ ーおよびデルタ−エンドトキシン遺伝子融合体のみがカナマイシン耐性を生じさ せる。カナマイシン耐性形質転換体を標準的組換え体ＤＮＡ技法〔マニアチス。

ティー、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等、上記引用〕によってスクリーニング して制限地図を確実にする。デルタ−エンドトキシン活性の発現は、タバコホー ンウオーム（スズメガ科のガの一種）〔カロリナ・バイオロジカルズ（Ｃａｒｏ ｌ　ｉｎａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）　）の新たにかえった幼虫を、その幼虫の 標準的食餌中に含ませたコロニーの試料に付すことによってモニターする０作用 レベルの幼虫毒性を生産することが見い出されたカナマイシン耐性形質転換体を 増殖させ、そのプラスミドＤＮＡを抽出する。

このプラスミドＤＮＡを、プロモーター−遺伝子融合領域（第５図参照）を切断 するＳｅａ　ＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断しそ して前述のように末端をプラントにする０次いで、このフラグメントを、標準的 方法〔マニアナス。ティ＋、（１’１ａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）等、上記引用〕に よって、プラントされたＥｃｏＲ１部位で組込みベクターｐｃＧ３００にクロー ニングする。連結ＤＮＡを前述のようにイー、コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＳＫ２６ ７に形質転換し、カナマイシン耐性について選択する。

後者の手順から得られた形質転換体を前述のように殺虫活性および予想される制 限地図についてスクリーニングする０次いで、正確な制限地図および殺虫活性を 与える形質転換体を、プラスミドＤＮＡ調製および引き続きのＴＢＩＡの形質転 換に対して増殖させる。

丁ＢＴＡプロトブーストのＵ ＴＢＩＡプロトプラストを以下の方法によって調製する。

１）凍結グリセロールストックからのＴＢＩＡを３８培地に接種し： ２）中間指数段階まで３０℃において培養物に通気し；３）この培養物に２％グ ルコースおよび０．１％グリシンを添加し、そして夜通しで（約１７８時間）通 気を続け：４）１０−のＳ聞Ｃ緩衝液（ソルビトール０．５Ｍ−２０ｍＭマレイ ン酸塩−２０ｍＭ　Ｍｇｌ！ｚ　２０１１ＭＣａＣｆｆ１ｚ（ｐＨ７，０）　（ ヨシハマ・エム、　（Ｙｏｓｂｉｈａｍａ　Ｍ、）等、ジェイ、バタテリオル。

（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１６２：　５９１〜５９７（１９’８５年）〕 ）中にとった２０−の培養物を無菌管中で４℃において５分間８０００ｒｐ−で 回転させて落とし、そして２．５■／−のりゾチームを含有するＳ聞Ｃ緩衝液２ が中に懸濁し； ５）３０℃で２〜３時間インキュベージランし、そして顕微鏡下でプロトプラス トの形成についてチェックし、そして６）５＠ｌのＳ財Ｃ緩衝液と一緒にした後 、４℃において６０００ｒｐｍ＋で１０分間遠心分離することにより細胞を集め 、そして１−のＳ聞Ｃ緩衝液中に懸濁する。

ＴＢＩＡプロトブーストのノ　− Ｓ８培地中で増殖しているＴＢＩＡの２０−指数的培養物を２％グルコースおよ び０．１％グリシンを用いて夜通しで（約１７時間）前処理し、プロトプラスト を上述したように調製する。プロトプラスト化された細胞の試料（０，３ａｆ） を試験管中に入れ、ＴＢＴＡプロモーターおよびビー、チュリンギエンシス（Ｂ 、ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）デルタエンドトキシン融合遺伝子を有するイン テグレイティヴプラスミドＤＮＡ［０，５Ｍソルビトール１０ｉ１！（ｐ１１７ ．０）中ＩｎのＤＮＡ）を添加する０次いで、Ｓ聞Ｃ＠衝液中２５％ＰＥＧの０ ．７ｄを添加した後穏やかに混合する。２５℃で５分間インキュベーションした 後、この混合物をＳＭ？ＩＣを用いて１０倍に稀釈し、上記のように遠心分離し 、ＳＳＣブロス（０，５Ｍソルビトールを有するＳ８ブロス（ｐＨ７，０））１ −中に懸濁し、そして３０℃において２時間振盪しながらインキュベーションす る。

形質転換したプロトプラス）（０，１ｄ）を非選択性再生プレート（Ｓ　Ｓ　Ｃ ）の上部のセルロースアセテート膜フィルター上に置き、２〜３日間３０℃でイ ンキュベーションしてカナマイシン耐性を発現させる０次いで、このフィルター を選択性再生プレート（ＳＳＣ＋カナマイシン（５０Ｒ／ｄ））に移して３０℃ においてさらにインキュベーションを行ないカナマイシン耐性形質転換体を選択 する。

トウモロコシ　でのバイブリフトＴＢＩＡの±　：。

カナマイシン耐性形質転換体（上記）を５０ｎ／−カナマイシンを加えたＳ８培 地中で増殖させ、そしてこの培養物の一部を上述のように生体内で幼虫殺虫活性 について試験する。

次いで、幼虫殺虫性単離体をトウモロコシ実生（ＦＲ６３２、イリノイス・ファ ンデーション・シーズ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ　ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｅｅｃｌｓ ）　）に接種する。接種は、試験すべきコロニーにつけておいた先のとがった無 菌メスを用いて２〜３週齢の実生に孔をあけることによって行なう、植物のライ フサイクルの間定期的に、木部汁液試料を取り出し、そして生体内的に幼虫殺虫 性であるカナマイシン耐性ハイブリッドについて試験する。

本明細書中で述べたように、病気の徴候なしにトウモロコシ−のコロニー形成（ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を通常に示しおよびＩＩＮ〔ビー、チュリンギエン シス（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）エンドトキシン〕を発現する単離体を 生体°内での能力の試験について選択する。後者の試験は、オオタバコガまたは アワツメイガの新たにかえった幼虫を用いて、接種を受けたトウモロコシ植物を 試験することによって実施した。

本発明の方法および生成物は主として窒素を固定することができるかまたはアヴ エルメクチンを生産することができる細菌のハイブリッドに関して記載してきた が、スクリーニング法を適当に変更することにより、他の農薬、例えば、殺虫剤 、除草剤、殺菌剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、植物成長調節物質および可溶化リン 酸塩を生産し得るハイブリッドを本発明に従って調製することができることが理 解されよう、さらに、前記の例はハイブリッド中に１種類の農薬の生産に対する 遺伝子を含めることを説明しているが、２種類またはそれ以上の適合性のある生 成物の生産に対する遺伝子を、本発明に従って見い出されるハイブリッド中に含 めることができることが理解されよう、従って、本発明に従って形成されたバイ ブリフトと他の農薬生産性生物との融合、１種類以上の農薬を生産することが知 られている微生物との初期融合、または１種類以上の農薬生産性微生物を用いて 行なわれる初期融合によってこのような複数種の農薬生産性生物を得ることがで きる。同様に、農薬の生産に対する２種またはそれ以上の遺伝子を、組換え体Ｄ ＮＡ法を用いて感染性微生物にクローニングすることができる０例えば、バシラ ス・チュリンギエンシス変種りルスタキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ。

１（ｕｒｓｔａｋｉ）およびバシラス・チュリンギエンシス変種テネプリオニス （ｈ虱１１ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ ｉｓ）のデルタ−エンドトキシンに対する遺伝子を感染性微生物にクローニング することができる。さらに、適用可能な植物宿主の範囲を、２種またはそれ以上 の感染性微生物の遺伝学的材料を結合することによって広げることができる。

本発明の方法および生成物に種々の変形および変化を施し得ることは当業者に明 白であろう、従って、本発明は、請求の範囲の内容およびその等個物の範囲内に 入いるものであることを条件として本発明の変形および変化を含むものであるこ とを意図している。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生 物の製法であって、農薬生産性微生物からの遺伝学的材料および前記植物宿主を 感染する感染性微生物を結合してハイブリッド微生物を形成する工程および前記 ハイブリッド微生物から、前記農薬を生産することができ、前記植物宿主に病気 の発現を引き起こすことなく、かつ前記植物宿主と内共生間係に入いることがで きるハイブリッド微生物を選択する工程を含んでなる製法。 ２．前記農薬生産性ハイブリッド微生物が、前記植物宿主の能力が該植物宿主へ の前記農薬または前記農薬生産性微生物の直接適用によって改善され得るような 条件下に、前記植物宿主の能力を改善することができる、請求の範囲第１項記載 の製法。 ３．植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生 物の製法であって、下記の工程：（Ａ）任意の好都合な順序で、 （１）前記植物宿主を特定する工程、 （２）前記植物宿主を感染する感染性微生物を特定する工程、 （３）前記宿主を感染する能力に加えて１種またはそれ以上の選択可能な特性を 有する前記感染性微生物の変異体を選択する工程、および （４）１種またはそれ以上の選択可能な特性を有する農薬生産性微生物を選択す る工程、 （Ｂ）前記感染性微生物および前記農薬生産性微生物の融合ハイブリッドを形成 する工程、 （Ｃ）先行して実施した工程または副工程の生成物から連続的におよび任意の好 都合な順序で、 （１）前記農薬生産性微生物の選択可能な特性の少なくとも１種および前記感染 性微生物の選択可能な特性の少なくとも１種の両方を有するハイブリッドを含ん でなるサブグループ、 （２）前記感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相の間植物組織と相 互作用する仕方で植物組織と相互作用し得る能力を示すハイブリッドを含んでな るサブグループ、 （３）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッドを含んで なるサブグループ、および（４）先に選択されていない場合には前記農薬を生産 する能力を有しているハイブリッドを含んでなるサブグループ を選択する工程、および （Ｄ）植物宿主の能力が該植物宿主への前記農薬または前記農薬生産性微生物の 直接適用によって改善され得るような条件下に前記植物宿主の能力を改善し得る ハイブリッド微生物を工程（Ｃ）（１）〜（Ｃ）（４）の最後に実施した工程か ら選択することによって、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生 産性ハイブリッド微生物を選択する工程 を含んでなる製法。 ４．前記工程（Ｃ）（１）において選択される農薬生産性微生物の選択可能な特 性が前記農薬を生産する能力である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共 生関係に入いることができる農薬生産性細菌物の製法。 ５．前記工程（Ｃ）（１）において選択される農薬生産性微生物の選択可能な特 性が前記農薬を生産する能力に加えて１種またはそれ以上の選択可能な特性であ る、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬 生産性ハイブリッド微生物の製法。 ６．前記感染性微生物および前記農薬生産性微生物が細菌である、請求の範囲第 ３項記載の製法。 ７．前記農薬生産性微生物および前記感染性微生物が細菌でありそしてこれらの 細菌がグラム染色に対して同じ応答を有している、請求の範囲第３項記載の植物 宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法 。 ８．自然または人工の遺伝学的技法を用いて前記内共生性農薬生産性ハイブリッ ド微生物をさらに変形して前記植物宿主に対する前記農薬の供給源としての該微 生物の能力を改善する工程を含んでいる、請求の範囲第３項記載の植物宿主との 内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ９．前記ハイブリッド微生物を、前記農薬を生産する能力について、および前記 感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相の間２倍またはそれ以上植物 組織と相互作用するように植物組織と相互作用する能力についてスクリーニング する、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農 薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １０．前記工程（Ｃ）の生成物を工程（Ｄ）の前に、この方法に従った一層のス クリーニングに対して前記植物宿主の全体にわたって最も容易に広がるハイブリ ッド微生物を選択することによりさらに限定する、請求の範囲第３項記載の植物 宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法 。 １１．前記感染性微生物の１種またはそれ以上の選択可能な特性が、抗生物質耐 性、栄養素補充に対する性質、毒素に対する耐性、またはそれらの組合わせから なる群より選ばれる、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いる ことができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １２．前記農薬生産性微生物の１種またはそれ以上の選択可能な特性が、抗生物 質耐性、栄養素補充に対する要求性、前記農薬の生産能、毒素に対する耐性、ま たはそれらの組合わせからなる群より選ばれる、請求の範囲第３項記載の植物宿 主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １３．前記感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相の間に植物組織と 相互作用する仕方で植物組織と相互作用する前記能力が、植物細胞に結合し得る 能力である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることがで きる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １４．前記感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相の間に植物組織と 相互作用する仕方で植物組織と相互作用する前記能力が、前記植物宿主の維管束 系を通って広がり得る能力である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生 関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １５．前記感染性微生物が前記植物宿主における感染の初期相の間に植物組織と 相互作用する仕方で植物組織と相互作用する前記能力が、病気の症状を引き起こ すことなく植物の根で生活し得る能力である、請求の範囲第３項記載の植物宿主 との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １６．前記工程（Ｃ）の生産物を工程（Ｄ）の前に、この方法に従った一層のス クリーニングに対して前記植物宿主の全体にわたって最も容易に広がるハイブリ ッド微生物を選択することによってさらに限定する、請求の範囲第１３項記載の 植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の 製法。 １７．前記植物宿主が単子葉植物である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との 内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １８．前記植物宿主が双子葉植物である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との 内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 １９．前記植物宿主が小麦、ライ小麦、大麦、ライ麦、オート麦からなる群より 選ばれる温帯性禾穀類植物である、請求の範囲第１７項記載の植物宿主との内共 生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２０．前記植物宿主がプロームグラス（イネ科スズメノチャヒキ属植物）、イチ ゴツナギ、トールフェスキューグラス（イネ科ウシノケグサ属植物）およびギョ ウギシバからなる群より選ばれるイネ科植物である、請求の範囲第１７項記載の 植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の 製法。 ２１．前記植物宿主がサトウキビ、トウモロコシ、キビまたはモロコシからなる 群より選ばれる熱帯性イネ科植物である、請求の範囲第１７項記載の植物宿主と の内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２２．前記植物宿主がイネである、請求の範囲第１７項記載の植物宿主との内共 生間係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２３．前記植物宿主がジャガイモ、トマト、タバコ、ナスまたはトウがラシから なる群より選ばれるナス科植物である、請求の範囲第１８項記載の植物宿主との 内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２４．前記植物宿主がカリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ケールまたはコ ールラビーからなろ群より選ばれるアブラナ科植物である、請求の範囲第１８項 記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微 生物の製法。 ２５．前記植物宿主がニンジンまたはパセリからなる群より選ばれる野菜である 、請求の範囲第１８項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬 生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２６．前記植物宿主がサトウダイコン、ワタ、果樹、液果植物またはブドウから なる群より選ばれる農業的栽培植物である、請求の範囲第１８項記載の植物宿主 との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２７．前記植物宿主がマツ、トウヒ、モミまたはヤマナラシからなる群より選ば れる木の種である、請求の範囲第１８項の植物宿主との内共生関係に入いること ができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２８．前記植物宿主がダイズ、アルファルファ、クローバー、フィールドビーン ズ、ヤエナリ、エンドウおよび他の豆類からなる群より選ばれるマメ科植物であ る、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬 生産性ハイブリッド微生物の製法。 ２９．前記農薬生産性微生物が窒素固定細菌である、請求の範囲第３項記載の植 物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製 法。 ３０．前記窒素固定細菌がアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾモ ナス（Ａｚｏｍｏｎａｓ）、ベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）ま たはドレキシア（Ｄｒｅｘｉａ）からなる群より選ばれる属に属している、請求 の範囲第２９項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性 ハイブリッド微生物の製法。 ３１．前記農薬生産性微生物が殺菌剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ３２．前記殺菌剤を生産する能力を有する細菌がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｖｃｅｓ）ストレプトベ ルチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、バシラス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ）またはノルカルジア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）からなる群より選ばれ る属に属している、請求の範囲第３１項記載の植物宿主との内共生関係に入いる ことができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ３３．前記農薬生産性微生物が抗菌剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ３４．前記抗菌剤を生産する能力を有している細菌がアグロバクテリウム（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ストレプトマイセ ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはバシラス（Ｂａｃ−ｉｌｌｕｓ）からな る群より選ばれる属に属している、請求の範囲第３３項記載の植物宿主との内共 生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ３５．前記農薬生産性微生物が抗ウイルス剤を生産する能力を有している細菌で ある、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農 薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ３６．前記抗ウイルス剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属している、請求の範囲第３５項記載の植物 宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法 。 ３７．前記農薬生産性微生物が殺虫剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ３８．前記殺虫剤を生産する能力を有している細菌がバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）またはストレプトマイセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群より選ばれる属に属している、請求の 範囲第３７項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハ イブリッド微生物の製法。 ３９．前記殺虫剤を生産する能力を有している細菌がバシラス・チュリンギエン シス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の株である、請求の範 囲第３８項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイ ブリッド微生物の製法。 ４０．前記農薬生産性微生物が線虫駆除剤を生産する能力を有している細菌であ る、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬 生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４１．前記線虫駆除剤を生産する能力を有している細菌がバシラス（Ｂａｃｉ１ １ｕｓ）属またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ）属に属し ている、請求の範囲第４０項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができ る農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４２．前記農薬生産性微生物がダニ駆除剤を生産する能力を有している細菌であ る、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬 生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４３．前記ダニ駆除剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属している、請求の範囲第４２項記載の植物宿 主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４４．前記農薬生産性細菌物が除草剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ４５．前記除草剤を生産する能力を有している細菌がシュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ−ｔｏｍｙｃｅｓ）か らなる群より選ばれる属に属している、請求の範囲第４４項記載の植物宿主との 内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４６．前記農薬生産性細菌が結合リン酸塩を可溶化する能力を有している細菌で ある、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農 薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４７．前記結合リン酵塩を可溶化する能力を有している細菌がバシラス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ）またはシユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）から選ばれる属 に属している、請求の範囲第４６項記載の植物宿主との内共生関係に入いること ができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４８．前記農薬生産性微生物が植物成長調節物質を生産する能力を有している細 菌である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができ る農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ４９．前記植物成長調節物質を生産する能力を有している細菌がアゾトバクター （Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）またはバシラス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ）からなる群より選ばれる属に属している、請求の範囲第４８項記載の植 物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製 法。 ５０．前記農薬生産性微生物が芳香物質およびアンチフィーディング剤からなる 群より選ばれる化学物質を生産する能力を有している細菌である、請求の範囲第 ３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッ ド微生物の製法。 ５１．前記農薬生産性微生物が菌類である、請求の範囲第３項記載の植物宿主と の内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ５２．前記農薬生産性微生物が藻類である、請求の範囲第３項記載の植物宿主と の内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ５３．前記感染性微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウ ィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）またはア グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群より選ばれる属に 属している細菌である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入い ることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ５４．前記感染性微生物が植物宿主に対する病原変種であるシユードモナス・シ リンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）の株である、請求の範 囲第５３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイ ブリッド微生物の製法。 ５５．前記感染性微生物が植物宿主に対する病原変種であるザントモナス・カン ペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の株である、請 求の範囲第５３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ５６．前記感染性微生物が前記植物宿主に対する病原変種であるアグロバクテリ ウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）の株である、請求の範囲第５３項記載の植物宿主との内共生関係に入いること ができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ５７．前記感染性微生物が前記植物宿主に対する病原変種であるエルウィニア・ カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）の株である、請求の範 囲第５３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイ ブリッド微生物の製法。 ５８．前記感染性微生物が植物宿主に対する病原変種であるエルウィニア・ステ ワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）の株である、請求の範囲第５３ 項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド 微生物の製法。 ５９．前記感染性微生物が前記植物宿主の病原変種であるシュードモナス・ソラ ナセラム（Ｐｓｏｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅｒｕｍ）の株である、請 求の範囲第５３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ６０．前記感染性微生物がアゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クラ ビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒ−ｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） からなる群より選ばれる属に属している、請求の範囲第３項記載の植物宿主との 内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ６１．前記感染性微生物がアゾスピリラム・リピフェラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌ ｌｕｍ　ｌｉｐｉｆｅｒｕｍ）の株である、請求の範囲第６０項記載の植物宿主 との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ６２．前記感染性微生物がアゾスピリラム・ブラシレンズ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌ ｌｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）の株である、請求の範囲第６０項記載の植物宿 主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ６３．前記感染性微生物がクラビバクテリア・キソリ（Ｃｌａ−ｖｉｂａｃｔｅ ｒｉａ　ｘｙｌｉ）の株である、請求の範囲第６０項記載の製法。 ６４．前記感染性微生物が木部限定性細菌である、請求の範囲第３項記載の植物 宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法 。 ６５．前記感染性微生物がピアース病細菌の株である木部限定性細菌である、請 求の範囲第６４項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産 性ハイブリッド微生物の製法。 ６６．前記感染性微生物が菌類である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内 共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ６７．前記菌類がアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）およびバランシア（ Ｂａｌａｎｓｉａ）からなる群より選ばれる属に属する菌類である、請求の範囲 第６６項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブ リッド微生物の製法。 ６８．前記感染性微生物が藻類である、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内 共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ６９．前記工程（Ｃ）（１）〜（Ｃ）（４）を記載した順序で実施する、請求の 範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイ ブリッド微生物の製法。 ７０．前記工程（Ｃ）（１）〜（Ｃ）（３）を記載した順序で実施しおよび工程 （Ｃ）（４）を省略する、請求の範囲第３項記載の植物宿主との内共生関係に入 いることができる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ７１．前記農薬生産性微生物がアゾトバクター・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃ ｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）の株でありそして前記感染性微生物が前記植物 宿主に対する病原変種であるシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）またはザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏ ｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる株である、請求の 範囲第１９項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハ イブリッド微生物の製法。 ７２．前記農薬生産性微生物がエルウィニア・ステワルチ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓ ｔｅｗａｒｔｉｉ）、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、アゾスピリラム・リピフェラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉ ｌｌｕｍ　ｌｉｐｉｆｅｒｕｍ）、アゾスピリラム・ブラシレンズ（Ａｚｏｓｐ ｉｒｉｌｌｕｍ　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）またはシユードモナス・シリンガエ（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）からなる群より選ばれる細菌の株 である、請求の範囲第１７項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができ る農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ７３．前記農薬生産性微生物がアゾトバクター・ビネランジ（Ａｚｏｔｏｂａｃ ｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）の株でありそして前記感染性微生物がアグロバ クテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｔｕｍｉｆａ ｃｉｅｎｓ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏ ｒａ）、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓ ｔｒｉｓ）、シユードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎ ｇａｅ）またはシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄ−ｏｍｏｎａｓ　 ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）からなる群より選ばれる細菌の株である、請求の範 囲第１８項記載の植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイ ブリッド微生物の製法。 ７４．前記単子葉植物がトウモロコシであり、前記農薬生産性微生物がバシラス ・チュリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の株 でありそして前記感染性微生物がクラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属 の株である、請求の範囲第１７項記載の植物宿主との内共生関係に入いることが できる農薬生産性ハイブリッド微生物の製法。 ７５．植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド徴 生物の製法であって、下記の工程：（Ａ）任意の好都合な順序で （１）前記植物宿主を特定する工程、および（２）前記植物宿主を感染する感染 性微生物を特定する工程、 （Ｂ）前記感染性微生物内に移すことができそして該微生物内で複製することが できるベクターを調製する工程、（Ｃ）前記感染性微生物による農薬の生産を指 令することができる発現モジュールを調製する工程、（Ｄ）前記ベクター中に前 記発現モジュールを入れて、前記感染性微生物内に移すことができそして該微生 物内で複製することができる発現ベクターを造成する工程、前記発現ベクターは 前記感染性微生物による前記農薬の生産を指令することができる、 （Ｅ）前記発現ベクターを用いて前記感染性微生物を形質転換しハイブリッド微 生物を製造する工程、（Ｆ）前記ハイブリッド微生物を選択する工程、（Ｇ）前 記ハイブリッド微生物から連続的におよび任意の好都合な順序で、 （１）前記感染性微生物が前記植物宿主内での感染の初期相の間に植物組織と相 互作用する仕方で植物組織と相互作用し得る能力を示すハイブリッド微生物を含 んでなるサブグループ、 （２）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッド微生物を 含んでなるサブグループ、および（３）先に選択されていない場合には前記農薬 を生産する能力を有しているハイブリッド微生物を含んでなるサブグループ を選択またはスクリーニングする工程、および（Ｈ）前記植物宿主の能力が該植 物宿主への前記農薬または前記農薬生産性微生物の直接適用によって改善され得 るような条件下に前記植物宿主の能力を改善し得るハイブリッド微生物を工程（ Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）の最後に実施した工程の生成物から選択することによ って、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微 生物を選択する工程 を含んでなる製法。 ７６．前記発現モジュールを調製するための工程が、前記農薬に対する１個また は複数個の構造遺伝子を含有するポータブルＤＮＡ配列を調製する工程、前記ポ ータブルＤＮＡ配列に対する転写および翻訳制御要素であって前記感染性微生物 に前記農薬の生産を指令することができる該制御要素を含有するベクター中に、 前記ポータブルＤＮＡ配列をクローニングする工程、および前記発現モジュール を回収する工程 を含んでなる、請求の範囲第７５項記載の製法。 ７７．植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッド微 生物の製法であって、下記の工程：（Ａ）任意の好都合な順序で （１）前記植物宿主を特定する工程、および（２）前記植物宿主を感染する感染 性微生物を特定する工程、 （Ｂ）組込み配列を含有しかつ前記感染性微生物のゲノム中に組込み可能である 組込みベクターを調製する工程、（Ｃ）前記感染性微生物による農薬の生産を指 令することができる発現モジュールを調製する工程、（Ｄ）前記組込みベクター の前記組込み配列内に前記発現モジュールを入れ、それによって前記感染性微生 物のゲノム内に組込むことができかつ前記感染性微生物による前記農薬の生産を 指令することができる変形された組込みベクターを製造する工程、 （Ｅ）前記変形された組込みベクターを用いて前記感染性微生物を形質転換して ハイブリッド微生物を製造する工程、（Ｆ）前記ハイブリッド微生物を選択する 工程、（Ｇ）前記ハイブリッド微生物から連続的におよび任意の好都合な順序で 、 （１）前記感染性微生物が前記植物宿主内での感染の初期相の間に植物組織と相 互作用する仕方で植物組織と相互作用し得る能力を示すハイブリッド微生物を含 んでなるサブグループ、 （２）前記宿主への適用後、病気の発現を引き起こさないハイブリッド微生物を 含んでなるサブグループ、および（３）先に選択されていない場合には前記農薬 を生産する能力を有しているハイブリッド微生物を含んでなるサブグループ を選択またはスクリーニングする工程、（Ｈ）前記植物宿主の能力が該植物宿主 への前記農薬または前記農薬生産性微生物の直接適用によって改善され得るよう な条件下に前記植物宿主の能力を改善することができるハイブリッド微生物を工 程（Ｇ）（１）〜（Ｇ）（３）の最後に実施した工程の生成物から選択すること によって、植物宿主との内共生関係に入いることができる農薬生産性ハイブリッ ド微生物を選択する工程 を含んでなる製法。 ７８．前記発現モジュールが前記農薬の生産に対する１個または複数個の構造遺 伝子を含有するポータブルＤＮＡ配列および転写および翻訳制御要素を含んでな り、前記制御要素が前記感染性微生物内で作動可能である、請求の範囲第７７項 記載の製法。 ７９．前記発現モジュールが前記感染性微生物内で選択可能な特性をコードする ＤＮＡ配列である、請求の範囲第７８項記載の製法。 ８０．前記発現モジュールの調製工程が、前記感染性微生物内で作動可能なプロ モーターを含んでいるベクターを調製する工程 前記農薬の生産に対する１個または複数個の構造遺伝子を含みかつ前記感染性微 生物内で作動可能である、プロモーター以外の転写および翻訳制御要素を含んで いるポータブルＤＮＡ配列を前記ベクター内に入れて発現モジュールを含有する 発現ベクターを製造する工程、前記発現モジュールはポータブルＤＮＡ配列およ び前記制御要素を含んでおりかつ前記感染性微生物内で作動可能である、および 前記発現ベクターから前記発現モジュールを回収する工程を含んでなる、請求の 範囲第７７項記載の製法。 ８１．前記感染性微生物内で選択可能な特性をコードするＤＮＡ配列を前記ベク ター内に入れる一層の工程を含み、その際、前記発現モジュールがさらに前記選 択可能な特性をコードする前記ＤＮＡ配列を含んでいる、請求の範囲第８０項記 載の製法。 ８２．前記感染性微生物内で選択可能な特性をコードする前記ＤＮＡ配列が前記 発現モジュール内にある、請求の範囲第８１項記載の製法。 ８３．前記感染性微生物が細菌である、請求の範囲第７７項記載の製法。 ８４．前記細菌がコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の 種である、請求の範囲第８３項記載の製法。 ８５．前記細菌がクラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属の種である、請 求の範囲第８３項記載の製法。 ８６．前記植物宿主がイネ科の植物である、請求の範囲第８５項記載の製法。 ８７．前記植物宿主がギョウギシバ、サトウキビまたはモロコシである、請求の 範囲第８６項記載の製法。 ８８．前記植物宿主がトウモロコシである、請求の範囲第８５項記載の製法。 ８９．前記細菌がクラビバクター・キシリ（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒｘｙｌｉ） 亜種シノドンティス（ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）でありそして前記植物宿主がトウ モロコシである、請求の範囲第８３項記載の製法。 ９０．前記細菌がクラビバクター・キシリ（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒｘｙｌｉ） 亜種キシリ（ｘｙｌｉ）でありそして前記植物宿主がトウモロコシである、請求 の範囲第８３項記載の製法。 ９１．前記農薬がバシラス・チュリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）のデルタ・エンドトキシンである、請求の範囲第７７項記載 の製法。 ９２．前記組込みベクターがｐＧ３００である、請求の範囲第７７項記載の製法 。 ９３．プロモーターを含む前記ベクターがｐＣＧ６である、請求の範囲第８０項 記載の製法。 ９４．請求の範囲第１項記載の方法によって製造された農薬生産性ハイブリッド 微生物。 ９５．請求の範囲第３項記載の方法によって製造された農薬生産性ハイブリッド 微生物。 ９６．農薬を生産し得る能力および植物宿主との非病原性の内共生関係に入いる ことができる能力を有している安定なハイブリッド微生物。 ９７．前記ハイブリッド微生物が前記植物宿主を感染することができる感染性微 生物および農薬生産性微生物からの遺伝学的材料を含んでいる、請求の範囲第９ ６項記載の安定なハイブリッド微生物。 ９８．前記農薬生産性微生物が細菌でありそして前記感染性微生物が細菌である 、請求の範囲第９７項記載の安定なハイブリッド微生物。 ９９．前記農薬生産性微生物が菌類でありそして前記感染性微生物が菌類である 、請求の範囲第９７項記載の安定なハイブリッド微生物。 １００．前記ハイブリッド微生物が農薬生産性細菌と前記植物宿主を感染するこ とができる感染性細菌とのプロトプラストまたはスフェロプラスト融合によって 製造された融合ハイブリッド細菌である、請求の範囲第９６項記載の安定なハイ ブリッド微生物。 １０１．前記感染性細菌がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ） 、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シユードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）またはアゾスピリラム（Ａｚｏｓ ｐ−ｉｒｉｌｌｕｍ）からなる群より選ばれる属の細菌である、請求の範囲第１ ０４項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０２．前記農薬生産性細菌が窒素固定細菌である、請求の範囲第１００項記載 の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０３．前記窒素固定細菌がアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属の細 菌である、請求の範囲第１０２項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０４．前記農薬生産性細菌が抗菌剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０５．前記抗菌剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌である、請求の範囲第１０４項記載の安定な 融合ハイブリッド細菌。 １０６．前記農薬生産性細菌が抗ウイルス剤を生産する能力を有している細菌で ある、請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０７．前記農薬生産性細菌が殺虫剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０８．前記殺虫剤を生産する能力を有している細菌がバシラス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）属またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌であ る、請求の範囲第１０７項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １０９．前記農薬生産性細菌が線虫駆除剤を生産する能力を有している細菌であ る、請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １１０．前記線虫駆除剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌である、請求の範囲第１０９項記載の安 定な融合ハイブリッド細菌。 １１１．前記細菌がダニ駆除剤を生産する能力を有している、請求の範囲第１０ ０項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １１２．前記ダニ駆除剤を生産する能力を有している細菌がストレプトマイセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌である、請求の範囲第１１１項記載の安 定な融合ハイブリッド細菌。 １１３．前記農薬生産性細菌が除草剤を生産する能力を有している細菌である、 請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １１４．前記農薬生産性細菌が結合リン酸塩を可溶化する能力を有している細菌 である、請求の範囲第１００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １１５．前記農薬生産性細菌が植物成長調節物質を生産する能力を有している細 菌である、請求の範囲第１０６項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １１６．前記農薬生産性細菌が芳香物質およびアンチフィーディング剤からなる 群より選ばれる化学物質を生産する能力を有している細菌である、請求の範囲第 １００項記載の安定な融合ハイブリッド細菌。 １１７．請求の範囲第７５項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １１８．請求の範囲第７７項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １１９．請求の範囲第８５項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２０．請求の範囲第８６項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２１．請求の範囲第８７項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２２．請求の範囲第８８項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２３．請求の範囲第８９項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２４．請求の範囲第９０項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２５．請求の範囲第９１項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２６．請求の範囲第９２項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２７．請求の範囲第９３項記載の製法によって製造された農薬生産性ハイブリ ッド微生物。 １２８．作物植物種子、該種子上に被覆された生物分解性の栄養素担体材料、お よび農薬を生産することができかつ前記担体材料と関係して前記作物植物との非 病原性の内共生関係に入いることができる能力を有している安定なハイブリッド 微生物を含んでなる農業用種子製品。 １２９．農薬を生産することができかつ作物植物との非病原性の内共生関係に入 いることができる能力を有している安定なハイブリッド微生物によって感染され た前記作物植物の種子を含んでなる農業用製品。 １３０．水と、農薬を生産することができかつ植物宿主との非病原性の内共生関 係に入いることができる能力を有している安定なハイブリッド微生物との混合物 を含んでなる農業用土壌水剤。 １３１．農薬を生産することができかつ植物宿主中への注射に適した園芸学的に 許容され得る担体により植物宿主との非病原性の内共生関係に入いることができ る能力を有している安定なハイブリッド微生物を含んでなる農業用製品。