JP2565696B2 - バシラス・チューリンゲンシス毒素のホスト範囲を変更する方法 - Google Patents

バシラス・チューリンゲンシス毒素のホスト範囲を変更する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はバシラス・チューリンゲンシス（Bacillus t
hringiensis,以下B.T.と略することもある）毒素のホス
ト範囲を変更する方法及びそれによって生産される新規
な毒素類に関する。
［従来の技術］ 最も広く使用されている微生物殺虫剤は、細菌B.T.か
ら誘導される。この細菌剤は、葉を食する広範囲のいも
虫（caterpillars）、マメコガネ（Japanese beetles）
及び蚊の防除に使用される。B.チューリンゲンシスは、
感受性のある昆虫ホストが摂取すると有毒なタンパク性
のパラ胞子又は結晶を生産する。例えば、B.T.バラエテ
ィ・カースタキ（kurstaki）HD−１は、デルタ毒素とい
う結晶を生産するが、これは幾つかの鱗し目（Lepidopt
era）昆虫の幼虫に有毒である。このB.T.結晶タンパク
遺伝子の大腸菌におけるクローン化及び発現は、公表文
献に記述されている［シュネフ・エッチ・イー（Sch−n
epf,H.E.）及びホワイトレー・エッチ・アール（Whitel
ey,H.R.）（1981年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA78巻2893
−2897頁］。合衆国特許第4,448,885号と合衆国特許第
4,467,036号は、大腸菌におけるB.T.結晶タンパクの発
現を明らかにしている。合衆国特許第4,467,036号に
は、B.チューリンゲンシス・バラエティ・カースタキHD
−１が、イリノイ州ピオリアの周知のNRRL培養基受託施
設から入手可能と明らかにされている。その呼出番号は
NRRL B−3792である。B.チューリンゲンシス・バラエテ
ィ・カースタキHD−73もNRRLから入手できる。その呼出
番号はNRRL B−4488である。
［発明の態様］ 本発明は、バルシス毒素、例えばB.T.毒素の昆虫ホス
ト範囲を変更する新規な方法に関する。ここで、「ホス
ト範囲を変更する」とは、特定の昆虫ホストに対する毒
性を増幅することにより、毒素の昆虫ホスト範囲を拡大
又は変更することを意味する。本方法は二つ以上のδ−
エンドトキシン遺伝子の可変領域を生体外で組替えるこ
とを含む。特定的に例示されているのは、二つのB.チュ
ーリンゲンシス・バラエティ・カースタキDNA配列、す
なわち本明細書でｋ−１及びｋ−73と呼ばれている部分
を組替えて、親DNAによって生産される毒素に比べて拡
大されたホスト範囲をもつキメラB.t.毒素をつくる方法
である。
本明細書で使用される「可変領域」とは、二つ以上の
DNA配列の非相同領域のことである。本明細書に記載の
実施例に示すように、二つの異なるB.t.DNA配列からの
このような可変領域の組替えで、拡大された昆虫ホスト
範囲をもつδ−エンドトキシンをコードしたDNA配列が
生ずるのは予想外である。関連する実施例で、異なる二
つのB.t.毒素遺伝子の二つの可変領域を組替えると、目
標害虫に対して毒性を高めたキメラ毒素分子がつくられ
る。本発明者らによるこの発見の有用性は、本明細書で
明らかにされた実施例より明白に広い。この発見から、
有用な新毒素が多数生産されることが予想される。従っ
て、本方法は周知の二つのB.t.カースタキDNA配列から
のキメラ毒素生産DNA配列の構築を例示しているが、本
方法はこれらの出発DNA配列に制限されないことを理解
すべきである。本発明方法は、任意のB.チューリンゲン
シス毒素生産DNA配列からキメラ毒素を構築するにも使
用できる。
二つ以上のδ−エンドトキシン遺伝子の可変領域を生
体外で組替えると、出発遺伝子によってつくられる毒素
に比べて拡大及び／又は増幅されたホスト毒性をもつキ
メラ毒素をコードした遺伝子が得られる。この組替えは
標準的な周知の遺伝子工学手法を用いて行なわれる。
本明細書で明らかにされている制限酵素は、メリーラ
ンド州ゲイサーズバーグのベテスダ研究所又はマサチュ
ーセッツ州ビバリーのニューイングランド・バイオラブ
から購入できる。酵素は供給者から提供される指示に従
って使用される。
プラスミド調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法は、この技術で周知である。これらの手順は
いずれも、マニアチス・ティー（Maniatis,T.）、フリ
ッシュ・イー・エフ（Fritsch,E.F.）及びサムブルック
・ジェイ（Sambrook,J.）（1982年）「分子クローン
化」（Molecular Cloning）（実験マニュアル、コール
ドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク）に記述さ
れている。このように、微生物細胞からDNAを抽出し、
制限酵素消化を行ない、DNA断片を電気泳動にかけ、プ
ラスミドをテールし、アニールし、DNAを挿入し、DNAを
再結合させ、細胞を形質転換し、プラスミドDNAを調製
し、タンパクを電気泳動にかけ、DNAを配列決定するの
は、遺伝子工学者の技術範囲にある。
下記のように構築されるプラスミドpEW1、pEW2、pEW3
及びpEW4は大腸菌ホスト中で、合衆国イリノイ州ピオリ
ア、合衆国の農務省北部研究所（NRRL）の永久保存施設
に寄託された（少なくとも30年保存）。その呼出番号と
寄託日は以下のとおりである。
pEW1−NRRL B−18134、1986年11月13日に寄託 pEW2−NRRL B−18033、1985年11月29日に寄託 pEW3−NRRL B−18034、1985年11月29日に寄託 pEW4−NRRL B−18135、1986年11月13日に寄託 B.チューリンゲンシス菌株MTX−36,NRRL B−18101,は19
86年８月25日に寄託された。
プラスミドpBR322は周知の入手可能なプラスミドであ
る。これは大腸菌ホストATCC37017中に保持されてい
る。精製pBR322DNAはボリバー・エフ（Bolivar,F.）、
ロドリゲス・アール・エル（Rodriguez,R.L）、グリー
ン・ピー・ジェイ（Greene,P.J.）、ベトラッチ・エム
・シー（Betlach,M.C.）、ヘイネッカー・エッチ・エル
（Heynecker,H.L.）、ボイヤー・エッチ・ダブリュー
（Boyer,H.W.）、クロサ・ジェイ・エッチ（Crosa,J.
H.）、及びファルコウ・エス・（Falkow,S.）（1977
年）Gene2巻95−113頁；及びサトクリフ・ジェイ・ジー
（Sutcliffe,J.G.）（1978年）Nucleic Acids Res.5巻2
721−2728頁に記述されたとおりに得られる。
NRRL B−18134,NRRL B−18033,NRRL B−18034,NRRL B
−18135,及びNRRL B−18101は、本明細書に記載の発明
と関連してこれらの呼出番号を明らかにした特許の授与
により、一般に入手可能となる。これらの寄託物が入手
できるとしても、政府措置によって本発明に対して授与
される特許権を侵害してまで本発明の実施権を構成する
ものではないことを理解すべきである。
上記のように、本発明の出発材料としてB.チューリン
ゲンシス毒素を生産する任意のDNA配列が使用できる。
既述のもの以外にB.チューリンゲンシス生物の例は次の
ものである。
バシラス・チューリンゲンシス・バラエティ・イスラエ
レンシス、ATCC35646 バシラス・チューリンゲンシスＭ−7,NRRL B−15939 バシラス・チューリンゲンシス・バラエティ・テネブリ
オニス、DSM2803 次のバシラス・チューリンゲンシス（B.t.）培養基が
テキサス州ブラウンビルの合衆国農務省（USDA）から入
手できる。請求は、合衆国79520テキサス州ブラウンビ
ル、私書箱1033、合衆国農務省ARS、ジョー・ガルシア
（Joe Garcia）宛て。
B.t.HD2 B.t.バラエティ・フィニチムスHD3 B.t.バラエティ・アレスチHD4 B.t.バラエティ・カースタキHD73 B.t.バラエティ・ソットウHD770 B.t.バラエティ・デンドロリムHD7 B.t.バラエティ・ケニヤエHD5 B.t.バラエティ・ガレリアエHD29 B.t.バラエティ・カナデンシスHD224 B.t.バラエティ・エントモシダスHD9 B.t.バラエティ・サブトキシクスHD109 B.t.バラエティ・アイザワイHD11 B.t.バラエティ・モリソニHD12 B.t.バラエティ・オストリニアエHD501 B.t.バラエティ・トルワーシHD537 B.t.バラエティ・ダルムシュタジエンシスHD146 B.t.バラエティ・ツマノフィHD201 B.t.バラエティ・キュウシュエンシスHD541 B.t.バラエティ・トンプソニHD542 B.t.バラエティ・パキスタニHD395 B.t.バラエティ・イスラエレンシスHD567 B.t.バラエティ・インディアナHD521 B.t.バラエティ・ダコタ B.t.バラエティ・トウホクエンシスHD866 B.t.バラエティ・クマノトエンシスHD867 B.t.バラエティ・トチギエンシスHD868 B.t.バラエティ・コルメリHD847 B.t.バラエティ・ウハネンシスHD525 本発明の主な対象はB.t.毒素のホスト範囲を変更する
方法に対するものであるが、他のバシラス毒素生産微生
物にも同様に適用できる。出発材料として使用できるこ
のようなバシラス生物の例は、次のとおりである。
バシラス・セレウス、ATCC21281 バシラス・モリタイ、ATCC21282 バシラス・ポピリアエ、ATCC14706 バシラス・レンチモルブス、ATCC14707 バシラス・スファエリクス、ATCC33203 本明細書に例示されているB.t.M−７は、鞘翅目（Col
eoptera）の甲虫の対し驚異的な活性をもつが、トリコ
プルシア・ニ（Trichoplusia ni）、スポドプテラ・エ
クシグア（Spodoptera exigua）、又はネッタイシマ蚊
（アエデス・アエギプチAedes aegypti）に対して活性
をもたないバシラス・チューリンゲンシスの単離体であ
る。鞘翅目に含まれるものとしては、農業上の大損害を
もたらす種々のディアブロティカ種（ハムシ科Chrysome
lidae）、例えばディー・ウンデシムプンクタータ（D.u
ndecimpunctata西部班点ウリハムシ）、ディー・ロンギ
コルニス（D.longicornisノーザン・コーン・ルートワ
ーム）及びディー・ウンデシムプンクタータ・ハワーデ
ィ（D.undecimpunctata howardiサザン・コーン・ルー
トワーム）がある。
B.チューリンゲンシスＭ−７は、独特のパラ胞子体
（結晶）をもつ点で異例である。これは位相差顕微鏡下
に暗色で、平らな四角型の外形を呈する。
本発明方法の出発材料として使用されるDNA配列によ
ってコードされた殺虫剤は微生物でつくられる任意の毒
素でありうる。例えばこれは、昆虫類、例えば鞘翅目、
鱗翅目、双翅目、半翅目、革翅目、及び直翅目；又はク
モ形類；腹足類；又は線虫類とへん形動物のようなぜん
虫など、真核多細胞の害虫に対して毒性をもつポリペプ
チドでありうる。感受性のある種々の昆虫は、甲虫、
ガ、ハエ、バッタ、シラミ、及びハサミムシを包含す
る。
更に、これは活性型又は、毒素活性のためになおも処
理を要する前駆型ないしプロ型でつくられるポリペプチ
ド、例えば害虫による処理を必要とするB.チューリンゲ
ンシス・バラエティ・カースタキの新規な結晶毒素であ
りうる。
本発明方法によってつくられ、キメラ毒素生産用のDN
A配列を含有する構造体は標準手順を使用して適当なホ
ストに形質転換できる。例示的なホスト細胞は原核生物
か真核生物を包含するが、通常、ほ乳類のような高等動
物に有毒な性質を生じない細胞に限定される。しかし、
毒素が不安定か、ほ乳類ホストへの毒性の可能性を回避
するのに十分な低い施用水準である場合には、高等生物
に有毒な物質をつくる生物でも使用できる。ホストとし
て、特に興味あるものは、原核生物とカビのような低級
真核生物である。グラム陰性と陽性双方の原核生物の例
はエシェキリア（Escherichia）、エルウィニア（Erwin
ia）、シゲラ（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）
及びプロテウス（Proteus）のような腸内細菌科（Enter
obacteriaceae）；バシラス科（Bacillaceae）；リゾビ
ウム（Rhizobium）のようなリゾビウム科（Rhizobiacea
e）；発光細菌、ジモモナス（Zymomonas）、セラティア
（Serratia）、アエロモナス（Aeromonas）、ビブリオ
（Vibrio）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、ス
ピリルム（Spirillum）のようならせん菌科；乳酸かん
菌科；シュードモナス（Pseudomonas）及びアセトバク
ター（Acetobacter）のようなシュードモナス科；アゾ
トバクター科及びニトロバクター科を包含する。真核生
物には藻菌類（Phycomycetes）と子のう菌類（Ascomyce
tes）のようなカビがあり、これはサッカロミセス（Sac
charomyces）とシゾザッカロミセス（Schizosaccharomy
ces）のような酵母、ロードトルラ（Rhodotorula）、ア
ウレオバシジウム（Aureobasidium）、スポロボロミセ
ス（Sporobolomyces）のような担子菌類（Basidiomycet
es）酵母を包含する。
生産目的のためのホスト細胞を選択する上で特に興味
ある特性は、キメラ毒素生産用遺伝子のホストへの導入
の容易さ、発現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺虫
剤の安定性、及び補助的遺伝子能力の存在を包含する。
殺虫剤ミクロカプセルとして使用するのに興味ある特性
は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッケージング又
は封入体の形成のような殺虫剤保護性：葉親和性：対ほ
乳類毒性の欠如；害虫に摂取させるための誘引力；毒素
に損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包含する。他の
考慮としては、処方と取り扱いの容易さ、経済性、保存
安定性等がある。
特に興味あるホスト生物は、ロードトルラの種、アウ
レオバシジウムの種、及びサッカロミセスの種のような
酵母；シュードモナスの種、エルウィニアの種及びフラ
ボバクテリウムの種のような葉面に生息する生物；又は
エシェリキア、乳酸かん菌の種、バシラスの種等の他の
生物を包含する。特定的な生物はシュードモナス・アエ
ルギノサ（Pseudomonas ae−ruginosa）、シュードモナ
ス・フルオレセンス（P.fluorescens）、サッカロミセ
ス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、バシ
ラス・チューリンゲンシス、大腸菌、枯草菌（B.subtil
is）を包含する。
キメラ毒素生産用遺伝子は、任意慣用の方法でホスト
に導入でき、染色体に保持されるか、又はホストゲノム
中に組み込まれる。
安定保持用の自律的複製断片（ars）と組合わせたプ
ラスミド、ウイルス、又は動原体からの複製系を含めた
種々の構造体が使用できる。組込みだけを望んでいる場
合は、複製を提供する構造体でトランスポゾンか、トラ
ンスポゾン様挿入活性をもつもの、又はホストゲノムと
の相同を提供する構造体を使用できる。DNA配列は、染
色体又はプラスミドのホストゲノム中の配列と相同であ
るような配列間にキメラ毒素生産遺伝子をもつものを使
用できる。キメラ毒素生産遺伝子が複数のコピーで存在
するのが好ましい。例えば、合衆国特許第4,399,216号
を参照のこと。このように、遺伝子を導入するには、接
合、形質導入、トランスフェクション、及び形質転換を
使用できる。
ベクターは、ColE1,P−１不和合性プラスミド、例え
ばpRK290、酵母2mμプラスミド、ラムダ等のような真核
及び原核複製系に依存した多数のベクターが現在入手で
きる。
染色体外要素を使用する場合は、DNA構造体は、この
構造体を含有するホスト細胞の選定を可能とするような
マーカーを包含するのが好ましい。マーカーは、一般に
殺生物耐性、例えば抗生物質耐性や重金属耐性、栄養要
求ホストに原栄養性をもたらす相補性等を提供するもの
である。複製系はランナウェー複製のような特別な性状
を提供でき、cos細胞その他の特徴をもちうる。
キメラ毒素生産遺伝子がホスト細胞によって認識され
る転写及び翻訳開始及び終結の調節信号をもつ場合は、
これらの調節特徴を遺伝子と連係させて使用するとうま
くいくことが多い。しかし、キメラ毒素生産遺伝子が、
例えばリーダー配列を除いたり全遺伝子が前駆体をコー
ドしている場合に殺虫剤の成熟型をコードする配列を提
供したりするため変更されているような状況において
は、天然のものとは異なる転写開始の調節配列が提供さ
れるようにDNA配列を操作する必要がしばしばある。
広範囲のホストに対して広範囲の転写開始配列が存在
する。この配列は、殺虫剤の構成的発現を提供でき、ま
た化学物質、例えば代謝物質や、温度、調節可能なリプ
レッサーによって調節を引出せる場合は調節発現を提供
できる。例として、合衆国特許第4,374,927号を参照の
こと。プロモーターの特定的な選択は、プロモーターの
強さ、細胞の生育力へのプロモーターの干渉、細胞に内
在する調節機構のプロモーターへの影響等の幾つかの因
子に依存しよう。商業的給源を含めた広範囲の給源から
の多数プロモーターが利用できる。
キメラ毒素生産用の殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホス
トは、任意慣用の栄養培地中で生育できる。そこにおい
てDNA構造体は選択的な利点を提供しており、細胞の全
部又は実質的に全部がキメラ毒素生産遺伝子を保持する
ように選択培地を用意する。これらの細胞は慣用方向に
従って収穫でき、上記の種々の方法で変更できる。その
代りに、細胞を収穫する前に固定することもできる。
キメラ毒素生産用DNA配列を含有するように形質転換
させたホスト細胞は、目標害虫環境への細胞施用時に殺
虫剤活性を持続させるために処理できる。この処理は、
殺虫活性を保持しながら、プロテアーゼ不活性又は細胞
壁強化条件下にホスト細胞を殺菌するものである。
細胞を種々の方法で増殖から阻止できるが、その手法
は殺虫剤性状に悪影響せず、殺虫剤を保護する細胞能力
を消さないものとする。手法としては物理的処理、化学
的処理、細胞の物理的性質の変更、又は細胞の物理的性
質を実質的に無傷に残す方法などがある。
ホスト細胞を不活性化する種々の手法は、通常50℃な
いし70℃の加熱、冷凍、紫外線照射、凍結乾燥：毒素
類、例えば抗生物質、フェノール、アニリド類、例えば
カリバニリドとサリチルアニリド；ヒドロキシユリア；
第四級塩；アルコール；抗菌染料;EDTA及びアミジン；
ハロゲン化剤、例えば塩素化剤、臭素化剤又はヨウ素化
剤のような非特異的有機及び無機化学物質；アルデヒド
類、例えばグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒド；
オゾンと酸化エチレンのような有毒ガス；過酸化物；ブ
ソラレン；乾燥剤等を包含し、これらを個々に又は組合
わせて使用できる。薬剤の選択は特定殺虫剤、ホスト細
胞の性質、架橋剤による細胞壁の固定と保存のような細
胞構造変更の性質などに依存している。
一般に細胞は強化された構造安定性をもち、これが畑
で環境的劣化への抵抗力を強化する。殺虫剤がプロ型の
場合は、目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟
型への処理を阻止しないように不活性化方法を選択すべ
きである。例えば、ホルムアルデヒドはタンパクを架橋
し、ポリペプチド殺虫剤のプロ型の処理を阻止しうる。
不活性化ないし殺菌法は毒素の生物学的利用率又は生物
活性の少なくとも実質部分を保持する。
生物の処理法は幾つかの役割を果たしている。第一
に、処理は構造一体性を高める。第二に、タンパク分解
への毒素の感受性を減少させるように毒素を変更するこ
とにより、また細胞内に天然に存在するプロテアーゼの
タンパク分解活性を減少させることにより、処理は毒素
の強化されたタンパク分解安定性を提供する。細胞が無
傷の段階にあり、毒素タンパクの実質的蓄積がなされた
時に、細胞を変更するのが好ましい。これらの変更は広
いスペクトラムの化学反応性をもつ化学試薬を使用する
など、種々の方法でこれらの変更を達成できる。約−10
℃ないし60℃の範囲の温度で、かきまぜを加えて、又は
加えずに、化学試薬を含有する液体試薬培地と無傷の細
胞を一緒にできる。反応時間は経験的に決定でき、試薬
と反応条件により大幅に変わる。細胞濃度は、ml当たり
102ないし1010の範囲にある。
化学試薬として特に興味あるものは、ハロゲン化剤、
特に原子番号17−80のハロゲンである。もっと特定的に
は、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を達成するの
に十分な時間に使用できる。他の適当な手法は、ホルム
アルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド
類；塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのような
抗感染剤；イソプロピルアルコールとエタノールのよう
なアルコール類；ブアン固定剤とヘリー固定剤［フマソ
ン（Humason）、グレッチェン・エル（Gretchen,L.）
「動物組織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、
1967年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での
処理；又は目標害虫環境に細胞を施用する時に細胞中に
つくられる毒素の活性を持続するような物理的処理（加
熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。
ヨウ素でのハロゲン化には、温度は概して約０℃ない
し50℃の範囲にあるが、反応は室温で都合よく行なわれ
る。酸性の水性媒体、特に約0.5−5Mの範囲のカルボン
酸水溶液中における0.5ないし５％の三ヨウ化物又はヨ
ウ素を使用して、ヨウ素化を行なうと好都合である。酢
酸を都合よく使用できるが、一般に約１ないし４個の炭
素原子の他のカルボン酸類も使用できる。反応時間は概
して１分未満から約24時間、通常約１ないし６時間の範
囲にある。任意の残留ヨウ素は、ジチオナイトやチオ硫
酸ナトリウムのような還元剤、又は畑での最終使用に適
合できる他の還元剤との反応によって除去できる。更
に、当業者に周知のように、反応媒体全部を除くための
洗浄、乾燥型での単離、及び典型的な粘着剤、展着剤、
及び農業用に一般に利用される助剤の処方など、変更細
胞をなおも処理にかけることができる。
特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬であ
る。この目的には幾つかの試薬が知られている。処置は
殺虫剤の安定性を強めるべきものである。すなわち、畑
条件下に殺虫剤の強化された持続性又は残留活性がなけ
ればならない。従って、未処理細胞の殺虫活性が消える
ような条件下に、処理細胞の活性は１倍から３倍の長期
間持続する。
環境中の使用のため細胞を種々の方法で処方できる。
これら無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩又は燐
酸塩）や植物材料（トウモロコシ穂軸、モミ殻又はクル
ミ殻）のような種々の不活性材料と混合することによっ
て、水和剤、粒剤、粉剤として使用できる。処方剤は粘
着／展着助剤、安定化剤、他の殺虫剤添加剤又は表面活
性剤を包含できる。液体処方剤は水性基盤又は非水性の
もので、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用さ
れる。成分は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤、重
合体類等を包含できる。
殺虫剤濃度は、特定処方剤の性質、例えばそれが濃厚
液か未希釈液で使用されるかによって変わる。一般に殺
虫剤は、少なくとも約１重量％の濃度で存在するが、10
0重量％まで可能である。乾燥処方剤は、約１ないし95
重量％の殺虫剤をもつが、液体処方剤は一般に液相中に
固形分約１−60重量％であろう。処方剤は一般にmg当た
り102ないし108（1E2−1E8）個の細胞数をもつ。
処方剤を害虫環境例えば植物、土壌又は水に、噴霧、
散布、散水等により施用できる。これらの処方剤は必要
に応じヘクタール当たり約２オンス（液体又は乾燥）〜
２ポンド以上の率で投与できる。
以下は本発明を実施するための最善の態様を含めた手
順を例示している。これらの実施例は限定的に考えられ
てはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重
量、溶媒混合物の割合はすべて容量による。
実施例１ プラスミドpEW1の構築 ｋ−１遺伝子は、シュネフ（Schnepf）ら（J.Biol.Ch
em.260巻6264−6272頁、1985年）が既述しているhd−１
遺伝子である。ｋ−１遺伝子をBal31で位置504まで５′
未満から切除した。この位置にSalIリンカー（５′GTCG
ACC3′）を付加した。遺伝子の３′末端を4211位置で酵
素Nde Iで切断し、DNAポリメラーゼのクレノフ断切でブ
ラントエンドにした。
クローニングベクターpUC8［メッシング・ジェイ（Me
ssing,J.）及びビエイラ・ジェイ（Vieira,J.）［198
2］Gene19巻269−276頁］は、ファーマシア社（ニュー
ジャージー州ピスキャタウェー）から購入できるもの
で、これをSal IとEcoR Iとで切断し、同じ酵素で切断
されたプラスミドpBR322へクローン化した。trpプロモ
ーター（ジェンブロック社、ファーマシア社から入手可
能）をクレノフにより５′未満でブラントエンドにし、
ベクターのSma I位置への５′未満のブラントエンド結
合及びベクターのSal I位置への３′未満の挿入によ
り、このハイブリッドベクターへ挿入した。次に、５′
未満のSal I位置を用い、そしてベクターのPvu II位置
への３′未満のブラントエンド結合を使用してｋ−１遺
伝子を挿入した。pEW1と呼ばれるこの構造体の模式図を
図面の第１図に示す。
プラスミドpEW1は、B.t.毒素ｋ−１をコードしたDNA
配列を含んでいる。
実施例２ プラスミドpEW2の構築 ｋ−73遺伝子はアダング（Adang）ら（Gene36巻289−
300頁、1985年）が記述したHD−73遺伝子である。ｋ−7
3遺伝子の位置176をNsi Iで切断した。次に配列の位置3
212をHind IIIで切断し、残基176−3212からなる3036塩
基の断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。
実施例１に述べたとおりにつくられるプラスミドpEW1
もHind IIIで切断し（第１表の位置3345）、部分的にNs
i Iで消化させた（第１表の位置556）。上に明らかにさ
れたｋ−73からの3036塩基の断片を、pEW1のNsiIからHi
ndIIIにかけての領域に挿入し、ｋ−１遺伝子の対応切
断と置換し、プラスミドpEW2をつくった。pEW2の模式図
を図面の第２図に示す。
プラスミドpEW2はB.t.毒素ｋ−73をコードしたDNA配
列を含んでいる。
実施例３ プラスミドpEW3の構築 ｋ−１遺伝子をSac Iにより、位置1873で切断した。
次に遺伝子をHind IIIによる部分的消化にかけ、残基18
73−3345からなる1427塩基の断片をアガロースゲル電気
泳動によって単離した。プラスミドpEWをSac I及びHind
IIIで切断し、プラスミド全体からｋ−２遺伝子のSac I
からHindIIIにかけての断片を差引いたものを表わす大
きな断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離し
た。次にｋ−１遺伝子からの1427塩基断片をpEW2のSac
IからHind IIIにかけての領域と連結させてプラスミドp
EW3をつくった。pEW3の模式図を図面の第３図に示す。
プラスミドpEW3はB.t.キメラ毒素ｋ−73/k−１（pH
Y）をコードしたDNA配列を含んでいる。
キメラ毒素をコードしたヌクレオチド配列を第１表に
示す。推論アミノ酸配列を第1A表に示す。
実施例４ プラスミドpEW4の構築 ｋ−１遺伝子をNsi Iにより、位置556で切断した。次
に遺伝子をSac Iにより位置1873で切断し、Nsi IからSa
c Iまでの1317塩基断片をアガロースゲル電気泳動によ
って単離した。プラスミドpEW2をSac Iで切断し、次い
でNsa Iによる部分的消化にかけた。プラスミド全体か
ら、ｋ−73遺伝子のNsi IからSac Iにかけての領域を差
引いたものを表わす大きな断片を、アガロースゲル電気
泳動によって単離した。次に遺伝子ｋ−１のNsi IからS
ac Iにかけての1317塩基断片を、pEW2のNsi IからSac I
への領域に再結合させてプラスミドpEW4をつくった。pE
W4の模式図を図面の第４図に示す。
キメラ毒素をコードしたヌクレオチド配列を第２表に
示す。導かれるアミノ酸配列は表2Aである。
プラスミドpEW4はB.t.キメラ毒素ｋ−1/k−73（PHY）
をコードしたDNA配列を含んでいる。
実施例５ 植物へのキメラ毒素遺伝子の挿入 本明細書で明らかにされているキメラ殺虫剤毒素をコ
ードした遺伝子は、アグロバクター・ツメファシエンス
（Agrobacter tumefaciens）からのTiプラスミドを使用
して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植物中で
再生させることができる［ザンブリスキー・ピー（Zamb
ryski,P.）、ヨウス・エッチ（Joos,H）、ジェンテロ・
シー（Gentello,C.）、リーマンス・ジェイ（Leemans,
J.）、バン・モンタギュー・エム（Van Montague,M.）
及びシェル・ジェイ（Schell,J.）（1983年）EMBO J.2
巻2143−2150頁；バートク・ケイ（Bartok,K.）、ビン
ス・エイ（Binns,A.）、マツケ・エイ（Matzke,A.）及
びチルトン・エムディー（Chilton,M−D.）（1983年）C
ell32巻1033−1043頁］。この点で特に有用なベクター
はpEND4Kである［クリー・エッチ・ジェイ（Klee,H.
J.）、ヤノフスキー・エム・エフ（Yanofsky,M.F.）、
及びネスター・イー・ダブリュー（Nester,E.W.）（198
5年）Bio Technology3巻637−642頁］。このプラスミド
は植物細胞中及び細菌中で複製でき、パッセンジャー遺
伝子に対して複数のクローニング部位をもっている。例
えば毒素遺伝子をpEND4KのBamHI位置に挿入し、大腸菌
で増殖させ、適当な植物細胞中に形質転換させることが
できる。
実施例６ B.チューリンゲンシス遺伝子のバクロウウイ
ルスへのクローン化 本明細書で明らかにされたB.t.キメラ毒素をコードし
た遺伝子を、オートグラファ・カリフォルニカ核ポリヘ
ドロシスウイルス（Autographa californica nuclear p
olyhedrosis virus,AcNPV）のようなバクロウイルスヘ
クローン化できる。pUC8のような商業的クローニングベ
クターヘクローン化されたAcNPCゲノムを含有するプラ
スミドを構築できる。ポリヘドロン（多角体）遺伝子が
除去され、パッセンジャー遺伝子に対する特異なクロー
ニング領域がポリヘドロンプロモーターのすぐ背後に置
かれるように、AcNPCゲノムを変更する。このようなベ
クター類の例は、ペノックらが記述したpGPB6874［ペノ
ック・ジー・ディー（Pennock,G.D.）、シューメーカー
・シー（Shoemaker,C.）、及びミラー・エル・ケイ（Mi
ller,L.K.）（1984年）Mol.Cell Biol.4巻399−406頁］
及びスミスらが記述したpAC380［スミス・ジー・イー
（Smith,G.E.）、サマース・エム・ディー（Summers,M.
D.）及びフレーザー・エム・ジェイ（Fraser,M.J.）（1
983年）mol.Cell Biol.3巻2156−2165頁］である。ｋ−
1,k−73,k−73/k−1,k−1/k−73又は他のB.t.遺伝子コ
ードした遺伝子を、コード領域から上下流の適当な領域
でBamH Iリンカーにより変更し、一つのAcNPVベクター
のパッセンジャー部位に挿入できる。
実施例７ ACB−１と指定されるキメラ毒素 試験した３種の昆虫全部に対する強化された毒性が、
ACB−１と指定された毒素によって示された。毒素ACB−
１（第3A表）はプラスミドpACB−１（第３表）によって
コードされる。pEW（実施例３）と比較した、pACB−１
コードされた殺虫活性は、次のとおりである。
上の試験は既述の条件を用いて行なった。
上の結果は、ACB−１毒素が３種の昆虫全部に対し
て、他の毒素に比べて最高の複合活性をもつことを示し
ている。
プラスミドpACB−１は、寄託呼出し番号NRRL B−1810
1をもつ野性型B.チューリンゲンシス菌株MTX−36の可変
領域と、HD−71の可変領域との間で、次のように構築さ
れた。MTX−36:N−未満からSac I部位まで;HD−71:Sac
IからＣ−末端まで。
全プラスミドDNAを標準手順により菌株MTX−36からつ
くった。DNAを制限酵素Spe I及びDra Iによる完全な消
化にかけた。消化物をアガロースゲル電気泳動により、
大きさに従って分離し、標準手順を使用する電気溶離に
よって1962bpの断片を精製した。
プラスミドpEW2を精製し、Spe Iで完全に消化させ、D
ra Iによる部分的消化にかけた。消化物をアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、4138bpの断片を上のように電気溶離
によって精製した。
二断片（MTX−36からの1962bpとpEW2からの4138bp）
を連結してpACB構造体をつくった。
プラスミドDNAをpACBから調製し、Sac IとNdeIで完全
に消化させ、アガロースゲル電気泳動に続く電気溶離に
よって3760bpの断片を単離した。
プラスミドpEW2をSac I及びNde Iで完全に消化させ、
アガロースゲル電気泳動に続く電気溶離によって2340bp
の断片を単離した。
二断片（pACBからの3760bpとpEW1からの2340bp）を連
結して、構造体pACB−１をつくった。
pACB−１遺伝子の完全なヌクレオチド配列を決定し、
毒素の導き出されたアミノ酸配列をpEW3（EW3）でコー
ドされた毒素について決定されたものと比較した。その
結果、ACB−１毒素の導きだされたアミノ酸配列は２箇
所の例外を除き、EW3の配列と同一であった。例外は次
のとおりである。（１）EW3のアスパラギン酸残基411が
ACB−１ではアスパラギンに変わっていた。（２）EW3の
グリシン酸基425は、ACB−１ではグルタミン酸に変わっ
ていた。これらの２アミノ酸の変化が両菌株間の昆虫毒
性のあらゆる変化の原因である。EW3毒素のアミノ酸配
列は、第１表に報告されたとおりである。この両毒素を
模式的に表示すると次の通りである。
上の開示は、二つ以上の毒素遺伝子の可変領域を生体
外で組替えることを含む、バシラス毒素のホスト範囲を
変更するための本発明方法を更に例示したものである。
キメラ毒素がつくられたら、毒素をコードした遺伝子
を、上で明らかにされたように、標準手順によって配列
決定できる。望んでいる新規な毒素を得るために、既知
の分子生物学的手順によって他のDNAを変更するために
シークェンシングデータを使用できる。例えば、HD−73
からのACB−１遺伝子を上記のように変化させると、次
のようにACB−１遺伝子の構築が可能となる。
毒素に対するコード配列を変更することによってプラ
スミドpEW3,NRRL B−18034,を変更した。コード配列の
ヌクレオチド残基1199でのAcc I制限位置及び残基1350
でのSac I制限位置によって結合された151bpのDNA断片
を、標準手順を使用する指示された制限エンドヌクレア
ーゼによる消化によって除去した。除去された151bpのD
NA断片を、標準手順により、次の合成DNAオリゴマーと
置き換えた。
A TAC AGA AAA AGC GGA ACG GTA GAT TCG CTG AAT GAA ATA CCG CCA CAG AAT AAC AAC GTC CCC CCG AGG CAA GAA TTT AGT CAT CGA TTA AGC CAT GTT TCA ATG TTT AGA TCT GGC TTT AGT AAT AGT AGT GTA AGT ATA ATA AGA GCT この変化の正味の結果は、pEW3によってコードされた
毒素中の位置411のアスパラギン酸残基（第１表）がア
スパラギンに転化され、位置425のグリシン残基がグル
タミン酸残基に転化されることである。これらの遺伝子
でコードされる他のアミノ酸はすべて同一である。
上述のように、位置411と425で行なわれた変化は、毒
素EW3におけるこれらの２位置の感受性をはっきりと示
している。従って、発明の範囲は変化に参加している特
定アミノ酸に限定されない。発明の範囲はこれらの位置
における他の19アミノ酸の全部の置換を包含する。これ
は次の図式によって示される。
式中Ｘは、位置425のアミノ酸がGlyの時には、Aspを
除く20個の普通アミノ酸の一つであり、Ｙは、位置411
のアミノ酸がAspの時にはGlyを除く20個のアミノ酸の一
つである。20個の普通アミノ酸は次のものである。アラ
ニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、
システイン、グルタミン、グルタミン酸塩、グリシン、
ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオ
ニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニ
ン、トリプトファン、チロシン、及びバリン。
実施例８ SYW1と指定されるキメラ毒素 試験昆虫に対する強化された毒性はSYW1と指定される
毒素によって示された。毒素SYW1（第4A表）はプラスミ
ドpSYW1（第４表）によってコードされる。pEW1（実施
例１）及びpEW2（実施例２）と比較した、pSYW1でコー
ドされる殺虫活性は次のとおりである。
上の試験は既述の条件を用いて行なった。
プラスミドpSYW1を次のように構築した。
pEW2からのプラスミドDNAを標準手順によってつく
り、制限酵素Asu IIによる完全な消化、及びEcoR Iによ
る部分消化にかけた。5878bpの断片を標準手順による消
化物のアガロースゲル電気泳動後、電気溶離によって精
製した。
菌株HD−１からのプラスミドDNAをつくり、制限酵素A
su II及びEcoR Iによる完全な消化にかけた。消化物の
アガロースゲル電気泳動後、222bpの断片を電気溶離に
よって精製した。
２断片（pEW2からの5878bpとHD−１からの222bp）を
標準手順により一緒に連結させて構造体pSYW1をつくっ
た。
EW3からの毒素SYW1におけるアミノ酸の変化（３）は
次の三つである。（１）EW3のアルギニン残基289がSYW1
中でグリシンに変化した。（２）EW3のアルギニン残基3
11がSYW1ではリジンに変わった。（３）チロシン残基31
3はSYW1ではグリシンに変わった。これらの２毒素の模
式的に表示すると、次のとおりである。
上述の位置289、311及び313で行なわれた変化は、毒
素EW3のこれら３位置の感受性をはっきりと示してい
る。従って、発明の範囲は変化に参加しているとして示
される特定アミノ酸に限定されない。発明の範囲はこれ
らの位置における普通アミノ酸の全部の置換を包含す
る。これは次の図式によって示される。
式中Ｘは、位置311のアミノ酸がArgで、位置313のア
ミノ酸がTyrの時には、Argを除く20個の普通アミノ酸の
一つであり、Ｙは、位置289のアミノ酸がArgで、位置31
3のアミノ酸がTyrの時にはArgを除く20個のアミノ酸の
一つであり、またＺは位置289のアミノ酸がArgで、位置
311のアミノ酸がArgの時には、Tyrを除く20個の普通ア
ミノ酸の一つである。
SYW1遺伝子の構築は、プラスミドpEW3からのACB−１
遺伝子の構築について上に明らかにされた手順により、
合成DNAオリゴマーに適当な変化を加えて実施すること
ができる。
この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列
は、DNAのヌクエオチド配列により決る。遺伝暗号の重
剰性のため、即ちタンパクを造るのに使用のアミノ酸の
殆どに対し、一以上のコードヌクエオチドトリプレット
（コドン）が使用できるため、特定アミノ酸に対して異
なるヌクエオチド配列がコードできる。このため遺伝暗
号を以下のように描くことができる。
フェニルアラニン（Phe）TKK ヒスチジン（His） CAK ロイシン（Leu） XTY グルタミン（Gln） CAJ イソロイシン（Ile） ATM アスパラギン（Asn） AAK メチオニン（Met） ATG リシン（Lys） AAJ バリン（Val） GTL アスパラギン酸（Asp） GAK セリン（Ser） QRS グルタミン酸（Glu） GAJ プロリン（Pro） CCL システイン（Cys） TGK スレオニン（Thr） ACL トリプトファン（Trp） TGG アラニン（Ala） GCL アルギニン（Arg） WGZ チロシン（Tyr） TAK グリシン（Gly） GGL 終結信号 TAJ 解読：各３文字のデオキシヌクレオチドトリプレット
が、左側に５′末端と右側に３′末端をもつmRNAのトリ
ヌクレオチドに対応している。本明細書で与えられるDN
Aはすべて、ウラシルについてはチミンで置き換えられ
た。mRNA配列に対応する配列のDNA鎖である。文字はデ
オキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジ
ン塩基を表わしている。Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡ又はＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はＣ ＹがＣ又はＴの場合は、Ｘ＝Ｃ ＸがＣの場合は、Ｙ＝A,G,C又はＴ ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はＧ ＺがＡ又はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はＡ ＺがＣ又はＴの場合は、Ｗ＝Ｃ ＷがＣの場合は、Ｚ＝A,G,C又はＴ ＷがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ ＳがA,G,C又はＴの場合は、QR＝TC;その代わりにＳがＴ
又はＣの場合は、QR＝AG Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝A,T,C又はＧ Ｍ＝A,C又はＴ 上は、キメラ毒素及び他の有用なタンパクの新規なア
ミノ酸配列が、タンパクの同じアミノ酸配列をコードし
た均等ヌクレオチド配列で造られることを示す。従っ
て、本発明はこのような均等ヌクレオチド配列を包含す
る。更に、アミノ酸配列を変更してもタンパクの二次構
造が不変なら、確認された構造と機能のタンパクを該変
更で構築できると分った［カイザー・イー・ティー（Ka
iser,E.T）及びケズディ・エフ・ジェイ（Kezdy,F.J.）
（1984年）Science223巻249−255頁］。このように、本
発明はタンパクの二次構造を変更しないような、本明細
書に記載のアミノ酸配列のムテインを包含する。
第1A及び2A表で使用されているアミノ酸に対する１文
字の記号は、この技術で周知である。便宜上、アミノ酸
に対する３文字の略字と１文字の記号の関係を示すと、
次の通である。
Ala Ａ Arg Ｒ Asn Ｎ Asp Ｄ Cys Ｃ Gln Ｑ Glu Ｅ Gly Ｇ His Ｈ Ile Ｉ Leu Ｌ Lys Ｋ Met Ｍ Phe Ｆ Pro Ｐ Ser Ｓ Thr Ｔ Trp Ｗ Tyr Ｙ Val Ｖ 本明細書に記載の全研究は、NIHガイドラインで特定
の物理及び生物学的隔離の要件に準拠し行なわれた。
上のプラスミドを含有する組替え大腸菌細胞をＬ−ブ
ロス＊中で一夜生育させた。細胞をペレット状にし、0.
85％NaClに再懸濁した。これらの細胞懸濁液につき575n
mで光学密度を測定し、0.85％NaCl中で適当な希釈を行
なった。各希釈の3mlを合衆国農務省ダイエット（餌）2
7ml［ダルメージ・エッチ・ディー（Dulmage,H.D.）、
マルチネイス・エイ・ジェイ（Martinez,A.J.）及びペ
ナ・ティー（Pena,T.）（1976年）合衆国農務省、農業
研究サービス技術ブレティン第1528号、合衆国政府印刷
局、ワシントンD.C.］に添加した。次にダイエット／毒
素混合物をプラスチック製組織培養トレー中の24個の縦
穴に分配した（1.0ml/縦穴）。トリコプルシア・ニ（Tr
ichoplusia ni）、スポドプテラ・エクシグア（Spodopt
era exigua）、又はヘリオシス・ジー（Heliothis ze
a）からの新生幼虫１匹を各縦穴に入れた。次にトレー
をマイラーで覆い、空気交換用の小穴を明けた。幼虫を
７日後に観察し、プロビット分析法を用いてLC50値を計
算した［フィニー・ディー・ジェイ（Finney,D.J.）（1
971年）プロビット分析、第３版、ケンブリッジ大学プ
レス、ケンブリッジ］。
＊Ｌ−ブロスは5g/l NaCl、10g/lバクトトリプトン、5
g/l酵母エキス。
種々のプラスミドを含有する大腸菌の一夜培養基を遠
心分離にかけ、1mM EDTA1,0.2mM PMSF2,0.2mM TPCK3及
び100mM NaOHを含有する0.85％NaCl中に再懸濁した。細
胞をビードビータ（バイオスペック・プロダクツ社、オ
クラホマ州バートルビル）中で破壊し、遠心分離し、上
澄液を20mMトリス−グリシン（pH8.5）に対して透析し
た。毒素を0.7％トリプシンで活性化した。コリストニ
ュウラ・フミフェラナ（Choristoneura fu−miferana）
細胞系統CF−１について検定を行なった。1.0ml容量中
の3.2×105個の細胞に活性化毒素抽出液約100μｇを添
加した。30分の培養後にATP水準を測定し、懸濁液中に
残る生存細胞の比率を標準曲線から決定した。
１）エチレンジアミン四酢酸 ２）フッ化フェニルメチルスルホニル ３）１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチ
ルケトン
【図面の簡単な説明】
第１図はバシラス・チューリンゲンシス毒素ｋ−１をコ
ードしたDNA配列を含有するプラスミドpEW1の模式図、 第２図はバシラス・チューリンゲンシス毒素ｋ−73をコ
ードしたDNA配列を含有するプラスミドpEW2の模式図、 第３図はバシラス・チューリンゲンシスキメラ毒素ｋ−
73/k−１（pHY）をコードしたDNA配列を含有するプラス
ミドpEW3の模式図、 第４図はバシラス・チューリンゲンシスキメラ毒素ｋ−
1/k−73（pHY）をコードしたDNA配列を含有するプラス
ミドpEW4の模式図を表す。
フロントページの続き (72)発明者 エドワード アール．ウィルコックス アメリカ合衆国 92025 カリフォルニ ア州 エスコンディド マリーレンプレ イス 2623 (72)発明者 シイゥーユィン ウォング アメリカ合衆国 92122 カリフォルニ ア州 サンディエゴ キャサーコート 7116

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】二以上のバシラス毒素遺伝子の可変領域を
    生体外で組替えて、特定の昆虫ホストに対する毒性を増
    幅することからなる、毒素の昆虫ホスト範囲を拡大又は
    変更する方法。
  2. 【請求項２】バシラスがバシラス・チューリンゲンシス
    （Bacillus thuringiensis）である特許請求の範囲第１
    項に記載の方法。
  3. 【請求項３】バシラス・チューリンゲンシス・バラエテ
    ィ・カースタキ（Bacillus thuringiensis var.kurstak
    i）HD−１とバシラス・チューリンゲンシス・バラエテ
    ィ・カースタキHD−73の可変領域が生体外で組替えられ
    て、変更されたホスト範囲をもつキメラ毒素をコードし
    た遺伝子を生じる、特許請求の範囲第２項に記載の方
    法。
JP61295116A 1985-12-12 1986-12-12 バシラス・チューリンゲンシス毒素のホスト範囲を変更する方法 Expired - Fee Related JP2565696B2 (ja)

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US80812985A 1985-12-12 1985-12-12
US808129 1985-12-12
US90457286A 1986-09-05 1986-09-05
US904572 1986-09-05

Publications (2)

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JPS62143689A JPS62143689A (ja) 1987-06-26
JP2565696B2 true JP2565696B2 (ja) 1996-12-18

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