JPS63137684A - バチラス・チユリンゲンシスのキメラ殺虫性蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、鱗翅目幼虫であるコナガおよびハスモンヨト
ウに対し、殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシス
・アイザワイＩＰＬ株の２種の殺虫性蛋白遺伝子から構
築したキメラ殺虫性蛋白遺伝子、該遺伝子を含みこれを
大腸菌等の微生物菌体内で発現させる発現プラスミド、
該プラスミドを保持し、バチラス・チュリンゲンシスの
キメラ殺虫性蛋白を生産する微生物菌株、および該微生
物を培養することを特徴とするキメラ殺虫性蛋白の製造
方法に関する。

（従来の技術〉 バチラス・チュリンゲンシスの各種菌株は、胞子形成期
に殺虫性蛋白からなる１〜２μｍにおよぶ結晶を形成し
、この・結晶蛋白を摂取した昆虫は、摂食活動を停止し
、腸管破裂等ののち、死に至ることが知られている。バ
チラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原やエステラー
ゼ活性などにより２９亜種に分類されており、各々の菌
株は特異的、かつそれぞれ異なる殺虫活性を示す、各種
菌株の内から防除目的の害虫に対して最も有効な菌株を
選定し、それを培養することによって殺虫性蛋白を作ら
せ、菌体または菌体を含む培養液にタルク等を混合する
ことにより製痢を作製し、それを殺虫剤として用いる。

〈発明の目的） 本発明者らは、鱗翅目昆虫のなかでも野菜類の主要害虫
であるコナガおよびハスモンヨトウに対し強い殺虫活性
を示すバチラス・チュリンゲンシスの生産する殺虫性蛋
白から構築したキメラ蛋白を殺虫剤として利用すること
を目的として研究を行ない本発明を完成した。

（問題解決の手段〉 本発明者らは、コナガおよびハスモンヨトウに対し殺虫
活性を示すバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩ
ＰＬ株のプラスミドＤＮＡから殺虫性蛋白をコードする
遺伝子をクローン化した後同遺伝子の構造遺伝子部分の
３４６５塩基の全配列を決定し、殺虫性蛋白（以下、１
２５ＫＤ殺虫性蛋白と呼ぶ）の１次構造を解明した（特
願昭　６Ｏ−２４２５２８）、この１２５ＫＤ殺虫性蛋
白の遺伝子を各種の発現ベクターに接続し微生物へ導入
することにより１２５ＫＤ殺虫性蛋白を生産する微生物
を製造し、この微生物を培養することにより同蛋白を大
量に生産する製造方法を完成した（特願昭　６１−０２
４５６３　）。

さらに、本発明者らは、バチラス・チュリンゲンシス・
アイザワイＩＰＬ株の染色体ＤＮＡから上述の１２５Ｋ
Ｄ殺虫性蛋白遺伝子と異なる殺虫性蛋白遺伝子をクロー
ン化した後、同遺伝子の構造遺伝子部分の全塩基配列を
決定して殺虫性蛋白（以下、１３０ＫＤ殺虫性蛋白と呼
ぶ）の１次構造を解明し、１３０ＫＤ殺虫性蛋白を大量
に生産する製造方法を完成した（特願昭　６ｌ−１９３
４８３）。

本発明者らは、バチラス・チュリンゲンシスの殺虫性蛋
白遺伝子についてさらに研究を重ねた結果、従来のバチ
ラス・チュリンゲンシス殺虫性蛋白とは異なる殺虫活性
を有するキメラ殺虫性蛋白の製造を目的として、上記２
種類の殺虫性蛋白遺伝子からキメラ殺虫性蛋白遺伝子を
構築し、これらのキメラ殺虫性蛋白遺伝子を微生物菌体
内で発現させる発現用プラスミド及び該プラスミドを保
持し該キメラ殺虫性蛋白を生産する微生物ｉ製造するこ
とに成功し、この微生物を培養することにより殺虫活性
を有するキメラ殺虫性蛋白を大量に生産する製造方法を
完成した。

（発明の構成） 本発明のキメラ殺虫性蛋白遺伝子は、殺虫性蛋白をコー
ドしている領域の特定の部分を他の殺虫性蛋白遺伝子の
相当する領域で置換することにより製造することができ
る。その例として、バチラス・チュリンゲンシス・アイ
ザワイＩＰＬ株の１２５ＫＯ殺虫性蛋白遺伝子を制限酵
素ＫＨｎｌ、　ｊ（ｉｎｄｌ［［で切断することにより
得られた、塩基番号１番目から２１７４番目＊　”？！
　（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　６１域（Ａ１）、２１７５番目
から２７４４番目までのＤ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域（Ａりある
いは２７４５番目から３４６５番目までのＤＮＡ領域（
Ａ３）を、同株の１３０ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子の相当す
る領域Ｃ，（１−２１７４）、Ｃ！（２１７５−２８２
２）、　Ｃｓ　（２８２３−３５２８）に置き換えるこ
とにより製造したキメラ殺虫性蛋白遺伝子６種（ＡＡＣ
，ＡＣＡ、ＡＣＣ，ＣＣＡ、ＣＡＡ、ＣＡＣ，と呼ぶ）
を挙げることができる。更に、殺虫性蛋白遺伝子のＡ１
およびＣ８に相当するＤ　Ｎ　Ａ　ｆｉｌ域を制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断して塩基番号１番目から９９４番目ま
でのＤＮＡｊｌ域（Ａ　ｔ　＋或いはＣ＋　＋　）と９
９５番目から２１７４番目までのＤ　Ｎ　Ａ　ｆｉｌ域
（Ａ　Ｉｚ或いはＣｔｚ）の２Ｍ域に分けることにより
１２５ＫＤおよび１３０ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子を各々４
領域に分け、１２５ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子（Ａ　ｒ　ｔ
　、　Ａ　ｌｔ　、　Ａ　ｔ　、Ａ　ｓ　）と１３０Ｋ
Ｄ殺虫性蛋白遺伝子ＣＣｒｒ、　Ｃｔｚ、　Ｃｚ、Ｃｓ
）のそれぞれの相当領域を置き換えることにより製造し
たキメラ殺虫性蛋白遺伝子を挙げることができる。　本
発明のキメラ殺虫性蛋白遺伝子は、例えば、バチラス・
チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株由来の１２５Ｋ
Ｄ殺虫性蛋白遺伝子を含むプラスミドρＴＢＩ　（特願
昭８０−２４２５２８＞及び１３０ＫＤ殺虫性蛋白遺伝
子を含むプラスミドｐＫＣ６（特願昭６ｌ−０２４５６
３）からそれぞれ必要部分を分離し、組合せを変えてつ
なぎ合わせることにより製造することができる。

本発明のキメラ殺虫性蛋白遺伝子の各領域の遺伝子の構
成を第１図および第２図に示した。

遺伝子組換え技術によれば基本となるＤＮＡの特定の部
位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を変化
させることなく、あるいはその特性を改善するように、
人為的に変異を起こすことができる０本発明により提供
される、天然の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡあるいは
天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡに
関しても同様に人為的に挿入、欠失、置換を行なうこと
により天然の遺伝子と同等あるいは改善された特性とす
ることが可能であり、本発明は、そのような変異遺伝子
をも含むものである。

本発明のバチラス・チュリンゲンシスのキメラ殺虫性蛋
白遺伝子を適当な発現ベクター、例えばｌａｃプロモー
ターを保持する発現ベクターｐＵｃ１Ｂ（ファルマシア
社）、大腸菌の強力プロモーターであるｔａｃプロモー
ターとｒｒｂＢリポソームＲＮＡのターミネータ−を保
持する発現ベクターρＫＫ２２３−４（特願昭６Ｏ−２
４２５２８）、ｔｒｐプロモーターを保持する発現ベク
ターｐＤＲ７２０（ファルマシア社）、誘導可能な発現
ベクターｐＰＬ−Ｌａｒａｂｄａ　（ファルマシア社）
等に接続することにより大腸菌等の微生物菌体内でバチ
ラス・チュリンゲンシスのキメラ殺虫性蛋白を生産させ
る発現ベクターを構築することができる。

本発明のキメラ殺虫性蛋白遺伝子を保持する発現ベクタ
ーを大腸菌〔例えば、大腸菌ＪＭ１０３株（ファルマシ
ア社）〕等の宿主微生物へ４人することにより菌体内で
殺虫活性の高いキメラ殺虫性蛋白を生産する微生物を得
ることができる。

この様にして製造された形質転換微生物を適当な培地、
条件で培養することにより殺虫活性を有するキメラ殺虫
性蛋白を大量生産することが可能である。

培養後のキメラ殺虫性蛋白の単離は、例えば菌体を超音
波で破砕し、遠心分離を行って、該キメラ殺虫性蛋白か
ら成る凝集体を容易に濃縮、回収することにより行なう
ことができる。

また、大腸菌の宿主−ベクター系のみならず、枯草菌、
酵母、シェウドモナス菌あるいは放線菌等の宿主−ベク
ター系も利用可能であり、それぞれの宿主−ベクター系
の特徴を生かしたキメラ殺虫性蛋白の大量生産が行える
。

以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。本発
明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、本
発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができる
。

実施例 ■、キメラ殺虫性蛋白発現プラスミドｐＡＡｃ１　、　
ｐＡＣＡｌ、ｐＡｃｃｌ、ｐｃｃＡｌ、ｐｃＡｃｌ、ｐ
ｃＡＡｌの構築ステップ１　：　　１２５ＫＤ殺虫性蛋
白発現プラスミドｐＴＢ１からのＤＮＡ断片の調製 約５μｇの１２５ＫＤ殺虫性蛋白発現プラスミドｐＴＢ
ｌ（特願昭６１−０２４５６３記載の方法で製造）に各
々２０ユニツトの制限酵素」匹Ｉ、Ｐｓｔｌを加え、２
００ｐｌ！のＭｅｄ反応液（１０ｍＭ　）リス−塩酸（
ｐＨ７，５）　、５０ｍＭ　ＮａＣ１、１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｇ、１＋ａＭジチオスレイトール〕中で３７℃１時
間反応後、反応液を０．１ｇｇ／ｍｌの臭化エチジウム
を含む０．８％の低融点アガロースゲル（ベセスダ、リ
サーチ、ラボラトリ−社製）に供し、アガロースゲル電
気泳動を行った。泳動後、紫外線ランプ下で６．７　Ｋ
ｂの」ｇｌ　−Ｐｓｔｌ　ＤＮＡ断片に相当するゲル部
分を切り出してこれを６５℃で５分間加熱した。融解し
たゲルに等容のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リス−塩酸（
ｐＨ８，０）、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ　）を加え、ＴＥ
緩衝液で飽和したフェノールを等容加えて撹拌した。１
０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上層を分取した後、
１１５０容の５Ｍ　ＮａＣ１および２倍容のエタノール
を加えて一８０℃に１０分間放置することによりＤＮＡ
をエタノール沈澱した後、１０．００Ｏｒｐｍで１０分
間遠心してＤＮＡを回収し、１０μｌの滅菌蒸留水に懸
濁した。以後のＤＮＡ断片の単離はこの方法で行った。

次に、ｐＴＢｌを制限酵素」理１　、ＰｓｔＩ　　およ
び旦回■で切断して、０．５７　Ｋｂの」凹Ｉ−肛回Ｉ
Ｉ［ＤＮＡ断片および０．７３　Ｋｂの肛回ｍ−ｐ旦Ｉ
　ＤＮＡ断片を単離した。６．７　Ｋｂの」凹１−　Ｐ
ｓｔ４　　断片をＣ１断片、０．５７　Ｋｂのｌｎｌ　
　−Ｈｌｎｄｌ［［断片をＣ２断片、０．７３にｂの肛
回ｍ−Ｐｓｔｌ断片をａ、断片と名付けた。

ステップ２　　：　１３０ＫＤ殺虫性蛋白発現プラスミ
ドｐＫＣ６からのＤＮＡ断片の調製 ステップｌと同様の方法で、１３０ＫＤ殺虫性蛋白発現
プラスミドρＫＣ６を制限酵素」凹Ｉ及びｂ［Ｉで切断
して６．７　Ｋｂの匠Ｉ−ハｔｌＤＮＡ断片を単離し、
Ｃ３断片と名付けた。

次に、ｐＫＣ６を制限酵素」凹１　、　Ｐｓｔ　Ｉ及び
Ｈｉｎｄ■で切断して０．６５Ｋｂの」匹■−肛何１１
１ＤＮＡ断片及び０．７３Ｋｂの肛匝ｍ−ＰｓｔＩＤＮ
Ａ断片をそれぞれ単離し、それぞれをＣｔ断片、Ｃ５断
片と名付けた。

ステップ３：　発現プラスミドｐＡＡｃ１　、ｐＡｃＡ
ｌ、ｐＡｃｃｌ　、ｐｃｃＡｌ　、ρＣＡＡＩ　、ｐｃ
Ａｃｌの構築ステップ１およびステップ２で調製した６
種のＤＮＡ断片ａｌ　＊　　ａＺ＋　　ａ２＊　　ｃ、
Ｉ　　Ｃ！＋　　Ｃ３＋各々１１００ｎずつを、■（ａ
ｔ　ｌ　　ａＲ＋　　０３　）　ｒ■（ａｌ　＋　　Ｃ
Ｚ　＋　　ａｎ　）＋■（ａｌ　＋　　’Ｚ　＋　　Ｃ
３）　＋■（ＣＩ＋　　０２　＋　　ａｎ　）＋■（Ｃ
＋　＋　　ａｔ　＋　　”３）、■（Ｃ＋　＋　　ａ２
＋　　Ｃ３）の組合わせで混合し、それぞれの混合液５
μｌに対し４０μｌのＤＮＡライゲーシッンキット（宝
酒造）Ａ液および５μｌの同Ｂ液を加えて攪拌し、１６
℃３０分間反応した。

その後、Ｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　６９　２１１０−２１１４）に従い、上記６種
類の反応ｌ 混液それぞれにより大腸菌ＪＭ１０９株（ファルマシア
社）を形質転換した。出現したアンピシリン耐性コロニ
ーを培養し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｎｕｃ　１ｅ
ｔｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　、　　７　、１５１３−１
５２３．）に従いプラスミドＤＮＡを調製した。約１１
００ｎのプラスミドＤＮＡに３ユニツトのＣ１ａ　Ｉあ
るいは３ユニツトのＰｖｕ　Ｉｆを加えてＭｅｄ反応液
中で３７℃１時間反応し、０．８％アガロースゲル電気
泳動で分析した。その結果、発現ベクターのｔａｃプロ
モーターの下流にキメラ殺虫性蛋白遺伝子が接続したプ
ラスミドの構造６種類をそれぞれ確認し、上記■〜■の
組合せから得られた発現プラスミドをそれぞれｐＡＡｃ
ｌ。

ρＡＣＡＩ、ｐＡｃｃ１．ｐｃｃＡ１．ｐｃＡＡｌ、ｐ
ｃＡｃｌと名付けた（第１図参照）。なお、各キメラ蛋
白遺伝子は、各発現プラスミドを制限酵素Ｂａａ旧及び
Ｐｓｔ　Ｉで切断することにより容易に単離することが
できる。

■、キメラ殺虫性蛋白発現プラスミドｐＡｃｃＡ１．ｐ
ＣＡＣＡ３の構築 ステップｌ：キメラ蛋白発現プラスミドｐＡｃＡ１から
のＤＮＡ断片の調製 ２μｇのキメラ蛋白発現プラスミドｐＡｃＡ１に１０ユ
ニツトの制限酵素Ｂａａ旧を加え１００μｌの旧ｇｈ反
応液（１０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　、　１
００ｍＭ　ＮａＣ１。

１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ、　１ｍＭジチオスレイトール
〕中で３７℃１時間反応後、１００μｌのフェノール・
クロロホルム（１：　１）混液を加えてフェノール抽出
をおこなった。１０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し上層
を分取後、２倍量のエタノールを加えて一８０℃に１０
分間放置した。　１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し
てＤＮＡを回収し乾固させた後、２０μｌの蒸留水に懸
濁した。

調製したＤＮＡ溶液に３ユニツトの制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１を加え５０μｌのＭｅｄ反応液中で２５℃５分間反
応してＤＮＡを部分切断した後、０．１ａｇ／ｍｌの臭
化エチジウムを含む１％低融点アガロースゲルに供し、
電気泳動を行った。泳動後、紫外線ランプ下で１．ＩＫ
ｂのＢａａ　ＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片に相当するゲル部分
を切り出して融解し、フェノール抽出、エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収し、ａ、断片と名付けた。

次に、ｐＡＣＡ　１をＨｉｇｈ反応液中で制限酵素匡ｏ
ＲＩおよびＥｃｏ　ＲＶで切断した後、低融点アガロー
スゲル電気泳動を行って０．６　ＫｂのＥｃｏ　Ｒ１−
ＥｃｏＲ１／断片を単離し、ａｄｚ断片とした。

゛ステップ２：キメラ蛋白発現プラスミドｐｃｃＡ１か
らのＤＮＡ断片の調製 ステップ１と同様の方法で、キメラ蛋白発現プラスミド
ｐｃｃＡ１を制限酵素Ｂａａ＋旧で切断した後匡９−Ｒ
１で部分切断し、１．Ｉ　Ｋｂの圏ｔｓ　ＨＩ−匡乞Ｒ
１断片を単離してｅ１１断片と名付けた。

次に、ｐｃｃＡｌをＥｃｏ　ＲＩおよびＥｃｏ　ＲＶで
切断して０．６にｂの旺ＲＩ−旺ＲＶ断片を単離し、Ｃ
４断片とした。さらに、ｐｃｃＡｌを制限酵素Ｂａａ旧
およびＥｃｏ　ＲＶで切断して６．４　ＫｂのＥｃｏ　
ＲＶ−Ｂａｇ旧断片を単離し、ｃａ断片とした。

ステップ３：キメラ蛋白発現プラスミドｐＡｃｃＡ１．
ｐＣＡＣＡ３の構築 ステップ１およびステップ２で調製した５種類のＤＮＡ
断片ａｌｌ＋　　ａｌ！＋　　Ｃ１１＋　　’１！＋　
　Ｃａ各々１１００ｎずつを、■（ａｌｌ＋　　ＣＩ□
、Ｃａ）％■（Ｃ１１＋　　ａｌｔ、Ｃａ　）の組合せ
で混合してリガーゼ反応を行なった。それぞれの反応混
液により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性コロニー培養してプラスミドＤＮＡを調
製した。

約１１００ｎのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの匣■を
加えてＭｅｄ反応液中で、あるいは３ユニツトノＥｃｏ
　ＲＶを加えて旧ｇｈ反応液中でそれぞれ３７℃１時間
反応した後、０．８χアガロースゲル電気泳動で分析し
た。アガロースゲル電気泳動の結果から、発現ベクター
のｔａｃプロモーターの下流にキメラ殺虫性蛋白遺伝子
が接続したプラスミドの構造２種類をそれぞれ確認し、
■の組合せから得られた発現プラスミドをｐＡｃｃＡｌ
、■の組合せから得られた発現プラスミドをｐＣＡＣＡ
３と名付けた（第２図参照）。なお、各キメラ蛋白遺伝
子は、発現プラスミドを制限酵素Ｂａａ旧およびＰｓｔ
　Ｉで切断することにより容易に単離することができる
。

■、大腸菌でのキメラ殺虫性蛋白の生産構築した各キメ
ラ蛋白発現プラスミドｐＡＡｃ１゜ｐＡｃＡｌ　、　ｐ
Ａｃｃｌ　、　ｐｃｃＡｌ　、　ｐｃＡｃｌ　、　ｐｃ
ＡＡｌ　、　ｐＡｃｃＡｌおよびｐＣＡＣＡ３をＣｏｈ
ｅｎらの方法に従い大腸菌ＪＭ１０３株へ導入した。

得られた大腸菌形質転換体ＪＭ１０３／ρＡＡＣＩ、Ｊ
１４１０３／ＰＡＣＡＩ、ＪＭ１０３／ρＡＣＣＩ　、
　ＪＭ１０３／ｐｃｃＡ１　、　ＪＭ１０３／ｐｃＡｃ
１　、　ＪＭ１０３／ｐｃＡＡ１．ＪＭ１０３／ｐＡｃ
ｃＡ１およびＪＭ１０３／ｐＣＡＣＡ３が生産するキメ
ラ殺虫性蛋白の同定、分析を以下の如く行なった。各大
腸菌菌株をＬブロス液体培地（Ｌｏｇのトリプトン（デ
ィフコ社）、５ｇのＮａＣ１゜５ｇのイーストエキスト
ラクト（ディフコ社）を１１の蒸留水に溶解させた培地
〕中で一夜培養する。培養液０．２５ｍ＃を分取し遠心
操作（１０，ＯＯＯｒｐｍ２分間）により集菌し、１０
０μｌのサンプル緩衝液（６２，５ｍＭ　）　’Ｊ　ス
ー塩酸（ｐＨ８，８）、　２χ（Ｗ／Ｖ）　　）’　テ
シル硫酸ナトリウム、５χ（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエ
タノール、１０　Ｘ（Ｖ／Ｖ）グリセｏ　−ル、０．０
１　Ｘ（Ｗ／Ｖ）ブロムフェノールブルー〕に懸濁後、
１００℃５分間熱処理した。　１０．ＯＯＯｒｐｍで５
分間遠心し上滑を分取した後、その２０ｐｌをＬａｅｍ
ｍｌｉ　らの方法（Ｎａｔｕｒｅη７６８０−６８５）
に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。泳動後、ゲルをクマージーブリリアントブルーで
染色し、゛脱気乾燥して口紙に固定した。その結果、キ
メラ蛋白発現プラスミドｐＡＡｃ１．ｐｃＡＡｌ、ｐｃ
Ａｃｌを含む大腸菌ＪＭ１０３株では分子量１２５ＫＤ
の蛋白バンドが検出され、キメラ蛋白発現プラスミドρ
ＡＣＡＩ、ｐＡｃｃｌ、ｐｃｃＡｌ、ｐＡｃｃＡｌ。

ρＣＡＣＡ３を含む大腸菌ＪＭ１０３株では分子ｔ　１
３０ＫＤの蛋白バンドが検出された。これらの蛋白バン
ドはいずれも抗１２５ＫＤ、　１３０ＫＤ殺虫性蛋白抗
体と特異的な交叉反応を示した。

ゲル上の各キメラ蛋白バンドをデンシトメーターで測定
したところ、各キメラ蛋白発現プラスミドを含む大腸菌
ＪＭ１０３株はそれぞれ全菌体蛋白あたり２５〜３０χ
に相当するキメラ殺虫性蛋白を生産した（第３図参照）
。従って、これらの大腸菌形質転換体は、バチラス・チ
ュリゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の１２５ＫＤ殺虫性
蛋白と１３０ＫＤ殺虫性蛋白とから構成されるキメラ殺
虫性蛋白を効率よく生産していることが確認された。

■、大腸菌で生産されたキメラ殺虫性蛋白の調製法 大腸菌形質転換体ＪＭ１０３／ｐＡＡｃ１．ＪＭ１０３
／ρＡＣＡｌ、ＪＭ１０３／ｐＡｃｃ１　、　ＪＭ　１
０３／ｐＣＣＡ　１　、　ＪＭ　１０３／ｐＣＡＡ　１
　、　ＪＭ　１０３／ｐＣＡＣ１、川１０３／ＰＡＣＣ
ＡＩおよびＪＭ１０３／ｐＣＡＣＡ３をそれぞれＬブロ
ス液体培地中で一夜培養した後、その０．１＋ｉＩｔを
１０ｍＡ！のしブロス培地に移し、３７℃で２０時間培
養した。培養液５１１１を分取し、６０００ｒｐｍ　、
　５分間遠心して菌を集め、−８０℃で凍結させた後、
室温で融解させた。この操作を３回繰り返した後、２Ｉ
ＩＩｔのＴＥ緩衝液に懸濁し３０秒間ずつ５回の超音波
処理を行った０次に、この粗抽出液を７　、０ＯＯｒｐ
■で５分間遠心し沈澱を集めた。この沈澱画分を電気泳
動用サンプル緩衝液に懸濁して１００℃５分間熱処理を
行なった後、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、各菌
株から調製した沈澱画分において、含まれる蛋白の約８
５χがキメラ殺虫性蛋白であった。従って、上記調製法
を用いることにより、容易に効率よくキメラ殺虫性蛋白
を調製できることが明らかとなった。なお、この調製法
は、大量の培養液について有効であることを確認してい
る。

■、大腸菌で生産されたキメラ殺虫性蛋白の殺虫活性 ■に記載した方法で調製したキメラ殺虫性蛋白ＡＡＣ，
ＡＣＣ，ＡＣＡ、と、同様に調製した１２５ＫＤ殺虫性
蛋白の懸濁液をそれぞれ１■ｔずつ人工飼料に浸み込ま
せた後、４令のハスモンヨトウ１０匹に摂食させ、３日
後の死虫数を観察した。また、各蛋白の懸濁液それぞれ
５０ｍｊ！にカンラン葉を浸した後、風乾し、３令のコ
ナガ幼虫１０匹に摂食させ、３日後の死虫敗を観察した
。

１　ｍｇ／＠Ｉｔの蛋白懸濁液をハスモンヨトウに与え
たとき、ＡＡＣ蛋白では１０匹Ｓ９匹が、ＡＣＡ蛋白で
は１０匹Ｓ１０匹が、ＡＣＣ蛋白では１０匹Ｓ１０匹が
それぞれ死亡し、それに対して１２５ＫＤ蛋白では１０
匹Ｓ１０匹が死亡した。また、２ｇｇｏｆｆｉｌの蛋白
懸濁液をコナガ幼虫に与えたとき、ＡＡＣ蛋白では１０
匹Ｓ５匹が、ＡＣＡ蛋白では１０匹中子匹が、ＡＣＣ蛋
白では１０匹Ｓ９匹がそれぞれ死亡し、それに対して１
２５ＫＤ蛋白では１０匹Ｓ６匹が死亡した。

従って、キメラ殺虫性蛋白ＡＣＡおよびＡＣＣは、両害
虫に対して、１２５ＫＤ蛋白と同等かあるいはそれ以上
の殺虫活性を示すことが明らかとなった。

また、キメラ殺虫性蛋白ＡＡＣも、１２５ＫＤ蛋白に匹
敵する殺虫活性を示すことが確認された。

参考例　１ １．１２５ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子の単離アイザワイＩＰ
Ｌ株〔ユ・ニス・デパートメント　オブ　アグリカルチ
ャー　リサーチ　サービス（Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＳｅｒｖｉｃｅ）保管〕をＰＹ平板培地（トリプトン
（シグマ社）１０ｇ、　　ＮａＣ１（牛丼化学）５ｇ、
イーストエキストラクト（シグマ社）５ｇ、および寒天
（シグマ社）１２ｇを加えて１βとし、作製した寒天培
地）上で純化し、得られた純化菌株３２個につき、プラ
スミド解析を行った。各々の菌株をｌ　ＱｍＪ！のＰＹ
液体培地（ＰＹ平板培地より寒天を除いた培地）で２４
時間培養後、菌を遠心操作（２０，０ＯＯｘ　ｇ、　　
３０分間）により集菌し、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ
　　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　・７．１
５１３−１５２３、）らの方法に従い、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、０．８％アガロースゲル電気泳動によりプ
ラスミド解析を行った。その結果、解析した３２個の純
化菌株は同一のプラスミドパターンを示さず、少なくと
も９つの異なるプラスミドパターンに分類でき、４．Ｏ
Ｍｄ、　　４．８Ｍｄ、　５．４Ｍｄ、　８．５Ｍｄ、
　１２Ｍｄ、　１５Ｍｄ、　１７Ｍｄ、　２１Ｍｄ、３
７Ｍｄ、　４０Ｍｄ、　５０Ｍｄ、　５２Ｍｄの１２本
のプラスミドＤＮＡバンドが観察された菌株をアイザワ
イＩＰＬＦｋＴ株と名付けた。

このアイザワイＩＰＬＮｌｋ７株は、ブダペスト国際寄
託当局（工業技術院微生物工業技術研究所）へ、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　　５ｕｂｓ
ｐ、　ａｉｚａｗａｉＩＰＬ　Ｎｏ、７、寄託番号微工
研条寄第１１５０号として寄託されている。

ステップｌ：合成りＮＡＡｃ−ブの作製バチラス・チュ
リンゲンシス・クリスターキ・ＨＤ−Ｉ　Ｄｉｐｅ１株
の殺虫性蛋白遺伝子の塩基配列（Ｗｈ　１ｔｅｌｅｙ　
ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６０．６２６４−
７２　（１９８５））を参考に合成りＮＡＡｃ−ブ（５
’　−ＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧ−３’　
”）を作製した。アプライド・バイオシステム社のＤＮ
Ａ合成合成デモデル３８０ＡちいてＤＮＡオリゴマーを
合成した後、ＤＮＡ捕集バイアルに２７％水酸化アンモ
ニウムを１ｍｌ加え、５５℃で４時間加温し、濃縮器に
かけ乾固させた。乾固後、１００μｌの０．０１Ｍ　）
リエチルアミンー酢酸（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７，２）に溶
解し、逆相ＨＰＬＣカラムｃ１８にかけ、アセトニトリ
ル−０，１ＭＴＥＡＡ　（ｐＨ７，２’）の溶媒系で溶
出を行った。２６０　ｒｏ＊の吸収ピーク画分を分取し
、乾固後１００μｌのアセトニトリルで調製した８０％
酢酸を加え、１５分間放置した。１５分間経過後、淡オ
レンジ色を呈したら、乾固し、０．ＯＩＭ　　Ｔ　ＥＡ
Ａ　（ｐＨ７，２）　　１００μｌを加え、さらに酢酸
エチルを１００μ！加え、混合した。酢酸エチル相をす
て、ジエチルエーテル１００μｌを加え、同様の操作を
２回行い、乾固した。　０．ＯＩＭ　Ｔ　Ｅ　ＡＡ　（
ｐ）ｌ　７．２）で溶解し、再びＨＰＬＣによる２６０
止吸収ピ一ク画分を分取し、乾固後、１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７，５）　＋　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ＴＥ
）溶液に溶解した。つぎに、調製した合成りＮＡＡｃ−
ブの３２ｐ標識化を行った。５μｌの合成りＮＡＡｃ−
ブ（約１００ｐｍ１００ｐに大腸菌ポリヌクレオチドカ
イネース（宝酒造）を１５ユニツト、１００μＣｉのＣ
ｒ−”Ｐ）ＡＴＰ　（アマ−ジャム・ジャパン）および
ｌＯ倍濃度の反応混液（０゜５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７
，６）　、０．　Ｉ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｚＯ，１Ｍ２−
メルカプトエタノール）を１０μ！加えたのち蒸留水を
加えて、全容を１００μｌとし、３７℃１時間反応後、
クロロホルム：フェノール（１：　１）を加え混合後、
上澄を分取した０分取した上澄を、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７
，５）で平衡化したＤＥ−５２カラム（ワットマン社、
Ｑ、５ｍｌのベッドサイズ）にアプライし、３ｍｌのＴ
ＥＩＩ衝液（ｐＨ７，５）で洗浄後、０．７Ｍ　ＮａＣ
１−ＴＥ暖衝液（ｐＨ７，５）で溶出を行い、放射活性
画分を分取し、３２Ｐ標識合成りＮＡＡｃ−ブを作製し
た。

ステップ２：アイザワイＩＰＬｌｌｋＬ７株のプラスミ
ドＤＮＡライブラリーの作製 ２０・ＱｍｆｆｉのＰＹ液体培地で培養したアイザワイ
ＩＰＬ！１ｈ７株の菌体を３　ＱｍｌのＧ緩衝液（１０
％　グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ８，０）　）で洗浄し、８ｍｌのリゾチーム
（５ｒｒｗ　／　ｍ　１２　）に懸濁し、３０℃で２時
間反応させた。つぎに、アルカリ溶液（０，２ＮＮ　ａ
　ＯＨ，１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を１
６ｍｊ！加え、混合し、室温に１０分間放置したのち、
中和溶液（３Ｍ酢酸ナトリウム（Ｐ）Ｉ　４．８））を
１２ｍ１加え、４℃に１．５時間放置した。遠心操作（
１４，００Ｏｒｐｍ、　２０分間）により上澄を分取し
、冷エタノールを７０ｍｊ！加え、−２０℃で１時間放
置し、エタノール沈澱により、ＤＮＡを回収した。乾固
後、５　ｍ　１２の０．１Ｍ酢酸ナトリウムに懸濁し、
ＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したフェノールによ
る処理を２回行ったのち、上澄を分取し、２容の冷エタ
ノールを加え、再度エタノール沈澱した。　さらに、乾
固後、６ｍｆのＴＥ緩衝１（ｐＨ７，５）に懸濁し、常
法に従って塩化セシウム平衡密度勾配遠心により、プラ
スミドＤＮＡを精製した。

つぎに、５μｇのプラスミドＤＮＡを１０ユニツトの制
限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで切断し、等容のフェノール：
クロロホルム（１：　１）を加え混合した後、上澄をと
り、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、乾固後、２
０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。また、
２μｇのｐＵ０８ベクタープラスミド（ファルマシア社
）を５ユニツトの制限酵素１３　ａ　ｍ　ＨＩで消化後
、同様の操作でＤ−ＮＡを回収し、２０ｐＨのＴＥ緩衝
液（ｐ）Ｉ　７．５）に懸濁後、５μｌの大腸菌アルカ
リホスファターゼ（宝酒造、２．０ユニツト）、５０μ
ｌの０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ８，０）、１５
μｌの蒸留水を加えた後、６０℃で１時間インキュベー
トし、アルカリフォスターゼ処理を行った。反応後、フ
ェノール−クロロホルム処理を２回行ったのち、上澄を
分取し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、２０μ
ｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。

つぎに、１５μｌのＢａｍＨＩ切断プラスミドＤＮＡ溶
液と１５ｔｔｌｌのＢ、ａｍＨＩ切断ｐＵＣ８ベクター
ＤＮＡ溶液を混合後、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造、０．１ユニツト）　、７．５μｌの０゜１Ｍジチ
オスレイトール（牛丼化学）　、７．５μｌの１０ｍＭ
アデノシン３リン酸（牛丼化学）、２５μｌの３倍濃度
反応混液（２００ｍ　Ｍ　）　’）スー塩酸（ｐＨ７，
６）２０ｍＭＭｇＣ１ｇ　）および５ｐｌの蒸留水を加
え、全容７５μｌとし、１４℃で６時間インキュベート
した。得られたりガーゼ反応液１０μｌを、スコツトら
の方法（細胞工学、■、６１６−６２６．１９８３）で
調製した１００μｌの大腸菌０８１株（ＡＴＣＣ３３８
４９）のコンビ−テントセルに加え、０℃で１５分間イ
ンキエベートし、４２℃で４０秒間熱処理したのち、０
．９ｍｆのＬブロス液体培地（トリプトン１０ｇ。

イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣＩＶ５ｇ、グルコ
ース（牛丼化学）Ｉｇを加え、蒸留水で全容１１とする
）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、最終濃度
５０μｇ　／　ｍ　Ｉｔのアンピシリンを含むしブロス
平板培地（Ｌブロス液体培地に１．２％となるよう寒天
を加えたもの）にプレートした。

ステップ３：コロニーハイブリダイゼーションによる殺
虫性蛋白遺伝子クローンの単離 プレートに広げたコロニーを２枚のニトロセルロースフ
ィルターにレプリカし、さらにアンピシリン（５０Ｍｇ
／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（６００μｇ／ｍｊ
りを含む平板プレートに移し、−夜インキユベートした
。１枚のフィルター当り、２．５ｍｆの０．５Ｎ　　Ｎ
ａＯＨを加え、５分間処理し、風乾後、等容のＩＭＩ−
リス−塩酸（ｐ）１７゜５）を加え、５分間放置した。

風乾後、さらに２゜５ｍＪのＩＭ）リス−塩酸（ｐＨ７
，５）−１，５Ｍ　　Ｎ　ａＣＩｌで５分間処理し、風
乾後、８０”Ｃで３時間、真空下で処理した。フィルタ
ー４枚当り、１０ｍＩｆ）０．１％　　５ＤＳ−４ｘＳ
ＳＣ（ＳＳＣはｏ、１５Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１−０，０１５
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）を示す）を加え、
６０℃１５分処理後、フィルター上のコロニーをふきと
り、６　ｍ　ｌのブレハイプリ溶液（４ｘＳＳＣ，，１
０ｘデンハート、１゜０８ｇ　／　ｍ　ｌサーモンテス
ティス１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ（シグマ社）；但し、１０ｘデ
ンハートは、０゜２％フィコール、０．２％、ポリビニ
ルピロリドン、０．２％ＢＳＡを含む溶液である）に浸
し、６０℃で３時間処理した。つぎに上記溶液に、ステ
ップ１で作製した３２ｐ標識化合成りＮＡプローブを加
えたハイブリ溶液中にフィルターを入れ、５６℃−夜イ
ンキユベートした。ハイブリダイゼーション後、５６℃
の４ｘＳＳＣ−０，１％ＳＤＳ溶液で１５分間４回洗浄
し、フィルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムにはさみ、オ
ートラジオグラフィを行った。ポジティブシグナルを与
えるコロニーをマスタープレートより拾い、再度、同様
のコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブ
クローン大腸菌ＤＨＩ／ｐＡＢ６を単離した。

単離したポジティブクローン大腸菌ＤＨＩ／１）・ＡＢ
６からＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙらの方法に従ッテ、
プラスミドｐＡＢ６を単離した。プラスミド　ｐＡＢ６
を制限酵素、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄｌ［［、旦ｓｔ■、
基１土■、Ｐｖｕ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、　Ａ工ａｍ、基エ
ユＩ　、’Ｃｌ　ａ　Ｉを用いて切断し、０゜７％アガ
ロース電気泳動で分析することにより、インサートＤ　
Ｎ　Ａ　　２２．４ｋｂの制限酵素地図を作製した（第
６図上部）、　さらに、上述の合成りＮＡプローブを用
いたサザン・ハイブリダイゼーション法（Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ、　９８．５０３−５１７（１９７５）　
）により、インサートＤＮＡ中の殺虫性蛋白遺伝子領域
を特定し、その領域の詳細な制限酵素地図を作製した（
第６図下部）、　続いて、各種制限酵素で切断したＤＮ
Ａ断片をベクターｐＵＣ８にサブクローニングした後、
ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙらの方法によりＤＮＡ断片
を含むプラスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを
１８μｌのＴＥ　（ｐＨ７，５）に懸濁後、２μｌの２
ＮＮａＯＨを加え、室温で５分間放置し、８μｌの７．
５Ｍ酢酸アンモニウムアを加え、１００μｌの冷エタノ
ールを加え、エタノール沈澱を行った。

１２．００Ｏｒｐｍ＋で５分間遠心し、沈澱を回収後、
乾固し、０．５　ｐｍｏｌ／　５　ｍ　ｌとなるよう蒸
留水に溶解させた。５μｌの調製したプラスミドＤＮＡ
　（５ｐｍｏｌ）に、１．５μｌの１０倍容濃度クレノ
ー緩衝液（宝酒造）、１μβのプライマーＤＮＡ　（Ｐ
Ｌバイオケミカル社）　、４．５μｌの蒸留水を加え、
全容を１２μＥとし、６０℃で１５分間加温後、室温に
２０分間放置した。この反応液に２μｌの（α−”Ｐ）
　ＡＴＰ　（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマ−ジャム・ジ
ャパン）と１μｌのクレノー断片酵素（宝酒造、２ユニ
ツト）を加え、混合した。この混合液の３．２μβずつ
を４種類の２μβのｄＮＴＰ＋　　ｄｄＮＴＰ混合液（
宝酒造）に加え、４２℃で２０分間放置した。各々に１
μｌのチェース溶液（宝酒造）を加え、さらに、４２℃
で２０分間放置した。最後に、６μｌの９５％ホルムア
ミド色素（０，１％ブロムフェノールブルーと０．１％
のキシレンシアツールを含む）を加えた。常法に従い、
６％アクリルアミド・尿素ゲルを作製し、上記反応液２
μｌをアプライし、１７００Ｖで６時間、電気泳動を行
った。ゲルを乾燥後、Ｘ線フィルムにはさみ、感光後、
塩基配列を読み取った。　解明した塩基配列を第５図に
示す。バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
ｌｌｈＴ株の殺虫性蛋白遺伝子は、開始コドンＡＴＧか
ら始まり、ストップコドンＴＡＡで終わる３４６５塩基
のコーディング領域をもち、１１５５のアミノ酸をコー
ドしていた。

■ ステップ１　：ＡｈａＩ［［ＤＮＡ断片の調製殺虫性蛋
白遺伝子を含む約１０μｇの組換え体プラスミドｐＡＢ
６に、約３０ユニツトの制限酵素Ａｈａｌ［［を加え、
３０ｔｔｌのＡｈａｍ反応液（１０ｍＭ）リス−塩酸（
ｐＨ７，５）、６０ｍＭＮａＣ１，７ｍＭＭｇＣ１１ｔ
　、１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール〕中
で３７℃１時間反応後、反応液をＯ１ｌμｇ　／　ｍ　
１の臭化エチジウムを含む０．８％の低融点アガロース
ゲル（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製）に供し
、アガロース電気泳動を行った。泳動後、紫外線ランプ
下で、３．５Ｋｂの　ＡｈａｎｌＤＮＡ断片に相当する
ゲル部分を切り出し、試験管にとり、６５℃で５分間加
熱した。融解したゲルに２倍量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
　　）リス−塩酸（ｐ　Ｈ８。

０）、０．５ｍＭＥＤＴＡ）を加え、ＴＥ緩衝液で飽和
したフェノールを加えて、フェノール抽出を行った＊　
１０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上層を分取した後
、１／４０量の４ＭＮａＣ１および２倍量のエタノール
を加えて、−８０℃に１０分間放置することによりＤＮ
Ａをエタノール沈澱した後、１０゜０００　ｒｐｍで１
０分間遠心し、ＤＮＡを回収し、１０μｌの蒸留水に懸
濁した。

ステップ２二ベクターの調製 １μｇの発現ベクターｐＵｃ１８（ファルマシア社）に
、１ユニツトの制限酵素）（ｉｎｃＩＩ　（宝酒造）を
加え、２０ａｌｌの）ｌｉｎｅＩＩ反応液〔１０ｍＭ）
リス−塩酸（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＮａＣ１，７ｍ
ＭＭｇＣｌ１ｔ、１０ｍＭジチオスレイトール〕中で３
７℃１時間反応した。反応後、反応液に等量のフェノー
ル・クロロホルム（１：１）混液を加え、混合し、１０
．００Ｏｒｐｍで５分間遠心後、上澄を分取した。つぎ
に、２倍量の冷エタノールを加えて、−８０℃に１５分
間放置した後、１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、
ＤＮＡを回収し、１０μｌの蒸留水に懸濁した。

ステップ３：発現プラスミドｐＡＨ７およびｐＡＨ８の
構築 ステップ１およびステップ２で調製したＡｈａｎ［ＤＮ
Ａ断片および発現ベクターｐＵｃ１８をそれぞれ１μｇ
ずつ混合し、７．２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加え、４５μｌのりガーゼ反応液（６６ｍＭ）
リス−塩酸（ｐＨ７，６）。

６．６μＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｊ！　ｚ、　１０ｍＭジチオス
レイトール、１゜０＋ａＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間
反応した。その後、Ｃｏｈｅｎらの方法に従い、反応液
を大腸菌　５Ｍ１０３（ファルマシア社）に形質転換し
た。出現したアンピシリン耐性コロニーを培養し、Ｂｉ
ｒｎ　　’□ｂｏｉｍらの方法に従いプラスミドＤＮＡ
を調製した。

約１μｇのプラスミドＤＮＡに、３ユニツトの制限酵素
Ｈｉ　ｎｄｌｌｌを加え、ＨｉｎｄＩＩＩ反応液（ＩＱ
ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、　　６０　ｍＭＮ　
ａ　Ｃ１！、１０ｍＭＭｇＣｊ！ｚ　　１ｍＭ２−メル
カプト主タノール、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン
）中で３７℃１時間反応し、アガロース電気泳動で分析
した。　アガロース電気泳動の結果より、発現ベクター
のｌａｃプロモーターと順方向に殺虫性蛋白遺伝子が接
続した発現プラスミドをｐＡＨ８とし、逆方向に接続し
た発現プラスミドをｐＡＨ７とした（第４図参照）。

ステップｌ：殺虫性蛋白遺伝子を含むＰｓ　ｔ　Ｉ　−
ＢａｍＨＩ断片の調製 殺虫性蛋白遺伝子を含む約５μｇの発現プラスミドｐＡ
Ｈ８に、約２０ユニツトの制限酵素ヱ土±■および約２
０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩを加え、５０ｕｌのＰ
ｓｔ１反応液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、
５０ｍＭＮａ（１！。

１０ｍＭＭｇＣ１ｚ　、１ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、１００μｇ　／　ｍ　ｊ！牛血清アルブミン〕中で
３７℃１時間反応後、３０μｌのＴＥ緩衝液で飽和した
フェノールを加えて、フェノール抽出を行ったｅ　１０
，００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上層を分取後、１／４
０１ｉの４Ｍ　　ＮａＣｊ！および２倍量のエタノール
を加えて、−８０℃に１０分間放置した。

１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心後、ＤＮＡを回収し
、乾固させたのち、２０μｌの蒸留水に懸濁した。

ス孟ヱ１又：ベクターの調製 約５μｇの発現ベクターｐＫＫ２２３−３　（ファルマ
シア社製）に、０．１ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ（
宝酒造）を加え、ＢａｍＨＩ反応液（１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐ　Ｈ８，０）　、？　ｍＭＭｇＣｌｔ、１００
ｍＭＮａＣｊ！、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、　
０．０１％ウシ血清シルブミン〕中で、３７℃１５分間
反応した。反応液を０゜１μｇ　／　ｍ　Ｉｔの臭化エ
チジウムを含む０．８％の低融点アガロースゲルに供し
、電気泳動を行った。

泳動後、紫外線ランプ下で、ｐＫＫ２２３−３が保持す
る２個の１３ａｍＨＩ認識部位のうち、１つのみ切断さ
れたと推定されるＤＮＡ分子（４，６Ｋｂ）を切り出し
、試験管にとり、６５℃で５分間加熱した。ゲルを融解
し、フェノール抽出後、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡ
を回収し、２０μＥの蒸留水に懸濁した。調製したＤＮ
Ａ溶液に、最終濃度３ｍＭの４種デオキシリボヌクレオ
チドおよび５ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩラ
ージフラグメントを加え、６０μｌのＨｉｎｄ■反応液
（１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、　　６０ｍＭ
ＮａＣｊ、１０ｍＭＭｇＣｊ！ｚ　、１ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、１００μｇ　／　ｍ　ｊ！牛血清アル
ブミン〕中で、２５℃、２時間反応後、フェノール抽出
、エタノール沈澱を行い、ＤＮＡを回収し、２０μｌの
蒸留水に懸濁した。約１μｇの回収したＤＮＡに、３ユ
ニツトＴ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（宝酒造）を加え
、４５μｌのリガーゼ反応液（６６ｍＭ）リス−塩酸（
ｐ　Ｈ７，６）、　６．６　ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃｊ！ｚ　
、１０ｍＭジチオスレイトール。

１．０ｍＭＡＴＰ）中で１６℃、２時間反応した。

その後、コーエンらの方法に従い、反応液を大腸菌ＪＭ
１０３株に形質転換した。出現したアンピシリン耐性コ
ロニーを培養し、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法に従い、プ
ラスミドＤＮＡを調製した。約１μｇのプラスミドＤＮ
Ａに、３ユニツトの制限酵素旦土工ＨＩを加え、基土ｍ
ＨＩ反応液中で３７℃、１時間反応し、アガロース電気
泳動で分析した。

解析したプラスミドのうち、ｐＫＫ２２３−３プラスミ
ドのマルチ・クローニング部位のＢ　ａ　ｍ　Ｈ■部位
が保存されており、他のＢａｍＨ１部位が消失している
プラスミドを選択し、ｐＫＫ２２３−４とした。つぎに
、約５μｇのｐＫＫ２２３−４ＤＮＡに、１０ユニツト
の制限酵素Ｐｓｔｌおよび１０ユニツトの制限酵素１３
ａｍＨＩを加え、５０ｔｔｌのＰｓｔＩ反応液（１０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、５０ｍＭＮａＣ１１，
１０ｍＭＭｇＣ１ｚ　＋　　１　ｍＭ　２−メルカプト
エタノール、１００μｇ　／　ｍ　１牛血清アルブミン
〕中で、３７℃、１時間反応後、フェノール抽出、エタ
ノール沈澱を行った後、ＤＮＡを回収し、２０μｌの蒸
留水に懸濁した。

ステップ３：発現プラスミドｐＴＢ１の構築ステップ１
およびステップ２で調製したＰｓｔｌ−ＢａｍＨＩ切断
ＤＮＡ断片およびベクターｐＫＫ２２３−４をそれぞれ
１ｇｇずつ混合し、７．２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造）を加え、４５μ！のりガーゼ反応液（６６
ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）、　６．６ｍＭＭｇＣ
１ｇ　、　１０ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭＡＴ
Ｐ）中で１６℃。

２時間反応した。コーエンらの方法に従い、反応液を大
腸菌ＪＭ１０３株に形質転換した。出現したアンピシリ
ン耐性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを調製した
。約１μｇのプラスミドＤＮＡに、３ユニツトの制限酵
素ＢａｍＨＩを加え、３０ｕｌのＩ３ａｍＨＩ反応液中
で３７℃、１時間反応し、アガロース電気泳動で分析し
た。アガロース電気泳動の結果より、発現ベクターのｔ
ａＣプロモーターの下流に、殺虫性蛋白遺伝子が接続し
たプラスミドを選択し、これを発現プラスミドｐＴＢ１
とした（第４図参照）。

参考例２ １．１３０ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子の単離バチラス・チュ
リンゲンシス・アイザワイＩＰＬＮｏ、７　（ブダペス
ト国際寄託　寄託番号微工研条寄第１１５０号）をアク
リジンオレンジ（０゜０４ｇｇ／ｍｌ）を含むＰＹ液体
培地（トリプトン（シグマ社）１０ｇ、　　Ｎａ（１！
　　（牛丼化学）５ｇ、イーストエキストラクト（シグ
マ社）５ｇを加えて１１とし、ｐＨ’７．　０　　とし
て作製した培地）中で３０℃で一晩培養し、１０５倍希
釈の００１ｍ１をスターチアガー平板培地（シグマ社ス
ターチアガー２５ｇを１１蒸留水にとかし、オートクレ
ーブしたもの）に植菌し、３０℃で３日間培養した後、
コロニーを選抜した。　位相差顕微鏡により、胞子と結
晶を確認後、アルカリラピッド法によりプラスミドＤＮ
Ａを調製し、アガロース電気泳動で分析した。

その結果、５２Ｍｄプラスミドの脱落したａ７Ａ０２１
株を得た。　５２Ｍｄプラスミドにはブラスミド由来の
殺虫性蛋白遺伝子が含まれているので、ａ７Ａ０２１株
にはこの殺虫性蛋白遺伝子は存在しない。　ａ　７Ａ０
２１株をＰＹ液体培地で３０℃、７日間培養し、集菌し
、凍結−融解を３回操り返した後、蒸留水に懸濁し、超
音波破砕処理を行うことにより、結晶懸濁液を調製した
。

得られた調製液２．２　ｘ　１０’胞子／ｍｌ及び２．
２　ｘ　１０ｈ胞子／ｍＡをそれぞれカンランの葉に浸
漬した後、コナガ３令幼虫に摂食させた。

その結果、２．２　ｘ　１０７胞子／ｍｌの濃度では２
０匹中２０匹のコナガが死亡し、２．２　ｘ　１０ｈ胞
子／　ｍ　１の濃度では２０匹中１２匹の死亡が確認さ
れた。　ハスモンヨトウについても４令幼虫を用い、同
様の試験を行った。　結晶懸濁液（１ｍＡあたり２．６
　ｘ　１０”胞子を含む）を１ｍｌハスモンヨトウに与
えたとき、２０匹中子匹が死亡した。　従って、ａ　７
Ａ０２１株は、両害虫に対して高い殺虫活性を示すこと
が明らかとなった。

アイザワイａ　７ＡＯ２１の′　　　白゛　云のクロー
ニング ステップ１：アイザワイａ　７Ａ０２１株の染色体ＤＮ
Ａライブラリーの作製 ２５０　ｍ　ｌのＰＹ液体培地にアイザワイａ？Ａ０２
１株を植菌し、終夜培養した。　菌を６．ＯＯＯｒｐｍ
で１０分間遠心し、集菌後、１００ｍＪの１００ｍＭＮ
ａｃｌ、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，９）−１０ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡで洗浄した。　再度、集菌して１０ｍ１
の１５０ｍＭＮａＣｊ！−１００ｍＭＥＤＴＡ　＜ｐＨ
７，９）に懸濁し、最終濃度０．２５ｍｇ　／　ｍ　ｌ
のリゾチームを加えた。　　３７℃で１時間インキュベ
ートし、１３ｍ１の１００ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
９）　−１００ｍＭＮａ　Ｃｆ−２％ＳＤＳを加えて、
ゆっくり混合した。　次に、上記ＳＤＳ溶液で飽和した
フェノール−クロロホルム（１：　１）混液で４回抽出
を繰り返した後、上層を分取し、２容の冷エタノールを
加えて、生じた白い沈澱をガラス棒で回収した。　　８
０％エタノールで３回洗浄後、乾固し、２００μｌの蒸
留水に懸濁した。

次に、１０／ｊｇのａ　？Ａ０２１株の全ＤＮＡに１０
ユニツトの制ｆｆｌ酵素Ａｈａｍ　（ファルマシア社）
を加え、３０ｔｔｌｌのＡｈａＩＩ［反応液〔１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７，５）　、６０ｍＭＮａＣｌ！　
、　７　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２！、１０ｍＭＥＤＴＡ
、ｉｍＭジチオスレイトール〕中で３７℃１時間反応後
、反応液を０．１Ｍｇ　／　ｍ　１の臭化エチジウムを
含む０．８％の低融点アガロースゲル（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリ社）に供し、アガロース電気泳動を行
った。　泳動後、紫外線ランプ下で、３．５ＫｂのＡｈ
ａｌ［ｌＤＮＡ断片に相当する部分を切出し、試験官に
とり、６５℃で５分間加熱した。　融解したゲルに２倍
容ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）　
、０．５ｍＭＥＤＴＡ）を加え、ＴＥ（１０ｍＭ）リス
−塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０））緩衝液で飽
和したフェノールを加えて、フェノール抽出を行った。

１０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、上層を分取した後
、１／４０の４ＭＮａＣｊ！および２倍容のエタノール
を加えて、−８６℃に１０分間放置することによりＤＮ
Ａをエタノール沈澱した後、１０．００Ｏｒｐｍで１０
分間遠心し、ＤＮＡを回収し、１０μｌの蒸留水に懸濁
した。　また、５ＭｇのｐＵｃ１８ベクタープラスミド
（ファルマシア社）を５ユニツトの制限酵素１（ｉｎｃ
Ｉ［で消化後、等容のＴＥ飽和フェノールを加え、混合
後、上層を分取した。　次に、同様の操作でエタノール
沈澱、ＤＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。

　このＤＮＡ溶液に５μｌの大腸菌アルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造、２ユニツト）、５０μｌの０．１Ｍ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）、１５μｌの蒸留水を加
えた後、６０℃で１時間インキュベートし、アルカリフ
ォスターゼ処理を行った。　反応後、フェノール−クロ
ロホルム処理を２回行った後、上澄を分取し、エタノー
ル沈澱によりＤＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁
した。

次に、１０ｐｌｔのＡｈａｌＩ［切断全ＤＮＡ溶液と１
０ｔｔｌの）（ｉｎｃＩ［切断ｐｕｃｔｓベクターＤＮ
Ａ溶液を混合後、１μｌの７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
、０．１ユニツト）、７．５μｌの０゜１Ｍジチオスレ
イトール（牛丼化学）　、７．５μｌの１０ｍＭアデノ
シン３リン酸（牛丼化学）、２５μｌの３倍濃度反応混
液（２００ｍＭｌ−リス−塩酸（ｐＨ７，６）　、２０
ｍＭＭｇＣｊ２．）および５μｌの蒸留水を加え、全容
７５μβとし、１４℃で６時間インキュベートした。　
得られたりガーゼ反応液１０μｌをスコツトらの方法（
細胞工学、２，６１６−６２６　（１９８３））で調製
した１００μｌの大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９
）のコンビ−テントセルに加え、０℃で１５分間インキ
ュベートし、４２℃で４０秒間熱処理した後、０．９ｍ
ｌのＬプロス液体培地〔１０ｇのトリプトン、５ｇのＮ
ａ　Ｃｊｌ、　　５　ｇのイーストエキストラクト、グ
ルコース１ｇを加え蒸留水で１１とした培地〕を加え、
３７℃で１時間インキュベートし、最終濃度５０μｇ　
／　ｍ　ｌのアンピシリンを含むしブロス平板培地（Ｌ
ブロス液体培地に１．２％となるように寒天を加えた培
地）にプレートした。

ステップ２：コロニーハイブリダイゼーションによる殺
虫性蛋白遺伝子のクローンの単離プレートに広げたコロ
ニーを２枚のニトロセルロースフィルターにレプリカし
、更に、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍ１ｌ）及びクロラ
ムフェニコール（６００μｓ／ｍｊりを含む平板プレー
トに移し、−夜インキエベートした。　一枚のフィルタ
ー当り、２．５ｍｌの０．５ＮＮａＯＨを力■え、５分
間処理し、風乾後、等容のＩ　Ｍ　ト１７スー塩酸（ｐ
　Ｈ７，５）を加え、５分間放置した。　風乾後、さら
に２．５　ｍ　ｌのＩＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　
−１，５ＭＮａＣＪで５分間処理し、風乾後、８０℃で
３時間、真空下で処理した。

フィルター４枚あたり、１０ｍＭの０．１％５ＤＳ−４
ｘＳＣＣ（ＳＣＣは０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ１−０．０
１５Ｍ　　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７゜５）を示す）
を加え、６０℃で１５分間処理後、フィルター上のコロ
ニーを拭き取り、６ｍ　Ｉ！のプレハイブリ溶液（４ｘ
ＳＣＣ，１０ｘデンハート、１００μｇ／ｍＩｌサーモ
ンテステイス１本鎖ＤＮＡ（シグマ社）；但し、１０ｘ
デンハートは、０゜２％フィコール、０．２％ポリビニ
ルピロリドン、０．２％ＢＳＡを含む溶液を意味する）
に浸し、６０℃で３時間処理した。　次に、上記溶液に
、ステップ１で作製した３ｔｐ標識化合成りＮＡプロー
ブを加えたハイプリ溶液中にフィルターを入れ、５６℃
で１夜インキエベートした。　ハイブリダイゼーション
後、５６℃の４ｘＳＣＣ−０゜１％ＳＤＳ溶液で１５分
間４回洗浄し、フィルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムに
はさみ、オートラジオグラフィを行った。　ポジティブ
シグナルを与えるコロニーをマスタープレートより拾い
、再度、同様のコロニーハイブリダイゼーションを行い
、ポジティブクローン大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　ＣＡ５お
よびＤＨ１／ｐＣＡ１を単離した。

単離したポジティブクローン大腸菌ＤＨＩ／ｐＣＡ５お
よびＤＨＩ／ｐｃＡＩからＢｉｒｎｂｉｏｍと００ｌｙ
らの方法に従って、それぞれプラスミドｐＣＡ５および
ｐｃＡＩを単離した。　プラスミドｐＣＡ５およびｐｃ
Ａｌを制限酵素、Ｃ１ａ　Ｉ　、、基土ｏＲＩ、５ａｃ
ｌ、）（ｉｎｄｌｎ、ｍｌを用いて切断し、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動で分析することにより、インサー
トＤＮＡ　（約３．５Ｋｂ）の制限酵素地図を作製した
（第７図参照）その結果、ｐｃＡＩはｐＣＡ５と逆向き
にインサートＤＮＡを組み込んだクローンであることが
判明した。

続いて、塩基配列決定を行う為、プラスミドｐＣＡ５を
各種制限酵素で切断し、ベクターｐＵＣ８およびｐＵＣ
９にサブクローニングした後、ＢｉｒｎｂｉｏｍとＤｏ
ｌｙらの方法に従ってＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮ
Ａを調製した。

得られたＤＮＡを１８μｌのＴＥ　（ｐＨ７，５）に懸
濁後、２μｌの２Ｎ　ＮａＯＨを加え、室温で５分間放
置し、８μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、１０
０μｌの冷エタノールを加え、エタノール沈澱を行った
。

１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、沈澱を回収後、乾
固し、０．５μｍｏ　１１５ｍ１となるように蒸留水に
溶解させた。　５μｌの調製したプラスミドＤＮＡ　（
５μｍｏ　ｌ）に１．５ｔｔｌｌの１０倍濃縮クレノー
緩衝液（宝酒造）　１μｌのブライマーＤＮＡ　（ＰＬ
−バイオケミカル社）　、４．５μｌの蒸留水を加え、
全容を１２μｌとし、６０℃で１５分間加温後、室温で
２０分間放置した。

この反応液に２μｌの〔α−”Ｐ）ＡＴＰ　（４００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ、アマジャム・ジャパン）と１μｌのクレ
ノー断片酵素（宝酒造、２ユニツト）を加え、混合した
。　この混合液の３．２μｌずつを４種類の２μｌのｄ
ＮＴＰ十ｄｄＮＴＰ混合液（宝酒造）に加え、４２℃で
２０分間放置した。　各々にｌμｌのチェース溶液（宝
酒造）を加え、さらに４２℃で２０分間放置した。　最
後に、６μｌの９５％ホルムアミド色素（０，１％ブロ
ムフェノールブルーと０１１％　キシレンシアツールを
含む）を加えた。　常法に従い、６％アクリルアミド・
尿素ゲルを作製し、上記反応液２μ！をアプライし、１
７００Ｖで６時間、電気泳動を行った。　ゲルを乾燥後
、Ｘ線フィルムにはさみ、感光後、塩基配列を読み取っ
た。　解明した塩基配列を第８図に示す。

バチラス・チュウリンゲンシス・アイザワイａ７Ａ０２
１株の殺虫性蛋白遺伝子は、開始コドンＡＴＧから始ま
り、ストップコドンＴＡＡで終わる３５３５塩基のコー
デング領域をもち、１１７６個のアミノ酸をコードして
いた。

ステップ１：ベクターの調製 約５μｇの発現ベクターｐＫＫ２２３−３　（ファルマ
シア社）に、０．１ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝
酒造）を加え、３ａｍＨ！反応液（１０ｍＭ）リス−塩
酸（ｐＨ８，０）　、７ｍＭＭｇＣ１ｔ、１００ｍＭＮ
ａＣｊ、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１％
ウシ血清アルブミン〕中で３７℃、１５分間反応した。

　反応液を０　、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の臭化エチジ
ウムを含む０゜８％の低融点アガロースゲルに供し電気
泳動を行った後、紫外線ランプ下で、ｐＫＫ２２３−３
が保持する２個のＢａｍＨＩ認識部位のうち一つのみ切
断されたと推定されるＤＮＡ分子（４，６Ｋｂ）を切出
し、試験管にとり、６５℃で５分間加熱した。　ゲルを
融解し、フェノール抽出後、エタノール沈澱を行い、Ｄ
ＮＡを回収し、２０μｌの蒸留水に懸濁した。　約１μ
ｇの回収したＤＮＡに３ユニツトＴ４ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造）を加え、４５μ！のりガーゼ反応液（６６ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７，６）　、６．６ｍＭＭｇＣ１よ
、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ〕中で１
６℃、２時間反応した。　その後、コーエンらの方法に
従い、反応液を大腸菌ＪＭＩ０３株に形質転換した。　
出現したアンピシリン耐性コロニーを培養し、Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍらの方法に従い、プラスミドＤＮＡを調製した
。　約１μｇのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの制限酵
素Ｂａｍ１（ｌを加え、１３ａｍＨＩ反応液中で３７℃
、１時間反応し、アガロース電気泳動で分析した。　解
析したプラスミドのうち、ｐＫＫ２２３−３プラスミド
のマルチクローニング部位の１３ａｍＨＩ部位が保存さ
れており、他のＢａｍＨ１部位が消失しているプラスミ
ドを選択し、ｐＫＫ”２２３−４とした。　つぎに、約
５μｇのｐＫＫ２２３−４ＤＮＡに、ＩＯユニットの制
限酵素Ｐｓｔｌと１０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩを
加え、５ｏμｌのＰｓｔ１反応（１０ｍＭ）リス−塩酸
（ｐＨ７゜５）　、５０ｍＭＮａＣｊ！、１０ｍＭＭｇ
Ｃｊ！、、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μ
ｇ／ｍＩｌ牛血清アルブミン〕中で、３７℃、１時間反
応後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行った後、Ｄ
ＮＡを回収し、２０μＥの蒸留水の懸濁した。

ステップ２：殺虫性蛋白遺伝子を含むＰｓ　ｔ　Ｉ　−
ＢａｍＨＩ断片の調製 殺虫性蛋白遺伝子を含む約５μｇの発現プラスミドｐＣ
Ａ５に、約２０ユニツトの制限酵素Ｐｓｔ■および約２
０ユニツトの制限酵素Ｂａ　ｍ　ＨＩを加え、５０μＪ
のＰｓｔ１反応液（１０ｍＭ）すスー塩酸（ｐＨ７，５
）　、５０ｍＭＮａＣ１１１０ｍＭＭｇＣ１ｇ、１ｍＭ
２−メルカプトエタノール、１００μｇ　／　ｍ　１牛
血清アルブミン〕中で、３７℃１時間反応後、３０μｌ
のＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを加えて、フェノー
ル抽出を行った。　１０，０００　ｒ　ｐｍで５分間遠
心し・上層を分取後、１／４０量の４ＭＮａＣＪおよび
２倍量のエタノールを加えて、−８０℃に１０分間放置
した。　　１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心後、ＤＮ
Ａを回収し、乾固させたのち、２０μｌの蒸留水に懸濁
した。

ステップ３：発現プラスミドｐＫＣ６の構築ステップ１
およびステップ２で調製したｐｓｔｌ−ＢａｍＨＩ切断
ベクターｐＫＫ２２３−４およびＤＮＡ断片をそれぞれ
ｌＩＩｇずつ混合し、７゜２ユニツトのＴ４リガーゼ（
宝酒造）を加え、４５μｌのリガーゼ反応液中で１６℃
２時間反応した。　コーエンらの方法に従い、反応液を
大腸菌ＪＭ１０３株に形質転換した。　出現したアンピ
シリン耐性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを調製
した。　約１μｇのプラスミドＤＮＡに３ユニツトの制
限酵素ＢａｍＨＩを加え、３０μｌの１３ａｍＨＩ反応
液中で３７℃で１時間反応し、アガロース電気泳動で分
析した。　アガロース電気泳動の結果より、発現ベクタ
ーのｔａｃプロモーターの下流に殺虫性蛋白遺伝子が接
続したプラスミドを選択し、これを発現プラスミドｐＫ
Ｃ６とした（第９図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、キメラ殺虫性蛋白発現プラスミドｐＡＡＣ１
，ｐＡＣＡｌ、ｐＡｃｃｌ、ｐｃｃＡｌ、ρＣＡＡ　１
およびｐｃＡｃｌの構築方法を示す図である。図中、白
色、斜線、横線、ドツトのボックスは、それぞれ、１２
５ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子、　１３０ＫＤ殺虫性蛋白遺伝
子、　ｔａｃプロモーターおよびリポソームＲＮＡター
ミネータ−を示している。　Ｋ、）Ｉ、Ｐはそれぞれ、
制限酵素ＫＰ！ＬＩ、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ迂畦■を示す。 第２図は、キメラ殺虫性蛋白発現プラスミドｐＡＣＣＡ
Ｉ、ＰＣＡＣＡ３の構築方法を示す図である。図中、白
色、斜線、横線、ドツトのボックスはそれぞれ、１２５
ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子、１３０ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子、
ｔａｃプロモーター、リポソームＲＮＡターミネータ−
を示している＊　Ｂ、Ｅｃ、ＥＶは、それぞれ、制限酵
素地図」並ＲＩ、Ｅｃｏ　　ＲＶを示す。 第３図は、発現したキメラ殺虫性蛋白の定量をデンシト
メーターで行った結果である。（１）〜（１０）はそれ
ぞれ、大腸菌形質転換体ＪＭ１０３／ＰＴＢｌ、ＪＭ１
０３／ｐＫＣ６，ＪＭ１０３／ｐＡＡｃ１．ＪＭ１０３
／ｐＡｃＡ１．川１０３／ｐＡｃｃ１　、　ＪＭ１０３
／ｐＣＣＡ　１　、　ＪＭ　１０３／ｐＣＡＡ　１　、
　ＪＭ　１０３／ｐｃＡｃ１　、　ＪＭ１０３／ｐＡｃ
ｃＡ１およびＪＭ１０３／ｐＣＡＣＡ３の菌体粗抽出液
中の殺虫性蛋白を測定したものである。矢印のピークが
、１２５ＫＤ殺虫性蛋白（（１））　、１３０ＫＤ殺虫
性蛋白（（２）　）　、キメラ殺虫性蛋白〔（３）〜（
１０））のバンドにそれぞれ相当する。 第４図は、発現プラスミドｐＡＨ７，ｐＡＨ８、および
ｐＴＢｌの構築方法を示している。黒色、縦線、横線、
白色およびドツトを含むそれぞれのボックスは、殺虫性
蛋白遺伝子、ｌａｃプロモーター、リポソームＲＮＡタ
ーミネータ−１ｔａｃプロモーターおよび１ａｃＺ遺伝
子を示している。 ＡＴＣおよびＴＡＡは殺虫性蛋白遺伝子のそれぞれ開始
コドン、終止コドンである。Ａｈ、Ｋｐ。 ｐＶ、Ｂｍ、Ｈｃ、Ｐｓは、制限酵素Ａｈａｌ［Ｉ、−
に上」工Ｉ　５Ｐｖｕ■、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｃ■、お
よびＰｓｔｌを示す。 第５図は、１２５ＫＤ殺虫性蛋白遺伝子の構造遺伝子部
分の３４６５塩基からなる全塩基配列を示す、上段は塩
基配列を下段はそれから推定されるアミノ酸配列を示す
。塩基配列中、塩基番号１番目から３４６５番目までの
領域が殺虫性蛋白質遺伝子の構造遺伝子をコードする領
域である。 第６図は、プラスミドｐＡＢ６のインサートＤＮＡ　（
２２，４ｋｂ）の制限酵素地図を示す。アイザワイＩＰ
Ｌ株殺虫性蛋白遺伝子領域を大枠で示す。図の下部は、
殺虫性蛋白遺伝子領域の詳細な制限酵素部位を示してい
る。 第７図は、プラスミドｐｃＡ１およびｐＣＡ５のインサ
ートＤＮＡ　（３，５ｋｂ）の制限酵素地図を示す図で
ある。ｐｃＡｌとｐＣＡ５のインサートは、ベクターに
対して逆向きに接続している。　図中、ＰＳ％　Ｃ％　
Ｅ％　ＰＶ％　３％　Ｈ，ＫｓＢは、それぞれ制限酵素
ＰｓｔＩ、Ｃ１ａＩ、旦ｃｏＲＩ、　　Ｐｖｕｆｆ、　
５ａｉｌ、Ｈｉｎｄｌｆｌ、ＫエエＴ　、　Ｂ　ａ　ｍ
ＨＩを表す。 第８図は、１３０ＫＤ殺虫生蛋白遺伝子の構造遺伝子部
分の３５３５塩基からなる全塩基配列を示す。　上段は
塩基配列を下段はそれから推定されるアミノ酸配列を示
す。 第９図は、発現プラスミドｐＫＣ６の構築方法を示す図
である。　図中、黒色、白色のボックスは、それぞれ、
殺虫性蛋白遺伝子、ｔａｃプロモーターを示している。 　ＫｐＳＰＶ％　Ｂｍｓ　ＰＳは制限酵素基ｌユＩ　％
　Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ、ＢａｍＨＩ。 およびＰｓｔｌを示す。 第１図 ｐｃＡＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　。 第２図 発現プラスミド 第９図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の２種の殺虫性蛋白、１２５キロダルトン（ＫＤ）殺
   虫性蛋白及び１３０キロダルトン（ＫＤ）殺虫性蛋白を
   コードする遺伝子を制限酵素￥Ｅｃ￥ｏＲ I 、￥Ｅｃ
   ￥ｏＲＶ、￥Ｋｐ￥ｎ I 、￥Ｈｉｎｄ￥IIIで切断して
   得た各５領域（塩基番号（１−９９４）（９９５−１５
   ６７）（１５６８−２１７４）（２１７５−２７４４）
   （２７４５−３４６５）及び（１−９９４）（９９５−
   １５６７）（１５６８−２１７４）（２１７５−２８２
   ２）（２８２３−３５２８））のそれぞれの相当する領
   域を置き換えることにより構築したキメラ殺虫性蛋白遺
   伝子およびこれを含むＤＮＡ（２）バチラス・チュリン
   ゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の２種の殺虫性蛋白、１
   ２５ＫＤ殺虫性蛋白及び１３０ＫＤ殺虫性蛋白をコード
   する遺伝子を制限酵素￥Ｋｐ￥ｎ I 、￥Ｈｉｎｄ￥II
   Iで切断して得た各３領域（塩基番号（１−２１７４）
   （２１７５−２７４４）（２７４５−３４６５）及び（
   １−２１７４）（２１７５−２８２２）（２８２３−３
   ５２８））のそれぞれの相当する領域を置き換えること
   により構築した特許請求の範囲第１項記載のキメラ殺虫
   性蛋白遺伝子およびこれを含むＤＮＡ （３）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の２種の殺虫性蛋白、１２５ＫＤ殺虫性蛋白及び１３
   ０ＫＤ殺虫性蛋白をコードする遺伝子を制限酵素￥Ｅｃ
   ￥ｏＲ I 、￥Ｅｃ￥ｏＲＶ、￥Ｋｐ￥ｎ I 、￥Ｈｉｎ
   ｄ￥IIIで切断して得た各５領域（塩基番号（１−９９
   ４）（９９５−１５６７）（１５６８−２１７４）（２
   １７５−２７４４）（２７４５−３４６５）及び（１−
   ９９４）（９９５−１５６７）（１５６８−２１７４）
   （２１７５−２８２２）（２８２３−３５２８））のそ
   れぞれの相当する領域を置き換えることにより構築した
   キメラ殺虫性蛋白遺伝子を含みこれを微生物体内で発現
   させる発現プラスミド（４）ｐＡＡＣ１、ｐＡＣＣ１、
   ｐＡＣＡ１、ｐＣＣＡ１、ｐＣＡＡ１、ｐＣＡＣｌ、ｐ
   ＡＣＣＡ１若しくはｐＣＡＣＡ３と命名した特許請求の
   範囲第３項記載の発現プラスミド （５）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の２種の殺虫性蛋白、１２５ＫＤ殺虫性蛋白及び１３
   ０ＫＤ殺虫性蛋白をコードする遺伝子を制限酵素￥Ｅｃ
   ￥ｏＲ I 、￥Ｅｃ￥ｏＲＶ、￥Ｋｐ￥ｎ I 、￥Ｈｉｎ
   ｄ￥IIIで切断して得た各５領域（塩基番号（１−９９
   ４）（９９５−１５６７）（１５６８−２１７４）（２
   １７５−２７４４）（２７４５−３４６５）及び（１−
   ９９４）（９９５−１５６７）（１５６８−２１７４）
   （２１７５−２８２２）（２８２３−３５２８））のそ
   れぞれの相当する領域を置き換えることにより構築した
   キメラ殺虫性蛋白遺伝子を含みこれを微生物体内で発現
   させる発現プラスミドにより形質転換されキメラ殺虫性
   蛋白を生産する微生物 （６）ｐＡＡＣ１、ｐＡＣＣ１、ｐＡＣＡ１、ｐＣＣＡ
   １、ｐＣＡＡ１、ｐＣＡＣ１、ｐＡＣＣＡ１、若しくは
   ｐＣＡＣＡ３と命名した発現プラスミドを保持する特許
   請求の範囲第５項記載の微生物（７）バチラス・チュリ
   ンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の２種の殺虫性蛋白、
   １２５ＫＤ殺虫性蛋白及び１３０ＫＤ殺虫性蛋白をコー
   ドする遺伝子を制限酵素￥Ｅｃ￥ｏＲ I 、￥Ｅｃ￥ｏ
   ＲＶ、￥Ｋｐ￥ｎ I 、￥Ｈｉｎｄ￥IIIで切断して得た
   各５領域（塩基番号（１−９９４）（９９５−１５６７
   ）（１５６８−２１７４）（２１７５−２７４４）（２
   ７４５−３４６５）及び（１−９９４）（９９５−１５
   ６７）（１５６８−２１７４）（２１７５−２８２２）
   （２８２３−３５２８））のそれぞれの相当する領域を
   置き換えることにより構築したキメラ殺虫性蛋白遺伝子
   を含みこれを微生物体内で発現させる発現プラスミドに
   より形質転換されキメラ殺虫性蛋白を生産する微生物を
   培養することを特徴とするキメラ殺虫性蛋白の製造方法 （８）ｐＡＡＣ１、ｐＡＣＣ１、ｐＡＣＡ１、ｐＣＣＡ
   １、ｐＣＡＡ１、ｐＣＡＣ１、ｐＡＣＣＡ１、若しくは
   ｐＣＡＣＡ３と命名した発現プラスミドを保持する微生
   物を培養することを特徴とする特許請求の範囲第７項記
   載の製造方法