JPS6070079A - グルコアミラ−ゼ遺伝子 - Google Patents
グルコアミラ−ゼ遺伝子Info
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- JPS6070079A JPS6070079A JP59010360A JP1036084A JPS6070079A JP S6070079 A JPS6070079 A JP S6070079A JP 59010360 A JP59010360 A JP 59010360A JP 1036084 A JP1036084 A JP 1036084A JP S6070079 A JPS6070079 A JP S6070079A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
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- Storing Facsimile Image Data (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の背景）
この発明はグルコアミラーゼ遺伝子、この遺伝子の分離
方法、及びこの遺伝子の発現ベクターで形質転換されグ
ルコアミラーゼを生産する宿主に関する。
方法、及びこの遺伝子の発現ベクターで形質転換されグ
ルコアミラーゼを生産する宿主に関する。
遺伝子工学の技法は製薬工業に成功裏に適用され、多く
の新規な生成物を提供した。同じ技法が、他の工業にお
いて価値ある酵素の大規模製造に適用し得ることが次第
に明らかになってきた。遺伝子工学による商業的に有用
な方法の完成による利点として（１）酵素の製造コスト
の低減が可能であること、（２）食品のためにより適切
であシ安全であると一般に認識されている生物による酵
素の製造が可能であること、及び（３） ＤＮＡレベル
で特定の遺伝的変形を行うことにより酵素の性質、例え
ば熱安定性及びその他の性能特性全改良することが可能
であること等が期待される。
の新規な生成物を提供した。同じ技法が、他の工業にお
いて価値ある酵素の大規模製造に適用し得ることが次第
に明らかになってきた。遺伝子工学による商業的に有用
な方法の完成による利点として（１）酵素の製造コスト
の低減が可能であること、（２）食品のためにより適切
であシ安全であると一般に認識されている生物による酵
素の製造が可能であること、及び（３） ＤＮＡレベル
で特定の遺伝的変形を行うことにより酵素の性質、例え
ば熱安定性及びその他の性能特性全改良することが可能
であること等が期待される。
遺伝子工学の東要な工業的適用の１つは、澱粉のごとき
複雑な炭水化物を分解する工業的酵母囚株の能力の改良
に関する。アルコール発酵のため用可能な基質に加水分
解する酵素を生産しない。
複雑な炭水化物を分解する工業的酵母囚株の能力の改良
に関する。アルコール発酵のため用可能な基質に加水分
解する酵素を生産しない。
現在、発酵用１禅母に利用され得る基質を調製するため
には、アルコール発酵の原料である澱粉を化学的又は酵
素的に糖化しなければならない。
には、アルコール発酵の原料である澱粉を化学的又は酵
素的に糖化しなければならない。
従って、澱粉を利用可能な基質に分解することができる
１種又は複数種の酵素を合成する能力を自ら有する発酵
酵母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−を、遺伝的
組換法によって構成することが望ましいであろう。ヨー
ロッ・ぐ特許出願第Ｑ、０３４．４７０号は、細菌性供
与体微生物を破壊してＤＮＡを得、この断片をベクター
に挿入することによる、アミラーゼをコードする遺伝子
を含有する組換ＤＮＡの調′！Ｊ１を開示している。こ
のＤＮＡにより生産される、澱粉を加水分解するための
アミラーゼ酵素は、好ましくはα−アミラーゼ、β−ア
ミラーゼ又はゾルラナーゼである。
１種又は複数種の酵素を合成する能力を自ら有する発酵
酵母、例えばサツカロミセス・セレビシェ−を、遺伝的
組換法によって構成することが望ましいであろう。ヨー
ロッ・ぐ特許出願第Ｑ、０３４．４７０号は、細菌性供
与体微生物を破壊してＤＮＡを得、この断片をベクター
に挿入することによる、アミラーゼをコードする遺伝子
を含有する組換ＤＮＡの調′！Ｊ１を開示している。こ
のＤＮＡにより生産される、澱粉を加水分解するための
アミラーゼ酵素は、好ましくはα−アミラーゼ、β−ア
ミラーゼ又はゾルラナーゼである。
（発明の要約）
従って、この発明は１つの観点において、ｌ殿粉の加水
分解においてα−１，連結合及びα−１，６結合のいず
れにおいても活性であってグルコースを生成せしめるグ
ルコアミラーゼをコーげする遺伝子を組換体の形で含有
する発酵酵母を構成することに関する。
分解においてα−１，連結合及びα−１，６結合のいず
れにおいても活性であってグルコースを生成せしめるグ
ルコアミラーゼをコーげする遺伝子を組換体の形で含有
する発酵酵母を構成することに関する。
この発明は一般に、酵母又は細菌を包含するがこれらに
限定されない外来性宿主に組換体の形で導入されるグル
コアミラーゼ遺伝子の構成に関する。このような宿主に
はウィルス、植物又は動物細胞も含まれるであろう。
限定されない外来性宿主に組換体の形で導入されるグル
コアミラーゼ遺伝子の構成に関する。このような宿主に
はウィルス、植物又は動物細胞も含まれるであろう。
この発明の１つの観点に従えば、変形されたＤＮＡ配列
が提供され、このＤＮＡ配列は菌類グルコアミラーゼ蛋
白質をコーＰし、又はその１個もしくは複数個の塩基が
置換、欠失、挿入もしくは逆位にされており、天然、合
成又は半会成源から誘導されたものであり、そして開裂
された発現ベクターに正しく連結されそしてこのベクタ
ーにより宿主生物が形質転換された場合、グルコアミラ
ーゼ酵素活性を有する非天然蛋白質を発現することがで
きることを特徴とする。最も好ましくは、発現ベクター
は、そのＨｌｎｄ ｆｆＪ部位において切断され、この
部位に前記の配列を挿入することが可能であるプラスミ
ドｐＡｃ１であり、このデラスミＰは後でさらに説明す
る。
が提供され、このＤＮＡ配列は菌類グルコアミラーゼ蛋
白質をコーＰし、又はその１個もしくは複数個の塩基が
置換、欠失、挿入もしくは逆位にされており、天然、合
成又は半会成源から誘導されたものであり、そして開裂
された発現ベクターに正しく連結されそしてこのベクタ
ーにより宿主生物が形質転換された場合、グルコアミラ
ーゼ酵素活性を有する非天然蛋白質を発現することがで
きることを特徴とする。最も好ましくは、発現ベクター
は、そのＨｌｎｄ ｆｆＪ部位において切断され、この
部位に前記の配列を挿入することが可能であるプラスミ
ドｐＡｃ１であり、このデラスミＰは後でさらに説明す
る。
ルコアミラーゼを誘導する条件下で増殖した場合、非誘
導条件下で増殖した細胞中には検出されない約２．２ｋ
ｂのポＩＪ Ａ −ＲＮＡを比較的高濃度で含有するこ
とが見出された。誘導されたポリＡ −ＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ ）は、無Ｉ１１胞蛋白質合成系において、分子量約
７０，０００〜７４，０００を有する非グリコジル化ポ
リヘゾチドの合成を指令する。この？リベデチドＨ１Ａ
ｓアワモリのグルコアミラーゼに対する抗体と免疫的に
反応する。
導条件下で増殖した細胞中には検出されない約２．２ｋ
ｂのポＩＪ Ａ −ＲＮＡを比較的高濃度で含有するこ
とが見出された。誘導されたポリＡ −ＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ ）は、無Ｉ１１胞蛋白質合成系において、分子量約
７０，０００〜７４，０００を有する非グリコジル化ポ
リヘゾチドの合成を指令する。この？リベデチドＨ１Ａ
ｓアワモリのグルコアミラーゼに対する抗体と免疫的に
反応する。
誘導されたポリＡ −ＲＮＡの放射性ラベルされたｃ
ＤＮＡコピー′（ｉｌ−調製し、これを、グルコアミラ
ーゼ遺伝子の一部を含有するＡ・アワモルのｒツム性Ｄ
ＮＡ断片を同定するための・・イプリッＰ形成試験にお
いて使用する。
ＤＮＡコピー′（ｉｌ−調製し、これを、グルコアミラ
ーゼ遺伝子の一部を含有するＡ・アワモルのｒツム性Ｄ
ＮＡ断片を同定するための・・イプリッＰ形成試験にお
いて使用する。
同様に、前記のｃＤＮＡを、ｒツム性ＤＮＡ断片を組換
体の形で含有するファージ又はプラスミＰベクターを同
定するだめに使用する。
体の形で含有するファージ又はプラスミＰベクターを同
定するだめに使用する。
Ａ・アワモリのグルコアミラーゼ遺伝子全含有する旦穂
ｄＩ［Ｉ断片を酵母に導入した場合、これらの異種性（
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ旧Ｏ宿主においては転写（ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）も翻訳（ｔｒａｎｓｒａｔｉ
ｏｎ）も検出されない。
ｄＩ［Ｉ断片を酵母に導入した場合、これらの異種性（
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ旧Ｏ宿主においては転写（ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）も翻訳（ｔｒａｎｓｒａｔｉ
ｏｎ）も検出されない。
この発明はさらに、前記のＤＮＡ配列を含有する組換Ｄ
ＮＡ発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、選
択された種類の異なる微生物宿主と適合性であり、該宿
主中での遺伝子の発現を許容するものが好ましい。発現
される外来性遺伝子はケ９ツム性ＤＮＡ 、合成りＮＡ
、又は逆転写酵素によりｍＲＮＡから得られたｃ Ｄ
ＮＡのいずれであってもよい。
ＮＡ発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、選
択された種類の異なる微生物宿主と適合性であり、該宿
主中での遺伝子の発現を許容するものが好ましい。発現
される外来性遺伝子はケ９ツム性ＤＮＡ 、合成りＮＡ
、又は逆転写酵素によりｍＲＮＡから得られたｃ Ｄ
ＮＡのいずれであってもよい。
グルコアミラーゼ遺伝子を調製するための新規な方法は
、一般に、デノム性消化断片の調製、グルコアミラーゼ
遺伝子プの調製、このグローブを使用するグルコアミラ
ーゼ遺伝子領域含有ゲノム性消化断片の同定、同定され
たｒツム件消化断片の分子クローニング、部分的ｃ Ｄ
ＮＡの分子クローニング、ゲノム性クローン及びｃ Ｄ
ＮＡクローンの配列決定、配列決定されたグルコアミラ
ーゼ遺伝子領域と成熟グルコアミラーゼ酵素のアミノ酸
配列の全部又は一部との比較によるゲノム性クローン中
のすべてのイントロン及びエクソンの存在と位置の決定
、並びにイントロンを含む配列が除去された場合のケ９
ツム性グルコアミラーゼ遺伝子のコドン配列と実質上同
一のコドン配列を有する遺伝子の哨戒が含まれる。
、一般に、デノム性消化断片の調製、グルコアミラーゼ
遺伝子プの調製、このグローブを使用するグルコアミラ
ーゼ遺伝子領域含有ゲノム性消化断片の同定、同定され
たｒツム件消化断片の分子クローニング、部分的ｃ Ｄ
ＮＡの分子クローニング、ゲノム性クローン及びｃ Ｄ
ＮＡクローンの配列決定、配列決定されたグルコアミラ
ーゼ遺伝子領域と成熟グルコアミラーゼ酵素のアミノ酸
配列の全部又は一部との比較によるゲノム性クローン中
のすべてのイントロン及びエクソンの存在と位置の決定
、並びにイントロンを含む配列が除去された場合のケ９
ツム性グルコアミラーゼ遺伝子のコドン配列と実質上同
一のコドン配列を有する遺伝子の哨戒が含まれる。
好ましい態様においては、グルコアミラーゼ遺伝子ブの
調製は、澱粉の非存在下キシロース又はグリセリンに増
殖した場合に菌類の種が生産するレベルの少なくとも１
０倍のレベルのグルコアミラーゼを澱粉に増殖した場合
に生産することができる菌類を選択し、選択されたこの
菌類の細胞をグリコアミラーゼの培地への分泌を誘導す
る条件下で培養し、培養細胞からｍＲＮＡ ｆ取得し、
得られたｍＲＮＡを大きさに従って分画し、ゲルコアミ
ラた同じ大きさのｍＲＮＡに比べて相対的に高濃度であ
ることが検知されるｍＲＮＡを選択し、そしてこうして
選択されたｍＲＮＡを複製してグルコアミラーゼグロー
ブを調製することにより行う。
調製は、澱粉の非存在下キシロース又はグリセリンに増
殖した場合に菌類の種が生産するレベルの少なくとも１
０倍のレベルのグルコアミラーゼを澱粉に増殖した場合
に生産することができる菌類を選択し、選択されたこの
菌類の細胞をグリコアミラーゼの培地への分泌を誘導す
る条件下で培養し、培養細胞からｍＲＮＡ ｆ取得し、
得られたｍＲＮＡを大きさに従って分画し、ゲルコアミ
ラた同じ大きさのｍＲＮＡに比べて相対的に高濃度であ
ることが検知されるｍＲＮＡを選択し、そしてこうして
選択されたｍＲＮＡを複製してグルコアミラーゼグロー
ブを調製することにより行う。
この発明の他の態様においては、宿主中で機能するプロ
モーター断片及び菌類グリコアミラーゼ蛋白質をコード
する変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメンｉｆ
含んで成り、該配列が前記宿主中で発現して非天然グル
コアミラーゼを生産するように前記セグメントが前記プ
ロモーター断片に対して方向ずけられているＩＩＩＶＡ
発現ベクターにより形質転換された宿主生物が提供され
る。
モーター断片及び菌類グリコアミラーゼ蛋白質をコード
する変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメンｉｆ
含んで成り、該配列が前記宿主中で発現して非天然グル
コアミラーゼを生産するように前記セグメントが前記プ
ロモーター断片に対して方向ずけられているＩＩＩＶＡ
発現ベクターにより形質転換された宿主生物が提供され
る。
この発明の遺伝子は、該遺伝子を含んで成る発現ベクタ
ーにより形質転換された宿主生物中で発現する場合、グ
リコアミラーゼ活性を有する酵素を生産する。好ましく
は、このグルコアミラーゼ酵素はＮ末端にシグナル配列
全盲し、分泌の過程で宿主生物によりプロセシングされ
るグレー蛋白質として生産される。
ーにより形質転換された宿主生物中で発現する場合、グ
リコアミラーゼ活性を有する酵素を生産する。好ましく
は、このグルコアミラーゼ酵素はＮ末端にシグナル配列
全盲し、分泌の過程で宿主生物によりプロセシングされ
るグレー蛋白質として生産される。
他の態様において、この発明は組換グルコアミラーゼ遺
伝子を用いる澱粉の糖化によるグルコースの製造方法に
関する。
伝子を用いる澱粉の糖化によるグルコースの製造方法に
関する。
他の態様においてこの発明は、前記のＤＮＡ発現ベクタ
ーによシ形質転換された宿主生物をグルコアミラーゼ酵
素の基質である非発酵性炭素源に増殖せしめることを含
んで成る、糖化と発酵を同時に行うことによるエタノー
ルの製造方法に関する。
ーによシ形質転換された宿主生物をグルコアミラーゼ酵
素の基質である非発酵性炭素源に増殖せしめることを含
んで成る、糖化と発酵を同時に行うことによるエタノー
ルの製造方法に関する。
他の態様において、この発明は任意の蛋白質性物質を細
胞外に分泌せしめる方法に関し、この方法は、プロモー
ター断片、実質上次のアミノ酸配列： ＭＦＴＳ鼠匹届Ｓ凪画圓患画Ｓ凪０λ′画Ｖ厄鄭窪ＧＬ
Ｙ ′ＬＮＡＬＡ ＡＳＮ ＶＡＬ ＩＩＥ ＳＩＲＬ
ＹＳ ＡＲＧを有するシグナル配列及び蛋白質性物質を
コードするＤＮＡセルメントを含んで成るＤＮＡ発現シ
ラスミドにより形質転換された宿主生物を培地中で培養
することを含んで成る。
胞外に分泌せしめる方法に関し、この方法は、プロモー
ター断片、実質上次のアミノ酸配列： ＭＦＴＳ鼠匹届Ｓ凪画圓患画Ｓ凪０λ′画Ｖ厄鄭窪ＧＬ
Ｙ ′ＬＮＡＬＡ ＡＳＮ ＶＡＬ ＩＩＥ ＳＩＲＬ
ＹＳ ＡＲＧを有するシグナル配列及び蛋白質性物質を
コードするＤＮＡセルメントを含んで成るＤＮＡ発現シ
ラスミドにより形質転換された宿主生物を培地中で培養
することを含んで成る。
好ましくは、この蛋白質性物質は正常に分泌される蛋白
質であり、最も好ましくはグルコアミラーゼである。
質であり、最も好ましくはグルコアミラーゼである。
この発明においては、外来性遺伝子が酵母において発現
した場合に得られるグルコアミラーゼ酵素はグリコジル
化されていることが認められる。
した場合に得られるグルコアミラーゼ酵素はグリコジル
化されていることが認められる。
さらに、グルコアミラーゼの大部分（９０％以上）が培
地中に分泌される。さらに、培地中に分泌された非天然
グルコアミラーゼ蛋白質（８５チより高い純度を有する
）めＮ末端の配列を決定した場合、最初の２９アミノ酸
がアス（ルギルスによシ分泌された成熟グルコアミラー
ゼ蛋白質と同一であることが見出された。ＳＤＳ ｙｌ
ｅリアクリルアミドｒル電気泳動によシ測定されたこの
発明の方法により得られたグルコアミラーゼ蛋白質の見
かけ上の分子量は、アスペルギルスによ）分泌された、
プロセシングされグリコジル化された成熟形の天然グル
コアミラーゼについて観察される分子量と同様であった
。さらに、カルボキシ末端アミノ酸は、アスペルギルス
により生産される大分子量形のグルコアミラーゼのそれ
と同一である。
地中に分泌される。さらに、培地中に分泌された非天然
グルコアミラーゼ蛋白質（８５チより高い純度を有する
）めＮ末端の配列を決定した場合、最初の２９アミノ酸
がアス（ルギルスによシ分泌された成熟グルコアミラー
ゼ蛋白質と同一であることが見出された。ＳＤＳ ｙｌ
ｅリアクリルアミドｒル電気泳動によシ測定されたこの
発明の方法により得られたグルコアミラーゼ蛋白質の見
かけ上の分子量は、アスペルギルスによ）分泌された、
プロセシングされグリコジル化された成熟形の天然グル
コアミラーゼについて観察される分子量と同様であった
。さらに、カルボキシ末端アミノ酸は、アスペルギルス
により生産される大分子量形のグルコアミラーゼのそれ
と同一である。
（好ましい具体的態様の詳細な記載）
この明細書において使用する用語は次の意味を有する。
「ＤＮＡ配列」は、隣接するペントースの３′及び５′
炭素間のホスホノエステル結合により相互に連結されて
いるヌクレオチド９の線状列である。
炭素間のホスホノエステル結合により相互に連結されて
いるヌクレオチド９の線状列である。
［変形されたＤＮＡ配列］は、例えば天然配列からのイ
ントロンの除去又は天然配列のイントロンの変形により
天然グルコアミラーゼＤＮＡ配列と異なるＤＮＡ配列で
ある。この例としてイントロンを含有しない配列を挙げ
ることができる。イントロン全実質上含有しない配列と
は約８０チより多くが除去されている配列を意味する。
ントロンの除去又は天然配列のイントロンの変形により
天然グルコアミラーゼＤＮＡ配列と異なるＤＮＡ配列で
ある。この例としてイントロンを含有しない配列を挙げ
ることができる。イントロン全実質上含有しない配列と
は約８０チより多くが除去されている配列を意味する。
「グルコアミラーゼ活性」は、澱粉又は澱粉加水分解物
の水性スラリーと接触した酵素が澱粉をグルコース分子
に分解する量である。
の水性スラリーと接触した酵素が澱粉をグルコース分子
に分解する量である。
変形された基本ＤｔＪＡ配列の「１個又は複数個の塩基
の置換、欠失、挿入及び逆位」とは、ＤＮＡ配列におけ
る変性であって、コドンが変異しており又はデオキシリ
がヌクレオチｒが異なる塩基もしくは他の要素を含有す
るように誘導されているが、このように変化したＤＮＡ
配列がなお、宿主中に形質転換された場合に、グルコア
ミラーゼ蛋白質全発現する場合を言う。
の置換、欠失、挿入及び逆位」とは、ＤＮＡ配列におけ
る変性であって、コドンが変異しており又はデオキシリ
がヌクレオチｒが異なる塩基もしくは他の要素を含有す
るように誘導されているが、このように変化したＤＮＡ
配列がなお、宿主中に形質転換された場合に、グルコア
ミラーゼ蛋白質全発現する場合を言う。
「菌類グルコアミラーゼ蛋白質」は、細菌に山域の菌株
に由来する蛋白質である。従って、菌類グルコアミラー
ゼ蛋白質をコーＰする変形されたＤＮＡ配列とは、この
ＤＮＡが細菌性供与体微生物から誘導されたものでない
ことを意味する。
に由来する蛋白質である。従って、菌類グルコアミラー
ゼ蛋白質をコーＰする変形されたＤＮＡ配列とは、この
ＤＮＡが細菌性供与体微生物から誘導されたものでない
ことを意味する。
「非天然グルコアミラーゼ蛋白質」は天然に又は自然に
生産されたのではなく宿主として使用された微生物によ
シ生産されたグルコアミラーゼ蛋白質である。
生産されたのではなく宿主として使用された微生物によ
シ生産されたグルコアミラーゼ蛋白質である。
「グルコアミラーゼの基質である非発酵性炭素源」は、
宿主が発酵することができないグルコアミラーゼ酵素の
基質であり、例えば澱粉、マルトース、インマルトース
、及び澱粉から誘導されるその他のオリゴサッカライｒ
である。セルロースはグルコアミラーゼの基質ではなく
、従ってこの定義に含まれない。
宿主が発酵することができないグルコアミラーゼ酵素の
基質であり、例えば澱粉、マルトース、インマルトース
、及び澱粉から誘導されるその他のオリゴサッカライｒ
である。セルロースはグルコアミラーゼの基質ではなく
、従ってこの定義に含まれない。
この発明は、変形されたＤＮＡ及び組換ＤＮＡ技法によ
シ遺伝子が導入された発現ベクターに関し、このベクタ
ーは宿主生物中に形質転換された場合グルコアミラーゼ
を発現する。変形されたＤＮＡ配列は天然、脅威又は半
合成源から誘導することができる。好ましくは、このＤ
ＮＡ配列は、非誘導レベルの少なくとも１０倍の誘導レ
ベルのグルコアミラーゼを生産する選択された自然の菌
類分離源から得る。誘導レベルとは唯一の又は主たる炭
素源としての澱粉に増殖した場合に菌類によって生産さ
れるレベルであり、非誘導レベルとは菌類がグリセリン
又はキシロースに増殖した場合に観察されるレベルであ
る。
シ遺伝子が導入された発現ベクターに関し、このベクタ
ーは宿主生物中に形質転換された場合グルコアミラーゼ
を発現する。変形されたＤＮＡ配列は天然、脅威又は半
合成源から誘導することができる。好ましくは、このＤ
ＮＡ配列は、非誘導レベルの少なくとも１０倍の誘導レ
ベルのグルコアミラーゼを生産する選択された自然の菌
類分離源から得る。誘導レベルとは唯一の又は主たる炭
素源としての澱粉に増殖した場合に菌類によって生産さ
れるレベルであり、非誘導レベルとは菌類がグリセリン
又はキシロースに増殖した場合に観察されるレベルであ
る。
グルコアミラーゼの生産について選択された菌類をグル
コアミラーゼ誘導条件下で適切に培養し、培養細胞から
ポリＡ −ＲＮＡ分画全分離し、そして非誘導細胞から
のｍＲＮＡに比べて検出され得る程高濃度で存在するグ
ルコアミラーゼｍＲＮＡをサイズ分画する。逆転写酵素
を用いてｍＲＮＡ ｋコピーすることによりグルコアミ
ラーゼｃＤＮＡを調製スる。
コアミラーゼ誘導条件下で適切に培養し、培養細胞から
ポリＡ −ＲＮＡ分画全分離し、そして非誘導細胞から
のｍＲＮＡに比べて検出され得る程高濃度で存在するグ
ルコアミラーゼｍＲＮＡをサイズ分画する。逆転写酵素
を用いてｍＲＮＡ ｋコピーすることによりグルコアミ
ラーゼｃＤＮＡを調製スる。
この発明において期待される好ましいＤＮＡ配列は、糸
状菌、好ましくはアスコミセーテス綱の種、好ましくは
糸状アスコミセーテス、さらに好ましミラーゼ（アミロ
グルコシダーゼ）をコーＰする配列である。これらの分
離源から得られる天然酵素は高分子量澱粉の分解におい
て活性であシ、そしてα−１，４−鎖結合と共にα−１
，６−側鎖結合を加水分解することができる。澱粉及び
種々の６炭素糖、例えばグルコースに増殖したＡ、アワ
モリの培養物により比較的高レベルの酵素が生産され、
そして分泌される。
状菌、好ましくはアスコミセーテス綱の種、好ましくは
糸状アスコミセーテス、さらに好ましミラーゼ（アミロ
グルコシダーゼ）をコーＰする配列である。これらの分
離源から得られる天然酵素は高分子量澱粉の分解におい
て活性であシ、そしてα−１，４−鎖結合と共にα−１
，６−側鎖結合を加水分解することができる。澱粉及び
種々の６炭素糖、例えばグルコースに増殖したＡ、アワ
モリの培養物により比較的高レベルの酵素が生産され、
そして分泌される。
この発明を、ＤＮＡ配列の分離源として特にＡ１アワモ
リに言及して記載するが、この発明は誘導性グルコアミ
ラーゼを有する他の菌類、好ましくはアスペルギルス属
の棟に適用されることが認識される。特に、後で記載す
るごとく、Ａ、アワモではないにしても類似している。
リに言及して記載するが、この発明は誘導性グルコアミ
ラーゼを有する他の菌類、好ましくはアスペルギルス属
の棟に適用されることが認識される。特に、後で記載す
るごとく、Ａ、アワモではないにしても類似している。
詳細な研弗のために菌類Ａ１アワモリ全選択した。この
菌類の種は、唯一の又は主要な炭素源としての澱粉に増
殖した場合、乾煉細胞電量当りの測定し得る酵素活性を
基礎にして、キシロース又はグリセリンに増殖した細胞
のグルコアミラーゼ量の約２００倍量のグリコアミラー
ゼを培地中に生産する。
菌類の種は、唯一の又は主要な炭素源としての澱粉に増
殖した場合、乾煉細胞電量当りの測定し得る酵素活性を
基礎にして、キシロース又はグリセリンに増殖した細胞
のグルコアミラーゼ量の約２００倍量のグリコアミラー
ゼを培地中に生産する。
Ａ１アワモルは、澱粉に増殖した場合、少なくとも２種
類の区別し得るグルコアミラーゼ酵素を生産する。これ
らの酵素の内の一方は、グルコアミラーゼ−■と称され
、文献１に報告されているごとく約７ ’４．９００の
分子量を有し、そして啄ゾチＰのセリン残基及びスレオ
ニン残基の若干又はすべてがグリコジル化されている。
類の区別し得るグルコアミラーゼ酵素を生産する。これ
らの酵素の内の一方は、グルコアミラーゼ−■と称され
、文献１に報告されているごとく約７ ’４．９００の
分子量を有し、そして啄ゾチＰのセリン残基及びスレオ
ニン残基の若干又はすべてがグリコジル化されている。
第二の酵素であるグルコアミラーゼ−Ｉは、文献１に報
告されているごとく約５４．３００の分子量含有し、そ
してやはシダリコシル化されている。糖蛋白質は精密に
特徴付けることが困難であるから、この明細書に記載す
るグリコジル化グルコアミラーゼの大きさは概略にすぎ
ない。
告されているごとく約５４．３００の分子量含有し、そ
してやはシダリコシル化されている。糖蛋白質は精密に
特徴付けることが困難であるから、この明細書に記載す
るグリコジル化グルコアミラーゼの大きさは概略にすぎ
ない。
幾通りかの証明により、Ａ、アワモリの２神類のグルコ
アミラーゼ酵素は共通のポリペプチド０から誘導される
ことが示唆される。後で記載するように、各酵素に対し
て調製された抗体は他方の酵素と免疫特異的に反応する
。これら２種類の酵素さらに、これらのＮ−末端配列は
アスペルギルス・二が一由来のグルコアミラーゼＩ形及
びｎ形のそれと同一であり、そして文献１ａに報告され
ているごとく、Ａにが−のこれら２種類のグルコアミラ
ーゼ形は共通のポリペプチドから誘導されるようである
。後で検討するように、この発明を支持するために行わ
れた実験は、１つのＡ１アワモリグルコアミラーゼ遺伝
子が１つのグルコアミラーゼポリペプチド前駆体をコー
ドし、これはＡ、二が−により生産されるそれと同一で
はないにしても非常に類似している。
アミラーゼ酵素は共通のポリペプチド０から誘導される
ことが示唆される。後で記載するように、各酵素に対し
て調製された抗体は他方の酵素と免疫特異的に反応する
。これら２種類の酵素さらに、これらのＮ−末端配列は
アスペルギルス・二が一由来のグルコアミラーゼＩ形及
びｎ形のそれと同一であり、そして文献１ａに報告され
ているごとく、Ａにが−のこれら２種類のグルコアミラ
ーゼ形は共通のポリペプチドから誘導されるようである
。後で検討するように、この発明を支持するために行わ
れた実験は、１つのＡ１アワモリグルコアミラーゼ遺伝
子が１つのグルコアミラーゼポリペプチド前駆体をコー
ドし、これはＡ、二が−により生産されるそれと同一で
はないにしても非常に類似している。
この発明の１つの観点に従えば、選択された菌類の種の
細胞は、グルコアミラーゼの培地中への分泌を誘導する
条件下で増殖した場合、非誘導条件下で、増殖した細胞
においては本質上検出されないポリＡ −ＲＮＡを含有
していることが見出された。このポＩＪ Ａ −ＲＮＡ
は、無細胞蛋白質合成系において、その菌類の種からの
グルコアミラーゼに対して調製された抗体と免疫反応す
るポリペブチＰの合成を指令する。
細胞は、グルコアミラーゼの培地中への分泌を誘導する
条件下で増殖した場合、非誘導条件下で、増殖した細胞
においては本質上検出されないポリＡ −ＲＮＡを含有
していることが見出された。このポＩＪ Ａ −ＲＮＡ
は、無細胞蛋白質合成系において、その菌類の種からの
グルコアミラーゼに対して調製された抗体と免疫反応す
るポリペブチＰの合成を指令する。
遺伝子は自己のそのままの制御要素によっては酵母宿主
中で発現しないので、酵母がこの遺伝子を転写し、ｍＲ
ＮＡを翻訳し、そして活性なグルコアミラーゼを生産す
るようにイントロンを除去又は変形し、そしてプロモー
ターを交換しなければならない。
中で発現しないので、酵母がこの遺伝子を転写し、ｍＲ
ＮＡを翻訳し、そして活性なグルコアミラーゼを生産す
るようにイントロンを除去又は変形し、そしてプロモー
ターを交換しなければならない。
イントロンは、文献中に知られているイントロン除去法
、又は後で例２Ｂに記載するようなさらに簡単な方法に
よりグルコアミラーゼ遺伝子から除去することができ、
後者の方法においては種々の段階で特定の制限酵素を用
いて断片全形成し、次にこれを連結し、そして部位指定
変異形成（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉａ） ｆ用いる。この変異形成技法においては
、グルコアミラーゼ遺伝子の最も５′側のイントロンを
、このイントロンの両側の配列に相同なプライマーを用
い、このプライマーをグルコアミラーゼゲノム性クロー
ンの単鎖ＤＮＡテングレートとアニーリングすることに
より除去する。次にこのプライマーを用いて、Ｍ１３単
鎖ファージＤＮＡテンプレート上でのプライマーの延長
により相補鎖のＤＮＡ合成をｆ”＝イムする。こうして
得られた分子は、イントロン配列を含有する単鎖ループ
を伴う二重鎖環状分子である。この分子を細胞に形質転
換した場合これらのループは切除され、これによジイン
トロンが除去される。
、又は後で例２Ｂに記載するようなさらに簡単な方法に
よりグルコアミラーゼ遺伝子から除去することができ、
後者の方法においては種々の段階で特定の制限酵素を用
いて断片全形成し、次にこれを連結し、そして部位指定
変異形成（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉａ） ｆ用いる。この変異形成技法においては
、グルコアミラーゼ遺伝子の最も５′側のイントロンを
、このイントロンの両側の配列に相同なプライマーを用
い、このプライマーをグルコアミラーゼゲノム性クロー
ンの単鎖ＤＮＡテングレートとアニーリングすることに
より除去する。次にこのプライマーを用いて、Ｍ１３単
鎖ファージＤＮＡテンプレート上でのプライマーの延長
により相補鎖のＤＮＡ合成をｆ”＝イムする。こうして
得られた分子は、イントロン配列を含有する単鎖ループ
を伴う二重鎖環状分子である。この分子を細胞に形質転
換した場合これらのループは切除され、これによジイン
トロンが除去される。
しかし、切除がなくてもＤＮＡの複製により正しい子孫
が生ずるであろう。遺伝子中にイントロンが存在する場
合、遺伝子が発現される酵母中でグルコアミラーゼ酵素
はほとんど又は全く生産されないＯ イントロンを除去した後、グルコアミラーゼ遺伝子を遺
伝的組換によりＤＮＡ発現ベクター、好ましくはプラス
ミドに挿入し、次にこのシラスミドを用いて微生物宿主
を形質転換する。このためにれる。この発明において有
用な微生物宿主はその形質転換のために適当な遺伝的背
景を含んでいなければならない。すなわち発現ベクター
が宿主株の遺伝的背景と適合しなければならない。例え
ば、酵母宿主を例示する次の例において使用される−る
宿主レシピエンド酵母菌株Ｃ４６８及びＨ２Ｓハ、イン
ゾロビルマレートデヒト”ログナーゼ活性を欠損してお
り、従って発現ベクターに選択可能なマーカーであるβ
−インプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）
を挿入することによりロイシン原栄養性に補完（ｃｏｍ
ｐｌａｍｅｎｔ）される。発現ベクターが選択可能なマ
ーカーを含有することにより自ら表現型選択を可能にす
ることもできるがその必要はない。宿主をグルコアミラ
ーゼ遺伝子についてスクリーニング又は選択することが
できるからである。
が生ずるであろう。遺伝子中にイントロンが存在する場
合、遺伝子が発現される酵母中でグルコアミラーゼ酵素
はほとんど又は全く生産されないＯ イントロンを除去した後、グルコアミラーゼ遺伝子を遺
伝的組換によりＤＮＡ発現ベクター、好ましくはプラス
ミドに挿入し、次にこのシラスミドを用いて微生物宿主
を形質転換する。このためにれる。この発明において有
用な微生物宿主はその形質転換のために適当な遺伝的背
景を含んでいなければならない。すなわち発現ベクター
が宿主株の遺伝的背景と適合しなければならない。例え
ば、酵母宿主を例示する次の例において使用される−る
宿主レシピエンド酵母菌株Ｃ４６８及びＨ２Ｓハ、イン
ゾロビルマレートデヒト”ログナーゼ活性を欠損してお
り、従って発現ベクターに選択可能なマーカーであるβ
−インプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）
を挿入することによりロイシン原栄養性に補完（ｃｏｍ
ｐｌａｍｅｎｔ）される。発現ベクターが選択可能なマ
ーカーを含有することにより自ら表現型選択を可能にす
ることもできるがその必要はない。宿主をグルコアミラ
ーゼ遺伝子についてスクリーニング又は選択することが
できるからである。
この発明において好ましい細菌宿主はＥ１コリス（Ｓ、
ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｌｓ）、又はこれらの混合
もしくは変異株、さらに好ましくはＳ１セレビンエーの
株、そして最も好ましくは後で詳細に記載する酵母Ｃ４
６８株である。
ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｌｓ）、又はこれらの混合
もしくは変異株、さらに好ましくはＳ１セレビンエーの
株、そして最も好ましくは後で詳細に記載する酵母Ｃ４
６８株である。
移転及び複製のために適当なりＮＡ発現ベクター又はＤ
ＮＡ移転ベクターは例えば文献ＩＣ及び１ｄに記載され
ている。この発明において使用される酵母ベクターの多
くはｐＢＲ３２２のごときＥ１コリベクターから誘導さ
れる。これらの文献、特にＩＣ及び１ｄは、組込み形質
転換（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ）について記載しており、この形質転換において
は微生物が複製開始点を有しないベクターにより形質転
換され、このベクターは宿主染色体に組み込まれ、保持
され、そして染色体の一部として複製される。この発明
の他の態様においては、宿主が自律複製ベクターにより
形質転ａされ、この場合ベクターが宿主細胞中でＤＮＡ
複製開始点として機能するＤＮＡセグメントを含有する
。自律複製セグメントを含有するベクターは文献１ｅに
も記載されている。複製画始点として機能することがで
きるＤＮＡセグメントは酵母に由来するものであること
が好ましい。この酵母由来の複製開始点には２つのタイ
プがあり、その一方は酵母染色体ＤＮＡから独立して複
製する能力を有し一般に２ミクロンサークルと称される
天然の酵母プラスミドから誘導されたものであシ、他方
はａｒｓ（ａｕｔ６ｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）と称する複製開始点配列を含
有する酵母染色体複製開始点から誘導されたものであり
、やはり自律複製能を供する。
ＮＡ移転ベクターは例えば文献ＩＣ及び１ｄに記載され
ている。この発明において使用される酵母ベクターの多
くはｐＢＲ３２２のごときＥ１コリベクターから誘導さ
れる。これらの文献、特にＩＣ及び１ｄは、組込み形質
転換（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ）について記載しており、この形質転換において
は微生物が複製開始点を有しないベクターにより形質転
換され、このベクターは宿主染色体に組み込まれ、保持
され、そして染色体の一部として複製される。この発明
の他の態様においては、宿主が自律複製ベクターにより
形質転ａされ、この場合ベクターが宿主細胞中でＤＮＡ
複製開始点として機能するＤＮＡセグメントを含有する
。自律複製セグメントを含有するベクターは文献１ｅに
も記載されている。複製画始点として機能することがで
きるＤＮＡセグメントは酵母に由来するものであること
が好ましい。この酵母由来の複製開始点には２つのタイ
プがあり、その一方は酵母染色体ＤＮＡから独立して複
製する能力を有し一般に２ミクロンサークルと称される
天然の酵母プラスミドから誘導されたものであシ、他方
はａｒｓ（ａｕｔ６ｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）と称する複製開始点配列を含
有する酵母染色体複製開始点から誘導されたものであり
、やはり自律複製能を供する。
この発明の発現ベクターは、菌類グルコアミラーゼ蛋白
質をコードする変形されたＤＮＡ配列と共に、微生物、
すなわち採用された宿主中で機能するプロモーター断片
を必ず含有する。蛋白質をコーＰするセグメントは、微
生物宿主中で発現して非天然グルコアミラーゼを生産す
るように、プロモーター断片に対して方向付けられてい
なければならない。Ｅ１コリのごとき細菌のためにはｔ
ｒｐプロモーターが好ましい。酵母のためには酵母プロ
モーター断片が好ましい。このための可能な酵母プロモ
ーター断片には、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（
ＡＤＨ−１）、３−ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）
、ピルベートキナーゼ（ＰＹＫ）、トリオースホスフェ
ートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、β−インプロピルマレー
トデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２ ） 、りりセロアルデ
ヒド３−ホスフェートデヒ１．Ｆ ｏダナーゼ（ＴＤＨ
）、エノラーゼＩ （ＥＮＯＩ）遺伝子のプロモーター
、及びこれらに類するものが含まれる。この発明のため
に好ましいプロモーター断片はエノラーゼ■遺伝子に由
来するものである。
質をコードする変形されたＤＮＡ配列と共に、微生物、
すなわち採用された宿主中で機能するプロモーター断片
を必ず含有する。蛋白質をコーＰするセグメントは、微
生物宿主中で発現して非天然グルコアミラーゼを生産す
るように、プロモーター断片に対して方向付けられてい
なければならない。Ｅ１コリのごとき細菌のためにはｔ
ｒｐプロモーターが好ましい。酵母のためには酵母プロ
モーター断片が好ましい。このための可能な酵母プロモ
ーター断片には、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（
ＡＤＨ−１）、３−ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）
、ピルベートキナーゼ（ＰＹＫ）、トリオースホスフェ
ートイソメラーゼ（ＴＰＩ）、β−インプロピルマレー
トデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２ ） 、りりセロアルデ
ヒド３−ホスフェートデヒ１．Ｆ ｏダナーゼ（ＴＤＨ
）、エノラーゼＩ （ＥＮＯＩ）遺伝子のプロモーター
、及びこれらに類するものが含まれる。この発明のため
に好ましいプロモーター断片はエノラーゼ■遺伝子に由
来するものである。
この発明の発現ベクターはさらに、蛋白質をコードする
セグメントに続いて微生物転写終結セグメント全コード
セグメントの転写の方向に含有するのが好ましい。可能
な転写終結セグメントの例には前記の遺伝子の３′セグ
メントが含まれる。好ましい転写終結セグメントはエノ
ラーゼ■遺伝子に由来するものである。
セグメントに続いて微生物転写終結セグメント全コード
セグメントの転写の方向に含有するのが好ましい。可能
な転写終結セグメントの例には前記の遺伝子の３′セグ
メントが含まれる。好ましい転写終結セグメントはエノ
ラーゼ■遺伝子に由来するものである。
好ましい宿主系は、！ラスミドｐＧＡＣ９で形質転換さ
れた酵母宿主Ｓ１セレビシェ−０４６８株である。この
好ましい形質転換された酵母は、ＡＴＣＣ寄託Ａ ２０
ｒ ６９０として１９８３年１１月１７日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）。
れた酵母宿主Ｓ１セレビシェ−０４６８株である。この
好ましい形質転換された酵母は、ＡＴＣＣ寄託Ａ ２０
ｒ ６９０として１９８３年１１月１７日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）。
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ
ｖｌｌｌｅ ＭＤ２０８５２に寄託された。他の好まし
い宿主系は、プラスミドｐＧＣ２４によ）形質転換され
た宿主Ｅ１コＩＪ Ｍ Ｈ２Ｏ株から成り、この形質転
換体はＡＴＣＣ寄託屋３９．５３７として１９８３年１
２月１６日にＡＴＣＣに寄託された。
ｖｌｌｌｅ ＭＤ２０８５２に寄託された。他の好まし
い宿主系は、プラスミドｐＧＣ２４によ）形質転換され
た宿主Ｅ１コＩＪ Ｍ Ｈ２Ｏ株から成り、この形質転
換体はＡＴＣＣ寄託屋３９．５３７として１９８３年１
２月１６日にＡＴＣＣに寄託された。
後で記載するように、Ａ％ アワモリグルコアミラーゼ
シグナル配列は、効果的なプロセシングのため及び酵母
からのグルコアミラーゼの分泌のために酵母中で機能す
ることが示される。この配列は又、酵母からの他の蛋白
質の分泌のためにも使用することができ、そして好まし
くは天然の宿主によシ正常に分泌される蛋白質の酵母か
らの分泌のだめに使用することができる。このような蛋
白質の例にはアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、
インターフェロン、リンホカイン、インスリン、及びホ
ルモンが含まれる。
シグナル配列は、効果的なプロセシングのため及び酵母
からのグルコアミラーゼの分泌のために酵母中で機能す
ることが示される。この配列は又、酵母からの他の蛋白
質の分泌のためにも使用することができ、そして好まし
くは天然の宿主によシ正常に分泌される蛋白質の酵母か
らの分泌のだめに使用することができる。このような蛋
白質の例にはアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、
インターフェロン、リンホカイン、インスリン、及びホ
ルモンが含まれる。
次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但し
これによシこの発明の範囲を限定するものではない。特
にことわらない限シ・母−セントはすべて重量による。
これによシこの発明の範囲を限定するものではない。特
にことわらない限シ・母−セントはすべて重量による。
すべての実験は、汚染に関するＮＩＨ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）
のがイドラインに従って行われた。
のがイドラインに従って行われた。
（例）
例において使用したすでに寄託機関に寄託されているす
べての菌株は、Ｕ、Ｓｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（ＮＲＲＬ）ｏｆ Ｐｅｏｒｌａ、ＩＬ６１６
０４又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃ目ｏｎ（ＡＴＣＣ）ｏｆ Ｒｏｃｋｖｌ
ｌ ｌｅ 、 ＭＤ２０８５２のいずれかに寄託され
ている。ＡＴＣＣに寄託された各菌株は、この特許出願
の出願人であるシータス社とＡＴＣＣとの契約に従って
例に示した個々のＡＴＣＣ名称を有する。
べての菌株は、Ｕ、Ｓｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ（ＮＲＲＬ）ｏｆ Ｐｅｏｒｌａ、ＩＬ６１６
０４又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃ目ｏｎ（ＡＴＣＣ）ｏｆ Ｒｏｃｋｖｌ
ｌ ｌｅ 、 ＭＤ２０８５２のいずれかに寄託され
ている。ＡＴＣＣに寄託された各菌株は、この特許出願
の出願人であるシータス社とＡＴＣＣとの契約に従って
例に示した個々のＡＴＣＣ名称を有する。
ＡＴＣＣとの契約により、これらの菌株子孫の永久的な
入手可能性が、寄託又は公表を記載しそして特定してい
る米国特許が与えられた時又は国米特許出願又は外国特
許出願いずれかが公衆に対して公開された時のいずれか
早い時の後、公衆に対して与えられ、そしてこれらの菌
株の子孫の入手可能性が、３５ Ｖ、Ｓ、Ｃ，１２２及
びこれに基く局長規則（８８６００６３８に特に関連す
ル３７０ＦＲ１，１４を含む）に従って米国特許商標局
長にょシ指定された者に与えられる。この特許出願の出
願人は、寄託中のこれらの菌株が、適切な条件下で培養
されながら死滅し、失われ又は破損した場合、その菌株
をそれと同一の生存菌株と迅速に取り換えることを認め
た。例に記載されておりそして特許寄託でないＮＲＲＡ
寄託株はこの出願の出願より前から公衆が自由に入手で
きる状態にあった。特にことわらない限り、例における
すべての部及びパーセントは重量により、そしてすべて
の温度は℃で示す。
入手可能性が、寄託又は公表を記載しそして特定してい
る米国特許が与えられた時又は国米特許出願又は外国特
許出願いずれかが公衆に対して公開された時のいずれか
早い時の後、公衆に対して与えられ、そしてこれらの菌
株の子孫の入手可能性が、３５ Ｖ、Ｓ、Ｃ，１２２及
びこれに基く局長規則（８８６００６３８に特に関連す
ル３７０ＦＲ１，１４を含む）に従って米国特許商標局
長にょシ指定された者に与えられる。この特許出願の出
願人は、寄託中のこれらの菌株が、適切な条件下で培養
されながら死滅し、失われ又は破損した場合、その菌株
をそれと同一の生存菌株と迅速に取り換えることを認め
た。例に記載されておりそして特許寄託でないＮＲＲＡ
寄託株はこの出願の出願より前から公衆が自由に入手で
きる状態にあった。特にことわらない限り、例における
すべての部及びパーセントは重量により、そしてすべて
の温度は℃で示す。
以下ふ２白
例１ グルコアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の決
定 んアワモリの細胞を、主炭素源としての澱粉又はキシロ
ースに実験的に増殖せしめた。この尤アワモリはＮＲＲ
Ｌから寄託７ａ３１１２として入手し、そしてｆｎ近Ｎ
ＲＲＬ寄託１ｆ６ ］ ５２７１として再度寄託した。
定 んアワモリの細胞を、主炭素源としての澱粉又はキシロ
ースに実験的に増殖せしめた。この尤アワモリはＮＲＲ
Ｌから寄託７ａ３１１２として入手し、そしてｆｎ近Ｎ
ＲＲＬ寄託１ｆ６ ］ ５２７１として再度寄託した。
菌の細胞の増殖は、水中胞子懸濁液から開始した。菌細
胞は、５ｗ／ｖ係の澱粉又はキシロースのいずれかを含
有する標準増殖培地（酸ｍエキストラクト１ ｗ／ｖ
％ 、硫酸アンモニウム０．０１Ｍ。
胞は、５ｗ／ｖ係の澱粉又はキシロースのいずれかを含
有する標準増殖培地（酸ｍエキストラクト１ ｗ／ｖ
％ 、硫酸アンモニウム０．０１Ｍ。
０．０２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７，０）中で、３
０℃にて２〜５日間攪拌培養することにより増殖せしめ
た。前記のごとく、澱粉に増殖した細胞は、乾燥細胞重
量当りの？１ｉ１１足し得る酵素活性を基礎にして、キ
シロースに増殖したにｆｌｌ胞に比べて約２００倍量の
グルコアミラーゼを生産した。
０℃にて２〜５日間攪拌培養することにより増殖せしめ
た。前記のごとく、澱粉に増殖した細胞は、乾燥細胞重
量当りの？１ｉ１１足し得る酵素活性を基礎にして、キ
シロースに増殖したにｆｌｌ胞に比べて約２００倍量の
グルコアミラーゼを生産した。
文献２に記載されているのと実質上同じグアニジウムチ
オシアナート／Ｃｓ Ｃｌ法により、菌培養物から全細
胞ＲＮＡを分離した。簡単に記載すれば、菌糸をチーズ
布中でしばって乾燥し、液体窒素中で凍結し、そして液
体窒素中でモーター及び乳棒で粉砕した。この細胞粉末
を、１０ｍＭアデノシン：ＶＯＳＯ４錯体を含有するグ
アニジウムチオシアナート溶液中でホモジナイズした。
オシアナート／Ｃｓ Ｃｌ法により、菌培養物から全細
胞ＲＮＡを分離した。簡単に記載すれば、菌糸をチーズ
布中でしばって乾燥し、液体窒素中で凍結し、そして液
体窒素中でモーター及び乳棒で粉砕した。この細胞粉末
を、１０ｍＭアデノシン：ＶＯＳＯ４錯体を含有するグ
アニジウムチオシアナート溶液中でホモジナイズした。
遠心分離により細胞断片をベレットにした後、ホモジネ
ートにＣｓＣ１を加え、そしてＲＮＡを高速遠心分離に
よるＣｓＣ１のノ千ッドによってペレットにした。
ートにＣｓＣ１を加え、そしてＲＮＡを高速遠心分離に
よるＣｓＣ１のノ千ッドによってペレットにした。
ポリＡを含有するＲＮＡ （ポリＡ−ＲＮＡ）を、オリ
コーｄＴセルロースを２回通すことによって全ＲＮＡか
ら分離し、そしてこのボＩＪ Ａ−ＲＮＡを、標準的方
法によシアガロースダル電気泳動することによりサイズ
分画した。
コーｄＴセルロースを２回通すことによって全ＲＮＡか
ら分離し、そしてこのボＩＪ Ａ−ＲＮＡを、標準的方
法によシアガロースダル電気泳動することによりサイズ
分画した。
誘導されたポＩＪ Ａ−ＲＮＡを、文献３に記載されて
いるのと実質上同じ方法によりアガロースダルから抽出
した。簡単に記載すれば、ゲルを溶融しそして次に凍結
することによりＲＮＡを溶液中に放出した。固イヒした
アガロースを遠心分離により除去した。こうして抽出さ
れたポリＡ−ＲＮＡをフェノールで抽出し、そしてエタ
ノールで沈澱せしめた。
いるのと実質上同じ方法によりアガロースダルから抽出
した。簡単に記載すれば、ゲルを溶融しそして次に凍結
することによりＲＮＡを溶液中に放出した。固イヒした
アガロースを遠心分離により除去した。こうして抽出さ
れたポリＡ−ＲＮＡをフェノールで抽出し、そしてエタ
ノールで沈澱せしめた。
無細胞蛋白質合成系における、誘導されたポリＡ −Ｒ
ＮＡの翻訳生成物を試験するために、Ａ、アワモリグル
コアミラーゼに対する抗体を調製した。Ａ、アワ志ヲか
らのグルコアミラーゼ−■及び■を、グルコアミラーゼ
誘導条件下で増殖したＡ、アワモリの培養物のｐ液から
得た。ジエチルアミノエチルセルロースカラムを用いる
イオン交換クロマトグラフィーによりｐ液を分画した。
ＮＡの翻訳生成物を試験するために、Ａ、アワモリグル
コアミラーゼに対する抗体を調製した。Ａ、アワ志ヲか
らのグルコアミラーゼ−■及び■を、グルコアミラーゼ
誘導条件下で増殖したＡ、アワモリの培養物のｐ液から
得た。ジエチルアミノエチルセルロースカラムを用いる
イオン交換クロマトグラフィーによりｐ液を分画した。
ｐＨ８，０〜３．０のＰＨグラジェントによる溶出によ
ってグルコアミラーゼ活性を示す２つの蛋白質ピークを
得た。低い−において溶出した酵素ピークは大形のグル
コアミラーゼ−■を含有し、他方のピークはグルコアミ
ラーゼ−■を含有していた。ｒルミ気泳動により、グル
コアミラーゼ−■は純粋であるがグルコアミラーゼ−１
は純粋でないことが示された。グルコアミラーゼ−１は
、架橋デキストランであるセフアルクリル（Ｓｅｐｈａ
ｒｃｒｙｌ ） Ｓ −２００カラムを用いる分子篩ク
ロマトゲラフィーによりさらに精製した。２つのピーク
が観察され、その内の一方がグルコアミラーゼ−■を含
有し、純粋であることが示された。いずれの形の酵素に
ついても、非−洗剤条件下でのポリアクリルアミドグル
電気泳動、及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドダル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により酵素純度
を確認した。
ってグルコアミラーゼ活性を示す２つの蛋白質ピークを
得た。低い−において溶出した酵素ピークは大形のグル
コアミラーゼ−■を含有し、他方のピークはグルコアミ
ラーゼ−■を含有していた。ｒルミ気泳動により、グル
コアミラーゼ−■は純粋であるがグルコアミラーゼ−１
は純粋でないことが示された。グルコアミラーゼ−１は
、架橋デキストランであるセフアルクリル（Ｓｅｐｈａ
ｒｃｒｙｌ ） Ｓ −２００カラムを用いる分子篩ク
ロマトゲラフィーによりさらに精製した。２つのピーク
が観察され、その内の一方がグルコアミラーゼ−■を含
有し、純粋であることが示された。いずれの形の酵素に
ついても、非−洗剤条件下でのポリアクリルアミドグル
電気泳動、及びドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドダル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により酵素純度
を確認した。
２つの形の精製されたグルコアミラーゼを用いて家兎に
抗グルコアミラーゼ抗体を生成せしめた。
抗グルコアミラーゼ抗体を生成せしめた。
生成した２種の免疫グロブリンＧ （ＩｇＧ ）抗体区
分のそれぞれが両方の形のグルコアミラーゼ活性を中和
することができた。さらに、２種の抗体分画と２つの形
の酵素とのオークテルロニー（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ
）分析により、各抗体が両方の形の酵素と免疫反応す
ることが示された。
分のそれぞれが両方の形のグルコアミラーゼ活性を中和
することができた。さらに、２種の抗体分画と２つの形
の酵素とのオークテルロニー（０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ
）分析により、各抗体が両方の形の酵素と免疫反応す
ることが示された。
誘導されたＡ、アワモリ及び誘導されていないＡ。
アワモリからのポリＡ−ＲＮＡを使用して、ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社、ピストン、マサツーセ
ッツから［レティクロサイトリゼート／メチオニンＬ−
［： ｓ］−）ランスレージョンシステム」トシて販売
されている家兎網状赤血球キット中で、放射性メチオニ
ン−ラベルポリペプチドの合成を指令した。文献４及び
５は典型的な網状赤血球リゼート系を記載している。所
定の反応時間の後、すゼートのアリコートを取り出し、
そして抗グルコアミラーゼ抗体又は正常家兎免疫グロブ
リンＧとの反応の前又は後において、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した。免疫反応性生成物は、実質上文献６に
記載されている方法に従って沈澱せしめた。
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社、ピストン、マサツーセ
ッツから［レティクロサイトリゼート／メチオニンＬ−
［： ｓ］−）ランスレージョンシステム」トシて販売
されている家兎網状赤血球キット中で、放射性メチオニ
ン−ラベルポリペプチドの合成を指令した。文献４及び
５は典型的な網状赤血球リゼート系を記載している。所
定の反応時間の後、すゼートのアリコートを取り出し、
そして抗グルコアミラーゼ抗体又は正常家兎免疫グロブ
リンＧとの反応の前又は後において、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した。免疫反応性生成物は、実質上文献６に
記載されている方法に従って沈澱せしめた。
澱粉に増殖せしめキシロースに増殖せしめなかったＡ、
アワモリの培養物におけるグルコアミラーゼ蛋白質の分
子的基礎を決定するため、グルコアミラーゼｍＲＮＡレ
ベルを試験した。全細胞ｍＲＮＡを分離し、そしてこれ
を用いて家兎網状赤血球リゼート系でのＡ、アワモリの
蛋白質合成を指令した。
アワモリの培養物におけるグルコアミラーゼ蛋白質の分
子的基礎を決定するため、グルコアミラーゼｍＲＮＡレ
ベルを試験した。全細胞ｍＲＮＡを分離し、そしてこれ
を用いて家兎網状赤血球リゼート系でのＡ、アワモリの
蛋白質合成を指令した。
翻訳生成物を、家兎抗グルコアミラーゼ抗体（レーン１
１キシロース増殖細胞；レーン３．澱粉増殖細胞）又は
正常家兎抗体（レーン２．キシロース増殖細胞；レーン
４．澱粉増殖細胞）を用いて免疫性＃ （ｉｍｍｕｎｏ
ｐｒｅｃｌｐｌｔａｔｅ ）せしめた。結果を第１図に
示す。この結果は、澱粉増殖細胞から得られたＲＮＡ中
に翻訳され得るｍＲＮＡが存在することを示している。
１キシロース増殖細胞；レーン３．澱粉増殖細胞）又は
正常家兎抗体（レーン２．キシロース増殖細胞；レーン
４．澱粉増殖細胞）を用いて免疫性＃ （ｉｍｍｕｎｏ
ｐｒｅｃｌｐｌｔａｔｅ ）せしめた。結果を第１図に
示す。この結果は、澱粉増殖細胞から得られたＲＮＡ中
に翻訳され得るｍＲＮＡが存在することを示している。
これに対して、キシロース増殖細胞中にはグルコアミラ
ーゼｍＲＮＡは検出されなかった。この結果は、これら
の細胞の培養土清液中に観察されるグルコアミラーゼ蛋
白質に２００倍の差があることと一致する。すなわち、
澱粉に増殖した培養物中のグルコアミラーゼ蛋白質の蓄
積は翻訳され得るグルコアミダーゼｍＲＮＡの対応する
増加に基づくことが明らかである。
ーゼｍＲＮＡは検出されなかった。この結果は、これら
の細胞の培養土清液中に観察されるグルコアミラーゼ蛋
白質に２００倍の差があることと一致する。すなわち、
澱粉に増殖した培養物中のグルコアミラーゼ蛋白質の蓄
積は翻訳され得るグルコアミダーゼｍＲＮＡの対応する
増加に基づくことが明らかである。
第２Ａ及び２Ｂ図にグルコアミラーゼｍＲＮＡを同定す
るゲル電気泳動・ぐターンを示す。第２Ａ図において、
澱粉含有培地（レーン１）又はキシロース含有培地（レ
ーン２）で増殖した細胞からのポリＡ含有ｍＲＮＡをＭ
ｅＨｇＯＨ−アガロ−スケ“ル市気泳動により分析した
。ヒト及び旦已恩のりボゾールＲＮＡを分子量マーカー
として使用した。Δ、１ワモリリ？シームＲＮＡを２８
Ｓ′′及び” ］ ８ Ｓ ”として示す。主要な「誘
導されたＪ ｍＲＮＡ （矢印）をグルから分離し、そ
して試験管内翻訳に全指令するのに使用した。第２Ｂ図
において、外来生ｍＲＮＡを含まない（レーン１）又は
分離された主要な「誘導されたＪ ｍＲＮＡ （レーン
２）を含む反応の全翻訳生成物を示す。レーン２におけ
る蛋白質生成物の、家兎抗グルコアミラーゼ抗体を使用
したイムノプレシピテーションをレーン３に示す。
るゲル電気泳動・ぐターンを示す。第２Ａ図において、
澱粉含有培地（レーン１）又はキシロース含有培地（レ
ーン２）で増殖した細胞からのポリＡ含有ｍＲＮＡをＭ
ｅＨｇＯＨ−アガロ−スケ“ル市気泳動により分析した
。ヒト及び旦已恩のりボゾールＲＮＡを分子量マーカー
として使用した。Δ、１ワモリリ？シームＲＮＡを２８
Ｓ′′及び” ］ ８ Ｓ ”として示す。主要な「誘
導されたＪ ｍＲＮＡ （矢印）をグルから分離し、そ
して試験管内翻訳に全指令するのに使用した。第２Ｂ図
において、外来生ｍＲＮＡを含まない（レーン１）又は
分離された主要な「誘導されたＪ ｍＲＮＡ （レーン
２）を含む反応の全翻訳生成物を示す。レーン２におけ
る蛋白質生成物の、家兎抗グルコアミラーゼ抗体を使用
したイムノプレシピテーションをレーン３に示す。
澱粉に増殖した細胞からのｍＲＮＡのＭｅＨｇＯＨ−ア
ガロースゲル電気泳動により約２．２ｋｂの主要なｍＲ
ＮＡ （矢印で示す）が示され、これはキシロースに増
殖した細胞からのｍＲＮＡには存在しない（第２Ａ図）
。この優勢な「誘導されたＪ ｍＲＮＡが高度に発現さ
れる「誘導された」グルコアミラーゼのｍ ＲＮＡを示
しているようである。この「誘導されたＪ ｍＲＮＡを
同定するために、約２．２ｋｂのｍＲＮＡバンドをゲル
から溶出し、そして家兎網状赤血球リゼート系において
翻訳した。蛋白質生成物と家兎抗グルコアミラーゼ抗体
とのイムノプレシピテーションにより、約２．２ｋｂの
「誘導された」ｍＲＮＡバンド中にグルコアミラーゼを
コードするｍＲＮＡが存在することが示された。
ガロースゲル電気泳動により約２．２ｋｂの主要なｍＲ
ＮＡ （矢印で示す）が示され、これはキシロースに増
殖した細胞からのｍＲＮＡには存在しない（第２Ａ図）
。この優勢な「誘導されたＪ ｍＲＮＡが高度に発現さ
れる「誘導された」グルコアミラーゼのｍ ＲＮＡを示
しているようである。この「誘導されたＪ ｍＲＮＡを
同定するために、約２．２ｋｂのｍＲＮＡバンドをゲル
から溶出し、そして家兎網状赤血球リゼート系において
翻訳した。蛋白質生成物と家兎抗グルコアミラーゼ抗体
とのイムノプレシピテーションにより、約２．２ｋｂの
「誘導された」ｍＲＮＡバンド中にグルコアミラーゼを
コードするｍＲＮＡが存在することが示された。
この発明の１つの観点に従って、選択された菌類の種に
由来する分離されたｍＲＮＡを用いて、このｍＲＮＡの
杭転写によりグルコアミラーゼｃＤＮＡを調製した。実
験においては、Ａ、アワモリ由来の誘導された７Ｊ？
ＩＪ Ａ−ＲＮＡを１０ ｍＭ ＭｅＨｇＯＨにより再
処理することによりこのＲＮＡを変性し、そして次にプ
ライマーとしてのオリゴｄＴ及びＲＮＡアーセ阻害剤と
しての２ｍＭアデノシン：ｖＯ８０４ヲ含有する反応系
に導入した。この一般的な技法の検討については文献７
を参照のこと。ｃＤＮＡ合成の後１．３ｅ ＋） Ａ−
ＲＮＡ″ｆ、ＮａＯＨ処理により破壊した。合成された
ｃ ＤＮＡをゲル電気泳動によってサイズ分画すること
により、全長ｃ ＤＮＡを不光全に形成された断片から
分離した。ｃ ＤＮＡ分画の典型的なゲル電気泳動ノ＋
ターンは約２．２ｋｂのサイズ領域に単一の検出し得る
バンドを示した。
由来する分離されたｍＲＮＡを用いて、このｍＲＮＡの
杭転写によりグルコアミラーゼｃＤＮＡを調製した。実
験においては、Ａ、アワモリ由来の誘導された７Ｊ？
ＩＪ Ａ−ＲＮＡを１０ ｍＭ ＭｅＨｇＯＨにより再
処理することによりこのＲＮＡを変性し、そして次にプ
ライマーとしてのオリゴｄＴ及びＲＮＡアーセ阻害剤と
しての２ｍＭアデノシン：ｖＯ８０４ヲ含有する反応系
に導入した。この一般的な技法の検討については文献７
を参照のこと。ｃＤＮＡ合成の後１．３ｅ ＋） Ａ−
ＲＮＡ″ｆ、ＮａＯＨ処理により破壊した。合成された
ｃ ＤＮＡをゲル電気泳動によってサイズ分画すること
により、全長ｃ ＤＮＡを不光全に形成された断片から
分離した。ｃ ＤＮＡ分画の典型的なゲル電気泳動ノ＋
ターンは約２．２ｋｂのサイズ領域に単一の検出し得る
バンドを示した。
誘導されたｍＲＮＡ及びこれに基いて調製したｃＤＮＡ
を放射性ラベルすることによ、す、相同のグルコアミラ
ーゼ遺伝子の全部又は一部を含有するケ゛ツム性ＤＮＡ
断片を同定するためのゾローブを得た。ｃ ＤＮＡは、
放射性ラベルしたヌクレオチドの存在下でその合成を行
うことにより容易にラベルすることができる。
を放射性ラベルすることによ、す、相同のグルコアミラ
ーゼ遺伝子の全部又は一部を含有するケ゛ツム性ＤＮＡ
断片を同定するためのゾローブを得た。ｃ ＤＮＡは、
放射性ラベルしたヌクレオチドの存在下でその合成を行
うことにより容易にラベルすることができる。
ｍＲＮＡを放射性ラベルするために使用される基本釣な
方法は文献８に記載されている。−例として、Ａ、アワ
モリ由来の誘導されたポリＡ −ＲＮＡを水酸化す）
ＩＪウムを用いて部分分解し、５’−０１（基を含有す
る断片を形成した。次にこれらの断片をポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて放射性燐酸（３２ｐ）−ＡＴＰによ
り燐酸化した。この Ｐ−ラベルＲＮＡ断片は分離され
たＲＮＡの全長にわたり、そしてグルコアミラーゼ遺伝
子の末端部を含有するケ９ツムＴ）ＮＡ断片用のプロー
ブとして有利に使用される。
方法は文献８に記載されている。−例として、Ａ、アワ
モリ由来の誘導されたポリＡ −ＲＮＡを水酸化す）
ＩＪウムを用いて部分分解し、５’−０１（基を含有す
る断片を形成した。次にこれらの断片をポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いて放射性燐酸（３２ｐ）−ＡＴＰによ
り燐酸化した。この Ｐ−ラベルＲＮＡ断片は分離され
たＲＮＡの全長にわたり、そしてグルコアミラーゼ遺伝
子の末端部を含有するケ９ツムＴ）ＮＡ断片用のプロー
ブとして有利に使用される。
Ａ、アワモリから分離した全ケ゛ツム性ＤＮＡを多数の
制限エンドヌクレアーゼの各々により完全消化した。断
片をケ°ル電気泳動によりサイズ分画し、そして前記の
ＲＮＡプローブ又はｃＤＮＡプローブの１つを用いて、
サザンプロット法によりバイブリド形成した（文献９）
。この方法の詳細は文献５．３８７頁に一般的に記載さ
れている。簡単に記載すれは、標準食塩クエン酸塩（０
，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸三ナト
リウム）の５倍濃度を用いて４２℃にて２４４時間前パ
イプリド成段階を行う。次に標準食塩クエン酸塩の２倍
濃度を用いて４２℃にて２４時間バイブリド形成段階を
行なう。
制限エンドヌクレアーゼの各々により完全消化した。断
片をケ°ル電気泳動によりサイズ分画し、そして前記の
ＲＮＡプローブ又はｃＤＮＡプローブの１つを用いて、
サザンプロット法によりバイブリド形成した（文献９）
。この方法の詳細は文献５．３８７頁に一般的に記載さ
れている。簡単に記載すれは、標準食塩クエン酸塩（０
，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸三ナト
リウム）の５倍濃度を用いて４２℃にて２４４時間前パ
イプリド成段階を行う。次に標準食塩クエン酸塩の２倍
濃度を用いて４２℃にて２４時間バイブリド形成段階を
行なう。
たアワモリゲノム性ＤＮＡを用いる実験において、使用
した幾つかのエンドヌクレアーゼ（Ｈｌｎ ｄ ■、Ｘ
ｈ。
した幾つかのエンドヌクレアーゼ（Ｈｌｎ ｄ ■、Ｘ
ｈ。
１、 Ｂｃｌ ｌ、及びＰｖｕ ｌを含む）が、前記の
Ａ、アワモリのラベルされたＲＮＡプローブ又はｃＤＮ
Ａプローブとバイブリド形成する唯一の断片を生成した
。単一遺伝子断片の移つかはＲＮＡ転写体と同じサイズ
範囲にあり、Ａ、アワモリがグルコアミラーゼポリペプ
チドをコードする遺伝子を１個だけ含有していることが
強く示唆された。ＥｃｏＲＩば、ラベルｃＤＮＡとバイ
ブリド形成する３、４ｋｂ断片を生成せしめた。
Ａ、アワモリのラベルされたＲＮＡプローブ又はｃＤＮ
Ａプローブとバイブリド形成する唯一の断片を生成した
。単一遺伝子断片の移つかはＲＮＡ転写体と同じサイズ
範囲にあり、Ａ、アワモリがグルコアミラーゼポリペプ
チドをコードする遺伝子を１個だけ含有していることが
強く示唆された。ＥｃｏＲＩば、ラベルｃＤＮＡとバイ
ブリド形成する３、４ｋｂ断片を生成せしめた。
Ｅｃｏ ＲＩを用いる消化により生成したＡ、アワモリ
のｒツム性ＤＮＡ断片を常法に従ってλシャロン（Ｃｈ
ａｒｏｎ ） ４ Ａファージベクターに連結した。
のｒツム性ＤＮＡ断片を常法に従ってλシャロン（Ｃｈ
ａｒｏｎ ） ４ Ａファージベクターに連結した。
Ｅｃｏ ＲＩ断片のライブラリーを、Ａ、アワモリグル
コアミラーゼｃＤＮＡとバイブリド形成する組換体につ
いてスクリーニングした。バイブリド形成するプラーク
を精製した。すべてが、グルコアミラーゼｃＤＮＡプロ
ーブとバイブリド形成する共通の３．４ ｋｂ Ｅｃｏ
Ｒｒ断片を含有していた。次に、この３．４ｋｂ孜Ｒ
７断片をｐＡ、ＣＹＣＩ ８４プラスミド（ＡＴＣＣ寄
託＆３７，０３３ ）のＥｃｏ Ｒ■部位にサブクロー
ニングし、組換プラスミドを構成した。これをこの明細
書においてｐＧＡＲ１と称する。
コアミラーゼｃＤＮＡとバイブリド形成する組換体につ
いてスクリーニングした。バイブリド形成するプラーク
を精製した。すべてが、グルコアミラーゼｃＤＮＡプロ
ーブとバイブリド形成する共通の３．４ ｋｂ Ｅｃｏ
Ｒｒ断片を含有していた。次に、この３．４ｋｂ孜Ｒ
７断片をｐＡ、ＣＹＣＩ ８４プラスミド（ＡＴＣＣ寄
託＆３７，０３３ ）のＥｃｏ Ｒ■部位にサブクロー
ニングし、組換プラスミドを構成した。これをこの明細
書においてｐＧＡＲ１と称する。
ｐＧＡＲ１で形質転換した４ジＩ）Ｋ１２ＭＭ２９４株
は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、 １２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、 ＭＤ ２０８５
２ ｒ米国。
は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、 １２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、 ＭＤ ２０８５
２ ｒ米国。
に１９８３年１２月２日に寄託され、そしてＡＴＣＣＡ
３９，５２７が与えられたｏ ＥｃｏＲＩ 、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ及びＢａｌ ｌのライブラリーから、グルコア
ミラーゼ遺伝子を含む約２０ ｋｂのＡ、アワモリ由来
ムＤＮＡを分離した。この２０ ｋｂ領領域混成制限地
図を第３図に示す。この図においてＥｃｏ Ｒｌ断片挿
入部が拡大されている。指示された制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位の位置を、エンドヌクレアーゼの選択さ
れた絹合わせによりプラスミドを消化し、そして得られ
た断片を公゛知の方法に従ってサイズ分画することによ
り決定した。完全構造遺伝子がシャロン４Ａライブラリ
ーから分離された３、４ｋｂＥｃｏ Ｒ■断片中に含ま
れる。５個のぬりつぶした長方形がグルコアミラーゼ遺
伝子の蛋白質コード領域を示す。ｍＲＮＡの転写の方向
１ｄ５’から３′の線で示されている。
３９，５２７が与えられたｏ ＥｃｏＲＩ 、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ及びＢａｌ ｌのライブラリーから、グルコア
ミラーゼ遺伝子を含む約２０ ｋｂのＡ、アワモリ由来
ムＤＮＡを分離した。この２０ ｋｂ領領域混成制限地
図を第３図に示す。この図においてＥｃｏ Ｒｌ断片挿
入部が拡大されている。指示された制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位の位置を、エンドヌクレアーゼの選択さ
れた絹合わせによりプラスミドを消化し、そして得られ
た断片を公゛知の方法に従ってサイズ分画することによ
り決定した。完全構造遺伝子がシャロン４Ａライブラリ
ーから分離された３、４ｋｂＥｃｏ Ｒ■断片中に含ま
れる。５個のぬりつぶした長方形がグルコアミラーゼ遺
伝子の蛋白質コード領域を示す。ｍＲＮＡの転写の方向
１ｄ５’から３′の線で示されている。
プラスミドｐＧＡＲ１がグルコアミラーゼ遺伝子配列を
含有することが、Ａ、アワモリグルコアミラーゼｍＲＮ
Ａ配列とバイブリド形成し、そしてこれを選択する可能
性により確認された。ｐＧＡＲ１をニトロセルロース上
に固定化し、そして全Δ、７２モリｍＲＮＡとバイブリ
ド形成せしめた。選択されたｍＲＮＡを試験管内で翻訳
し、そしてその生成物を家兎抗グルコアミラーゼ抗体と
のイムノプレシビテーションにより同定した。第４図に
示す結果により、グルコアミラーゼをコードするものと
してのｐＧＡＲ１、そして約２．２ｋｂの「誘導された
」ｍＲＮＡの同定が確認された。第４図には、全Ａ、ア
’７％ユｍＲＮＡ （レーン１）及びｐＧＡＲＩ ＤＮ
Ａとのバイブリド形成により分離されたｒｒ＋ＲＮＡ
（レーン２）を試験管内翻訳した場合の蛋白質生成物が
示されている。レーン２の蛋白質生成物を家兎抗グルコ
アミラーゼ抗体、又は正常な家兎抗体を用いてイミノプ
レシピテーションした結果をレーン３及びレーン４に示
す。
含有することが、Ａ、アワモリグルコアミラーゼｍＲＮ
Ａ配列とバイブリド形成し、そしてこれを選択する可能
性により確認された。ｐＧＡＲ１をニトロセルロース上
に固定化し、そして全Δ、７２モリｍＲＮＡとバイブリ
ド形成せしめた。選択されたｍＲＮＡを試験管内で翻訳
し、そしてその生成物を家兎抗グルコアミラーゼ抗体と
のイムノプレシビテーションにより同定した。第４図に
示す結果により、グルコアミラーゼをコードするものと
してのｐＧＡＲ１、そして約２．２ｋｂの「誘導された
」ｍＲＮＡの同定が確認された。第４図には、全Ａ、ア
’７％ユｍＲＮＡ （レーン１）及びｐＧＡＲＩ ＤＮ
Ａとのバイブリド形成により分離されたｒｒ＋ＲＮＡ
（レーン２）を試験管内翻訳した場合の蛋白質生成物が
示されている。レーン２の蛋白質生成物を家兎抗グルコ
アミラーゼ抗体、又は正常な家兎抗体を用いてイミノプ
レシピテーションした結果をレーン３及びレーン４に示
す。
Ａ、アワモリグルコアミラーゼ遺伝子を含有するサブク
ローンｐＧＡＲ１を種々の制限酵素により実質上完全に
消化した。これらの配列はＥｅｏ ＲＴ断片（すなわち
第６図中の断片）に含まれる。断片のいくつかをＭＩ３
ベクターＭ １３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９にサブクロー
ニングした。これらのバクテリオ７フージベクターはＢ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、 Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ ６００９ 、 Ｇａ１ｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｙ＋ＭＤ２０８７７から入手することがで
きる０第６図はｒツム性グルコアミラーゼ遺伝子を含有
するＥｃ。
ローンｐＧＡＲ１を種々の制限酵素により実質上完全に
消化した。これらの配列はＥｅｏ ＲＴ断片（すなわち
第６図中の断片）に含まれる。断片のいくつかをＭＩ３
ベクターＭ １３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９にサブクロー
ニングした。これらのバクテリオ７フージベクターはＢ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、 Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ ６００９ 、 Ｇａ１ｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｙ＋ＭＤ２０８７７から入手することがで
きる０第６図はｒツム性グルコアミラーゼ遺伝子を含有
するＥｃ。
ＲＩ断片の制限地図を示す。ここで、配列中のぬりつぶ
した箱はエクソンすなわちグルコアミラーゼ遺伝子のコ
ード領域を示し、矢印はｍＲＮＡの転写の方向を示す。
した箱はエクソンすなわちグルコアミラーゼ遺伝子のコ
ード領域を示し、矢印はｍＲＮＡの転写の方向を示す。
ベクターＭ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９にサブクローニ
ングしたグルコアミラーゼゲノム領域の断片を、文献１
０及び１１に記載されているジデオキシヌクレオチド鎖
ターミネーション法により配列決定した。配列の部分は
マキサム−シルバード配列決定法（文献１２）により確
認した。３．４ ｋｂ Ｅｃ。
ングしたグルコアミラーゼゲノム領域の断片を、文献１
０及び１１に記載されているジデオキシヌクレオチド鎖
ターミネーション法により配列決定した。配列の部分は
マキサム−シルバード配列決定法（文献１２）により確
認した。３．４ ｋｂ Ｅｃ。
Ｒ１断片の全配列を第１表に示す。
Ｖ、下４７日
（５３：
５６Ｓ
し民、Ｅ Ｅ５ ｆｌ、２菖ミ闘は趨ｎ（５５）
（Ｊａｌ Ｑｌ：ｌ （Ｊｌ−＋ （ｓ６ （ａｌ （
Ｊａｌ Ｑ ロ 〇 −〇 −ｏｃｂ ｏ ΦＱ−１（
−＋ ＱΦ 〇−Ｑ−ｏ−ｅΦ ＜ｈ ○淵 く鴎 ト
ぶａ＜ ＵＯ＜囚 ｏ＜ ｏ＜ ｏ＜ ｕ−ｈｈ ＜←
Φく ←条翳Ｉ３葺占扉ミ葺珪転５革５６ドばじ ■扉ミし司５郭旧鮎１ｔｊ５ Ｗ＋−ｍ転日３５１ｊｊ
（５闘目５院ｉＩ弓ヨ院護闘し院託ｉ鈷じ託３旨ミ眠ロ
３旧關６５Ｈ，Ｅ華： ３： ８： 奪ご ｔ４： ８
： ８ピ に； ８： し二 臼；ｏｑ １−Ｉｃｏ
ｈｃｏ Ｕ＜ Ｅ−１ｉｌｌ ｈｃａ ＣＪ＜ ａ＞
Ｏｃ ｏ＜ ｏ＞葺二院詐翳し託闘番遍１１買買 Ｌ ’？’ｓＣＱ Ｌ Ｌ ５諾葺ｉ日旧葺ａし領占Ｘ
二目庄Ｘμ３ミじ３占冨ミ騎ぶ％５ ！Ｅ Ｍ−ｊ巳占
葺ａ訂じ職ｉま酔慕＜ ”ＡＥ ５ｃ； ’Ａぶ賊ｉ葺
９院目趨ａ興占し翳まシ３５１５１＋ｄ Ｃａｍ Ｅ−
＋Φ ０１１１０ロ ＣＪｈＱロ ○り （！１１１−
＜ａｌ Ｑｌ−（Ｊ ＋Ｉｏ −６−１−〇−←Φ
○ｏ ＜ −Ｅ−４Φ ０淵 ＣＪ −（ＪａｌＣ：）
＜ Ｑ＜ ＜ＨＱ＜ ｏ−←φ Φ００− く← ０く
←〃１占Ｇ顕ぶＵ５ Ｆ慕ミＵ曹占慕ミ葺；１箸と１
院１ミし慕ミ３語社３５１番 闘しｉＰ Ｒ’Ｅ ｊ４ｉ＃ ！−；院ＣＡ５ Ｊ５眠
１５鮎（５４） （ 得られたヌクレオチド配列を、コンピュータにプログラ
ムしたつき合わせ操作により、Ａ、ニが−（文献１ａ及
び１ｂ）、及びＡ、アワモリの公知のアミノ酸配列領域
と比較した。６種類の可能ｆ！ｔ／Ｐ枠のそれぞれがコ
ードするアミノ酸配列についてつき合わせ操作を行った
。つき合わせ操作により、グルコアミラーゼ遺伝子のコ
ード領域とＡ、アワモリに由来するグルコアミラーゼの
知られているアミノ酸配列領域の間にほとんど完全な対
応が得られた。Ａ、ニが−の内部にプチドのアミノ酸配
列の１つ（文献１ａの第７図）が核酸配列（第１表のヌ
クレオチド７５３〜８９５）により隣接してコードされ
ていないことが見出された。５５ヌクレオチドの介在配
列がこの蛋白質コード領域を中断していると予想された
。グルコアミラーゼ中のイントロンは小文字で示しであ
る。グルコアミラーゼ遺伝子のアミノ酸配列を対応する
ヌクレオチドの下に示し、そして右側のヌクレオチド配
列の番号の下にアミノ酸配列の番号が付しである。−２
４〜−１のアミノ酸（すべて大文字で示しである）はブ
レグルコアミラーゼ蛋白質のシグナル配列を示す。
Ｊａｌ Ｑ ロ 〇 −〇 −ｏｃｂ ｏ ΦＱ−１（
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１５鮎（５４） （ 得られたヌクレオチド配列を、コンピュータにプログラ
ムしたつき合わせ操作により、Ａ、ニが−（文献１ａ及
び１ｂ）、及びＡ、アワモリの公知のアミノ酸配列領域
と比較した。６種類の可能ｆ！ｔ／Ｐ枠のそれぞれがコ
ードするアミノ酸配列についてつき合わせ操作を行った
。つき合わせ操作により、グルコアミラーゼ遺伝子のコ
ード領域とＡ、アワモリに由来するグルコアミラーゼの
知られているアミノ酸配列領域の間にほとんど完全な対
応が得られた。Ａ、ニが−の内部にプチドのアミノ酸配
列の１つ（文献１ａの第７図）が核酸配列（第１表のヌ
クレオチド７５３〜８９５）により隣接してコードされ
ていないことが見出された。５５ヌクレオチドの介在配
列がこの蛋白質コード領域を中断していると予想された
。グルコアミラーゼ中のイントロンは小文字で示しであ
る。グルコアミラーゼ遺伝子のアミノ酸配列を対応する
ヌクレオチドの下に示し、そして右側のヌクレオチド配
列の番号の下にアミノ酸配列の番号が付しである。−２
４〜−１のアミノ酸（すべて大文字で示しである）はブ
レグルコアミラーゼ蛋白質のシグナル配列を示す。
この中断配列が介在配列であることを確認するため、及
びグルコアミラーゼ遺伝子中に存在する他の介在配列を
同定するために、グルコアミラーゼｍＲＮＡから誘導さ
れたｃＤＮＡ配列を分子クローニングした。澱粉に増殖
したＡ、アワモリのｍＲＮＡから２重鎖ｃＤＮＡを調製
し、そしてｃＤＮＡライブラリーをｐＢＲ３２２中に調
製した。このプラスミドも前記のとと（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
入手することができる。グルコアミラーゼｃＤＮＡを含
有する１６個のプラスミドをｐＧＡＲ１プローブを用い
て同定した。最大のシラスミドｐ２４Ａ２は約２．２ｋ
ｂのグルコアミラーゼｍＲＮＡの３′末端から誘導され
る１、８ｋｂの配列を含有していた。このプラスミドｐ
２４Ａ２を１９８３年１２月７日にＮａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ。
びグルコアミラーゼ遺伝子中に存在する他の介在配列を
同定するために、グルコアミラーゼｍＲＮＡから誘導さ
れたｃＤＮＡ配列を分子クローニングした。澱粉に増殖
したＡ、アワモリのｍＲＮＡから２重鎖ｃＤＮＡを調製
し、そしてｃＤＮＡライブラリーをｐＢＲ３２２中に調
製した。このプラスミドも前記のとと（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから
入手することができる。グルコアミラーゼｃＤＮＡを含
有する１６個のプラスミドをｐＧＡＲ１プローブを用い
て同定した。最大のシラスミドｐ２４Ａ２は約２．２ｋ
ｂのグルコアミラーゼｍＲＮＡの３′末端から誘導され
る１、８ｋｂの配列を含有していた。このプラスミドｐ
２４Ａ２を１９８３年１２月７日にＮａｔｉｏｎａｌ
Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ。
Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｌｎｏｉｓ、米国、に寄託し、
ＮＲＲＬ Ａ Ｂ−１４２１７と指定された。ｐ２４Ａ
２中のグルコアミラーゼｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列
を決定し、そして第１表に示すヌクレオチド５０１かう
２４８９〜２４９１位のポリアデニル化部位のケ９ツム
配列にわたっていることを見出した。（ヌクレオチド２
４９０〜２４９１に２個のＡ残基が存在するため正確な
ポリアデニル化部位を決定することはできない。）分子
クローニングされたグルコアミラーゼ遺伝子のヌクレオ
チド配列と、分子クローニングされたグルコアミラーゼ
ｃ ＤＮＡから決定されたグルコアミラーゼｍＲＮＡの
それ、及びグルコアミラーゼのアミノ酸配列とを比較す
ることにより４個の介在配列（イントロン）がＡ、アワ
モリグルコアミラーゼ遺伝子中に存在することが明らか
になった。（第１の介在配列の連結部ばんアワモリグル
コアミラーゼ−■の残基４３〜４９における不完全なア
ミノ酸配列データから推定した。）介在配列は短かく（
５５〜７５ ｂｐの範囲）、そしてすべて蛋白質コード
配列中に位置していた。グルコアミラーゼ遺伝子の介在
配列連結部に隣接するこれらの配列を、一般には真核生
物（文献１２）そして特にｓ、−ｈどビシエ（ａ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｌａｅ） （文献１４）の共通スプライス連
結配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｐｌｉａｅ ｊｕｎｃｔ
ｉｏｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）と比較した。グルコアミラ
ーゼ遺伝子中のスプライス連結部は介在配列の５′及び
３′末端における共通配列と密接に一致した。Ｓ、セレ
ビシェ−におけるスプライシングに必要であるとして文
献１５においてＬａｎｇｆｏｒｄ等が仮定した共通配列
ＴＡＣＴＡＡＣＡに関連する配列がすべてのグルコアミ
ラーゼ介在配列の３′末端の近くに見出された。
ＮＲＲＬ Ａ Ｂ−１４２１７と指定された。ｐ２４Ａ
２中のグルコアミラーゼｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列
を決定し、そして第１表に示すヌクレオチド５０１かう
２４８９〜２４９１位のポリアデニル化部位のケ９ツム
配列にわたっていることを見出した。（ヌクレオチド２
４９０〜２４９１に２個のＡ残基が存在するため正確な
ポリアデニル化部位を決定することはできない。）分子
クローニングされたグルコアミラーゼ遺伝子のヌクレオ
チド配列と、分子クローニングされたグルコアミラーゼ
ｃ ＤＮＡから決定されたグルコアミラーゼｍＲＮＡの
それ、及びグルコアミラーゼのアミノ酸配列とを比較す
ることにより４個の介在配列（イントロン）がＡ、アワ
モリグルコアミラーゼ遺伝子中に存在することが明らか
になった。（第１の介在配列の連結部ばんアワモリグル
コアミラーゼ−■の残基４３〜４９における不完全なア
ミノ酸配列データから推定した。）介在配列は短かく（
５５〜７５ ｂｐの範囲）、そしてすべて蛋白質コード
配列中に位置していた。グルコアミラーゼ遺伝子の介在
配列連結部に隣接するこれらの配列を、一般には真核生
物（文献１２）そして特にｓ、−ｈどビシエ（ａ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｌａｅ） （文献１４）の共通スプライス連
結配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｐｌｉａｅ ｊｕｎｃｔ
ｉｏｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）と比較した。グルコアミラ
ーゼ遺伝子中のスプライス連結部は介在配列の５′及び
３′末端における共通配列と密接に一致した。Ｓ、セレ
ビシェ−におけるスプライシングに必要であるとして文
献１５においてＬａｎｇｆｏｒｄ等が仮定した共通配列
ＴＡＣＴＡＡＣＡに関連する配列がすべてのグルコアミ
ラーゼ介在配列の３′末端の近くに見出された。
合成オリゴヌクレオチドを用いてｍＲＮＡテンプレート
から逆転写酵素合成をプライムすることによりグルコア
ミラーゼｍＲＮＡの５′末端を決定した。
から逆転写酵素合成をプライムすることによりグルコア
ミラーゼｍＲＮＡの５′末端を決定した。
第５図に示すごとく、グルコアミラーゼｍＲＮＡの５′
末端近くのシグナルペプチドコード領域内の配列に相補
的である１５連ヌクレオチド ５’ＧＣＧＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＧＧ ３’を用いて４
つの主要なプライマー延長生成物を合成した。対（ｄｏ
ｕｂｌｅｔｓ ）の短い方のバンドは、長いバンドの不
完全に延長された形であると解釈される。このパターン
に対するＲＮＡ二次構造の可能性ある影響を試験するた
め、プライマー延長を４２℃及び５０℃で行った。
末端近くのシグナルペプチドコード領域内の配列に相補
的である１５連ヌクレオチド ５’ＧＣＧＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＧＧ ３’を用いて４
つの主要なプライマー延長生成物を合成した。対（ｄｏ
ｕｂｌｅｔｓ ）の短い方のバンドは、長いバンドの不
完全に延長された形であると解釈される。このパターン
に対するＲＮＡ二次構造の可能性ある影響を試験するた
め、プライマー延長を４２℃及び５０℃で行った。
４２℃（レーンｌ）及び５０℃（レーン２）におけるプ
ライマー延長の生成物を、文献１６に記瞳されている配
列決定ｒル上に、同じ１５連プライマーを用いるこの部
分のｍ１３／ジ−デオキシヌクレオチド配列決定反応と
平行して示す（第５図）。
ライマー延長の生成物を、文献１６に記瞳されている配
列決定ｒル上に、同じ１５連プライマーを用いるこの部
分のｍ１３／ジ−デオキシヌクレオチド配列決定反応と
平行して示す（第５図）。
第５図に示す配列はグルコアミラーゼｍＲＮＡ配列を示
し、示された配列決定反応から読み取られるそれと相補
的である。プライマー延長のパターンは変らず、グルコ
アミラーゼｍＲＮＡの集団中に４種の異なる５′末端が
存在することが支持された。
し、示された配列決定反応から読み取られるそれと相補
的である。プライマー延長のパターンは変らず、グルコ
アミラーゼｍＲＮＡの集団中に４種の異なる５′末端が
存在することが支持された。
ジデオキシヌクレオチドの存在下で行ったプライマ延長
反応により、この領域におけるゲノム性配列とｒｒ＋Ｒ
ＮＡ配列の共直線性（ｃｏｌｌｎｅａｒｌｔｙ ）が確
認さｆｌ、た。プライマー延長生成物中にＴ残基が翻訳
開始部位から−７１、−６６、−５９、及び−５２位に
存在し、そして第１表に示されている。逆転写酵素がｍ
ＲＮＡの最も瑞の末端ヌクレオチドをコピーすることが
できる限り、グルコアミラーゼｍＲＮＡの５′末端はこ
れら４領域に位置する◇転写開始領域の５’ＤＮＡ配列
が、ＲＮＡ ＆ ＩＪメラーゼＨによる転写開始に関与
するものとしてすでに示されている共通配列に相同な配
列を含むことが見出された。
反応により、この領域におけるゲノム性配列とｒｒ＋Ｒ
ＮＡ配列の共直線性（ｃｏｌｌｎｅａｒｌｔｙ ）が確
認さｆｌ、た。プライマー延長生成物中にＴ残基が翻訳
開始部位から−７１、−６６、−５９、及び−５２位に
存在し、そして第１表に示されている。逆転写酵素がｍ
ＲＮＡの最も瑞の末端ヌクレオチドをコピーすることが
できる限り、グルコアミラーゼｍＲＮＡの５′末端はこ
れら４領域に位置する◇転写開始領域の５’ＤＮＡ配列
が、ＲＮＡ ＆ ＩＪメラーゼＨによる転写開始に関与
するものとしてすでに示されている共通配列に相同な配
列を含むことが見出された。
第２Ａ表に成熟グルコアミラーゼぼりペプチドをコード
するヌクレオチド配列を示す。
するヌクレオチド配列を示す。
し、１：余日
第２Ａ表
ＧＣＧＡＣＣＴＴＧωＪτＡπ右η’ＧＡＧＣＡＡＣＧ
晶ＧＱＴ： ＡＣＣＧＴＧ…α江ＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣ
ＣＴＧ ＡＡＴ ＡＡＣＡＴＣαｎＧＣＧＣＡＣＧＧＴ
ＧＣＴπＸ’； ＧＴＧ ＴＱ”；ＯＧＣＧＣＧ Ｇ
ＡＣ’Ｉ”ＣＴ ＧＧＣＡＣＴ ＧＴＣＧＴｒ ＧＣ’
ｒ ＡＧｒ ＣＣＣＫ、ＣＡＣｒ； ＧＡＴ ＡＡＣα
１１； ＧＡＣＴＡＣＴｒＣＴＡＣＡＣＣπＵ ＡＣＴ
ＣＧＣＧＡＣｒ （’ＤＴ ＣＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡ
ＧＡＣＣロ℃σ■Ｘンαａ℃慢℃侃晶Ｔα浜いＴＡＣＣ
Ａ（πσＣσ℃ＴＣＣＡＣＣＡ’ＩＴ ＧＡＧ ＡＡＣ
ＴＡＣＡｆｆＣ’ＩＤ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＡ ＡＴｒ
ＧＴＣＣＡＧ ＧＧＴＡＴＣＡＧＴ ＡＡＣＣＣＣ’
ｌｆｆ１ （ｆｆ ＧＡＴ Ｃ’１ｌｆｆ ’ＩＤＣＡ
ＧＣＧＧＣＧＣｆｆ （’ｒｅ （ｎＴ ＧＡＡαＸ：
ＡＡＧ ’Ｉ７℃九肩■刀℃Ｇ四〇日ＡＣＴ ＧＣＣ
ＴＡＣＡ（丁■Ｔ’ＩＹ牙π刀α込α右α）ＣＣＡＧ鍬
ＧＡＴαπσ℃α℃π■０り石Ａ訂ｑ牙ＡπトＭ℃αに
慢℃ＧＧＧＣＡＡ’１１ｍＣ１℃ＯＴω、Ｃん四αＸ：
： ＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣαＡ／ＱＣＧＡＣＡＴＴ
σ口’ ＴＣＯＣＣＣＣＴＣＧＩＴ ＡＧＧ ＡＡＣＧ
ＡＣＣ１℃ｕ ＴＡＴ ＧＴＧαπＣＡＡ ＴＡＣ’１
ＧＧＡＡＣＣＡＧ 、釦Ａα込ＴＡＴ Ｇ／四ａ℃寵０
υ「０鋳Ａ刀℃ＡＡＴ ＧＧＣＴＣＧ ＴＣＴ ＴｒＣ
ＴＩＴ 、Ｍ）ＣＡＴｒ ＧＣＴ ＧｒＧ ＣＡＡ Ｃ
ｉ℃ｃｃｃ ＧＣＣＣＴＴＧｒＣＧｆｉＡαπＡＧＴ
ＧＣＣＴｒＣ（ＸＩＩＩＩＨＡ（Ｉ； ＧＣＣＧＴＣα
Ｃｕ ＴＣＣ’ＩＴ’、ＣＴＣＣＴＧＧ ＴＧｒＧＡＴ
’ＩｃｒＧＡＧＧＣＡαＸ： ＧＡＡＡＴＴσ［’ｌ
： Ｔｆｆ ＴＡＣｍ ＣＡＧＴＣＣＴｒＣｒｒＧＧＡ
ＣＣＧＧＣＡＧＣＴｒＣＡＴｒ ｍα℃んｋｃ ＴｒＣ
（Ａ１＼ＡＧＣＡＧＣαＪＴＣＣＣＨＬＡＡＧ ＧＡＣ
ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＧ”ＣＣ′ｒＧαａＡＧＣＡＴＣＣ
ＡＣＡＣＣＴＩＴωααＴＧＡＧα℃αＸ ′ｒＧｃＧ
１℃０℃ＴＣＣＡＣＣｆｆ ＣＡＧαＤ Ｔｌ＄ ＴＣ
Ｃα℃σ℃αＤＣｒＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＧＡＧ
ＧＴＴ ＧＴＡＧＡＣＴＣｒ ＴＴＣＣＧＣπ’ＡＡＴ
ＣＴＡＴ ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＡＴＧＸ ＣＴＣＡＧ
ＴＧＡＣＡＧＣＧＩＧＣ１２Ｔ ＧＴｒＧＯ； ＧＴＧ
ＧＧＴ Ｃｒ’、ＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＯＣＴ
ＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣα℃ＴＯＧ′ｖｒ′Ｃｃ
ｘ ＴＧＣＡＣＣｍ ａｃｒ ＧＣＣＧＣＡ ａｍ Ｃ
ＡＧ ｍ ＴＡＣＧＡＴ ｃａｒＣＴＡ ＴＡＣＣＡＧ
ＴＧＧＧＡＣＡＡＧ ＣＡＧσＩ ｎ ＴｒＧ Ｇ＜
ＧＴＣＡＣＡ ＧＡＴ Ｇ’１ＧＴＣＧ ＣＴＹ’；
ＧＡＣ’１７１”ＣＴ’ｆＣＡＡＧ Ｃ，Ｃｆｉ、
ＣＴＧ ’ｌ’Ａｃ ＡＣ，ＣＧＡＴαｒｒＡＣＴα℃
ＡＣＣＴＡＣｒ ＴαドｒＣＣＡＧＴπ）ＣＡはＴＡＴ
Ａ（７ｒ ＡＧＣＡ貫σＡＧＡＴＧＣＣ冊ＡＡＧＡＣ
Ｔ ｆｆαＥＣＧＡＴα℃η℃Ｇ冗π万）■丁ＧπＩＷ
仏Ａ口１０℃Ｃ，ＣＸ２ ＧＣＡ ＡＧＣＡＡＣＧＧＣ
’Ｔｍ ＡＴＧ ＴＣＣＧＡＧ ＣＡＡ ＴＡＣ（’ｉ
℃ＡＡＧＴＣＴＧＡＴ（Ｘ’、ＣＧＡＧ ＣＩ ＣＴｒ
ＴＣＣＧＣＴ ｆｆ’、ＣＧＡＣＣ”Ｉｎ Ａ■筋Ｔ
Ｃ’ｒ ＴＡＴ ＧＣＴαπロ℃ロ’Ｇ ＡＣＣα℃ん
℃んりαπσＪ晶ＣＧτＧｍα万ソｒＣＣαゴ奮直αＸ
Ｉ： ＧＡＧ ＡＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧ’
ＩＧ Ｃ（ＩＥ （ＥＧＣＡＣＣＴＧＴαＤＧＣＣＡＣ
Ａ ＴＣＴ ＧＣＣＡＴＩ’ ＧＧＴ ＡＣＣＴＡＣＡ
ＧＣＡＧＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＴＣＡＣＣＴｍ ＴＧ
ＧαＸ； ＡＧＴ ＡＴＣＧＴＣＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧ
ＣＧＧＣＡ（ＥＣＡＣＴ ＡＣＧ ＡＣＧα：Ｔ ＡＣ
ＣＣＣＣＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣσｆＡＧＣＧπＬＭ℃
πｗ ＡＣＣＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＡＣＣα）ＣＡ（π
αＷ ＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＡＣ”−ＣＡＣＣＡＧＴ
ＫＧ ＴｕＡ ＴＣＡ ＡＧＣＴＣＣπ；Ｔ ＡＣＣＡ
ＣＴα？ＣＡα： Ｃ，ＣＣ（７１’ＧαπωＵＡ（ゴ
！ロ℃ＧＡＴ口Ｉ； ＡＣＡαゴ＼ＡＣＣＡ鄭ＡＣＣＴ
ＡＣＯＧＣＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣ１℃ｃｗ （
ＥＧｐ、 Ｔｍ ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＧ Ｃｍ （ＦＧ
ｒＯ℃Ｔｍ ＧＡＡ ＡＣＣＩＥ’、ｃ ＧＡＣαＸ２
ＡＴＡ ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＣｒ ＧＡＣＡ
ＡＧ ＴＡＣＡＣＴ ＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＱＩ； Ｃ
ＴＣ′ｌ０ＧＴＡＴ ＧＴＣＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ
Ｃ’［’Ｇ αＩＩ； ＧＣＴ（１；Ｔ ＧＡＧπＤ
ＴＩＴ ＧＡＧ ＴＡＣＡＡＧ ＴＴＴ ＡＴＣαＸＩ
： ＡＴｒ ＧＡＧ ＡＧＣＧＡＴ ＧＡＣＴＣＣＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ’ＴＣＫ； ＧＡＧ ＡＧｒ ＧＡＴ Ｃ
ＣＣＡＡＣＣＧＡ ＧＡＡ ＴＡＣＡｃｅ ＧＴｒα丁
ＣＡＧ（ＥＯＩＩ；π℃αａ ＡＯＣｕ ＡＣ：： Ｇ
ＣＧ ＡＣＧ Ｇ’１ｌｆｆ ＡＣＴ ＧＡＣＡＣＣ寵
０１ＥＧヌクレオチド２０６〜２７７ＵＡ、アワモリグ
ルコアミラーゼのためのシグナル配列をコードする。
晶ＧＱＴ： ＡＣＣＧＴＧ…α江ＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣ
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ＡＡＧ ’Ｉ７℃九肩■刀℃Ｇ四〇日ＡＣＴ ＧＣＣ
ＴＡＣＡ（丁■Ｔ’ＩＹ牙π刀α込α右α）ＣＣＡＧ鍬
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慢℃ＧＧＧＣＡＡ’１１ｍＣ１℃ＯＴω、Ｃん四αＸ：
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σ口’ ＴＣＯＣＣＣＣＴＣＧＩＴ ＡＧＧ ＡＡＣＧ
ＡＣＣ１℃ｕ ＴＡＴ ＧＴＧαπＣＡＡ ＴＡＣ’１
ＧＧＡＡＣＣＡＧ 、釦Ａα込ＴＡＴ Ｇ／四ａ℃寵０
υ「０鋳Ａ刀℃ＡＡＴ ＧＧＣＴＣＧ ＴＣＴ ＴｒＣ
ＴＩＴ 、Ｍ）ＣＡＴｒ ＧＣＴ ＧｒＧ ＣＡＡ Ｃ
ｉ℃ｃｃｃ ＧＣＣＣＴＴＧｒＣＧｆｉＡαπＡＧＴ
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Ｃｕ ＴＣＣ’ＩＴ’、ＣＴＣＣＴＧＧ ＴＧｒＧＡＴ
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ＣＣＧＧＣＡＧＣＴｒＣＡＴｒ ｍα℃んｋｃ ＴｒＣ
（Ａ１＼ＡＧＣＡＧＣαＪＴＣＣＣＨＬＡＡＧ ＧＡＣ
ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＧ”ＣＣ′ｒＧαａＡＧＣＡＴＣＣ
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πｗ ＡＣＣＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＡＣＣα）ＣＡ（π
αＷ ＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＡＣ”−ＣＡＣＣＡＧＴ
ＫＧ ＴｕＡ ＴＣＡ ＡＧＣＴＣＣπ；Ｔ ＡＣＣＡ
ＣＴα？ＣＡα： Ｃ，ＣＣ（７１’ＧαπωＵＡ（ゴ
！ロ℃ＧＡＴ口Ｉ； ＡＣＡαゴ＼ＡＣＣＡ鄭ＡＣＣＴ
ＡＣＯＧＣＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣ１℃ｃｗ （
ＥＧｐ、 Ｔｍ ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＧ Ｃｍ （ＦＧ
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ＡＴＡ ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＣｒ ＧＡＣＡ
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Ｃ’［’Ｇ αＩＩ； ＧＣＴ（１；Ｔ ＧＡＧπＤ
ＴＩＴ ＧＡＧ ＴＡＣＡＡＧ ＴＴＴ ＡＴＣαＸＩ
： ＡＴｒ ＧＡＧ ＡＧＣＧＡＴ ＧＡＣＴＣＣＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ’ＴＣＫ； ＧＡＧ ＡＧｒ ＧＡＴ Ｃ
ＣＣＡＡＣＣＧＡ ＧＡＡ ＴＡＣＡｃｅ ＧＴｒα丁
ＣＡＧ（ＥＯＩＩ；π℃αａ ＡＯＣｕ ＡＣ：： Ｇ
ＣＧ ＡＣＧ Ｇ’１ｌｆｆ ＡＣＴ ＧＡＣＡＣＣ寵
０１ＥＧヌクレオチド２０６〜２７７ＵＡ、アワモリグ
ルコアミラーゼのためのシグナル配列をコードする。
この明細書において「シグナル配列」は一般に、蛋白質
鎖の排出（ｅｘｐｏｒｔ ）の開始のために機能するア
ミノ酸配列である。成長しつつある蛋白質の排出が開始
された後、シグナル配列は特定の部位において成熟蛋白
質から切断される。この用語は又１先導配列（１ｅａｄ
ｅｒ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ）又は先導被デチド（１ｅａ
ｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ）を包含する。この発明にお
いて好ましいシグナル配列１ｄＡ、アワモリグルコアミ
ラーゼ遺伝子から推定されるシグナル配列である。これ
を第２Ｂ表に示す。
鎖の排出（ｅｘｐｏｒｔ ）の開始のために機能するア
ミノ酸配列である。成長しつつある蛋白質の排出が開始
された後、シグナル配列は特定の部位において成熟蛋白
質から切断される。この用語は又１先導配列（１ｅａｄ
ｅｒ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ）又は先導被デチド（１ｅａ
ｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ）を包含する。この発明にお
いて好ましいシグナル配列１ｄＡ、アワモリグルコアミ
ラーゼ遺伝子から推定されるシグナル配列である。これ
を第２Ｂ表に示す。
ｒＳＥＲＰＨＥ Ｍ’Ｇ ５ｌｉｄ ＬＥＵ ＬＥＵ
ＡＬＡ Ｉ、ＥＩＪ ＳＦＲＧＬＹ ＬＥＩＪ ＶＡＬ
ＣＹＳπＴｊＧＬＹ ＬＥＵ ＡＬＡ ＡＳＮ ＶＡ
Ｌ ＩＬＥ ＳＦＲＬＹＳ ＡＲＧ以下全白 例２ 酵母におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現 酵母において高レベルで遺伝子を発現する方法は、酵母
エノラーゼ■プロモーター及びターミネータ−領域（文
献６）を含有するベクターの構成に関連する。エノラー
ゼセグメントをあらかじめ操作シ、プロモーターとター
ミネータ−が唯一の用ｎｄ１１部位により分離されるよ
うにした。
ＡＬＡ Ｉ、ＥＩＪ ＳＦＲＧＬＹ ＬＥＩＪ ＶＡＬ
ＣＹＳπＴｊＧＬＹ ＬＥＵ ＡＬＡ ＡＳＮ ＶＡ
Ｌ ＩＬＥ ＳＦＲＬＹＳ ＡＲＧ以下全白 例２ 酵母におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現 酵母において高レベルで遺伝子を発現する方法は、酵母
エノラーゼ■プロモーター及びターミネータ−領域（文
献６）を含有するベクターの構成に関連する。エノラー
ゼセグメントをあらかじめ操作シ、プロモーターとター
ミネータ−が唯一の用ｎｄ１１部位により分離されるよ
うにした。
プラスミドｐＡｃ］ （１（’）、６７ｋｂ ）ば４己
」／酵母シャトルベクターであって、Ｅ、コリ及び酵母
のいずれにおいても自律複製する。このプラスミドｎ、
Ｅ−コリ及び類縁様において、ＴＥＭタイプＩβ−ラク
タマーゼの合成の結果としてβ−ラクタム抗生物質アン
ピシリンに対する耐性を供する。さ−イソプロピルマレ
ートデヒドロゲナーゼ活性の欠損により生ずる増殖のた
めのロイシン要求が消失する。
」／酵母シャトルベクターであって、Ｅ、コリ及び酵母
のいずれにおいても自律複製する。このプラスミドｎ、
Ｅ−コリ及び類縁様において、ＴＥＭタイプＩβ−ラク
タマーゼの合成の結果としてβ−ラクタム抗生物質アン
ピシリンに対する耐性を供する。さ−イソプロピルマレ
ートデヒドロゲナーゼ活性の欠損により生ずる増殖のた
めのロイシン要求が消失する。
プラスミドｐＡＣ１は次のＤＮＡセグメントから構成さ
れる。番号付与はエノラーゼ■プロモーター断片のＥｃ
ｏ Ｒ１部位において始まり、そして時計方向に進行す
る。
れる。番号付与はエノラーゼ■プロモーター断片のＥｃ
ｏ Ｒ１部位において始まり、そして時計方向に進行す
る。
座標Ｏ〜７２５はプラスミドｐｅｎｏ ４６ （文献１
６）中の同様の断片から誘導された７ ２５ ｂｐ Ｅ
ｃｏ Ｒ１−ＨＩＴＩ ｄ ｍ ＤＮＡ断片から成り、
Ｓ、セレビシェ−Ｅｎｏ Ｉ遺伝子の５′非翻訳領域か
らのＤＮＡを含有する。この断片を、エノラーゼ遺伝子
の開始コドン（ＡＴＧ）の直前領域において変形しＨｉ
ｎｄｌ１１部位を形成した。さらに詳しくは、配列を ＣＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＧからＣＡＣＧＧＴＣＧ
ＡＧＣＡＡＧＣ管（Ａ’ｒＧ）に変えた。座標７２６〜
２２８１は、Ｓ、セレビシェ−Ｅｎｏ Ｉ遺伝子の３′
非翻訳領域からの１．５５ｋｂＨｉｎ ｄ ｌｌｌ−Ｂ
ｇｌ Ｉｆ ＤＮＡ断片から構成され、もともとシラス
ミドｐｅｎｏ ４６ （文献１６）から得られたもので
ある。座標２２８２〜２５５７は、Ｂａｍ ＨＩ及びＳ
ａｌ ｌ認識部位間のプラスミドｐＢＲ３２２（文献１
６ａ）からの２７５ ｂｐ ＤＮＡ断片（ｐＢＲ３２２
座標３７５〜６５０）から成る。座標２５５８〜４７７
３は昼セレビシェ−からの２．２２ｋｂ離ｌ−８ａｌｌ
ＤＮＡ断片から成り、ＬＥＵ２遺伝子生成物であるβ−
インプロビルマレートデヒドロダナーゼ’６コードする
。プラスミドＹＥｐ １３ （文献１６ｂ）は、目的の
２２１５ｂｐＤＮＡ断片のための有利な分離源を提供す
る。座標４４７４〜８５２８は、酵母菌株中のシラスミ
ドＡＣ１の自律複製を可能にする３、７５ ｋｂ ＤＮ
Ａ断片から成る。この領域は酵母２μプラスミドの一部
をコードし、そしてシラスミドｐＤＢ２４８（文献１６
ｃ）から誘導された。プラスミドｐＤＢ２４８を酵素Ｅ
ｃｏ Ｒｌ及びＳａｌ ｌにょυ消化することによって
、プラスミドＡＣＩ中に導入される目的の３．７５ ｋ
ｂ ＤＮＡ断片が遊離する。座標８５２９〜１０６７２
は、４三」宿主菌株における自律複製を可能にし、そし
てアンピシリン耐性を供するＤＮＡ配列である。目的の
２１４３ ｂｐ ＤＮＡ断一旦碧ＲＩ ＤＮＡ断片（そ
れぞれ、ｐＢＲ３２２座標２２１８〜４３６０）として
得られる。ｐＡＣ１により形質転換されたＥ、 ：Ｉ
Ｉ Ｋ １２ ＭＭ ２９４株は、１９８３年１２月２
日付でＡＴＣＣ屋３９，５３２としてＡｍｅｒｌｏａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに
寄託された。
６）中の同様の断片から誘導された７ ２５ ｂｐ Ｅ
ｃｏ Ｒ１−ＨＩＴＩ ｄ ｍ ＤＮＡ断片から成り、
Ｓ、セレビシェ−Ｅｎｏ Ｉ遺伝子の５′非翻訳領域か
らのＤＮＡを含有する。この断片を、エノラーゼ遺伝子
の開始コドン（ＡＴＧ）の直前領域において変形しＨｉ
ｎｄｌ１１部位を形成した。さらに詳しくは、配列を ＣＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＧからＣＡＣＧＧＴＣＧ
ＡＧＣＡＡＧＣ管（Ａ’ｒＧ）に変えた。座標７２６〜
２２８１は、Ｓ、セレビシェ−Ｅｎｏ Ｉ遺伝子の３′
非翻訳領域からの１．５５ｋｂＨｉｎ ｄ ｌｌｌ−Ｂ
ｇｌ Ｉｆ ＤＮＡ断片から構成され、もともとシラス
ミドｐｅｎｏ ４６ （文献１６）から得られたもので
ある。座標２２８２〜２５５７は、Ｂａｍ ＨＩ及びＳ
ａｌ ｌ認識部位間のプラスミドｐＢＲ３２２（文献１
６ａ）からの２７５ ｂｐ ＤＮＡ断片（ｐＢＲ３２２
座標３７５〜６５０）から成る。座標２５５８〜４７７
３は昼セレビシェ−からの２．２２ｋｂ離ｌ−８ａｌｌ
ＤＮＡ断片から成り、ＬＥＵ２遺伝子生成物であるβ−
インプロビルマレートデヒドロダナーゼ’６コードする
。プラスミドＹＥｐ １３ （文献１６ｂ）は、目的の
２２１５ｂｐＤＮＡ断片のための有利な分離源を提供す
る。座標４４７４〜８５２８は、酵母菌株中のシラスミ
ドＡＣ１の自律複製を可能にする３、７５ ｋｂ ＤＮ
Ａ断片から成る。この領域は酵母２μプラスミドの一部
をコードし、そしてシラスミドｐＤＢ２４８（文献１６
ｃ）から誘導された。プラスミドｐＤＢ２４８を酵素Ｅ
ｃｏ Ｒｌ及びＳａｌ ｌにょυ消化することによって
、プラスミドＡＣＩ中に導入される目的の３．７５ ｋ
ｂ ＤＮＡ断片が遊離する。座標８５２９〜１０６７２
は、４三」宿主菌株における自律複製を可能にし、そし
てアンピシリン耐性を供するＤＮＡ配列である。目的の
２１４３ ｂｐ ＤＮＡ断一旦碧ＲＩ ＤＮＡ断片（そ
れぞれ、ｐＢＲ３２２座標２２１８〜４３６０）として
得られる。ｐＡＣ１により形質転換されたＥ、 ：Ｉ
Ｉ Ｋ １２ ＭＭ ２９４株は、１９８３年１２月２
日付でＡＴＣＣ屋３９，５３２としてＡｍｅｒｌｏａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに
寄託された。
グルコアミラーゼ遺伝子は、その開始コドン（ＡＴＧ）
のすぐ前にベクターにクローニングするために有用な便
利な制限部位を有しないが、ＡＴＧから３２ｂｐ上流に
１つの塩基対の変化を有することができ、これによって
唯一のＨ１ｎｄｌ１部位が形成され、転写開始のための
エノラーゼプロモーターの使用が可能となる。目的とす
る変異を得るために部位特異的変異処理を用いた。目的
とするＨｌｎ ｄ ■部位を含む領域に相補的であり、
そして適切なミスマツチ（ｍｌｓｍａｔｃｈ）を有する
１６連オリゴヌクレオチドを用いてグルコアミラーゼ遺
伝子の単鎖Ｍ１３テンプレート上でＤＮＡ合成をプライ
ムした。使用したプライマーは ＧＡＧＣＣ卦ＡＧＣＴＴＣＡＴＣであり、アンダーライ
ンがミスマツチ部分を示す。プライマーに第２のミスマ
ツチを導入し、プライマー延長のために使用したのと同
じオリゴヌクレオチド（放射性ラベルした後）と候補プ
ラークとのバイブリド形成により正しいクローンをスク
リーニングする際に用いた。
のすぐ前にベクターにクローニングするために有用な便
利な制限部位を有しないが、ＡＴＧから３２ｂｐ上流に
１つの塩基対の変化を有することができ、これによって
唯一のＨ１ｎｄｌ１部位が形成され、転写開始のための
エノラーゼプロモーターの使用が可能となる。目的とす
る変異を得るために部位特異的変異処理を用いた。目的
とするＨｌｎ ｄ ■部位を含む領域に相補的であり、
そして適切なミスマツチ（ｍｌｓｍａｔｃｈ）を有する
１６連オリゴヌクレオチドを用いてグルコアミラーゼ遺
伝子の単鎖Ｍ１３テンプレート上でＤＮＡ合成をプライ
ムした。使用したプライマーは ＧＡＧＣＣ卦ＡＧＣＴＴＣＡＴＣであり、アンダーライ
ンがミスマツチ部分を示す。プライマーに第２のミスマ
ツチを導入し、プライマー延長のために使用したのと同
じオリゴヌクレオチド（放射性ラベルした後）と候補プ
ラークとのバイブリド形成により正しいクローンをスク
リーニングする際に用いた。
１ピコモルの単鎖ＤＮＡファージ、２．３ｋｂのグルコ
アミラーゼ遺伝子断片（Ｅｃｏ Ｒ１からＳａ１■まで
）を含有する断片を、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，
９，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１００ ｎＭ ＮａＣｔ、
及び２０ｍＭのβ−メルカプトエタノールをさらに含有
する１５μｊの反応混合物中で１０ピコモルのプライマ
ーとアニルリングした。混合物を６７℃に加熱し、３７
°Ｃにて３０分間インキュベートし、次に氷上で冷却し
た。
アミラーゼ遺伝子断片（Ｅｃｏ Ｒ１からＳａ１■まで
）を含有する断片を、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，
９，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１００ ｎＭ ＮａＣｔ、
及び２０ｍＭのβ−メルカプトエタノールをさらに含有
する１５μｊの反応混合物中で１０ピコモルのプライマ
ーとアニルリングした。混合物を６７℃に加熱し、３７
°Ｃにて３０分間インキュベートし、次に氷上で冷却し
た。
上記のアニーリング混合物に１０ｒｎＭの各デオキシヌ
クレオチドトリホスフェート１μｊを加えて最終濃度を
５００μＭとした。次に、ＤＮＡポリメラーゼ■のＥ、
コリフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ）フラグメント（５単位
）（０，５μりを加え、そして延長反応を氷上で３０分
間行った。氷上で開始することによりプライマーの３７
−５７エキンヌクレアーゼ消化及びそれに続くミスマツ
チの正常化を最小にした。
クレオチドトリホスフェート１μｊを加えて最終濃度を
５００μＭとした。次に、ＤＮＡポリメラーゼ■のＥ、
コリフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ）フラグメント（５単位
）（０，５μりを加え、そして延長反応を氷上で３０分
間行った。氷上で開始することによりプライマーの３７
−５７エキンヌクレアーゼ消化及びそれに続くミスマツ
チの正常化を最小にした。
氷上に３０分分間−た後、反応を３７℃にて２時間行い
、そして６７℃にて１ｏ分間加熱することにより不活性
化した。
、そして６７℃にて１ｏ分間加熱することにより不活性
化した。
公表されている方法と異り、プライマーはキナーゼの作
用を受けず、そしてリガーゼを使用しなかった。１μ！
の反応物によりＪＭ１０３コンペテント細胞を形質転換
し、そして５４又は５０μ！をプレートした。
用を受けず、そしてリガーゼを使用しなかった。１μ！
の反応物によりＪＭ１０３コンペテント細胞を形質転換
し、そして５４又は５０μ！をプレートした。
プライムに使用する１６連ヌクレオチドをラベルされた
Ｐ−ＡＴＰを用いてキナーゼ処理し比活性３Ｘ］Ｏ’
ｃｐル今ＪｉＭ＝Ｌｍ。ニトロセルロースｐ紙を用いて
直接吸上げによりプラークからファージＤＮＡを結合せ
しめ、変性し、中和しそして洗浄した。８０℃にて２時
間加熱した後、ｐ紙を４５℃にて３時間、９Ｍ ＮａＣ
１，０，９Ｍクエン酸ナトリウム及びドデシル硫酸ナト
リウムの溶液２５ｍ７！、０．５ｇのウシ血清アルブミ
ン、０．５ｇのフィコール（Ｆｌｃｏｌｌ） ４００
（炭水化物重合体）及び０．５Ｉのポリビニルピロリド
ンの５０−の溶液、並びに５０μｍ１７ｍ１酵母ＲＮＡ
中で前バイブリド形成した。
Ｐ−ＡＴＰを用いてキナーゼ処理し比活性３Ｘ］Ｏ’
ｃｐル今ＪｉＭ＝Ｌｍ。ニトロセルロースｐ紙を用いて
直接吸上げによりプラークからファージＤＮＡを結合せ
しめ、変性し、中和しそして洗浄した。８０℃にて２時
間加熱した後、ｐ紙を４５℃にて３時間、９Ｍ ＮａＣ
１，０，９Ｍクエン酸ナトリウム及びドデシル硫酸ナト
リウムの溶液２５ｍ７！、０．５ｇのウシ血清アルブミ
ン、０．５ｇのフィコール（Ｆｌｃｏｌｌ） ４００
（炭水化物重合体）及び０．５Ｉのポリビニルピロリド
ンの５０−の溶液、並びに５０μｍ１７ｍ１酵母ＲＮＡ
中で前バイブリド形成した。
前バイブリド形成の後、１．５ Ｘ ］、 ０５ｃｐｍ
／ｌｎｌのキナーゼ処理プライマーを加え、そしてノ・
イブリド形成を４５℃にて一夜続けた。次の日、約５℃
にて９ＭＮａＣ１及び０．９Ｍクエン酸ナトリウムの溶
液中で５分間ずつ２回洗浄しく非特異的に結合したカウ
ントを除去するため）、そして４５℃にて５分間１回洗
浄した（非変異ファージＤＮＡと）・イブリド形成した
プローブを除去するため）。ｐ紙を空気乾燥し、強化ス
クリーンを有するコダックＭＡＲ（高速）フィルム上に
置き、そして−７０℃にて一夜露光せしめた。
／ｌｎｌのキナーゼ処理プライマーを加え、そしてノ・
イブリド形成を４５℃にて一夜続けた。次の日、約５℃
にて９ＭＮａＣ１及び０．９Ｍクエン酸ナトリウムの溶
液中で５分間ずつ２回洗浄しく非特異的に結合したカウ
ントを除去するため）、そして４５℃にて５分間１回洗
浄した（非変異ファージＤＮＡと）・イブリド形成した
プローブを除去するため）。ｐ紙を空気乾燥し、強化ス
クリーンを有するコダックＭＡＲ（高速）フィルム上に
置き、そして−７０℃にて一夜露光せしめた。
以下余白
第１回のスクリーニングにおいて数千のプラーク中１個
の変異クローンを見出した。次にこのクローンを制限酵
素で消化し、グルコアミラーゼ遺伝子の前にＨｌｎ ｄ
Ｉ［［が導入されたことを確認した。
の変異クローンを見出した。次にこのクローンを制限酵
素で消化し、グルコアミラーゼ遺伝子の前にＨｌｎ ｄ
Ｉ［［が導入されたことを確認した。
次の段階において、グルコアミラーゼ遺伝子の３′末端
にＨｊｎ ｄ Ｉ１１部位を形成した。遺伝子の５末端
の近くに操作されたＨｌｎ ｄ Ｉｎ部位を有するクロ
ーンをＮ凹Ｉにより切断し、この接着末端をＬコリＤＮ
Ａポリメラーゼ−Ｉのフレノウフラグメントを用いて酵
素的に修復することによシ平滑末端に転換し、そしてこ
れをＥｃｏ ＲＩによυ切断した。
にＨｊｎ ｄ Ｉ１１部位を形成した。遺伝子の５末端
の近くに操作されたＨｌｎ ｄ Ｉｎ部位を有するクロ
ーンをＮ凹Ｉにより切断し、この接着末端をＬコリＤＮ
Ａポリメラーゼ−Ｉのフレノウフラグメントを用いて酵
素的に修復することによシ平滑末端に転換し、そしてこ
れをＥｃｏ ＲＩによυ切断した。
第７図にこの領域の制限地図を示す。この方法により、
グルコアミラーゼ遺伝子を含有し、そしてこの遺伝子の
５′末端の前にＥｃｏ ＲＴ接着末端を有しそして遺伝
子の３′末端の後に平滑末端を有する断片が生成した。
グルコアミラーゼ遺伝子を含有し、そしてこの遺伝子の
５′末端の前にＥｃｏ ＲＴ接着末端を有しそして遺伝
子の３′末端の後に平滑末端を有する断片が生成した。
この断片を、プラスミドｐＵＣ８のポリリンカー領域に
クローニングすることによシ断片の３′末端の２０ヌク
レオチド内にＨ１ｎｄＩＩ部位を形成し、）ｉｉｎｂｌ
ｌ［カセットを得た。前記プラスミドｐＵＣ８はＢｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓから入手できる。
クローニングすることによシ断片の３′末端の２０ヌク
レオチド内にＨ１ｎｄＩＩ部位を形成し、）ｉｉｎｂｌ
ｌ［カセットを得た。前記プラスミドｐＵＣ８はＢｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓから入手できる。
グルコアミラーゼ遺伝子のゲノム性クローンに相同な領
域を有する形成されそして分離された最長ｃＤＮＡ、ρ
２４Ａ２は、配列において、ペプチド５０１〜２４９０
のゲノム性クローンから第１表の小文字で示したイント
ロンを差引いたものに対応する。このクローンはなお、
全長ｃＤＮＡクローンに必要とされるものよシ数百ヌク
レオチドだけ短かい。遺伝子の全長ｃＤＮＡコピーの構
成を数段階によシ完成した。遺伝子の５′末端の近くに
）（Ｉｎ ｄ ＩＩＩＩｎ部位するゲノム性クローンを
ｇｃｏ ＲＩ及びＡｖａ １１によ多切断し、そしてこ
の断片を精製した。
域を有する形成されそして分離された最長ｃＤＮＡ、ρ
２４Ａ２は、配列において、ペプチド５０１〜２４９０
のゲノム性クローンから第１表の小文字で示したイント
ロンを差引いたものに対応する。このクローンはなお、
全長ｃＤＮＡクローンに必要とされるものよシ数百ヌク
レオチドだけ短かい。遺伝子の全長ｃＤＮＡコピーの構
成を数段階によシ完成した。遺伝子の５′末端の近くに
）（Ｉｎ ｄ ＩＩＩＩｎ部位するゲノム性クローンを
ｇｃｏ ＲＩ及びＡｖａ １１によ多切断し、そしてこ
の断片を精製した。
上記の最長ｃＤＮＡクローンを７１ｖａ ＩＩ及び−Ｐ
ｓ＋ｔＩで消化し、そしてＡｖａ ＩＩ −Ｐａｔ ｌ
不断片を精製した。
ｓ＋ｔＩで消化し、そしてＡｖａ ＩＩ −Ｐａｔ ｌ
不断片を精製した。
ファージベクターＭ１３ｍｐＨ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｌｃａｌｇ 。
ｍｌｃａｌｇ 。
１０３７Ｗ、 Ｍｃｋｉｎｌｅｙ Ａｖｅ、 、 Ｍｉ
ｌｗａｕｋｅｅ、 Ｗ ｌ５３２０５から入手できる）
をＥｃｏ ＲＩ及びＰｓｔ Ｉで消化し、そしてこの大
ベクター断片を小ポリリンカー断片から精製した。これ
ら３種の断片連結し、ゲノム性クローンのｇｃｏ Ｒ１
及びＰｓｔ Ｉ領域を含有するが第２イントロンを失っ
ているＭ１３ｍｐＨベクターを生成した。
ｌｗａｕｋｅｅ、 Ｗ ｌ５３２０５から入手できる）
をＥｃｏ ＲＩ及びＰｓｔ Ｉで消化し、そしてこの大
ベクター断片を小ポリリンカー断片から精製した。これ
ら３種の断片連結し、ゲノム性クローンのｇｃｏ Ｒ１
及びＰｓｔ Ｉ領域を含有するが第２イントロンを失っ
ているＭ１３ｍｐＨベクターを生成した。
次に、最長ｃＤＮＡクローンをＰｓｔ Ｉによシ、この
制限酵素の製造者によシ与えられた条件を用いて切断し
、そして犬Ｐｓｔ ｌ断片を分離した。上記のＭ１３ｍ
ｐＨベクターをＰｓｔ Ｉによ多切断し、そしてｃＤＮ
Ａクローンからの大Ｐａｔ ｌ断片をこの部位に連結し
た。この連結により形成されたクローンをスクリーニン
グし、正しい方向に挿入されたＰｓｔｌ断片を有するク
ローンを同定した。この段階から分離されたクローンは
Ｅｃｏ ＲｒからＡｖａ ＩＩまでのゲノム性配列（第
１イントロン及び新しい５’Ｈ１ｎ ｄ ■部位を含有
する）及びポＩＪ Ａテイル領域を越えるＡｖａ ＩＩ
からＰｓｔ ｌまでのｃＤＮＡ配列を有していた。
制限酵素の製造者によシ与えられた条件を用いて切断し
、そして犬Ｐｓｔ ｌ断片を分離した。上記のＭ１３ｍ
ｐＨベクターをＰｓｔ Ｉによ多切断し、そしてｃＤＮ
Ａクローンからの大Ｐａｔ ｌ断片をこの部位に連結し
た。この連結により形成されたクローンをスクリーニン
グし、正しい方向に挿入されたＰｓｔｌ断片を有するク
ローンを同定した。この段階から分離されたクローンは
Ｅｃｏ ＲｒからＡｖａ ＩＩまでのゲノム性配列（第
１イントロン及び新しい５’Ｈ１ｎ ｄ ■部位を含有
する）及びポＩＪ Ａテイル領域を越えるＡｖａ ＩＩ
からＰｓｔ ｌまでのｃＤＮＡ配列を有していた。
遺伝子の５′末端に残留するイントロンを、イントロン
領域をまたぐ２９連オリゴペゾチドを用いる部位指定変
異形成によシ除去した。この２９連ヌクレオチドはイン
トロンの５′側の１５ｂｐ及び３′側の１４ ｂｐに相
同性を有し次の配列を有する。
領域をまたぐ２９連オリゴペゾチドを用いる部位指定変
異形成によシ除去した。この２９連ヌクレオチドはイン
トロンの５′側の１５ｂｐ及び３′側の１４ ｂｐに相
同性を有し次の配列を有する。
５ ’ ＣＧＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＴ
ＡＣＡＣＣＴＧＧ ３ ’部位指定変異形成の操作にお
いては、２．３ｋｂのグルコアミラーゼ遺伝子断片（Ｅ
ｃｏ ＲＩから５ａｌｌまで）を含有する、Ｍ１３ｍｐ
９と称する単鎖ＤＮＡファージ誘導体（商業的に得られ
る）１ピコモルを１０ピコモルのプライマーに、６ｍＭ
のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以後Ｔｒ
ｉｍと称する）ｐ）１７．９．６ｒｎＭＭｇ Ｃ２２及
び１００ ｍＭ ＮａＣ４を含有する１５μｌ中でアニ
ーリングする。この混合物を６７℃に加熱し、３７℃で
３０分間インキュベートし、そして氷上に置いた。この
温度において２９連ヌクレオチドのいずれの半分もテン
プレート上のその相補部分にアニールすることができ、
適正なループの形成が可能となる。
ＡＣＡＣＣＴＧＧ ３ ’部位指定変異形成の操作にお
いては、２．３ｋｂのグルコアミラーゼ遺伝子断片（Ｅ
ｃｏ ＲＩから５ａｌｌまで）を含有する、Ｍ１３ｍｐ
９と称する単鎖ＤＮＡファージ誘導体（商業的に得られ
る）１ピコモルを１０ピコモルのプライマーに、６ｍＭ
のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以後Ｔｒ
ｉｍと称する）ｐ）１７．９．６ｒｎＭＭｇ Ｃ２２及
び１００ ｍＭ ＮａＣ４を含有する１５μｌ中でアニ
ーリングする。この混合物を６７℃に加熱し、３７℃で
３０分間インキュベートし、そして氷上に置いた。この
温度において２９連ヌクレオチドのいずれの半分もテン
プレート上のその相補部分にアニールすることができ、
適正なループの形成が可能となる。
上記のアニーリング混合物に１μノずつの１０ｍＭデオ
キシヌクレオチドトリホスフェートを加えて最終濃度を
５００μＭとする。次に、Ｅ、コＩＪ ＤＮＡポリメラ
ーゼ−■のフレノウフラグメント（５ユニツ））（０，
５μｌ）を加え、そしてプライマ−の３／、−５７エキ
ソヌクレアーゼ消化を最小にするため氷上で３０分間延
長反応を行う。氷上に３０分分間−た後、反応を３７℃
にて２時間行い、そして６７℃にて１０分間加熱するこ
とにより不活性化した。
キシヌクレオチドトリホスフェートを加えて最終濃度を
５００μＭとする。次に、Ｅ、コＩＪ ＤＮＡポリメラ
ーゼ−■のフレノウフラグメント（５ユニツ））（０，
５μｌ）を加え、そしてプライマ−の３／、−５７エキ
ソヌクレアーゼ消化を最小にするため氷上で３０分間延
長反応を行う。氷上に３０分分間−た後、反応を３７℃
にて２時間行い、そして６７℃にて１０分間加熱するこ
とにより不活性化した。
ここで使用した操作においては、他の公表されている方
法と異り、プライマーがキナーゼの作用を受けず、そし
てリガーゼを使用しなかった。
法と異り、プライマーがキナーゼの作用を受けず、そし
てリガーゼを使用しなかった。
１μノの前記反応液でＪＭ１０３コンペテント細胞を形
質転換し、そして５μｌ又は５０μｌをプレートした。
質転換し、そして５μｌ又は５０μｌをプレートした。
（ＪＭ１０３は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅａ 。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅａ 。
Ｉｎｃ、、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、 ＭＤ ２
０８７７によシ提供されるＥ、コリの菌株である）。
０８７７によシ提供されるＥ、コリの菌株である）。
プライミングに使用した２９連ヌクレオチドを、ラベル
した Ｐ−ＡＴＰによシキナーゼ処理して比活性ヲ３
Ｘ １０ ｃｐｍ／μｇとした。ニトロセルロース濾紙
を使用して直接吸上げによシプラークからのファージＤ
ＮＡを結合せしめ、そしてこの濾紙を中和しそして洗浄
した。８０℃にて２時間加熱した後、この濾紙を５５℃
にて３時間、９ＭＮａＣｔ１０．９Ｍクエン酸ナトリウ
ム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの溶液２５ｍ１．
０．！ｌのウシ血清アルブミン、０．５ｇのフィコール
４００ （ＰｈａｒｍａｃｉａＦｌｎｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｇから得られる炭水化物重合体）及び０．５ｇのポ
リビニルぎロリドンを含有する５０−の溶液、並びに最
後に５０μｇＡＩＬｌの酵母ＲＮＡ中の前バイブリド形
成した。この前ノ・イブリド形成の後、１．５ Ｘ １
０ ｃｐｍ７ｆｎ、ｌのキナーゼ処理プライマーを加え
、そして５５℃にて一夜ノ・イブリド形成を続けた。
した Ｐ−ＡＴＰによシキナーゼ処理して比活性ヲ３
Ｘ １０ ｃｐｍ／μｇとした。ニトロセルロース濾紙
を使用して直接吸上げによシプラークからのファージＤ
ＮＡを結合せしめ、そしてこの濾紙を中和しそして洗浄
した。８０℃にて２時間加熱した後、この濾紙を５５℃
にて３時間、９ＭＮａＣｔ１０．９Ｍクエン酸ナトリウ
ム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの溶液２５ｍ１．
０．！ｌのウシ血清アルブミン、０．５ｇのフィコール
４００ （ＰｈａｒｍａｃｉａＦｌｎｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｇから得られる炭水化物重合体）及び０．５ｇのポ
リビニルぎロリドンを含有する５０−の溶液、並びに最
後に５０μｇＡＩＬｌの酵母ＲＮＡ中の前バイブリド形
成した。この前ノ・イブリド形成の後、１．５ Ｘ １
０ ｃｐｍ７ｆｎ、ｌのキナーゼ処理プライマーを加え
、そして５５℃にて一夜ノ・イブリド形成を続けた。
次の日、濾紙を、約５℃において９ Ｍ ＮａＣｔ及ヒ
０．９ Ｍクエン酸ナトリウムの溶液中で５分間ずつ２
回洗浄しく非特異的結合カウントを除去するため）、そ
して次に５５℃にて５分間で１回洗浄した（非変異ファ
ージＤＮＡとバイブリド形成したプローブを除去するた
め）。
０．９ Ｍクエン酸ナトリウムの溶液中で５分間ずつ２
回洗浄しく非特異的結合カウントを除去するため）、そ
して次に５５℃にて５分間で１回洗浄した（非変異ファ
ージＤＮＡとバイブリド形成したプローブを除去するた
め）。
回収された陽性プラークの頻度は約４チであった。陽性
の候補プラークを、ミニ−プレツブ（ｍｉｎｔ−ｐｒｅ
ｐｓ）を調製し、そしてこれらを消化して７５ ｂｐイ
ントロンの除去によるサイズの減少が生じたか否かを試
験した。
の候補プラークを、ミニ−プレツブ（ｍｉｎｔ−ｐｒｅ
ｐｓ）を調製し、そしてこれらを消化して７５ ｂｐイ
ントロンの除去によるサイズの減少が生じたか否かを試
験した。
最後の段階において、このプラスミドベクターをＥｃｏ
Ｒ■及び−■によシ消化し、そして断片を精製し、そ
してこれを使用して前記のＡ項に記載したゲノム性Ｈ１
ｎｄｌｌｌカセットベクター中のＥｃｏ ＲＩ −Ｂａ
ｍＨＩ断片と置換した。こうして、クローンの３′末端
に正常なポリアデニル化シグナルを有するが４個のすべ
てのイントロンを喪失したであろうｃＤＮＡ Ｈｌｎ
ｄ １１カセツトを形成する。
Ｒ■及び−■によシ消化し、そして断片を精製し、そ
してこれを使用して前記のＡ項に記載したゲノム性Ｈ１
ｎｄｌｌｌカセットベクター中のＥｃｏ ＲＩ −Ｂａ
ｍＨＩ断片と置換した。こうして、クローンの３′末端
に正常なポリアデニル化シグナルを有するが４個のすべ
てのイントロンを喪失したであろうｃＤＮＡ Ｈｌｎ
ｄ １１カセツトを形成する。
母菌法
前記Ａ項に記載したゲノム性グルコアミラーゼ遺伝子の
イントロン含有ＨｉｎｄＩ［［カセットを切υ出し、そ
して酵母発現ベクターシラスミドｐＡＣ１に挿入してｐ
Ｇｃ２１と称するプラスミドを形成した。
イントロン含有ＨｉｎｄＩ［［カセットを切υ出し、そ
して酵母発現ベクターシラスミドｐＡＣ１に挿入してｐ
Ｇｃ２１と称するプラスミドを形成した。
このプラスミドの制限地図を第８図に示す。ｐＧｃ２１
で形質転換したＥ、コリＫ １２ ＭＭ２９４株は、Ｎ
ＲＲＬ ＡＢ−１４２１５として、１９８３年１２月７
日にＮＲＲＬに寄託された。ρＡＣＩによシ形質転換さ
れたＥ、 ｊｌＪＫ１２ＭＭ２９４はＡＴＣＣＡ ３９
，５３２として、１９８３年１２月２日にＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ａｃｔｉｏ
ｎに寄託された。前記Ｂ項に記載したイントロンを喪失
した全長ｃＤＮＡクローンのカセットを同様に切シ出し
、そしてベクターｐＡｃ １に挿入してｐＧＡＣ９と称
するプラスミドを形成した。このプラスミドの制限地図
を第７図に示す。
で形質転換したＥ、コリＫ １２ ＭＭ２９４株は、Ｎ
ＲＲＬ ＡＢ−１４２１５として、１９８３年１２月７
日にＮＲＲＬに寄託された。ρＡＣＩによシ形質転換さ
れたＥ、 ｊｌＪＫ１２ＭＭ２９４はＡＴＣＣＡ ３９
，５３２として、１９８３年１２月２日にＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ａｃｔｉｏ
ｎに寄託された。前記Ｂ項に記載したイントロンを喪失
した全長ｃＤＮＡクローンのカセットを同様に切シ出し
、そしてベクターｐＡｃ １に挿入してｐＧＡＣ９と称
するプラスミドを形成した。このプラスミドの制限地図
を第７図に示す。
プラスミドＤＮＡｐＧＣ２１及びｐＧＡＣ９をＥ、コリ
中で増幅し、塩化セシウムグラジェントにより精製し、
そしてこれ′を用いて２種類の酵母菌株に形質転換した
。一方は隆に４６８株であり、これはロイシン及びヒス
チジンの栄養要求マーカーを有する一倍体サッカロミセ
ス・セレビシェ−である。他方は酵母８１８株であり、
これはロイシン及びヒスチジンの栄養要求マーカーを有
する一倍体Ｓ、セレーゼのためのレプレッサーを喪失し
ている。アスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ遺
伝子の発現についてＬａｕ＋形質転換体をスクリーニン
グした。Ｈ２Ｓ株は、ＮＲＲＬ Ａ Ｙ−１２８４２と
して、１９８３年１２月７日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅ
ｇｌｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 。
中で増幅し、塩化セシウムグラジェントにより精製し、
そしてこれ′を用いて２種類の酵母菌株に形質転換した
。一方は隆に４６８株であり、これはロイシン及びヒス
チジンの栄養要求マーカーを有する一倍体サッカロミセ
ス・セレビシェ−である。他方は酵母８１８株であり、
これはロイシン及びヒスチジンの栄養要求マーカーを有
する一倍体Ｓ、セレーゼのためのレプレッサーを喪失し
ている。アスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ遺
伝子の発現についてＬａｕ＋形質転換体をスクリーニン
グした。Ｈ２Ｓ株は、ＮＲＲＬ Ａ Ｙ−１２８４２と
して、１９８３年１２月７日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅ
ｇｌｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 。
Ｐｅｏｒ４ａ 、 ｌ１ｌｌｎｏｌｅ 、米国、に寄託
された。
された。
酵母発現ベクターｐＧｃ２１及びｐＧＡＣ９により形質
転換された酵母菌株のそれぞれを、親プ２スミドｐＡｃ
１により形質転換された同じ菌株と、種々の澱粉での増
殖について、液体培地及び固体培地において比較した。
転換された酵母菌株のそれぞれを、親プ２スミドｐＡｃ
１により形質転換された同じ菌株と、種々の澱粉での増
殖について、液体培地及び固体培地において比較した。
３種類の澱粉、すなわち「洗浄した」澱粉（７０％エタ
ノールで３回洗浄して糖及び短鎖炭水化物を除去した可
溶性澱粉）、キャッサパ澱粉、及び可溶性バレイショ澱
粉（ベカー製）を使用した。３種類のプラスミドのいず
れで形質転換した酵母も３種類の澱粉に増殖したが、液
体培地及び固体培地のいずれにおいてもｃＤＮＡクロー
ン（ｐＧＡＣ９）が他のクローンよシ良好な増殖を示し
た。３種類の澱粉の同量も重合度が高いペーカーの澱粉
を２ ｗ／ｖ％の濃度で固体培地に使用した場合、プレ
ートが濁った。これらのプレートに、親プラスミドを有
する菌株、ゲノム性クローンを有する菌株、及びｃＤＮ
Ａクローンを有する菌株、並びに酵母グルコアミラーゼ
を発現するサツカロミセス・ジアスタチクス（ＮＲＲＬ
寄託ＡＹ−２０４４）を塗付した。ｃ ＤＮＡクローン
（ｐＧＡＣ９）を担持する菌株は増殖領域の周囲の澱粉
を透明にすることができ、これらが澱粉を完全に分解し
得ることが示された。
ノールで３回洗浄して糖及び短鎖炭水化物を除去した可
溶性澱粉）、キャッサパ澱粉、及び可溶性バレイショ澱
粉（ベカー製）を使用した。３種類のプラスミドのいず
れで形質転換した酵母も３種類の澱粉に増殖したが、液
体培地及び固体培地のいずれにおいてもｃＤＮＡクロー
ン（ｐＧＡＣ９）が他のクローンよシ良好な増殖を示し
た。３種類の澱粉の同量も重合度が高いペーカーの澱粉
を２ ｗ／ｖ％の濃度で固体培地に使用した場合、プレ
ートが濁った。これらのプレートに、親プラスミドを有
する菌株、ゲノム性クローンを有する菌株、及びｃＤＮ
Ａクローンを有する菌株、並びに酵母グルコアミラーゼ
を発現するサツカロミセス・ジアスタチクス（ＮＲＲＬ
寄託ＡＹ−２０４４）を塗付した。ｃ ＤＮＡクローン
（ｐＧＡＣ９）を担持する菌株は増殖領域の周囲の澱粉
を透明にすることができ、これらが澱粉を完全に分解し
得ることが示された。
これに対して、Ｓ、ジアスタチクス株、及び親プラスミ
ドｐＡｃ１又はゲノム性クローンｐＧｃ２１にょシ形質
転換された酵母菌株は増殖領域の周囲の澱粉を透明にす
ることができなかった。ｐＧＡＣ９含有菌株によシ高度
に重合した澱粉が透明になったことは、１．４−及び１
．６−アミラーゼ活性の両者を有する人、アワモリグル
コアミラーゼ遺伝子が機能的に発現したことを示す。
ドｐＡｃ１又はゲノム性クローンｐＧｃ２１にょシ形質
転換された酵母菌株は増殖領域の周囲の澱粉を透明にす
ることができなかった。ｐＧＡＣ９含有菌株によシ高度
に重合した澱粉が透明になったことは、１．４−及び１
．６−アミラーゼ活性の両者を有する人、アワモリグル
コアミラーゼ遺伝子が機能的に発現したことを示す。
上記の結果を第９図に示す。すなわち、第９図は種々の
形質転換された酵母菌株にょるペーカーの澱粉の分解に
ついてのプレートアッセイを示す。下記の菌株を、４Ｃ
Ｊｎ９／ｌのヒスチジン及び２ｗ／ｖ％のべ一カーの澱
粉を含有する最少培地上に塗付した。３０℃にて１２日
間培養した後、プレートをヨウ素蒸気によシ染色した。
形質転換された酵母菌株にょるペーカーの澱粉の分解に
ついてのプレートアッセイを示す。下記の菌株を、４Ｃ
Ｊｎ９／ｌのヒスチジン及び２ｗ／ｖ％のべ一カーの澱
粉を含有する最少培地上に塗付した。３０℃にて１２日
間培養した後、プレートをヨウ素蒸気によシ染色した。
澱粉が紫色に染色され、そして澱粉が加水分解された領
域が透明なゾーンとして示された。
域が透明なゾーンとして示された。
１ ａ Ｃ４６８ｐＡｃｌ
ｂ Ｃ４６８ｐＧＡＣ９
ａ Ｃ４６８ｐＧｃ２１
ｄＣ４６８ｐＧｃ２１
２ ａ Ｃ４６８ｐＡｃｌ
ｂ Ｃ４＆８ ｐＧＡｃ９
Ｃ４６８ｐＧＡＣ９
ｄ Ｃ４６８ｐＧＡＣ９
３ａ Ｈ２Ｓ ｐＡｃｌ
ｂ Ｈ２Ｓ ｐＧＡＣ９
Ｃ３０３＊
ｄ Ｈ２Ｓ ｐＧＡＣ９
グルコアミラーゼの発現に関する他の試験において、対
照プラスミドｐＡｃ１、ｃＤＮＡクローン、又はｐＧＡ
Ｃ９を担持する酵母細胞を洗浄澱粉液体培地に増殖せし
めた。細胞を採取し、凍結−解凍の反復によシ溶解し、
そしてガラスピーズと共に渦流せしめた。細胞内蛋白質
を含有する各細胞溶解物’ｋ、０．１％のドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）及び７．６Ｍ尿素を含有する７％
アクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして臭化シアン
で活性化したセルロース紙に移した。蛋白質が移行した
後、この紙を、Ａ、アワモリグルコアミラーゼに対して
免疫した家兎からの抗血清で探査し、そして次に放射性
ラベルした５ｔａｐｈ Ａ蛋白質（抗体分子に結合する
）によシ探査した。未結合放射能を洗浄除去した後、紙
を乾燥し、そしてＸ線フィルムに暴した。「ウェスタン
」法と称されるこの技法は文献１７に記載されており、
そして抗血清又は精製抗体を用いて実施することができ
る。グルコアミラーゼ抗血清と反応する蛋白質がｐＧＡ
ｃ９ 、 ｃＤＮＡクローンからの溶解物中に検出され
たが、ｐＡｃｌの対照中には検出されなかった。
照プラスミドｐＡｃ１、ｃＤＮＡクローン、又はｐＧＡ
Ｃ９を担持する酵母細胞を洗浄澱粉液体培地に増殖せし
めた。細胞を採取し、凍結−解凍の反復によシ溶解し、
そしてガラスピーズと共に渦流せしめた。細胞内蛋白質
を含有する各細胞溶解物’ｋ、０．１％のドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）及び７．６Ｍ尿素を含有する７％
アクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして臭化シアン
で活性化したセルロース紙に移した。蛋白質が移行した
後、この紙を、Ａ、アワモリグルコアミラーゼに対して
免疫した家兎からの抗血清で探査し、そして次に放射性
ラベルした５ｔａｐｈ Ａ蛋白質（抗体分子に結合する
）によシ探査した。未結合放射能を洗浄除去した後、紙
を乾燥し、そしてＸ線フィルムに暴した。「ウェスタン
」法と称されるこの技法は文献１７に記載されており、
そして抗血清又は精製抗体を用いて実施することができ
る。グルコアミラーゼ抗血清と反応する蛋白質がｐＧＡ
ｃ９ 、 ｃＤＮＡクローンからの溶解物中に検出され
たが、ｐＡｃｌの対照中には検出されなかった。
士アワモリグルコアミラーゼ遺伝子の発現をさらに、こ
の遺伝子を含有しなければ資化することができない炭素
源上での増殖の可能性にょシ、直接的に試験した。酵母
０４６８株及びＨ２Ｓ株はいずれも炭素源としてのマル
トースの資化を遮断する変異（１）を担持するので、こ
れらの酵母菌株について炭素源としてマルトースを用い
る前記の増殖試験を行った。対照プラスミドｐＡｃ１又
はｃＤＮＡプラスミドｐＧＡＣ９を含有する０４６８株
及び）１１ｇ株が炭素源としてのマルトース及びグルコ
ースに増殖する可能性を第３表に示す。グルコースプレ
ートはヒスチジンを含有し、マルトースプレートはヒス
チ・シン及びロイシンの両方を含有する。この表から、
プラスミド上におけるグルコアミラーゼ遺伝子の存在が
、Ｃ４６８がマルトース上でゆっくりと増殖することを
可能にし、そしてＩ（１８７５！対照よりわずかに良好
に増殖することを可能にすることがわかる。
の遺伝子を含有しなければ資化することができない炭素
源上での増殖の可能性にょシ、直接的に試験した。酵母
０４６８株及びＨ２Ｓ株はいずれも炭素源としてのマル
トースの資化を遮断する変異（１）を担持するので、こ
れらの酵母菌株について炭素源としてマルトースを用い
る前記の増殖試験を行った。対照プラスミドｐＡｃ１又
はｃＤＮＡプラスミドｐＧＡＣ９を含有する０４６８株
及び）１１ｇ株が炭素源としてのマルトース及びグルコ
ースに増殖する可能性を第３表に示す。グルコースプレ
ートはヒスチジンを含有し、マルトースプレートはヒス
チ・シン及びロイシンの両方を含有する。この表から、
プラスミド上におけるグルコアミラーゼ遺伝子の存在が
、Ｃ４６８がマルトース上でゆっくりと増殖することを
可能にし、そしてＩ（１８７５！対照よりわずかに良好
に増殖することを可能にすることがわかる。
これらの試験は、グルコアミラーゼ遺伝子の存在がＣ４
６８のｍａｌ変異を補完し、そして酵母の増殖が人アワ
モリグルコアミラーゼ遺伝子の固有、且つ適切な機能発
現のみに依存する直接的選択実験を促進する。
６８のｍａｌ変異を補完し、そして酵母の増殖が人アワ
モリグルコアミラーゼ遺伝子の固有、且つ適切な機能発
現のみに依存する直接的選択実験を促進する。
これらの実験のすべてが、プラスミドｐＧＡＣ９を含有
する酵母Ｃ４６８株がグルコアミラーゼ遺伝子の発現に
おいて全く卓越していることを示している。ｐ ＧＡＣ
９によシ形質転換された酵母０４６８株は、ＡＴＣＣ寄
託Ａ２０，６９０として、１９８３年１１月１７日にＡ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔ１ｏｎに寄託された。
する酵母Ｃ４６８株がグルコアミラーゼ遺伝子の発現に
おいて全く卓越していることを示している。ｐ ＧＡＣ
９によシ形質転換された酵母０４６８株は、ＡＴＣＣ寄
託Ａ２０，６９０として、１９８３年１１月１７日にＡ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔ１ｏｎに寄託された。
グルコース マルトース
Ｃ４６８ｐＡｃｌ（り士 ＋ ＋ｏｏｏｏ。
Ｃ４６８ｐＧＡＣ９± ＋ ＋ ０ ０ ｍ ± ＋Ｈ
１８ｐＡｃｌ（り士 ＋ 十 ｏｏｏｏ。
１８ｐＡｃｌ（り士 ＋ 十 ｏｏｏｏ。
ｍ＝微小コロニー〈０．３霞
±＝小コロニー〈１澗
十＝正常コロニー２〜３■
Ｄ、 （１）酵母培養におけるグルコアミラーゼ活性の
特徴付は 前記のようにして調製したｐＡｃｌ又はｐＧＡＣ９を含
有する酵母０４６８株の静置培養を、炭素源としてグル
コース又は洗浄したディフコ可溶性澱粉を含む最少培地
中で行った。グルコース培養においては５日目、澱粉培
養においては７日後に培養物を採取し、そして遠心分離
により無細胞上清液を調製した。この上清液を、ＰＭＩ
Ｏ膜を有するアミコン濃縮器によ＃）１０〜２０倍に濃
縮した。対照フ９ ｘ ミ）’ ｐＡｃｌを含有する酵
母０４６８株のグルコース培養及び澱粉培養からの上清
液についてはグルコアミラーゼ測定が陰性であった。こ
れに対して、プラスミドｐＧＡＣ９を含有する細胞は１
１当たり約６ユニツトのグルコアミラーゼ活性を分泌し
た。（グルコアミラーゼ活性の単位の定義については第
４表の注を参照のこと。） 次に、ｐＧＡＣ９プラスミドを含有する酵母０４６８株
の好気的振とりフラスコ培養におけるグルコアミラーゼ
生産を測定した。３０℃、２５ Ｏｒｐｍの振とうにて
２日間培養した後、ｐＧＡＣ９を含有する酵母０４６８
株の培養が定常期に達した。この培養において細胞密度
が約２ｇ乾燥重量／ｌに達した。
特徴付は 前記のようにして調製したｐＡｃｌ又はｐＧＡＣ９を含
有する酵母０４６８株の静置培養を、炭素源としてグル
コース又は洗浄したディフコ可溶性澱粉を含む最少培地
中で行った。グルコース培養においては５日目、澱粉培
養においては７日後に培養物を採取し、そして遠心分離
により無細胞上清液を調製した。この上清液を、ＰＭＩ
Ｏ膜を有するアミコン濃縮器によ＃）１０〜２０倍に濃
縮した。対照フ９ ｘ ミ）’ ｐＡｃｌを含有する酵
母０４６８株のグルコース培養及び澱粉培養からの上清
液についてはグルコアミラーゼ測定が陰性であった。こ
れに対して、プラスミドｐＧＡＣ９を含有する細胞は１
１当たり約６ユニツトのグルコアミラーゼ活性を分泌し
た。（グルコアミラーゼ活性の単位の定義については第
４表の注を参照のこと。） 次に、ｐＧＡＣ９プラスミドを含有する酵母０４６８株
の好気的振とりフラスコ培養におけるグルコアミラーゼ
生産を測定した。３０℃、２５ Ｏｒｐｍの振とうにて
２日間培養した後、ｐＧＡＣ９を含有する酵母０４６８
株の培養が定常期に達した。この培養において細胞密度
が約２ｇ乾燥重量／ｌに達した。
濃縮してない上清液についてのグルコアミラーゼ測定に
より、約４７ユニツト／ｌの活性を有する上清液が得ら
れたことが示された。
より、約４７ユニツト／ｌの活性を有する上清液が得ら
れたことが示された。
大部分のグルコアミラーゼ活性が培地中に存在するか細
胞内に存在するかを解明するため、次の実験を行った。
胞内に存在するかを解明するため、次の実験を行った。
０４６８−ｐＧＡｃＱ株及びＣ４６８−ｐＡｃｌ株を、
１１描シ１．４５ｇのディフコ酵母窒素ペース（Ｄｌｆ
ｃ。
１１描シ１．４５ｇのディフコ酵母窒素ペース（Ｄｌｆ
ｃ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｄａｔｒｏｉｔ、ＭＩ
４８２３８ ）、５．２ｇの硫酸アンモニウム及び２チ
のグルコースを含有する培地５００ｍ／！中に、細胞密
度が２−３ Ｘ １０個／ｄになるまで増殖せしめた。
４８２３８ ）、５．２ｇの硫酸アンモニウム及び２チ
のグルコースを含有する培地５００ｍ／！中に、細胞密
度が２−３ Ｘ １０個／ｄになるまで増殖せしめた。
この培養物を４℃にて遠心分離し、そして上清液と細胞
ベンットを分離した。上清液を０．４５μのフィルター
で濾過し、そしてＰＩ（−１０膜を有するアミコン攪拌
セルを用いて約１５〜２０倍に濃縮した。細胞ペレット
は１Ｍツルヒト−ルー０．１ Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７，
５中で１回洗浄し、そして細胞のパックドがリウムを、
円錐形目盛付遠心管中で約１０００ｘｃにて５分間遠心
分離することによシ測定した。ｌ ｍｌずつのパックド
セルを１．０Ｍソルビトール−０，１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７，５中に１．５ＴｒＬｌになるように懸濁し、そし
て同量のチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）５０００
（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 、 Ｅ；１ｋｈａ
ｒｔ ＩＮ ４６５１５ ）を加えた。
ベンットを分離した。上清液を０．４５μのフィルター
で濾過し、そしてＰＩ（−１０膜を有するアミコン攪拌
セルを用いて約１５〜２０倍に濃縮した。細胞ペレット
は１Ｍツルヒト−ルー０．１ Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７，
５中で１回洗浄し、そして細胞のパックドがリウムを、
円錐形目盛付遠心管中で約１０００ｘｃにて５分間遠心
分離することによシ測定した。ｌ ｍｌずつのパックド
セルを１．０Ｍソルビトール−０，１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７，５中に１．５ＴｒＬｌになるように懸濁し、そし
て同量のチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）５０００
（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 、 Ｅ；１ｋｈａ
ｒｔ ＩＮ ４６５１５ ）を加えた。
細胞を室温にて１時間ゆっくシと混合し、そして次に５
００×Ｇで遠心分離することによシプロトプラストを調
製した。細胞壁と内部膜との間に存在する蛋白質を代表
する上清液を氷上に置き、その後の操作に使用した。酵
母における細胞膜（ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ）と細胞
壁（ｗａ １１ ）との間の空間を間質（ｉｎｔｅｒｓ
ｔｉＨａｌ）空間と称し、そしてこのプロトプラスト上
清試料を以後間質試料と称する。プロトプラストを１Ｍ
ソルビトール−０，１Ｍ ＫＰＯ４緩衝液−１０ｍＭＮ
ａＮ３中ＫＭｍＬ、そして５ｏｏｘｃにて１回洗浄した
。ペレットを５ｍｌの１Ｍソルビトール−０，１Ｍ Ｋ
ＰＯ４，ｌμ７−５−、１０ ｍＭＮａＮｙ、に懸濁し
、そして１ｍｌを用いて無傷のアジド処理したプロトプ
ラスト中に存在するグルコアミラーゼ活性を測定した。
００×Ｇで遠心分離することによシプロトプラストを調
製した。細胞壁と内部膜との間に存在する蛋白質を代表
する上清液を氷上に置き、その後の操作に使用した。酵
母における細胞膜（ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ）と細胞
壁（ｗａ １１ ）との間の空間を間質（ｉｎｔｅｒｓ
ｔｉＨａｌ）空間と称し、そしてこのプロトプラスト上
清試料を以後間質試料と称する。プロトプラストを１Ｍ
ソルビトール−０，１Ｍ ＫＰＯ４緩衝液−１０ｍＭＮ
ａＮ３中ＫＭｍＬ、そして５ｏｏｘｃにて１回洗浄した
。ペレットを５ｍｌの１Ｍソルビトール−０，１Ｍ Ｋ
ＰＯ４，ｌμ７−５−、１０ ｍＭＮａＮｙ、に懸濁し
、そして１ｍｌを用いて無傷のアジド処理したプロトプ
ラスト中に存在するグルコアミラーゼ活性を測定した。
残りの４づのプロトプラストに４−の５０ ｍＭ Ｔｒ
ｌｓ 、 ｐＨ７，５−１０ｍＭＥＤＴＡを６ｇの殺菌
がラスビーズ（０，４５〜０．５ ｔａｎ Ｂ、ブラウ
ン）と共に加え、そしてこの混合物を２０秒間激しく渦
流せしめ、氷上で冷却し、この操作を、顕微鏡観察にお
いて膜ゴースト又は粒子は存在するが無傷のプロトシラ
ストがほとんど又は全く存在しなくなるまで反復した。
ｌｓ 、 ｐＨ７，５−１０ｍＭＥＤＴＡを６ｇの殺菌
がラスビーズ（０，４５〜０．５ ｔａｎ Ｂ、ブラウ
ン）と共に加え、そしてこの混合物を２０秒間激しく渦
流せしめ、氷上で冷却し、この操作を、顕微鏡観察にお
いて膜ゴースト又は粒子は存在するが無傷のプロトシラ
ストがほとんど又は全く存在しなくなるまで反復した。
チューブの底に挿入したバスツールビヘットによシ無菌
の２Ｍシェークロースをゆっくシ加え、そして溶解物を
ガラスピーズから浮上せしめた。溶解物をあらたなチー
ーブに取シ出し、そして間質試料と並行して４℃にて約
２０．０ＯＯＸＧで３０分間遠心分離した。破壊された
プロトプラストからの上清液を細胞内試料と称し、そし
て間質試料からのペレット及び破壊されたプロトプラス
トからの試料を一緒にして膜試料とする。こうして酵母
培養物を５種類の試料、すなわち、細胞外又は上清試料
１間質試料、−緒にした膜試料、及び細胞内試料、並び
に無傷のアジド処理プロトプラスト含有試料に分画した
。
の２Ｍシェークロースをゆっくシ加え、そして溶解物を
ガラスピーズから浮上せしめた。溶解物をあらたなチー
ーブに取シ出し、そして間質試料と並行して４℃にて約
２０．０ＯＯＸＧで３０分間遠心分離した。破壊された
プロトプラストからの上清液を細胞内試料と称し、そし
て間質試料からのペレット及び破壊されたプロトプラス
トからの試料を一緒にして膜試料とする。こうして酵母
培養物を５種類の試料、すなわち、細胞外又は上清試料
１間質試料、−緒にした膜試料、及び細胞内試料、並び
に無傷のアジド処理プロトプラスト含有試料に分画した
。
グルコアミラーゼによシ可溶性澱粉から遊離さレルクル
コースヲ検出するパーオキシダーゼ−グルコースオキシ
ダーゼ（ＰＧＯ） ／ Ｏ−ジアニシジン（ＯＤＡＤ）
測定（シクマ・キット＋５１０）を用いて、培養試料
のグルコアミラーゼ活性を分析した。この測定はグルコ
ースを使用する存在する他の酵素、又は試料中に存在す
るグルコースにょシ行うことができる。各ＰＧＯ−ＯＤ
ＡＤ測定混合物を既知量のグルコース（−４に、０〜５
５０ナノモルの一連の稀釈）を用いて試験し、そして標
準曲線を得た。
コースヲ検出するパーオキシダーゼ−グルコースオキシ
ダーゼ（ＰＧＯ） ／ Ｏ−ジアニシジン（ＯＤＡＤ）
測定（シクマ・キット＋５１０）を用いて、培養試料
のグルコアミラーゼ活性を分析した。この測定はグルコ
ースを使用する存在する他の酵素、又は試料中に存在す
るグルコースにょシ行うことができる。各ＰＧＯ−ＯＤ
ＡＤ測定混合物を既知量のグルコース（−４に、０〜５
５０ナノモルの一連の稀釈）を用いて試験し、そして標
準曲線を得た。
１グルコアミラーゼユニツトを、３７℃において洗浄可
溶性澱粉から１分間に１μモルのグルコースを遊離せし
めるグルコアミラーゼの量と定義する。
溶性澱粉から１分間に１μモルのグルコースを遊離せし
めるグルコアミラーゼの量と定義する。
試料を、調製したその日に洗浄可溶性澱粉と反応せしめ
、次に煮沸し、そして後でグルコース測定を行うために
一２０℃に冷却した。各新鮮な試料の一部を冷９５チエ
タノール３容量を加えることによシ沈澱せしめ、そして
−夜装置し、そして４℃にて５分間、２０００×Ｇで遠
心分離することにより沈澱を集めた。エタノール上清中
に懸濁して残留している小粒状物を回収するために上清
試料を再遠心分離する必要があった。ペレットを乾燥し
、そして次に５０ ｍＭ Ｔｒｉｍ 、 ｐＨ７，４−
１０ｍＭＥＤＴＡに再懸濁しもとの容量の半分にした。
、次に煮沸し、そして後でグルコース測定を行うために
一２０℃に冷却した。各新鮮な試料の一部を冷９５チエ
タノール３容量を加えることによシ沈澱せしめ、そして
−夜装置し、そして４℃にて５分間、２０００×Ｇで遠
心分離することにより沈澱を集めた。エタノール上清中
に懸濁して残留している小粒状物を回収するために上清
試料を再遠心分離する必要があった。ペレットを乾燥し
、そして次に５０ ｍＭ Ｔｒｉｍ 、 ｐＨ７，４−
１０ｍＭＥＤＴＡに再懸濁しもとの容量の半分にした。
但し再懸濁した上清試料はもとの容量の２０分の１とし
た。これらのエタノール沈澱試料を洗浄可溶性澱粉と反
応せしめ、そして煮沸し、そして新鮮試料と共に測定す
るために一２０℃に凍結した。
た。これらのエタノール沈澱試料を洗浄可溶性澱粉と反
応せしめ、そして煮沸し、そして新鮮試料と共に測定す
るために一２０℃に凍結した。
無傷のアジド処理プロトプラストを、１Ｍソルビトール
−０，５％の洗浄澱粉、及び２００μｌのプロトプラス
トを含有する反応混合物中で測定した。
−０，５％の洗浄澱粉、及び２００μｌのプロトプラス
トを含有する反応混合物中で測定した。
これらの混合物を３７℃にて３０分間インキエペートシ
、次に５００ＸＧで遠心分離し、そして上清を濾過し、
次に煮沸し、そして測定し又は−２０℃にて貯蔵した。
、次に５００ＸＧで遠心分離し、そして上清を濾過し、
次に煮沸し、そして測定し又は−２０℃にて貯蔵した。
これらの測定によシ、反応混合物が幾らかの残存グルコ
ースを含有すること、及びプロトプラストが０、インキ
ュベーション中に混合物中のグルコースの量を減少せし
めることが明らかになった。溶解したプロトプラストを
同じ混合物中にインキュベートした場合、プロトシラス
トが無傷である場合に比べてより多くのグルコースが使
用された。グルコアミラーゼプラスミドを担持する菌株
についての値はグルコアミラーゼＤＮＡ挿入部を有しな
い同じプラスミドを担持する菌株についてのそれと同様
であり、膜に結合しているグルコアミラーゼ活性は、存
在するとしても非常に少ないことが示唆された。
ースを含有すること、及びプロトプラストが０、インキ
ュベーション中に混合物中のグルコースの量を減少せし
めることが明らかになった。溶解したプロトプラストを
同じ混合物中にインキュベートした場合、プロトシラス
トが無傷である場合に比べてより多くのグルコースが使
用された。グルコアミラーゼプラスミドを担持する菌株
についての値はグルコアミラーゼＤＮＡ挿入部を有しな
い同じプラスミドを担持する菌株についてのそれと同様
であり、膜に結合しているグルコアミラーゼ活性は、存
在するとしても非常に少ないことが示唆された。
新しく分画した試料を測定し、そして細胞内試料が測定
するのに高すぎる残存グルコースレベルを有することが
見出された。ｐＧＡＣ９で形質転換された細胞及びｐＡ
ｃｌで形質転換された細胞からの膜結合試料及び間質試
料はいずれも可溶性澱粉から検出できるレベルのグルコ
ースを生成せしめなかった。ｐＧＡＣ９で形質転換した
酵母からの上清試料は、約２２ユニツト／ｌのグルコア
ミラーゼ活性を示し、他方ｐＡｃ１で形質転換した酵母
からの試料はグルコアミラーゼ活性を示さなかった。ｐ
Ａｃｌで形質転換した酵母からのエタノール沈澱試料は
無視し得る程度（Ｏ，ＯＳユニット／ｌ以下）のグルコ
アミラーゼ活性を示し、又は全く示さなかった。ｐ Ｇ
ＡＣ９で形質転換した酵母からのエタノール沈澱試料は
０．１５ユニツト／ｌ又はこれより高いグルコアミラー
ゼ活性を示した。上清試料が全グルコアミラーゼ活性の
９０％以上を含有し、そして細胞内試料、膜結合試料及
び間質試料は、試料によシ全活性の１〜４チを含有して
いた。従ってグルコアミラーゼ酵素のほとんどが細胞外
培地に分泌される。
するのに高すぎる残存グルコースレベルを有することが
見出された。ｐＧＡＣ９で形質転換された細胞及びｐＡ
ｃｌで形質転換された細胞からの膜結合試料及び間質試
料はいずれも可溶性澱粉から検出できるレベルのグルコ
ースを生成せしめなかった。ｐＧＡＣ９で形質転換した
酵母からの上清試料は、約２２ユニツト／ｌのグルコア
ミラーゼ活性を示し、他方ｐＡｃ１で形質転換した酵母
からの試料はグルコアミラーゼ活性を示さなかった。ｐ
Ａｃｌで形質転換した酵母からのエタノール沈澱試料は
無視し得る程度（Ｏ，ＯＳユニット／ｌ以下）のグルコ
アミラーゼ活性を示し、又は全く示さなかった。ｐ Ｇ
ＡＣ９で形質転換した酵母からのエタノール沈澱試料は
０．１５ユニツト／ｌ又はこれより高いグルコアミラー
ゼ活性を示した。上清試料が全グルコアミラーゼ活性の
９０％以上を含有し、そして細胞内試料、膜結合試料及
び間質試料は、試料によシ全活性の１〜４チを含有して
いた。従ってグルコアミラーゼ酵素のほとんどが細胞外
培地に分泌される。
以下令ｔ′Ｊ
Ｅ、１０７発酵槽における酵母からの組換グル特徴付け
るために十分なグルコアミラーゼを製造するために、唯
一の炭素源としてグルコース全含有する最少培地におい
て、ｐＧＡｃ９’ｉ含有する酵母Ｃ４６８株の１０１発
酵を行った。１００ｄの種母を最少培地中で６８０ ｎ
ｍにおける光学濃度（ＯＤ６８ｏ）が６になるまで増殖
せしめ、そして発酵槽に加えた。０Ｄ６８ｏが１０に達
するまで、発酵槽を好気的回分発酵として運転し、そし
てグルコースのフィード全開始した。０Ｄ６８ｏが約３
０になるまでグルコースフィードを継続した後フィード
全停止し、そして残存グルコースを消費せしめた。
るために十分なグルコアミラーゼを製造するために、唯
一の炭素源としてグルコース全含有する最少培地におい
て、ｐＧＡｃ９’ｉ含有する酵母Ｃ４６８株の１０１発
酵を行った。１００ｄの種母を最少培地中で６８０ ｎ
ｍにおける光学濃度（ＯＤ６８ｏ）が６になるまで増殖
せしめ、そして発酵槽に加えた。０Ｄ６８ｏが１０に達
するまで、発酵槽を好気的回分発酵として運転し、そし
てグルコースのフィード全開始した。０Ｄ６８ｏが約３
０になるまでグルコースフィードを継続した後フィード
全停止し、そして残存グルコースを消費せしめた。
全発酵時間は約３２時間であっだ０最終細胞濃度は約１
０ｇ乾物重ｔ／ｌであった。発酵上清液の稀釈した試料
をグルコアミラーゼ活性について測定し、測定データ全
第４表に示す０上清液を、分画分子量１０，０００のア
ミコンホローファイバーコンセントレージョンユニット
（Ａｍｊｃｏｎ ＨｏｌｌｏｗＦｉｂｅｒ Ｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ）ｆ用いて濃縮した。
０ｇ乾物重ｔ／ｌであった。発酵上清液の稀釈した試料
をグルコアミラーゼ活性について測定し、測定データ全
第４表に示す０上清液を、分画分子量１０，０００のア
ミコンホローファイバーコンセントレージョンユニット
（Ａｍｊｃｏｎ ＨｏｌｌｏｗＦｉｂｅｒ Ｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ）ｆ用いて濃縮した。
濃縮した発酵上清液を、濃厚な緩衝液を加えることによ
り ５０ ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，ｓに調整し、そしてＤ
ＥＡＥセファロース（ＣＬ−６Ｂ ）カラムに負荷した
。このカラムを一グラジェント（出発ｐＨ７，５、最終
ｐｉ−１３，０）により溶出した。溶出の状況を第１０
図に示す。カラムからの種々の試料をＳＤＳ −尿素ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によシ分析した。ビオラ
ド銀染色によシ染色したゲルの写真は、濃縮した発酵上
溝液が少数の蛋白質のみを含有していることを示してお
り、これによりグルコアミラーゼは培地に分泌されたの
であって、細胞の溶解により放出されたのではないこと
が証明された。この濃縮された発酵上清液と、同じ容量
のピーク分画とのグルコアミラーゼ活性を比較すること
により、蛋白質純度が相当に上昇したことが示された。
り ５０ ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７，ｓに調整し、そしてＤ
ＥＡＥセファロース（ＣＬ−６Ｂ ）カラムに負荷した
。このカラムを一グラジェント（出発ｐＨ７，５、最終
ｐｉ−１３，０）により溶出した。溶出の状況を第１０
図に示す。カラムからの種々の試料をＳＤＳ −尿素ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によシ分析した。ビオラ
ド銀染色によシ染色したゲルの写真は、濃縮した発酵上
溝液が少数の蛋白質のみを含有していることを示してお
り、これによりグルコアミラーゼは培地に分泌されたの
であって、細胞の溶解により放出されたのではないこと
が証明された。この濃縮された発酵上清液と、同じ容量
のピーク分画とのグルコアミラーゼ活性を比較すること
により、蛋白質純度が相当に上昇したことが示された。
上清蛋白質の２０〜３０チがグルコアミラーゼであり、
ピーク分画においては約８０％がグルコアミラーゼであ
ると評価される０組換グルコアミラーゼは、んアワモリ
グルコアミラーゼよりもわずかに遅い移動度で移動し、
形質転換された酵母によシ生産されたグルコアミラーゼ
も又グリコジル化されていることが示された。
ピーク分画においては約８０％がグルコアミラーゼであ
ると評価される０組換グルコアミラーゼは、んアワモリ
グルコアミラーゼよりもわずかに遅い移動度で移動し、
形質転換された酵母によシ生産されたグルコアミラーゼ
も又グリコジル化されていることが示された。
ピークカラム分画のグルコアミラーゼ活性の測定により
、組換グルコアミラーゼが天然のＡ、アワモリグルコア
ミラーゼに匹敵する比活性、すなわち２５〜５０ユニツ
ト／タヲ有することが示されたＯ 酵母Ｃ４６８／ ｐＧＡＣ９により生産された組換グル
コアミラーゼがグリコジル化されていることが実験によ
シ証明された。Ａ、アワモリグルコアミラーゼ−■及び
グルコアミラーゼ−■、並びに組換グルコアミラーゼの
試料’ｅ、１０％ポリアクリルアミド−８ＤＳゲル中で
、標準法により２レーンずつ電気泳動した。電気泳動の
後、ゲル金切シ離し、ソシてレーン１〜４をクーマシー
ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ）染色によシ
蛋白質について染色し、そしてレーン５〜７を過ヨウ素
酸シッフ染色によシ炭水化物について染色した。この方
法の詳細は文献１８に記載されている。グルコアミラー
ゼ−■（レーン２及び５）、グルコアミラーゼ−■（レ
ーン３及び６）、並びに組換グルコアミラーゼ（レーン
４及び７）の比較を第１１図に示す。これらの蛋白質に
対応するバンドが炭水化物染色についても染色され、こ
のことは組換グルコアミラーゼが酵母によりグリコジル
化されることを示している。
、組換グルコアミラーゼが天然のＡ、アワモリグルコア
ミラーゼに匹敵する比活性、すなわち２５〜５０ユニツ
ト／タヲ有することが示されたＯ 酵母Ｃ４６８／ ｐＧＡＣ９により生産された組換グル
コアミラーゼがグリコジル化されていることが実験によ
シ証明された。Ａ、アワモリグルコアミラーゼ−■及び
グルコアミラーゼ−■、並びに組換グルコアミラーゼの
試料’ｅ、１０％ポリアクリルアミド−８ＤＳゲル中で
、標準法により２レーンずつ電気泳動した。電気泳動の
後、ゲル金切シ離し、ソシてレーン１〜４をクーマシー
ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ）染色によシ
蛋白質について染色し、そしてレーン５〜７を過ヨウ素
酸シッフ染色によシ炭水化物について染色した。この方
法の詳細は文献１８に記載されている。グルコアミラー
ゼ−■（レーン２及び５）、グルコアミラーゼ−■（レ
ーン３及び６）、並びに組換グルコアミラーゼ（レーン
４及び７）の比較を第１１図に示す。これらの蛋白質に
対応するバンドが炭水化物染色についても染色され、こ
のことは組換グルコアミラーゼが酵母によりグリコジル
化されることを示している。
例３．形質転換された酵母によるアルコールの製造
ｐＧＡＣ９’ｉ金含有る酵母０４６８株及びｐＡｃｌ
ｉ含有する酵母０４６８株（対照）を、次の組成を有す
る培地５０ｍＪ中に接種した。
ｉ含有する酵母０４６８株（対照）を、次の組成を有す
る培地５０ｍＪ中に接種した。
以下仝白
コハク酸 １１．８１Ｊ
Ｈ３ＰＯ４０，５８、！ｉ’
Ｈ２ＳＯ４０，３１ｇ
ＫＣＩ ０．３７ｇ
ＮａＣ１５８，４■
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２００，２ｇ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ１，７”ｉｉ’
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，２５ｍ９
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０１，４４Ｊｎ９
ＣｏＣ１２・６Ｈ２０１，１９１ｒＱ
Ｎａ２Ｍｏ０４ ・２Ｈ２０１，２１りＨ３ＢＯｓ ３
．０９１ダ ＣａＣｌ２・２Ｈ２ｏ １４．７ｍ９ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１１，１ｍ９ ヒスチジン ４０ダ 洗浄可溶性澱粉（→ １００ｇ 水を加えて１）にする。
．０９１ダ ＣａＣｌ２・２Ｈ２ｏ １４．７ｍ９ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１１，１ｍ９ ヒスチジン ４０ダ 洗浄可溶性澱粉（→ １００ｇ 水を加えて１）にする。
注；（＊）澱粉’ｅ７０％エタノール中で３回洗浄する
ことによシ低分子炭水化物全除去した。次に沈澱を乾燥
した。しかし若干のアルコールと水は残留していた。
ことによシ低分子炭水化物全除去した。次に沈澱を乾燥
した。しかし若干のアルコールと水は残留していた。
フラスコへの酸素の流入を制限するための空気制限装置
を装着した２５０ゴのフラスコ中で発酵を行った。フラ
スコを３２℃でインキュベートし、そして２００ ｒｐ
ｍで７日間振とうした。
を装着した２５０ゴのフラスコ中で発酵を行った。フラ
スコを３２℃でインキュベートし、そして２００ ｒｐ
ｍで７日間振とうした。
各フラスコのエタノール含量をガスクロマトグラフィー
により評価した。Ｃ４６８／ ｐＧＡＣ９培養物は２３
．４ｇ／ｌのエタノールを含有し、対照Ｃ４６８／ ｐ
Ａｃ１培養物は４．５ｇ／ｌのエタノールを含有してい
た。この結果は、Ｃ４６８／ ｐＧＡＣ９によるグルコ
アミラーゼの生産によシ、この菌株が可溶性澱粉をグル
コースに転換し、そして次にこのグルコース全エタノー
ルに発酵することが可能であることを示している。
により評価した。Ｃ４６８／ ｐＧＡＣ９培養物は２３
．４ｇ／ｌのエタノールを含有し、対照Ｃ４６８／ ｐ
Ａｃ１培養物は４．５ｇ／ｌのエタノールを含有してい
た。この結果は、Ｃ４６８／ ｐＧＡＣ９によるグルコ
アミラーゼの生産によシ、この菌株が可溶性澱粉をグル
コースに転換し、そして次にこのグルコース全エタノー
ルに発酵することが可能であることを示している。
メ
グルコアミラーゼ遺伝子全Ｅ、コリ中で発現せしめるた
めに、５′非翻訳領域ヲ、斗已思中での転写及び翻訳に
さらに適合するように変形した。詳しくは、ＡＴＧ開始
コドンから３２ ｂｐ上流に形成されているＨｌｎｄＩ
［１部位と該ＡＴＧコドンとの間の２７ ｂｐを、イン
トロンの除去に関して例２Ｂにおいて記載した方法を用
いるオリゴヌクレオチド変異形成によシ除去した。除去
すべき領域の５′側の１２ｂｐ及び３′側の１１ ｂｐ
と相同であるオリゴヌクレオチドは次の配列を有する０ ５’ ＧＡＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＴＣＧＴＴＣ
ＣＧ ３’この領域を除去した点を除き、最終旦罰ｄｌ
ｌカセットは例２における酵母発現ベクターの構成と同
じである。
めに、５′非翻訳領域ヲ、斗已思中での転写及び翻訳に
さらに適合するように変形した。詳しくは、ＡＴＧ開始
コドンから３２ ｂｐ上流に形成されているＨｌｎｄＩ
［１部位と該ＡＴＧコドンとの間の２７ ｂｐを、イン
トロンの除去に関して例２Ｂにおいて記載した方法を用
いるオリゴヌクレオチド変異形成によシ除去した。除去
すべき領域の５′側の１２ｂｐ及び３′側の１１ ｂｐ
と相同であるオリゴヌクレオチドは次の配列を有する０ ５’ ＧＡＧＣＣＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＴＣＧＴＴＣ
ＣＧ ３’この領域を除去した点を除き、最終旦罰ｄｌ
ｌカセットは例２における酵母発現ベクターの構成と同
じである。
！、シ発現ベクターｐｔｒｐ３ ｆ、ｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲＩ一旦１ａｌ領域（座標−３〜２８、文献１６ａ
参照） ’ｋ、Ｅ、旦）リプトフアンプロモーター及び
リボゾーム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａ Ｉ
断片で置き換えた。この領域のヌクレオチド配列を第５
表に示す。旦ｅｏＲＩ 、Ｃ１ａｌ及びＨｌｎｄ［［部
位が第（１０２） この例において前記したグルコアミラーゼ遺伝子のＨ１
ｎｄｎＩカセットを、ｐｔｒｐ３のＨ４ｎｄ１１１部位
にクローニングした。形質転換体を、グルコアミラーゼ
遺伝子がプロモーターと同じ方向にあるクルコクローン
を同定するためにマツピングするＤＮＡ 制限断片によ
シスクリーニングした。このクローンの１つをさらに検
討するために選択しｐＧＣ２４とした。
ｃｏＲＩ一旦１ａｌ領域（座標−３〜２８、文献１６ａ
参照） ’ｋ、Ｅ、旦）リプトフアンプロモーター及び
リボゾーム結合部位を含有するＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａ Ｉ
断片で置き換えた。この領域のヌクレオチド配列を第５
表に示す。旦ｅｏＲＩ 、Ｃ１ａｌ及びＨｌｎｄ［［部
位が第（１０２） この例において前記したグルコアミラーゼ遺伝子のＨ１
ｎｄｎＩカセットを、ｐｔｒｐ３のＨ４ｎｄ１１１部位
にクローニングした。形質転換体を、グルコアミラーゼ
遺伝子がプロモーターと同じ方向にあるクルコクローン
を同定するためにマツピングするＤＮＡ 制限断片によ
シスクリーニングした。このクローンの１つをさらに検
討するために選択しｐＧＣ２４とした。
ｔｒｐプロモーターを用いるグルコアミラーゼ遺伝子の
発現を試験するために、プラスミドｐＧＣ２４を月、已
」宿主ＭＨ７０に形質転換した。この宿主はｇ、三ｌゼ
ネティックストックセンター、エール大学（収集番号Ｃ
Ｇ５Ｃ６１５３）がう入手Ｌ７’ｃ。ＭＨ７０ハｍａ
ｌ−Ｅ、三Ｊ菌株であシ、この遺伝子型はａｒａＤ１３
９、Δ（ａｒｇＦ−１ａｃ ） ２０５、ｆｌｂＢ５３
０１、ｐ ｔ ５Ｆ２５、ｒｅｌＡｌ？、ｒｐｓＬ１５
０ ＳｍａｌＱ６３、ｂｇｌＲ１５、ｄｅｅｃ１？であ
る。匹り３変異はアミＣＩマルターゼ遺伝子に存在する
。この遺伝子の変異によ、ｐ、Ｅ、コリはマルトースを
グルコースに加水分解することができなくなる。
発現を試験するために、プラスミドｐＧＣ２４を月、已
」宿主ＭＨ７０に形質転換した。この宿主はｇ、三ｌゼ
ネティックストックセンター、エール大学（収集番号Ｃ
Ｇ５Ｃ６１５３）がう入手Ｌ７’ｃ。ＭＨ７０ハｍａ
ｌ−Ｅ、三Ｊ菌株であシ、この遺伝子型はａｒａＤ１３
９、Δ（ａｒｇＦ−１ａｃ ） ２０５、ｆｌｂＢ５３
０１、ｐ ｔ ５Ｆ２５、ｒｅｌＡｌ？、ｒｐｓＬ１５
０ ＳｍａｌＱ６３、ｂｇｌＲ１５、ｄｅｅｃ１？であ
る。匹り３変異はアミＣＩマルターゼ遺伝子に存在する
。この遺伝子の変異によ、ｐ、Ｅ、コリはマルトースを
グルコースに加水分解することができなくなる。
ｐＣＧ２４により形質転換された皿７０はＡＴＣＣ寄託
Ｎｏ３９．５３７として、１９８３年１２月１６日にＡ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎに寄託された。
Ｎｏ３９．５３７として、１９８３年１２月１６日にＡ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎに寄託された。
ＭＨ７ｏ／ｐａｃ２４形質転換体及び菌株ＭＨ７０を、
５０ｒｎ９／ｌのトリプトファンを含有する次の培地５
ｄ中で３７℃、２００ ｒｐｍで増殖せしめた。
５０ｒｎ９／ｌのトリプトファンを含有する次の培地５
ｄ中で３７℃、２００ ｒｐｍで増殖せしめた。
２５Ｘボンネル−フォーゲル塩 ４０Ｍアンピシリン
５０ダ グルコース ２ｇ ビタミンＢｌ １０ダ カザミノ酸 ２ｇ 水１０００１ｒｌＶＣスｂ。
５０ダ グルコース ２ｇ ビタミンＢｌ １０ダ カザミノ酸 ２ｇ 水１０００１ｒｌＶＣスｂ。
２５ＸホンネルーフオーゲノｌＪｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＸＶＩＩＡ：５）：ガラユ
蒸留水 ６７０ゴ ＭｇＳＯ４・７に２０ ５ ｇ クエン酸・Ｈ２Ｏ５０ｇ Ｋ２ＨＰＯ４２５０ｇ ＮａＮＨ４ＨＰＯ＋ ・４ｆ（２０８７，５ｇガラス蒸
留水 １０００ｒｎｌにする。
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＸＶＩＩＡ：５）：ガラユ
蒸留水 ６７０ゴ ＭｇＳＯ４・７に２０ ５ ｇ クエン酸・Ｈ２Ｏ５０ｇ Ｋ２ＨＰＯ４２５０ｇ ＮａＮＨ４ＨＰＯ＋ ・４ｆ（２０８７，５ｇガラス蒸
留水 １０００ｒｎｌにする。
−夜インキユベートした後、３０００ＸＧにて５分間遠
心分離することによシ細胞を採取し、そしてトリプトフ
ァンを含有しない上記の培地５ｍＡ！に再懸濁した。次
に、細胞を、トリプトファンを含有しない２０′ｆｎｌ
の培地中でＡ６６ｏが０．０５〜０．０７になるまで予
備培養した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍにてＡ４６
０が０．０５になるまで増殖せしめた。１０ｍ１の培養
物から上記のようにして遠心分離によシ細胞を採取し、
そしてＩＴＬｌのソニケート用緩衝液（１５チシユーク
ロース、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，４０ｍＭ Ｋ
ＤＴＡ ）に再懸濁した。この試料をカップソニケータ
−（Ｓｏｎｉｆｌｅｒ Ｃｅ１ｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ
＋５０％ Ｂｒｏｎａｏｎ ５ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ
Ｃｏ、）中で３分間にわたって超音波処理した。細胞溶
解物上Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で５
分間遠心分離し、そして透明な上清液金取シ出して分析
した。透明な溶解物をポリアクリルアミドドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル上で電気泳動し、そして例２
Ｃに記載したウェスタン分析により分析した。分子量約
６９，０００ 、すなわちグリコジル化されていない形
のグルコアミラーゼであると予想される大きさの蛋白質
バンドがＭＨ７０／ ｐＧＣ２４の透明溶解物中に検出
されたが、ＭＨ７０溶解物中には検出されなかった。
心分離することによシ細胞を採取し、そしてトリプトフ
ァンを含有しない上記の培地５ｍＡ！に再懸濁した。次
に、細胞を、トリプトファンを含有しない２０′ｆｎｌ
の培地中でＡ６６ｏが０．０５〜０．０７になるまで予
備培養した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍにてＡ４６
０が０．０５になるまで増殖せしめた。１０ｍ１の培養
物から上記のようにして遠心分離によシ細胞を採取し、
そしてＩＴＬｌのソニケート用緩衝液（１５チシユーク
ロース、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，４０ｍＭ Ｋ
ＤＴＡ ）に再懸濁した。この試料をカップソニケータ
−（Ｓｏｎｉｆｌｅｒ Ｃｅ１ｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ
＋５０％ Ｂｒｏｎａｏｎ ５ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ
Ｃｏ、）中で３分間にわたって超音波処理した。細胞溶
解物上Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で５
分間遠心分離し、そして透明な上清液金取シ出して分析
した。透明な溶解物をポリアクリルアミドドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル上で電気泳動し、そして例２
Ｃに記載したウェスタン分析により分析した。分子量約
６９，０００ 、すなわちグリコジル化されていない形
のグルコアミラーゼであると予想される大きさの蛋白質
バンドがＭＨ７０／ ｐＧＣ２４の透明溶解物中に検出
されたが、ＭＨ７０溶解物中には検出されなかった。
活性グルコアミラーゼ酵素が王、三」中で生産されるこ
とをさらに証明するために、ＭＨ７０／ｐＧｃ２４及び
ＭＨ７０ｋ １ ％のマルトースｔｔ有するマツコンキ
ー（ＪａｃＣｏｎｋｅｙ ）寒天（ディフコ社、デトロ
イト、ＭＩ４８２３２）プレートに塗布した。マルトー
スの発酵によυ培地中に−の変化が生じ、このことはコ
ロニーにおける無色から赤色への変化にょシ示される。
とをさらに証明するために、ＭＨ７０／ｐＧｃ２４及び
ＭＨ７０ｋ １ ％のマルトースｔｔ有するマツコンキ
ー（ＪａｃＣｏｎｋｅｙ ）寒天（ディフコ社、デトロ
イト、ＭＩ４８２３２）プレートに塗布した。マルトー
スの発酵によυ培地中に−の変化が生じ、このことはコ
ロニーにおける無色から赤色への変化にょシ示される。
発酵しないコロニーは無色のままであるＯＭＨ７０はｍ
ａｌＱ−であるからこのコロニーは無色であった。Ｍｆ
（７０／ ｐＧＣ２４におけるＡ、アワモリグルコアミ
ラーゼの発現にょシマルトースのグルコースへの加水分
解が生じ、そしてこのグルコースの発酵により赤色が生
じた。従って、Ｅ、コリ中で活性グルコアミラーゼが生
産される。
ａｌＱ−であるからこのコロニーは無色であった。Ｍｆ
（７０／ ｐＧＣ２４におけるＡ、アワモリグルコアミ
ラーゼの発現にょシマルトースのグルコースへの加水分
解が生じ、そしてこのグルコースの発酵により赤色が生
じた。従って、Ｅ、コリ中で活性グルコアミラーゼが生
産される。
ここにこの発明の好ましい態様を記載したが、この発明
の精神全逸脱することなく種々の変法を行うことができ
よう。例えば、すべての例は宿主中での自律複製を示し
ているが、文献ＩＣ及び１ｄに記載されているように、
遺伝子及びプロモーターが染色体に組込まれる、宿主の
組込み形質転換を用いることも可能である。
の精神全逸脱することなく種々の変法を行うことができ
よう。例えば、すべての例は宿主中での自律複製を示し
ているが、文献ＩＣ及び１ｄに記載されているように、
遺伝子及びプロモーターが染色体に組込まれる、宿主の
組込み形質転換を用いることも可能である。
文献
この明細書において番号で示した文献は次の通シである
・ １、Ｌｉｎｅｂａｃｋ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｃｅｒｅａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
・ １、Ｌｉｎｅｂａｃｋ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｃｅｒｅａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
４９：２８３（１９７２）。
１ａ、 ５ｖｅｎｓｓｏｎ＋ｅｔ ａｌ、＋Ｃａｒｌｓ
ｂｅｒ Ｒｅａ、Ｃｏｒｒｍｕｎ、＋４７：５５（１９
８２）。
ｂｅｒ Ｒｅａ、Ｃｏｒｒｍｕｎ、＋４７：５５（１９
８２）。
ｌｂ、 ５ｖｅｎｓｓｏｎ＋ ａｔ ａｌ−＋ Ａｂｓ
ｔｒａｃｔ ＩＶ−２７＋ＸＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＳｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ＋Ｖａｎｅｏｕｖｅｒ、Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｃｏｌｕ
ｍｂｉａ。
ｔｒａｃｔ ＩＶ−２７＋ＸＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＳｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ＋Ｖａｎｅｏｕｖｅｒ、Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｃｏｌｕ
ｍｂｉａ。
Ａｕｇ、、１９８２゜
ｂｙ ５ｔｒａｔｈｅｒｎ＋ ｅｔ ａｌ−（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ： Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）、ｐ−６０７ｆｆ。
Ｙｏｒｋ： Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２）、ｐ−６０７ｆｆ。
ｌｄ、５ｔｒｕｈｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：３９１（
１９８３）。
１９８３）。
ｌｅ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ ８１３０３１５５６（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
４５５７３ ｄａｔｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙｌｏ、１９
８２）ｔｏ ５ｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
。
ｏｎ ８１３０３１５５６（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
４５５７３ ｄａｔｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙｌｏ、１９
８２）ｔｏ ５ｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
。
２、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ＋ ｅｔ ａｌ−＋ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ−＋ １８：５２９４（１９７９）。
ｅｍ−＋ １８：５２９４（１９７９）。
３、Ｓｅｈｇａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ＋７９：１１１（１９８１）、ａｔ ｐ、１
１７゜４、 Ｐｅｌｈａｍ、ｅｔ ａｌ−＋ Ｅｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
ｏｌｏｇｙ＋７９：１１１（１９８１）、ａｔ ｐ、１
１７゜４、 Ｐｅｌｈａｍ、ｅｔ ａｌ−＋ Ｅｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
６７：２４７（１９７６）。
５、Ｍａｎｉａｔｉｓ＋＋ｅｔ ａｌ−＋ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ＋ ｐｕｂｌ・＋ ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、（１９８２）、ｐｐ、３４
４−３４９゜６、 Ｉｖａｒｉｅ＋ ｅｔ ａｌ−＋
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−＋９７：２４（１９７９）
。
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ＋ ｐｕｂｌ・＋ ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、（１９８２）、ｐｐ、３４
４−３４９゜６、 Ｉｖａｒｉｅ＋ ｅｔ ａｌ−＋
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−＋９７：２４（１９７９）
。
７、Ｃｈａｎｇ、ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２７５
：６１７（１９７８）。
：６１７（１９７８）。
８、 Ｄｏｅｌ ＋ ａｔ ａｌ、＋ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｚ４：３７０１（１９７７）。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｚ４：３７０１（１９７７）。
９、 ８ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌｌ、９
８：５０３（１９７５）。
８：５０３（１９７５）。
１０、Ｓａｎｇｅｒ＋ ｅｔ ａｌ−＋ Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ−８ｃ１．ＵＳＡ＋７４：５４６３（１
９７７）。
ａｔ、Ａｃａｄ−８ｃ１．ＵＳＡ＋７４：５４６３（１
９７７）。
１１、Ｍｅｓｓｉｎｇ＋ ｅｔ ａｌ−＋ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、＋９：３０９（１９８１）。
ｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、＋９：３０９（１９８１）。
１２、Ｍａｘａｍ＋ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
、Ａｃａｄ、Ｓｃ １−ＵＳＡ＋７４：５６０（１９７
７）。
、Ａｃａｄ、Ｓｃ １−ＵＳＡ＋７４：５６０（１９７
７）。
１３、 Ｍｏｕｎｔ＋ Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
ｓ、、１０：４５９（１９８２）。
ｓ、、１０：４５９（１９８２）。
１４、Ｌａｎｇｆｏｒｄ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
８０：１４９６（１９８３）。
１５、 Ｌａｎｇｆｏｒｄ＋ ａｔ ａｌ、、Ｃｅ１ｌ
、 ３３：５１９（１９８３）。
、 ３３：５１９（１９８３）。
１６、Ｈｏ１ｌａｎｄ＋ ａｔ ａｌ、＋ Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、＋２５６：１３８５（１９８１）− １ｏｇｙ、４３ニア７（１９７８）。
ｌ、Ｃｈｅｍ、＋２５６：１３８５（１９８１）− １ｏｇｙ、４３ニア７（１９７８）。
１６ｂ、Ｂｒｏａｃｈ、ａｔ ａｌ−＋ Ｇｅｎｅ＋
８：１２１（１９７９）。
８：１２１（１９７９）。
１６ｃ、Ｂｅａｅｈ＋ ｅｔ ａｌ−＋ Ｎａｔｕｒｅ
＋ ２９０：１４０（１９８１）。
＋ ２９０：１４０（１９８１）。
１７ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ＋ ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、＋２５４：１２，２４０（１９７９）。
、Ｃｈｅｍ、＋２５４：１２，２４０（１９７９）。
１７ｂ、Ｅｒ１ｉｃｈ＋ ｅｔ ａｌ、＋ Ｉｎｆ、ａ
ｎｄ Ｉｍｍ、＋４１：６８３（１９８３）。
ｎｄ Ｉｍｍ、＋４１：６８３（１９８３）。
１８、Ｄｅｗａｌｄ＋ ｅｔ ａｌ−＋ ｉｎ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ ＆ｚｙｍｏｌｏｇｙ＋Ｖｏ１． ＸＸ
ＸＩＬ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＋Ｐａｒｔ Ｂ＋
ｅｄ、ｂｙＦｌｅｌａｃｈｅｒ ａｔ ａｌ、（Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ： ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅａｓ、１９７４
）、ｐ、８７−８８゜
ｈｏｄｓ ｉｎ ＆ｚｙｍｏｌｏｇｙ＋Ｖｏ１． ＸＸ
ＸＩＬ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＋Ｐａｒｔ Ｂ＋
ｅｄ、ｂｙＦｌｅｌａｃｈｅｒ ａｔ ａｌ、（Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ： ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅａｓ、１９７４
）、ｐ、８７−８８゜
第１図は、炭素源としてキンロース又は澱粉金含有する
培地中で増殖した細胞からのＡ、アワモリｍＲＮＡの試
験管内翻訳を示すゲル電気泳動パターンである。 第２Ａ図及び２Ｂ図は、グルコアミラーゼｍＲＮＡ ｋ
同定するゲル電気泳動図である。 第３図は、グルコアミラーゼ遺伝子を含むＡ、アワモリ
ゲノムの制限エンドヌクレアーゼ地図である。 第４図は、グルコアミラーゼｍＲＮＡとバイブリド形成
し、これを選択するのにｐＧＡＲｌが使用されるゲル′
電気泳動パターンである。 第５図は、グルコアミラーゼｍＲＮＡの５’末Ｍ−決定
するためのプライマー延長、及び決定された配列を示す
。 第６図は、ゲノム性グルコアミラーゼ遺伝子を含有する
ＥｃｏＲＩ断片の制限地図を示す。 第７図は、ｐＧＡＣ９のプラスミド地図を示す。 第８図は、ｐＧ（’Ｌｌのプラスミド地図を示す。 第９図は、種々の形質転換された酵母によるベーカーの
澱粉の分解のプレートアッセイを示す。 第１０図は、１０１発酵槽中で組換体酵母により生産さ
れたグルコアミラーゼのＤＥＡ−セファロースクロマト
グラフィーを示す。 第１１図は、蛋白質のゲル電気泳動パターンを示し、レ
ーン１はビオラド高分子蛋白質標準を示すＯ 以下余白 図面の、１う１！（（ 内′Ｕに変更なし） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号優先権主
張 ０１９８坪１２月２０日［相］米国（Ｕ Ｓ）■５
６４０７８［相］１９８シト１２月２０日［相］米国（
ＵＳ）０５６３９４１０発 明 者 マイケル アラン
イ アメリカ合衆国。 ニーズ ドウカールセフ ０発 明 者 デビット ハロウ ゲ アメリカ合衆国
。 ルファンド ドウジェル８フ ０発 明 者 ジエイムズ ヘンリー アメリカ合衆国
。 ミード ランシス ドライ カリフォルニア ９４６０２．オークランストリート
３１３３ カリフォルニア ９４６１１．オークランドライブ ６
２０８ カリフォルニア ９４５６４．ピノール、ツブ２５４０ 手続補正書（自発） 昭和５９年４月２８日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第０１０３６０号 ２、発明の名称 グルコアミラーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタス コーポレイション ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正の対象 （１）明細書の「特許請求の範囲」の欄（２） 明細書
の「発明の詳細な説明」の欄６、補正の内容 （１１特許請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）明細書 ■ 明細書第５３〜５５頁の第１表を別紙の通り補正す
る。 ■ 明細書第６２〜６３頁の第２Ａ表を別紙の通り補正
する。 ７、添付書類の目録 （１） 補正特許請求の範囲 １通（？４ｙ：ｆ、）（
２）補正 第１表 ｌ！ （１４７，ｆＪ、７貫）（３
）補 （２） 明細書の冷力（内容に変更なし） ２、特許請求の範囲 ！ 変形されたＤＮＡ配列において、この配列が菌類グ
ルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしく
は複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされ
ており、天然、合成又は半合成源から誘導されたもので
あり、そして開裂された発現ベクターに正しく連結され
そしてこのベクターにより宿主生物が形質転換された場
合、グルコアミラーゼ酵素活性を有する非天然蛋白質を
発現することができることを特徴とするＤＮＡ配列。 ２、前記ＤＮＡがｃＤＮＡであり、そして前記配列がコ
ードする菌類グルコアミラーゼ蛋白質が工４＜ ｋ ４
ｋ Ｘ ・７７ ％史（７，ｒｚｉ ｌ １ ｕ ｓ
ａｗａｍｏ ｒ ｉ ）種又は７．’１ペルギルス・
ニガー（Ａｓｐ肛担１ｕｓ ｎｊｇｅｒ ｆｌに由来す
る特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ３、前記の禎がＬ／□酌乞乞不・アワモＩＪＮＲＲＬ１
５１２７１であり、そして前記ＤＮＡ配列が５′から３
′の方向に実質上次の配列： 以下４゛ミ白 ＧＣＧ Ａｃｅ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ Ｔ
ＴＧ ＡＧＣＡＡＣＧＡＡ ＧＣＧ ＡＣＣＧＴＧ Ｇ
ＣＴ ＣＧＴＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＴ Ａ
ＡＣＡＴＣＧＧＧ ＧＣＧ ＧＡＣＧＧＴ ＧＣＴ Ｔ
ＧＧ ＧＴＧ ＴＣＧＧＧＣＧＣＧ ＧＡＣＴＣＴ Ｇ
ＧＣＡＴＴ ＧＴＣＧＴＴ ＴＣｒ ＡＧＴ ＣＣＣＡ
ＧＣＡＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣＣＣＧ ＧＡＣＴＡＣＴＴ
ＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧ ＡＣＩ’αに： ＧＡＣＴはＧ
ＧＴ Ｃ１℃ＧＴＣＣＴＣＡＡＧ ＡＣＣＣＴＣＧＴＣ
ＧＡＴ ＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＡＡＴ （Ｋａ ＧＡＴ
ＡＣＣＡＧＴ ＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧ ＴＴＣＡ
ＡＴ ＧＴＣＧＡＴ ＧＡＧ ＡＣＴ ＧＣＣＴＡＣＡ
ＣＴ ＧＧＴ Ｔ（？ｒ ＴＧＧ ＧＧＡＣＧＧ ＣＣ
Ｇ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＣＧ ＧＣＴ
ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＴＧ
ＡＴＣＧＧＣＴｒＣＧＧＧ Ｃｕ ＴＧＧ ＣＴＣＣＴ
Ｔ ＧＡＣＡＡＴ ＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡｃｅ
ＧＣＡＡＣＧ ＧＡＣＡＴＴ ＧＴＴ ’］Ｙ４ ＣＣ
ＣＣｒＣＧＴｒ ＡＧＧ ＡＡＣＧＡＣＣ’ｌ’Ｇ Ｔ
ＣＧ ＴＡＴ ＧＴＧＧＣＴ ＣＡＡ ＴＡＣＴＧＧ
ＡＡＣＣＡＧ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＴ
ＣＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＴＣＡＡＴ ＧＧＣＴＣ
Ｇ ＴＣＴ ＴＴＣ’ＩＴＴ ＡＣＧ Ａ’ＩＴ ＧＣ
Ｔ ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣ’ＩＴＧＴ
ＣＧＡＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＣＣＴｒＣＧＣＧ ＡＣ
Ｇ ＧＣＣＧＴＣＧＧＣＴＣＧ ＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴ
ＧＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＣｒ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＣ
ＣＧＡＡ ＡＴｒ ＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧ ＣＡＧ
ＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴ
Ｔ ＣＴＧ ＧＣＣんｆ ＴＴＣＧＡＴ ＡＧＣＡＧＣ
ＣＧＴＴＣＣＧＧＣＡＡＧ ＧＡＣＧＣＡ ＡＡＣＡＣ
ＣＣＴＣＣ’ｒＧＧＧＡ ＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴ
ＴＴＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣＡ ＴＧＣＧ
ＡＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＣＣＣＴＧＣＴ
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ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＡＣＴＣＴ ＴＴ
ＣＣＧＣＴＣＡ ＡＴＣＴＡＴ ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧ
ＡＴ ＧＧＴ ＣＴＣＡＧＴ ＧＡＣＡＧＣＧＡＧ Ｇ
ＣＴ ＧＴＴＧＣＧ ＧＴＧ ＧＧＴ ｃＧＧＴＡＣＣ
ＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧ
ＧＣＡＡＣＣＣＧ（２） （１） ＴＧＧ ＴＴＣＣＴＧ ＴＧＣＡＣＣＴＴＧ ＧＣＴ
ＧＣＣＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＴＡＣＧＡＴ
ＧＣＴＣＴＡ ＴＡＣＣＡａ ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＧ
ＣＡＧ ＧＧＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣＡ
ＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＣＴＴＣＴ
ｒＣＡＡＧ ＧＣＡ Ｃ１℃ＴＡＣＡＧＣＧＡＴ ＧＣ
Ｔ ＧＣＡ ＡαＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴ ＴＣＧ
ＴＣＣＡＧＴ ＴＣＧ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＧＴ ＡＧ
ＣＡＴｒ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣＧＴＧ ＡＡＧ Ａ
ＣＴ ＴＴＣＧＣＣＧＡＴ ＧＧＣＴｖｒＣＧＴＣＴＣ
Ｔ ＡＴｒ ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣＧＣＣＧ
ＣＡ ＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧ ＴＣＣＧＡＧ
ＣＡＡ ＴＡＣＧＡＣＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴＧＧＣ
ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣＧＣＴ ＣＧＣＧＡＣ
ＣＩ’Ｇ ＡＣＣＴＧＧ Ｔ（’ｒ ＴＡＴ ＧＣＴ
ＧαＣＴＧ Ｃ５ＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴ Ｃ
ＧＴ ＡＡＣＧＴＣＧＴＧ ＣＣＴ ＴＣＣαｒ ’Ｔ
ＣＴＴＧＧ ＧＧＣＧＡＧ ＡＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧ
ＣＡＧＣＧＴＧ ＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴ ＧＣＧ
ＧＣＣＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣＣＡＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ
ＴＡＣＡＧＣＡＧＴ ＧＴＧ ＡＣＩ’ ＧＴＣＡＣＣ
ＴＣＧ ＴＧＧＣＣＧ ＡＧＴ ＡＴＣＧＴＧ ＧＣＴ
ＡＣＴ ＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＴ ＡＣＧ ＡＣＧ
ＧＣＴ ＡＣＣＣＣＣＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣＧＧＣ
ＡＧＣＧＴＧ ＡＣＣＴＣＧ ＡＣＣＡＧＣＡＡＧ Ａ
ＣＣＡＣＣＧＣＧ ＡＣＴＧＣｒ ＡＧＣＡＡＧ ＡＣ
ＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＣ
ＣＴＣＣＴＧＴ ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣＧＴ
Ｇ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣＧＡＴ ＣＴＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＡ
Ｇ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＴＣＧＧＡ ＴＣＧ
ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＧＴＧＡＣＴＧＧ
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ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＣＣＣＡＡＣＣＧＡ ＧＡＡ
ＴＡＣＡＣＣＧ’ｌ’ｒ ＣＣＴＣＡＧ ＧＣＧ Ｔ
ＧＣＧＧＡ ＡＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＧ
ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣＡＣＣＴＧＧα℃を有する特許
請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ４、ＤＮＡ発現ベクターにおいて、該ベクターが宿主中
で機能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ配列
を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌
類グルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個も
しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位に
されており、天然、合成又は半合成源から誘導されたも
のであり、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発
現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するよう
に前記プロモーター断片に対して方向ずけられているこ
とを特徴とする発現ベクター。 ５、前記の宿主生物が細菌、ウィルス又は酵母に由来す
る特許請求の範囲第４項記載のベクター。 ５項記載のベクター。 ７、前記宿主生物が酵母である特許請求の範囲第５項記
載のベクター。 属の種である特許請求の範囲第７項記載のベクター０ ９、前記配列がコードする菌類グルコアミラーゼ蛋白質
がアスペルギルス・アワモリ種又はアスペルギルス・ニ
ガ一種に由来する特許請求の範囲第４項記載のベクター
。 １０、 ＤＮＡ発現ベクターにおいて、該ベクターが宿
主中で機能するプロモーター断片、及び変形されたＤＮ
Ａ配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配
列が： 以下余白 ＧＣＧ ＡＣＣＴＴＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＴ
Ｇ ＡＧＣＡＡＣＧＡＡ ＧＣＧ ＡＣＣＧＴＧ ＧＣ
Ｔ ＣＧＴＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＴ ＡＡ
ＣＡＴＣＧＧＧＧＣＧ ＧＡＣＧＧＴ ＧＣＴ ＴＧＧ
ＧＴＧ ＴＣＧａａｃ ＧＣＧＧＡＣＴＣＴ ａａｃ
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ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣＡ ＴＧＣＧＡＣ
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ＣＣＧ ＣＧＣＧＣＧ ＣＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡ
Ｇ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＡＣＴＣＴ ＴＴＣＣ
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ＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣＡＣＧ ＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧ
ＣＡＡＣＣＣＧ（６） （５） Ｔ（ＥＧ ＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＧ ＧＣＴ
ＧＣＣＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＴＡＣＧＡＴ
ＧＣＴＣＴＡ ＴＡＣＣＡＧ ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＧ
ＣＡＧ ＧＧＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣＡ
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ＣＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴ Ｔ
ＣＧ ＴＣＣＡＧＴ ＴＣＧＡＣＴ ＴＡＴ ＡＧＴ
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ＡＧ ＣＡＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴＧＧ
ＣＧＡＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣＧＣＴ ＣＧＣＧＡ
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Ｔ ＣＧＴ ＡＡＣＣＴＣＧＴＧＣＣＴ ＴＣＣＧＣＴ
ＴＣＴπ℃αＸ： ＧＡＧ ＡＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡ
ＧＣＡＧＣＧＴＧ ＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴ ＧＣＧ
ＧＣＣＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣＣＡＴｒ ＧＧＴ ＡＣ
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ＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＣＡ Ａ
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ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣＧＡＴ ＣＴ
Ｇ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣ
ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＴＣＧＧＡ Ｔ
ＣＧ ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＧ Ｃ１℃απＧＡＣＴＧＧ
ＧＡＡ ＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＴＡ ＧＣＴ
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ＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＣＱ ＣＴＣＴＧＧ ＴＡＴ
ＧＴＣＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ （ＴＧαｐＧαＧＧＴ
ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＴｒ ＧＡＧ ＴＡＣＡＡＧ Ｔ
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ＧＡＣＴＣＣＧＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＧ
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Ｇ ＴＣＧ ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＴ
ＧＡＣＡＣＣＴＧＧα追で表わされ、そして前記ＤＮＡ
セグメントが、宿主中で発現されて非天然グルコアミラ
ーゼ蛋白質を生産するように前記プロモーターに対して
方向ずけられていることを特徴とする特許請求の範囲第
４項記載のベクター。 １１、シラスミドｐＧＡＣ９である特許請求の範囲第４
項記載のベクター。 １２、発現ベクターによシ形質転換された宿主生物にお
いて、該発現ベクターが宿主中で機能するプロモーター
断片及び変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメン
トを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グルコアミラーゼ蛋白
質をコードし、又はその１個もしくは複数個の塩基が置
換、欠失、挿入もしくは逆位にされておシ、天然、合成
又は半合成源から誘導されたものであり、そして前記Ｄ
ＮＡセグメントが、宿主中で発現されて非天然グルコア
ミラーゼ蛋白質を生産するように前記プロモーター断片
に対して方向ずけられていることを特徴とする宿主生物
。 １３、細菌、ウィルス、又は酵母である特許請求の範囲
第１２項記載の宿主生物。 １４．エセリヒア・コリである特許請求の範囲第１３項
記載の宿主生物。 １５、酵母である特許請求の範囲第１３項記載の宿主生
物。 １６、前記酵母がサツカロミセス属の種である特許請求
の範囲第１５項記載の宿主生物。 １７、プラスミドｐＧＡＣ９によυ形質転換された酵母
である特許請求の範囲第１２項記載の宿主生物。 １８、前記配量がＣ４６８株である特許請求の範囲第１
７項記載の宿主生物。 １９、酵母中で機能するプロモーター断片、実質上次の
アミノ酸配列： Ｍ［！Ｔ ＥＩＥ！ＲＦＨＦｉ ＡＲＧ ＥＩＥＲＬＷ
Ｔ ＩＪＵ ＡＬＡ ＩＪＴ ＳＥＲＧＬＹ ＩＪＪ
ＶＡＬ ＯＹＳ ＴＨＲＧＬＹ ＬＥＵ ＡＬＡ ａ
ＶＡＬ ＩＩＩＪ！ｌｉ ＳＩＲＬＹＳＡＲＧを有する
シグナル配列、及び蛋白質性物質をコードするＤＮＡセ
グメントを含んで成るＤＮＡ発現ベクターによシ形質転
換された宿主生物を増殖せしめることを特徴とし、そし
て前記蛋白質性物質が、通常の宿主細胞から分泌される
間に通常切断される疎水性シグナル配列を伴って通常の
宿主中で合成される細胞蛋白質であることを特徴とする
、蛋白質性物質を細胞外に分泌せしめる方法。 ２０、蛋白質性物質がグルコアミラーゼである特許請求
の範囲第１９項記載の方法。 ２１、 ｌ＠地中で宿主生物を増殖せしめることを特徴
トスるグルコアミラーゼの製造方法であって、該宿主生
物が、次の発現ベクターすなわち宿主中で機能するプロ
モーター断片及び変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ
セグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グルコアミラ
ーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしくは複数個の
塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされており、天
然、合成又は半合成源から誘導されたものであシ、そし
て前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発現されて非天然
グルコアミラーゼ蛋白質を生産するように前記プロモー
ター断片に対して方向ずけられている発現ベクターによ
シ形質転換されている、製造方法。 ２２、澱粉、又はオリゴサツカライドを含有する澱粉加
水分解物の糖化方法において、該澱粉又はオリゴサツカ
ライドを含有する澱粉加水分解物をグルコアミラーゼ剤
によシ処理し、該グルコアミラーゼが、ベクターすなわ
ち宿主中で機能するプロモーター断片及び変形されたＤ
ＮＡ配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ
配列が菌類グリコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はそ
の１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしく
は逆位にされておシ、天然、合成又は半合成源から誘導
されたものであシ、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿
主中で発現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産
するように前記プロモーター断片に対して方向ずけられ
ている発現ベクターによし形質転換された宿主生物によ
り生産されたものであることを特徴とする方法。 ２３、糖化と発酵とを同時に行うことによるアルコール
の製造方法において、次のベクターすなわち宿主中で機
能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ配列を有
するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グ
ルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしく
は複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされ
ておシ、天然、合成又は半合成源から誘導されたもので
あシ、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発現さ
れて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するように前
記プロモーター断片に対して方向ずけられている発現ベ
クターによシ形質転換された宿主生物を、グルコアミラ
ーゼの基質である非発酵性炭素源に増殖せしめることを
特徴とする方法。 ２４、宿主が酵母である特許請求の範囲第２１項〜第２
３項のいずれか１項に記載の方法。 ２５、宿主が酵母である特許請求の範囲第１９項記載の
方法。 ２６、形質転換された宿主中の次のベクターすなわち宿
主中で機能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ
配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列
が菌類グルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１
個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆
位されており、天然、合成又は半合成源から誘導された
ものであり、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で
発現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するよ
うに前記プロモーター断片に対して方向ずけられている
発現ベクター中の該変形されたＤＮＡ配列の発現によシ
生産されたグルコシダーゼ活性を有する酵素。 ２７、次の式：ビＳ正亜刊Ｓ玉」Ｈ団島ＩＪＪ ６１１
！ＲＧＬＹ ＩＪＪ ＶＡＬ ＣＹＳ ＴＨＲＧＬＹ
ＬＦＩＪ ＡＩＡ ＡｆｌＮ Ｖｊ山ＩＩＪ ＳＥＲＬ
ＹＳ ＡＲＧで示されるシグナル配列。 以下余白 （１３） ｒ５３ノ ５８６ 第２Ａ表 ＧＣＧ ＡＣＣＴｒＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＴ
Ｇ ＡＧＣＡＡＣＧＡＡ ＧＣＧ ＡＣＣＧＴＧ ＧＣ
Ｔ ＣＧＴＡＣＴ ＧｃＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＴ ＡＡ
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Ｇ ＧＴＧ ＴＣＧＧＧＣＧＣＧ ＧＡＣＴＣＴ ＧＧ
ＣＡＴ’ｒ ＧＴＣＧＴｒ ＧＣＴ ＡＧＴ ＣＣＣＡ
ＧＣＡＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣＣＣＧ ＧＡＣＴＡＣＴ’
ｒＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧ ＡＣＴ ＣＧＣＧＡＣＴＣ’
ｌ’ ＧＧＴ ＣＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧ ＡＣＣＣＴ
ＣＧＴＣＧＡＴ ＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＡＡ’ｒ ＧＧ
Ａ ＧＡＴ ＡＣＣＡＧＴ ＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧ
ＴＴＣＡＡＴ ＧＴＣＧＡＴ ＧＡＧ Ａ（’Ｉ’
ＧＣＣＴＡＣＡＣＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＧＡ
ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ Ｃ
ＣＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣ
Ｔ ＡＴＧ ＡＴＣＧＧＣ’ＩＴＣＧＧＧ ＣＡＡ Ｔ
ＧＧ ＣＴＧ ＣＴＴ ＧＡＣＡＡＴ ＧＧＣＴＡＣＡ
ＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧ ＧＡＣＡＴＩ’ ＧＴ
Ｔ ＴＧＧ ＣＣＣＣＴＣＧＴＴ ＡＧＧ ＡＡＣＧＡ
ＣＣＴＧ ＴＣＧ ＴＡＴ ＧＴＧＧＣＴ ＣＡＡ Ｔ
ＡＣＴＧＧ ＡＡＣＣＡＧ ＡＣＡ ＧＧＡＴＡＴ Ｇ
ＡＴ ＣＴＣＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＴＣＡＡＴ
ＧＧＣＴＣＧ ＴＣＴ ＴｒＣＴＴＴ ＡＣＧ ）、Ｔ
Ｔ ＧＣｒ ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＴ
ＴＧＴＣＧＡＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＣＣＴＴＣＧＣＧ
ＡＣＧ ＧＣＣＧＴＣＧＧＣＴＣＧ ＴＣＣＴＧＣＴ
ＣＣＴＧＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＣＡ
ＣＣＣＧＡＡＡＴＴ ＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧ Ｃ
ＡＧ ＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ）、ＣＣＧＧＣＡＧＣＴＩ
’ＣＡＴＴ ＣＴＧ ＧＣＣＡＡＣＴＴＣＧＡＴ ＡＧ
ＣＡＧＣＣＧＴＴＣＣＧＧＣＡＡＧ ＧＡＣＧＣＡ Ａ
ＡＣＡＣＣＣＩ’ＣＣＴＧ ＧＧＡ ＡＧＣＡＴＣＣＡ
ＣＡＣＣＴｌ’ｒＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣ
Ａ ＴＧＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧ Ｃ
ＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＧ ＣＧＣＧＣＧ ＣＴＣＧＣＣ
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ＣＴＣＴ ＴＴＣＣＧＣＴＣＡ ＡＴＣＴＡＴ ＡＣＣ
ＣｒＣＡＡＣＧＡＴ ＧＧＴ ｃＴＣＡＧＴ ＧＡＣＡ
ＧＣＧＡＧ ＧＣＴ ＧＴＴＧＣＧ ＧＴＧ ＧＧＴ
ＣＧＧ ＴＡＣＣＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣＡＣＧ ＴＡＣ
ＴＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＣＧＴＧＧ ＴＴＣＣＴＧ
ＴＧＣＡＣＣＴＴＧ ＧＣＴ ＧＣＣＧＣＡ ＧＡＧ
ＣＡＧ ＴＴＧ ＴＡＣ’ ＧＡＴ ＧＣＴＣＴＡ
ＴＡＣＣＡＧ ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＧ ＣＡＧ ＧＧＧ
ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣＡＣＡ ＧＡＴ Ｇ
ＴＧＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＣＴＴＣＴｒＣＡＡＧ ＧＣ
Ａ ＣＴＧ ＴＡ、ＣＡＧＣＧＡＴ ＧＣＴ ＧＣＴ
ＡＣＴ ＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴ ＴＣＧ ＴＣＣＡ
ＧＴ ＴＣＧ ＡＣｒ ＴＡＴ ＡＧＴ ＡＧＣＡＴＴ
ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣＧＴＧ ＡＡＧ ＡＣＴ Ｔ
ＴＣＧＣＣＧＡＴ ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＣＴ ＡＴＴ
ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣＧＣＣＧＣＡ ＡＧ
ＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧ ＴＣＣＧＡＧ ＣＡＡ
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ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣａｃｒ ＣＧＣＧＡＣｃＴＧＡ
ＣＣＴＧＧ ＴＣＴ ＴＡＴ ｃａｒ ＧＣＴＣＴＧ
ＣＴＧ ＡＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＸ７ｒ ＣＧＴ
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ＴＧＧ ＧＧＣＧＡＧ ＡＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧｃＡ
ＧＣＧＴＣＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧｒ ＧＣＧ ＧＣＣ
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ＡＧＣＡＧＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＴＣＡＣＣＴＣＧ
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ＣＴ ＡＣＣＣＣＣＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣＧＧＣＡＧ
ＣＧＴＧ ＡＣＣＴＣＧ ＡＣＣＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣ
ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＴＧＣＴ ＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＡ
ＧＣＡＣＣＡＧＴ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＣＣＴ
ＣＣＴＧＴ ＡＣＣＡＣ’ｒＣＣＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧ
ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣＧＡＴ ＣＴＧ Ａ
ＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＡＧ
ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＴＣＧＧＡ ＴＣＧ
ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＧＴＧ入ＣＴＧＧ
ＧＡＡ ＡＣＣＡＧＣＧＡＣ＋’；ＧＣＡＴＡ ＧσＧ
℃ＭπＧのＧＡＣ、静ΩＴＡＣＡＣＴ ＴＣＣＡＧＣＧ
ＡＣＣＣＧ ＣＴＣＴＧＧ ＴＡＴ ＧＴＣＡＣＴ Ｇ
ＴＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＴＧＧＴ ＧＡＧ
ＴＣＧ ＴＴＴ ＧＡＧ ＴＡＣＡＡＧ ＴＴＴ Ａ
ＴＣＣＧＣＡＴＴ ＧＡＧ ＡＧＣＧＡＴ ＧＡＣＴＣ
ＣＧＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ
ＣＣＣＡＡＣＣＧＡ ＧＡＡ ＴＡＣＡＣＣＧＴｒ Ｃ
ＣＴＣＡＧ ＧＣＧ ＴＧＣＧＧＡ ＡＣＧ ＴＣＧ
ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣＡＣＣ
ＴＧＧ ＣＧＧ手続補正書（方式） 昭和５９年５月ノ９日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０３６０号 ２、発明の名称 グルフアミラーゼ遺伝子 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタス コーポレイション ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外
４名） ６、補正の対象 （１）明細書の「図面の簡単な説明」の欄（２）図面捲
■ｂる暴斎（第１図、第２Ａ図、第２Ｂ図、第４図、第
５図、第９図及び第１１図）７、補正の内容 （１）■ 明細書第１１０頁第１１行目「である。」を
「を示す図面に代る写真である。」に補正する。 ■ 同第１１０頁第１３行目「電気泳動図である。」を
「電気泳動を示す図面に代る写真である。」に補正する
。 ■ 同第１１０頁第１９行目「・母ターンである・」を
「パターンを示す図面に代る写真である。」に補正する
。 ■ 同第１１１頁第２行目「配列を示す。」を「配列を
示す図面に代る写真である。」に補正する。 ■ 同第１１１頁第８行目「プレートアッセイを示す。 」を「プレートアッセイ（生物の形態）を示す図面に代
る写真である。」に補正する。 ■ 同第１１１頁第１４行目「ず。」を「す図面に代る
写真である。」に補正する。 （２）別紙の通シ ８、添付書類の目録 （１）図面に俳わ基１義（第１図、第２Ａ図、第２Ｂ図
、第４図、第５図、第９図及び第１１図）１通 （２）上 申 書 １通 （３） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０３６０号 ２、発明の名称 グルコアミラーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタス コーポレイション ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号許請
求の範囲」、′第１表」及υ、、ｒ″第２ハ衣１の欄 ７、補正の内容 （１）浄書された特許請求の範囲 １通（２）浄書され
た第１表 １通 （３）浄書された第２Ａ表 １通
培地中で増殖した細胞からのＡ、アワモリｍＲＮＡの試
験管内翻訳を示すゲル電気泳動パターンである。 第２Ａ図及び２Ｂ図は、グルコアミラーゼｍＲＮＡ ｋ
同定するゲル電気泳動図である。 第３図は、グルコアミラーゼ遺伝子を含むＡ、アワモリ
ゲノムの制限エンドヌクレアーゼ地図である。 第４図は、グルコアミラーゼｍＲＮＡとバイブリド形成
し、これを選択するのにｐＧＡＲｌが使用されるゲル′
電気泳動パターンである。 第５図は、グルコアミラーゼｍＲＮＡの５’末Ｍ−決定
するためのプライマー延長、及び決定された配列を示す
。 第６図は、ゲノム性グルコアミラーゼ遺伝子を含有する
ＥｃｏＲＩ断片の制限地図を示す。 第７図は、ｐＧＡＣ９のプラスミド地図を示す。 第８図は、ｐＧ（’Ｌｌのプラスミド地図を示す。 第９図は、種々の形質転換された酵母によるベーカーの
澱粉の分解のプレートアッセイを示す。 第１０図は、１０１発酵槽中で組換体酵母により生産さ
れたグルコアミラーゼのＤＥＡ−セファロースクロマト
グラフィーを示す。 第１１図は、蛋白質のゲル電気泳動パターンを示し、レ
ーン１はビオラド高分子蛋白質標準を示すＯ 以下余白 図面の、１う１！（（ 内′Ｕに変更なし） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号優先権主
張 ０１９８坪１２月２０日［相］米国（Ｕ Ｓ）■５
６４０７８［相］１９８シト１２月２０日［相］米国（
ＵＳ）０５６３９４１０発 明 者 マイケル アラン
イ アメリカ合衆国。 ニーズ ドウカールセフ ０発 明 者 デビット ハロウ ゲ アメリカ合衆国
。 ルファンド ドウジェル８フ ０発 明 者 ジエイムズ ヘンリー アメリカ合衆国
。 ミード ランシス ドライ カリフォルニア ９４６０２．オークランストリート
３１３３ カリフォルニア ９４６１１．オークランドライブ ６
２０８ カリフォルニア ９４５６４．ピノール、ツブ２５４０ 手続補正書（自発） 昭和５９年４月２８日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第０１０３６０号 ２、発明の名称 グルコアミラーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタス コーポレイション ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正の対象 （１）明細書の「特許請求の範囲」の欄（２） 明細書
の「発明の詳細な説明」の欄６、補正の内容 （１１特許請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）明細書 ■ 明細書第５３〜５５頁の第１表を別紙の通り補正す
る。 ■ 明細書第６２〜６３頁の第２Ａ表を別紙の通り補正
する。 ７、添付書類の目録 （１） 補正特許請求の範囲 １通（？４ｙ：ｆ、）（
２）補正 第１表 ｌ！ （１４７，ｆＪ、７貫）（３
）補 （２） 明細書の冷力（内容に変更なし） ２、特許請求の範囲 ！ 変形されたＤＮＡ配列において、この配列が菌類グ
ルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしく
は複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされ
ており、天然、合成又は半合成源から誘導されたもので
あり、そして開裂された発現ベクターに正しく連結され
そしてこのベクターにより宿主生物が形質転換された場
合、グルコアミラーゼ酵素活性を有する非天然蛋白質を
発現することができることを特徴とするＤＮＡ配列。 ２、前記ＤＮＡがｃＤＮＡであり、そして前記配列がコ
ードする菌類グルコアミラーゼ蛋白質が工４＜ ｋ ４
ｋ Ｘ ・７７ ％史（７，ｒｚｉ ｌ １ ｕ ｓ
ａｗａｍｏ ｒ ｉ ）種又は７．’１ペルギルス・
ニガー（Ａｓｐ肛担１ｕｓ ｎｊｇｅｒ ｆｌに由来す
る特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ３、前記の禎がＬ／□酌乞乞不・アワモＩＪＮＲＲＬ１
５１２７１であり、そして前記ＤＮＡ配列が５′から３
′の方向に実質上次の配列： 以下４゛ミ白 ＧＣＧ Ａｃｅ ＴＴＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ Ｔ
ＴＧ ＡＧＣＡＡＣＧＡＡ ＧＣＧ ＡＣＣＧＴＧ Ｇ
ＣＴ ＣＧＴＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＴ Ａ
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ＧＣＡＴＴ ＧＴＣＧＴＴ ＴＣｒ ＡＧＴ ＣＣＣＡ
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Ｇ ＴＣＴ ＴＴＣ’ＩＴＴ ＡＣＧ Ａ’ＩＴ ＧＣ
Ｔ ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣ’ＩＴＧＴ
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Ｇ ＧＣＣＧＴＣＧＧＣＴＣＧ ＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴ
ＧＧ ＴＧＴ ＧＡＴ ＴＣｒ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＣ
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ＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴ
Ｔ ＣＴＧ ＧＣＣんｆ ＴＴＣＧＡＴ ＡＧＣＡＧＣ
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ＴＴＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣＡ ＴＧＣＧ
ＡＣＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＣＣＣＴＧＣＴ
ＣＣＣＣＧ ＣＧＣＧＣＧ ＣＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣ
ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＡＣＴＣＴ ＴＴ
ＣＣＧＣＴＣＡ ＡＴＣＴＡＴ ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧ
ＡＴ ＧＧＴ ＣＴＣＡＧＴ ＧＡＣＡＧＣＧＡＧ Ｇ
ＣＴ ＧＴＴＧＣＧ ＧＴＧ ＧＧＴ ｃＧＧＴＡＣＣ
ＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧ
ＧＣＡＡＣＣＣＧ（２） （１） ＴＧＧ ＴＴＣＣＴＧ ＴＧＣＡＣＣＴＴＧ ＧＣＴ
ＧＣＣＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＴＡＣＧＡＴ
ＧＣＴＣＴＡ ＴＡＣＣＡａ ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＧ
ＣＡＧ ＧＧＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣＡ
ＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＣＴＴＣＴ
ｒＣＡＡＧ ＧＣＡ Ｃ１℃ＴＡＣＡＧＣＧＡＴ ＧＣ
Ｔ ＧＣＡ ＡαＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴ ＴＣＧ
ＴＣＣＡＧＴ ＴＣＧ ＡＣＴ ＴＡＴ ＡＧＴ ＡＧ
ＣＡＴｒ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣＧＴＧ ＡＡＧ Ａ
ＣＴ ＴＴＣＧＣＣＧＡＴ ＧＧＣＴｖｒＣＧＴＣＴＣ
Ｔ ＡＴｒ ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣＧＣＣＧ
ＣＡ ＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧ ＴＣＣＧＡＧ
ＣＡＡ ＴＡＣＧＡＣＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴＧＧＣ
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ＧＣＣＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣＣＡＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ
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ＴＣＧ ＴＧＧＣＣＧ ＡＧＴ ＡＴＣＧＴＧ ＧＣＴ
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ＧＣＴ ＡＣＣＣＣＣＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣＣＧＧＣ
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ＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＣ
ＣＴＣＣＴＧＴ ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣＧＴ
Ｇ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣＧＡＴ ＣＴＧ
ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＧＡ
Ｇ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＴＣＧＧＡ ＴＣＧ
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ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＣＴ ＧＡＣＡＡＧ ＴＡＣＡＣＴ
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ＧＴＣＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＣＧ Ｇ
ＣＴα’ｎ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴｒＴ ＧＡＧ ＴＡＣ
ＡＡＧ ＴＩＴ ＡＴＣＣＧｃ Ａ’Ｉ’ｒ ＧＡＧ
ＡＧＣＧＡＴ ＧＡＣＴＣＣＧＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ
ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＣＣＣＡＡＣＣＧＡ ＧＡＡ
ＴＡＣＡＣＣＧ’ｌ’ｒ ＣＣＴＣＡＧ ＧＣＧ Ｔ
ＧＣＧＧＡ ＡＣＧ ＴＣＧ ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＧ
ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣＡＣＣＴＧＧα℃を有する特許
請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 ４、ＤＮＡ発現ベクターにおいて、該ベクターが宿主中
で機能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ配列
を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌
類グルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個も
しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位に
されており、天然、合成又は半合成源から誘導されたも
のであり、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発
現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するよう
に前記プロモーター断片に対して方向ずけられているこ
とを特徴とする発現ベクター。 ５、前記の宿主生物が細菌、ウィルス又は酵母に由来す
る特許請求の範囲第４項記載のベクター。 ５項記載のベクター。 ７、前記宿主生物が酵母である特許請求の範囲第５項記
載のベクター。 属の種である特許請求の範囲第７項記載のベクター０ ９、前記配列がコードする菌類グルコアミラーゼ蛋白質
がアスペルギルス・アワモリ種又はアスペルギルス・ニ
ガ一種に由来する特許請求の範囲第４項記載のベクター
。 １０、 ＤＮＡ発現ベクターにおいて、該ベクターが宿
主中で機能するプロモーター断片、及び変形されたＤＮ
Ａ配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配
列が： 以下余白 ＧＣＧ ＡＣＣＴＴＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＴ
Ｇ ＡＧＣＡＡＣＧＡＡ ＧＣＧ ＡＣＣＧＴＧ ＧＣ
Ｔ ＣＧＴＡＣＴ ＧＣＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＴ ＡＡ
ＣＡＴＣＧＧＧＧＣＧ ＧＡＣＧＧＴ ＧＣＴ ＴＧＧ
ＧＴＧ ＴＣＧａａｃ ＧＣＧＧＡＣＴＣＴ ａａｃ
ＡＴＴ ＧＴＣＧＴＴ ＧＣＴ ＡＧＴ ＣＣＣＡＧ
ＣＡＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣＣＣＧ ＧＡＣＴＡＣ’ｌ’
Ｔ（！ ＴＡＣＡＣＣＴＧＧ ＡＣＴ ＣＧＣＧＡＣＴ
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ＣＧＴＣＧＡＴ ＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＡＡＴ ＧＧＡ
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ＴＴＣＡＡＴ ＧＴＣＧＡＴ ＧＡＧ ＡＣＴ ＧＣＣ
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ｎ ＣＣＧ Ｃｍ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＣＣＧ
ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＧＡＧＣＡＡＣＴ ＧＣＴ ＡＴＧ
ＡＴＣＧＧＣＴｒＣＧＧＧ ＣＡＡ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＣＴｒ ＧＡＣＡＡＴ ＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡ
ＣＣＧＣＡＡＣＧ ＧＡＣＡＴＴ Ｇ’ｒＩ’ ＴＧＧ
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Ｇ ＴＡＴ ＧＴＧＧＣＴ ＣＡＡ ＴＡＣＴＧＧＡＡ
ＣＣＡＧ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＴＣＴ
ＧＧ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＴＣＡＡＴ ＧＧＣＴＣＧ
ＴＣＴ ＴＴＣＴＴＴ ＡＣＧ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＴ
Ｇ ＣＡＡ ＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧ
ＧＴ ＡＧＴ ＧＣＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧ ＧＣＣＧＴ
ＣＧＧＣＴＣＧ ＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧ ＴＧＴ
ＧＡＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＣＣＧＡＡ ＡＴ
Ｔ ＣＩ’ＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧ ＣＡＧ式℃ＴＴＣ’
ｆ’ｒＧ ＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴｒ ＣＴＧ
ＧＣＣＡＡＣＴＩ’ＣＧＡＴ ＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣ
ＣＧＧＣＡＡＧ ＧＡＣＧＣＡ ＡＡＣＡ（１’ｃ Ｃ
ＴＣＣＴＧ ＧＧＡ ＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＴ
ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣＡ ＴＧＣＧＡＣ
ＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧ ＣＣＣＴＧＣＴＣＣ
ＣＣＧ ＣＧＣＧＣＧ ＣＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡ
Ｇ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＡＣＴＣＴ ＴＴＣＣ
ＧＣＴＣＡ ＡＴＣＴＡＴ ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＡＴ
ＧＧＴ ＣＴＣＡＧＴ ＧＡＣＡＧＣＧＡＧ ＧＣＴ
ＧＴＴＧＣＧ ＧＴＧ Ｃ，ＧＴ ＣＧＧ ＴＡＣＣ
ＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣＡＣＧ ＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧ
ＣＡＡＣＣＣＧ（６） （５） Ｔ（ＥＧ ＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＧ ＧＣＴ
ＧＣＣＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＴＧ ＴＡＣＧＡＴ
ＧＣＴＣＴＡ ＴＡＣＣＡＧ ＴＧＧ ＧＡＣＡＡＧ
ＣＡＧ ＧＧＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣＡ
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ＴＣＡＡＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＡＣＡＧＣＧＡＴ Ｇ
ＣＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴ Ｔ
ＣＧ ＴＣＣＡＧＴ ＴＣＧＡＣＴ ＴＡＴ ＡＧＴ
ＡＧＣＡＴＴ ＧＴＡＧＡＴ ＧＣＣＧＴＧ ＡＡＧ
ＡＣＴ ＴＩＴｃＧＣＣＧＡＴ ＧＧＣＴＩ’ＣＧＴＣ
ＴＣＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＡＡ ＡＣＴ ＣＡＣＧＣ
ＣＧＣＡ ＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧ ＴＣＣＧ
ＡＧ ＣＡＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴＧＧ
ＣＧＡＧ ＣＡＧ ＣＴＴ ＴＣＣＧＣＴ ＣＧＣＧＡ
ＣＣＴＧ ＡＣＣＴＧＧ ＴＣＴ ＴＡＴ （Ｘ’ｒ
ＧＣＴＣＴＧ ＣＴＧ ＡｃＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧ
Ｔ ＣＧＴ ＡＡＣＣＴＣＧＴＧＣＣＴ ＴＣＣＧＣＴ
ＴＣＴπ℃αＸ： ＧＡＧ ＡＣＣＴＣＴ ＧＣＣＡ
ＧＣＡＧＣＧＴＧ ＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴ ＧＣＧ
ＧＣＣＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣＣＡＴｒ ＧＧＴ ＡＣ
ＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＴＣＡＣＣ
Ｔ（！Ｇ ＴＧＧＣＣＧ ＡＧＴ ＡＴＣＧＴＧ ＧＣ
Ｔ ＡＣＴ ＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＴ ＡＣＧ ＡＣ
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ＧＣＡＧＣＧＴＧ ＡＣＣＴｃＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧ
ＡＣＣＡｃｅ ＧｃＧＡＣＴＧＣＴ ＡＧＣＡＡＧ Ａ
ＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＴ ＡＣＧ ＴＣＡ ＴＣＡ Ａ
ＣＣＴＣＣＴＧＴ ＡＣＣＡＣＩ’ＣＣＣＡＣＣＧＣＣ
ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＴＣＧＡＴ ＣＴ
Ｇ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣ
ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧ ＧＴＣＧＧＡ Ｔ
ＣＧ ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＧ Ｃ１℃απＧＡＣＴＧＧ
ＧＡＡ ＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＴＡ ＧＣＴ
ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＣＴ ＧＡＣＡＡＧ ＴＡＣＡＣＴ
ＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＣＱ ＣＴＣＴＧＧ ＴＡＴ
ＧＴＣＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ （ＴＧαｐＧαＧＧＴ
ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＴｒ ＧＡＧ ＴＡＣＡＡＧ Ｔ
ＴＴ ＡＴＣＣＧＣＡＴＴ 、０Ｍニー ＡＧＣＧＡＴ
ＧＡＣＴＣＣＧＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＧ
Ｔ ＧＡＴ ＣＣＣＡＡＣＣＧＡ ＧＡＡ ＴＡＣＡＣ
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Ｇ ＴＣＧ ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＴ
ＧＡＣＡＣＣＴＧＧα追で表わされ、そして前記ＤＮＡ
セグメントが、宿主中で発現されて非天然グルコアミラ
ーゼ蛋白質を生産するように前記プロモーターに対して
方向ずけられていることを特徴とする特許請求の範囲第
４項記載のベクター。 １１、シラスミドｐＧＡＣ９である特許請求の範囲第４
項記載のベクター。 １２、発現ベクターによシ形質転換された宿主生物にお
いて、該発現ベクターが宿主中で機能するプロモーター
断片及び変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメン
トを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グルコアミラーゼ蛋白
質をコードし、又はその１個もしくは複数個の塩基が置
換、欠失、挿入もしくは逆位にされておシ、天然、合成
又は半合成源から誘導されたものであり、そして前記Ｄ
ＮＡセグメントが、宿主中で発現されて非天然グルコア
ミラーゼ蛋白質を生産するように前記プロモーター断片
に対して方向ずけられていることを特徴とする宿主生物
。 １３、細菌、ウィルス、又は酵母である特許請求の範囲
第１２項記載の宿主生物。 １４．エセリヒア・コリである特許請求の範囲第１３項
記載の宿主生物。 １５、酵母である特許請求の範囲第１３項記載の宿主生
物。 １６、前記酵母がサツカロミセス属の種である特許請求
の範囲第１５項記載の宿主生物。 １７、プラスミドｐＧＡＣ９によυ形質転換された酵母
である特許請求の範囲第１２項記載の宿主生物。 １８、前記配量がＣ４６８株である特許請求の範囲第１
７項記載の宿主生物。 １９、酵母中で機能するプロモーター断片、実質上次の
アミノ酸配列： Ｍ［！Ｔ ＥＩＥ！ＲＦＨＦｉ ＡＲＧ ＥＩＥＲＬＷ
Ｔ ＩＪＵ ＡＬＡ ＩＪＴ ＳＥＲＧＬＹ ＩＪＪ
ＶＡＬ ＯＹＳ ＴＨＲＧＬＹ ＬＥＵ ＡＬＡ ａ
ＶＡＬ ＩＩＩＪ！ｌｉ ＳＩＲＬＹＳＡＲＧを有する
シグナル配列、及び蛋白質性物質をコードするＤＮＡセ
グメントを含んで成るＤＮＡ発現ベクターによシ形質転
換された宿主生物を増殖せしめることを特徴とし、そし
て前記蛋白質性物質が、通常の宿主細胞から分泌される
間に通常切断される疎水性シグナル配列を伴って通常の
宿主中で合成される細胞蛋白質であることを特徴とする
、蛋白質性物質を細胞外に分泌せしめる方法。 ２０、蛋白質性物質がグルコアミラーゼである特許請求
の範囲第１９項記載の方法。 ２１、 ｌ＠地中で宿主生物を増殖せしめることを特徴
トスるグルコアミラーゼの製造方法であって、該宿主生
物が、次の発現ベクターすなわち宿主中で機能するプロ
モーター断片及び変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡ
セグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グルコアミラ
ーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしくは複数個の
塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされており、天
然、合成又は半合成源から誘導されたものであシ、そし
て前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発現されて非天然
グルコアミラーゼ蛋白質を生産するように前記プロモー
ター断片に対して方向ずけられている発現ベクターによ
シ形質転換されている、製造方法。 ２２、澱粉、又はオリゴサツカライドを含有する澱粉加
水分解物の糖化方法において、該澱粉又はオリゴサツカ
ライドを含有する澱粉加水分解物をグルコアミラーゼ剤
によシ処理し、該グルコアミラーゼが、ベクターすなわ
ち宿主中で機能するプロモーター断片及び変形されたＤ
ＮＡ配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ
配列が菌類グリコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はそ
の１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしく
は逆位にされておシ、天然、合成又は半合成源から誘導
されたものであシ、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿
主中で発現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産
するように前記プロモーター断片に対して方向ずけられ
ている発現ベクターによし形質転換された宿主生物によ
り生産されたものであることを特徴とする方法。 ２３、糖化と発酵とを同時に行うことによるアルコール
の製造方法において、次のベクターすなわち宿主中で機
能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ配列を有
するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グ
ルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしく
は複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされ
ておシ、天然、合成又は半合成源から誘導されたもので
あシ、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発現さ
れて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するように前
記プロモーター断片に対して方向ずけられている発現ベ
クターによシ形質転換された宿主生物を、グルコアミラ
ーゼの基質である非発酵性炭素源に増殖せしめることを
特徴とする方法。 ２４、宿主が酵母である特許請求の範囲第２１項〜第２
３項のいずれか１項に記載の方法。 ２５、宿主が酵母である特許請求の範囲第１９項記載の
方法。 ２６、形質転換された宿主中の次のベクターすなわち宿
主中で機能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ
配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列
が菌類グルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１
個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆
位されており、天然、合成又は半合成源から誘導された
ものであり、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で
発現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するよ
うに前記プロモーター断片に対して方向ずけられている
発現ベクター中の該変形されたＤＮＡ配列の発現によシ
生産されたグルコシダーゼ活性を有する酵素。 ２７、次の式：ビＳ正亜刊Ｓ玉」Ｈ団島ＩＪＪ ６１１
！ＲＧＬＹ ＩＪＪ ＶＡＬ ＣＹＳ ＴＨＲＧＬＹ
ＬＦＩＪ ＡＩＡ ＡｆｌＮ Ｖｊ山ＩＩＪ ＳＥＲＬ
ＹＳ ＡＲＧで示されるシグナル配列。 以下余白 （１３） ｒ５３ノ ５８６ 第２Ａ表 ＧＣＧ ＡＣＣＴｒＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＴ
Ｇ ＡＧＣＡＡＣＧＡＡ ＧＣＧ ＡＣＣＧＴＧ ＧＣ
Ｔ ＣＧＴＡＣＴ ＧｃＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＴ ＡＡ
ＣＡＴＣＧＧＧ ＧＣＧ ＧＡＣＧＧＴ ＧＣＴ ＴＧ
Ｇ ＧＴＧ ＴＣＧＧＧＣＧＣＧ ＧＡＣＴＣＴ ＧＧ
ＣＡＴ’ｒ ＧＴＣＧＴｒ ＧＣＴ ＡＧＴ ＣＣＣＡ
ＧＣＡＣＧ ＧＡＴ ＡＡＣＣＣＧ ＧＡＣＴＡＣＴ’
ｒＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧ ＡＣＴ ＣＧＣＧＡＣＴＣ’
ｌ’ ＧＧＴ ＣＴＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧ ＡＣＣＣＴ
ＣＧＴＣＧＡＴ ＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＡＡ’ｒ ＧＧ
Ａ ＧＡＴ ＡＣＣＡＧＴ ＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧ
ＴＴＣＡＡＴ ＧＴＣＧＡＴ ＧＡＧ Ａ（’Ｉ’
ＧＣＣＴＡＣＡＣＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＧＡ
ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＧＴ Ｃ
ＣＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＧＣ
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ＡＧ ＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ）、ＣＣＧＧＣＡＧＣＴＩ
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℃ＭπＧのＧＡＣ、静ΩＴＡＣＡＣＴ ＴＣＣＡＧＣＧ
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ＴＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＴＧＧＴ ＧＡＧ
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ＣＧＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ
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ＣＴＣＡＧ ＧＣＧ ＴＧＣＧＧＡ ＡＣＧ ＴＣＧ
ＡＣＣＧＣＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＧＡＣＡＣＣ
ＴＧＧ ＣＧＧ手続補正書（方式） 昭和５９年５月ノ９日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０３６０号 ２、発明の名称 グルフアミラーゼ遺伝子 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタス コーポレイション ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外
４名） ６、補正の対象 （１）明細書の「図面の簡単な説明」の欄（２）図面捲
■ｂる暴斎（第１図、第２Ａ図、第２Ｂ図、第４図、第
５図、第９図及び第１１図）７、補正の内容 （１）■ 明細書第１１０頁第１１行目「である。」を
「を示す図面に代る写真である。」に補正する。 ■ 同第１１０頁第１３行目「電気泳動図である。」を
「電気泳動を示す図面に代る写真である。」に補正する
。 ■ 同第１１０頁第１９行目「・母ターンである・」を
「パターンを示す図面に代る写真である。」に補正する
。 ■ 同第１１１頁第２行目「配列を示す。」を「配列を
示す図面に代る写真である。」に補正する。 ■ 同第１１１頁第８行目「プレートアッセイを示す。 」を「プレートアッセイ（生物の形態）を示す図面に代
る写真である。」に補正する。 ■ 同第１１１頁第１４行目「ず。」を「す図面に代る
写真である。」に補正する。 （２）別紙の通シ ８、添付書類の目録 （１）図面に俳わ基１義（第１図、第２Ａ図、第２Ｂ図
、第４図、第５図、第９図及び第１１図）１通 （２）上 申 書 １通 （３） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０３６０号 ２、発明の名称 グルコアミラーゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 シタス コーポレイション ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号許請
求の範囲」、′第１表」及υ、、ｒ″第２ハ衣１の欄 ７、補正の内容 （１）浄書された特許請求の範囲 １通（２）浄書され
た第１表 １通 （３）浄書された第２Ａ表 １通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、変形されたＤＮＡ配列において、この配列が菌類グ
ルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１個もしく
は複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされ
ており、天然、合成又は半合成源から誘導されたもので
あり、そして開裂された発現ベクターに正しく連結され
そしてこのベクターにより宿主生物が形質転換された場
合、グルコアミラーゼ酵素活性を有する非天然蛋白質を
発現することができることを特徴とするＤＮＡ配列。 ２、 前記ＤＮＡがｃＤＮＡであり、そして前記配列が
コードする菌類グルコアミラーゼ蛋白質がアスペに由来
する特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ３、前記の種がアスペルギルス・アワモリＮＲＲＬ１５
．２７１であり、そして前記ＤＮＡ配列が５′か（１）
【Ａ＾ ら３１の方向に実質上次の配列： 以下余白 （２） αηＡＣＣ慢Ｄ ＧＡＴτＡπｔ７℃ｗＣ品ＣＧ品ＧＯ
ＣＡ国σ℃απαπＡＣＴ ＧＣｃ Ａ’ＩｃＣ１℃Ａ
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ＡσαπＭ罫刀印Ａ四αＤ ＣＡＧ Ｑ３Ａ ＧＡＴ
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ＡＧＴ ＧＣＣＴｒＣＧα； ＡＣＧ ＧＣＣＧＩ’Ｃ
ＧＧＣＴ田ＴＣＣＩＣＴＣＣ′ｒＯＧ’ＩＹ７１’ Ｇ
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ＣＧＣＣＧＴＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＴ ’ＩＴＣＧ
ＡＴ ＣＴＧＡＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣＡＣ’ＣＡＣＣＴ
ＡＣＧ１１ｌ ＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣｍ ＧＴＣ
ＧＧＡ Ｔ田ＡＴＣＴＣ’ｒ ＣＡＧ （Ｗ （ＥＧＴ
ＧＡＣπ刀Ｇ品Ａ（支）ＡＧＣＧＡＣα；ＣＡＴＡαπ
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ＡＧＣＧＡＣｃＣＯＣＴＣπＸ； ＴＡＴσｒＣＡＣＴ
ＧＴＧ ＡＣＴ Ｃ’ｌｕ Ｃ０ｆｆαゴ（Ｘ７ｒ
ＧＡＧ Ｔｆｆ３ ＴＴｒ ＧＡＧ ＴＡＣんｆｆｉ
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ＡＴ ＧＡＣＴＣＣＧＴＧ ＧＡＧ ＴＯＯＧＡＧ Ｉ
Ｔ ＧＡＴαＸ： Ａ、ＡＣ０ｆｆＡ ＧＡＡ ＴＡＧ
ＡＣＣＧＴＴ ＣＣｒＣＡＧ Ｇ（１３ＴＧＣＧＧＡ
ＡＣＧＴ田ＡＣＣＧ（Ｉ３ Ａ（Ｄ Ｇ’ｌＹ； Ａ
ＣＩ’ ＧＡＣＡＣＣ世（ｍを有する特許請求の範囲第
２項記載のＤＮＡ配列。 ４、ＤＮＡ発現ベクターにおいて、該ベクターが宿主中
で機能するプロモーター断片及び変形されたひ沃配列を
有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類
グルコアミラーゼ蛋白質をコーＰし、又はその１個もし
くは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位にさ
れており、天然、合成又は半合成源から誘導されたもの
であり、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発現
されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するように
前記ゾロモーター断片に対して方向ずけられていること
を特徴とする発現ベクター。 ５、前記の宿主生物がｉ’Ｌ ウィルス又は酵母に由来
する特許請求の範囲第４項記載のベクター。 記載のベクター。 ７、前記宿主生物が酵母である特許請求の範囲第５項記
載のベクター。 属の種である特許請求の範囲第７項記載のベクター 〇 ９、前記配列がコードする菌類ゲルコアミラー第４項記
載のベクター。 １０、ＤＮＡ発現ベクターにおいて、該ベクターが宿主
中で機能するプロモーター断片、及び変形されたＤＮＡ
配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列
が： 以下余白 Ｇ田ＡＣＣ’ＩＴＧＧＡＴ ＴＣＡπ刀刊℃ｇ；ＣＡＡ
ＣＧＭα刀ＡＣＣＧＴＧＧＣＴ 田ＴＡＣｒ ＧＣＣＡ
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Ｉｆｆ ＧＡＣＴＣＴα２ＣＡＴｒ ＧＴＣＧＴｒ （
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Ｃｒ ＣＧＣＧＡＣＴｅｌ’ ＧＧＴ ａｒｃ ＧＴＣ
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ＡＣＡＴＣＴα： ＧＣＣＧＡＧ ＧＣＡ ＡＴｒ Ｇ
ＴＣＣＡＤ （’、ＧＴＡＴＣＡＧＴ ＡＡＣＣＣＣＴ
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Ｇ 田Ａ ＧＡＴα３Ｔ Ｃ（Ｄαｒ 宵ＧＡＧ ＡＧ
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ＡＣロ℃賀ＤＴＡＴＧルＧＣｒ ＣＡＡ ＴＡＣπｎ
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Ａ ＧＡＡ ＧＴＣＡＡＴ ＧＧＣＴＣＧ ＴＣＴ Ｔ
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ＡＣＴＣＣＡＣＣ’ＩＴＣＣＡＧ ＣＣＣＩＹＸ： Ｔ
ＣＣＣＣＧ ＩＣＧＧＩＩ； ＣＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡ
ＣＡＡＧ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＡＣＴＣＴ Ｔ
ＴＣＯ’；ＣＴＣＡ ＡＴＣＴＡＴ ＡＣＣＣＴＣん’
ＩＣＧＡＴα’；Ｔ ＣｐＣＡＧＴ ＧＡＣＡＧＣＱ７
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ＡＣＣＣｒ ＧＡＧ ＧＡＣＡＣＤ ＴＡＣＴＡＣＡＡ
ＣＱＩＥＣＡＡＣ（ＩＪＵπ追ＴＴＣＣ’ＩＯ霜ＣＡＣ
Ｃ’Ｉ’ｌｌＥ ＧααＥＣＧＣＡＧ沼Ｃ餡Ｔ川ＴＡＣ
ＧＡＴ 用αａＡＴＡＣＣＡＧ ’ＩＹＥＧ ＧＡＣん
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ＧＣＴ ＧＣＴ Ａαα℃ＡＣＣＴＡＣＴＣＴ Ｔ田
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Ｔ ＧＧＣＴｒＣＧＴＣＴＣＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＡ
Ａ ＡＣＴ Ｃ’ＡＣＧＣＣＧＣＡ ＡＧＣ、ＡＡＣα
ＥＣＴＣＣＡＴｃ ＴＣＣＧＡＧ ＣＡＡ ＴＡＣＧＡ
ＣＡＡＧ賀ｒ ＧＡＴ（ｎｃ ＧＡＧ ＣＡＧ Ｃ’円
７ ＴＣＣＧＣＴ 田ＣＧＡＣＣ’ｌｌＧ ＡＣＣＴＧ
Ｇ ＴＣＴ ＴＡＴ Ｇααπ０℃σｒＯＡＣＣＧＣＣ
ＡＡＣＡＡＣ（ＬＴ 国Ｔ ＡＡＣＧＴＣＧ’ＩＧαｒ
Ｔα： ＧＣ’ｒ ＴＣＴπ刀ＧＧＣ’ ＧＡＧ ＡＣ
ＣＴＣＴ ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧ犯■Ｃ圓ＣＡＣＣ実Ｔ
Ｇ田ＧＣＣＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣＣＡ’ＩＴ ＧＧＴ
ＡＣＣＴＡＣΔＧＣＡＧＴ ＧＴＧ ＡσＧτＡ癖Ｔ山
筋（Ｘｌｌ； ＡＧＴ −ＡＴＣＧＴＩＴｈ ＧαＡＣ
Ｔ ＧＧＣＯＧＣＡＣＣＡＣＴ ＡＧｌ１２ Ａ田ＧＣ
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ＡＧＣσ［ＧＡ工窃Ａ工餡ＣＡ側ＡＣＣＡ工Ｇ田ＡσＧ
ｃ’ｒ ＡＧＣＡＡＧ ＡＣＣＡＧＣＡＣＣｐｔ、＝
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ＣＴＡＣＧＧＣＧＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＩ ＧＴＣ
ＧＧＡ ＴＯＴｈ ＡＴＣＴＣＴ ＣＡＢ Ｃ’Ｉ’Ｇ
ＧＧＴＧＡＣ’Ｉ１ｍ ＧＡＡ ＡＣＣ沼ＣＧＡＣＧ
ＧＣＡＴＡ （Ｘ？ｒ ｏｎＡＧＴ ＧαＧＡＣＡＡＧ
ＴＡＣＡｃｒ ＴＣＣＡＧＣＧＡＣｃｃｃ ａｒｃ
ＴＧＧ ＴＡＴ ＧＴＣＡαＧＩＡα口℃αＤＧαＧＧ
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Ｔｒ ＡＴＣＣ１；ＣＡ實ＧＡＧ ＭＥＣＧＡＴ ＧＡ
ＣＴＣＣＧＴＧ ＧＡＧπｎ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ
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Ｔｈ ｒ℃ＣＧＱＩ； 、ＭＹＩｉ 珊ＡＣＴ ＧＡＣ
ＡＣＣＴＧＧ Ｑｎで表わされ、そして前記ＤＮＡセグ
メントが、宿主中で発現されて非天然グルコアミラーゼ
蛋白質を生産するように前記プロモーターに対して方向
ずけられていることを特徴とする特許請求の範囲第４項
記載のベクター。 １１、プラスミドｐＧＡＣ９である特許請求の範囲第４
項記載のベクター。 １２、発現ベクターにより形質転換された宿主生物にお
いて、核発現ベクターが宿主中で機能するプロモーター
断片及び変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメン
トを含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グルコアミラーゼ蛋白
質をコードし、又はその１個もしくは複数個の塩基が置
換、欠失、挿入もしくは逆位にされており、天然、合成
又は半合成源から誘導されたものであり、そして前記Ｄ
ＮＡセグメントが、宿主中で発現されて非天然グルコア
ミラーゼ蛋白質を生産するように前記プロモーター断片
に対して方向ずけられていることを特徴とする宿主生物
。 １３、ｌ菌、ウィルス、又は酵母である特許請求の範囲
第１２項記載の宿主生物。 １４、エセリヒア・つりである特許請求の範囲第１３項
記載の宿主生物。 １５、酵母である特許請求の範囲第１３項記載の宿主生
物。 許請求の範囲第１５項記載の宿主生物。 １７、ソラスミ）’ ｐＧＡＣ９にょ如形質転換された
酵母である特許請求の範囲第１２項記載の宿主生物。 １８、前記配量がＣ４６８株である特許請求の範囲第１
７項記載の宿主生物。 １９、酵母中で機能するプロモーター断片、実質上次の
アミノ酸配列： 廚ＳＥＲ駆刑ＳＥＲ温Ｈ初烏画Ｓ田Ｇ「画■バπ詣Ｇ「
画島ぷＶ厄ＩＬＥ Ｓ田面殉圏 を有するシグナル配列、及び蛋白質性物質をコーること
を特徴とし、そして前記蛋白質性物質が、通常の宿主細
胞から分泌される間に通常切断される疎水性シグナル配
列を伴って通常の宿主中で合成される細胞蛋白質である
ことを特徴とする、蛋白質性物質全細胞外に分泌せしめ
る方法。 ２０、蛋白質性物質がグルコアミラーゼである特許請求
の範囲第１９項記載の方法。 ２１、培地中で宿主生物全増殖せしめることを特徴とす
るグリコアミラーゼの製造方法であって、該宿主生物が
、次の発現ベクターすなわち宿主中で機能するプロモー
ター断片及び変形されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグ
メントヲ含有し、該ＤＮＡ配列が菌類グルコアミラーゼ
蛋白質全コードし、又はその１個もしくは複数個の塩基
が置換、欠失、挿入もしくは逆位にされておシ、天然、
合成又は半合成源から誘導されたものであり、そして前
記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発現されて非天然グル
コアミラーゼ蛋白質を生産するように前記プロモーター
断片に対して方向ずけられている発現ベクターにより形
質転換されている、製造方法。 ２２、澱粉、又はオリゴサツカライドを含有する澱粉加
水分解物の糖化方法において、該澱粉又はオリゴサツカ
ライドを含有する澱粉加水分解物をグルコアミラーゼ剤
により処理し、該グルコアミラーゼが、ベクターすなわ
ち宿主中で機能するプロモーター断片及び変形されたＤ
ＮＡ配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ
配列が菌類グリコアミラーゼ蛋白質をコーＰし、又はそ
の１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしく
は逆位にされており、天然、合成又は半合成源から誘導
されたものであシ、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿
主中で発現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産
するように前記プロモーター断片に対して方向ずけられ
ている発現ベクターにより形質転換された宿主生物によ
り生産されたものであることを特徴とする方法。 ２３、糖化と発酵とを同時に行うことによるアルコール
の製造方法において、次のベクターすなわち宿主中で機
能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ配列を有
するＩ）ＮＡ上セグメント含有し、該ＤＮＡ配列が菌類
グルコアミラーゼ蛋白質をゴー１’シ、又はその１個も
しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆位に
されており、天然、合成又は半合成源から誘導されたも
のであり、そして前記ＤＮＡセグメントが、宿主中で発
現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質全生産するよう
に前記プロモーター断片に対して方向ずけられている発
現ベクターにより形質転換された宿主生物を、グルコア
ミラーゼの基質である非発酵性炭素源に増殖せしめるこ
とを特徴とする方法。 ２４、宿主が酵母である特許請求の範囲第２１項範囲第
１９項カ書番学十号記載の方法。 ２６、形質転換された宿主中の次のベクターすなわち宿
主中で機能するプロモーター断片及び変形されたＤＮＡ
配列を有するＤＮＡセグメントを含有し、該ＤＮＡ配列
が菌類グルコアミラーゼ蛋白質をコードし、又はその１
個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは逆
位されておシ、天然、合成又は半合成源から誘導された
ものであり、そして前記圓Ａセグメントが、宿主中で発
現されて非天然グルコアミラーゼ蛋白質を生産するよう
に前記プロモーター断片に対して方向ずけられている発
現ベクター中の該変形されたＤＮＡ配列の発現によ
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46192083A | 1983-01-28 | 1983-01-28 | |
| US461920 | 1983-01-28 | ||
| US564078 | 1983-12-20 | ||
| US563941 | 1983-12-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6070079A true JPS6070079A (ja) | 1985-04-20 |
Family
ID=23834466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59010360A Pending JPS6070079A (ja) | 1983-01-28 | 1984-01-25 | グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6070079A (ja) |
| IE (1) | IE840161L (ja) |
| ZA (1) | ZA84685B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60256388A (ja) * | 1983-12-22 | 1985-12-18 | デルタ バイオテクノロジイ リミテッド | エタノ−ルおよびタン白質の製造法 |
| JP2008525036A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | デンプン加工法 |
-
1984
- 1984-01-25 JP JP59010360A patent/JPS6070079A/ja active Pending
- 1984-01-25 IE IE840161A patent/IE840161L/xx unknown
- 1984-01-30 ZA ZA84685A patent/ZA84685B/xx unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60256388A (ja) * | 1983-12-22 | 1985-12-18 | デルタ バイオテクノロジイ リミテッド | エタノ−ルおよびタン白質の製造法 |
| JP2008525036A (ja) * | 2004-12-22 | 2008-07-17 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | デンプン加工法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA84685B (en) | 1984-09-26 |
| IE840161L (en) | 1984-07-28 |
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