DE60037407T2 - Fusionsproteine mit pestizidwirkung - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pestizid-Fusionspolypeptide mit Bindungs- und Toxinabschnitten. Sie betrifft ferner Verfahren und Materialien zur Herstellung und zum Einsatz solcher Polypeptide sowie Tests und Sets zum Testen der Toxizität der Polypeptide.
  • STAND DER TECHNIK
  • Auf dem Gebiet der Erfindung ist bekannt, dass von Bacillus thuringiensis (Bt) abgeleitete Toxine Insektizideigenschaften aufweisen. In der Natur werden große Protoxin-Moleküle (130–160 kDa) in der alkalischen Umgebung des Insektenmitteldarms gelöst. Die gelösten Toxine werden dann proteolytisch in kleinere Fragmente (30–80 kDa) gespalten. Nach der Lösung und der Aktivierung von δ-Endotoxinkristallen tritt das Toxin mit spezifischen Oberflächenrezeptoren der Mitteldarmzellen in Wechselwirkung und bildet Poren in der Membran. Das Ionengleichgewicht der Zellen wird gestört und die Zellen lysiert.
  • Für Anwender von Bt-Toxinen ist deren Wirtbereich, ihre Toxizität in geringen Konzentrationen und die Fähigkeit der Zielinsekten, eine Resistenz zu entwickeln, von besonderem Interesse.
  • Es wurde über verschiedene Experimente berichtet, die diese verschiedenen Themen in Hinblick auf die Verbesserung eines oder mehrere davon in Bezug auf das native Toxin untersuchen.
  • Demnach ist allgemein anerkannt, dass das Vorhandensein von spezifischen Rezeptoren auf der Apikalmembran eine wichtige Rolle für die Spezifizität von Bt-Toxinen spielt (1). Unter solchen Umständen kann die Toxinwirksamkeit von der Menge der Rezeptoren und deren Affinität für das Protein sowie von der Fähigkeit des Toxins, Poren zu bilden, abhängen. Die Insektizidkristallproteine CryIA(a) und CryIA(c) weisen eine Homologie von 82% auf, wobei letzteres Protein doch eine um das 10fache höhere Insektizidaktivität in Bezug auf Heliothis virescens und Trichoplusia ni aufweist als CryIA(a) (4). Das Scannen von Homologen und reziproke Kombinationen zwischen diesen beiden Genen zeigten, dass die Aminosäuren 335–450 auf CryIA(c) mit der Aktivität in Bezug auf T. ni in Zusammenhang stehen, während die Aminosäuren 335–615 auf demselben Toxin erforderlich sind, um eine volle Spezifität in Bezug auf H. virescens zu erzeugen (4).
  • Im Allgemeinen ist die Spezifizität eines Insektizidproteins das Ergebnis mehrerer Funktionen, umfassend die proteolytische Verarbeitung durch die Insektenmitteldarmproteasen, die Rezeptorenbindung und/oder cytolytische Funktionen (4). Die Ergebnisse terminaler Deletionen eines Lepidopteran-spezifischen Insektizidkristallproteins zeigte, dass Deletionen bis zum 10. Codon vom 5'-Ende aus oder dem 645. Codon vom 3'-Ende aus die Toxizität nicht beseitigten (5).
  • Durch ortsgerichtete Mutagenese wurde vorläufig bestimmt, dass Cry-Toxine drei funktionelle Domänen aufweisen. Domäne I ist an der Toxininsertion in die Membran beteiligt und beeinflusst die Ionenkanalfunktion, Domäne II ist an der Rezeptorbindung und der Insertion in die Membran beteiligt, und Domäne III ist an der Ionenkanalfunktion, der Rezeptorbindung und der Insertion in die Membran beteiligt (6).
  • Bindungsuntersuchungen wurden mit zwei Bt-δ-Endotoxinen, Bt2 (einem rekombinanten kristallinen Protein mit 130 kDa von B. thuringiensis subsp. berliner) und Bt4412 (einem kristallinen Protein mit 136 kDa von B. thuringiensis subsp. thuringiensis), auf Bürstensaummembranbläschen des Tabakschwärmers (Manduca sexta) und des Großen Kohlweißlings (Pieris brassicae) durchgeführt (12). Das aktive Bt2-Protein (60 kDa) bindet an Insekten beider Spezies und tötet diese, während das aktive Bt4412-Protein nur für M.-sexta-Larven hochtoxisch ist (12). In dieser Untersuchung wurde gezeigt, dass P. brassicae zwei separate Bindungsstellen für Bt2- und Bt4412-Toxine aufweist, da die beiden Proteine nur in zu vernachlässigendem Ausmaß um die Bindungsstellen des jeweils anderen konkurrieren (12).
  • Ein Rezeptor für das CryIA(b)-Toxin wurde aus den Mitteldarm-Epithelzellen des anfälligen Tabakschwärmers, M. sexta, kloniert (13). Es wurde bestimmt, dass der Rezeptor, ein Membranglykoprotein mit 210 kDa, eine 30–60%ige Ähnlichkeit und eine 20–40%ige Identität mit der Cadherin-Überfamilie der Proteine aufweist (13). Cadherine sind Membranglykoproteine, und es wird angenommen, dass sie calciumabhängige Zellaggregation und -sortierung vermitteln (13). Die richtige Funktion des Rezeptors wurde nicht aufgeklärt. Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass er am Membrantransport beteiligt sein könnte, einer Funktion, die jener des Cadherin-ähnlichen menschlichen Darmpeptidtransportprotein ähnlich ist, das Peptidantibiotika durch Epithelzellen kanalisiert, die den Dünndarm auskleiden (13). Es wird angenommen, dass B.-thuringiensis-Toxine primär auf Epithelzellen im Mitteldarm anfälliger Insekten wirken (13).
  • Ein weiteres Bindungsprotein wurde aus M. sexta gereinigt, und es wurde gezeigt, dass seine Größe 120 kDa betrug (14). Dasselbe Protein, Aminopeptidase N, wurde aus Bürstensaummembranbläschen von Lymantria dyspar (Schwammspinner) gereinigt (14). Bei Tests in Bezug auf CryIA(a), CryIA(b), CryIIA, CryIC, CryIIIA, CryIIB, CryID, CryIF und CryIVD wies die aus L. dyspar gereinigte Aminopeptidase N eine zu vernachlässigende Bindungsaktivität auf (14). Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass aus M. sexta gereinigte Aminopeptidase N CryIA(a), CryIA(b) und CryIA(c) mit hoher Affinität band (14). Dieser Unterschied in Bezug auf die Bindungsaktivität von Aminopeptidase N ist unerklärt. Es wurde spekuliert, dass das Protein in Abhängigkeit von dem Insekt, aus dem es gereinigt wurde, variiert oder dass die Unterschiede Variationen in Bezug auf die Sensibilität der verwendeten Protokolle wiederspiegeln (14). Ein Kulturpflanzenschädling, die Kohlmotte (Plutella xylostella), hat in Freilandpopulationen eine Resistenz in Bezug auf Bt entwickelt, obwohl Selektionsexperimente im Labor zeigten, dass viele Insekten eine Resistenz in Bezug auf Bt-Gene entwickeln können (17). Es wurde gezeigt, dass ein autosomales rezessives Gen in P. xylostella eine extrem hohe Resistenz in Bezug auf vier Bt-Toxine, CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c) und CryIF, vermittelt (16). Das deutet an, dass eine Mutation, die Resistenz in Bezug auf die vier Bt-Toxine verleiht, zu einer Zerstörung der Bindung an ein einziges Insektenprotein, das als Rezeptor für alle vier Bt-Toxine fungiert, führt (16, 18). Das deutet darauf hin, dass die Resistenz in Bezug auf Pflanzen, die sogar mehrere Bt enthalten, eine reale Möglichkeit darstellt.
  • WO 91/17254 (The Regents of the University of California) offenbart ein Verfahren zur Verbesserung des Wirtbereichs oder der Toxizität von Insektizidtoxinen. Im Wesentlichen wurden die Insektizidproteine mit dem spezifischen Darmepithel-bindenden Glykoprotein gp64 kombiniert, das von dem Autographa-californica-Polyhedrose-Virus mit mehreren Kernen (MNPV) abgeleitet ist. Es wurde angenommen, dass dieses Glykoprotein mit den Epithelzelloberflächenrezeptoren in Wechselwirkung tritt, wodurch eine Konzentration auf und ein Eindringen in die Mitteldarmzellen ermöglicht wird. In einer alternativen Ausführungsform wurde vorgeschlagen, dass das Cyt-A-Protein zur Steigerung der Toxizität eingesetzt werden könnte. Es wurde angenommen, dass dieses Protein Fettsäuren im Lipidanteil der Zellen bindet, wodurch diese durch eine Detergenzien-ähnliche Wirkungsweise zerstört werden. Die Bedeutung für eine Resistenz, sofern eine solche vorhanden ist, werden nicht erläutert.
  • Die Bindungsdomänen in natürlichen Bt-Genen wurden auch mit anderen Bt-Genen vertauscht, um die Toxizität der Proteine zu verändern (siehe z. B. De Maagd et al., Appl. Env. Microb. 62, Nr. 5, 1537–1543 (1996)). Wie obenstehend beschrieben, z. B. in Bezugnahme auf (16), kann diese Strategie möglicherweise keine verbesserten Eigenschaften in Bezug auf eine mögliche Resistenz bereitstellen.
  • Im Lichte dieser Beobachtungen ist ersichtlich, dass neue Toxinpestizidmaterialien, insbesondere solche, die einen alternativen Ansatz oder einen Vorteil gegenüber den oben beschriebenen bieten, einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der Erfindung leisten würden.
  • WO 98/18820 (University Southern California) offenbart Zusammensetzungen, die Ricin-Toxin-A (RTA) enthalten, zur Behandlung von Krebs oder Autoimmunerkrankungen. Das RTA kann heterodimer mit einem mutierten Ricin-Toxin-B (RTB) assoziiert sein. Es werden auch RTB-Domänen offenbart, die an einen für einen bestimmten Zelloberflächenrezeptor spezifischen Liganden fusioniert sind.
  • WO 96/10083 (CIBA-GEIGY) offenbart insektenspezifische Pestizidproteine von Bacillus und transgene Pflanzen, die diese exprimieren. Es werden auch Fusionsproteine offenbart, die das insektenspezifische Protein fusioniert an ein Hilfsprotein umfassen.
  • US-Patent Nr. 5.668.255 (Murphy) offenbart Fusionen von (i) einem Zellbindungsabschnitt, z. B. Diphtheria-Toxin (DT) oder IL-2, (ii) einer Membrantranslokalisationsdomäne, z. B. von DT, und (iii) einer in eine Zelle einzuführende chemischen Substanz. Die Fusionen stellen ein System zur Zufuhr eines Toxins/eines Markierungsmittels/einer anderen chemischen Substanz in eine Zielzelle für menschliche Gesundheitsanwendungen basierend auf der Grundlage des Bindungs-Translokations-Mechanismus bereit, durch den DT in Zellen eindringt.
  • US-Patent Nr. 5.763.245 (Greenplate et al.) offenbart eine Kombination von Bacillusthuringiensis-CryIA(b) oder -CryIA(c) mit 3-Hydroxysteroidoxidase zur Bekämpfung von Insekten, wie z. B. Lepidoptera und Baumwollkapselkäfer.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Fusionsproteingene synthetisiert, die hochtoxische Fusionsproteine exprimieren. Diese Proteine umfassen eine an eine heterologe Bindungsdomäne fusionierte Toxindomäne, was die Wirksamkeit des Toxinabschnitts steigert. Bei der Bindungsdomäne handelt es sich vorzugsweise um eine, die nicht-spezifisch an Zellmembranen binden kann, ohne diese zu zerstören, wodurch eine Konzentration und Immobilisierung der Toxindomäne an diesem Wirkungsort ermöglicht wird, ohne dass das Vorhandensein spezieller Rezeptoren erforderlich ist. Als Beispiel wurde ein von Bt abgeleiteter Abschnitt und ein Kohlenwasserstoffbindungsabschnitt, wie z. B. die Galactose-Bindungsdomäne des Ricin-Toxin-B-Kettengens, herangezogen.
  • Es wurde unter Einsatz eines neuen modifizierten Tests unter Verwendung einer Insektenzelllinie und eines Paars fluoreszierender Farbstoffe gezeigt, dass die Toxizität des Expressionsprodukts höher war als jene von beiden Bestandteilen des Fusionsproteins. Der In-vitro-Biotest zur Bewertung der Toxizität der Fusionsgenprodukte wurde entwickelt und basiert auf Ethidium-Homodimer 1 und Calcein AM. Die beiden Fluorophore wurden zuvor hauptsächlich in Lebend-/Tot-Toxizitätstests eingesetzt (39). Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend beschrieben.
  • In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird demnach ein Nucleinsäuremolekül offenbart, das für ein Pestizid-Fusionspolypeptid kodiert, das
    • (i) eine Toxindomäne,
    • (ii) eine heterologe Bindungsdomäne, die nicht-spezifisch an eine Zellmembran binden kann, ohne diese zu zerstören,
    umfasst.
  • „Pestizid" bedeutet, dass es eine Toxizität in Bezug auf einen oder mehrere Schädlingstypen aufweist, insbesondere wirbellose Schädlinge von wirtschaftlicher Bedeutung, wie z. B. Insekten und andere Arthropoden, z. B. Arachnida. Insekten umfassen alle Entwicklungsstadien eines Insekts. Spezielle Insektenklassen, die von Interesse sind, umfassen Lepidoperta, Coleoptera, Culicidae, Simuliidae, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera und Diptera.
  • „Fusionspolypeptid" bezeichnet ein Polypeptid, das zwei oder mehrere Komponenten umfasst, die in Bezug aufeinander heterolog, d. h. nicht Teil einer natürlich vorkommenden einzigen Polypeptidkette, sind. Gegebenenfalls kann eine Linkerregion integriert werden, was das Falten der Domänen in ihre natürliche Konformation durch die Reduktion der sterischen Hinderung zwischen den Domänen erleichtern kann.
  • „Toxin" bezeichnet ein Material, das für Schädlinge toxisch ist, vorzugsweise in einer Menge, die von einem Schädling aufgenommen werden kann. Der Toxinabschnitt des Fusionsproteins kann synthetisch sein oder von einer natürlichen Quelle, wie z. B. Prokaryoten, Eukaryoten (umfassend Pilze, Pflanzen und Tiere), stammen. Insbesondere wird die Verwendung von erwiesenen Proteintoxinen (wie z. B. Bt-Toxinen oder pflanzlichen Verteidigungsallochemikalien, z. B. Proteasehemmern, wie z. B. von der Augenbohne oder der Sojabohne) oder Abschnitte davon ins Auge gefasst. Vorzugsweise sind diese Pestizid, aber für Menschen und Tiere nicht toxisch. Bei dem Toxin handelt es sich vorzugsweise um ein Toxin, das seinen eigentlichen Wirkungsbereich an der Zellmembran hat.
  • Die oben erläuterten Bt-Toxine sind besonders wirksam als Quelle für die Toxinkomponente. In den meisten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung stammt das Toxin von einem Bt-cry-Polypeptid. In einer Ausführungsform dieses Aspekts handelt es sich demnach bei dem Toxin um Bt-CryIA(b) oder -(c).
  • Die „Bindungs"-Domäne des Fusionspolypeptids kann nicht-spezifisch an eine Zellmembran binden, ohne diese zu zerstören, und ist demnach an sich nicht toxisch.
  • „Nicht-spezifisch" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass kein spezieller, spezifischer Rezeptor erforderlich ist. Das hat den Vorteil, dass die Wahrscheinlichkeit gesenkt wird, dass der Schädling durch eine Mutation in der Nucleinsäuresequenz, die für einen Toxinrezeptor kodiert, in der Lage ist, eine Resistenz in Bezug auf die Fusion zu entwickeln, wie es, wie man annimmt, bei einigen Formen von Bt-Resistenz der Fall ist (siehe Literaturverweise 16, 17, 18). Es wird ein alternativer Ansatz zu physikalischen Verfahren bereitgestellt, die eingesetzt werden können, um die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung einer Resistenz zu minimieren, d. h. das Mischen von Bt-transformierten Pflanzen mit nicht transformierten Pflanzen während der Aussaat, um den Selektionsdruck zu minimieren.
  • Die „Bindungs"-Domäne ist an sich nicht toxisch, d. h. sie verursacht, wenngleich sie die Toxizität der Toxindomäne verstärken kann, selbst keine signifikante oder noch bevorzugter keine Zerstörung der Zellmembran, wenn sie allein oder in dem Fusionsprotein zum Einsatz kommt. Demnach dient der Bindungsabschnitt wirksam dazu, zu ermöglichen, dass das Toxin seine Wirkung ausüben kann, verändert aber vorzugsweise die Wirkungsweise des Toxinmechanismus nicht, wodurch eine vorher sehbarere Spezifizität und Reaktion bereitgestellt wird. Dies ist besonders in Ausführungsformen nützlich, in denen das Fusionsprotein in die Tiernahrungskette gelangen kann und in denen das Toxin sorgfältig ausgewählt wurde, so dass es für Tiere nicht toxisch ist.
  • Vorzugsweise bindet die Bindungsdomäne Kohlenhydrat, das auf der extrazellulären Seite aller eukaryotischen Zellmembranen in Form von Glykolipiden und Glykoproteinen vorhanden ist. Die Bindungsdomäne dient demnach dazu, das Toxin an einem Wirkungsort vieler verschiedener Zellen zu verankern.
  • Vorzugsweise sind die Zellen Teil des Schädlingsdarmepitheliums.
  • Vorzugsweise wird das Toxin an dem Wirkungsort tatsächlich immobilisiert, wobei der Einsatz der heterologen Bindungsdomäne, auch wenn es nicht zu einer tatsächlichen (unumkehrbaren) Immobilisierung kommt, weiterhin bewirkt, dass die wirksame Konzentration des Toxins an seinem Wirkungsort auf der Zellmembran gesteigert wird.
  • In einer Ausführungsform dieses Aspekts besteht die Bindungsdomäne aus einem vollständigen Lectin oder einem Teil eines Lectins. Auf dem Gebiet der Erfindung ist bekannt, dass Lectine in der Lage sind, fest an Kohlenhydrat zu binden, wobei verschiedene Lectine im Allgemeinen spezielle Affinitäten für verschiedene Zuckerreste aufweisen. Besonders wünschenswert sind Domänen mit Galactose- oder Galactosylaffinität, was eine weit verbreitete Bindung in der Zielschädlingsklasse ermöglichen würde.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem Lectin um ein Ribosomen inaktivierendes Protein des Typs II, und die (nicht toxische) B-Kette wird eingesetzt. Beispiele für diesen Typ umfassen:
    • (a) Abrus precatorius (Abrin)
    • (b) Viscum album (Viscumin)
    • (c) Adenia digitata (Modeccin)
    • (d) Adenia volkensii (Volkensin)
  • Eine Tabelle, die den Ursprung und die Eigenschaften der vier oben angeführten Beispiele auflistet, ist angeführt (Stirpe et al., Ribosome-inactivating Proteins from plants: present status and future prospects. Bio/Technology, Band 10, 405–412 (1992); Barbieri et al., Ribosome-inactivating Proteins from plants. Biochemica et Biophysica Acta, Band 1154, 237–282 (1993)).
  • Besonders bevorzugt wird das Ricin-Toxin-B-Kettengen, das von dem Ricin-Toxin abgeleitet ist, in der Nucleinsäure eingesetzt. Ricin ist ein toxisches Glykoprotein, das zwei Polypeptidketten, A und B, umfasst, die durch eine Disulfidbindung verbunden sind (32).
  • Die Bindung der B-Kette an Reste mit endständigem Galactosyl auf Zelloberflächen erfolgt durch zwei Galactose-Bindungsdomänen, die sich an beiden Enden des Peptids befinden (34). Jede der beiden Bindungsstellen ist in der Lage, Galactose und komplexere Zucker ohne die andere Stelle zu binden, ohne dass es zu einer signifikanten Abnahme der Affinität für den Liganden kommt (35).
  • Es wurde gezeigt, dass Ricin-B-Ketten-Mutanten mit doppelter Lectin-Stelle, die in Insektenzellen exprimiert werden, eine Bindung von Restgalactose aufweisen: ein Hinweis für mehr als zwei Lectinstellen an der Ricin-Toxin-B-Kette. Ferrini et al., Bioconjugate Chem., Band 7, 621–628 (1995); Expression of functional ricin B chain using baculovirus system, Eur. J. Biochem., Band 233, 772–777. Das deutet darauf hin, dass andere Zelloberflächenbindungsstellen vorhanden sein können. Eine Möglichkeit besteht darin, dass Mannose-Seitenketten an der Ricin-B-Kette selbst mit Mannoserezeptoren auf der Zelloberfläche in Wechselwirkung treten (siehe Newton et al., J. Biol. Chem. 267(17), 11917–11922 (1992); Frankel et al., Carbohydrate Research 300, 3, 251–258 (1997)).
  • Die Bindung seiner B-Kette an die Zelloberfläche, beispielsweise an ein Glykokonjugat mit nicht-reduzierendem entständigem Galactoserest, verursacht oder erleichtert die Internalisierung von Ricin in die Zelle. Die Internalisierung kann über eine endozytotische Aufnahme in ummantelte und nicht ummantelte Gruben erfolgen (siehe Frankel et al., Protein Engineering 9, 4, 371–379 (1996); Magnusson und Berg, Biochem. J. 291, 749–755 (1993)). Nach dem Routen und der Freisetzung der freien A-Kette in das Zytosol wird die zelluläre Proteinsynthese in eukaryotischen. Zellen durch die Spaltung eines einzigen Adeninrests von der eukaryotischen 28-S-RNA in der 60-S-Ribosomenuntereinheit gehemmt (33). Verschiedene kürzlich veröffentlichte Berichte unterstützen die Annahme, dass die Ricin-Toxin-B-Kette eine umfassende Rolle spielt; wobei angenommen wird, dass das Polypeptid nicht nur mit Galactoseresten auf der Zelloberfläche in Wechselwirkung tritt, sondern auch an dem intrazellulären Transfer des Ricin-Toxins beteiligt sein kann (44). Zahlreiche Rezeptoren, die einen Kreislauf durch die endosomalen Vesikel zur Zelloberfläche führen, verlaufen durch das trans-Golgi-Netz. In den Zellen weist der Golgi die dichteste Konzentration an Ricin-Bindungsstellen auf, was möglicherweise die Konzentration von Galactosyltransferasen in diesem Teil der Zelle widerspiegelt (45). Es wurde beobachtet, dass sich Ricin-Toxin, das durch die Wechselwirkung mit Rezeptoren mit endständiger Galactose in Zellen eindringt, im Golgi-Bereich konzentriert (45).
  • Wenngleich rekombinante B-Ketten-Lectinderivate in der Vergangenheit bereits hergestellt wurden, erfolgte dies im Allgemeinen für therapeutische Anwendungen, um die Toxizität der A-Kette zu verstärken. Aus diesem Grund wurde in vielen Versuchen beobachtet, dass Immunotoxine, die mit der Ricin-Toxin-B- und -A-Kette gemeinsam aufgebaut sind, durchwegs toxischer sind als jene, die beispielsweise nur mit der Ricin-Toxin-A-Kette aufgebaut sind (siehe z. B. Vitetta et al., Sem. Cell. Biol., Band 2, 47–58 (1991); Timar et al., Br. J. Cancer, Band 64, 655–662 (1991); Embleton et al., Br. J. Cancer, Band 63, 670–674 (1991)).
  • Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Nucleinsäuremolekül, das
    • (i) eine Sequenz, die für ein vollständiges Bt-cry-Polypeptid oder einen Teil eines Bt-cry-Polypeptids kodiert, und
    • (ii) eine Sequenz, die für ein vollständiges Lectin oder einen Teil eines Lectins kodiert,
    umfasst.
  • Erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle und die Polypeptidprodukte, für die sie kodieren, können in im Wesentlichen reiner oder homogener Form oder frei von oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure oder Genen der Spezies von Interesse oder mit einem anderen Ursprung als der Sequenz, die für ein Polypeptid mit der erforderlichen Funktion kodiert, aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert und/oder gereinigt werden.
  • Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann cDNA, RNA, genomische DNA umfassen und kann vollständig oder teilweise synthetisch sein.
  • Die Bezeichnung „isoliert" umfasst alle diese Möglichkeiten. Wenn die DNA-Sequenz spezifiziert ist, z. B. in Bezug auf die Seq.-ID Nr. 1–11 in 3(a)–(k), umfasst diese, wenn es der Zusammenhang nicht anders erfordert, das RNA-Äquivalent, wobei U für T substituiert ist, wo dieses vorkommt, sowie degenerativ äquivalente und komplementäre Sequenzen.
  • Vorzugsweise umfasst der Abschnitt des Nucleinsäuremoleküls, der für das Bt-cry-Toxin kodiert, die vollständige Seq.-ID Nr. 1 (CryIA(b)) oder Seq.-ID Nr. 2 (CryIA(c)) oder einen Teil von diesen.
  • Vorzugsweise umfasst der Abschnitt des Nucleinsäuremoleküls, der für Lectin kodiert, die vollständige Seq.-ID Nr. 3 (RTB1), Seq.-ID Nr. 4 (RTB2) oder Seq.-ID Nr. 5 (RTB3) oder einen Teil von diesen; diese wurden von der Ricin-Toxin-B-Kette wie untenstehend erläutert abgeleitet, umfassten aber Mutationen, um Restriktionsstellen einzuführen.
  • Vorzugsweise umfasst das Nucleinsäuremolekül die in einer beliebigen von Seq.-ID Nr. 6 (CryIA(b)-RTB1), Seq.-ID Nr. 7 (CryIA(b)-RTB2), Seq.-ID Nr. 8 (CryIA(b)-RTB3), Seq.-ID Nr. 9 (CryIA(c)-RTB1), Seq.-ID Nr. 10 (CryIA(c)-RTB2) oder Seq.-ID Nr. 11 (CryIA(c)-RTB3) angeführte CryIA-RTB-Kombination.
  • Es ist hervorzuheben, dass die Erfindung auch Nucleinsäuren umfasst, die für Varianten von natürlich vorkommendem/n Toxin und Bindungsmolekülen kodieren, wobei es sich beispielsweise um Mutanten oder andere Derivate solcher Moleküle handeln kann. Insbesondere Nucleinsäuren mit modifizierten Sequenzen auf Basis der Seq.-ID Nr. 1 bis 11 sind Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • In jedem Fall kodiert die Variante für ein Toxin oder ein Bindungsprodukt, wobei beide homolog zu einer natürlich vorkommenden Sequenz (z. B. Bt-Cry oder Lectin) sind und die geeignete funktionelle Eigenschaft dieses Produkts (z. B. Toxizität bzw. die Fähigkeit, Glykosylierung zu binden) beibehalten.
  • Ähnlichkeit oder Homologie können wie durch das TBLASTN-Programm von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990), das auf dem Gebiet der Erfindung herkömmlicherweise eingesetzt wird, oder, und dies ist zu bevorzugen, durch das Standardprogramm BestFit, das Teil des Wisconsin-Pakets, Version 8 (September 1994) (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711) ist, definiert und bestimmt werden.
  • Homologie kann auf der Ebene der Nucleotidsequenz und/oder auf jener der Aminosäuresequenz vorliegen. Vorzugsweise weisen die Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz etwa 50% oder 60% oder 70% oder 80%, besonders bevorzugt zumindest etwa 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, Homologie in Bezug auf die Sequenz auf, die die Basis der Variante ist (z. B. die natürliche Sequenz oder eine beliebige der Seq.-ID Nr. 1 bis 11).
  • Die Homologie kann sich im Vergleich mit, je nachdem, der relevanten Aminosäuresequenz oder Nucleotidsequenz über die volle Länge der jeweiligen Sequenz erstre cken oder noch bevorzugter eine durchgehende Sequenz von etwa 25, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200 oder mehr Aminosäuren (oder Codons) oder länger sein.
  • Eine Sequenzvariante gemäß der vorliegenden Erfindung kann demnach beispielsweise innerhalb der Hybridsequenzen (Seq.-ID Nr. 6 bis 11) für eine einzige Aminosäureveränderung in Bezug auf diese Sequenzen oder für 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 Veränderungen, etwa 10, 15, 20, 30, 40 oder 50 Veränderungen oder mehr als etwa 50, 60, 70, 80 oder 90 Veränderungen kodieren. Zusätzlich zu einer oder mehreren Veränderungen innerhalb der Aminosäuresequenz, für die die dargestellten Sequenzen kodieren, kann eine kodierte Aminosäuresequenzvariante zusätzliche Aminosäuren am C-Terminus und/oder N-Terminus umfassen. Natürlich sind auch Veränderungen an der Nucleinsäure, die keinen Unterschied in Bezug auf die kodierte Aminosäuresequenz hervorrufen (d. h. „degenerativ äquivalent" sind), Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Die Homologie kann unter Einsatz von Hybridisierungsverfahren (52) bestimmt werden, beispielsweise unter Einsatz von Hybridisierungslösungen, die Folgendes umfassen: 5 × SSC (worin „SSC" = 0,15 M Natriumchlorid; 0,15 M Natriumcitrat; pH 7), 5 × Denhardt's Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,05% Natriumpyrophosphat und bis zu 50% Formamid.
  • Eine bekannte Formel zur Berechnung der Stringenzbedingungen, die erforderlich sind, um eine Hybridisierung zwischen Nucleinsäuremolekülen zu erzielen, die eine bestimmte Sequenzhomologie aufweisen, ist Folgende (52):
    Tm = 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (% G + C) – 0,63 (% Formamid) – 600/Anzahl bp im Doppelstrang
  • Zur Veranschaulichung der oben angeführten Formel beträgt Tm unter Einsatz von [Na+] = [0,368] und 50% Formamid, einem GC-Gehalt von 42% und einer mittleren Sondengröße von 200 Basen 57°C. Die Tm eines DNA-Doppelstrangs nimmt mit 1% Rückgang der Homologie um 1–1,5°C ab. Somit wäre bei Targets mit einer Se quenzidentität von mehr als etwa 75% eine Hybridisierungstemperatur von 42°C zu beobachten.
  • Für bestimmte Anwendungen, z. B. die Expression in Pflanzen, kann die Veränderung der Codon-Nutzung (d. h. eine degenerativ neutrale Mutation) zur Unterstützung der Expression besonders nützlich sein. Das AU/GC-Verhältnis für Cry-Gene weicht beispielsweise deutlich von Werten ab, die für pflanzliche kodierende Bereiche und gut exprimierte Reportergene, wie z. B. nptII, bar, gus und cat, festgestellt wurden (24). Ein pflanzlicher kodierender Bereich weist typischerweise einen AU-Gehalt von etwa 40–50% auf, während die für CryI kodierenden Bereiche einen AU-Gehalt von 60–64% aufweisen, der in manchen Bereichen sogar 70% übersteigt (24). Die Codon-Nutzung der für Cry kodierenden Sequenz ist auch ganz anders als die bevorzugte pflanzliche Codon-Nutzung (25). An mehreren Stellen sind Cluster ungünstiger Codons vorhanden. Die Veränderung der Codon-Nutzung kann die wirksame Translation und Verlängerung verbessern, wodurch die mRNA stabiler in Bezug auf zytoplasmatische RNase-Aktivitäten wird (23, 26).
  • Die hierin beschriebenen Mutanten weisen die oben erläuterten verbesserten Bindungseigenschaften auf.
  • Eine Möglichkeit für die Analyse von Mutanten oder anderen Derivaten besteht in der Transformation zur Bewertung der Funktion einer Einführung in eine Wirtszelle, die in der Lage ist, die erfindungsgemäße Nucleinsäure zu exprimieren, und im darauf folgenden Vergleich der Lebensfähigkeit dieser Zelle mit jener von Zellen, die mit anderen Nucleinsäuren transformiert wurden. Die Methode für eine solche Transformation und Analyse, für die ein Beispiel unter Einsatz von SF21-Insektenzellen angeführt ist, wird untenstehend detaillierter beschrieben. Ein weiteres Verfahren umfasst die Verwendung von transgenen Pflanzen, die die Mutante oder das Derivat exprimieren.
  • Verfahren zur Herstellung einer oben offenbarten Mutante oder eines oben offenbarten Derivats umfassen beliebige Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
  • Ein weiterer Aspekt besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäure, die für ein Pestizid-Fusionspolypeptid kodiert, wobei das Verfahren den Schritt der Kombination einer Nucleinsäure, die für ein Toxin kodiert, mit einer Nucleinsäure, die für eine heterologe Bindungsdomäne kodiert, umfasst, wobei die Bindungsdomäne in der Lage ist, nicht spezifisch an eine Zellmembran zu binden, ohne diese zu zerstören.
  • Gegebenenfalls können diesem Verfahren Schritte vorausgehen oder kann dieses Verfahren Schritte umfassen, bei denen Veränderungen der Sequenz des Toxins oder der Bindungsdomäne durchgeführt werden, um eine Mutante oder ein Derivat herzustellen, was durch Addition, Insertion, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide in der Nucleinsäure erfolgen kann, was wiederum zur Addition, Insertion, Deletion oder Substitution einer oder mehrere Aminosäuren in dem kodierten Polypeptid führt.
  • Veränderungen können aus verschiedenen Gründen wünschenswert sein, umfassend das Einführen oder die Entfernung folgender Merkmale: Restriktionsendonuclease-Sequenzen; andere Stellen, die für eine Modifikation nach der Translation erforderlich sind; Spaltungsstellen in dem kodierten Polypeptid; Motive in dem kodierten Polypeptid für Glykosylierung, Lipoylierung etc. Leader-Sequenzen oder andere Targetingsequenzen können zu dem exprimierten Protein zugesetzt werden, um seine Lokalisierung nach der Expression zu bestimmen. Diese können alle ein wirksames Klonieren und das Exprimieren eines aktiven Polypeptids in rekombinanter Form (wie untenstehend beschrieben) unterstützen.
  • Weitere wünschenswerte Mutationen können zufallsbestimmte oder ortsgerichtete, Mutagenese sein, um die Aktivität (z. B. die Spezifität) oder die Affinität oder Stabilität des kodierenden Polypeptids zu verändern.
  • Es ist klar, dass die Polypeptid-Homologie in Bezug auf die Aminosäure-Ähnlichkeit oder -Identität (in diesem Fall in Bezug auf die veränderte Toxin- und/oder Bindungsdomäne) beurteilt wird.
  • Ähnlichkeit ermöglicht konservative Variation, d. h. die Substitution eines hydrophoben Rests, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie z. B. Lysin durch Arginin, Asparaginsäure durch Glutaminsäure oder Asparagin durch Glutamin. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist bekannt, dass die Veränderung der Primärstruktur eines Polypeptids durch konservative Substitution die Aktivität dieses Peptids möglicherweise nicht signifikant verändert, da die Seitenkette der Aminosäure, die in die Sequenz insertiert wird, in der Lage sein kann, ähnliche Bindungen und Kontakte zu bilden wie die Seitenkette der Aminosäure, die substituiert wurde. Das ist auch der Fall, selbst wenn die Substitution in einem Bereich erfolgt, der wesentlich für die Bestimmung der Peptidkonformation ist.
  • Homologe mit nicht-konservativen Substitutionen sind auch Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, beeinflussen Substitutionen in Bereichen eines Peptids, die nicht wesentlich für die Bestimmung seiner Konformation sind, seine Aktivität nicht in großem Ausmaß, da sie die dreidimensionale Struktur des Peptids nicht wesentlich verändern. In Bereichen, die für die Bestimmung der Konformation oder der Aktivität von Peptiden entscheidend sind, können solche Veränderungen dem Polypeptid vorteilhafte Eigenschaften verleihen. Veränderungen, wie z. B. die oben beschriebenen, können dem Peptid leicht vorteilhafte Eigenschaften verleihen, z. B. die Toxizität oder den Wirtsbereich noch weiter verbessern.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt die oben beschrieben Nucleinsäure in Form eines rekombinanten und vorzugsweise replizierbaren Vektors vor.
  • Die Definition von „Vektor" umfasst unter anderem ein beliebiges Plasmid, Cosmid, einen beliebigen Phagen oder einen Agrobacterium-Binärvektor in doppel- oder einfachsträngiger, linearer oder zirkulärer Form, das/der konjugativ oder mobilisierbar sein kann oder nicht und einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch die Integration in das Zellgenom transformieren kann oder extrachromosomal vorhanden sein kann (z. B. ein autonomes replizierendes Plasmid mit Replikati onsstartpunkt). Für manche Anwendungen sind BAC- oder BiBAC-Vektoren besonders zu bevorzugen.
  • Shuttle-Vektoren sind spezifisch auch Teil dieser Definition, wobei damit ein DNA-Träger gemeint ist, der, natürlich oder durch künstliches Design, zur Replikation in zwei verschiedenen Wirtsorganismen in der Lage ist, die aus Actinomyceten und verwandten Spezies, Bakterien und Eukaryoten (z. B. Zellen von höheren Pflanzen, Säugetieren, Hefe oder Pilzen) ausgewählt sein kann.
  • Ein Vektor, der erfindungsgemäße Nucleinsäure umfasst, muss keinen Promotor oder eine andere Regulationssequenz umfassen, insbesondere wenn der Vektor zum Einführen der Nucleinsäure in Zellen zur Rekombination in das Genom eingesetzt werden soll.
  • Vorzugsweise wird die Nucleinsäure in dem Vektor jedoch durch einen geeigneten Promotor oder andere Regulationselemente für die Transkription in einer Wirtszelle, wie z. B. einer Mikroben-, z. B. Bakterien-, oder Pflanzenzelle, reguliert oder ist operabel an diesen/dieses gebunden. Der Vektor kann ein bifunktioneller Expressionsvektor sein, der in zahlreichen Wirten funktioniert. Im Fall von genomischer DNA kann dieser seinen eigenen Promotor oder andere Regulationselemente enthalten, und im Fall von cDNA kann er durch einen geeigneten Promotor oder andere Regulationselemente für die Expression in der Wirtszelle reguliert werden.
  • „Promotor" bezeichnet eine Nucleotidsequenz, durch die die Transkription von operabel stromab (d. h. in der 3'-Richtung auf dem Sense-Strang von doppelsträngiger DNA) gebundener DNA initiiert werden kann.
  • „Operabel gebunden" bedeutet als Teil desselben Nucleinsäuremoleküls gebunden, auf geeignete Weise positioniert und für die Transkription, die durch den Promotor initiiert werden soll, ausgerichtet. DNA, die operabel an einen Promotor gebunden ist, befindet sich „unter der Transkriptionsinitiationssteuerung" des Promotors.
  • Somit stellt dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Genkonstrukt bereit, vorzugsweise einen replizierbaren Vektor, der einen operabel an eine durch die vorliegende Erfindung wie oben beschrieben bereitgestellte Nucleotidsequenz, wie z. B. Seq.-ID Nr. 9, 10 oder 11, gebundenen Promotor umfasst.
  • Im Allgemeinen sind Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung in der Lage, für die rekombinante Genexpression Vektoren zu konstruieren und Protokolle zu gestalten. Geeignete Vektoren können ausgewählt oder konstruiert werden, wobei sie geeignete Regulationssequenzen, umfassend Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und andere geeignete Sequenzen, enthalten. Weitere Details sind beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laborstory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989), zu finden.
  • Viele bekannte Verfahren und Protokolle zur Manipulierung von Nucleinsäuren, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, für Mutagenese (siehe oben), Sequenzieren, das Einführen von DNA in Zellen und Genexpression und zur Analyse von Proteinen werden detailliert in Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology (2. Auflage), John Wiley & Sons (1992), beschrieben. Spezifische Verfahren und Vektoren, die bereits zuvor mit großem Erfolg bei Pflanzen angewandt wurden, werden von Bevan (Nucl. Acids Res. 12, 8711–8721 (1984)) und Guerineau und Mullineaux („Plant transformation and expression vectors", in: Plant Molecular Biology Labfax, 121–148, (Croy RRD (Hrsg.)), BIOS Scientific Publishers, Oxford (1993)) beschrieben.
  • Im vorliegenden Zusammenhang sind Insektenzellvektoren (z. B. auf Baculovirus-Basis) und Pflanzenvektoren von besonderem Interesse.
  • Geeignete Promotoren, die in Pflanzen wirksam sind, umfassen den Blumenkohlmosaikvirus-35S-(CaMV-35S-)Genpromotor, der in hohem Maß in fast allen Pflanzengeweben exprimiert wird (Benfey et al., 1990a und 1990b); den Blumenkohl-Meri-5-Promotor, der im vegetativen Apikalmeristem und an mehreren gut lokalisierten Posi tionen im Pflanzenkörper, z. B. im inneren Phloem, der Blütenanlage, den Verzweigungspunkten in Wurzel und Trieben, exprimiert wird (Medford (1992); Medford et al. (1991)), und den Arabidopsis-thaliana-LEAFY-Promotor, der sehr früh in der Blütenentwicklung exprimiert wird (Weigel et al. (1992)). Weitere Promotoren umfassen den Reis-Aktin-Promotor.
  • In einer Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Genkonstrukt, vorzugsweise ein replizierbarer Vektor, bereitgestellt, der einen induzierbaren Promotor umfasst, der operabel an eine durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Nucleotidsequenz gebunden ist.
  • Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, was die Bezeichnung „induzierbar" in Bezug auf einen Promotor bedeutet. Im Wesentlichen wird die Expression, die durch einen induzierbaren Promotor gesteuert wird, in Reaktion auf einen angewandten Reiz „angeschaltet" oder gesteigert. Die Natur des Reizes variiert in Abhängigkeit von dem Promotor. Einige induzierbare Promotoren verursachen nur ein geringes oder ein nicht detektierbares Maß an Expression (oder keine Expression), wenn der geeignete Reiz fehlt. Andere induzierbare Promotoren rufen eine detektierbare konstitutive Expression auch bei Fehlen des Reizes hervor. Unabhängig davon, wie das Expressionsausmaß bei Fehlen des Reizes aussieht, wird die Expression durch jeden induzierbaren Promotor bei Vorhandensein des richtigen Reizes gesteigert. Vorzugsweise steigt das Ausmaß der Expression bei Anwendung des entsprechenden Reizes in wirksamem Maß an, um eine phänotypische Eigenschaft zu verändern. Somit kann ein induzierbarer (oder „schaltbarer") Promotor eingesetzt werden, der ein Basisausmaß an Expression ohne das Vorhandensein eines Reizes hervorruft, wobei dieses Ausmaß zu gering ist, um einen gewünschten Phänotyp zu bedingen (und auch null sein kann). Bei Anwendung des Reizes wird die Expression auf ein Maß gesteigert (oder angeschaltet), das den gewünschten Phänotyp hervorbringt.
  • Ein geeigneter induzierbarer Promotor kann der GST-II-27-Genpromotor sein, von dem gezeigt wurde, dass er durch bestimmte chemische Verbindungen induziert werden kann, die auf wachsende Pflanzen angewandt werden können. Der Promotor ist sowohl in Monocotyledonen als auch in Dicotyledonen wirksam. Aus diesem Grund kann er eingesetzt werden, um die Genexpression in verschiedenen genetisch veränderten Pflanzen zu steuern, umfassend Feldfrüchte, wie z. B. Raps, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle; Getreide, wie z. B. Weizen, Gerste, Reis, Kukuruz (Mais), Hirse; Früchte, wie z. B. Paradeiser (Tomaten), Mangos, Pfirsiche, Apfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen, sowie Gemüse, wie z. B. Karotten, Salat, Kohl und Zwiebel. Der GST-II-27-Promotor ist auch zur Verwendung in verschiedenen Geweben, umfassend Wurzeln, Blätter, Stängel und Fortpflanzungsgewebe, geeignet. Weitere Promotoren umfassen den Potatin-Promoter (Knollengewächse) und den Ubiquitin-Promotor (Weizenkeime).
  • Der Promotor kann ein oder mehrere Sequenzmotive oder Elemente umfassen, die entwicklungs- und/oder gewebespezifische regulatorische Expressionssteuerung vermitteln.
  • Besonders vorteilhaft im vorliegenden Zusammenhang kann ein induzierbarer Promotor sein, der in Reaktion auf Elicitoren oder andere Pflanzensignale, die während der Prädation ausgelöst werden, angeschaltet wird. Dieses System kann die Reduktion der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung einer Resistenz bei Nahrungsmittelschädlingen über längere Zeiträume hinweg aufgrund des Selektionsdrucks unterstützen, der auf konstitutiv toxische Pflanzen ausgeübt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit, umfassend das Einführen eines solchen Konstrukts in eine Pflanzenzelle und/oder die Induktion der Expression eines Konstrukts in einer Pflanzenzelle, durch die Anwendung eines geeigneten Reizes, eines wirksamen exogenen Induktors.
  • Die oben beschriebenen Vektoren können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, z. B. durch Konjugieren, Mobilisieren, Transformation, Transfektion, Transduktion oder Elektroporation, wie untenstehend detaillierter beschrieben wird, in Wirte eingeführt werden.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Wirtszelle offenbart, die eine Nucleinsäure oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, insbesondere eine Pflanzen-, Insekten- oder Mikrobenzelle.
  • Pflanzenzellen, die mit dem DNA-Segment, das die Sequenz enthält, transformiert sind, können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
  • Somit kann DNA unter Einsatz einer beliebigen geeigneten Technologie, wie z. B. unter Einsatz eines unschädlichen Ti-Plasmidvektors, der durch Agrobacterium getragen wird, unter Ausnutzung dessen natürlicher Gentransferfähigkeit ( EP-A-270355 , EP-A-0116718 , NAR 12(22) 8711–87215 (1984)), mittels Partikel- oder Mikroprojektilbeschuss ( US 5100792 , EP-A-444882 , EP-A-434616 ), mittels Mikroinjektion ( WO 92/09696 , WO 94/00583 , EP 331083 , EP 175966 , Green et al., Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press (1987)), mittels Elektroporation ( EP 290395 , WO 8706614 Gelvin Debeyser), durch andere Formen der direkten DNA-Aufnahme ( DE 4005152 , WO 9012096 , US 4684611 ), durch Liposom-vermittelte DNA-Aufnahme (z. B. Freeman et al., Plant Cell Physiol. 29, 1353 (1984)) oder durch das Vortex-Verfahren (z. B. Kindle, PNAS U.S.A. 87, 1228 (1990d)), in Pflanzenzellen transformiert werden. Physikalische Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen werden in Oard, Biotech. Adv. 9, 1–11 (1991), behandelt.
  • Die Agrobacterium-Transformation wird von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung verbreitet zur Transformation von Dicotyledonen-Spezies eingesetzt. In letzter Zeit gab es deutliche Fortschritte in Richtung einer routinemäßigen Herstellung von stabilen, fruchtbaren transgenen Pflanzen bei fast allen wirtschaftlich relevanten Monocotyledonen-Pflanzen (Toriyama et al., Bio/Technology 6, 1072–1074 (1988); Zhang et al., Plant Cell Rep. 7, 379–384 (1988); Zhang et al., Theor. Appl. Genet. 76, 835–840 (1988); Shimamoto et al., Nature 338, 274–276 (1989); Datta et al., Bio/Technology 8, 736–740 (1990); Christou et al., Bio/Technology 9, 957–962 (1991); Peng et al., International Rice Research institute, Manila, Philippinen, 563–574 (1991); Cao et al., Plant Cell Rep. 11, 585–591 (1992); Li et al., Plant Cell Rep. 12, 250–255 (1993); Rathore et al., Plant Molecular Biology 21, 871–884 (1993); Fromm et al., Bio/Technology 8, 833–839 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, 603–618 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4, 1495–1505 (1992); Walters et al., Plant Molecular Biology 18, 189–200 (1992); Koziel et al., Biotechnology 11, 194–200 (1993); I. K. Vasil, Plant Molecular Biology 25, 925–937 (1994); Weeks et al., Plant Physiology 102, 1077–1084 (1993); Somers et al., Bio/Technology 10, 1589–1594 (1992); WO 92/14828 ). Insbesondere erweist sich die Agrobacterium-vermittelte Transformation nun auch als hochwirksames alternatives Transformationsverfahren in Monocotyledonen (Hiei et al., The Plant Journal 6, 271–282 (1994)).
  • Mikroprojektil-Beschuss, Elektroporation und direkte DNA-Aufnahme sind zu bevorzugen, wenn die Verwendung von Agrobacterium nicht effizient oder unwirksam ist. Alternativ dazu kann eine Kombination verschiedener Verfahren eingesetzt werden, um die Effizienz des Transformationsprozesses zu verbessern, z. B. Beschuss mit Agrobacterium-beschichteten Mikropartikeln ( EP-A-486234 ) oder Beschuss mit Mikroprojektilen, um eine Wunde zu verursachen, gefolgt von der gemeinsamen Kultivierung mit Agrobacterium ( EP-A-486233 ).
  • Die spezielle Auswahl eines Transformationsverfahrens wird durch dessen Effizienz in Bezug auf die Transformation bestimmter Pflanzen-Spezies sowie die Erfahrung und Vorlieben der Person, die die Erfindung ausführt, in Bezug auf eine spezielle gewählte Methode bestimmt. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass die spezielle Wahl eines Transformationssystems zur Einführung von Nucleinsäure in Pflanzenzellen nicht wesentlich für die Erfindung ist und auch keine Einschränkung derselben darstellt, noch gilt dies für die Wahl des Verfahrens zur Pflanzenregeneration.
  • Wenn gewünscht können auch selektierbare genetische Marker eingesetzt werden, die aus chimären Genen bestehen, die selektierbare Phänotypen verleihen, wie z. B. Resistenz gegen Antibiotika, wie z. B. Kanamycin, Hygromycin, Phosphinotricin, Chlorsulfuron, Methotrexat, Gentamycin, Spectinomycin, Imidazolinone und Glyphosat.
  • Es wurde auf dem Gebiet der Erfindung über eine Reihe von Pflanzen berichtet, die mit Bt-Genen transformiert wurden. Insbesondere wurde unter Einsatz einer synthetischen Version von CryIA(b) transgener Mais erhalten, der resistent in Bezug auf extrem starken und wiederholten Maiszünsler-Befall ist (27). Durch die Transformation mit nativem Bt-Gen war es nicht gelungen, die Produktion eines detektierbaren Proteinausmaßes zu erzielen, während ein Steigern des G-C-Gehalts von 38% auf 65% zur Herstellung eines Gens führte, das in hohem Maß in Mais exprimiert wird (27). Dieses CryIA(b)-Gen weist auf Nucleotid-Ebene etwa 65% Homologie mit dem nativen Gen auf und ist so gestaltet, dass es einem Maisgen in Bezug auf die Codon-Nutzung ähnlich ist (27). In den Aspekten der vorliegenden Erfindung, in denen die Pestizid-Fusionsgene zur Expression in Pflanzen eingeführt werden, kann es demnach wünschenswert sein, die Codon-Nutzung wie in (27) beschrieben entsprechend zu verändern, um die Polypeptid-Ausbeute zu steigern.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Transformation einer Pflanzenzelle bereit, das das Einführen eines Vektors der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle und das Hervorrufen oder Ermöglichen einer Rekombination zwischen dem Vektor und dem Pflanzenzellgenom zur Einführung der Nucleotidsequenz in das Genom umfasst.
  • Die Erfindung umfasst ferner eine Wirtszelle, die mit Nucleinsäure oder einem Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert ist, insbesondere eine Pflanzen- oder Mikrobenzelle. In der transgenen Pflanzenzelle (d. h. in Bezug auf die betreffende Nucleinsäure transgen) kann sich das Transgen auf einem extra-genomischen Vektor befinden oder, vorzugsweise stabil, in das Genom inkorporiert sein. Es kann mehr als eine Nucleotidsequenz pro Haploidgenom vorhanden sein.
  • In einer Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Pflanzenzelle bereitgestellt, in deren Genom eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung inkorporiert ist, die operabel durch eine Regulationssequenz zur Steuerung der Expression gesteuert wird. Die kodierende Sequenz kann operabel an eine oder mehrere Regulationssequenzen gebunden sein, die in Bezug auf das Pestizid- Fusionspolypeptid-Gen heterolog oder fremd sein können, d. h. nicht natürlich mit einem Teil des Gens für dessen Expression in Zusammenhang stehen. Die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch einen extern induzierbaren Genpromotor gesteuert werden, um eine Steuerung der Expression durch den Anwender zu ermöglichen.
  • Im Allgemeinen kann eine Pflanze nach der Transformation regeneriert werden, z. B. aus einzelnen Zellen, Kallusgewebe oder Blattscheiben, wie es auf dem Gebiet der Erfindung üblich ist. Fast jede Pflanze kann vollständig aus Zellen, Geweben oder Organen der Pflanze regeneriert werden. Verfügbare Verfahren werden in Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Band I, II und III, Laborstory Procedures and Their Applications, Academic Press (1984), und Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press (1989), behandelt.
  • Die Herstellung von fruchtbaren transgenen Pflanzen gelang bei den Getreidearten Reis, Mais, Weizen, Hafer und Gerste (in K. Shimamoto, Current Opinion in Biotechnology 5, 158–162 (1994), Vasil et al., Bio/Technology 10, 667–674 (1992); Vain et al., Biotechnology Advances 13 (4), 653–671 (1995); Vasil, Nature Biotechnology 14, S. 702 (1996), erläutert).
  • Zusätzlich zu der regenerierten Pflanze umfasst die vorliegende Erfindung Folgendes: einen Klon einer solchen Pflanze, die Saat, geselbstete Nachkommen oder Hybridnachkommen und Abkömmlinge (z. B. F1- und F2-Nachkommen) und alle Teile von diesen, wie z. B. Ableger, Samen.
  • Die Erfindung stellt auch eine pflanzliche Diaspore einer solchen Pflanze bereit, d. h., alle Teile, die bei der, sexuellen oder asexuellen, Reproduktion oder Verbreitung eingesetzt werden, wie z. B. Ableger, Samen und dergleichen.
  • Eine Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Pflanze sein, die sich in einer oder mehreren Eigenschaften nicht reinrassig fortpflanzt. Pflanzensorten können ausgeschlossen werden, insbesondere Pflanzensorten, die gemäß den „Plant Breeders' Rights" einzutragen sind. Es ist anzumerken, dass eine Pflanze nicht als „Pflanzensorte" erachtet werden muss, nur weil sie ein Transgen, das in eine Zelle der Pflanze oder eines Vorfahren dieser Pflanze eingeführt wurde, stabil in ihrem Genom behält.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Beeinflussung der Toxizität einer Pflanze in Bezug auf einen Schädling bereit, wobei dieses das Hervorrufen oder das Ermöglichen der Expression eines Pestizid-Fusionspolypeptid-Gens in den Zellen der Pflanze, wie obenstehend erläutert, umfasst.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, das die Expression einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung (z. B. wie in 3 dargestellt oder einer Mutante, eines Allels oder eines Derivats dieser Sequenz) in den Zellen einer Pflanze (wodurch das kodierte Polypeptid erzeugt wird) nach dem vorhergehenden Schritt des Einführens der Nucleinsäure in eine Zelle der Pflanze oder eines Vorfahrens dieser Pflanze umfasst. Solche Verfahren beeinflussen die Resistenz der Pflanze in Bezug auf einen bestimmten Schädling. Vorzugsweise ist die Pflanze in Bezug auf den Schädling immun, d. h. der Schädling wird die Pflanze unter allen bekannten Bedingungen nicht verzehren oder verletzen. Alternativ dazu kann die Resistenz im Vergleich mit nicht transformierten Pflanzen hoch oder gering sein (d. h. der Schaden ist geringer als im Durchschnitt).
  • Natürlich umfasst die vorliegende Erfindung auch das Expressionsprodukt aller offenbarten Nucleinsäuresequenzen und Verfahren zur Herstellung des Expressionsprodukts durch die Expression von für dieses kodierenden Nucleinsäuren unter geeigneten Bedingungen, was in geeigneten Wirtszellen erfolgen kann.
  • Nach der Expression kann das Produkt aus dem (z. B. mikrobiellen) Expressionssystem isoliert werden und wunschgemäß eingesetzt werden, beispielsweise zur Formulierung einer Zusammensetzung, die zumindest eine zusätzliche Komponente (z. B. eine Trägerflüssigkeit) umfasst. Solche Insektizidzusammensetzungen können beispielsweise in Form von Sprays eingesetzt werden, insbesondere in Situationen, die zu jenen analog sind, in denen die Toxinkomponente des Fusionsproteins bereits zuvor eingesetzt worden sein könnte.
  • Demnach ist eine Pflanze oder eine andere Ware, die anfällig für Schädlingsangriffe ist und mit einer solchen Zusammensetzung behandelt wurde, auch Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Alternativ dazu kann das Polypeptidprodukt seine Funktion in vivo oder wie oben beschrieben in situ erfüllen.
  • Die Erfindung umfasst demnach auch ein Verfahren zur Schädlingsbekämpfung, das den Einsatz eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung (oder einer Zusammensetzung oder eine Wirtszelle, die dieses umfasst) umfasst, insbesondere ein Verfahren zur Schädlingsvernichtung, das die Verabreichung oder das Hervorrufen oder Ermöglichen der Aufnahme des Polypeptids (oder der Zusammensetzung oder der Wirtszelle, die dieses umfasst) durch die Schädlinge umfasst.
  • Die gereinigten Polypeptide der Erfindung können eingesetzt werden, um Verfahren bereitzustellen, die Antikörper einsetzen und auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind. Antikörper und Polypeptide, die Antigen-Bindungsfragmente von Antikörpern umfassen, können z. B. in Tests für das Polypeptid oder zu dessen Markierung eingesetzt werden.
  • Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen das Immunisieren eines Säugetiers (z. B. eines Menschen, einer Maus, eines Kaninchens, eines Pferds, einer Ziege, eines Schafs oder eines Affen) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus den immunisierten Tieren unter Einsatz eines beliebigen aus einer Reihe von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten werden und können, vorzugsweise unter Einsatz von Antikörperbindung an das Antigen von Interesse, gescreent werden.
  • Beispielsweise können Western-Blotting-Verfahren oder Immunausfällung eingesetzt werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)). Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Antikörper können auf verschiedene Arten modifiziert werden. Der Begriff „Antikörper" sollte so ausgelegt werden, dass er alle spezifischen Bindungssubstanzen umfasst, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifizität aufweisen. Diese Bezeichnung umfasst demnach auch Antikörperfragmente, -derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, umfassend alle Polypeptide, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne umfassen, unabhängig davon, ob sie natürlich oder synthetisch sind. Chimäre Moleküle, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne umfassen, oder Äquivalente davon, die an ein anderes Polypeptid fusioniert sind, sind auch von dieser Bezeichnung erfasst. Das Klonieren und die Expression von chimären Antikörpern sind in EP-A-0120694 und EP-A-0125023 beschrieben.
  • Es wurde gezeigt, dass Fragmente eines vollständigen Antikörpers die Funktion der Bindung von Antigenen erfüllen können. Beispiele für Bindungsfragmente umfassen (i) das Fab-Fragment, das aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzigen Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (E. S. Ward et al., Nature 341, 544–546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; (vi) F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei verbundene Fab-Fragmente umfasst; (vii) einkettige Fv-Moleküle (scFv), worin eine VH-Domäne und eine VL-Domäne durch einen Peptidlinker verbunden sind, der es den beiden Domänen ermöglicht, sich zur Bildung einer Antigen-Bindungsstelle zu verbinden (Bird et al., Science 242, 423–426 (1988); Huston et al., PNAS U.S.A. 85, 5879–5883 (1988)); (viii) bispezifische einkettige Fv-Dimere, ( PCT/US92/09965 ) und (ix) „Diakörper", mehrwertige oder multispezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert werden ( WO 94/13804 ; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993)).
  • Diakörper sind Polypeptidmultimere, wobei jedes Polypeptid eine erste Domäne, die eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Leichtkette umfasst, und eine zweite Do mäne umfasst, die eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Schwerkette umfasst, wobei die beiden Domänen verbunden sind (z. B. durch einen Peptidlinker), aber nicht in der Lage sind, miteinander eine Bindung zur Bildung einer Antigen-Bindungsstelle einzugehen: Antigen-Bindungsstellen werden durch die Bindung der ersten Domäne des einen Polypeptids in dem Multimer mit der zweiten Domäne eines anderen Polypeptids in dem Multimer gebildet ( WO 94/13804 ).
  • Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers können Antikörper mit einer geeigneten Bindungsspezifität aus einer rekombinant hergestellten Bibliothek exprimierter variabler Immunglobulindomänen erhalten werden, z. B. unter Einsatz eines λ-Bakteriophagen oder eines filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-Bindungsdomänen auf ihren Oberflächen aufweisen, siehe beispielsweise WO 92/01047 .
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bewertung der Toxizität eines Polypeptids für eine spezielle Spezies offenbart, wobei dieses Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) das Einführen einer Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, in eine Wirtszelle dieser Spezies,
    • (ii) das Hervorrufen oder Ermöglichen der Expression der Nucleinsäure in einer Wirtszelle dieser Spezies,
    • (iii) das Beobachten der Lebensfähigkeit der Zelle, wonach die Ergebnisse der Beobachtung mit der Toxizität des Polypeptids in Beziehung gesetzt werden.
  • Das Einführen und die Expression des Toxins kann wie oben beschrieben erfolgen. Vorzugsweise wird ein gut charakterisierter Promotor eingesetzt, um etwaige Variationen in der Transkription zu minimieren. Die Lebensfähigkeit kann durch ein beliebiges Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, bewertet werden, möglicherweise allein durch visuelle Beobachtung oder durch EM-Betrachtung. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren jedoch den Einsatz eines Tests, durch den die Esterase-Aktivität oder die Membranintegrität bewertet wird, beispiels weise ein Test, der auf dem Ethidium-Homodimer-1, Calcein AM oder Trypan-Blau basiert (siehe Molecular Probes, Produktinformation, Lebend/Tot/Cytotoxizitäts-Set, L-3224). Ethidium-Homodimer-1 und Calcein AM testen verschiedene Aspekte der Zelllebensfähigkeit – nämlich die Plasmamembranintegrität bzw. die intrazelluläre Esterase-Aktivität (40, 41).
  • Wenngleich diese Fluorophore bereits früher in Lebend/Tot-Tests eingesetzt wurden (39), wurden sie nicht in Zusammenhang mit einer spezifisch eingeführten Nucleinsäure, die für ein Toxin kodiert, eingesetzt.
  • Tests in Bezug auf die Membranintegrität können speziell zum Testen von Toxinen (z. B. von Toxinen auf Bt-cry-Basis) nützlich sein, von denen angenommen wird, dass sie auf Membranen wirken.
  • Das Testformat der vorliegenden Erfindung weist eine Reihe von nützlichen Eigenschaften auf – insbesondere wird das zytotoxische Mittel nicht extern aufgebracht. Dadurch wird der Bedarf für die Messung des zytotoxischen Mittels und dessen Reinigung überflüssig.
  • In der vorliegenden Erfindung kann es sich demnach bei dem Polypeptid um das oben beschriebene Pestizid-Polypeptid handeln. Die Wirtszelle stammt von einem geeigneten Schädling, z. B. handelt es sich um eine Insektenzelle.
  • Vorzugsweise wird das Ergebnis der Bewertung der Lebensfähigkeit mit jenem einer Kontrollzelle verglichen, in der das Toxin nicht exprimiert wurde, aber in die gegebenenfalls andere heterologe Nucleinsäuren eingeführt wurden. Ein solcher Vergleich, verbessert die Zuverlässigkeit, mit der eine Korrelation hergestellt werden kann.
  • Baculoviren sind besonders wirksame Vektoren zur Verwendung in diesem Verfahren, da die Proteinsynthese unter Einsatz dieser Vektoren vorübergehend ist (Miller, Ann. Rev. Microbiol. 42, 177–199 (1988)). Während andere Dinge übereinstimmen, steigt die Proteinkonzentration in den Kontroll- und den Versuchszellen mit der damit einhergehenden toxischen Wirkung stetig an, wobei die Stärke dieser Wirkung durch den LC50-Wert des Proteins bestimmt wird.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Zeichnungen und Beispiele weiter veranschaulicht.
  • ZEICHNUNGEN
  • 1 – In Sf21-Zellen und transgenen Reispflanzen exprimierte Konstrukte. (A) Ortsgerichtete Mutagenese der Ricin-Toxin-B-Kette (RTB) zur Ableitung von 3'-terminalen Fragmenten, die die Galactose-Bindungsdomänen (grüne Balken) durchdringen. Fehlgepaarte Oligonucleotide LF1, LB1, LB2 und LB3 wurden eingesetzt, um neue EcoRI-(LF1) und HindIII-(LB1, LB2 und LB3)Stellen einzuführen. Drei RTB-Fragmente wurden erhalten und als RTB1, RTB2 und RTB3 bezeichnet. (B) Schematische Diagramme der Kontroll- und Fusionskassetten. Bt-cry1Ab- und -cry1Ac-Sequenzen werden als orange Balken dargestellt und die RTB-Fragmente als dicke Linien. Die Konstrukte pB und pC waren Bt-Kontrollen, die Konstrukte pR1, pR2 und pR3 waren RTB-Kontrollen, und pBR1, pBR2, pBR3, pCR1, pCR2 und pCR3 waren Fusionskonstrukte. Restriktionsstellen sind nur für pBR1 dargestellt, sind aber für alle Konstrukte gültig. Die Restriktionsstellen sind wie folgt abgekürzt: B = BamHI, Ec = EcoRI, Eh = EheI, H = HindIII. (C) Zur Expression in transgenen Pflanzen wurden die 11 Konstrukte in den Vektor pAC76, der den Mais-Ubiquitin-1-Promotor, das erste Intron und den NOS-Terminator enthielt, kloniert. Die Restriktionsstellen sind wie folgt abgekürzt: Eh = EheI, H = HindIII, S = SmaI.
  • 2 – Überleben, Wachstum und Entwicklung von Reisstängelbohrer-Larven, die, sich von transgenen Reisstämmen ernähren, und Kontrollindividuen. Das Diagramm zeigt das mittlere Überleben der Insekten ± SE nach 4 Tagen (Inokulum zu Beginn: 6 neonatale Larven). Jeder Wert steht für das Mittel vier replizierter Biotests, mit Ausnahme der Kontrolle, die für sechs replizierte Biotests steht.
  • 3(a) bis (k) – Diese Zeichnung zeigt die Nucleotidsequenzen von CryIA (b&c), der Ricin-Toxin-B-Ketten-Genfragmente und der in pFASTBAC1 durch den Polyhedrin-Promotor gesteuert klonierten Fusionsgene. Die Sequenzen sind als Seq.-ID Nr. 1–11 bezeichnet. Alle Sequenzen sind in die 5'-3'-Richtung zu lesen. Das Codon ATG, das bei Nucleotid 97 beginnt, entspricht der Translationsinitiationsstelle für die Gene CryIA (b&c) und alle Fusionsgene. Für die Ricin-Toxin-B-Kettenfragmente dient das Codon ATG, das bei Nucleotidposition 125 beginnt, als Translationsinitiationsstelle. Alle Gene enden in der SV40-Polyadenylierungssequenz. Die Stoppcodons TAG und TAA werden eingesetzt, und ihre Positionen (wenn die Sequenzen in 5'-3'-Richtung gelesen werden) variieren in Abhängigkeit von der Größe jedes Gens. Wenn die Sequenzen in 3'-5'-Richtung gelesen werden, befinden sich die beiden Codone TAG und TAA an der Nucleotidposition 17 bzw. 7.
  • BEISPIELE
  • Materialien: Alle Restriktionsendonucleasen, T4-Ligase und alle Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim (UK) bezogen. Das QIAGEN-Plasmid-Set und das QIAquick-Gelextraktionsset wurden von QIAGEN bezogen. Der pGEM-T-Klonierungsvektor wurde von Promega (UK) erworben. Das Ethidium-Homodimer 1 und Calcein AM wurden von Molecular Probes Europe BV (Niederlande) erworben. Der pFASTBAC1-Baculovirus-Transfervektor, die TC-100-Insektenzellkulturschalen und -nährmedien, fötales Kälberserum, Cellfectin und die DH10BAC-kompetenten Zellen wurden von GIBCO BRL (UK) bezogen. Das Ricin-Toxin-B-Ketten-Gen (Plasmid pWBT) und die Anti-Ricin-Toxin-B-Ketten-Antikörper, die in dieser Untersuchung eingesetzt wurden, wurden freundlicherweise von Dr. L. Roberts von der Warwick University zur Verfügung gestellt. Die Plasmide pUBB und pUBC, die die CryIA(b)- und CryIA(c)-Gene enthielten, wurden freundlicherweise von Dr. I. Altoscar von der University of Ottawa, Kanada, zur Verfügung gestellt und waren wie in Sardana et al. (1996) beschrieben. Alle eingesetzten Primer wurden bei Genosys Biotechnologies (England) synthetisiert.
  • Beispiel 1: Herstellung des Toxingens
  • Ortsgerichtete Mutagenese des Ricin-Toxin-B-Kettengens. Vier mutagene Oligonucleotide wurden in PCR-Reaktionen eingesetzt, um eine EcoRI- und eine HindIII-Restriktionsstelle an ausgewählten Positionen im Verlauf des Ricin-Toxin-B-Kettengens in dem Plasmid pBWT (Wales et al. (1991)) zu schaffen – diese sind in 1A dargestellt. Die fünf mutagenen Oligonucleotide (mutierte Basen sind unterstrichen) waren Folgende:
    Figure 00320001
  • Die PCR-Mutagenese erfolgte in einem Gesamtvolumen von 50 ml, umfassend 1 × PCR-Puffer (Boehringer Mannheim), 200 mM von jedem dNTP, 15 mM MgCl2, 300 nM von jedem Primer, 2,6 Einheiten Enzymgemisch (Boehringer Mannheim) und 70 ng pBWT-Plasmid-DNA. Nach einem anfänglichen 2-minütigen Denaturierungsschritt bei 94°C wurden 10 fixe Amplifizierungszyklen durchgeführt (15 s, 94°C; 30 s, 65°C; 1 min 72°C), worauf 20 weitere schrittweise verlängernde Zyklen folgten (94°C, 15 s; 65°C, 30 s; 72°C, 1 min; wobei die Verlängerung mit jedem Zyklus um 5 s anstieg). Ein letzter Ausdehnungsschritt wurde 7 min lang bei 72°C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden mittels 0,8% Agarosegel-Elektrophorese klassiert, gereinigt (QIA-Quick-Gelextraktionsset, Qiagen) und in den Vektor pGEM-T (Promega) subkloniert. Die Größe und Ausrichtung des Inserts wurde mittels Verdau mit EcoRI und HindIII bestätigt.
  • Sequenzieren zur Bestätigung der ursprünglichen RTB-Sequenz erfolgte unter Einsatz von M13/pUC19-Primern (Gibco BRL) und dem BIG-DYE-Sequenzierset (Boehringer Mannheim). Ein Sequenzierkreislauf wurde unter Einsatz des PTC-200-Peltier-Thermozyklierers (M. J. Research Inc.) durchgeführt.
  • Beispiel 2: Herstellung einer Fusion in einem Baculovirus-Vektor
  • Übersicht über das Baculovirus-System
  • Es wurde bereits zuvor gezeigt, dass die Insekten-Baculoviren Autographa-californica-(Ac) und Bombyx-mori-Polyhedroseviren mit mehreren Kernen (MNPV) vielseitige Hochexpressionsvektoren von heterologen Proteinen sind (6, 7, 13, 17). Das liegt hauptsächlich an der einzigartigen Natur des Baculovirus-Replikationszyklus, der die sequenzielle Expression der durch den Virus kodierten Gene in vier, zeitlich voneinander getrennten Phasen umfasst (2, 7, 10, 18). Die ersten drei Phasen führen zur Herstellung von infektiösen Viruspartikeln, die in andere Zellen eindringen und somit die Infektion verbreiten. In der abschließenden, sehr späten Phase der Genexpression, die etwa 18 h nach der Infektion beginnt, werden die Viruspartikel zu kristallinen proteinhältigen Strukturen, die als Polyeder bezeichnet werden, eingeschlossen (7). Das Polyhedrin-Gen ist für die Produktion der Virus-Partikel entbehrlich und kann durch fremde kodierende Sequenzen ersetzt werden (7, 27). Da das Polyhedrin-Gen in der späten Phase der Genexpression exprimiert wird, kann es durch Sequenzen ersetzt werden, die für toxische Proteine kodieren, ohne die Virusinfektiosität zu beeinträchtigen.
  • Es wurde gezeigt, dass mehrere Insektizid-Kristalltoxine in mit Baculoviren infizierten Insektenzellen exprimiert werden können. Das vollständige Insektizid-Kristallproteingen CryIA(b) wurde in AcNPV kloniert, wodurch das Polyhedrin-Gen ersetzt wird (8). Ein bakterielles moskitozidales CryIVD-Protein voller Länge und in trunkierter Form wurden unter Einsatz des Baculovirus-Vektors auch erfolgreich in Lepidoptera-Zellen exprimiert (11).
  • Klonieren in einen pFASTBAC1-Baculovirus-Transfervektor
  • Die CryIAb- und CryIAc-Gene wurden aus Quellenplasmiden (pUBB und pUBC (46)) durch Verdau mit BamHI und EcoRI exzidiert und in den Baculovirus-Transfervektor pFASTBAC Hb (Gibco) subkloniert. Die rekombinanten Plasmide wurden mit EcoRI und HindIII verdaut, was ein gerichtetes Subklonieren des Ricin-Genfragments ermöglichte. 6 pFASTBAC-Hb-Zwischenfusionskonstrukte wurden erzeugt, die für die zwei Bt-Gene standen, die jeweils an eines der drei RTB-Fragmente fusioniert waren. Diese wurden mit Eco47III und EcoRI (cryIAb) oder EcoRI und XhoI (cryIAc) verdaut, und die Enden wurden unter Einsatz von Mungobohnen-Nuclease geglättet, wodurch die für Bt und RTB kodierenden Regionen bei der erneuten Ligation in den Leseraster gebracht wurden (1). Die rekombinanten Plasmide wurden dann mit StuI und HindIII verdaut, wodurch ein gerichtetes Subklonieren der Fusionskonstrukte in den auf ähnliche Weise verdauten Vektor pFASTBAC1, dessen Polylinker mit Tn7-Bindungsstellen flankiert ist, ermöglicht wurde. Der pFASTBAC1-Vektor wurde auch getrennt davon mit BamHI und EcoRI oder mit EcoRI und HindIII verdaut, um das Subklonieren der beiden nicht modifizierten Bt-Gene bzw. der RTB-Fragmente zur Kontrolle zu ermöglichen.
  • Ortsgerichtete Transposition
  • Rekombinante pFASTBAC1-Transfervektoren wurden in kompetente Escherichia-coli-Zellen des Strangs DH10BAC (Gibco BRL) transformiert. Diese Zellen enthalten ein modifiziertes Baculovirus-Genom, das eine Tn7-Bindungsstelle aufweist, und ein Plasmid, das Tn7-Transposase bereitstellt, wodurch die ortsgerichtete Transposition der in pFASTBAC1 klonierten Kassetten in das Baculovirus-Genom ermöglicht wird. Weiße Kolonien wurden isoliert, und aus diesen wurde hochmolekulare DNA wie dargelegt gereinigt (37).
  • Rekombinante Bacmide wurden unter Einsatz von PCR und der M13/PUC19-Primer bestätigt. 5 μl eines 10 × PCR-Puffers, 1 μl eines 10 × dNTP-Gemischs, 1,25 μl einer, 10 μM Stammlösung jedes Primers, 1,5 μl 50 mM MgCl2, 2,5 μl einer 1%igen Lösung des Tensids W-1, 1 μl Matrix-DNA und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase wurden in 50-μl-PCR-Reaktionen eingesetzt. Nach 3-minütiger Inkubation bei 93°C wurden 35 PCR-Zyklen wie folgt durchgeführt: 45 s lang bei 94°C, 45 s lang bei 55°C und 5 min lang bei 72°C (37). 10 μl der PCR-Reaktionen wurden auf einem 0,8% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen.
  • Ergebnisse der Vektorkonstruktion
  • Drei terminale Deletionen des Ricin-Toxin-B-Kettengens wurden erhalten. Der Verdau der resultierenden rekombinanten pGEM-T-Vektoren mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII lieferte die erwarteten drei Ricin-Toxin-B-Kettengen-Deletionen RTB1, RTB2 und RTB3. Für RTB3 (480 bp, AA1–AA139) wurden die Primer LF1xLB3 eingesetzt; für RTB2 (739 bp, AA1–AA236) wurden die Primer LF1 × LB2 eingesetzt, und für LB1 (841 bp, AA1–AA262) wurden die Primer LF1 × LB1 eingesetzt.
  • Die drei Ricin-Toxin-B-Kettenfragmente wurden dann mit den beiden Bt-Genen (unter Einsatz der EcoRI-Stelle jedes Gens) fusioniert, um 6 verschiedene Translationsfusionsproteine zu erhalten. Die 6 Translationsfusionsproteingene wurden mittels Restriktionsenzymverdau bestätigt (Ergebnisse nicht angeführt).
  • Die Fusionsgene wurden dann unter Steuerung des Polyhedrin-Promotors in das Baculovirus-Genom transponiert. Der Erfolgt der ortsgerichteten Transposition wurde mittels PCR unter Einsatz der M13/PUC-Primer bestätigt. Die Primer wurden auf die Tn7-Bindungsstelle des Baculovirus-Genoms gerichtet. Eine PCR-Reaktion nur in dieser Region (ohne Konstrukt) liefert ein Fragment mit 300 Basenpaaren. Wenn diese Region mit einer nicht-rekombinanten pFASTBAC1-DNA transponiert wird, liefert eine PCR in dieser Region unter Einsatz der M13/PUC19-Primer ein DNA-Fragment mit 2.300 Basenpaaren. Die Ergebnisse der PCR (nicht angeführt) bestätigen die erfolgreiche Transposition der gesamten Translationsfusionsproteingen-Expressionskassetten, wie der entsprechende Größenanstieg auf mehr als 2.300 Basenpaare anzeigt. Diese rekombinanten Baculoviren wurden dann in Sf21-Insektenzellen transfiziert. Hochmolekulare DNA, die aus den infizierten Insektenzellen extrahiert wurde, bestätigte auch (mittels PCR unter Einsatz der M13/PUC-Primer) die erfolgreiche Infektion der Insektenzellen (Ergebnisse nicht angeführt).
  • Beispiel 3: Herstellung von Wirtszellen, die das Pestizid-Fusionspolypeptid exprimieren
  • Transfektion von Sf21-Insektenzellen mit rekombinanter Bacmid-DNA. 1 Million Sf21-Insektenzellen wurden über Nacht in 2 ml mit 10% fötalem Kälberserum ergänztem TC-100-Medium in eine 35-mm-Zellkulturplatte gesät. Die Zellen wurden 2-mal mit Serum und antibiotikafreiem Medium gewaschen und 5 h lang mit 1 ml des Transfektionsgemischs (5 μl rekombinante Bacmid-DNA, 800 μl Serum und antibiotikafreies TC-100-Medium und 6 μl Cellfectin) bedeckt (37). Nach der Entfernung des Transfektionsgemischs wurden die Zellen mit vollständigem TC-100-Medium (ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum) 48 h lang bedeckt. Das Virus wurde in dem Überstand geerntet (erstes Inokulum), und die Zellen wurden weitere 48 h lang mit 2 ml vollständigem Medium bedeckt, wonach das Virus erneut geerntet wurde (zweites Inokulum). Der zweite Überstand wurde als Inokulum in Versuchen eingesetzt, um den optimalen Expressionszeitpunkt der Proteine zu bestimmen. Für alle Infektionen wurde das Medium von den Zellen abgesaugt, und die Zellen wurden 1 h lang mit 250 μl Inokulum bedeckt (m. o. = 5). Nach 1 h wurde das Inokulum verworfen, und die Zellen wurden mit 2 ml vollständigem, mit 10% fötalem Kälberserum ergänztem TC-100-Medium bedeckt. Die Proteinexpression wurde über einen Zeitraum von 60 h hinweg analysiert. Am Ende jeder Analysephase wurden die Zellen unter Einsatz eines Proteinaufschlusspuffers (62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS) lysiert. 15 μl Proteinprobe wurden dann auf ein 12,5% Polyacrylamidgel geladen, und eine Western-Blotting-Analyse wurde entweder mit Anti-Ricin-Toxin-B-Ketten-Antikörpern oder Anti-CryIA(c)-Antiseren durchgeführt.
  • Ergebnis der Western-Blotting-Analyse der Proteinexpression
  • Die Baculovirus-Proteinexpression wurden über einen Zeitraum von 60 h hinweg analysiert. Die Zellproben wurden nach 2, 20, 24, 34, 48 und 60 h p. i. entnommen, und die Proteinkonzentration wurde unter Einsatz des Farbstoffbindungsverfahrens bestimmt (47). Die Proteinproben (20 μg) wurden mittels 12,5% SDS-PAGE fraktio niert und unter Einsatz der Trans-Blot-Halbtrocken-Transferzelle (Bio-Rad) gemäß den Herstellerhinweisen in Nitrocellulosemembranen (Hybond C; Amersham) übertragen. Filter wurden mit Antiseren gegen CryIAb und CryIAc (Ms. S. Bano-Maqbool, Center for Excellence in Plant Molecular Biology, Pakistan) oder RTB (Dr. L. Roberts, University of Warwick, UK) sondiert. Die Erfinder setzten alkalische-phosphatase-(AP-)konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG (Fc) als sekundären Antikörper (Promega) ein, und die Detektion wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
  • Bei RTB1, RTB2 und RTB3 (Kontrollkonstrukte, die nur die Ricin-Toxin-Fragmente enthielten) begann die Proteinexpression etwa 20 h nach der Infektion und stieg schrittweise auf 60 h an, wobei das Optimum um 34 h nach der Infektion erzielt wurde. Proteinbanden, die ein geringeres Molekulargewicht aufwiesen als erwartet und vermutlich Abbauprodukte darstellten, wurden nach 48 h (RTB1), 34 h (RTB2) und 24 h (RTB3) detektiert. Die dritte Ricin-Toxin-B-Kettengen-Deletion, RTB3, scheint demnach insbesondere instabil zu sein und sich nach der Synthese zu zersetzen.
  • Bei den cryIA(a)- und cryIA(c)-Genen gemeinsam mit den Fusionsproteinen wurden Abbauprodukte schon nach 20 h detektiert, was darauf hindeutet, dass die Proteine sensibel in Bezug auf Abbau in den Insektenzellen waren.
  • Beispiel 4: In-vitro-Toxizitätstests
  • Bestimmung der optimalen Fluorophor-Konzentration
  • Die optimale Farbstoffkonzentration variiert in Abhängigkeit von den Zelltypen. Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die geringste Farbstoffkonzentration zu ermitteln, die ein ausreichendes Signal bereitstellt. Gesunde wachsende Zellen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen geerntet und einmal mit 1000 μl Dulbeccos Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Die Hälfte dieser Zellen wurde durch den 30-minütigen Einsatz von 30% Methanol getötet. Unter getrenntem Einsatz von Proben von toten und lebenden Zellen wurde jeweils eine Aliquote der Zellen mit ver schiedenen Konzentrationen des Ethidium-Homodimers-1 von 0,1–12,8 μM 30 min lang inkubiert. Getrennte Proben lebender und toter Zellen wurden auch mit verschiedenen Maßen an Calcein AM (0,1–12,8 μM) inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden unter einem herkömmlichen Fluoresceinmikroskop sichtbar gemacht. Durch eine Konzentration von 6,8 μM Ethidium-Homodimer-1 wurden die Kerne der toten Zellen auf ausreichende Weise hellrot markiert. Bei einer Konzentration von 0,4 μM Calcein AM wurden lebende Zellen in ausreichendem Maß grün markiert. Die beiden Fluorophore wurden dann vermischt, um eine Lösung zu erhalten, die aus 6,8 μM Ethidium-Homodimer-1 und 0,4 μM Calcein AM in D-PBS bestand, wobei die Lösung dann eingesetzt wurde, um Proben toter und lebender Zellen zu färben. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die beiden Fluorophore in den ausgewählten Konzentrationen verlässlich eingesetzt werden können, um die Lebensfähigkeit von infizierten Zellen zu bewerten.
  • Lebend/Tot-Lebensfähigkeits-/Cytotoxizitätstests im Verlauf von 96 h
  • 1 Million Zellen wurden für jede Infektion über Nacht in 35-mm-Kulturschalen gesät (jeweils 7 Wiederholungen). Das Medium wurde von den Zellen abgesaugt, und die Zellen wurden mit 250 μl Inokulum bedeckt. Die 14 verschiedenen durchgeführten Infektionen umfassten Folgende:
    • (a) mit Medium schein-infizierte Insektenzellen;
    • (b) mit nicht-rekombinantem Baculovirus infizierte Zellen;
    • (c) mit rekombinantem Baculovirus, das das gus-Gen enthielt, infizierte Insektenzellen;
    • (d) getrennt voneinander mit rekombinantem Baculovirus, das die kodierende Sequenz von CryIA(b), CryIA(c), RTB1, RTB2 und RTB3 umfasst, infizierte Insektenzellen;
    • (e) getrennt voneinander mit 6 verschiedenen Fusionsgenen infizierte Insektenzellen.
  • Die infizierten Zellen wurden lysiert, und DNA wurde 34 h nach der Infektion aus diesen extrahiert. Die Zusammensetzung des Lysepuffers und das Extraktionsverfahren wurden entsprachen King und Possee (38). Diese DNA wurde eingesetzt, um den Erfolg der Infektion der Sf21-Insektenzellen in PCR-Reaktionen unter Einsatz der M13/PUC-Primer zu überprüfen. Infizierte Zellen aus einer Kulturschale für jede Infektion wurden 2, 24, 34, 48, 72 und 96 h nach der Infektion in Bezug auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Die Zellen wurden bei 5.000 × g pelletiert und einmal mit sterilem Dulbeccos Phosphat-gepufferter Salzlösung (D-PBS) mit Gewebekultur-Qualität gewaschen. Die Zellen wurden vorsichtig erneut in 50 μl des Lebend/Tot-Testreagens (6,8 μM Ethidium-Homodimer-1 und 0,4 μM Calcein AM in D-PBS) suspendiert und bei Raumtemperatur 30 min lang inkubiert. Nach 30 min wurden 40 μl des Testreagens von den Zellen entfernt und verworfen. Ungestört hätten sich die Zellen zu diesem Zeitpunkt bereits am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen abgesetzt. Die verbleibenden 10 μl, die mit Zellen konzentriert waren, wurden auf einen Mikroskopträger aufgebracht und unter dem Fluoresceinmikroskop (485 ± 11 nm) bei 400facher Vergrößerung fotografiert.
  • Ethidium-Homodimer-1 bindet fest an DNA und fluoresziert tiefrot, jedoch handelt es sich um ein hydrophiles Molekül und kann lebende Zellmembranen nicht durchdringen. Calcein AM ist ein neutrales Molekül, dass frei in Zellen diffundiert. Es wird durch die intrazelluläre Esterase-Aktivität gespalten und fluoresziert hellgrün. Ethidiu-Homodimer-1 markiert demnach die Kerne von toten Zellen, während Calcein AM das Cytosol von lebenden Zellen markiert.
  • Zwei Fotosets, eines für die Ethidium-Homodimer-1-Fluoreszenz und das andere für die Calcein-AM-Fluoreszenz, wurden aufgenommen, indem die beiden Filtersets abwechselnd eingeschaltet wurden, so dass es für jede Zellprobe ein Foto gab, das den Anteil der noch immer lebenden Zellen zeigte (grüne Fluoreszenz), und ein weiteres, das den Anteil der toten Zellen zeigte (rote Fluoreszenz).
  • Ergebnisse der Toxizitätstests
  • Bei Betrachtung unter einem Inversionslichtmikroskop (400fache Vergrößerung) wiesen mit den Fusionsproteinen infizierte Zellen bereits 24 h nach der Infektion eine Reihe von Toxizitätssymptomen auf. Die Symptome umfassten Treiben auf dem Medium, große kugelförmige Formen und lysierte Zellen. Einige der Symptome, speziell die Zelllyse, traten in Kontrollexperimenten später als 60 h nach der Infektion auf. Die Kontrollexperimente umfassten mit Medium schein-infizierte Zellen, ausschließlich mit Baculovirus infizierte Zellen und mit rekombinantem Baculovirus, das nur das gus-Gen und Ricin-Toxin-B-Ketten-Genfragmente enthielt, infizierte Zellen. In den Leben/Tot-Lebensfähigkeitstests der mit rekombinanten, verschiedene Proteine exprimierenden Baculoviren infizierten Sf21-Insektenzellen wiesen Zellen mit grüner Fluoreszenz eine Esterase-Aktivität auf und wurden somit als lebend eingestuft, während Zellen mit roter Fluoreszenz beeinträchtigte Membranen aufwiesen und als tot eingestuft wurden.
  • Die Ergebnisse der Tests können wie folgt zusammengefasst werden:
    • (a) Der Test wurde mit gesunden Sf21-Insektenzellen getestet. Nicht infizierte Zellen wurden 72 h lang ungestört und ohne Veränderung des Mediums stehen gelassen. Bei einer wie oben beschrieben durchgeführten Betrachtung wurden nur sehr wenige tote Zellen beobachtet. Wenn gesunde Zellen 30 min lang mit 70% Methanol behandelt wurden, ergab die Betrachtung, dass alle Zellen tot waren.
    • (b) Sf21-Insektenzellen, die nur mit Baculovirus infiziert waren, wurden 2 h, 24 h, 34 h und 72 h nach der Infektion betrachtet. Nach 72 h waren noch viele Zellen am Leben.
    • (c) Sf21-Insektenzellen, die GUS-Aktivität aufwiesen, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Wiederum waren nach 72 h noch viele Zellen am Leben.
    • (d) Sf21-Insektenzellen, die CryIA(b) exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Die Zellen waren durch dieses Protein zwischen 34 und 72 h nach der Infektion stark beeinträchtigt.
    • (e) Sf21-Insektenzellen, die CryIA(c) exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Wiederum waren die Zellen durch dieses Protein zwischen 23 und 72 h nach der Infektion stark beeinträchtigt.
    • (f) Sf21-Insektenzellen, die das RTB1-Protein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Nach 72 h waren viele Zellen noch am Leben.
    • (g) Sf21-Zellen, die das CryIA(b)-RTB1-Fusionsprotein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Die Zellen waren zwischen 24 und 34 h nach der Infektion stark beeinträchtigt.
    • (h) Sf21-Zellen, die das CryIA(c)-RTB1-Fusionsprotein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Die Zellen waren zwischen 24 und 34 h nach der Infektion stark beeinträchtigt.
    • (i) Sf21-Zellen, die das RTB2-Protein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Nach 72 h waren viele Zellen noch am Leben.
    • (j) Sf21-Zellen, die das CryIA(b)-RTB2-Fusionsprotein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Nach 24 h waren viele Zellen tot, d. h. viel früher als in den obenstehenden Tests.
    • (k) Sf21-Zellen, die das CryIA(c)-RTB2-Fusionsprotein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Eine signifikante Zahl der Zellen war nach 24 h tot; wiederum früher als bei alleinigem Einsatz des Toxins.
    • (l) Sf21-Insektenzellen, die das RTB3-Protein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Nach 72 h waren viele Zellen noch am Leben.
    • (m) Sf21-Zellen, die das CryIA(b)-RTB3-Fusionsprotein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Nach 24 h waren viele Zellen tot, wenngleich einige Zellen auch nach 72 h noch überlebten.
    • (n) Sf21-Zellen, die das CryIA(c)-RTB3-Fusionsprotein exprimierten, wurden 2, 24, 34 und 72 h nach der Infektion getestet. Viele Zellen überlebten auch bis nach 72 h.
  • Insektenepithelzellkulturen stellen keine natürlichen Ziele für Bt-d-Endotoxine dar, und ihre Toxinsensibilität ist um einige Größenordnungen geringer als jene, die in den Insekten zu beobachten sind, von denen sie stammen23. Zellkulturen werden jedoch routinemäßig eingesetzt, um die Aktivität von Bt-Toxinen gegen verschiedene Insektenspezies einzuschätzen24.
  • Wenngleich die schwerwiegendsten Symptome in Insektenzellen beobachtet wurden, die mit Fusionsproteinen infiziert wurden, die RTB1 und RTB2 enthielten, führte die Fusion eines beliebigen der drei verschiedenen RTB-Fragmente mit CryIAb oder CryAc zu einer deutlich verstärkten Toxinsensibilität in Sf21-Zellen, wenn diese unter Einsatz von Ethidium-Homodimer-1 und Calcein AM in Bezug auf ihre Lebensfähigkeit getestet wurden. Etwa 34 h nach der Infektion wurden Toxizitätssymptome beobachtet. Es ist klar, dass die Fusionsproteine eine starke zytotoxische Wirkung auf die Insektenzellen haben, die sie produzieren, und es ist auch klar, dass die Addition eines Glykosylierungsbindungs-(Ricin-Toxin-B-Ketten-)Gens zu dem Toxin diese Toxizität verstärkt, wie durch den verfrühten Zelltod und umfassende Zelllyse gemessen werden konnte.
  • Die Wahl der Toxine CryIAb und CryIAc und die Verwendung von Sf21-Zellen basierte auf früheren Beobachtungen, dass CryIAb für Sf9- und IPLB-Sf21-Insektenzellen in moderatem Maß toxisch ist, während CryIAc keine Wirkung auf diese Zellen hat (42, 43). Der Erwerb von Toxizität durch CryIAc bei Kombination mit der Ricin-Toxin-B-Kette deutet klar darauf hin, dass die Galactose-Bindung bei der Vermittlung von Toxizität eine Rolle spielt.
  • Beispiel 5: Verwendung von insektiziden Fusionen in Pflanzen
  • Fusionsproteine können wie folgt in Pflanzen, beispielsweise in Mais oder Reis, transformiert werden. Die Sequenz, die für das Fusions-Polypeptid kodiert, wird gesteuert durch einen Ubiquitin-Promotor in eine Expressionskassette insertiert. Pflanzen werden mittels Partikel-Beschuss transformiert (siehe z. B. Christenson et al., Plant Mol. Biol. 18, 675–689 (1992); Christou et al., Bio/Technol. 16, 957–962 (1991)). Die Pflanzen können dann in Insektenfutter-Biotests eingesetzt werden, um die Toxizität der Fusionen auf Ebene des gesamten Organismus zu bewerten und die Resistenz unter Bedingungen mit unterschiedlichem Selektionsdruck zu messen. Pflanzen können auch in Bezug auf Transgen-Integration und Expressionsmuster untersucht werden, und das Expressionsprodukt kann unter Einsatz von Standardprotokollen gereinigt werden. Ein Beispiel mit Reis ist untenstehend angeführt.
  • Übersicht über die Erzeugung von Bt-transgenen Reispflanzen
  • Von reifen Samen abgeleiteter Reiskeimkallus wurde mit den 11 in 1B dargestellten Konstrukten (6 Fusionen und 5 Kontrollen) transformiert. Jedes Konstrukt wurde mittels Teilchen-Beschuss gemeinsam mit einem Co-Transformationsvektor, der die Selektion von Hygromycin-Resistenz ermöglichte, in Reisgewebe eingeführt. Ferner wurden Pflanzen analysiert, die gleichwertige Mengen der 11 rekombinanten Proteine exprimierten. Die Fusionsproteine wurden wirksamer in transgenen Reispflanzen exprimiert als in Baculovirus-infizierten Insektenzellen, wie es auch bei den nicht modifizierten Bt-Proteinen der Fall war.
  • Transgene Konstrukte
  • Die oben beschriebenen Kontroll- und Fusionsprotein-Kassetten wurden aus den pFASTBAC-Hb-Zwischenvektoren unter Einsatz von EheI und HindIII isoliert und gerichtet in mit SmaI und HindIII verdautes pAL76 (ein Transformationsvektor auf Ubiquitin-Promotor-Basis aus Eigenproduktion) subkloniert (1C).
  • Teilchen-Beschuss und Gewinnen von transgenen Pflanzen
  • Reife Reissamen (Oryza staiva L. cv Eyi105) wurden enthülst und 2 min lang in 70% Ethanol gewaschen. Nach zweimaligem Spülen in destilliertem Wasser wurden die Samen in 1,6% Natriumhypochlorit 30 min lang unter sanftem Rühren sterilisiert und dann drei Mal in sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden in Dunkelheit auf Reiskallus-Induktionsmedium (RCIM; mit 2,5 mg/l 2,4-D ergänztem und mit 2,5 g/l Phytagel verfestigtem MS-Basalmedium) keimen gelassen. Nach 7 Tagen wurde der von dem Scutellum stammende Kallus von den keimenden Samen seziert und in Dunkelheit auf Osmotikummedium (mit 36 g/l Sorbit und 36 g/l Mannit ergänztem RCIM) 4 h lang kultiviert (48). Der Kallus wurde dann mit mit DNA beschichteten Goldteilchen mit 0,95 mm Durchmesser beschossen. Der Beschuss wurde in einem 4-h-Intervall zwei Mal vorgenommen, und der Kallus wurde mit einem der 11 Plasmide, das Fusions- oder Kontrollkonstrukte enthielt, und einem Co-Transformationsplasmid, das einen Hygromycin-Resistenz verleihenden Marker (49) enthielt, gemeinsam in einem Molverhältnis von 1:3 beschossen. Teilchenbeschichtung und Beschussverfahren wurden bereits früher beschrieben (50, 51). Nach dem zweiten Beschuss wurde der Kallus in Dunkelheit weitere 16 h lang auf dem Osmotikummedium inkubiert und für 3 Tage in RCIM übertragen. Der Kallus wurde dann für 4 Wochen in Selektionsmedium (mit 30 mg/l Hygromycin-B ergänztes RCIM) übertragen. Subkulturen wurden in 2-Wochen-Intervallen durchgeführt. Hygromycin-resistenter Kallus wurde bei Tageslicht in HRSM1-Medium (mit 30 g/l Maltose, 2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, 30 mg/l Hygromycin B und 5 g/l Gelrite-Gellan-Gum ergänztes MS-Basalmedium) übertragen, um die Regeneration von Trieben zu initiieren. Nach 1 Woche wurde der regenerierende Kallus in HRSM2 Medium (wie HRSM1, jedoch mit nur 2,5 g/l Gelrite-Gellan-Gum) übertragen und unter denselben Bedingungen kultiviert. Vollständig regenerierte Triebsysteme wurden in Wurzelmedium HRRM (1/2 MS-Basalmedium ergänzt mit 10 g/l Saccharose) übertragen. Reife Pflanzen wurden in ein Glashaus versetzt.
  • RT-PCR-Analyse
  • Die gesamte RNA wurde unter Einsatz des „RNeasy Plant Mini Sets" (Qiagen) gemäß den Herstellerempfehlungen aus 100 mg Blattgewebe transformierter Reispflanzen und Reispflanzen des Wildtyps extrahiert. RT-PCR wurde unter Einsatz des Access-PCR-Sets (Promega) gemäß den Herstellerhinweisen durchgeführt. Die Erfinder verwendeten 100 ng vollständige RNA und 50 pmol jedes Primers. Die Primer CRF1 und CRR1 amplifizieren sowohl CryIAb als auch CryIAc, während die Primer RTF1 und RTR1 das RTB-Genfragment amplifizieren. Die Primersequenzen sahen wie folgt aus:
    Figure 00450001
  • Northern-Blots
  • Vollständige RNA wurde wie oben beschrieben extrahiert, und 15-mg-Aliquoten wurden mittels Elektrophorese auf 1% Agaroseformaldehydgelen fraktioniert und gemäß Standardverfahren in Nitrocellulosefilter übertragen (52). Die Erfinder haben 1,8-kbp-BamHI/EcoRI-Fragmente gemäß den kodierenden Regionen von CryIAb und CryIAc zur Verwendung als Sonden markiert.
  • Western-Blot-Analyse
  • Die Western-Blot-Analyse der transgenen Pflanzen wurde unter Verwendung von kleinen Blattteilen durchgeführt, die unter flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerkleinert wurden. Proben wurden in Proteinextraktionspuffer (100 mM Tris.Cl, pH 8,1, 100 mM 2-Mercaptoethanol) dispergiert und bei 12.000 × g 10 min lang bei 4°C zentrifugiert. SDS-PAGE wurde unter Einsatz von 30-mg-Proben durchgeführt, und die Blotting- und Detektionsverfahren wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
  • Die Analyse der Bandenmuster der Western-Blots deutete darauf hin, dass die Fusionsproteine, die das längste RTB-Fragment (RTB1) enthielten, am stabilsten waren. Die Kontroll-RTB-Fragmente wurden auch wirksam in transgenen Reispflanzen exprimiert. Das Vorhandensein von transgenen mRNAs in den Pflanzen wurde mittels Northern-Blotting-Analyse und RT-PCR bestätigt (Daten nicht angeführt).
  • Demnach ist klar, dass die Fusionsproteine wirksam in den transgenen Reispflanzen exprimiert wurden.
  • Beispiel 6: Insekten-Biotests
  • Übersicht über Insekten-Biotests
  • Insekten-Biotests wurden unter Einsatz von Stängelteilen von Kontrollpflanzen des Wildtyps und transgenen Linien, die individuell mit 9 der 11 in 1B angeführten Konstrukte (6 Fusionen und 5 Kontrollen) transformiert worden waren, durchgeführt. Mit pR2 oder pR3 (Kontrollkonstrukte, die die kürzeren RTB-Fragmente enthielten) transformierte Pflanzen wurden nicht getestet. Die Wirkung dieser Kontroll- und Fusionsproteine wurde anhand eines Reisschädlings getestet, der von wirtschaftlicher Bedeutung ist, nämlich dem gestreiften Reisstängelbohrer.
  • Insektenbiotests
  • Eine Kultur mit Eiern des gestreiften Reisstängelbohrers (Chilo suppressalis) wurde von Dr. M. Cohen, International Rice Research Institute, Philippinen, zur Verfügung gestellt. Die Eier wurden bei einem Temperaturrhythmus von 27/25°C Tag/Nacht mit, einer 16-ständigen Lichtphase gehalten. Die Insekten wurden unter MAFF-Lizenz EPHL 51/2595 (3/1998) gehalten. Reispflanzen wurden gezüchtet und unter identischen Bedingungen gehalten.
  • Biotests wurden unter Verwendung von Stängelteilen primärer Transformanten und Kontrollpflanzen des Wildtyps durchgeführt. Ein einziger Stängelteil, 7 cm lang mit zumindest 1 Knoten, wurde von jeder Pflanze herangezogen. Die Teile wurden auf feuchtem Filterpapier in Schalen platziert und dem Befall durch neonatale Reisstängelbohrer-Larven (< 2 h alt) ausgesetzt, indem drei an jedes Ende der abgeschnittenen Teile platziert wurden, um das Eindringen in den Stängel zu erleichtern. Für jede Linie mit Ausnahme der Kontrollpflanze des Wildtyps, für die 8 Teile zur Wiederholung eingesetzt wurden, standen 4 Teile zur Wiederholung zur Verfügung. Die Schalen wurden dann mit Parafilm abgeschlossen und 4 Tage lang in einer Wachstumskammer unter den oben dargelegten Bedingungen unter Kontrolle stehen gelassen. Nach der Versuchsperiode wurden die Stängelteile unter einem Binokularmikroskop seziert, und das Überleben, die Entwicklung und das Gewicht der Insekten wurden aufgezeichnet. Die statistische Analyse der Insektendaten erfolgte unter Einsatz der Statview-Software v. 5.0 (Abacus Concepts, Kalif.). Eine Varianzanalyse (ANOVA) wurde eingesetzt, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen zu ermitteln. Es wurde eine Ausscheidungsgrenze von p > 0,05 verwendet.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in 2 angeführt. Das Insektenüberleben bei den Stängelteilen der Kontrollpflanzen des Wildtyps betrug > 95%.
  • Bei Pflanzen, die die nicht-modifizierten CryIAb- und CryIAc-Toxine exprimierten, ging das Überleben der Insekten auf zwischen 55 und 80% (Mittelwerte: 79% (CryIAb) und 71% (CryIAc)) zurück. Die Daten deuteten darauf hin, dass CryIAc für den Stängelbohrer etwas toxischer ist als CryIAb, wenngleich der Unterschied statistisch nicht signifikant war. Es bestand keine signifikante Wirkung auf das Überleben der Insekten in der pR1-Linie, die das RTB1-Kontrollfragment exprimierte, wenngleich. die überlebenden Larven ein beeinträchtigtes Wachstum aufwiesen (siehe unten).
  • Mit Ausnahme der mit dem pBR3-Konstrukt transformierten Pflanzen war das mittlere Überleben der Insekten bei allen Pflanzen, die Fusionsproteine exprimierten, signifikant geringer als bei den Kontrollpflanzen des Wildtyps und den Pflanzen, die Kontrollproteine exprimierten.
  • Pflanzen, die mit den Konstrukten pCR1, pCR2 und pCR3 transformiert worden waren, waren hochresistent in Bezug auf den Stängelbohrer, wobei die Insektenmortalität bei 87%, 74% bzw. 61% lag.
  • Die Ergebnisse für die mit den Konstrukten pBR1, pBR2 und pBR3 transformierten Pflanzen variierten in größerem Maß, wobei das Überleben im Bereich von 30–50% lag und pBR2 am wirksamsten war.
  • Die überlebenden Larven wiesen in allen transgenen Linien ein beeinträchtigtes Wachstum und einen Entwicklungsstillstand auf. Das mittlere Larvengewicht fiel in Pflanzen, die die Kontroll-Bt-Proteine und das Kontroll-RTB-Fragment exprimieren, um 30%. In Pflanzen, die CryIAc exprimierten, war der Entwicklungsstillstand gravierender als in jenen, die CryIAb exprimierten.
  • Von den CryIAb-Fusionsproteinen hatte nur pBR1 eine signifikant höhere Wirkung als das Kontroll-Bt-Protein CryIAb, wobei es zu einer 60%igen Reduktion des mittleren Larvengewichts führte. Deutliche Reduktionen des Larvenwachstums und der Larvenentwicklung wurden auch in Pflanzen beobachtet, die pCR1, pCR2 und pCR3 exprimierten. Die Ergebnisse mit pCR2 und pCR3 waren jenen für pBR1 ähnlich, wobei es sich bei pCR1 wiederum um das wirksamste Konstrukt handelte, das einen Rückgang des mittleren Larvengewichts von > 80% hervorrief und eine Entwicklung über das Stadium der Primärlarve hinaus verhinderte.
  • Transgene Reispflanzen, die Fusionsproteine exprimierten, waren demnach vollständig gegen den Verzehr durch den gestreiften Reisstängelbohrer geschützt, wobei eine Insektenmortalität von 55–80% und in überlebenden Larven mangelhaftes Wachstum und ein Entwicklungsstillstand hervorgerufen wurden. pCR1 war das toxischste Fusionsprotein. Nach 4 Tagen betrug die Insektenmortalität 87%, und bei überlebenden Larven bestand ein Entwicklungsstillstand im Stadium der Primärlarve. Nach 4 Tagen hatten Larven, die sich von Reispflanzen des Wildtyps ernährten, das dritte Larvenstadium erreicht und ernste Schäden an den Stängeln verursacht. Larven, die sich von transgenen Pflanzen ernährten, die die Fusionsproteine exprimier ten, verursachten umgekehrt keinen signifikanten Schaden. Die Hinzufügung einer Galactose-Bindungsdomäne zu den Bt-Toxinen verbesserte deren Aktivität gegen den gestreiften Reisstängelbohrer demnach signifikant.
  • Schlussfolgerungen
  • Diese Beispiele zeigen deutlich, dass eine heterologe Bindungsdomäne, die an sich nicht toxisch ist, aber in der Lage ist, nicht spezifisch an eine Zellmembran zu binden, ohne diese zu zerstören (z. B. Ricin-Toxin-B-Kette), bei Kombination mit einem Toxin (z. B. den d-Endotoxinen CryIAb und CryIAc) die Palette molekularer Wechselwirkungen, die den Toxinen zur Verfügung stehen, erweitern kann, wodurch deren Aktivitätsspektrum potenziell auch erweitert wird. Die Beispiele zeigen insbesondere eine gesteigerte Toxizität im Vergleich mit dem nicht modifizierten Toxin sowohl in vitro (in Bezug auf Sf21-Zellen) als auch in vivo (in Bezug auf den gestreiften Reisstängelbohrer). Zusätzlich dazu besteht die Wahrscheinlichkeit, dass die Addition einer neuen Bindungsdomäne die Entwicklung einer Resistenz in Insektenpopulationen verzögert oder verhindert, da es weniger wahrscheinlich ist, dass Insekten Mutationen erfahren, die zwei oder mehrere verschiedene zelluläre Aufnahmeaktivitäten aufheben.
  • Beispiel 7: Bindung von Lectinen, Bt-Toxin und Bt-Lectin-Fusionen an Insektendarm-Polypeptide
  • Methode
  • Kurz zusammengefasst wurden die Gedärme von zwei Reisinsektenschädlingen, dem für die oben beschriebenen Insekten-Biotests eingesetzten gestreiften Reisstängelbohrer und einer Homoptera-Spezies, der Reiszikade (Nilaparvate lugens), seziert. Die extrahierten Darm-Polypeptide wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, einem Blotting unterzogen und mit Lectinen, Bt-Toxin oder Bt-Lectin-Fusionsproteinen sondiert; gebundene Sonden wurden dann durch einen geeigneten spezifischen Antikörper detektiert.
  • Genauer gesagt wurde ein Konstrukt, das für eine His-markierte Fusion der Domäne 1 des Bt-Toxins CryIAc und von Schneeglöckchen-Lectin (GNA) (als JD1 bezeichnet) kodiert, zunächst in E. coli exprimiert. Das Fusionsprotein wurde mittels Chromatographie auf Ni-NTA-Agarose-Perlen (Qiagen) nach der Solubilisierung gereinigt, zur Entfernung von Denaturanten dialysiert und mittels Ultrafiltration konzentriert, um ein Präparat eines löslichen, funktionellen Proteins zu liefern. Die Endkonzentration und die Reinheit wurden mittels SOS-PAGE ermittelt. Reiszikaden-(Nilaparvatalugens-)Mitteldarm wurde aus frisch von Reispflanzen gesammelten Insekten herausgeschnitten und mittels Beschallung in SDS-Probepuffer homogenisiert. Der Mitteldarm des gestreiften Reisstängelbohrers (von Dr. Mike Cohen, IRRT zur Verfügung gestellt) wurde aus Larven im späten Stadium gewonnen und auf ähnliche Weise behandelt. Solubilisiertes Darmprotein wurde dann mittels SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) aufgespalten und auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Proteinmenge entsprach 1,5 Därmen pro Spur für die Reiszikade und etwa 5 μg Protein pro Spur für den gestreiften Reisstängelbohrer. Nach der 60-minütigen Inkubation in Blockierreagens (Sigma) wurden Membranen, die die Darmproteine enthielten, durch die Inkubation mit JD1, CryIAc (eine Spende von Dr. David Ellar; wobei das Protoxin mittels Trypsin-Behandlung wie beschrieben (53) aktiviert wurde), GNA (Dr. W. Peumans und E. van Damme, Catholic University of Leuven, Belgien) bzw. Riciniuscommunis-Agglutinin (Sigma) sondiert. Die Inkubation erfolgte 60 min lang bei 25°C bei einer Konzentration von 1 μg/ml. Die Membranen wurden drei Mal jeweils 5 min lang mit 20 ml Tris-gepufferter Triton-Salzlösung (TBS-T; 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, umfassend 0,15 M NaCl und 0,1% Triton X-100) gewaschen. Die Ligandenbindung wurde dann durch Inkubation mit dem geeigneten Primärantikörper (Anti-CryIAc, eine freundliche Spende von Dr. David Ellar; Anti-GNA, von den Autoren hergestellt; Anti-Ricinus-communis-Agglutin, Vector Labs) 60 min lang in TBS-T bei einer Verdünnung von 1:10.000 bei 25°C detektiert. Die Membran wurde wiederum wie oben beschrieben gewaschen und mit dem Sekundärantikörper (HRP-konjugiert; Bio-Rad) bei einer Verdünnung von 1:5000 inkubiert. Die Membran wurde wiederum wie oben beschrieben gewaschen und weiters zwei Mal in destilliertem Wasser ge spült, bevor ECL-Reagenzien (Amersham Pharmacia Biotech, UK) zugesetzt wurden und der Blot gemäß den Herstellerhinweisen einem Röntgenfilm ausgesetzt wurde.
  • Ergebnisse
  • Die Kombination von Ricinus-communis-Lectin als Sonde und Anti-Ricinuscommunis-Lectin-Antikörpern als Detektionsreagens zeigte eine starke Bindung an eine große Anzahl von Polypeptiden in den Extrakten der Darmgewebe beider Insekten. Im Gegensatz dazu band die CryIAc-Proteinsonde in denselben Extrakten nur an ein Polypeptid stark (etwa 45 kDa im gestreiften Reisstängelbohrer und 90 kDa in der Reiszikade). Um die Unterschiede in Bezug auf die Bindung zwischen Bt-Toxin und einer Bt-Lectin-Fusion weiter zu charakterisieren, wurde ein Fusionsprotein des spezifisch Mannose-bindenden Lectins des Schneeglöckchens (Galanthus-nivalis-Agglutinin; GNA) und CryIAc durch die Expression eines geeigneten Genkonstrukts in E. coli hergestellt. Die Bindung des Fusionsproteins an Insektendarm-Polypeptide wurde dann getrennt mit jener von GNA- und CryIAc-Proteinen verglichen. In Übereinstimmung mit den vorhergehenden Ergebnissen band GNA stark an Polypeptide mit etwa 75 kDa (2 Banden) und 50 kDa, die aus dem Darm der Reiszikade extrahiert worden waren, und band stark an ein Polypeptid mit etwa 80 kDa aus dem Darm des gestreiften Reisstängelbohrers. GNA band auch an ein 45-kDa-Polypeptid im Darmextrakt des Stängelbohrers, das ein ähnliches Molekulargewicht aufwies wie die durch CryIAc detektierte Hauptbande. Die GNA-CryIAc-Fusion band nur sehr schwach an das 85-kDa-Polypeptid, das im Darm des gestreiften Reisstängelbohrers von GNA erkannt worden war, aber band an das 45-kDa-Polypeptid, das von GNA und CryIAc-Toxin erkannt wurde. Die Fusion wies andererseits eine Bindung an alle wichtigen Polypeptide auf, die durch GNA und CryIAc-Toxine in Darmextrakten der Reiszikade (etwa 90 kDa, 75 kDa und 45 kDa) erkannt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Lectin-Bt-Fusionen verglichen mit dem Bt-Toxin, von dem sie abgeleitet sind, andere Bindungsspezifitäten in Bezug auf aus Insektendarmgeweben extrahierte Polypeptide aufweisen.
  • Diskussion
  • In den obenstehenden Experimenten wurde ermöglicht, dass gereinigte Lectine, Bt-Toxine und Bt-Lectin-Fusionsproteine mit aus Insektendärmen extrahierten Polypeptiden reagieren. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Galactose-Bindungsdomäne in Ricin stark an viel mehr Polypeptide in Insektendarmextrakten bindet als das CryIAc-Toxin. Die bifunktionelle Natur der Bindung von Lectin-Bt-Fusionsproteinen (d. h. mit Bindungseigenschaften, die von beiden beitragenden Proteindomänen abgeleitet sind) wurde direkt durch Bindungstest mit einem gereinigten GNS-CryIAc-Fusionsprotein anhand von Polypeptiden aus Insektendärmen gezeigt.
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Claims (36)

  1. Nucleinsäuremolekül, das für ein Pestizid-Fusionspolypeptid kodiert, das (i) eine Toxindomäne und (ii) eine heterologe Bindungsdomäne, die in der Lage ist, sich nichtspezifisch an eine Zellmembran zu binden, ohne diese Membran zu zerstören, umfasst.
  2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Toxindomäne von einem cry-Toxin von Bacillus thuringiensis abgeleitet ist.
  3. Nucleinsäure nach Anspruch 2, worin das cry-Toxin von Bacillus thuringiensis CryIA(b) oder -(c) ist.
  4. Nucleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Bindungsdomäne Kohlenhydrat bindet.
  5. Nucleinsäure nach Anspruch 4, worin die Bindungsdomäne Galactose- oder Galactosylaffinität aufweist.
  6. Nucleinsäure nach nach Anspruch 4 oder 5, worin die Bindungsdomäne von einem Lectin abgeleitet ist.
  7. Nucleinsäure nach Anspruch 6, worin das Lectin ein Ribosomen inaktivierendes Protein des Typs II ist.
  8. Nucleinsäure nach Anspruch 7, worin die Bindungsdomäne von der Ricin Toxin-B-Kette abgeleitet ist.
  9. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin die Toxindomäne eine Aminosäuresequenz umfasst, für die die gesamte oder ein Teil der Seq.-ID Nr. 1 (CryIA(b)) oder Seq.-ID Nr. 2 (CryIA(c)) kodieren kann.
  10. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 9, worin die Bindungsdomäne eine Aminosäuresequenz umfasst, für die die gesamte oder ein Teil von Seq.-ID Nr. 3 (RTB1), Seq.-ID Nr. 4 (RTB2) oder Seq.-ID Nr. 5 (RTB3) kodieren kann.
  11. Nucleinsäure nach Anspruch 9 oder 10, worin das Polypeptid die CryIA-RTB-Kombination umfasst, die eine Aminosäuresequenz aufweist, für die eine beliebige der Seq.-ID Nr. 6 (CryIA(b)-RTB1); Seq.-ID Nr. 7 (CryIA(b)-RTB2); Seq.-ID Nr. 8 (CryIA(b)-RTB3); Seq.-ID Nr. 9 (CryIA(c)-RTB1); Seq.-ID Nr. 10 (CryIA(c)-RTB2); oder Seq.-ID Nr. 11 (CryIA(c)-RTB3) kodieren kann.
  12. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 8, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die zumindest 90% Homologie mit einer beliebigen der Seq.-ID Nr. 1 bis 11 aufweist.
  13. Verfahren zur Produktion einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Verfahren den Schritt des Kombinierens einer Nucleinsäure, die für ein Toxin kodiert, mit einer Nucleinsäure, die für eine heterologe Bindungsdomäne kodiert, umfasst, worin die Bindungsdomäne in der Lage ist, sich nichtspezifisch an eine Zellmembran zu binden, ohne sie zu zerstören.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verfahren weiters den Schritt des Modifizierens der Sequenz des Toxins oder der Bindungsdomäne durch Addition, Insertion, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nucleotide in der Nucleinsäure umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Modifikation der Sequenz eine Änderung in der Codon-Nutzung der Sequenz verursacht.
  16. Rekombinanter Vektor, der eine in einem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchte Nucleinsäure umfasst.
  17. Vektor nach Anspruch 16, worin die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit einem Promotor operabel verbunden ist.
  18. Vektor nach Anspruch 17, worin der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, der als Reaktion auf einen Elicitor oder ein anderes Pflanzensignal, das als Reaktion auf Prädation ausgelöst wird, eingeschaltet wird.
  19. Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18, der ein Baculovirus-Vektor oder ein Vektor ist, der zur Verwendung in einer Pflanze geeignet ist.
  20. Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle, wobei das Verfahren den Schritt der Einführung eines Vektors nach einem der Ansprüche 16 bis 19 in die Zelle und das Herbeiführen oder Ermöglichen von Rekombination zwischen dem Vektor und dem Zellgenom, um die Nucleinsäure in das Genom einzuführen, umfasst.
  21. Wirtszelle, welche eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 19 enthält.
  22. Wirtszelle, die mit einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder einem Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 19 transformiert ist.
  23. Wirtszelle nach Anspruch 21 oder 22, die eine Pflanzenzelle ist.
  24. Wirtszelle nach Anspruch 23, worin die Pflanze eine Monokotyle ist.
  25. Wirtszelle nach Anspruch 24, worin die Monokotyle Mais oder Reis ist.
  26. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst; (a) Durchführen eines Verfahrens nach Anspruch 20, um eine transformierte Pflanzenzelle zu erzeugen; (b) Regenerieren einer Pflanze aus der transformierten Wirtszelle.
  27. Pflanze, die durch ein Verfahren nach Anspruch 26 erhältlich ist und eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 23 bis 25 umfasst.
  28. Pflanze, die ein Klon, eine geselbstete oder eine Hybrid-Nachkommenschaft oder ein anderer Abkömmling einer Pflanze nach Anspruch 27 ist und eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 23 bis 25 umfasst.
  29. Pflanze nach Anspruch 27 oder 28, die eine Monokotyle ist.
  30. Pflanze nach Anspruch 29, worin die Monokotyle Mais oder Reis ist.
  31. Teil oder Propagationseinheit einer Pflanze nach einem der Ansprüche 27 bis 30, der/die eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 23 bis 25 umfasst.
  32. Verfahren zum Beeinflussen der oder Einwirken auf die Toxizität einer Pflanze für einen Schädling, wobei das Verfahren den Schritt des Herbeiführens und/oder Ermöglichens von Expression aus Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Pflanze umfasst.
  33. Pestizid-Fusionspolypeptid, für das Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.
  34. Verfahren zum Produzieren eines Polypeptids nach Anspruch 33, wobei das Verfahren den Schritt des Herbeiführens von Expression aus Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einer geeigneten Wirtszelle umfasst.
  35. Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 33 sowie zumindest eine zusätzliche Komponente umfasst.
  36. Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen, das die Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 33 umfasst.
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