CN1250727C - 杀虫融合物 - Google Patents
杀虫融合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1250727C CN1250727C CN00809697.XA CN00809697A CN1250727C CN 1250727 C CN1250727 C CN 1250727C CN 00809697 A CN00809697 A CN 00809697A CN 1250727 C CN1250727 C CN 1250727C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cell
- cryia
- plant
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 80
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 75
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 52
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 8
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 112
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 93
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 22
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 22
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 13
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 11
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 9
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 5
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 178
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 28
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 9
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 abstract description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 abstract description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 90
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 31
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 26
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 19
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 11
- 241001556089 Nilaparvata lugens Species 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 9
- 230000008676 import Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-nitro-2-(2-nitrophenyl)-4-oxochromen-8-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(C(C=2[N+]([O-])=O)=O)=C1OC=2C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 4
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 4
- 235000010492 gellan gum Nutrition 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- -1 methane amide Chemical class 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 4
- 101100497219 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki cry1Ac gene Proteins 0.000 description 3
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 3
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 3
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 3
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000144619 Abrus precatorius Species 0.000 description 2
- 241000567143 Adenia digitata Species 0.000 description 2
- 241001639638 Adenia volkensii Species 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101100386311 Arabidopsis thaliana DAPB3 gene Proteins 0.000 description 2
- XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N Aspergillomarasmine A Chemical compound OC(=O)C(N)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O XFTWUNOVBCHBJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 2
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 101150076189 CRR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 description 2
- 241001498622 Cixius wagneri Species 0.000 description 2
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 2
- 102100038018 Corticotropin-releasing factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 101000878678 Homo sapiens Corticotropin-releasing factor receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000848490 Homo sapiens Putative RNA polymerase II subunit B1 CTD phosphatase RPAP2 Proteins 0.000 description 2
- 101000639777 Homo sapiens RNA polymerase-associated protein RTF1 homolog Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 101000963974 Hydrophis stokesii Alpha-elapitoxin-Ast2b Proteins 0.000 description 2
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000964025 Naja naja Long neurotoxin 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 2
- 102100034621 Putative RNA polymerase II subunit B1 CTD phosphatase RPAP2 Human genes 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 102100034463 RNA polymerase-associated protein RTF1 homolog Human genes 0.000 description 2
- 101000948733 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Probable phospholipid translocase non-catalytic subunit CRF1 Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 101000693619 Starmerella bombicola Lactone esterase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 101150065438 cry1Ab gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 230000009571 larval growth Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- XIAYFENBYCWHGY-UHFFFAOYSA-N 2-[2,7-bis[[bis(carboxymethyl)amino]methyl]-3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl]benzoic acid Chemical compound C=12C=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C(=O)C=C2OC=2C=C(O)C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)=CC=2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O XIAYFENBYCWHGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000239223 Arachnida Species 0.000 description 1
- 241001566735 Archon Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 241000193368 Bacillus thuringiensis serovar berliner Species 0.000 description 1
- 241000193364 Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001674939 Caulanthus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 244000237791 Chionanthus virginicus Species 0.000 description 1
- 235000015256 Chionanthus virginicus Nutrition 0.000 description 1
- 241001427559 Collembola Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000009847 Cucumis melo var cantalupensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000256113 Culicidae Species 0.000 description 1
- 229920000832 Cutin Polymers 0.000 description 1
- 241001071944 Cyta Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000234283 Galanthus nivalis Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101000962469 Homo sapiens Transcription factor MafF Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241000428199 Mustelinae Species 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000214558 Nemapogon granella Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241001556090 Nilaparvata Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 241000133134 Saussurea Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 241000256103 Simuliidae Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000046109 Sorghum vulgare var. nervosum Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 241001406921 Squamosa Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000255901 Tortricidae Species 0.000 description 1
- 102100039187 Transcription factor MafF Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000219977 Vigna Species 0.000 description 1
- 235000010726 Vigna sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000221013 Viscum album Species 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYJODZUSLXOFNC-UHFFFAOYSA-N [S].[Cl] Chemical compound [S].[Cl] HYJODZUSLXOFNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 101150086784 cry gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 210000003002 eukaryotic large ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical group 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003458 metachromatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 108010010621 modeccin Proteins 0.000 description 1
- 231100001224 moderate toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920001206 natural gum Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000000590 parasiticidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003161 proteinsynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001507 sample dispersion Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 108010076805 snowdrop lectin Proteins 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010043904 volkensin Proteins 0.000 description 1
- KQNNSYZQMSOOQH-GLDAUDTLSA-N volkensin Chemical compound C=1([C@@H]2C[C@@H]3O[C@@H](O)C[C@@H]4[C@]5(C)[C@H]6[C@H]([C@H]([C@@]4(C)C3=C2C)O)OC[C@]6(C)[C@H](OC(C)=O)C[C@@H]5OC(=O)C(/C)=C/C)C=COC=1 KQNNSYZQMSOOQH-GLDAUDTLSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开的是编码杀虫融合多肽的核酸分子，该多肽包括(i)毒素结构域；和(ii)能够与细胞膜非特异性结合而又不破坏该膜的异源结合结构域。优选该毒素结构域来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cry毒素(如CryIA(b)或(c))，结合结构域来自外源凝集素(例如蓖麻毒蛋白B链)。应用此融合物有助于防止用该多肽处理的害虫群产生耐药性。还公开了产生和应用该核酸及其编码多肽的方法和材料。以及载体(如杆状病毒载体或对我们而言适用于植物的载体)、宿主细胞和植物等。本发明的另一方面是评价多肽对某类害虫之毒性的方法，包括(i)将编码该多肽的核酸导入到来自该害虫的宿主细胞内；(ii)使或允许该核酸在来自该害虫的宿主细胞内表达，(iii)观察该细胞的存活率并将观察结果与该多肽的毒性相联系，其中存活率通过衡量酯酶活性或膜完整性来测定。
Description
技术领域
本发明涉及具有结合与毒性部分的新型杀虫融合多肽。其还涉及产生和使用此类多肽的方法和材料，以及分析多肽毒性的分析方法和试剂盒。
现有技术
本领域公知源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的毒素具有杀虫特性。自然状态下，前毒素大分子(130-160kDa)溶于昆虫中肠的碱性环境中。溶解的毒素然后发生蛋白水解，裂解为更小的片段(30-80kDa)。在δ内毒素晶体溶解和活化后，该毒素与特定的中肠细胞表面受体相结互作用，在膜内形成孔洞。细胞的离子平衡受到破坏，细胞裂解。
Bt毒素引起使用者特别注意的地方是其宿主范围、低浓度毒性，以及使目的昆虫产生耐药性的能力。
已报道了许多研究该诸多问题、意欲改善天然毒素的一或多方面的实验。
这样一般认为顶膜上特定受体的存在对于Bt毒素的特异性起重要作用(1)。在这种情况下，毒素潜力可依赖于受体丰度及其与该蛋白的亲和力，以及该毒素形成孔洞的能力。杀虫晶体蛋白CryIA(a)和CryIA(c)有82％同源性，但后者对烟芽夜蛾(heliothisvirescens)和粉纹夜蛾(trichoplusiani)的杀虫活性比CryIA(a)高10倍(4)。这两种基因之间的同源扫描和相互重组表明，CryIA(c)的335-450氨基酸与抗T.ni的活性有关，而同一毒素的335-615氨基酸是完全变成H.virescens特异性所必需的(4)。
总体而言，杀虫蛋白的特异性是几种功能的结果，包括昆虫中肠蛋白酶的蛋白水解过程、受体结合和/或细胞裂解功能(4)。鳞翅类特异性的杀虫晶体蛋白的末端缺失结果表明5’端至第10密码子或3’端第645密码子缺失不会使毒性消失(5)。
通过点定向突变，Cry毒素暂定为含三个功能结构域。结构域I与毒素插入到膜内有关并影响离子通道的功能，结构域II与受体结合和插入到膜内有关，结构域III与离子通道功能、受体结合以及插入到膜内有关(6)。
在烟草天蛾幼虫(manduca sexta)和甘蓝蝴蝶(大菜粉蝶(Pierisbrassicae))的刷状缘膜囊泡上进行两种Btδ内毒素Bt2(源自苏云金芽孢杆菌柏林那亚种(B.thuringiensis berliner)的130kDa重组晶体蛋白)和Bt4412(源自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种(B.thuringiensis thuringiensis)的136kDa晶体蛋白)的结合研究(12)。Bt2活性蛋白(60kDa)结合并杀伤两种昆虫而Bt4412活性蛋白仅对烟草天蛾幼虫有强毒性(12)。该研究表明大菜粉蝶与Bt2和Bt4412毒素具有两种不同的结合位点，因为两种蛋白几乎并不竞争彼此的结合位点(12)。
自敏感烟草天蛾幼虫的中肠上皮细胞克隆得到CryIA(b)毒素的受体(13)。据测定该210kDa的膜糖蛋白受体与钙粘蛋白蛋白质超家族具有30-60％相似性，和20-40％同一性。钙粘蛋白是膜糖蛋白，据信介导钙依赖的细胞积聚和分类(13)。该受体的确切功能尚未得知。但有可能参与膜转运，一种与钙粘蛋白样人肠肽转运蛋白的功能相类似的功能，后者引导肽类抗生素透过沿小肠排列的上皮细胞(13)。认为苏云金芽孢杆菌毒素主要作用于敏感昆虫的中肠上皮细胞(13)。
另一结合蛋白质纯化自烟草天蛾，大小为120kDa(14)。同一蛋白质，氨肽酶N，纯化自舞毒蛾(Lymantra dyspar(卷叶蛾)刷状缘膜囊泡(14)。测试CryIA(a)、CryIA(b)、CryIIA、CryIC、CryIIIA、CryIIB、CryID、CryIF和CryIVD时，纯化自舞毒蛾的氨肽酶N几乎没有结合活性(14)。相反，纯化自烟草天蛾的氨肽酶N与CryIA(a)、CryIA(b)和CryIA(c)有很强的结合亲和力(14)。尚不清楚为何氨肽酶N的结合活性有此差别。相反推测蛋白质根据其得以纯化的昆虫来源不同而产生差别，或该差异反映了所用方法的敏感性的差别(14)。虽然实验室选择实验表明许多昆虫可产生Bt基因抗性，一农作物害虫，菱形斑纹蛾(plutella xylostella)的户外群已产生Bt耐药性(17)。已发现菱形斑纹蛾的一种常染色体隐性基因对四种Bt毒素CryIA(a)、CryIA(b)、CryIA(c)和CryIF具有极高抗性(16)。这表明抵抗四种Bt毒素的此类突变导致破坏(其)与作为所有四种Bt毒素之共同受体的单一昆虫蛋白质的结合(16，18)。这表明确实可能对甚至含有多种Bt毒素的植物产生抵抗力。
WO91/17254(加利福尼亚大学的董事)公开了改善宿主范围或杀虫毒素毒性的方法。主要是将杀虫蛋白与源自苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)的多核多角病毒(MNPV)的特定的肠-上皮-结合糖蛋白gp64相连接。该糖蛋白据说与上皮细胞表面受体相互作用，从而使积聚并进入到中肠细胞内。另一实施方案表明CytA蛋白质可用来增强毒性。该蛋白据说与细胞脂质部分的脂肪酸结合，通过去污剂样的作用方式使之得以破坏。未讨论抗性(若有的话)。
天然Bt基因的结合结构域也已由其他的Bt基因替代，从而改变该蛋白质的毒性(见如De Maagd等人(1996)Appl Env Microb 62No 5：1537-1543)。如上所述，如参见(16)，考虑到可能产生抗性，此策略不会使特性改善。
根据这些发现，可以看到新型毒素杀虫物质，尤其是提供另外的方法的或优于上述杀虫物质的新型毒素杀虫物质，将对本领域有所贡献。
发明内容
本发明已经合成高表达毒性融合蛋白质的融合蛋白质基因。这些蛋白质包括与提高毒素部分的效能的异源结合结构域融合的毒素结构域。该结合结构域优选能非特异性地与细胞膜结合而不破坏它们的结构域，从而使该毒素结构域在其作用位点浓缩和固定而不需要特殊受体的呈递。已经应用Bt-来源的区域和碳水化合物结合部分，例如蓖麻毒蛋白B链基因的半乳糖结合结构域举例说明。
应用采用昆虫细胞系和一对荧光染料的新型改良分析方法，已经证实该表达产物的毒性优于该融合蛋白质任一组成部分的毒性。发展了评价融合基因产物毒性的体外生物分析方法，该方法建立在乙锭同源二聚体1和钙黄绿素(Calcein)AM的基础上。这两种荧光团早先主要用于活/死毒性分析中(39)。下面将描述本发明的这些和其它方面的内容。
这样在本发明第一方面的内容中公开了编码杀虫融合多肽的核酸分子，其中所述融合多肽包括：
(i)毒素结构域
(ii)能与细胞膜非特异性结合而不破坏该膜结构的异源结合结构域。
‘杀虫的’意思是指具有抗任何一种或多种类型害虫，尤其是包括昆虫和其它节肢动物如蛛形纲的有经济学意义的非脊椎类害虫的毒性。昆虫包括任何发育时期的昆虫。感兴趣的昆虫的具体类别包括鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、蚊科(Culicidae)、蚋科(Simuliidae)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)和双翅目(Diptera)昆虫。
‘融合多肽’意思是指含有两个或多个成分的多肽，这些成分是互为异源性的，也就是不是天然存在的单一多肽链的一部分。或者可包括连接区，该连接区通过减少结构域之间的位阻效应促使这些结构域折叠成天然构象。
‘毒素’是指优选以害虫所能摄入之数量对害虫产生毒性的物质。融合蛋白质的毒素部分可以是合成的或者源自天然来源，如原核生物、真核生物(包括真菌、植物和动物)。尤其想到应用已证实的蛋白质毒素(比如，Bt毒素或者植物防御性的异化学物例如来自豇虫或大豆的蛋白酶抑制剂)或其部分。优选这些杀虫剂可杀虫但对人类和动物无害。优选在细胞膜具有其确切作用位点的毒素。
上面所提的Bt毒素是非常有效的毒素成分来源。在本发明第一方面的最优选形式中，该毒素源自Bt cry多肽。这样在该方面的一实施方案中该毒素为Bt cryIA(b)或(c)。
融合多肽的‘结合’结构域可以与细胞膜非特异性结合而不破坏该膜，因此该结合域本身是无毒的。
本文中‘非特异性’是指无需特定的特异性受体。其优越性在于减少害虫通过在编码毒素受体的核酸序列内发生突变而产生对融合物抗性的可能性，因为考虑在Bt抗性中发生过这种情况(见参考文献16、17、18)。其提供除物理方法以外的方法，可用来最大限度地减少抗性发生的可能性，也就是播种时将Bt转化的植物与非-转化植物混合以便最大限度地减少选择性压力。
‘结合’结构域本身是无毒的，也就是尽管其可以增加毒素结构域的毒性，但在融合蛋白质中单独应用时，其本身不引起明显的或更优选地任何的对细胞膜的破坏。这样结合区域高效协助毒素发挥其作用，但是优选不改变该毒素机理的作用方式，从而提供更高的可预测的特异性和反应。这在其中该融合蛋白质可进入动物食物链中，并且其中该毒素已经严格筛选、对动物无-毒的实施方案中是非常有用的。
优选该结合结构域与碳水化合物结合，后者以糖脂和糖蛋白的形式存在于所有的真核细胞膜的细胞外侧。因此该结合结构域将毒素锚定在多种细胞的作用位点上。
优选该细胞形成害虫的肠上皮部分。
优选将毒素实际上固定于作用位点，但是即使实际上(不可逆的)未发生固定，应用异源结合结构域仍将作用以提高毒素在其细胞膜作用位点的有效浓度。
在此方面的一个实施方案中，结合结构域含有所有的或部分外源凝集素。本领域技术人员熟知外源凝集素具有与碳水化合物紧密结合的能力，不同的外源凝集素一般对不同的糖残基具有特定的亲和力。尤其需要的是具有半乳糖和半乳糖基亲和力的结构域，其可以在靶害虫类别中导致非常广泛的结合。
优选的外源凝集素是2型核糖体失活蛋白质，并应用(非-毒性)B链。该类型的例子包括
(a)相思豆(Abrus precatorius)(相思豆毒素)
(b)欧寄生(Viscum album)(檞寄生毒素)
(c)蒴莲属digitata(Adenia digitata)(modeccin)
(d)蒴莲属volkensii(Adenia volkensii)(volkensin)
给出列有上述4种范例的起源和特性的表格(Stirpe等人，1992.植物来源的核糖体失活蛋白质：现况与展望(Riobosome-inactivating proteins from plants：present status and futureprospects)。生物/技术(Bio/Technology)，10卷，405-412；Barbieri，等人.，1993.植物来源的核糖体失活蛋白质(Riobosome-inactivating proteins from plants).Biochemica etBiophysica Acta，1154卷，237-282)。
最优选在核酸中应用来源于蓖麻毒蛋白的蓖麻毒蛋白B链基因。蓖麻毒蛋白是毒性糖蛋白，包括两个多肽链，A和B，它们通过二硫键相连(32)。
B-链与细胞表面的半乳糖苷末端残基的结合是通过位于该肽任何一端的两个半乳糖结合结构域来完成的(34)。在缺乏另一位点时，两个结合位点中的每一个位点都能与半乳糖和更复杂的糖结合，与配体的亲和力无明显降低(35)。
已经发现在昆虫细胞中表达的双外源凝集素位点蓖麻毒蛋白B链突变体具有半乳糖残基结合能力：蓖麻毒蛋白B链上具有两个以上的外源凝集素位点的证据。Bioconjugate，Chem.7卷，651-658；Ferrini，等人.，1995.应用杆状病毒系统表达功能性蓖麻毒蛋白B链(Expression of functional ricin B chain using thebaculovirus system).欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.).233卷，772-777)。这表明可能存在其他的细胞-表面结合位点。一种可能是蓖麻毒蛋白B链本身的甘露糖侧链与细胞表面的甘露糖受体相作用(见Newton等人(1992)生物化学杂志(J Biol Chem)267(17)：11917-11922；Frankel等人(1997)糖类研究(CarbohydrateResearch)300，3：251-258)。
其B链与细胞表面的结合，例如与具有非还原末端半乳糖残基的糖缀合物结合，使得或促进蓖麻毒蛋白内吞到细胞内。内吞可通过包壳和非包壳小窝内的胞内吸收来完成(见如Frankel等人(1996)蛋白质工程(Protein Engineering)9，4：371-379；Magnusson和Berg(1993)生物化学杂志291：749-755)。运送并释放自由A链至胞浆后，通过自60s核糖体亚基内的真核28sRNA断裂一个腺嘌呤残基来抑制真核细胞的细胞蛋白质合成(33)。几种最新研究支持蓖麻毒蛋白B链的广泛作用；该多肽据认为不仅与细胞表面半乳糖残基相作用，也可能与蓖麻毒蛋白的细胞内转运有关(44)。经内涵体囊泡再循环至细胞表面的许多受体穿过跨-高尔基网状体。细胞内的高尔基体蓖麻毒蛋白结合位点最密集，也许说明半乳糖转移酶在此细胞器内的浓度(45)。已观察到通过与半乳糖-末端受体相互作用而进入细胞的蓖麻毒蛋白积聚在高尔基体区域(45)。
尽管过去已制备了重组B链外源凝集素衍生物，但其一般用于治疗应用，以便增强A链的毒性。因此在许多实验中已观察到，利用蓖麻毒蛋白B和A链一起构建的免疫毒素比仅用例如蓖麻毒蛋白A链构建的毒素有更强的毒性(见如Vitetta等人，1991 Sem.Cell Biol 2卷，47-58；Timar，等人1991英国癌症杂志(Br.J.Cancer)，64卷，655-662；Embleton，等人，1991英国癌症杂志，63卷，670-674)。
因此本发明的第二方面是包括以下部分的核酸分子：
(i)编码全部或部分Bt cry多肽的序列和
(ii)编码全部或部分外源凝集素的序列。
可以分离和/或纯化自其天然环境，基本上很纯或均质的形式，或没有或基本没有不同于编码具有所需功能多肽之序列的感兴趣种类或来源的核酸或基因来提供本发明的核酸分子和其编码的多肽产物。
本发明的核酸可包括cDNA、RNA、基因组DNA，可以是全部或部分合成的。
术语‘分离的’包含所有这些可能性。指定DNA序列时，例如参考图3(a)-(k)的Seq ID Nos 1-11，除非文章另外要求，否则由U替代T的RNA等价物和简并的等价物以及互补序列也包括在内。
优选核酸分子的Bt cry毒素-编码部分包括Seq ID No 1(CryIA(b))或Seq ID No 2(CryIA(c))的全部或部分。
优选核酸分子的外源凝集素-编码部分包括全部或部分Seq ID No3(RTB1)、Seq ID No4(RTB2)或Seq ID No5(RTB3)；如下所述这些来源于蓖麻毒蛋白B链，但是包括导入限制性位点的突变体。
优选该核酸分子含有任何一个Seq ID No 6(CryIA(b)-RTB1)；Seq ID No 7(CryIA(b)-RTB2)；Seq ID No 8(CryIA(b)-RTB3)；Seq ID No 9(CryIA(c)-RTB1)；Seq ID No 10(CryIA(c)-RTB2)或Seq ID No 11(CryIA(c)-RTB3)中所示的CryIA-RTB联合体。
需着重指出的是本发明也涉及编码天然毒素和结合分子的变异体的核酸，其可以例如为这些分子的突变体或其它衍生物。尤其包括具有依据Seq ID No 1到11所修饰的序列的核酸。
在每种情况下，该变异体编码与天然序列(如Bt Cry或外源凝集素)同源的毒素或结合产物，并保留那些产物的恰当的功能特点(例如，分别地，毒性或结合糖基化的能力)。
相似性或同源性可通过Attschul等人.(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-10的TBLASTN程序来定义或判定，该程序是在本领域中标准应用的程序，或者可以优选标准程序BestFit，其是Wisconsin软件包版本8，1994年9月的一部分，(遗传学计算机组(Genetics Computer Group)575 Science Drive，Madison，威斯康辛州，美国，威斯康辛53711)。
同源性可以是核苷酸序列和/或氨基酸序列水平上的。优选地，核酸和/或氨基酸序列与作为该变体基础的序列(例如天然序列，或任一Seq ID Nos 1到11序列)共享大约50％，或60％，或70％，或80％的同源性，最优选地至少大约90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。正如可能存在的情况所示，与相关氨基酸序列或核苷酸序列相比，同源性可以就相关序列全长来说，或更优选地可以就大约或多于约20、25、30、33、40、50、67、133、167、200个或更多氨基酸(或密码子)的连续序列来说。
这样本发明的变异序列可以编码，例如(杂交序列Seq ID Nos 6到11)关于那些序列的单一氨基酸变化，或2、3、4、5、6、7、8或9个变化，大约10、15、20、30、40或50个变化，或超过大约50、60、70、80、或90个变化。除了所述序列编码的氨基酸序列中一个或多个改变之外，编码的变异氨基酸序列可包括C-端和/或N-端其它氨基酸。自然地，包括所编码氨基酸序列无变化的核酸的改变(也就是‘简并等价物’)。
应用杂交技术(52)例如应用杂交液可以评价同源性，该杂交液包括：5×SSC(其中‘SSC’＝0.15M氯化钠；0.15M柠檬酸钠；pH7)、5×Denhardt氏试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.05％焦磷酸钠和最高50％的甲酰胺。
计算完成特定序列同源性的核酸分子之间的杂交所需严格条件的一般公式为(52)：Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp(双链)
就上述公式举例说明，采用[Na+]＝0.368和50％的甲酰胺，及GC含量42％和200个碱基的平均探针长度，Tm为57℃。同源性每降低1％，DNA双链的Tm降低1-1.5℃。因此，超过大约75％序列同一性的靶序列可以用42℃杂交温度观察。
对于某些应用例如在植物内表达尤其有用的是密码子使用上的变化(即简并中性突变)，以便帮助表达。例如Cry基因的AU/GC比值明显不同于植物编码区和良好表达的报告基因如nptII、bar、gus和cat中的比值(24)。植物编码区AU含量一般约为40-50％，而CryI编码区AU含量为60-64％，一些区域超过70％(24)。同样，Cry-编码序列所用密码子与优选使用的植物密码子明显不同(25)。一些位点存在不利的密码子群。改变所用的密码子可提高翻译和延伸效率以便使mRNA更稳定地抵抗胞质RNA酶的活性(23，26)。
此处所述的突变体具有上述增强的结合特性。
一种分析突变体或其他衍生物的可能方式是通过转化来评价导入到能表达本发明之核酸的宿主细胞内的功能，随后比较该细胞和转化有其他核酸的细胞的存活率。利用SF21昆虫细胞作为示例，下面详述了此类转化和分析的方法。另一方法包括应用表达突变体或衍生物的转基因植物。
产生上述突变体或衍生物的方法包括对本领域技术人员而言所熟悉的任何方法。
因此另一方面是产生编码杀虫融合多肽的核酸的方法，包括编码毒素的核酸与编码异源结合结构域的核酸的连接步骤，其中该结合结构域能与细胞膜非特异性结合而不破坏之。
或者该方法可包括，或在这之前加上，改变毒素或结合结构域的序列以便产生突变体或衍生物这一步骤，其可通过在核酸内添加、插入、缺失或替换一或多个核苷酸导致所编码的多肽中添加、插入、缺失或替换一个或多个氨基酸。
可因多种原因需要改变，包括导入或去掉以下特征：限制性内切酶序列；翻译后修饰所需的其他位点；所编码多肽的断裂位点；所编码多肽发生糖基化或脂化等的基序等。可将先导或其他靶序列加到表达蛋白上以便确定其在表达后的位置。所有这些可有助于有效克隆和表达重组形式的活性多肽(如下所述)。
其他所需突变可以是随机或点定向诱变，以改变所编码多肽的活性(如特异性)或亲和力或稳定性。
容易理解，多肽同源性通过氨基酸相似性或同一性来判断(这种情况下考虑毒素结构域和/或结合结构域的变化)。
相似性可以是保守变化，即一种疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替换另一疏水性残基，或一极性残基替换另一极性残基，如精氨酸替换赖氨酸、谷氨酸替换天冬氨酸、或谷氨酰胺替换天冬酰胺。正如本领域的技术人员所熟知的，通过保守性替换改变多肽的一级结构可以不明显改变此多肽的活性，因为插入该序列的氨基酸的侧链可能能够形成与替换出的氨基酸的侧链相似的键和连接。甚至当替换发生于决定该肽构象的关键区域时也是如此。
具有非-保守性替换的同源体也包括在内。如本领域技术人员所熟知的，对确定其构象不是关键性的区域的替换对其活性可能无太大影响，因为它们不明显改变该肽的三维结构。在确定肽构象或活性中关键的区域，这样的改变可以赋予该多肽有益特性。实际上，如上所述的改变可稍稍提高该肽的特性，例如毒性增加或宿主-范围扩广。
在本发明一个方面中，上述的核酸的形式是重组体形式并且优选为可复制载体。
“载体”定义包括，特别是任何质粒、粘粒、噬菌体或双链或单链线性或环状形式的Agrobacterium(土壤杆菌属)binary载体，其可以或不可以自身传递和转移，并能通过整合到细胞基因组内或存在于染色体外(例如具有复制起始点的自我复制质粒)来转化原核或真核宿主。对于一些应用而言尤其适用的是BAC或BiBAC载体。特别包括穿梭载体，即自然地或通过设计能够在两个不同宿主生物体内复制的DNA载体，宿主可选自放线菌或相关种类，细菌和真核生物(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。
包含本发明之核酸的载体无需含有启动子或其它调控序列，尤其是如果应用该载体向细胞中导入核酸以进行基因组重组时。
但是，优选载体中的核酸在适宜的启动子或其它调控元件的控制之下，并可操作性地与其相连，以便在宿主细胞例如微生物如细菌，或植物细胞中转录。该载体可以是在多种宿主中发挥功能的双-功能表达载体。就基因组DNA而言，其可含有其自身启动子或其他调控元件；就cDNA而言，其可以在适宜启动子或其它调控元件的控制之下，以便在宿主细胞中表达。
“启动子”意思是指可以启动可操作性地连接到其下游的DNA的(即以双链DNA有义链的3’方向)的转录的核苷酸序列。
“可操作性连接”是指作为相同核酸分子的一部分连接，适宜定位和定向以便由启动子起始转录。可操作性地与启动子连接的DNA在该启动子的“转录起始调控下”。
这样本发明的此方面提供基因构建体，优选可复制载体，包括与如上所述本发明提供的核苷酸序列例如SEQ ID No 9、10或11操作性相连的启动子。
一般而言，本领域的那些技术人员能够很好地构建载体和设计重组基因表达方案。可选择或构建适宜的载体，其含有适宜的调控序列，包括启动子序列、终止片段、多聚腺苷酸序列、增强子序列、标记基因和其它的适当序列。细节见，例如，分子克隆(MolecularCloning)实验室手册：第二版，Sambrook等人，1989，冷泉港实验室出版社。
许多已知的核酸操作技术和方案，例如制备核酸构建体、诱变(见上)、测序、向细胞内导入DNA和基因表达，及蛋白质分析在分子生物学当前技术(Current Protocols in Molecular Biology)，第二版，Ausubel等人编辑.John Wiley和Sons，1992.中有详细描述。Sambrook等人和Ausubel等人的公开内容在此引入作为参考。早先广泛地成功应用于植物的具体方法和载体见Bevan(核酸研究(Nucl.Acids Res.)12，8711-8721(1984))和Guerineau和Mullineaux(1993)(植物转化和表达载体(Plant transformationand expression vectors.).于：植物分子生物学Labfax(Cory RRDed))牛津，Bios Scientific Publisher，PP121-148)所述。
本文中具体涉及昆虫-细胞载体(例如以杆状病毒为基础)和植物载体。
在植物中起作用的适宜启动子包括实际上在全部植物组织中高水平表达的菜花样花叶病毒35S(CaMV35S)基因启动子(Benfey等人，1990a和1990b)；在植物顶端分生组织和植物体中几个很好定位的部位例如，内韧皮部、花原基、根和芽的分支点表达的菜花样花叶病毒5启动子(Medford，1992；Medford等人，1991)，和在花极早发育时期表达的拟南芥(Arabidopsis thaliana)Leafy启动子(Weigel等人，1992)。其它的启动子包括水稻肌动蛋白启动子。
在本发明此方面的一个实施方案中提供基因构建体，优选可复制载体，包括与本发明提供的核苷酸序列操作性连接的可诱导性启动子。
本领域的技术人员很好理解应用于启动子的术语“可诱导”一词。实际上，在可诱导性启动子控制下的表达针对所施加的刺激“开启”或增加。启动子之间的刺激特性是不同的。在没有适宜刺激物存在的情况下，某些可诱导性启动子不引起表达或表达水平无法检测(或无表达)。其它的可诱导启动子在无刺激物存在的情况下引起可检测的组成型表达。在没有刺激物的情况下无论表达水平如何，在正确刺激物存在的情况下任何可诱导性启动子导致表达增加。优选的情况是以有效改变表型特性的剂量应用相关刺激物时，表达水平增加。因此在无刺激物存在的情况下(刺激物水平太低以至于不能产生所需表型(且可能实际为零))，可应用导致基础水平表达的可诱导性(或‘可开启’)启动子。加入刺激物时，表达增加(或开启)至产生所需表型的水平。
GST-II-27基因启动子可以是适宜的可诱导性启动子，已发现其可通过能够用于培育植物的某些化学化合物来诱导。在单子叶植物和双子叶植物中该启动子均行使功能。因此在多种遗传修饰植物中，包括大田农作物例如芸苔、向日葵、烟草、甜菜、棉花；谷类例如小麦、大麦、水稻、玉米、高粱；水果例如西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉和甜瓜；及蔬菜例如胡萝卜、莴苣和洋葱，可应用该启动子来控制基因表达。GST-II-27启动子也适宜用于多种组织中，包括根、叶、茎和生殖组织。其它的启动子包括potatin启动子(块茎)和泛素启动子(小麦胚)。
该启动子可包括一个或多个序列基序或提供发育和/或组织-特异性表达调控的元件。
本文内容中的独特优势是可诱导启动子，其可以受诱发物或捕食过程中触发的其它植物信号影响而反应性地开启。该系统可辅助降低长期喂食-害虫的过程中所产生耐药性的可能性，其是因为组成性毒性植物所带来的筛选压力造成的。
本发明提供的方法还包括将这些构建体导入植物细胞和/或通过应用适宜刺激物、有效的外源诱导剂，诱导植物细胞中构建体的表达。
通过任何适宜的方法例如结合、移动、转化、转染、转导或如下详述的电穿孔方法可将上述的载体导入宿主中。在本发明的另一方面中，公开了含有根据本发明的核酸或载体的宿主细胞，尤其是植物、昆虫或微生物细胞。
应用那些本领域技术人员所熟知的标准技术可制备用含有该序列的DNA片段转化的植物细胞。
因此可应用任何的适宜技术将DNA转化进入植物细胞，例如土壤杆菌属利用其自然基因转移能力携带的双臂(disarmed)Ti-质粒载体(EP-A-270355、EP-A-0116718、NAR12(22)8711-87215，1984)、颗粒或微粒轰击(US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)微注射(WO 92/09696，WO 94/00583、EP 331083、EP 175966，Green等人。(1987)植物组织和细胞培养(Plant Tissue and CellCulture)，Academic Press)、电穿孔(EP290395、WO 8706614 GelvinDebeyser)其他形式的定向DNA摄取(DE 4005152、WO 9012096、US 4684611)、脂质体介导的DNA摄取(例如，Freeman等人，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol).29：1353(1984))、或震荡方法(例如Kindle，美国国家科学院院报，美国.87：1228(1990d))。在Oard，1991，生物技术进展(Biotech.Adv.)9：1-11中综述了转化植物细胞的物理方法。
那些本领域的技术人员广泛应用土壤杆菌属转化来转化双子叶种类。近来，在几乎所有的经济相关单子叶植物中常规制备稳定能育转基因植物已经取得了实质性进步(Toriyama，等人.(1988)生物/技术(Bio/Technology)6，1072-1074；Zhang，等人.(1988)PlantCell Rep.7，379-384；Zhang，等人.Theor Appl Genet 76，835-840；Shimamoto，等人(1989)自然(Nature)338，274-276；Datta，等人.(1990)生物/技术8，736-740；Christou，等人.(1991)生物/技术9，957-962；Peng，等人.(1991)国际水稻研究所(International Rice Institute)，马尼拉，菲律宾563-574；Cao，等人.(1992)Plant Cell Rep.11，585-591；Li，等人.(1993)Plant Cell Rep.12，250-255；Rathore，等人.(1993)植物分子生物学(Plant Molecular Biolgy)21，871-884；Fromm，等人.(1990)生物/技术8，833-839；Gordon-Kamm，等人.(1990)植物细胞(PlantCell)2，603-618；D’Halluin，等人.(1992)植物细胞4，1495-1505；Walters，等人.(1992)植物分子生物学18，189-200；Koziel，等人.(1993)生物技术(Biotechnology)11，194-200；Vasil，I.K.(1994)植物分子生物学25，925-937；Weeks，等人.(1993)植物生理学(Plant Physiology)102，1077-1084；Somers，等人.(1992)生物/技术10，1589-1594；WO92/14828).特别地，现在土壤杆菌属介导的转化也成为单子叶植物中的另一种高效转化方法(Hiei等人.(1994)植物杂志(The Plant Journal)6，271-282)。
在土壤杆菌属无效或无作用时优选微粒轰击、电穿孔和直接DNA摄取。或者可以结合应用不同的技术来提高转化过程的效率，例如用包被有土壤杆菌的微颗粒进行轰击(EP-A-486234)或微粒轰击以便诱导损伤，然后用土壤杆菌属共同培养(EP-A-486233)。
转化技术的具体选择将通过其转化某些植物种类的效率和用特定选择方法来实施本发明的人的经验和偏好来决定。很显然，对于技术人员来说，将核酸导入植物细胞的转化系统的具体选择是非必须的或不限制本发明，植物再生技术的选择同样如此。如果需要的话，可应用由嵌合基因组成的可选择性遗传标志，其提供例如对抗生素如卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素(phosphinotricin)、氯磺隆、氨甲蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮和草甘膦耐药的可选择性表型。
本领域已经报道许多转化有Bt基因的植物。具体而言，应用合成的CryIA(b)已经获得抵抗欧洲玉米蛀虫极高度和反复感染的转基因玉米(27)。用天然Bt基因进行转化无法产生可检测水平的蛋白质，而将G-C含量由38％提高至65％产生了在玉米中高度表达的基因(27)。在核苷酸水平上此CryIA(b)基因与天然基因具有大约65％的同源性并且按照密码子应用状况将其设计组装到玉米基因中(27)。这样在本发明之向植物导入杀虫-融合基因以便表达的那些方面中，需要相应地如(27)中所述改变密码子应用状况以便提高多肽的产量。
这样本发明的另一方面提供转化植物细胞的方法，包括将本发明的载体导入植物细胞中并且致使或允许该载体和该植物细胞基因组之间重组以便将该核苷酸序列导入基因组中。
本发明还包括转化有本发明之核酸或载体的宿主细胞，尤其是植物或微生物细胞。在转基因植物细胞(也就是对正讨论的核酸的转基因)中该转基因可以在外-基因组载体上或优选牢固地掺入基因组中。每个单倍体基因组可有一个以上的核苷酸序列。这样在本发明此方面的一个实施方案中提供其基因组中已掺入本发明核酸的植物细胞，该核酸受控制表达的调控序列的操作性控制。编码序列可以可操作性地与一个或多个调控序列连接，该调控序列可以是与杀虫融合多肽基因异源或外源的，即与该基因表达的任一部分无天然联系。本发明的核酸可置于在外部可诱导的基因启动子的控制下，从而将表达置于使用者的控制之下。
一般说来，在转化之后，植物可以从例如，单细胞、愈伤组织或叶片再生，这是本领域标准技术。几乎任何的植物能从该植物的细胞、组织和器官完全再生。在Vasil等人.，细胞培养和植物体细胞遗传学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics)，卷I、II、III，实验室方法及其应用，Academic Press，1984和Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法(Methods for Plant MolecularBiology)，Academic Press，，1989中综述了可以使用的技术。
已经能够在谷类水稻、玉米、小麦、燕麦和大麦中实现能育转基因植物的增升(见综述Shimamoto，K.(1994)生物技术的当前观点(Current Opinion in Biotechnology)5，158-162；Vasil等人.(1992)生物/技术10，667-674；Vain等人.1995生物技术进展(Biotechnology Advances)13(4)：653-671；Vasil，1996，自然生物技术(Nature Biotechnology)14 702页)。
除了再生的植物，本发明包括下面所有内容：这样一种植物的克隆、种子、自交或杂交子代和后代(例如F1和F2后代)及任何这些东西的任何部分，例如插条、种子。
本发明还提供取自这样一种植物的植物繁殖体，其为可用于再生或繁殖的任何有性或无性部分，包括插条、种子等等。
本发明的植物可以是一或多种特性根本无法培育的植物。可以排除植物品种，特别是根据植物培育者权利可注册的植物品种可除外。注意不必仅因为其基因组中稳定含有导入该植物的细胞或其祖细胞中的转基因就认为该植物是‘植物品种’。
本发明还提供影响或改变植物对害虫毒性的方法，包括造成或使得上述杀虫融合多肽基因在植物细胞中表达。
本发明还提供包括在早先将核酸导入植物细胞或其祖先的细胞中的步骤之后该本发明核酸(例如图3所示，或该序列的突变体、等位基因或衍生物)在植物细胞中(从而产生该编码多肽)表达的方法。这些方法将影响或改变植物对于特定害虫的抵抗性。优选植物将有对此害虫的免疫力，即在任何已知的情况下此害虫将不消耗或损伤该植物。或者与非转化植物相比抵抗性可高或低(即损害低于平均水平)。
自然地本发明还包括任何所公开的核酸序列的表达产物及通过在适宜条件下，在适宜的宿主细胞中，编码核酸的表达而产生表达产物的方法。表达后，可从表达系统(如微生物)中分离该产物并可以根据需要用于例如包括至少一种附加成分(例如液体载体)的组合物的制备。这些杀虫组合物可用作例如，喷雾剂，尤其在与已事先采用该融合蛋白质的毒性成分的情形相似的情况下。
这样，对经这样一种组合物处理的害虫之攻击敏感的植物或其它物品，也是本发明的一部分。
或者该多肽产物可如上所述在体内或在原位行使其功能。
因此本发明还包括防制害虫的方法，包括应用本发明多肽(或组合物或含有其的宿主细胞)，尤其是杀死害虫的方法，包括向害虫给予或造成或使得其摄入该多肽(或组合物或含有其的宿主细胞)。
采用本领域标准技术可应用本发明的纯化多肽制备抗体。抗体和包括抗体的抗原-结合片段的多肽可以用于例如多肽的分析，或对其进行标记。
制备抗体的方法包括用蛋白质或及其片段免疫哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或猴)。应用任何本领域中已知的各种技术可从免疫动物中获取抗体，并且优选应用抗体与目的抗原的结合进行筛选。例如，可应用Western印迹技术或免疫沉淀(Armitage等人，1992，自然(Nature)357：80-82)。抗体可以是多克隆的或单克隆的。抗体可通过多种方法修饰。实际上术语“抗体”应理解为涵盖任何具有所需特异性的结合结构域的特异性结合物。这样，该术语涵盖抗体片段、抗体衍生物、功能等价物和同系物，包括任何含有免疫球蛋白结合结构域的天然或合成多肽。因此与其它多肽融合的含有免疫球蛋白结合结构域或等价体的嵌合分子包括在内。嵌合抗体的克隆和表达见EP-A-0120694和EP-A-0125023中所述。
已经发现整个抗体的片段能行使结合抗原的功能。结合片段的示例为：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的V1和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人.，自然341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab’)2片段，含有两个相连Fab片段的二价片段(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域与VL结构域通过肽连接物连接，该连接物使两个结构域连接以产生抗原结合位点(Bird等人，科学(Science)，242，423-426，1988；Huston等人，美国国家科学院院报，美国，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“diabodies”，通过基因融合构建的多价体或多特异性片段(WO94/13804；P Holliger等人.美国国家科学院院报，美国，90 6444-6448，1993)。
Diabodies是多肽的多聚体，每一个多肽具有含免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和含免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，将两结构域连接(例如通过肽连接物)但不能相互结合以形成抗原结合位点：通过多聚体中一多肽的第一结构域与多聚体中另一多肽的第二结构域的连接来形成抗原结合位点(WO94/13804)。
作为免疫哺乳动物的替代物或补充物，例如应用表面具有功能性免疫球蛋白结合结构域的λ噬菌体或丝状噬菌体；例如见WO92/01047，可从表达免疫球蛋白可变结构域的重组制备文库中获取具有适宜结合特异性的抗体。
在本发明的又一方面公开了评价多肽对具体物种之毒性的方法，包括：
(i)将编码所述多肽的核酸导入该物种的宿主细胞，
(ii)导致或使该核酸在该物种的宿主细胞中表达，
(iii)观察该细胞的存活力并使观察结果与该多肽的毒性相联系。
如上所述可完成该毒素的导入和表达。为最大限度地减少转录中的任何变异优选应用已充分表征的启动子。可通过本领域已知的任何方法，可能仅通过视觉观察，或应用EM观察，来评价存活力。但是，在优选的实施方案中，该方法包括应用评价酯酶活性或膜完整性的测定法，例如以乙锭同源二聚体1、钙黄绿素AM或台盼蓝(见分子探针(Molecular Probes)，产品说明书，活/死/细胞毒性试剂盒，L-3224)为基础的测定法。乙锭同源二聚体1和钙黄绿素AM分别测定细胞存活力-质膜完整性和细胞内酯酶活性的不同方面(40，41)。
尽管以前在活/死分析(39)中应用过这些发色团，其应用还未涉及过特异性导入的毒素-编码核酸。
膜完整性分析对于测定考虑作用于膜的毒素(例如以Bt cry为基础的毒素)是非常有用的。
本发明的测定格式具有许多有用特征-尤其是不用外加细胞毒性试剂。这便无需检测该细胞毒性试剂及其纯度。
因此在本文中该多肽可以是上述的杀虫性多肽。该宿主细胞将来自适宜的害虫，例如昆虫细胞。
优选将存活力评价结果与不表达该毒素、但其中已随意导入了其它异源核酸的对照细胞的结果进行比较。此比较将提高可获得相关性的可信性。
杆状病毒是本方法中应用的非常有效的载体，因为应用这些载体的蛋白质合成是瞬间的(Miller(1988)微生物年度综述(Ann RevMicrobiol)42：177-199)。在对照细胞和实验细胞中与该蛋白质浓度相同的其它东西将稳定增加共存的毒性效应，其严重程度将由该蛋白质的LC50来测定。
参考下面的非-限制性图表和实施例，本发明将进一步得到说明。根据这些说明本领域技术人员可采用本发明范围内的其他实施方案。
附图
图1-在Sf21细胞和转基因水稻植物中表达的构建体。(A)蓖麻毒蛋白B-链(RTB)的点定向诱变以衍生跨越半乳糖-结合结构域(绿盒)的3’末端片段。将错配的寡核苷酸LF1、LB1、LB2和LB3用于导入新的EcoRI(LF1)和HindIII(LB1、LB2和LB3)位点。获得三个RTB片段并命名为RTB1、RTB2和RTB3。(B)对照物和融合盒的示意图。橙色盒表示Bt cry1Ab和cry1Ac序列，粗线为RTB片段。pB和pC构建体是Bt对照物，pR1、pR2和pR3构建体是RTB对照，pBR1、pBR2、pBR3、pCR1、pCR2和pCR3是融合构建体。仅显示pBR1限制性位点，但适用于所有的构建体。将位点简写如下：B＝BamHI、Ec＝EcoRI、Eh＝EheI、H＝HindIII。(C)转基因植物中的表达，在含有玉米泛素-1启动子和第一内含子及nos终止子的pAC76载体中克隆该11个构建体。限制性位点简写为：Eh＝EheI、H＝HindIII、S＝SmaI。
图2-以转基因水稻茎和对照物为食的枝干蛀虫幼虫的生存、生长和发育。图示在4天后的昆虫平均存活率±SE(6个新生幼虫的初始接种物)。每一数值代表除对照外4个重复的生物分析的平均值，对照代表6次重复的生物分析。
图3(a)到(k)-显示CryIA(b&c)、蓖麻毒蛋白B链基因片段和在多角体蛋白启动子的控制下将融合基因克隆到pFASTBAC1中的核苷酸序列。该序列为Seq ID Nos 1-11。所有序列按照5’-3’方向阅读。自第97核苷酸开始的ATG密码子是CryIA(b&c)基因和所有融合基因的翻译起始位点。就蓖麻毒蛋白B链片段而言自第125位核苷酸开始的ATG密码子为翻译起始位点。所有基因终止于SV40多聚腺苷酸序列。采用的终止密码子为TAG和TAA，其位置(按照5’-3’方向阅读序列的话)因每一基因的长度而变化。若以3’-5’方向阅读序列的话，两种密码子TAG和TAA分别位于17和7位的核苷酸。
实施例
材料。所有限制性核酸内切酶、T4连接酶和所有限制性酶购自Boehringer Manheim(英国)。QUIAGEN质粒试剂盒和QUIAquick凝胶提取试剂盒购自QUIAGEN。pGEM-T克隆载体购自Promega(英国)。乙锭同源二聚体1和钙黄绿素AM购自分子探针欧洲BV(荷兰)。pFASTBAC1杆状病毒转移载体、TC-100昆虫细胞培养皿和培养基、胎牛血清、cellfectin和DH10BAC全能细胞购自GIBCO BRL(英国)。本研究所使用的蓖麻毒蛋白B链基因(pWBT质粒)和抗-蓖麻毒蛋白B链抗体由Warwick大学的L.Roberts博士惠赠。含有CryIA(b)和CryIA(c)基因的pUBB和pUBC质粒由加拿大渥太华大学I.Altosaar博士惠赠，并如同所述(Sardana等人，1996)。所有使用的引物由Genosys生物技术(英国)合成。
实施例1：毒素基因的制备
对蓖麻毒蛋白B链基因进行点定向诱变。将4种诱变寡聚核苷酸用于PCR反应，以便在pWT质粒内的蓖麻毒蛋白B链的所选择位点产生EcoRI和HindIII限制性位点(Wales等人，1991)-见图1A。五种诱变寡聚核苷酸(有下划线的为突变碱基)为：
LF1＝5′CAACAACAAAG
GAATT
CATGCTGATG 3′
LB1＝5′GGACACACACACTGCAAG
CTTGTAATC 3′
LB2＝5′CGGATCCGA
AAGC
TTCACATCTAACAC 3′
LB3＝5′GCTTGCAAGC
TTAGACCATATAGCCC 3′
在含有1X PCR缓冲液(Boehringer Mannheim)、200mM每种dNTP、15mM MgCl2、300nM每种引物、2.6单位酶混合物(BoehringerMannheim)和70ng pBWT质粒DNA的50ml总体积内进行PCR诱变。开始的变性步骤为94℃2分钟，然后是10次固定的扩增循环(94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，1分钟)，然后是另一进行性延长的20个循环(94℃，15秒；65℃，30秒；72℃，1分钟；延伸步骤每循环增加5秒)。最后的延伸步骤是72℃进行7分钟。通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物大小，纯化之(QIA-quick凝胶提取试剂盒，Qiagen)并亚克隆到pGEM-T载体(Promega)内。通过EcoRI和HindIII酶切来确定插入物的大小和方向。
应用M13/pUC19引物(Gibco BRL)和BIG DYE测序试剂盒(Boehringer Mannheim)进行测序以确认原来的RTB序列。应用PTC-200 Peltier热循环仪(M.J.Research Inc.)进行循环测序。
实施例2：杆状病毒载体内融合物的制备
杆状病毒系统回顾
先前已发现苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)(Ac)昆虫杆状病毒和家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒(MNPV)是异源蛋白的多能高水平表达载体(6，7，13，17)。这主要是由于杆状病毒复制循环的独特性质所致，包括病毒编码基因在四个短暂而不同的时相中的系列表达(2，7，10，18)。前三个阶段产生侵犯其他细胞并因而播散感染的感染性病毒颗粒。最后，基因表达的极晚时期(开始于转染后约18小时)，病毒颗粒包纳入称为多角体蛋白的晶体蛋白结构中(7)。多角体蛋白基因不是产生病毒颗粒所必需的，可由外源编码序列取代(7，27)。由于多角体蛋白基因是在基因表达的晚期表达的，其可由编码毒性蛋白的序列替代而不影响病毒的感染能力。
已发现几种杀虫晶体毒素可在杆状病毒感染的昆虫细胞内表达。将完整的杀虫晶体蛋白基因cryIA(b)克隆到AcNPV中，替代多角体蛋白基因(8)。应用杆状病毒载体在鳞翅类昆虫细胞中也成功表达了全长和截短的细菌CryIVD灭蚊蛋白(11)。
克隆入pFASTBAC1杆状病毒转移载体。
通过BamHI和EcoRI酶切自原质粒(pUBB和pUBC(46))切除Cry1Ab和Cry1Ac基因，亚克隆到杆状病毒转移载体pFASTBAC Hb(Gibco)中。重组质粒用EcoRI和HindIII酶切以便定向亚克隆蓖麻毒蛋白基因片段。产生六个中间pFASTBAC Hb融合构建体，表示两个Bt基因每个融合到三种RTB片段之一中。用Eco47III和EcoRI(CryIAb)或EcoRI和XhoI(CryIAc)酶切这些构建体，用绿豆核酸酶将断端切平以便在重新连接时使Bt和RTB编码区域在读框内连接(图1)。然后用StuI和HindIII酶切重组质粒，以便将融合构建体定向亚克隆到同样酶切的载体pFASTBAC1中，后者的多接头侧翼是Tn7连接位点。pFASTBAC1载体也分别用BamHI和EcoRI或EcoRI和HindIII酶切以便分别亚克隆两种未修饰的Bt基因和RTB片段作为对照。
点特异性转位。
将重组pFASTBAC1转移载体转化到感受态大肠埃希氏杆菌细胞DH10BAC株中(Gibco BRL)。这些细胞含有带Tn7连接位点的修饰的杆状病毒基因组，以及提供Tn7转位酶的质粒，以便使在pFASTBAC1中克隆的盒点-特异性地转位到杆状病毒基因组中。分离白色克隆，从中按文献所述(37)纯化高分子量DNA。
应用PCR和M13/PUC19引物证实重组杆粒。50μl PCR反应液中应用5微升10×PCR缓冲液、一微升10×dNTP混合物、1.25μl 10μM每种引物原液、1.5μl 50mM MgCl2、2.5μl1％去污剂W-1溶液、一微升模板DNA和2.5单位Taq聚合酶。在93℃温育3分钟后，如下进行35个PCR循环：94℃45秒、55℃45秒和72℃5分钟(37)。取10微升PCR反应液在0.8％琼脂糖凝胶上电泳观察。
载体构建结果。
获得三个蓖麻毒蛋白B链基因的末端缺失片段。应用限制性酶EcoRI和HindIII酶切所产生的pGEM-T重组载体，得到预期的三种蓖麻毒蛋白B链基因缺失片段RTB1、RTB2和RTB3。对于RTB3(480bp，AA1-AA139)使用引物LF1xLB3；对于RTB2(739bp，AA1-AA236)使用引物LF1×LB2；对于LB1(841bp，AA1-AA262)使用引物LF1×LB1。
然后将三种蓖麻毒蛋白B链片段与两种Bt基因融合(应用每一基因的EcoRI位点)以得到六种不同的翻译融合蛋白。通过限制性酶切证实这六种翻译融合蛋白基因(结果未列)。
然后在多角体蛋白启动子的控制下将该融合基因转位至杆状病毒基因组中。应用M13/PUC引物通过PCR证实点特异性转位是成功的。该引物指向杆状病毒基因组的Tn7连接位点。仅此区(无任何构建体)的PCR反应产生300碱基对的片段。若该区与非重组pFASTBAC1DNA发生转位，应用M13/PUC19引物该区的PCR产生2300碱基对的DNA片段。PCR结果(未列)证实整个翻译融合蛋白基因表达盒发生了成功转位，这一点由超过2300碱基对大小的片段相应增加来指明。然后将这些重组杆状病毒转染到Sf21昆虫细胞中。自感染的昆虫细胞提取的高分子量DNA也证实(用M13/PUC引物通过PCR)昆虫细胞发生了成功感染(结果未列)。
实施例3：表达杀虫融合多肽之宿主细胞的产生
用重组杆粒(bacmid)DNA转染Sf21昆虫细胞。在35mm细胞培养皿中将一百万Sf21昆虫细胞接种到2ml含10％胎牛血清的TC-100培养基中培养过夜。用无血清和抗生素的培养基洗细胞两次，铺上1ml转染混合物(5微升重组杆粒DNA、800μl无血清和抗生素的TC-100培养基和6微升cellfectin)作用5小时(37)。去掉转染混合物后细胞然后覆盖有完全TC-100培养基(含10％胎牛血清)中培养48小时。收集上清中的病毒(首次接种物)，细胞在2毫升完全培养基中再培养48小时，收集病毒(二次接种物)。实验中采用第二次的上清作为接种物来测定蛋白质表达的最佳时间。对所有的感染而言，吸出细胞的培养基，加入250μl接种物将细胞1小时(m.o.＝5)。一小时后去掉接种物，加入两毫升含10％胎牛血清的完全培养基覆盖细胞。在60小时内分析蛋白质的表达。在每一分析阶段末用蛋白裂解缓冲液(62.5mM Tris-HCl、2％SDS)裂解细胞。然后将15微升蛋白样品上样到12.5％聚丙烯酰胺凝胶上，用抗蓖麻毒蛋白B链抗体或抗-CryIA(c)抗血清进行Western印迹分析。
蛋白质表达的Western印迹分析结果。
60小时内分析杆状病毒蛋白质的表达。在2、20、24、34、48和60小时后p.i.收集细胞样品，用染料结合方法测量蛋白质浓度(47)。蛋白质样品(20μg)在12.5％SDS-PAGE上分级分离并按照厂家说明用半干式电转移印迹槽(Bio-Rad)将之转移到硝酸纤维素膜上(Hybond C；Amersham)。用抗Cry1Ab和Cry1Ac的抗血清(Ms.S.Bano-Maqbool，植物分子生物学中心(Centre forExcellence in Plant Molecular Biology)，巴基斯坦)或抗RTB的抗血清(L.Roberts博士，Warwick大学，英国)对滤膜进行检测。我们使用碱性磷酸酶(AP)缀合的抗兔IgG(Fc)(Promega)作为二抗，按照提供者的建议进行检测。
对RTB1、RTB2和RTB3而言(对照构建体仅含蓖麻毒蛋白片段)，蛋白质在转染后约20小时开始表达，并不断增加，直到60小时，在34小时左右最佳。在48小时(RTB1)、34小时(RTB2)和24小时(RTB3)检测到意外的低分子量蛋白带，可能是降解产物。这样尤其第三个蓖麻毒蛋白B链基因缺失片段RTB3看起来并不稳定，并在合成后降解。
就CryIA(a)和CryIA(c)基因及融合蛋白而言，早在20小时就检测到了降解产物，说明这些蛋白质在昆虫细胞中对降解敏感。
实施例4：体外毒性分析
确定荧光团最佳浓度。
染料的最佳浓度随细胞类型而不同。以下实验是为了确定产生足够(强)信号的最低染料浓度。将健康生长的细胞收集到微量离心管中，用1000μlDulbecco’S磷酸缓冲盐水洗一次。半数细胞加入30％甲醇处理30分钟，使细胞死亡。分别采用死细胞和活细胞样品，每份细胞与0.1-12.8μM不同浓度的乙锭同源二聚体1温育30分钟。活细胞和死细胞的样本也分别与不同水平的钙黄绿素AM温育(0.1-12.8μM)。在普通的荧光显微镜下观察着色细胞。6.8μM乙锭同源二聚体1的浓度足以使死细胞的核标记成亮红色。0.4μM钙黄绿素AM的浓度足以使活细胞标记成绿色。然后将两种荧光团混合一起，得到含6.8μM乙锭同源二聚体1和0.4μM钙黄绿素AM的D-PBS溶液，用来对死细胞和活细胞样品进行染色。从这些结果得出结论：所选浓度的两种荧光团可以可靠地用来评价感染细胞的存活力。
96小时内存活/死亡存活力/细胞毒性分析。
对每种感染而言将一百万细胞接种到35mm培养皿中过夜培养(每种重复7次)。从细胞吸出培养基，加入250μl接种物。进行14种不同的感染，包括：
(a)用培养基感染的昆虫细胞模拟物
(b)用非-重组杆状病毒感染的昆虫细胞
(c)用含gus基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞
(d)分别用含CryIA(b)、CryIA(c)、RTB1、RTB2和RTB3之编码序列的重组杆状病毒感染的昆虫细胞.
(e)分别用六种不同的融合基因感染的昆虫细胞.
感染后34小时裂解感染的细胞，提取DNA。裂解缓冲液组成和提取方法按照King和Possee所述(38)。在用M13/PUC引物的PCR反应中该DNA用来核实Sf 21昆虫细胞的感染成功与否。在感染后2、24、34、48、72和96小时分析每种感染的一个培养皿的感染细胞。以5000xg离心细胞，用无菌的组织培养级Dulbecco’S磷酸缓冲盐水(D-PBS)洗一次。将细胞小心重悬于50μl活/死(细胞)分析试剂(6.8μM乙锭同源二聚体1和0.4μM钙黄绿素AM，溶解于D-PBS)，室温温育30分钟。30分钟后，自细胞取出40μl分析试剂，弃之。现在如果未受破坏，细胞应沉积于微量离心管的底部。将剩余的10μl细胞浓缩液置于显微镜载玻片上，在荧光显微镜下以400x的放大倍数(485±11nm)拍照。
乙锭同源二聚体1与DNA紧密结合，发出深红色荧光，但它是亲水分子，无法穿过活细胞膜。钙黄绿素AM是可自由扩散到细胞内的中性分子。其由细胞内酯酶活性裂解而发出亮绿色荧光。因此乙锭同源二聚体1可标记死细胞的核，而钙黄绿素AM标记活细胞的胞质。
通过转换两套滤光片来拍摄两套图片，一种为乙锭同源二聚体1荧光，另一种为钙黄绿素AM荧光，这样每个细胞样本既有显示活细胞(绿荧光)比例的图片，也有显示死细胞(红荧光)比例的图片。
毒性分析结果
在倒置光学显微镜下观察(X400)时，感染有融合蛋白的细胞早在感染后24小时便出现一些毒性症状。该症状包括，漂浮于培养基中、大的球形和裂解的细胞。对照实验中一些症状，尤其是细胞裂解，在感染后超过60小时出现。对照实验包括感染培养基的细胞模拟物、仅感染杆状病毒的细胞和仅感染含gus基因和蓖麻毒蛋白B链基因的重组杆状病毒的细胞。在对感染有表达不同蛋白质之重组杆状病毒的Sf21昆虫细胞进行活/死存活力分析的实验中，产生绿色荧光的细胞具有酯酶活性，认为是活细胞，而产生红色荧光的细胞的膜受到损害，认为是死细胞。
分析结果总结如下：
(a)用健康Sf21昆虫细胞进行分析。未感染的细胞没有干扰再培养72小时，不更换培养基。用上述方法评价时发现极少有细胞死亡。用70％甲醇处理健康细胞30分钟时发现细胞全部死亡。
(b)仅用杆状病毒感染的Sf21昆虫细胞在感染后2小时、24小时、34小时和72小时进行评价。许多细胞在72小时后仍存活。
(c)在感染后2、24、34、72小时评价表达GUS活性的Sf21昆虫细胞。同样许多细胞在72小时后仍存活。
(d)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(b)的Sf21昆虫细胞。在34-72小时之间许多细胞受到该蛋白的严重影响。
(e)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(c)的Sf21昆虫细胞。同样在23-72小时之间细胞也受到该蛋白的严重影响。
(f)在感染后2、24、34、72小时评价表达RTB1蛋白质的Sf21昆虫细胞。许多细胞在72小时后仍存活。
(g)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(b)-RTB1融合蛋白的Sf21细胞。在感染后24-34小时之间细胞受到严重影响。
(h)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(c)-RTB1融合蛋白的Sf21细胞。在24-34小时之间细胞受到严重影响。
(i)在感染后2、24、34、72小时评价表达RTB2蛋白质的Sf21细胞。许多细胞在72小时后仍存活。
(j)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(b)-RTB2蛋白质的Sf21细胞。24小时以内许多细胞死亡，即明显早于上述分析。
(k)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(c)-RTB2蛋白质的Sf21细胞。大量细胞在24小时以内死亡；同样早于毒素本身。
(l)在感染后2、24、34、72小时评价表达RTB3蛋白质的Sf21细胞。许多细胞在72小时后仍存活。
(m)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(b)-RTB3融合蛋白的Sf21细胞。许多细胞在24小时以内死亡，但有些细胞活过了72小时。
(n)在感染后2、24、34、72小时评价表达CryIA(c)-RTB3融合蛋白的Sf21细胞。许多细胞活过了72小时。
昆虫上皮细胞培养物不是Bt d-内毒素的天然靶点，与在其来源的昆虫中所观察到相比，其毒素敏感性低几个数量级23。然而，常规使用细胞培养物来估计Bt毒素抗多种昆虫物种的活性24。
尽管在感染有含RTB1和RTB2之融合蛋白的昆虫细胞中观察到最严重症状，用乙锭同源二聚体1和钙黄绿素AM分析存活力时，三种不同的RTB片段的任片段与Cry1Ab或Cry1Ac融合会大大提高Sf21细胞的毒素敏感性。在感染后约34小时观察到毒性症状。很明显融合蛋白对产生之的昆虫细胞有严重的细胞毒性效应，也很明显将糖基化-结合(蓖麻毒蛋白B链)基因加给该毒素提高其毒性，正如通过成熟前细胞死亡和广泛的细胞裂解所测量到的一样。
之所以选择Cry1Ab和Cry1Ac毒素及使用Sf21细胞是基于早先的观察，即Cry1Ab对Sf9和IPLB-Sf21昆虫细胞有中度毒性而Cry1Ac对这些细胞没有作用(42，43)。很明显，与蓖麻毒蛋白B链结合使Cry1Ac获得毒性说明半乳糖-结合起介导毒性的作用。
实施例5：在植物中应用杀虫融合物
可如下将融合蛋白转化到植物例如玉米或水稻中。将编码融合多肽的序列插入到泛素启动子控制下的表达盒中。应用颗粒轰击的方法转化植物(见如Christenson等人(1992)植物分子生物学(PlantMol Biol)18：675-689；Christou等人(1991)生物/技术(Bio/Technol)16：957-962)。该植物然后可用于昆虫饲养生物分析以便评价融合物在整个有机体水平的毒性以及衡量在不同选择压力条件下的抗性。也可评价植物的转基因整合和表达模式，并用传统方法纯化表达产物。用水稻示例如下。
Bt-转基因水稻植株的产生(方法)回顾
将11个构建体(六个融合物，5个对照物)转化到成熟的种子来源的胚胎水稻愈伤组织(callus)中，见图1B。通过颗粒轰击方法将每一构建体导入水稻组织，同时导入的还有共-转化载体以便筛选潮霉素抗性。在表达相同数量的11种重组蛋白质的植物上进行进一步分析。与未修饰的Bt蛋白一样，融合蛋白在转基因水稻植株中的表达效率高于在杆状病毒-感染的昆虫细胞中的表达。
转基因构建体
应用EheI和HindIII自pFASTBAC Hb中间载体分离上述对照物和融合蛋白盒，并定向亚克隆到经SamI和HindIII酶切的pAL76(内部以泛素启动子为基础的转化载体)中(图1C)。
颗粒轰击和转基因植物的回收
脱去成熟水稻种子(ORYZA STAIVA L CV EYIL105)的壳，在70％的乙醇中洗2分钟。用蒸馏水冲洗两次后，将种子置于1.6％次氯酸钠中轻轻摇动30分钟进行消毒，然后用无菌的蒸馏水冲洗3次。在避光条件下种子在水稻愈伤组织诱导培养基(RCIM；加入2.5mg l-12，4-D并用2.5g l-1phytagel固化的MS基础培养基)上发芽。7天后，从发芽的种子上剖离源自角质鳞部的愈伤组织，在渗透剂培养基(加有36g l-1山梨醇和36g l-1甘露醇的RCIM(48))上避光培养4小时。然后用包被有DNA的0.95mm直径的金粒轰击愈伤组织。轰击两次，间隔4小时，用含有融合或对照构建体的11种质粒的一种和含带来潮霉素抗性的标记的共转化质粒(49)以1∶3的摩尔比共-轰击愈伤组织。颗粒包被以及轰击方法以前有述(50，51)。在第二次轰击后，在渗透剂培养基上再避光培养愈伤组织16小时，然后转移到RCIM上培养三天。然后将愈伤组织转移到选择培养基(含30mg l-1潮霉素B的RCIM)培养4周。间隔2周进行继代培养。在日光下将潮霉素抗性愈伤组织转移到HRSM1培养基中(添加有30g l-1麦芽糖、2mg l-1BAP、0.5mg l-1NAA、30mg l-1潮霉素B和5g l-1脱乙酰吉兰糖胶吉兰糖胶的MS基础培养基)以促使其发芽再生。一周后将再生的愈伤组织转移到HRSM2培养基中(与HRSM1培养基相同，只是仅含有2.5g l-1脱乙酰吉兰糖胶吉兰糖胶树胶)，在同样的条件下培养。完全再生的发芽系统转移到生根培养基HRRM(添加有10g l-1蔗糖的1/2MS基础培养基)上。将成熟植株转移到温室中。
RT-PCR分析
应用Rneasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)按照厂家说明自100mg转化和野生型水稻的叶组织提取总RNA。按照厂家说明应用Access-PCR试剂盒(Promega)进行RT-PCRs。我们使用100ng总RNA和50pmol每一引物。CRF1和CRR1引物扩增cry1Ab和cry1Ac，而RTF1和RTR1引物扩增RTB基因片段。引物序列如下：CRF1(5’CGCATTGAAAC CGGTTACACTC CCA-3’)、CRR1(5’CTTGGGCAGAACCACGGAAGCTACC-3’)、RTF1(5’GATGTTTGTATGGATCCTCAGCCCA-3’)和RTR1(5’GCCGAACAATGGTTGTAACAAAAGG-3’)。
Northern印迹
如上所述提取总RNA，在1％琼脂糖-甲醛凝胶上电泳分级分离15mg样品，按照标准方法将其转移到硝酸纤维素膜上(52)。标记相对应于cyr1Ab和cry1Ac编码区域的1.8kbp BamHI/EcoRI片段，用作探针。
Western印迹分析
对在液氮下研磨成细粉的小叶切片进行转基因植物的Western印迹分析。将样品分散于蛋白质提取缓冲液中(100mM Tris.Cl pH8.1，100mM 2-巯基乙醇)，在4℃以12000xg离心10分钟。用30mg样品进行SDS-PAGE，如上所述进行印迹和检测程序。
对Western印迹上的泳带图案进行分析表明含最长的RTB片段(RTB1)的融合蛋白最稳定。对照RTB片段在转基因水稻植物中也得以高效表达。通过Northern印迹和RT-PCR证实植物中存在转基因mRNAs(数据未列)。这样很明显，融合蛋白在转基因水稻植物中得以高效表述。
实施例6：昆虫生物学分析
昆虫生物学分析回顾
应用野生型对照植物和各转化有11种构建体(六种融合物和五种对照物)之9种的转基因系的茎切片进行昆虫生物学分析，见图1B。未测试转化有pR2或pR3(含较短RTB片段的对照构建体)的植物。检测了这些对照物和融合蛋白对有重要经济学意义的水稻害虫，斑纹枝干蛀虫的影响。
昆虫生物学分析
自菲律宾国际水稻研究所M.Cohen博士获得斑纹钻心蛀虫的卵培养物(二化螟(chilo suppressalis))。在27/25℃白天/夜晚温度设置下维持卵，光周期为16小时。昆虫置于MAFF许可号EPHL51/2595(3/1998)下。水稻植株在相同条件下生长和维持。
在原代转化物和野生型对照物的茎切片上进行生物学分析。每一植株取出一段至少含一个结节的7厘米长的单一茎切片。将切片置于潮湿的滤纸上，放到平皿内，用茎蛀虫幼虫(＜2小时龄)进行感染，切开的切片每端放3个幼虫以便进入到茎内。每一品系设4个重复，野生型对照物设8个重复。然后用封口膜密封平皿，在上述具体条件下置于条件生长箱内4天。试验期最后，在双目微镜下仔细研究茎切片，记录昆虫的存活、发育和体重状况。用Statview软件V.5.0(Abacus Concepts，CA)对昆虫数据进行统计学分析。应用方差分析(ANOVA)来衡量处理组之间的显著性差异。应用P＞0.05的弃除限。
结果
结果见图2。野生对照茎切片的昆虫存活率超过95％。
在表达未修饰的Cry1Ab和Cry1Ac毒素的植物上的昆虫存活率降至55到80％之间(均值为79％(Cry1Ab)和71％(Cry1Ac))。该数据表明Cry1Ac对茎蛀虫的毒性略大于Cry1Ab对茎蛀虫的毒性，但这种差异在统计学上并不显著。表达RTB1对照片段的pR1系对昆虫的存活率没有显著影响，但存活的幼虫表现出生长速度降低(见下文)。
除转化pBR3构建体的植物外，表达融合蛋白的所有植物上的昆虫的平均存活率，比野生型对照植物和表达对照蛋白的植物上(的昆虫存活率)低得多。
转化pCR1、pCR2和pCR3构建体的植物对茎蛀虫有很大的抵抗力，昆虫死亡率分别为87％、74％和61％。
转化pBR1、pBR2和pBR3构建体的植物结果变化更大，存活率在30-50％范围内，pBR2最有效。
所有转基因品系的存活幼虫表现出生长减缓和发育停止现象。在表达对照Bt蛋白和对照RTB片段的植物中平均幼虫体重下降了30％。表达Cry1Ac的植物比表达Cry1Ab的植物幼虫发育停止现象更严重。
在Cry1Ab融合蛋白中，仅pBR1比对照Bt蛋白质Cry1Ab效果显著增强，使幼虫的平均体重下降60％。在表达pCR1、pCR2和pCR3的植物中也观察到幼虫生长和发育状况严重下降。pCR2和pCR3结果与pBR1类似，而pCR1同样是最有效的构建体，使幼虫的平均体重下降超过80％并使其发育期阻滞在第一龄期。
这样表达融合蛋白的转基因水稻植物完全受到保护抵抗斑纹茎蛀虫的吞噬，导致昆虫55-80％死亡，存活幼虫生长减缓，发育停滞。毒性最大的融合蛋白是pCR1。四天后87％昆虫死亡，存活幼虫在第一龄期阶段发育阻滞。四天后，摄食野生型水稻植物的幼虫达到第三龄期，并对茎造成严重损害。相反，摄食表达融合蛋白的转基因植物的幼虫未造成明显损害。这样Bt毒素加上半乳糖结合结构域显著提高其抗斑纹钻心虫的活性。
结论
这些实施例清楚表明，本身无毒但与毒素(如d-内毒素Cry1Ab和Cry1Ac)连接时能够非-特异性结合细胞膜而不破坏该膜(如蓖麻毒蛋白B链)的一类异源结合结构域，可提高毒素分子相互作用范围，进而有效扩大其活性谱。尤其是这些实施例表明，与未修饰的毒素相比，(修饰的)毒素体外(针对Sf21细胞)和体内(针对斑纹钻心虫)毒性升高。另外，加入新型结合结构域可能会延缓或防止昆虫群体发展耐药性，因为昆虫不太可能发生消除两种或多种不同的细胞吸收活性的突变。
实施例7：外源凝集素、Bt毒素和Bt-外源凝集素融合物与昆虫
肠多肽的结合
方法学
简而言之，从两种水稻昆虫害虫，用于上文所述昆虫生物学测定的斑纹钻心虫和同翅类，稻褐飞虱(褐稻虱(Nilaparvata lugens))中分离肠道。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所提取出的肠多肽，进行印迹并用外源凝集素、Bt毒素或Bt-外源凝集素融合蛋白探测；然后用适宜的特异性抗体检测结合的探针。
更具体而言，编码His-标记的Bt毒素Cry1Ac结构域1和雪花莲外源凝集素(GNA)(称为JD1)之融合物的构建体在大肠杆菌中首先表达。在溶解、透析以去除变性物以及通过超滤浓缩后，该融合蛋白通过在Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)上层析的方法得以纯化，得到可溶的功能蛋白质制品。通过SDS-PAGE估计最后的浓度和纯度。从新收集自水稻植株的昆虫分离水稻褐色植物跳虫(褐稻虱(Nilaparvata lugens))中肠，在SDS样品缓冲液中通过超声使之匀浆化。斑纹茎蛀虫中肠(由Mike Cohen博士提供，IRRI)收集自晚龄期幼虫，同样进行处理。然后通过SDS-PAGE(12.5％丙烯酰胺)分离溶解的肠蛋白，将之转移到硝酸纤维素膜上。就稻褐飞虱而言，每道上样蛋白量相当于1.5肠；就斑纹钻心虫而言，每道上样蛋白约5μg。在封闭液(Sigma)中温育60分钟后，通过分别与JD1、Cry1Ac(David Ellar博士惠赠；前毒素如(53)所述通过胰酶处理而激活)、GNA(W.Peumans和E.Van Damme博士，Leuven天主教大学，比利时)或蓖麻(Ricinus Communis)外源凝集素(Sigma)温育检测含肠蛋白的膜。温育条件为25℃60分钟，浓度为1μg ml-1。用Tris-缓冲的Triton-盐水(TBS-T；50mM Tris-Hcl缓冲液，pH7.2，含0.15MNaCl和0.1％ Triton X-100)洗膜3次，每次5分钟。然后与恰当的一抗(抗Cry1Ac，David Ellar博士惠赠；抗-GNA，作者制备；抗蓖麻外源凝集素，载体实验室)在10,000稀释的TBS-1中在25℃温育60分钟来检测配体结合。同上再次洗膜，与二抗温育(HRP-缀合；Bio-Rad)(稀释度1∶5000)。同上再次洗膜，另外用蒸馏水冲洗2次，然后按照厂家说明加入ECL试剂(Amersham PharmaciaBiotech，UK)，将膜在X-射线胶片上曝光。
结果
用蓖麻(Ricinus communis)外源凝集素作为探针、抗蓖麻外源凝集素抗体作为检测剂的组合发现其与两种昆虫肠组织提取物内的许多多肽与有很强的结合力。相反，Cry1Ac蛋白质探针仅与同样提取物中的一种多肽(斑纹钻心虫中约45kDa，稻褐飞虱中约90kDa)强烈结合。为进一步表征Bt毒素和Bt-外源凝集素融合物之间结合的差别，通过在大肠杆菌内表达合适的基因构建体产生源自雪莲的特异性甘露糖-结合外源凝集素雪花莲(Galanthus nivalis)外源凝集素，GNA)和Cry1Ac的融合蛋白。然后将融合蛋白与昆虫肠多肽的结合力与GNA和Cry1Ac蛋白质分别与肠多肽的结合力进行比较。与以前的结果一致，GNA与自水稻稻褐飞虱肠提取的约75kDa(2条带)和50kDa的多肽强烈结合，与取自斑纹钻心虫肠的约80kDa的多肽强烈结合。GNA还与钻心虫肠提取物的45kDa多肽结合，该多肽的分子量与Cry1Ac检测到的主要蛋白带类似。GNA-Cry1Ac融合物与GNA在斑纹钻心虫肠中所识别的85kDa的多肽结合力非常弱，但可与GNA和Cry1Ac毒素都识别的45kDa的多肽结合。另一方面，该融合物表现出与GNA和Cry1Ac毒素在稻褐飞虱肠提取物中所识别的所有主要多肽(约90Da、75kDa和45kDa)结合。这些结果表明，与其来源的Bt毒素相比较，外源凝集素-Bt融合物与昆虫肠组织提取的多肽具有不同的结合特异性。
讨论
在上述实验中，使纯化的外源凝集素、Bt毒素和Bt-外源凝集素融合蛋白与自昆虫肠道提取的多肽反应。结果表明蓖麻毒蛋白的半乳糖-结合结构域与Cry1Ac毒素相比，强烈结合昆虫肠提取物中更多的多肽。通过纯化的GNA-Cry1Ac融合蛋白在昆虫肠多肽上的结合分析，直接说明了外源凝集素-Bt融合蛋白的结合双功能特性(即具有源自两种有贡献的蛋白质结构域的结合特性)。
参考文献
1.Monette等(1997)。应用与环境微生物学63(2)，440-447。
2.Luckow，(1991)。用杆状病毒载体在昆虫细胞内克隆和表达异源基因，p.97-151.Prokop等，(Ed)，重组DNA技术与应用。McGraw-Hill，New York，NY。
3.Ferrini等，(1995)欧洲生化杂志233，772-777。
4.Ge等，(1991).生物化学杂志266(27)，17954-17958。
5.Schnepf和Whitley，(1985)。生物化学杂志266，(10)，6273-6280。
6.Dean等，(1996)基因179，111-117。
7.Weyer等，(1990)。普通病毒学杂志71，1525-1534。
8.Martens等，(1990).应用与环境微生物学56(9)，2764-2770。
9.Merryweather等，(1990).普通病毒学杂志71，1535-1544。
10.Miller，(1988)。微生物学年度综述42，177-199.
11.Pang等，(1992)。一般病毒学杂志73，89-101。
12.Hofmann等，(1988).美国国家科学院院报85，7844-7844。
13.Vadlamudi等，(1995).生物化学杂志270(10)5490-5494。
14.Lee等，(1996).应用与环境微生物学62(8)2845-2849。
15.Masson等，(1995).生物化学杂志270(35)，20309-20315.
16.Tabashnik等，(1997).美国国家科学院院报94，1640-1644.
17.Tabashnik，(1994).昆虫学年度综述39，47-79.
18.Tabashnik等.应用与环境微生物学62(8)2839-2844.
19.Perlak等，(1990).生物/技术8，939-943.
20.Vaek等，(1989).Cell Cult.Somatic Genet.Plants6，425-439.
21.Vaek等，(1987).自然327，33-37.
22.Cornelissen，(1989).核酸研究17，7203-7209.
23.Perlak等，(1991).美国国家科学院院报88，3324-3328.
24.Arsine等，(1995).植物分子生物学28，513-524.
25.Murray等，(1989).核酸研究17，477-498.
26.Wolin和Walter，(1988).Embo Journal 7，3559-3569.
27.Koziel等，(1993).生物/技术11，194-199.
28.Dellaporta和Calderon-Urrea，(1994).科学266，1501-1505.
29.Irish，(1996).生物分析18(5)，363-369.
30.Heslop-Harrison，(1961).Proc.Linn.Soc.，London.172，108-123.
31.Hansen等，(1976).农作物科学16，371-374.
32.Morino等，(1995).生物药学简报18(12)1770-1772.
33.Endo和Tsurugi，(1987).生物化学杂志262，8128.
34.Wales等，(1992).生物化学和生物物理档案294(1)，291-296.
35.Wales等，(1991).生物化学杂志266(29)，19172-19179.
36.Sardana等，(1996).植物细胞报告15，677-681.
37.GIBCO(1996).BAC-TO-BACTM杆状病毒表达系统：指导手册1-33.
38.King和Possee，(1990).杆状病毒表达系统：实验指导Chapman和Hall，143-144。
39.分子探针产物信息表，活/死存活力/细胞毒性试剂盒kit(L-3224)，ppl.
40.Glaze和Rye(1992)自然359：859-861.
41.Bell等(1988)J.Orthopaedic Res.6：467-474.
42.Johnson(1994)J.Invertebr.Pathol.63：123-129.
43.[see 1]
44.Newton等(1992)生物化学杂志267：11917-11922.
45.Gonatas等(1975)表达细胞研究94：426-431.
46.[see 36]
47.Bradford(1976)分析生物化学72：248-254.
48.Vain等(1993)Plant Cell Rep.12：84-88.
49.Cooley等(1995)Theoret.Appl.Genet.90，97-104.
50.Klein等(1988)美国国家科学院院报85：4305-4309
51.Sudhakar等(1998)转基因研究7：289-294
52.Sambrook等(1989).分子克隆：实验手册。第二版，冷泉巷实验出版社。
53.Knight等(1994)分子微生物学11：429-436.
Claims (31)
1.编码杀虫融合多肽的核酸分子，其中所述融合多肽包括(i)毒素结构域；和(ii)能与细胞膜非特异性结合而不破坏该膜的异源结合结构域，其中该结合结构域源自外源凝集素。
2.权利要求1中的核酸，其中该毒素结构域源自苏云金芽孢杆菌cry毒素。
3.权利要求2中的核酸，其中该苏云金芽孢杆菌cry毒素是CrylA(b)或(c)。
4.任一上述权利要求中的核酸，其中该结合结构域具有半乳糖或半乳糖基亲和力。
5.权利要求1-3之任一的核酸，其中该外源凝集素是2型核糖体失活蛋白质。
6.权利要求5的核酸，其中该结合结构域源自蓖麻毒蛋白B链。
7.权利要求2、3和6之任一的核酸，其中该毒素结构域衍生自由Seq ID No 1编码的CryIA(b)或由Seq ID No 2编码的CryIA(c)。
8.权利要求2、3和6之任一的核酸，其中该结合结构域衍生自由Seq ID No 3编码的RTB1、由Seq ID No 4编码的RTB2或由Seq ID No 5编码的RTB3。
9.权利要求7的核酸，包括Seq ID No 6(CryIA(b)-RTB1)；Seq ID No 7(CryIA(b)-RTB2)；Seq ID No 8(CryIA(b)-RTB3)；Seq ID No 9(CryIA(c)-RTB1)；Seq ID No 10(CryIA(c)-RTB2)或Seq ID No 11(CryIA(c)-RTB3)中任一序列所示的CryIA-RTB组合体，或其简并的等同序列。
10.权利要求8的核酸，包括Seq ID No 6(CryIA(b)-RTB1)；Seq ID No 7(CryIA(b)-RTB2)；Seq ID No 8(CryIA(b)-RTB3)；Seq ID No 9(CryIA(c)-RTB1)；Seq ID No 10(CryIA(c)-RTB2)或Seq ID No 11(CryIA(c)-RTB3)中任一序列所示的CryIA-RTB组合体，或其简并的等同序列。
11.权利要求2、3和6之任一的核酸，包括与Seq ID Nos 1到11的任一序列具至少90％同源性的核苷酸序列。
12.权利要求1-11之任一的核酸的制备方法，该方法包括将编码毒素的核酸与编码异源结合结构域的核酸连接起来的步骤，其中该结合结构域能与细胞膜非特异性结合而不破坏之，以及其中该结合结构域衍生自一种外源凝集素。
13.权利要求12的方法，其中该方法还包括通过在核酸中添加、插入、缺失或替换一个或多个核苷酸来改变毒素或结合结构域序列的步骤。
14.权利要求13的方法，其中序列的改变使该序列的密码子使用发生变化。
15.包括权利要求1-11之任一的核酸的重组载体。
16.权利要求15的载体，其中权利要求1-11之任一的核酸操作性地连接一种启动子。
17.权利要求16的载体，其中该启动子是一种可诱导性启动子，其响应一种诱导物或响应捕食作用而激发的其它植物信号而开启。
18.权利要求15-17之任一的载体，其为杆状病毒载体或适用于植物的载体。
19.转化宿主细胞的方法，包括将权利要求15-18之任一的载体导入细胞，并致使或允许该载体和细胞基因组之间发生重组以便将该核酸导入到基因组内这一步骤。
20.含有权利要求1-11之任一的核酸或权利要求15-18之任一的载体的宿主细胞。
21.权利要求20的宿主细胞，其为植物细胞。
22.权利要求21的宿主细胞，其中该植物为单子叶植物。
23.权利要求22的宿主细胞，其中该单子叶植物为玉米或水稻。
24.产生转基因植物的方法，该方法包括步骤：
(a)实施权利要求19的方法，以便产生转基因植物细胞；
(b)从该转化的宿主细胞再生植物。
25.权利要求24的方法，其中所述植物为单子叶植物。
26.权利要求25的方法，其中所述单子叶植物为玉米或水稻。
27.影响或改变植物对害虫毒性的方法，该方法包括使或允许权利要求1-11之任一的核酸在植物中表达的步骤。
28.权利要求1-11之任一的核酸编码的杀虫融合多肽。
29.制备权利要求28的多肽的方法，该方法包括使权利要求1-11之任一的核酸在合适的宿主细胞内表达的步骤。
30.包括权利要求28的多肽以及至少一种附加成分的组合物。
31.控制害虫的方法，包括应用权利要求28的多肽。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9909796.6 | 1999-04-28 | ||
| GBGB9909796.6A GB9909796D0 (en) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | Pesticidal fumes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1359424A CN1359424A (zh) | 2002-07-17 |
| CN1250727C true CN1250727C (zh) | 2006-04-12 |
Family
ID=10852427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN00809697.XA Expired - Fee Related CN1250727C (zh) | 1999-04-28 | 2000-04-27 | 杀虫融合物 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7019197B1 (zh) |
| EP (1) | EP1173591B1 (zh) |
| JP (1) | JP2002542833A (zh) |
| CN (1) | CN1250727C (zh) |
| AT (1) | ATE380876T1 (zh) |
| AU (1) | AU777669B2 (zh) |
| CA (1) | CA2369964A1 (zh) |
| DE (1) | DE60037407T2 (zh) |
| ES (1) | ES2298140T3 (zh) |
| GB (1) | GB9909796D0 (zh) |
| WO (1) | WO2000066755A2 (zh) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE416192T1 (de) | 2001-04-19 | 2008-12-15 | Kansai Chem Eng | Protein, das sich an die zelloberflächenschichten bindet, und dessen verwendung |
| GB0119274D0 (en) * | 2001-08-08 | 2001-10-03 | Univ Durham | Fusion proteins for insect control |
| EP1688429A1 (en) * | 2005-02-04 | 2006-08-09 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Riproximin, a novel type II ribosome-inactivating protein and uses thereof |
| US7547677B2 (en) | 2006-12-11 | 2009-06-16 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Plant virus transmission inhibitor and methods |
| CN101679491B (zh) * | 2007-03-28 | 2013-11-06 | 先正达参股股份有限公司 | 杀虫的蛋白质 |
| WO2008157263A2 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Arkansas State University | Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same |
| US20100322977A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-23 | The Ohio State University Research Foundation | Biomaterials, compositions, and methods |
| KR20110026545A (ko) * | 2009-09-08 | 2011-03-16 | 주식회사 농우바이오 | ＣｒｙＩＡｃ 유전자로 형질전환된 배추좀나방 저항성 양배추 및 이의 제조 방법 |
| JP2012246227A (ja) * | 2011-05-25 | 2012-12-13 | Mie Univ | 土壌病害防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法 |
| BRPI1102841B1 (pt) * | 2011-06-08 | 2018-11-21 | Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria Embrapa | MUTANTES DE INIBIDORES DE ALFA AMILASES ISOLADOS DE Phaseolus vulgaris COM PROPRIEDADES DE CONTROLAR INSETOS-PRAGA, COMPOSIÇÕES CONTENDO TAIS MUTANTES E MÉTODOS DE OBTENÇÃODOS MESMOS E DE LINHAGENS TRANSGÊNICAS |
| EP3766978A1 (en) | 2012-03-09 | 2021-01-20 | Vestaron Corporation | Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides |
| US11692016B2 (en) | 2012-03-09 | 2023-07-04 | Vestaron Corporation | High gene expression yeast strain |
| CN103039494A (zh) * | 2012-12-05 | 2013-04-17 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 控制害虫的方法 |
| CN105936644B (zh) * | 2016-07-09 | 2021-11-16 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 一种杀虫蛋白及其核苷酸序列和应用 |
| US11535653B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-12-27 | Vestaron Corporation | Cleavable peptides and insecticidal and nematicidal proteins comprising same |
| EP3415010A1 (en) | 2017-06-13 | 2018-12-19 | Agrosavfe Nv | Insect-controlling polypeptides and methods |
| JP2021525514A (ja) * | 2018-05-30 | 2021-09-27 | ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロントＴｈｅ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ | 受容体−リガンド相互作用に関連付けられるタンパク質を同定するための方法及びキット |
| CN109679992B (zh) * | 2019-01-31 | 2023-04-28 | 北京大北农生物技术有限公司 | 杀虫蛋白的用途 |
| CN113615456B (zh) * | 2021-08-11 | 2022-10-21 | 华南师范大学 | 一种防治夜蛾科农业害虫的方法及杀虫剂 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US5538868A (en) * | 1984-02-08 | 1996-07-23 | Cetus Oncology Corporation | Recombinant ricin toxin fragments |
| US5668255A (en) * | 1984-06-07 | 1997-09-16 | Seragen, Inc. | Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region |
| US5290914A (en) * | 1988-04-28 | 1994-03-01 | Mycogen Corporation | Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins |
| JPH06192295A (ja) * | 1991-03-01 | 1994-07-12 | Toagosei Chem Ind Co Ltd | 融合結晶毒素蛋白及び該蛋白をコードする遺伝子 |
| US5763245A (en) | 1991-09-23 | 1998-06-09 | Monsanto Company | Method of controlling insects |
| US5849870A (en) | 1993-03-25 | 1998-12-15 | Novartis Finance Corporation | Pesticidal proteins and strains |
| AU5003597A (en) | 1996-10-28 | 1998-05-22 | Medical University Of South Carolina | Methods and compositions for ricin fusion protein immunotoxins to treat cancer and autoimmune disease |
-
1999
- 1999-04-28 GB GBGB9909796.6A patent/GB9909796D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-04-27 CN CN00809697.XA patent/CN1250727C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-27 CA CA002369964A patent/CA2369964A1/en not_active Abandoned
- 2000-04-27 AU AU45863/00A patent/AU777669B2/en not_active Ceased
- 2000-04-27 ES ES00927459T patent/ES2298140T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-27 AT AT00927459T patent/ATE380876T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-04-27 JP JP2000615777A patent/JP2002542833A/ja active Pending
- 2000-04-27 WO PCT/GB2000/001633 patent/WO2000066755A2/en active IP Right Grant
- 2000-04-27 DE DE60037407T patent/DE60037407T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-27 US US09/980,650 patent/US7019197B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-27 EP EP00927459A patent/EP1173591B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB9909796D0 (en) | 1999-06-23 |
| DE60037407D1 (de) | 2008-01-24 |
| US7019197B1 (en) | 2006-03-28 |
| ATE380876T1 (de) | 2007-12-15 |
| CN1359424A (zh) | 2002-07-17 |
| AU4586300A (en) | 2000-11-17 |
| EP1173591B1 (en) | 2007-12-12 |
| WO2000066755A2 (en) | 2000-11-09 |
| DE60037407T2 (de) | 2008-12-04 |
| WO2000066755A3 (en) | 2001-01-18 |
| EP1173591A2 (en) | 2002-01-23 |
| JP2002542833A (ja) | 2002-12-17 |
| ES2298140T3 (es) | 2008-05-16 |
| AU777669B2 (en) | 2004-10-28 |
| CA2369964A1 (en) | 2000-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1250727C (zh) | 杀虫融合物 | |
| CN1102659C (zh) | 重组杆状病毒杀虫剂 | |
| CN1176577C (zh) | 编码杀虫性晶体蛋白的核苷酸序列及其应用 | |
| US9546378B2 (en) | Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis | |
| CN1849397A (zh) | 苏云金芽孢杆菌分泌的杀虫蛋白及其应用 | |
| CN1119877A (zh) | 新杀虫蛋白和菌株 | |
| CN1375009A (zh) | 抗昆虫的水稻植物 | |
| CN1241213A (zh) | 苏云金芽孢杆菌CryET33和CryET34组合物及其使用 | |
| CN1246893A (zh) | 对鞘翅类昆虫和栉头蚤属种昆虫有毒的苏云金芽孢杆菌CryET29组合物 | |
| CN1037924A (zh) | 改进昆虫毒素效力的方法 | |
| CN1085387A (zh) | 苏芸金芽孢杆菌分离物在防治芽科害虫上的应用 | |
| CN1408023A (zh) | 杀虫蛋白 | |
| JP2017521055A (ja) | 害虫防除に有用な植物性殺虫タンパク質 | |
| CN1202202A (zh) | 保幼激素或其激动剂之一作为以受体介导的反式激活控制植物基因表达的化学配体 | |
| CN1074936A (zh) | 杀虫有效肽类 | |
| CN1333833A (zh) | 鉴定非寄主植物抗病基因的新方法 | |
| CN1217024A (zh) | 趋化因子α－2 | |
| US5665595A (en) | Immunoglobulins against insect tissue | |
| CN1420932A (zh) | 由表达serk相互作用蛋白质实现无融合生殖 | |
| CN1154970A (zh) | 抗菌肽及其生产方法和应用 | |
| CN1039332C (zh) | 用杀虫多肽防治害虫的方法 | |
| CN1650018A (zh) | 昆虫抗性植物及产生该植物的方法 | |
| CN1195063C (zh) | 蛋白酶抑制剂融合蛋白 | |
| CN1147275A (zh) | 生物学昆虫控制剂 | |
| CN1119027A (zh) | 控制昆虫的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: FRAUNHOFER ASSOCIATION FOR THE PROMOTION OF APPLI Free format text: FORMER OWNER: PLANT BLOSCIENCE LTD. Effective date: 20021114 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20021114 Address after: Munich, Germany Applicant after: Fraunhofer Ges Forschung Address before: British Norwich Applicant before: Plant Biological Scienic Co., Ltd. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060412 Termination date: 20170427 |