KR100419438B1 - 신규살충성단백질및균주 - Google Patents

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마이클 진 코지엘
마르타 앨리스 물린스
고든 제임스 나이
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크리스티 코스티치카
니콜라스 브렌던 덕
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Abstract

본 발명은 살충성 균주 및 단백질에 관한 것이다. 영양생장하는 동안 살충성 단백질 및 보조 단백질을 생산할 수 있는 바실루스 균주가 제공된다. 정제 단백질, 이 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 균주, 단백질 및 유전자를 해충 방제용으로 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

신규 살충성 단백질 및 균주
곤충 해충은 상업적으로 중요한 전세계 농작물 손실의 주요 원인이다. 광범위한 살충 스펙트럼을 갖는 화학적 살충제가 해충을 방제 또는 박멸하기 위하여 농업적으로 중요하게 널리 사용되어 왔다. 그러나, 효과적인 대체 살충제의 개발이 필요하였다.
미생물 살충제는 화학적 해충 방제의 대안으로서 중요한 역할을 수행해 왔다. 가장 널리 사용된 미생물 살충제는 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis(Bt)) 세균에 바탕을 두고 있다. Bt는 포자 형성기에 살충성 결정 단백질(ICP)을 생산하는 그람-양성 포자 형성성 바실루스이다.
서로 다르지만 관련이 있는 25개 이상의 ICP를 생산하는 수많은 Bt 변종이 공지되어 있다. Bt에 의해 생산된 ICP의 대부분은 나비 목, 파리 목 및 딱정벌레목의 특정 곤충의 유충에 독성을 나타낸다. 일반적으로, 감수성 곤충이 ICP를 섭취하면, 그 결정은 용해되어 곤충 장 프로테아제에 의해 독성 물질로 변형된다. 딱정벌레목 유충 예컨대 콜로라도 감자 딱정벌레(렙티노타르사 데셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata)) 또는 황색 밀웜(테네브리오 몰리토르 (Tenebrio molitor))에 대해 활성이 있는 어떤 ICP도 디아브로티카 속 생물, 특히 디아브로티카 비르지페라 비르지페라 (Diabrotica virgifera virgifera, 서부 옥수수 뿌리벌레(WCRW)) 또는 디아브로티카 롱기코르니스 바르베티 (Diabrotica longicornis barbeti, 북부 옥수수 뿌리벌레)에는 현저한 효과를 나타내지 않는다.
바실루스 세레우스 (Bacillus cereus(Bc))는 Bt와 밀접하게 관련되어 있다. Bc에 있어서 눈에 띄는 주요한 특징은 연쇄포자 결정이 없다는 것이다. Bc는 토양에서 흔히 발견되며 다양한 음식 및 약제로 부터 분리되어온 널리 분포하는 세균이다. 이 생물은 음식의 부패와 관련되어 있다.
비록 Bt가 해충 방제에 있어서 매우 유용하지만, 가능한 생물학적 방제제의 수를 증가시킬 필요가 있다.
본 발명은 식물 및 비식물성 해충을 방제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 영양 생장기의 바실루스로 부터 분리 가능한 신규 살충성 단백질이 개시되어 있다. 바실루스 균주, 단백질, 및 이 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 식물 및 비식물성 해충을 방제하기 위한 다양한 체계에서 사용할 수 있다.
본 발명은 식물 해충을 방제하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 영양 생장기의 바실루스 균주가 생산한 신규 살충성 단백질을 제공한다. 이 단백질은 살충제로서 유용하다.
보다 상세하게는, 본 발명은 영양 생장기에 살충성 단백질을 생산하는 실질적으로 정제된 바실루스 균주에 관한 것이며 상기 바실루스는 바실루스 스파에리쿠스 SSII-1(B. sphaericusSSII-1)는 아니다. 수탁 번호 NRRL B-21058의 바실루스 세레우스 균주 및 수탁 번호 NRRL B-21060의 바실루스 투린지엔시스가 바람직하다. 또한 수탁 번호 NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230, 및 NRRL B-21439로 부터 선택된 바실루스 균주도 바람직하다.
본 발명은 또한 바실루스 종, 바람직하게는 바실루스 투린지엔시스 및 바실루스 세레우스 균주의 영양 생장기에 분리 가능한 곤충 특이적 단백질, 및 이들의 성분에 관한 것이며 상기 단백질은 바실루스 스파에리쿠스 SSII-1로 부터 얻은 모기 치사 독소는 아니다. 본 발명의 곤충 특이적 단백질은 바람직하게는 딱정벌레 목 또는 나비 목 곤충에 대하여 독성이 있으며 분자량이 약 30 kDa 이상, 바람직하게는 약 60 내지 약 100 kDa, 및 더욱 바람직하게는 약 80 kDa이다.
특히, 본 발명의 곤충 특이적 단백질은 아그로티스 및/또는 스포도프테라 종에 대한 활성, 그러나 바람직하게는 검거세미[아그로티스 입실론 (Agrotis ipsilon); BCW] 및/또는 가을 멸강나방[스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda)] 및/또는 사탕무우 멸강나방[스포도프테라 엑시구아 (Spodoptera exigua)] 및/또는 담배 싹벌레 및/또는 옥수수 이삭벌레[헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea)]에 대한 활성을 포함하는 살충 활성의 범주를 갖는다.
본 발명의 곤충 특이적 단백질은 바람직하게는, 예컨대 수탁 번호 NRRL B-21058을 갖는 바실루스 세레우스로 부터, 또는 수탁 번호 NRRL B-21060을 갖는 바실루스 투린지엔시스로 부터 단리시킬 수 있다.
본 발명의 곤충 특이적 단백질은 바람직하게는 수탁 번호 NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230, 및 NRRL B-21439로 부터 선택된 바실루스 종 균주로 부터 단리시킬 수 있다.
본 발명은 특히 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:7로 구성된 군으로 부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 곤충 특이적 단백질을 포함하며, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 단백질도 포함한다.
더욱 바람직한 곤충 특이적 단백질은 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:2로 구성된 군으로 부터 선택된 서열을 갖는 것이며, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 단백질도 포함한다.
특히 바람직한 곤충 특이적 단백질은 SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:32로 구성된 군으로 부터 선택된 서열을 갖는 것이며, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 단백질도 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 형태는 분비 시그널을 나타내는 서열이 제거 또는 불활성화된 본 발명의 곤충 특이적 단백질을 포함한다.
본 발명은 곤충 특이적 단백질의 곤충-특이적 활성을 증가시키는 보조 단백질을 추가로 포함한다. 상기 보조 단백질은 바람직하게는 약 50 kDa의 분자량을 가지며, 예컨대 영양 생장기의 바실루스 세레우스, 특히 바실루스 세레우스 균주 AB78로 부터 분리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태는 분비 시그널을 나타내는 서열이 제거 또는 불활성화된 보조 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하고 이 폴리펩티드 사슬 중의 하나 이상이 본 발명의 곤충 특이적 단백질을 나타내며 상기 폴리펩티드 사슬 중의 하나 이상이 상기 곤충 특이적 단백질의 살충 작용을 활성화시키거나 또는 증가시키는 본 발명의 보조 단백질을 나타내는 다량체 살충성 단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다량체 살충성 단백질은 바람직하게는 약 50 kDa 내지 약 200 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명은 특히 본 발명의 곤충 특이적 단백질 및 상기 곤충 특이적 단백질의 살충 작용을 활성화시키거나 또는 증가시키는 본 발명에 따른 보조 단백질을 포함하는 다량체 살충성 단백질을 포함한다.
본 발명은 또한 리보솜에 의해 번역되면 적어도 본 발명의 곤충 특이적 단백질 및/또는 본 발명에 따른 보조 단백질 및, 임의로 융합에 사용된 기타 성분의 복합된 속성에 의해 융합 단백질을 생산하는 프레임 유전자 융합에 의해 생산된 본 발명의 하나 이상의 곤충 특이적 단백질 및/또는 본 발명에 따른 하나의 보조 단백질을 포함하는 몇개의 단백질 영역으로 구성된 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 특별한 형태는 리보뉴클레아제 S-단백질, 본 발명의 곤충 특이적 단백질 및 본 발명에 따른 보조 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 더욱 특별한 형태는 곤충 특이적 단백질 또는 보조 단백질을 상기 융합 단백질의 N-말단에 갖는 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질 및 본 발명에 따른 보조 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
SEQ ID NO:5에 나타낸 곤충 특이적 단백질 및 SEQ ID NO:2에 나타낸 보조 단백질을 포함하고, SEQ ID NO:23에 나타낸 단백질 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 단백질을 포함하는 융합 단백질이 바람직하다.
또한 SEQ ID NO:35에 나타낸 곤충 특이적 단백질 및 SEQ ID NO:27에 나타낸 보조 단백질을 포함하고, SEQ ID NO:50에 나타낸 단백질 및 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 단백질을 포함하는 융합 단백질이 바람직하다.
본 발명은 또한 수용 단백질에 대하여 이질적 기원의 시그널 서열, 바람직하게는 트랜스진 산물을 특정 세포 기관 또는 세포 구획으로 이동시키는 분비 시그널 서열 또는 표적 서열과 융합된 본 발명의 곤충 특이적 단백질 및/또는 본 발명에 따른 보조 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
상기 단백질이 SEQ ID NO:43 또는 SEQ ID NO:46에 나타낸 서열을 갖는 융합 단백질 및 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 단백질을 포함하는 융합 단백질이 본 발명 내에서 특히 바람직하다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 실질적인 서열 상동성은 아미노산 서열 간의 긴밀한 구조적 관계를 의미한다. 예컨대, 실질적으로 상동인 단백질은 40%, 바람직하게는 50% 및 가장 바람직하게는 60% 또는 80%, 또는 그 이상으로 상동일 수 있다. 상동성은 또한 하나 또는 몇개의 아미노산 부분 서열이 잘리거나, 또는 첨가된 아미노산이 분산되어 있는 부분 서열 간의 관계를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 또한 바실루스 종의 영양 생장기에 분리 가능한 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 이들의 성분을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이며, 상기 단백질은 바실루스 스파에리쿠스 SSII-1로 부터 얻은 모기 치사 독소는 아니다. 특히, 본 발명은 아그로티스 및/또는 스포도프테라 종에 대한 활성, 그러나 바람직하게는 검거세미[아그로티스 입실론; BCW] 및/또는 가을 멸강나방[스포도프테라 프루지페르다] 및/또는 사탕무우 멸강나방[스포도프테라 엑시구아] 및/또는 담배 싹벌레 및/또는 옥수수 이삭벌레[헬리코베르파 제아]에 대한 활성을 포함하는 살충 활성의 범주를 갖는 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.
분자가 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자 및 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
상기 분자가 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:31, 또는 SEQ ID NO:1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명은 또한 곤충 특이적 단백질의 곤충-특이적 활성을 증가시키는 본 발명에 따른 보조 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.
상기 분자가 SEQ ID NO:19에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 바실루스 종의 영양 생장기에 분리 가능한 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 이들의 성분을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이며, 상기 단백질은 바실루스 스파에리쿠스 SSII-1로 부터 얻은 모기 치사 독소는 아니며, 상기 뉴클레오타이드 서열은 미생물 또는 식물에서의 발현을 위하여 최적화되었다.
상기 분자가 SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO:18에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
상기 분자가 SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, 또는 SEQ ID NO:30에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명은 또한 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 상기 폴리펩티드 사슬 중에서 하나 이상이 본 발명의 곤충 특이적 단백질을 나타내며 상기 폴리펩티드 사슬 중에서 하나 이상이 상기 곤충 특이적 단백질의 살충 작용을 활성화시키거나 또는 증가시키는 본 발명의 보조 단백질을 나타내는 다량체 살충성 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.
본 발명의 곤충 특이적 단백질 및 상기 곤충 특이적 단백질의 살충 작용을 활성화시키거나 또는 증가시키는 본 발명에 따른 보조 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
상기 분자가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:19에 나타낸 뉴클레오타이드 서열및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명의 또 다른 형태는 리보솜에 의해 번역되면 적어도 본 발명의 곤충 특이적 단백질 및/또는 본 발명에 따른 보조 단백질 및 임의로 융합에 사용된 기타 성분의 복합된 속성에 의해 융합 단백질을 생산하는 프레임 유전자 융합에 의해 생산된 본 발명의 하나 이상의 곤충 특이적 단백질 및/또는 본 발명에 따른 하나의 보조 단백질을 포함하는 몇개의 단백질 영역으로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.
본 발명 내에서 곤충 특이적 단백질 또는 보조 단백질을 상기 융합 단백질의 N-말단에 갖는 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질 및 본 발명에 따른 보조 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자가 바람직하다. 상기 분자가 SEQ ID NO:22에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명은 또한 수용 단백질에 대하여 이질적 기원의 신호 서열, 바람직하게는 트랜스진 산물을 특정 세포 기관 또는 세포 구획으로 이동시키는 분비 시그널 서열 또는 표적 서열과 융합된 본 발명의 곤충 특이적 단백질 및/또는 본 발명에 따른 보조 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 다량체 단백질을 코딩하는뉴클레오타이드 서열을 포함하는 미생물 또는 식물에서의 발현을 위하여 최적화된 DNA 분자를 포함한다.
상기 분자가 SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:45, 또는 SEQ ID NO:49에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 및, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자를 포함하는 최적화된 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명은 또한 5' 말단이 제거된 분비 시그널을 코딩하는 서열을 갖는 최적화된 DNA 분자, 그러나 특히 SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:39에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 최적화된 DNA 분자에 관한 것이며, 이와 구조적으로 및/또는 기능적으로 상동인 DNA 분자도 포함한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 실질적인 서열 상동성은 뉴클레오타이드 서열 간의 긴밀한 구조적 관계를 의미한다. 예컨대, 실질적으로 상동인 DNA 분자는 60%, 바람직하게는 80% 및 가장 바람직하게는 90% 또는 95%, 또는 그 이상으로 상동일 수 있다. 상동성은 또한 하나 또는 몇개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 부분 서열이 잘리거나, 또는 첨가된 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 분산되어 있는 부분 서열 간의 관계를 포함한다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 DNA 분자에 혼성되지만, 바람직하게는 중간 정도의 스트린젠트(stringent) 조건하에서 길이가 10 뉴클레오타이드 이상인 상기 곤충 특이적 단백질의 코딩 서열과 인접된 영역을 포함하는 상기 DNA 분자로 부터 수득 가능한 올리고뉴클레오타이드 탐침에 혼성되고 분자가 곤충-특이적 활성을 가지며 또한 상기 DNA 분자에 의해 곤충 특이적 단백질이 코딩되는 DNA 분자도 본발명에 포함된다.
혼성화가 7% SDS 및 0.5M 인산나트륨을 포함하는 65℃ 완충액 안에서 일어나는 DNA 분자가 바람직하다.
(a) 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 수득하고; 및 (b) 상기 DNA 분자를 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, 또는 SEQ ID NO:31에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로 부터 수득된 청구항 107에 따른 올리고뉴클레오타이드 탐침으로 혼성시키고; 및 (c) 상기 혼성된 DNA를 단리시키는 것을 포함하는 과정에 의해 수득 가능한 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 분자에 의해 코딩되는 곤충 특이적 단백질에 관한 것이다.
결합된 DNA 구조물을 숙주 생물, 바람직하게는 미생물 또는 식물에서 발현시키는 데 필요한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 발현 서열에 기능적으로 연결된 본 발명에 따른 DNA 분자, 및 임의의 추가적 조절 서열을 포함하는 발현 카세트도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발현 카세트 및/또는 벡터 분자는 식물 게놈의 일부가 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 바람직하게는 숙주 생물의 게놈 안에 안정하게삽입된 본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자를 포함하는 숙주 생물, 바람직하게는 식물 및 곤충 세포, 세균, 효모, 배큘로바이러스, 원생 동물, 선충 및 조류로 구성된 군에서 선정된 숙주 생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바람직하게는 식물 게놈 안에 안정하게 삽입된 본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물, 바람직하게는 옥수수 식물의 부위뿐만 아니라 이들의 후대 및 종자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자로 안정하게 형질전환된 식물의 부위뿐만 아니라 이들의 후대 및 종자를 포함하는 트랜스제닉 식물이 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 발현하는 식물의 부위뿐만 아니라 이들의 후대 및 종자를 포함하는 트랜스제닉 식물이 바람직하다.
본 발명은 또한 제 2의 특징적 곤충 방제요소, 바람직하게는 Bt δ-내독소를 발현하는 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물, 바람직하게는 옥수수 식물에 관한 것이다. 상기 식물은 바람직하게는 교잡 식물이다.
트랜스제닉 식물의 부위는 본 발명의 범주 내에서 본 발명에 따른 DNA 분자로 미리 형질전환시킨 트랜스제닉 식물 또는 이들의 후대에서 유래된 예컨대, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리뿐만 아니라, 식물 세포, 원형질체, 조직, 유합 조직, 배를 포함하는 것으로 해석할 수 있다.
본 발명은 또한 종자 보호성 피복제로 처리한 본 발명에 따른 식물의 식물 증식 물질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자로 형질전환된 것으로 바람직하게는 식물에서 증식하는 미생물, 더욱 바람직하게는 뿌리 착생 세균을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 포함하는 미생물을 포함하는 캡슐화된 곤충 특이적 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 숙주 생물, 바람직하게는 정제된 바실루스 균주 살충 유효량과 적합한 담체를 포함하는 살곤충성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 단독으로 또는 본 발명의 숙주 생물 및/또는 본 발명에 따른 캡슐화된 곤충 특이적 단백질과 조합된 본 발명에 따른 살충 유효량의 단리된 단백질 분자 및 적합한 담체를 포함하는 살곤충성 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 곤충 특이적 단백질을 포함하는 용액을 NAD 칼럼에 가하여 결합된 단백질을 용출시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따라 정제된 곤충 특이적 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다.
또한 바실루스 균주를 배양액에서 생장시키고; 상기 배양액으로 부터 상층액을 수득하고; 상기 상층액이 가해진 먹이를 곤충 유충에게 섭취시키고; 또 치사율을 측정하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질의 곤충 활성을 확인하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 바실루스 균주를 배양액에서 생장시키고; 상기 배양액으로 부터 상층액을 수득하고; 및, 상기 상층액으로 부터 상기 곤충 특이적 단백질을 단리시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 단리시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 수득하고; 상기 DNA 분자를 바실루스 균주로 부터 수득한 DNA와 혼성시키고; 상기 혼성된 DNA를 단리시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 단백질의 살충 활성을 나타내는 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 단리시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질과는 다른 하나 이상의 살충성 단백질, 바람직하게는 Bt δ-내독소, 프로테아제 억제제, 렉틴, α-아밀라제 및 과산화효소로 구성된 군으로 부터 선택된 살충성 단백질과 조합하여 사용함으로써 대상 곤충의 범위를 넓히는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질과는 다른 하나 이상의 살충성 단백질, 바람직하게는 Bt δ-내독소, 프로테아제 억제제, 렉틴, α-아밀라제 및 과산화효소로 구성된 군으로 부터 선택된 살충성 단백질과 조합함으로써 상기 식물에서 발현시킴으로써 한 식물에서의 대상 곤충의 범위를 넓히는 방법이 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 살곤충성 조성물 또는 독소 단백질을 식물또는 식물의 생장 지역에 투여하는 것을 포함하는, 곤충 해충, 바람직하게는 스포도프테라 및/또는 아그로티스 종, 및 더욱 바람직하게는 검거세미[아그로티스 입실론; BCW] 및/또는 가을 멸강나방[스포도프테라 프루지페르다] 및/또는 사탕무우 멸강나방[스포도프테라 엑시구아] 및/또는 담배 싹벌레 및/또는 옥수수 이삭벌레[헬리코베르파 제아]에 의해 초래되는 손상으로부터 식물을 보호하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물을 상기 곤충 해충이 발생할 수 있는 구역에 식재하는 것을 포함하는, 곤충 해충, 바람직하게는 스포도프테라 및/또는 아그로티스 종, 및 더욱 바람직하게는 검거세미[아그로티스 입실론; BCW] 및/또는 가을 멸강나방[스포도프테라 프루지페르다] 및/또는 사탕무우 멸강나방[스포도프테라 엑시구아] 및/또는 담배 싹벌레 및/또는 옥수수 이삭벌레[헬리코베르파 제아]에 의해 초래되는 손상으로부터 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 숙주 생물을 본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 숙주 게놈 안에 안정하게 삽입된 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하고 바람직하게는 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 발현하는 숙주 생물을 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 식물 및 식물 세포를 각각 본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는벡터 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 식물 게놈 안에 안정하게 삽입된 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하고 바람직하게는 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따라 분리된 바실루스 균주 및/또는 숙주 생물 및/또는 분리된 단백질 분자, 및/또는 캡슐화된 단백질 살충 유효량을 적합한 담체와 혼합하는 것을 포함하는 살곤충성 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 모(parent) 식물을 본 발명에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자로 형질전환시켜 공지된 식물 육종 기술을 사용하여 살충 특성을 상기 트랜스제닉 모식물의 후대로 전달시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 식물 게놈 안에 안정하게 삽입된 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 모식물의 트랜스제닉 후대를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바실루스 종의 영양 생장기에 단리 가능한 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성될 수 있고, 상기 단백질이 바실루스 스파에리쿠스 SSII-1로 부터 얻은 모기 치사 독소가 아니며, 길이가 10 뉴클레오타이드 이상인 상기 곤충 특이적 단백질의 코딩 서열과 인접된 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 탐침 및 이들의 성분 그리고 곤충 특이적 단백질이 천연적으로 존재하는지 여부 또는 형질전환된 특정 생물이 상기 유전자를 포함하고 있는지의 여부를 결정하기 위하여 바실루스 균주 또는 기타 생물을 스크리닝하기 위한 상기 올리고뉴클레오타이드 탐침의 용도를 포함한다.
본 발명은 살충성 단백질이 바실루스 균주의 영양 생장기에 생산된다는 것을 밝혔다. 이 강이 존재한다는 것을 밝혔으므로, 본 발명은 바실루스 스파에리쿠스 SSII-1로 부터 얻은 모기 치사 독소를 제외한 영양 생장기의 모든 살충성 단백질(이후, VIP로 약칭)을 포함한다.
본 VIP는 포자 형성 이후에는 풍부하지 않으며 특히 정지기 전의 로그 생장기에 발현한다. 본 발명의 목적을 위하여 영양 생장기는 포자 형성이 시작되기 전의 기간으로 정의한다. 해충 방제 계획에 사용하기 위하여, 상기 VIP를 코딩하는 유전자를 단리시키고, 클론화시켜 다양한 운반장치 내로 형질전환시킬 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 해충은 곤충에 한정되어 있지 않고, 진균, 세균, 선충, 응애, 진드기, 원생 동물 병원체, 동물-기생성 간 디스토마 등을 포함한다. 곤충 해충은 딱정벌레 목, 파리 목, 벌 목, 나비 목, 털이 목, 매미 목, 노린재 목, 메뚜기 목, 총채벌레 목, 집게벌레 목, 흰개미 목, 이 목, 벼룩 목, 날도래 목, 등등, 특히 딱정벌레 목 및 나비 목으로 부터 선택된 곤충을 포함한다.
표 1 내지 표 10은 주요 작물 식물과 관련된 해충과 인간 및 가축에 있어서 중요한 해충의 목록이다. 이들 해충은 본 발명의 범주에 속한다.
[표 1]
레피도프테라(나비 및 나방)
옥수수
오스트리니아 누비랄리스 (Ostrinia nubilalis, 유럽 옥수수 조명충나방)
아그로티스 입실론 (Agrotis ipsilon, 검거세미)
헬리코베르파 제아 (Helicoverpa zea,옥수수 이삭벌레)
스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda,가을 멸강나방)
디아트라에아 그란디오셀라 (Diatraea grandiosella, 남서부 옥수수 조명충나방)
엘라스모팔푸스 리그노셀루스 (Elasmopalpus lignosellus, 소옥수수대 조명충나방)
디아트라에아 사카랄리스 (Diatraea saccharalis, 사탕수수 조명충나방)
소굼
칠로 파르텔루스 (Chilo partellus, 소굼 조명충나방)
스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda,가을 멸강나방)
헬리코베르파 제아 (Helicoverpa zea,옥수수 이삭벌레)
엘라스모팔푸스 리그노셀루스 (Elasmopalpus lignosellus, 소옥수수대 조명충나방)
펠티아 서브테라네아 (Feltia subterranea, 과립형 거세미)
밀
슈달레티아 유니푼크타타 (Pseudaletia unipunctata, 멸강나방)
스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda,가을 멸강나방)
엘라스모팔푸스 리그노셀루스 (Elasmopalpus lignosellus, 소옥수수대 조명충나방)
아그로티스 오르토고니아 (Agrotis orthogonia, 담색 서부 거세미)
해바라기
술레이마 헬리안타나 (Suleima helianthana, 해바라기 싹 나방)
호모에오소마 에렉텔룸 (Homoeosoma electellum, 해바라기 나방)
면화
헬리오티스 비레센스 (Heliothis virescens, 면화 다래벌레)
헬리코베르파 제아 (Helicoverpa zea,면화 다래벌레)
스포도프테라 엑시구아 (Spodoptera exigua,사탕무우 멸강나방)
펙티노포라 고시피엘라 (Pectinophora gossypiella, 연분홍 다래벌레)
벼
디아트라에아 사카랄리스 (Diatraea saccharalis, 사탕수수 조명충나방)
스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda,가을 멸강나방)
헬리코베르파 제아 (Helicoverpa zea,옥수수 이삭벌레)
대두
슈도플루시아 인클루덴스 (Pseudoplusia includens, 대두 자벌레)
안티카르시아 겜마탈리스 (Anticarsia gemmatalis, 벨벳콩 모충)
플라티페나 스카브라 (Plathypena scabra, 녹색 클로우버벌레)
오스트리니아 누비랄리스 (Ostrinia nubilalis, 유럽 옥수수 조명충나방)
아그로티스 입실론 (Agrotis ipsilon, 검거세미)
스포도프테라 엑시구아 (Spodoptera exigua,사탕무우 멸강나방)
헬리오티스 비레센스 (Heliothis virescens, 면화 다래벌레)
헬리코베르파 제아 (Helicoverpa zea,면화 다래벌레)
보리
오스트리니아 누비랄리스 (Ostrinia nubilalis, 유럽 옥수수 조명충나방)
아그로티스 입실론 (Agrotis ipsilon, 검거세미)
[표 2]
딱정벌레 목(딱정벌레)
옥수수
디아브로티카 비르지페라 비르지페라 (Diabrotica virgifera virgifera,서부 옥수수 뿌리벌레)
디아브로티카 롱기코르니스 바르베티 (Diabrotica longicornis barbeti,북부 옥수수 뿌리벌레)
디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디 (Diabrotica undecimpunctata howardi, 남부 옥수수 뿌리벌레)
멜라노투스 종 (Melanotus spp., 방아벌레)
시클로세팔라 보레아리스 (Cyclocephala borealis, 북부 차폐 풍뎅이(흰 굼벵이))
시클로세팔라 임마쿨라타 (Cyclocephala immaculata, 남부 차폐 풍뎅이(흰 굼벵이))
포필리아 자포니카 (Popillia japonica, 일본 딱정벌레)
차에톡네마 풀리카리아 (Chaetocnema pulicaria, 옥수수 벼룩 딱정벌레)
스페노포루스 마이디스 (Sphenophorus maidis, 옥수수 부리벌레)
소굼
필로파가 크리니타 (Phyllophaga crinita, 흰 굼벵이)
엘레오데스(Eleodes), 코노데루스(Conoderus) 및 아에올루스 종(Aeolus spp.) (방아벌레)
오울레마 멜라노푸스 (Oulema melanopus, 곡류 잎 딱정벌레)
차에톡네마 풀리카리아 (Chaetocnema pulicaria,옥수수 벼룩 딱정벌레)
스페노포루스 마이디스 (Sphenophorus maidis, 옥수수 부리벌레)
밀
오울레마 멜라노푸스 (Oulema melanopus, 곡류 잎 딱정벌레)
히페라 푼크타타 (Hypera punctata, 클로우버 잎 바구미)
디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디 (남부 옥수수 뿌리벌레)
해바라기
지고그람마 엑스클라마티오니스 (Zygogramma exclamationis, 해바라기 딱정벌레)
보티루스 깁보수스 (Bothyrus gibbosus, 당근 딱정벌레)
면화
안토노무스 그란디스 (Anthonomus grandis, 다래 바구미)
벼
콜라스피스 브룬네아 (Colaspis brunnea, 포도 콜라스피스)
리소르홉트루스 오리조필루스 (Lissorhoptrus oryzophilus, 벼 물바구미)
시토필루스 오리자에 (Sitophilus oryzae, 벼 바구미)
대두
에필라츠나 바리베스티스 (Epilachna varivestis, 멕시코 콩 딱정벌레)
[표 3]
매미 목(가루이, 진딧물 등)
옥수수
로팔로시품 마이디스 (Rhopalosiphum maidis, 옥수수 잎 진디)
아누라피스 마이디라디시스 (Anuraphis maidiradicis, 옥수수 뿌리 진디)
소굼
로팔로시품 마이디스 (Rhopalosiphum maidis, 옥수수 잎 진디)
시파 플라바 (Sipha flava, 노랑 사탕수수 진디)
밀
러시아 밀 진디
스치자피스 그라미눔 (Schizaphis graminum, 녹색벌레)
마크로시품 아베나에 (Macrosiphum avenae, 영국 곡류 진디)
면화
아피스 고시피이 (Aphis gossypii, 면화 진디)
슈다토모스셀리스 세리아투스 (Pseudatomoscelis seriatus, 면화 벼룩)
트리알레우로데스 아부틸로네아 (Trialeurodes abutilonea, 띠모양날개 가루이)
벼
네포텍틱스 니그로픽투스 (Nephotettix nigropictus, 벼 매미충)
대두
미주스 페르시카에 (Myzus persicae, 녹색 복숭아 진디)
엠포아스카 파바에 (Empoasca fabae, 감자 매미충)
보리
스치자피스 그라미눔 (Schizaphis graminum, 녹색벌레)
오일 종자 유채
브레비코리네 브라시카에 (Brevicoryne brassicae, 양배추 진디)
[표 4]
노린재 목 (노린재)
옥수수
블리수스 레우콥테루스 레우콥테루스 (Blissus leucopterus leucopterus, 긴노린재)
소굼
블리수스 레우콥테루스 레우콥테루스 (Blissus leucopterus leucopterus, 긴노린재)
면화
리구스 리네올라리스 (Lygus lineolaris, 변색 식물 벌레)
벼
블리수스 레우콥테루스 레우콥테루스 (Blissus leucopterus leucopterus, 긴노린재)
아크로스테르눔 힐라레 (Acrosternum hilare, 녹색 노린재)
대두
아크로스테르눔 힐라레 (Acrosternum hilare, 녹색 노린재)
보리
블리수스 레우콥테루스 레우콥테루스 (Blissus leucopterus leucopterus, 긴노린재)
아크로스테르눔 힐라레 (Acrosternum hilare, 녹색 노린재)
에우스치스투스 세르부스 (Euschistus servus, 갈색 노린재)
[표 5]
메뚜기 목 (메뚜기, 귀뚜라미 및 바퀴벌레)
옥수수
멜라노플루스 페무루브룸 (Melanoplus femurrubrum, 빨강 다리 메뚜기)
멜라노플루스 산귀니페스 (Melanoplus sanguinipes, 이동성 메뚜기)
밀
멜라노플루스 페무루브룸 (Melanoplus femurrubrum, 빨강 다리 메뚜기)
멜라노플루스 디페렌티알리스 (Melanoplus differentialis, 변종 메뚜기)
멜라노플루스 산귀니페스 (Melanoplus sanguinipes, 이동성 메뚜기)
면화
멜라노플루스 페무루브룸 (Melanoplus femurrubrum, 빨강 다리 메뚜기)
멜라노플루스 디페렌티알리스 (Melanoplus differentialis, 변종 메뚜기)
대두
멜라노플루스 페무루브룸 (Melanoplus femurrubrum, 빨강 다리 메뚜기)
멜라노플루스 디페렌티알리스 (Melanoplus differentialis, 변종 메뚜기)
구조물/가정
페리플라네타 아메리카나 (Periplaneta americana, 미국 바퀴벌레)
블라텔라 게르마니카 (Blattella germanica, 독일 바퀴벌레)
블라타 오리엔탈리스 (Blatta orientalis, 동양 바퀴벌레)
[표 6]
파리 목 (파리 및 모기)
옥수수
힐레미아 플라투라 (Hylemya platura, 옥수수종자 구더기)
아그로미자 파르비코르니스 (Agromyza parvicornis, 옥수수 반점 침식충)
소굼
콘타리니아 소르그히콜라 (Contarinia sorghicola, 소굼 모기)
밀
마이에티올라 데스트룩토르 (Mayetiola destructor, 헤세 파리)
시토디플로시스 모셀라나 (Sitodiplosis mosellana, 밀 모기)
메로미자 아메리카나 (Meromyza americana, 밀 줄기 구더기)
힐레미아 코아륵타타 (Hylemya coarctata, 밀 구근 파리)
해바라기
네올라시옵테라 무르트펠드티아나 (Neolasioptera murtfeldtiana, 해바라기 종자 모기)
대두
힐레미아 플라투라 (Hylemya platura, 옥수수종자 구더기)
보리
힐레미아 플라투라 (Hylemya platura, 옥수수종자 구더기)
마이에티올라 데스트룩토르 (Mayetiola destructor, 헤세 파리)
인간 및 동물을 공격하며 질병을 옮기는 곤충
아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 황열병 모기)
아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus, 숲 모기)
플레보토무스 파파타시이 (Phlebotomus papatasii, 모래 파리)
무스카 도메스티카 (Musca domestica, 집 파리)
타바누스 아트라투스 (Tabanus atratus, 검정 말 파리)
코클리오미이아 호미니보락스 (Cochliomyia hominivorax, 나사벌레 파리)
[표 7]
총채벌레 목 (삽주벌레)
옥수수
아나포트립스 옵스쿠루스 (Anaphothrips obscurus, 잔디 삽주벌레)
밀
프란클리니엘라 푸스카 (Frankliniella fusca, 담배 삽주벌레)
면화
트립스 타바시 (Thrips tabaci, 양파 삽주벌레)
프란클리니엘라 푸스카 (Frankliniella fusca, 담배 삽주벌레)
대두
세리코트립스 바리아빌리스 (Sericothrips variabilis, 대두 삽주벌레)
트립스 타바시 (Thrips tabaci, 양파 삽주벌레)
[표 8]
벌 목 (잎벌, 개미, 장수말벌 등)
옥수수
솔레놉시스 밀레스타 (Solenopsis milesta, 도둑 개미)
밀
세푸스 신크투스 (Cephus cinctus, 밀 줄기 잎벌)
[표 9]
기타 목 및 대표종
집게벌레 목 (집게벌레)
포르피쿨라 아우리쿨라리아 (Forficula auricularia, 유럽 집게벌레)
흰개미 목 (흰개미)
레티쿨리테르메스 플라비페스 (Reticulitermes flavipes, 서부 지중 흰개미)
털이 목 (깨무는 이)
쿠클로토가스테르 헤테로그라파 (Cuclotogaster heterographa, 닭 머리 이)
보비콜라 보비스 (Bovicola bovis, 소 이)
이 목 (빠는 이)
페디쿨루스 휴마누스 (Pediculus humanus, 머리 및 신체의 이)
벼룩 목 (벼룩)
크테노세팔리데스 펠리스 (Ctenocephalides felis, 고양이 벼룩)
[표 10]
진드기 목 (응애 및 진드기)
옥수수
테트라니쿠스 우르티카에 (Tetranychus urticae, 쌍반점 거미 응애)
소굼
테트라니쿠스 신나바리누스 (Tetranychus cinnabarinus, 양홍색 거미 응애)
테트라니쿠스 우르티카에 (Tetranychus urticae, 쌍반점 거미 응애)
밀
아세리아 툴리파에 (Aceria tulipae, 밀 곱슬 응애)
면화
테트라니쿠스 신나바리누스 (Tetranychus cinnabarinus, 양홍색 거미 응애)
테트라니쿠스 우르티카에 (Tetranychus urticae, 쌍반점 거미 응애)
대두
테트라니쿠스 투르케스타니 (Tetranychus turkestani, 딸기 거미 응애)
테트라니쿠스 우르티카에 (Tetranychus urticae, 쌍반점 거미 응애)
보리
페트로비아 라텐스 (Petrobia latens, 갈색 밀 응애)
중요한 인간 및 동물의 진드기
데마센토르 바리아빌리스 (Demacentor variabilis, 미국 개 진드기)
아르가스 페르시쿠스 (Argas persicus, 가금 진드기)
데르마토파고이데스 파리나에 (Dermatophagoides farinae, 미국 집먼지 응애)
데르마토파고이데스 프테로니시누스 (Dermatophagoides pteronyssinus, 유럽 집먼지 응애)
본 발명에서 살충성 단백질은 영양 생장기의 바실루스로부터 단리시킬 수 있으며, 기타 균주는 표준 기술에 의해 단리시키고 또 특정 식물성 및 비-식물성 해충에 대한 활성을 시험할 수 있음을 밝혔다. 통상 바실루스 균주는 당업계에 알려진 방법을 통하여 토양, 식물, 곤충, 곡물 창고의 먼지 및 기타 시료 물질 등을 포함하는 어떠한 주변의 시료로부터 단리시킬 수 있다. 예컨대, 트래버스(Travers) 일행의 (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1263-1266 페이지; 살레흐(Saleh) 일행의 (1969) Can. J. Microbiol. 15: 1101-1104 페이지; 드룩카(DeLucca) 일행의 (1981) Can. J. Microbiol. 27: 865-870 페이지; 및 노리스(Norris) 일행의 (1981) "바실루스 및 스포로락토바실루스 속(The generaBacillusandSporolactobacillus)", 스타(Starr) 일행(편집자)의 "원핵생물: 세균의 서식지, 단리 및 동정에 관한 핸드북"(The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ⅱ권, 스프링거-베르로크 베를린 하이델베르크)을 참조하라. 단리시킨 후, 영양 생장기 동안의 살충 활성에 대하여 균주를 시험할 수 있다. 이러한 방법으로, 신규 살충성 단백질 및 균주를 동정할 수 있다.
본 발명에서 사용한 상기 바실루스 미생물은 바실루스 세레우스 및 바실루스 투린지엔시스, 뿐만 아니라 하기 표 11에 나열한 바실루스 종을 포함한다.
[표 11]
바실루스( Bacillus ) 종의 목록
형태학적 군 1
B. 메가테리움 (B. megaterium)
B. 세레우스*
B. 세레우스 변종 미코이데스 (B. cereus var. mycoides)
B. 투린지엔시스*
B. 리체니포르미스 (B. licheniformis)
B. 서브틸리스*(B. subtilis * )
B. 푸밀루스 (B. pumilus)
B. 피르무스*(B. firmus * )
B. 코아굴란스 (B. coagulans)
형태학적 군 2
B. 폴리믹사 (B. polymyxa)
B. 마세란스 (B. macerans)
B. 시르쿨란스 (B. circulans)
B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus)
B. 알베이*(B. alvei * )
B. 라테로스포루스*(B. laterosporus * )
B. 브레비스 (B. brevis)
B. 풀비파시엔스 (B. pulvifaciens)
B. 포필리아에*(B. popilliae * )
B. 렌티모르부스*(B. lentimorbus * )
B. 라르바에*(B. larvae * )
형태학적 군 3
B. 스파에리쿠스*(B. sphaericus * )
B. 파스테우리이 (B. pasteurii)
무할당 균주
아군 A
B. 아피아루스*(B. apiarus * )
B. 필리콜로니쿠스 (B. filicolonicus)
B. 티아미노리티쿠스 (B. thiaminolyticus)
B. 알칼로필루스 (B. alcalophilus)
아군 B
B. 시로플라젤로수스 (B. cirroflagellosus)
B. 치티노스포루스 (B. chitinosporus)
B. 렌투스 (B. lentus)
아군 C
B. 바디우스 (B. badius)
B. 아네우리노리티쿠스 (B. aneurinolyticus)
B. 마크로이데스 (B. macroides)
B. 프레운덴레이치이 (B. freundenreichii)
아군 D
B. 판토텐티쿠스 (B. pantothenticus)
B. 에피피투스 (B. epiphytus)
아군 E1
B. 아미노보란스 (B. aminovorans)
B. 글로비스포루스 (B. globisporus)
B. 인솔리투스 (B. insolitus)
B. 시크로필루스 (B. psychrophilus)
아군 E2
B. 시크로사카롤리티쿠스 (B. psychrosaccharolyticus)
B. 막쿠아리엔시스 (B. macquariensis)
*= 패리(Parry), 제이.엠. 일행의 바실루스 종의 원색 도감(Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, 1983, 런던)에 따른 곤충군과 연관된 것으로 종전에 알려진 바실루스 균주
본 발명에 따라서, 영양 생장기에 생산된 살충성 단백질은 바실루스로부터 단리할 수 있다. 한가지 구체예로서, 영양 생장기에 생산된 살충성 단백질은 단리할 수 있다. 단백질의 단리 방법은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 단백질은 젤-여과법, 이온-교환법, 및 면역친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 예컨대 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피, 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피, 고성능 크로마토포커싱 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 포함하는 통상적인 크로마토그래피에 의해서, 또는 전기영동 분리법 예컨대 일차원 젤 전기영동, 이차원 젤 전기영동 등에 의해 정제할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 알려져 있다. 예컨대 아우수벨(Ausubel) 일행이 편집한Current Protocols in Molecular Biology(1권 및 2권, John Wiley & Sons 출판사, 뉴욕, 1988년) 참조. 추가로, 실질적으로 순수한 단백질 제조물에 대한 항체를 준비할 수 있다. 예컨대 라드카(Radka) 일행의J. Immunol. (1983년) 128: 2804 페이지; 및 라드카(Radka) 일행의Immunogenetics(1984년) 19: 63 페이지 참조. 살충 특성을 갖는 단백질을 정제하기 위하여 어떠한 조합의 방법을 사용할 수 있다. 실험 계획이 설정되면, 살충 활성은 각 정제 단계 이후에 측정한다.
상기 정제 단계는 실질적으로 정제된 단백질 분획을 생성시킨다. "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 순수한"이란 것은 천연 상태의 단백질과 통상 결합된어떠한 화합물도 실질적으로 없음을 의미한다. "실질적으로 순수한" 단백질 제조물은 SDS-PAGE를 수행하여 시각적으로 또는 밀도 스캐닝에 의해 측정된 기타 검출성 단백질 밴드의 부재에 의해 평가할 수 있다. 대안으로, 정제된 제조물에서 기타 아미노-말단 서열 또는 N-말단 잔기의 부재는 순도의 정도를 나타낼 수 있다. 순도는 이온 교환, 역상 또는 모세관 전기영동에 의해 다른 피크의 부재를 나타내는 "순수한" 제조물을 재크로마토그래피함으로써 확인할 수 있다. "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"이란 용어는 상기 단백질과 다른 화합물의 인공 또는 합성 혼합물을 배제하는 것을 의미하진 않는다. 이 용어는 또한 상기 단백질의 생물학적 활성을 방해하지 않으며, 예컨대 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 소량의 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하진 않는다.
일단 정제된 단백질이 분리되면, 이 단백질 또는 이를 구성하는 폴리펩티드는 당업계에서 알려진 일반적인 방법에 의해 특성을 밝히고 서열을 결정할 수 있다. 예컨대, 정제된 단백질 또는 이를 구성하는 폴리펩티드는 브롬화 시아노겐, 단백질 분해 효소 예컨대 파파인, 키모트립신, 트립신, 리실-C 엔도펩티다제 등을 사용하여 단편화시킬 수 있다(오이케(Oike) 일행 (1982)J. Biol. Chem.257: 9751-9758페이지; 리우(Liu) 일행 (1983)Int. J. Pept. Protein Res.21: 209-215페이지). 펩티드 산물은 바람직하게는 HPLC, 또는 젤 분리법 및 PVDF 막을 이용한전기 블롯팅에 의해 분리시키고, 아미노산 서열을 결정한다. 이 실험을 수행하기 위하여, 펩티드는 바람직하게는 자동 서열결정기에 의해 분석한다. N-말단, C-말단, 또는 내부 아미노산 서열을 결정할 수 있음이 확인되었다. 정제된 단백질의 아미노산 서열로부터, 살충성 단백질을 코딩하는 유전자의 분리를 도와주는 탐침으로 사용할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 합성할 수 있다.
살충성 단백질은 소중합성일 수 있으며 분자량, 기본 단위체의 수, 펩티드 성분, 특정 해충에 대한 활성, 및 기타 특성에 있어서 다양할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 설명한 방법에 의해, 다양한 해충에 대하여 활성이 있는 단백질을 분리시키고 특성을 밝힐 수 있다.
일단 정제된 단백질을 분리시키고 특성을 밝히면 아미노산 치환, 제거, 절두, 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변화시킬 수 있다. 이들 조작 방법은 통상 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 살충성 단백질의 아미노산 서열 변종은 DNA 내의 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 이들 변종은 필요로 하는 살충 활성을 가질 수 있다. 분명히, 변종을 코딩하는 DNA 내에서 형성되는 돌연변이는 리딩 프레임밖의 서열에서 생기지 않아야하며 또 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 형성할 수 있는 상보적 영역을 만들지 않아야 한다. EP 특허 출원 공고 75,444호 참조.
이런 방법으로, 본 발명은 살충성 단백질뿐만 아니라 이들의 성분 및 단편에 관한 것이다. 즉, 살충 활성을 갖는 단백질의 기본 단위체 성분, 폴리펩티드 또는 단편을 제조할 수 있음이 확인되었다. 이들 단편은 단백질의 N-말단, C-말단, 내부 및 내부적으로 제거된 아미노산 서열뿐만 아니라 절두된 서열을 포함한다.
상기 단백질 서열의 제거, 삽입 및 치환의 대부분은 상기 살충성 단백질의 특성에 급격한 변화를 유발하지 않을 것으로 예상된다. 그러나, 실험에 앞서 치환, 제거 또는 삽입의 정확한 영향을 예측하기 어려운 경우, 당업자는 통상적인 스크리닝 분석법에 의해 이 영향을 평가할 것이다.
본 발명에서 기술한 단백질 또는 기타 폴리펩티드 성분은 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 즉, 몇몇 단백질은 상이한 곤충 해충을 방제하기 위하여 사용할 수 있다.
몇몇 단백질은 단일 폴리펩티드 사슬인 반면 많은 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 다시 말해서 이들은 소중합성이다. 또한, 몇몇 VIP는 소중합체로서 살충 활성이 있다. 이런 경우에, 살충 활성을 증가시키거나 또는 살충성 단백질을 활성화시키기 위하여 추가적인 기본 단위체를 사용한다. 증가 또는 활성화시키는 이들 기본 단위체를 보조 단백질로 칭한다. 보조 단백질은 살충성 단백질과 상호 작용하여 보조 단백질이 없을 때에 비하여 증가된 살충 활성을 갖는 소중합성 단백질을 형성함으로써 살충성 단백질을 활성화시키거나 또는 향상시킨다.
보조 단백질은 AB78로부터 단리시킨 VIP1 단백질과 같은 살충성 단백질을 활성화시키거나 또는 활성을 증가시킨다. 상기 보조 단백질의 예로는 AB78로부터 단리시킨 VIP2 단백질을 들 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 본 출원의 실험 영역에서 증명한 바와 같이, 보조 단백질은 수많은 살충성 단백질을 활성화시킬 수 있다.그래서, 본 발명의 한 형태에서, 한 식물, 모식물 1은 보조 단백질을 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 이 모식물 1은 살충 활성이 보조 단백질에 의해 활성화되는 하나 이상의 살충성 단백질을 사용하여 형질전환시킨 수많은 모식물 2와 교배할 수 있다. 본 발명의 살충성 단백질 중에서 신규 집단의 곤충 특이적 단백질은 본 발명의 범주 내에서 확인할 수 있다. 본 발명에서 VIP3으로서 지칭된 상기 단백질은 바실루스 종 균주, 그러나 바람직하게는 바실루스 투린지엔시스 균주 및 가장 바람직하게는 바실루스 투린지엔시스 균주 AB88 및 AB424로부터 수득할 수 있다. 상기 VIP는 균주 AB88에서 전체의 75% 이상의 양으로 바실루스 배양액의 상층액에 대부분 존재한다. VIP3 단백질은 또한 아그로티스 및/또는 스포도프테라 종, 그러나 바람직하게는 검거세미[BCW] 및/또는 가을 멸강나방 및/또는 사탕무우 멸강나방 및/또는 담배 싹벌레 및/또는 옥수수 이삭벌레에 대한 활성을 포함하는 독특한 범주의 살충 활성을 갖는 특징이 있다.
검거세미는 δ-내독소에 대하여 매우 내성이 있는 농업적으로 중요한 곤충이다. 맥킨토시(Macintosh) 일행은 (1990년, J Invertebr Pathol 56, 258-266페이지) δ-내독소 CrylA(b) 및 CrylA(c)이 BCW에 대하여 LC50이 각각 투여량 80 ㎍/㎖ 및 18 ㎍/㎖인 살충 특성을 갖는다는 것을 보고했다. 본 발명에 따른 VIP3A 살충성 단백질은 단지 50%의 치사율을 획득하는데 필요한 CrylA 단백질의 양보다 적어도 10 내지 500배, 바람직하게는 50 내지 350배, 및 더욱 바람직하게는 200 내지 300배 적은 양의 단백질을 첨가했을 때 50% 이상의 치사율을 나타냈다. 본 발명내에서 특히 바람직한 것은 단지 50%의 치사율을 획득하는데 필요한 CrylA 단백질의 양보다 적어도 260배 적은 양의 단백질을 첨가했을 때 100%의 치사율을 나타낸 VIP3A 살충성 단백질이다.
본 발명에 따른 VIP3A 살충성 단백질은 대부분 배양액의 상층액에 존재하며 따라서 분비 단백질로서 분류되어야 한다. 이들은 바람직하게는 소수성 코어 영역의 다음에 오는 수많은 양성자성 잔기를 N-말단 서열에 함유하고 있어서 반출되는 동안에 N-말단이 처리되지 않는다.
본 발명의 범주 내에서 보고한 기타 살충성 단백질처럼, VIP3 단백질은 δ-내독소 계열에 속하는 기타 단백질과 뚜렷히 구별되는 포자 형성기 이전 단계에서 검출할 수 있다. 바람직하게는, 곤충 특이적 단백질의 발현은 중간-로그 생장기에 시작되어 포자 형성기에도 계속된다. VIP3 단백질의 높은 안정성과 조합된 특이한 발현 양상으로 인하여, 다량의 VIP3 단백질은 포자 형성기 배양액의 상층액에서 검출할 수 있다. 특히 SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:32에서 확인된 VIP3 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상응하는 DNA 분자, 그러나 특히 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30 및 SEQ ID NO:31에서 주어진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자가 바람직하다.
본 발명의 살충성 단백질은 대상 곤충의 범위를 넓히기 위하여 Bt 내독소 또는 기타 살충성 단백질과 조합하여 사용할 수 있다. 또한, Bt δ-내독소 또는 뚜렷한 특성을 갖는 기타 살충 요소와 조합된 본 발명의 VIP의 용도는 곤충 내성의 예방 및/또는 처리를 위하여 특별히 유용하다. 기타 살충 요소는 프로테아제 억제제(세린 및 시스테인 형), 렉틴, α-아밀라제 및 과산화효소를 포함한다. 하나의 바람직한 형태로는, 트랜스제닉 식물 안에서 VIP의 발현은 하나 이상의 Bt δ-내독소의 발현을 수반한다. 동일한 트랜스제닉 식물 안에서 하나 이상의 살충 요소의 공동발현은 식물이 필요한 모든 유전자를 함유하고 발현하도록 유전적으로 처리함으로써 달성할 수 있다. 대안으로, 하나의 식물, 모식물 1은 VIP의 발현을 위하여 유전적으로 처리할 수 있다. 두 번째 식물, 모식물 2는 Bt δ-내독소의 발현을 위하여 유전적으로 처리할 수 있다. 모식물 1과 모식물 2를 교배함으로써, 모식물 1 및 2에 도입된 모든 유전자를 발현하는 후대 식물을 수득한다. 특히 바람직한 Bt δ-내독소는 본 발명의 참고자료로서 포함된 EP-A-0 618976호에 개시되어 있다.
비록 모두는 아니지만, 상당히 많은 수의 세포독성 단백질은 작용에 있어서 2성분성이다. 2성분 독소는 하나가 A 영역 다른 하나가 B 영역으로 지칭된 통상 두 개의 단백질 영역으로 구성된다(박테리아성 단백질 독소의 원전(Sourcebook of Bacterial Protein Toxins), 제이.이.알로우프 및 제이.에이치.프리어 편저(1991), 아카데미 출판사 참조). A 영역은 강한 세포독성 활성을 갖는다. B 영역은 내화되기 전에 외부의 세포 표면 수용체와 결합한다. 통상, 세포독성 A 영역은 전치 영역에 의해 세포질로 운반되어야 한다. 종종 A 및 B 영역은 단백질-단백질 상호작용 또는 디-술피드 결합에 의해 결합되는 별개의 폴리펩티드 또는 기본 단위체이다. 그러나 독소는 슈도모나스 외독소 A의 경우처럼 세포 내에서 두 개의 영역으로 단백질 분해 처리되는 단일 폴리펩티드일 수 있다. 요약하면 2성분 독소는 통상 3개의 영역, 예컨대 세포독성 A 영역, 수용체 결합성 B 영역 및 전치 영역을 갖는다. A 및 B 영역은 종종 단백질-단백질 상호작용 영역에 의해 결합한다.
본 발명의 수용체 결합 영역은 어떠한 단백질, 독소, 효소, 전사 인자, 핵산, 화학물질 또는 기타 인자를 본 특허에서 기술한 2성분 독소의 수용체 결합 영역에 의해 인지되는 수용체를 갖는 대상 곤충으로 전달하는데 있어서 유용하다. 이와 비슷하게, 2성분 독소가 인지질 2층 세포막을 관통하며 이들 세포막을 가로질러 세포독소를 운반하는 전치 영역을 갖고 있기 때문에, 이들 전치 영역은 인지질 2층막 예컨대 원형질막 또는 액포막을 가로질러 어떠한 단백질, 독소, 효소, 전사 인자, 핵산, 화학물질 또는 기타 인자를 운반하는데 있어서 유용할 수 있다. 전치 영역은 그 자체가 세포막에 구멍을 낼 수 있어서, 독성 또는 살충 특성을 갖는다. 또한, 모든 2성분 독소는 세포독성 영역을 갖고 있으며; 이 세포독성 영역은 단독으로 또는 어떠한 방법에 의해 대상 세포 내로 운반되었을 때 치사 단백질로서 유용할 수 있다.
마지막으로, 두 개의 폴리펩티드로 구성된 2성분 독소가 종종 복합체를 형성하기 때문에, 본 발명의 2성분 독소의 성분 내에 단백질-단백질 상호작용 영역이 존재하는 듯하다. 이들 단백질-단백질 상호작용 영역은 독소, 효소, 전사 인자, 핵산, 항체, 세포 결합성 단편, 또는 기타 화학물질, 인자, 단백질 또는 단백질 영역과 어떠한 조합의 결합을 형성하는데 있어서 유용하다.
독소, 효소, 전사 인자, 항체, 세포 결합성 단편 또는 기타 단백질 영역은 리보솜에 의해 번역되면 VIP 및 융합시 사용한 기타 성분의 속성이 결합된 융합 단백질을 생산하는 프레임 유전자 융합법에 의해 살충성 또는 보조 단백질과 융합할수 있다. 또한, VIP에 융합된 단백질 영역이 또 다른 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 또는 기타 화학물질 또는 인자에 대한 친화성을 갖는 경우, 3-성분 복합체가 형성될 수 있다. 이 복합체는 모든 성분의 속성을 가질 것이다. 4성분 이상의 복합체를 생산하기 위하여 유사한 원리를 사용할 수 있다. 이들 복합체는 살충성 독소, 약제, 실험용 시약 및 진단 시약 등으로서 유용하다. 현재 사용되는 이들 복합체의 예로는 잠재적인 암치료용 융합 독소, ELISA 검정법 및 면역블롯 검정법에서의 시약을 들 수 있다.
살충성 또는 보조 단백질을 개조하는 하나의 방법은 단백질의 곤충 세포 결합 영역, 전치 영역 또는 단백질-단백질 상호작용 영역을 파괴하지 않고 15-아미노산 "S-태그"를 단백질에 융합시키는 것이다. S-태그는 이에 결합하여 활성 리보뉴클레아제를 형성하는 리보뉴클레아제 S-단백질에 대하여 높은 친화도(Kd= 10-9M)를 갖는다(에프.엠.리차드 및 에이치.더블류.윅코프(1971), "효소(The Enzymes)", 4권(편집자 피.디.보이어), 647-806 페이지, 아카데미 출판사, 뉴욕 참조). 살충성 또는 보조 단백질의 세포독성 활성이 파괴되거나 또는 제거되도록 융합할 수 있으며, 이로써 VIP의 세포독성 활성이 리보뉴클레아제의 새로운 세포독성 활성으로 바뀔 수 있다. 최종 독소는 S-태그와의 전사 융합체로서 살충성 단백질 또는 보조 단백질을 생성하는 S-단백질, 살충성 단백질 및 보조 단백질로 구성될 수 있다. 유사한 방법은 기타 잠재성 독소를 리보솜 불활성화 단백질, 곤충 호르몬, 호르몬 수용체, 전사 인자, 프로테아제, 포스파타제, 슈도모나스 외독소 A, 또는 세포 내로 운반될 때 치사적인 기타 단백질 또는 화학물질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 살충성 또는 보조 단백질에 융합시키는 것이다. 비슷하게, 치명적이진 않지만, 세포를 생화학적으로 또는 생리적으로 변화시킬 수 있는 단백질을 세포 내로 전달할 수 있다.
상이한 종에 대한 독성 스펙트럼은 독성 영역을 기타 종으로부터 세포 표면 수용체를 인지하는 살충성 또는 보조 단백질과 융합시킴으로써 변화시킬 수 있다. 이런 영역은 항체, 트랜스페린, 호르몬, 또는 친화 선택성 라이브러리를 나타내는 파아지로부터 단리된 펩티드 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 세포 내로 운반된 영양분, 비타민, 호르몬, 또는 기타 화학물질과 결합한 펩티드 서열은 독성 범위를 변화시키는데 사용할 수 있다. 비슷하게, 세포 표면 수용체 또는 세포막에 결합하여 내화될 수 있는 기타 단백질 또는 화학물질은 VIP1 및 VIP2의 활성 범위를 변화시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 살충성 단백질은 특정 살충 특성을 부여하는 단백질이다. 이러한 단백질은 다양한 분자량을 가지며, 분자량이 적어도 30 kDa 이상, 바람직하게는 50 kDa 이상인 폴리펩티드 성분을 갖는다.
본 발명의 보조 단백질은 다양한 분자량을 가지며, 분자량이 적어도 약 15 kDa 이상, 바람직하게는 20 kDa 이상; 더욱 바람직하게는 약 30 kDa 이상이다. 보조 단백질 자체도 폴리펩티드 성분을 가질 수 있다.
살충성 단백질 및 보조 단백질은 중합성, 살충성 단백질 성분을 가질 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드 성분으로서 보조 단백질을 포함하는 살충성 단백질은적어도 50 kDa 내지 적어도 200 kDa, 바람직하게는 약 100 kDa 내지 150 kDa의 다양한 분자량을 가질 수 있다. 보조 단백질은 활성을 증가시키거나 또는 살충성 단백질을 활성화시키기 위하여 본 발명의 살충성 단백질과 조합하여 사용할 수 있다. 보조 단백질이 활성에 영향을 주는지의 여부를 결정하기 위하여, 살충성 단백질을 단독으로 및 보조 단백질과 조합하여 발현시키고 각각의 활성을 살충 활성에 대한 피딩 검정으로 비교할 수 있다.
단독으로 및 보조 단백질과 조합하여 균주 활성을 검사함으로써 잠재적 살충 활성을 갖는 균주를 스크리닝하는 것이 유리하다. 몇몇 예에서 균주의 자체 단백질과 조합하여 사용된 보조 단백질은 보조 단백질이 부재시에는 볼 수 없는 살충 활성을 나타낸다.
보조 단백질은 상술한 바와 같이 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 개질될 수 있다. 그래서, 본 발명의 목적을 위하여, "영양 살충성 단백질(VIP)"이란 용어는 단독으로 또는 조합하여 살충 활성용으로 사용할 수 있는 영양 생장기에 생산된 단백질을 포함한다. 이 용어는 살충성 단백질, 보조 단백질 및 단지 보조 단백질 또는 이들 단백질의 폴리펩티드 성분이 존재할 때 활성을 나타내는 단백질을 포함한다.
본 단백질의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 수득할 수 있는 대안이 있는 것으로 확인되었다. 예를 들면, 살충성 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위하여, 살충성 단백질을 발현하는 코스미드 클론을 게놈 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 큰 활성 코스미드 클론으로부터 작은 서브클론을 만들어 활성을 검사할 수 있다. 이런 방법으로, 이 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 활성 살충성 단백질을 발현하는 클론의 서열을 결정할 수 있다. 그 후, 단백질의 아미노산 서열을 유추할 수 있다. 일반적인 분자 생물학적 방법을 위하여, 예컨대 분자 클로닝(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2판, 1-3권, 샘브룩(Sambrook) 일행(편저), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 뉴욕(1989)) 및 여기에 인용된 참고 문헌 참조.
본 발명은 또한 본 발명의 바실루스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화에 의해 분리 가능한, 바실루스 이외의 개체로부터 얻은 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 이들 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질을 살충 활성 검사할 수 있다. 본 발명은 또한 이 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질이 본 발명의 단백질에 대한 항체와 교차-반응하는, 바실루스 이외의 개체로부터 수득한 단백질에 관한 것이다. 또한 분리한 단백질은 본 발명에서 개시한 또는 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해 살충 활성을 검정할 수 있다.
일단 본 발명의 살충성 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 분리되면, 이들은 미생물 및 식물을 포함하여 기타 개체를 포함하는 다양한 숙주 안에서 단백질을 발현시키도록 조작 및 사용할 수 있다.
본 발명의 살충성 유전자는 식물에서 발현을 향상시키기 위하여 최적화될 수 있다. 예컨대 EP-A-0 618976호; EP-A-0 359472호; EP-A-0 385962호; WO 91/16432호; 퍼랙 일행 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 3324-3328; 및 무레이 일행(1989)Nucleic Acids Research17: 477-498 참조. 이와같이, 이들 유전자는 식물 에 바람직한 코돈을 이용하여 합성될 수 있다. 특정 숙주에 바람직한 코돈은 숙주에서 그 아미노산을 가장 일반적으로 코딩하는 단일 코돈을 의미한다. 특정 아미노산에 대한 옥수수에 바람직한 코돈은 예컨대 옥수수로 부터 공지된 유전자 서열로 부터 유도될 수 있다. 옥수수 식물로 부터 28개 유전자에 대한 옥수수 코돈 사용은 무레이 일행(1989)Nucleic Acids Research17: 477-498에 기재되어 있으며, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되어 있다. 합성 유전자는 특정 아미노산에 대한 특정 숙주가 사용하는 코돈의 분포를 기준으로 하여 제조할 수 있다.
이렇게 하여, 이 뉴클레오타이드 서열은 임의의 식물에서 발현되기에 적합하게될 수 있다. 유전자 서열의 전부 또는 일부는 최적화되거나 또는 합성될 수 있는 것이 알려져있다. 즉, 합성 또는 부분적으로 최적화된 서열이 사용될 수 있다.
마찬가지로, 이 뉴클레오타이드 서열은 임의의 미생물에서도 발현하기 위해 최적화될 수 있다. 바실루스에 바람직한 코돈을 사용하는 경우, 예컨대 미국 특허 5,024, 837호 및 요한슨 일행 (1988)Gene65: 293-304 참조.
식물 발현 카세트의 작성법 뿐만 아니라 외래 DNA를 식물에 도입하는 방법은 이 기술분야에서 공지되어 있다. 이러한 발현 카세트는 프로모터, 터미네이터, 인헨서(enhancer), 리더 서열, 인트론 및 살충성 단백질 코딩 서열에 기능적으로 연결된 기타 조절 서열을 포함할 수 있다. VIP 유전자의 프로모터 또는 터미네이터는 발현 카세트에 사용될 수 있다고 알려져 있다.
일반적으로, 외래 DNA를 식물에 도입하기 위해서는 Ti 플라스미드 벡터가 외래 DNA를 전달하기 위해 이용되었을 뿐만 아니라 직접적인 DNA 흡수, 리포좀, 전기천공법, 미량주입법 및 미량투사체를 이용하는 방법이 이용되었다. 이러한 방법은 이 기술분야에서 공지되어 있다. 예컨대 구에르케 일행 (1987)Plant Science52: 111-116; 노이하우스 일행 (1987)Theor. Appl. Genet. 75: 30-36; 클라인 일행 (1987)Nature327: 70-73; 하웰 일행 (1980)Science208: 1265; 호슈 일행 (1985)Science227: 1229-1231; 드블록 일행 (1989)Plant Physiology91: 694-701;Methods for Plant Molecular Biology(바이스바하 및 바이스바하, 편집) Academic Press, Inc. (1988); 및Methods in Plant Molecular Biology(슐러 및 지엘린스키, 편찬), 아카데미 출판사, (1989) 참조. 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허출원 번호 08/008,374호 참조. 또한 EP-A-0 193 259호 및 EP-A-0 451 878호 참조. 형질전환법은 형질전환될 식물 세포에 따라 다를 것이다.
발현 카세트의 성분은 발현양을 증가시키기 위하여 개질될 수 있음도 알려져 있다. 예컨대 절단된 서열, 뉴클레오타이드 치환 또는 기타 변형이 이용될 수 있다. 예컨대 퍼랙 일행 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 3324-3328; 무레이 일행, (1989)Nucleic Acids Research17: 477-498; 및 WO 91/16432호 참조.
상기 작성물은 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연결된 터미네이터와 같은 기타 필수적인 조절제(구에리네아우 일행 (1991),Mol. Gen. Genet.,226: 141-144; 프라우드푸트, (1991),Cell, 64: 671-674; 샌파콘 일행 (1991),Genes Dev.5: 141-149; 모겐 일행 (1990),Plant Cell, 2: 1261-1272; 문로에 일행 (1990),Gene, 91: 151-158; 발라스 일행 (1989),Nucleic Acids Res.,17: 7891-7903; 죠시 일행 (1987),Nucleic Acid Res.,15: 9627-9639); 식물 번역 콘센서스 서열 (죠시, 씨. 피., (1987),Nucleic Acids Research, 15: 6643-6653), 인트론 (루에르센 및 발보트, (1991),Mol. Gen. Genet.,225: 81-93) 등을 포함할 수 있다. 발현 카세트 작성물에 5' 리더 서열을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 향상시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 이 기술분야에 공지되어 있고 다음을 포함한다:
피코르나바이러스 리더, 예컨대 EMCV 리더 (엔세팔로마이오카디티스 5' 비코딩 영역) (엘로이-슈타인, 오., 푸에르스트, 티.알., 및 모스, B. (1989)PNAS USA86: 6126-6130);
포티바이러스 리더, 예컨대 TEV 리더 (담배 에치 바이러스)(알리슨 일행, (1986); MDMV 리더 (옥수수 난장이 모자이크 바이러스);Virology, 154: 9-20), 및
사람의 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP), (마세잭, 디.지., 및 사르노우, 피., (1991),Nature, 353: 90-94;
담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV), (갈릴리에, 디. 알. 일행 (1989),Molecular Biology of RNA, 237-256페이지; 및
옥수수 백화 반점 바이러스 리더 (MCMV) (롬멜, 에스.에이. 일행 (1991),Virology, 81: 382-385. 델라-시오파 일행 (1987),Plant Physiology,84: 965-968 참조.
식물 터미네이터는 발현 카세트에 이용될 수 있다. 로젠버그 일행 (1987),Gene, 56: 125; 구에리네아우 일행, (1991),Mol. Gen. Genet.,226: 141-144; 프라우드푸트, (1991), Cell, 64: 671-674; 샌파콘 일행 (1991),Genes Dev.,5: 141-149; 모겐 일행 (1990),Plant Cell, 2: 1261-1272; 문로에 일행 (1990),Gene, 91: 151-158; 밸라스 일행, (1989),Nucleic Acids Res.,17: 7891-7903; 죠시 일행 (1987),Nucleic Acid Res.15: 9627-9639 참조.
조직 특이적 발현을 위하여, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 조직 특이적 프로모터에 기능적으로 연결될 수 있다. 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 EP-A-0 618 976호 참조.
본 발명의 범위에는 트랜스제닉 식물, 특히 상술한 방법에 의해 형질전환된 트랜스제닉 식물 및 본 발명에 따른 살충성 단백질을 발현하는 이들의 무성생식적 및/또는 유성생식적 후대를 포함한다. 잡종 식물이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있다. 바람직한 것은 롤륨(Lolium), 제아(Zea), 트리티쿰(Triticum), 트리티칼레(Triticale), 소굼(Sorghum), 사카룸(Sacchrarum), 브로무스(Bromus), 오리자애(Oryzae), 아베나(Avena), 호르데움(Hordeum), 세칼레(Secale) 및 세타리아(Setaria) 식물을 비롯한 그라미나세아애(Graminaceae)과의 단자엽 식물이다.
특히 바람직한 것은 트랜스제닉 옥수수, 밀, 보리, 소굼, 호밀, 귀리, 잔디풀 및 벼이다.
쌍자엽 식물중에서는 콩, 면화, 담배, 사탕무우, 평지유 및 해바라기가 특히 바람직하다.
"후대"라는 표현은 트랜스제닉 식물의 "무성생식적" 및 "유성생식적"으로 생긴 후대를 포괄하여 의미한다. 이 정의는 세포 융합 또는 돌연변이 선택과 같은 공지 방법으로 수득할 수 있고 초기 형질전한된 모식물의 특징적 특성을 그대로 나타내는 모든 돌연변이체 및 변종 뿐만 아니라 형질전환된 식물 물질의 교배 및 융합 산물을 포괄하여 의미한다.
본 발명의 다른 목적은 트랜스제닉 식물의 증식물질에 관한 것이다.
트랜스제닉 식물의 증식물질은 체내 또는 체외에서 유성생식적 또는 무성생식적으로 증식될 수 있는 모든 식물물질로서 정의된다. 본 발명의 범위에서 특히 바람직한 것은 원형질체, 세포, 칼러스, 조직, 기관, 종자, 배, 화분, 난세포, 접합체 뿐만 아니라 트랜스제닉 식물로 부터 수득할 수 있는 다른 증식물질을 들 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 미리 형질전환된 트랜스제닉 식물 또는 이들의 후대에서 기인하는 식물의 일부, 예컨대 꽃, 줄기, 과일, 잎, 뿌리는 트랜스제닉 식물의 일부를 구성하므로 본 발명의 다른 목적이기도 한다.
식물증식물질[과일, 기경, 알곡, 종자], 특히 종자는 시판되기 전에, 통상 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들 제제의 수개와 제제 기술에서 흔히 사용되는 기타 담체, 계면활성제 또는 투여증진 보조제를 포함하는 보호성 피복으로 처리되어 세균, 진균 또는 동물 해충에 의해 유발되는 손상으로 부터 보호된다.
종자를 처리하기 위하여, 보호성 피복은 괴경 또는 알곡을 액체 배합물로 함침시키거나 또는 이들을 습윤 또는 건조 배합물로 피복하는 것에 의해 종자에 도포될 수 있다. 또한 특별한 경우, 싹 또는 과일에 직접 처리하는 것과 같은 다른 방법으로 식물에 도포될 수 있다.
본 발명에 따른 살충성 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA분자를 포함하는 본 발명에 따른 식물 종자는 종자 처리 화합물, 예컨대 캅탄, 카르복신, 티람(TMTD?), 메타락실(Apron?) 및 피리미포스-메틸(Actellic?) 및 종자 처리에 통상적으로 사용되는 기타 물질과 같은 종자 처리 화합물을 포함하는 종자 보호성 피복으로 처리될 수 있다. 본 발명의 범위내에서 바람직한 것은 종자 처리에 통상적으로 사용되는 종자 보호성 피복 단독 또는 조합하여 본 발명에 따른 살곤충성 조성물을 포함하는 종자 보호성 피복이다.
따라서 본 발명의 다른 목적은 경작 식물의 식물 증식 물질, 특히 상기 정의한 바와 같은 종자 보호성 피복으로 처리한 식물 종자를 제공하는 것이다.
살충성 단백질을 코딩하는 유전자는 곤충 병원성 생물을 형질전환하기 위하여 사용될 수 있음이 알려져 있다. 이러한 생물은 배큘로바이러스, 진균, 원생동물, 세균 및 선충을 포함한다.
본 발명의 바실루스 균주는 농작물 및 그 산물을 해충으로 부터 보호하기 위해 사용할 수 있다. 다르게는, 살충제를 코딩하는 유전자는 적합한 벡터를 통하여 미생물 숙주로 도입될 수 있고 상기 숙주는 환경 또는 식물 또는 동물에 도포될 수 있다. 미생물 숙주는 관심을 두고 있는 하나 이상의 작물의 식물권(필로플란, 엽권, 근권 및/또는 뿌리표면)을 점유하는 것으로 알려진 것에서 선택할 수 있다. 이들 미생물은 특정 환경에서 야생형 미생물과 성공적으로 결쟁시킬 수 있도록 선정하지만, 폴리펩티드 살충제를 발현하는 유전자의 안정한 유지와 발현을 제공하며 환경의 분해 및 불활성화로 부터 살충제의 향상된 보호를 제공한다.
이러한 미생물은 세균, 조류 및 진균이다. 특히 중요한 것은 슈도모나스(Pseudomonas), 에리위니아 (Erwinia), 세라티아 (Serratia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 크산토모나스 (Xanthomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 리조븀 (Rhizobium), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 메틸리우스 (Methylius), 아그로박테륨 (Agrobacterium), 아세토박터 (Acetobacter), 락토바실루스 (Lactobacillus), 아르쓰로박터 (Arthrobacter), 아조토박터 (Azotobacter), 로이코노스톡 (Leuconostoc) 및 알칼리게네스 (Alcaligenes)와 같은 세균; 사카로마이세스 (Saccharomyces), 크립토코커스 (Cryptococcus), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyes), 로도토룰라 (Rhodotorula) 및 아우레오바시듐 (Aureobasidium)과 같은 진균, 특히 효모이다. 특히 중요한 것은 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루에센스 (Pseudomonas fluorescens),세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 아세토박터 크실리늄 (Acetobacter xylinum), 아그로박테리아 (Agrobacteria), 로도슈도모나스 스페로이데스 (Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 리조비움 멜리오티 (Rhizobium melioti), 알칼리게네스 엔트로푸스 (Alcaligenes entrophus), 클라비박터 크실리 (Clavibacterxyli) 및 아조박터 빈란디 (Azotobacter vinlandii)와 같은 엽권 세균종; 및 로도토룰라 루브라 (Rhodotorula rubra), 알.글루티니스 (R. glutinis), 알. 마리나 (R. marina), 알. 아우란티아카 (R. aurantiaca), 크립토코커스 알비두스 (Cryptococcus albidus), 씨. 디플루엔스 (C. diffluens), 씨, 라우렌티 (C. laurentii), 사카로마이세스 로세이 (Sacchraomyces rosei), 에스, 프레토리엔시스 (S. pretoriensis), 에스. 세레비시아애 (S. cerevisiae), 스포로볼로마이세스 로수에스 (sporobolomyces rosues), 에스. 오도루스 (S. odorus), 클루이베로마이세스 베로나애 (Kluyveromyces veronae) 및 아우레오바시둠 폴루란스 (Aureobasidium pollulans)와 같은 엽권 효모종이다. 특히 착색된 미생물이 중요하다. 살충성 단백질을 발현하는 유전자를 그 유전자의 안정한 유지와 발현을 가능하게 하는 조건하에서 미생물 숙주로 도입하기 위한 다수의 방법이 있다. 예컨대 DNA 작성물의 발현을 위한 전사 및 번역 조절 시그널과 기능적으로 연결된 DNA 작성물 및 숙주 생물에 있는 서열과 상동성을 가짐으로 인하여 통합이 일어날 수 있는 DNA서열 및/또는 숙주에서 작용할 수 있어 안정한 통합 또는 유지될 수 있는 복제 시스템을 포함하는 발현 카세트를 작성할 수 있다.
전사 및 번역 조절 시그널은 프로모터, 전사 개시 부위, 오퍼레이터, 액티베이터, 향상제, 기타 조절 요소, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 종결 시그널 등을 포함할 수 있고 이들에 한정되지 않는다. 예컨대 미국 특허 5,039,523호; 미국 특허 4,853,331호; EPO 0480762A2; 샘브룩 일행, 상기 동일; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis 일행(편집) 콜드 스프링 하버 라보라토리, 콜드 스프링 하버, 뉴욕 (1982); Advanced Bacterial Genetics, 데이비스 일행(편찬), 콜드 스프링 하버 라보라토리, 콜드 스프링 하버, 뉴욕(1980); 및 여기에 인용된 참고문헌 참조.
살충제 함유 세포가 세포내에서 독소의 활성을 연장시키도록 처리된 다음 처리된 세포가 표적 해충의 환경에 도포되는 적합한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물을 포함할 수 있고 이들 세포는 생물, 특히 포유동물에 독성인 물질을 생산하지 않는한 제한되지 않는다. 그러나 고등 생물에 독성인 물질을 생산하는 생물은 그 독소가 불안정하거나 포유류 숙주에 독성으로 될 가능성을 충분히 낮춘 투여량으로 투여된다면 사용될 수 있다. 숙주로서는 원핵생물 및 낮은 진핵생물, 예컨대 진균일 수 있다. 원핵생물의 예로서는 그람 음성 및 그람 양성 생물을 들 수 있고, 에세리키아 (Escherichia), 에르위니아 (Erwinia), 시겔라 (Shigella), 살모넬라 (Salmonella) 및 프로테우스 (Proteus)와 같은 엔테로박테리아세아애 (Enterobacteriaceae); 바실라세아애 (Bacillaceae); 리조븀 (Rhizobium)과 같은 리조비세아애 (Rhizobiceae); 포토박테륨 (photobacteium), 지모모나스 (Zymomonas), 세라티아 (Serratia), 아에로모나스 (Aeromonas), 비브리오 (Vibrio), 데술포비브리오 (Desulovibrio), 스피릴륨 (Spirillum)과 같은 리조비세아애 (Rhizobiceae); 락토바실라세아애 (Lactobacillaceae); 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 아세토박터 (Acetobacter)와 같은 슈도모나다세아애 (Pseudomonadaceae); 아조토박터라세아애 (Azotobacteraceae) 및 니트로박터라세아애 (Nitrobacteraceae)를 포함한다. 진핵생물로서 피코마이세테스(Phycomycetes)및 자낭균류(Ascomycetes)와 같은 진균, 사카로마이세스(Saccharomyces) 및 시조사카로마이세스 (Schizosaccharromyces)와 같은 효모; 및 로도토룰라 (Rhodotorula), 아우레오바시듐 (Aureobasidium), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces) 등과 같은 담자 균류 효모를 들 수 있다.
상기 생산 목적에 적합한 숙주 세포를 선택하는데 있어서 특히 중요한 특징은 단백질 유전자가 숙주로 도입하기 위한 용이성, 발현계의 유용성, 발현 효율, 숙주에서 단백질의 안정성 및 보조 유전자 능력의 존재 여부등이다. 살충제 마이크로캡슐로서 사용하기 위한 특히 중요한 특징은 살충제로서 보호 특성, 두꺼운 세포벽, 착색 및 세포내 팩케이징 또는 봉합체의 형성; 잎 친화성, 포유류 독성의 결여; 해충이 섭취하도록 유인하는 능력; 치사용이성 및 독소에 손상없이 고정하는 능력 등이다. 또한 배합 및 취급의 용이성, 경제성, 저장 안정성 등도 고려해야한다. 특히 중요한 숙주 생물은 로도토룰라(Rhodotorula)종, 아우레오바시듐(Aureobasidium)종, 사카로마이세스(Saccharomyces)종 및 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)종과 같은 효모; 슈도모나스 (Pseudomonas)종, 에르위니아(Erwinia)종 및 플라보박테륨 (Flavobacterium)종과 같은 필로플란 생물; 또는 에세리키아 (Escherichia), 락토바실루스 (LactoBacillus)종, 바실루스 (Bacillus)종과 같은 기타 생물을 포함한다. 특정 생물은 슈도모나스 아에우르기노사(Pseudomonas aeurginosa), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 사카로마이세스 세레비시아애 (Sacchraomyces cerevisiae), 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 대장균, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 포함한다.
VIP 유전자는 식물(착생식물)상에서 증식하는 미생물로 도입되어 VIP 단백질을 잠재적 표적 해충으로 전달한다. 착생식물은 예컨대 그람 양성이거나 그람 음성 세균일 수 있다.
뿌리 착생 세균은 이 기술분야에 공지된 방법에 의해 관련 식물로 부터 단리될 수 있다. 특히, 뿌리 착생 바실루스 세레우스 균주는 식물의 뿌리로 부터 단리될 수 있다(예컨대 제이. 한델스만, 에스. 라펠, 이. 메스터, 엘, 운더리히 및 씨. 그라우에 의한Appl. Environ. Microbiol. 56: 713-718, (1990) 참조). VIP1 및/또는 VIP2 및/또는 VIP3은 이 기술분야의 표준 방법에 의해 뿌리 착생 바실루스 세레우스에 도입될 수 있다.
특히,바실루스 세레우스 균주 AB78로 부터 유도된 VIP1 및/또는 VIP2는 표준 방법을 이용하여 콘쥬게이션법에 의해 뿌리 착생 바실루스 세레우스로 도입될 수 있다(제이. 곤잘레스, 비.브라운 및 비. 칼톤에 의한Proc. Natl. Acad. Sci.79: 6951-6955, (1982) 참조).
또한 본 발명의 VIP1 및/또는 VIP2 및/또는 VIP3 또는 기타 VIP는 전기-형질전환법에 의해 뿌리 착생 바실루스에 도입될 수 있다. 특히, VIP는 실시예 10에 기재된 바와 같이 pHT3101 (디. 레레클루스 일행,FEMS Microbiol. Letts., 60: 211-218 (1989))과 같은 셔틀 벡터로 클로닝될 수 있다. 특정 VIP의 코딩 서열을 함유하는 셔틀 벡터 pHT3101은 전기천공법(electroporation)에 의해 뿌리 착생 바실루스로 형질전환될 수 있다(디. 레레클루스 일행, 1989,FEMS Microbiol. Letts.60: 211-218).
발현계는, VIP 단백질이 그람 음성 세균, 예컨대 대장균의 세포질 밖으로 분비되도록 고안될 수 있다. 분비된 VIP 단백질을 갖는 이점은 (1) 세포질내에서 발현된 VIP 단백질의 잠재적 독성 효과를 피할 수 있고 또 (2) 발현된 VIP 단백질의 양을 증가시킬 수 있으며 또 (3) VIP 단백질의 정제를 효과적으로 실시할 수 있는 점이다.
VIP 단백질은 적합한 대장균 시그널 펩티드를 VIP 시그널 펩티드의 아미노 말단에 융합시키거나 또는 VIP 시그널 펩티드를 대장균 시그널 펩티드로 교체함으로써 대장균에서 분비되도록 제조될 수 있다. 대장균이 인식하는 시그널 펩티드는 대장균에서 분비되는 것으로 이미 공지된 단백질, 예컨대 OmpA 단백질에서 찾아 볼 수 있다(제이. 그라이예브, 에이취. 키무라, 엠. 타카하라, 와이. 마스이 및 엠. 이노우에,EMBO J., 3: 2437-2442 (1984) 참조). OmpA는 대장균 외막의 주요 단백질로서 그의 시그널 펩티드는 가공되기 전에 변형될 필요가 없으므로 시그널 펩티드, 예컨대 지방단백질 시그널 펩티드일 수 있다(지. 두파우드, 피. 마치 및 엠. 이노우에,Methods in Enzymology, 153: 492 (1987) 참조).
특히, 이 기술분야의 표준 수법을 이용하여 VIP 코딩 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단에 독특한 BamHI 제한 부위를 도입할 수 있다. 이들 BamHI 단편은 구조대로 벡터 pIN-III-ompA1, A2 또는 A3(제이. 그라이예브, 에이취. 키무라, 엠. 타카하라, 에이취. 시웅, 와이. 마스이 및 엠. 이노우에,EMBO J., 3: 2437-2442 (1984) 참조)에 클로닝되어 ompA:VIP 융합 유전자를 생성하며 이것은 주변세포질공간으로 분비된다. pIN-III-ompA의 폴리링커중의 기타 제한 부위는 VIP 아미노 말단 아미노산 코딩 서열이 ompA 시그널 펩티드 절단 부위 바로 뒤에 존재하도록 이 기술분야에서 공지된 표준 방법에 의해 제거될 수 있다. 따라서 대장균에서 분비된 VIP 서열은 천연 VIP 서열과 동일할 것이다.
VIP 천연 시그널 펩티드가 성숙 단백질의 적당한 중첩에 필요치 않은 경우, 이러한 시그널 서열은 제거되고 ompA 시그널 서열로 교체될 수 있다. 독특한 BamHI 제한 부위는 VIP의 시그널 펩티드 코딩 서열 바로 뒤의 프로단백질 코딩 서열의 아미노 말단 및 VIP 코딩 서열의 카르복시 말단에 도입될 수 있다. 이들 BamHI 단편은 상술한 바와 같이 pIN-III-ompA 벡터로 클로닝될 수 있다.
본 발명의 균주를 살충제 방제 분야에 적용하는 방법 또는 기타 생물을 샬충제로서 공학처리하는 일반적 방법은 이 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대 미국 특허 5,039,523호 및 EP 0480762A2 참조.
VIP는 세균 숙주에서 발효될 수 있고 또 생성한 세균은 바실루스 투린지엔시스 균주가 살충제 분무제로서 사용되는 방법과 동일 방식으로 가공되고 미생물 분무제로 이용될 수 있다. 바실루스로 부터 분비된 VIP의 경우, 분비 시그널은 이 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 제거되거나 돌연변이 처리될 수 있다. 이러한 돌연변이 및/또는 제거는 발효공정 동안 VIP 단백질이 생장 배지로 분비되는 것을 방지한다. VIP는 세포내에 잔존하므로 세포는 가공되어 캡슐화된 VIP를 생성한다. 적합한 미생물이 상기 목적에 사용될 수 있다. 슈도모나스는 바실루스 투린지엔시스 내독소를 캡슐화된 단백질로서 발현하기 위하여 사용되며 생성한 세포는살충제로서 가공되고 분무된다 (에이취. 가에르트너 일행, 1993, In Advanced Engineered Pesticides, L. Kim 편찬 참조).
바실루스 투린지엔시스의 다양한 균주가 상기와 같이 사용된다. 이러한 Bt 균주는 내독소 단백질 뿐만 아니라 VIP를 생산한다. 다르게는, 이러한 균주는 VIP만 생산할 수도 있다. 포자를 형성하지 않는 바실루스 서브틸리스 균주는 바실루스 투린지엔시스로 부터 CryIIIA 내독소를 다량 생산하는 것으로 밝혀져있다(아가이세, 에이취. 및 레레클루스, 디., "바실루스 투린지엔시스 CryIIIA 독소 유전자의 바실루스 서브틸리스에서의 발현은 포자형성 특이적 시그마 인자에 상관없고 spoOA 돌연변이에서 증가되었다",J. Bacteriol, 176: 4734-4741 (1994) 참조). 유사한 spoOA 돌연변이체가 바실루스 투린지엔시스에서 제조될 수 있고 배지로 분비되지 않고 세포내에 존재하는 캡슐화된 VIP를 생산하기 위해 사용되었다.
바실루스 세포내에 유지되는 VIP를 갖기 위하여, 시그널 펩티드는 분비 시그널로서 더 이상 작용하지 않도록 처리될 수 있다. 특히 VIP1의 가상 시그널 펩티드는 상기 서열(지. 폰 헤이진,J. Mol. Biol.184: 99-105 (1989) 참조)의 C-말단부에 가상의 콘센서스 절단 부위, Ala-X-Ala를 갖는 단백질의 첫 31개 아미노산을 포함하고 또 VIP2의 가상 시그널 펩티드는 Ala40 뒤에 가상의 절단 부위를 갖는 단백질의 첫 40개 아미노산을 포함한다. VIP1 또는 VIP2중의 절단 부위는 이 기술분야의 공지 방법에 따라 돌연변이되어 절단부위 콘센서스 서열이 시그널 펩티다제에 의해 인식되지 않는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
이와다르게는, 본 발명의 VIP1, VIP2 및/또는 기타 VIP는 서열로 부터 제거되어 바실루스에서 분비 단백질로서 인식되지 않을 수 있다. 특히, 메티오닌 개시 부위는 VIP1중의 Asp32로 시작되는 프로단백질 서열의 전면에서 처리될 수 있거나, 또는 VIP중의 Glu41로 시작되는 프로단백질 서열에서 이 기술분야의 공지 방법에 의해 처리될 수 있다.
VIP유전자는 식물상에서 증폭되는 미생물(착생식물)로 도입되어 VIP단백질을 임의의 표적 해충으로 전달한다. 착생식물은 예컨대 그람 양성 또는 그람 음성의 세균일 수 있다.
살충제 유전자 및 단백질을 함유하도록 유전학적으로 변형된 미생물 또는 본 발명의 바실루스 균주는 농작물 및 산물을 해충으로 부터 보호하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 특징으로, 독소(살충제) 생산 생물의 전체(즉, 용균되지 않은) 세포는 세포가 표적 해충의 환경에 적용되었을 때 세포에서 생산되는 독소의 활성을 연장시키는 물질과 처리된다.
다르게는, 살충제는 이종 유전자를 세포성 숙주로 도입함으로써 생산할 수 있다. 이종 유전자의 발현은 직접 또는 간접적으로 세포내 생산을 유발하며 살충제를 유지시킨다. 이들 세포는 세포가 표적 해충의 환경에 적용될 때 세포에서 생산되는 독소의 활성을 연장시키는 조건하에서 처리한다. 생성한 생산물은 독소의 독성을 갖고 있다. 이들 천연적으로 캡슐화된 살충제는 표적 해충이 존재하는 환경, 예컨대 토양, 물 및 식물의 잎에 적용하기 위해 통상의 수법으로 제제화될 수 있다. 예컨대 EPA 0 192319호 및 그에 포함된 참고문헌 참조.
본 발명의 활성성분은 통상 조성물 형태로 도포되고 처리될 식물의 생장지역또는 식물에 다른 화합물과 동시에 또는 연속적으로 처리할 수 있다. 이들 화합물은 식물 생장에 영향을 주는 비료 또는 미량영양소 공여체 또는 기타 제제일 수 있다. 이들은 선택적 제초제, 살충제, 살진균제, 세균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들 제제 몇개와 필요한 경우 기타 농업적으로 허용되는 담체, 계면활성제 또는 제형기술분야에서 통상적으로 사용되는 투여증진 보조제의 혼합물일 수 있다. 적합한 담체 및 보조제는 고체 또는 액체일 수 있고 또 제형기술분야에서 통상적으로 이용되는 천연 또는 재생 무기 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 결합제 또는 비료이다.
본 발명의 세균 균주에 의해 생산된 하나 이상의 곤충 특이적 단백질을 함유하는 본 발명의 활성성분 또는 본 발명의 농화학 조성물을 투여하기 위한 바람직한 방법은 엽면투여, 종자피복법 및 토양도포법이다. 투여횟수 및 투여비율은 상응하는 해충의 감염정도에 따라서 상이하다.
따라서 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 신규 곤충 특이적 단백질 하나 이상 및/또는 신규한 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 재조합 미생물, 특히 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 바실루스 세레우스 또는 바실루스 투린지엔시스와 같은 재조합 바실루스 종 균주 또는 이들의 유도체 또는 돌연변이체와 함께 담체, 희석제, 계면활성제 또는 투여증진 보조제와 같은 농업 보조제를 포함하는 살곤충성 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 또한 추가의 생물학적 활성 화합물을 함유할 수있다. 상기 화합물은 비료 또는 미량영양 공여체 또는 식물 생장에 영향을 줄 수 있는 기타 제제일 수 있다. 이들은 제초제, 살충제, 살진균제, 살세균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들 몇개 제제와 필요에 따라 농업적으로 허용되는 담체, 계면활성제 또는 제형분야에서 흔히 사용되는 투여증진 보조제와의 혼합물일 수 있다. 적합한 담체 및 보조제는 고체 또는 액체일 수 있고 또 제형기술분에서 흔히 사용되는 물질, 예컨대 무기 또는 재생 무기 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 결합제 또는 비료일 수 있다.
상기 조성물은 0.1 내지 99 중량%의 활성성분, 1 내지 99.9 중량%의 고체 또는 액체 보조제 및 0 내지 25 중량%의 계면활성제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 하나 이상의 신규 곤충 특이적 단백질 또는 신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 재조합 미생물, 특히 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 바실루스 세레우스 또는 바실루스 투린지엔시스와 같은 재조합 바실루스 종 균주 또는 이들의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 활성성분, 또는 상기 활성성분을 함유하는 조성물은 특성 손실없이 특정 기타 살충제 또는 화학물질과 함께 보호될 식물 또는 작물에 투여될 수 있다(1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canada). 통상적으로 사용되는 농약 분무 물질과는 상용성이지만 강알칼리성 분무 용액으로 사용되어서는 안된다. 살포제, 현탁액, 수화제 또는 기타 농업용으로 적합한 형태로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 신규 곤충 특이적 단백질 또는 상기 신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 재조합 미생물을 포함하는 활성성분 또는 상기 활성성분을 포함하는 조성물을 (a) 곤충 해충이 생길 수 있는 환경, (b) 곤충 해충에 의해 유발된 손상으로 부터 식물 또는 식물 부위를 보호하기 위해 식물 또는 식물 부위, 또는 (c) 곤충 해충에 의해 유발된 손상으로 부터 종자를 보호하기 위해 종자에 도포함으로써 곤충 해충을 방제 또는 억제하는 방법을 제공한다.
식물 보호를 위해 바람직한 투여방법은 식물의 잎에 투여(엽면투여)하는 것이고, 투여빈도 및 투여비율은 방제하고자하는 해충의 감염정도에 따라 조정할 수 있다. 그러나, 활성성분은 식물 재배지가 액체 조성물을 흡수하도록하여 뿌리계를 통하여 식물에 도달되거나(전신작용) 또는 고체 형태의 활성성분을 식물 재배지 예컨대 토양에 과립제 형태로 혼입하는 것에 의해 식물에 도달될 수 있다(토양 투여). 논의 경우에서, 과립제는 물이 충분한 논에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 식물 증식물질 예컨대 과일, 괴경 또는 알곡과 같은 종자, 또는 식물 삽목을 진균 감염 및 동물 해충으로 부터 보호하는데 적합하다. 증식물질은 사용하기 전에 조성물로 처리될 수 있으며, 예컨대 종자는 파종하기 전에 드레싱될 수 있다. 본 발명에 따른 활성성분은 종자 낟알을 액체 조성물에 함침시키거나 또는 종자 낟알을 고체 조성물로 피복하는 것에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 예컨대 종자 이랑에 파종하는 동안에 증식물질이 사용된 부위에 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 식물 증식물질을 처리하는 방법 및 이렇게 처리된식물증식 물질에 관한 것이다.
활성성분으로서 재조합 형태의 신규 독소 유전자 하나 이상을 함유하는 재조합 미생물, 특히 신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 재조합 형태로 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 함유하는 바실루스 세레우스 또는 바실루스 투린지엔시스 균주와 같은 재조합 바실루스 종 균주, 또는 이들의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 세균 균주를 사용하여 종자 또는 토양을 처리하는 공지된 방법으로 적용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 4,863,866호 참조. 이 균주는 미생물이 살고 있지 않을 때에도 생물방제에 효과적이다. 그러나 생존 미생물에 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 범위내에서 보호될 표적 작물의 예는 다음과 같다:
곡류(소맥, 보리, 호밀, 귀리, 벼, 소굼 및 관련작물); 사탕무우(설탕제조용 또는 사료용 사탕무우); 이과, 핵과 및 연과와 같은 과일, 예컨대 사과, 배, 플럼, 복숭아, 아몬드, 체리, 스트로베리, 라즈베리 및 블랙 베리; 콩과식물 예컨대 강남콩, 편두, 완두콩 또는 콩; 오일식물 예컨대 유채, 겨자, 양귀비, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자유 식물, 코코아 콩, 땅콩; 오이식물 예컨대 오이, 서양호박 또는 멜론; 섬유 식물 예컨대 목화, 아마, 삼, 황마; 감귤류 예컨대 오렌지, 레몬, 그레이프프루트 또는 밀감; 채소류, 예컨대 시금치, 상치, 아스파라가스, 양배추 및 브라시카애, 양파, 토마토, 감자, 또는 벨 후추; 라우세아애 예컨대 아보카도, 당근, 계피 또는 캄퍼; 활엽수 및 침엽수, 예컨대 린덴 나무, 주목, 참나무, 오리나무, 포플라, 벚꽃나무, 전나무, 낙엽송, 소나무; 또는 옥수수, 담배, 너트, 커피, 사탕수수, 차, 덩쿨나무, 바나나 및 천연 고무 식물 뿐만 아니라 관상용 식물(국화과 포함).
신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 바실루스 세레우스 또는 바실루스 투린지엔시스 균주와 같은 재조합 바실루스 종 균주는 살곤충성 조성물 형태로 보통 투여되고 기타의 생물학적 활성 화합물과 동시에 또는 연속해서 처리할 작물 재배지역 또는 식물에 투여될 수 있다. 이들 화합물은 비료 또는 미량영양 공여제 또는 식물 생장에 영향을 주는 기타 제제일 수 있다. 이들은 선택적 제초제, 살충제, 살진균제, 살세균제, 살선충제, 살연체동물제 또는 이들 몇개 제제와 추가의 담체, 계면활성제 또는 제형분야에서 흔히 사용되는 투여증진 보조제의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따른 활성성분은 비변형 형태 또는 적합한 농업적으로 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다. 이러한 담체는 농업분야에서 흔히 사용되는 보조제이므로 공지 방법으로 유화 농축액, 피복 페이스트, 직접 분무가능하거나 희석가능한 용액, 희석 유제, 수화제, 가용성 분말, 살포제, 과립 및 중합체 물질중의 캡슐화제로 제제화될 수 있다. 유리한 투여율은 헥타아르("ha"는 약 2.471 에이크에 상당한다)당 약 50g 내지 약 5kg의 활성성분(a.i.), 바람직하게는 약 100 g 내지 약 2 kg a.i./ha이다. 중요한 투여율은 약 200 g 내지 약 1 kg a.i./ha, 200 g 내지 500 g a.i./ha 이다. 종자 드레싱하기 위해서는 0.5 g 내지 1000 g a.i./100 kg 종자, 바람직하게는 3 g 내지 100 g a.i./100 kg 종자 또는 10 g 내지 50 ga.i./100 kg 종자이다.
적합한 담체 및 보조제는 고체 또는 액체일 수 있고 또 제형 기술에서 통상 사용되는 물질, 예컨대 천연 또는 재생 무기 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 결합제 또는 비료에 상당한다. 신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 바실루스 세레우스 또는 바실루스 투린지엔시스 균주와 같은 재조합 바실루스 종 균주를 활성성분으로 함유하는 배합물, 즉 살곤충성 조성물, 제제 또는 혼합물 또는 이들과 기타 활성성분 및 경우에 따라 고체 또는 액체 보조제와의 조합물은 공지 방식으로, 예컨대 활성성분을 증량제, 예컨대 용매, 고체 담체 및 일부 경우 표면활성 화합물(계면활성제)와 균일하게 혼합 및/또는 분쇄하는 것에 의해 제조한다.
적합한 용매로는, 부분적으로 할로겐화될 수 있는 방향족 탄화수소, 바람직하게는 알킬벤젠의 C8-C12분류물, 예컨대 크실렌 혼합물 또는 치환된 나프탈렌; 디부틸 프탈레이트 또는 디옥틸 프탈레이트와 같은 프탈레이트; 시클로헥산 또는 파라핀과 같은 지방족 탄화수소; 에탄올, 에틸렌 글리콜 모노메틸 또는 모노에틸과 같은 알코올 및 글리콜 및 이들의 에테르; 시클로헥산온과 같은 케톤; N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸술폭시드 또는 디메틸포름아미드와 같은 강한 극성 용매 뿐만 아니라 에폭시화된 코코넛 오일 또는 간장콩 오일과 같은 식물오일 또는 에폭시화된 식물 오일; 또는 물을 들 수 있다.
예컨대 살포제 및 분산성 분말제용으로 사용되는 고체 담체는 대개 칼사이트,탈크, 카올린, 몬모릴로나이트 또는 애터펄자이트와 같은 천연 광물성 충전제이다. 또한 물리적 성질을 개선시키기 위하여 고분산 실리카 또는 고분산 흡수성 중합체를 첨가할 수도 있다. 적합한 흡수성 과립 담체는 다공성 타입, 예컨대 경석, 파쇄 벽돌, 세피올라이트 또는 벤토나이트이며, 적합한 비흡수성 담체 재료는 칼사이트 또는 모래이다. 더나아가, 특히 돌로마이트나 분쇄된 식물 잔사와 같은 무기 또는 유기성의 많은 과립화 재료를 사용할 수 있다.
적합한 계면활성 화합물은, 배합시킬 활성성분의 성질에 따라, 우수한 유화성, 분산성 및 습윤성을 갖는 비이온, 양이온 및/또는 음이온 계면활성제이다. 용어 "계면활성제"는 계면활성제의 혼합물을 포괄하여 의미한다. 적합한 음이온성 게면활성제는 수용성 비누 및 수용성 합성 계면활성 화합물일 수 있다. 적합한 비누는 고급 지방산(C10-C22)의 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 또는 비치환 또는 치환된 암모늄염, 예컨대 올레산 또는 스테아르산 또는 코코넛 오일 또는 탤로우 오일로 부터 수득할 수 있는 천연 지방산 혼합물의 나트륨 또는 칼륨염이다. 적합한 계면활성제는 지방산 메틸타우린 염 뿐만 아니라 변형되거나 변형되지 않은 인지질이다.
보다 빈번하게는 소위 합성 계면활성제, 특히 지방 술포네이트, 지방 술페이트, 술폰화 벤즈이미다졸 유도체 또는 알킬아릴술포네이트가 사용된다. 지방 술포네이트 또는 술페이트는 대개 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 또는 치환 혹은 비치환 암모늄염의 형태이고, 대개 아실 라디칼의 알킬 부분도 포함하는 탄소수 8 내지 22의 알킬 라디칼을 함유하며, 그 예로는 리그노술폰산, 도데실술페이트 또는 천연 지방산으로부터 제조된 지방 알코올 술페이트 혼합물의 나트륨 또는 칼슘염이다. 이들 화합물은 또한 술페이트화 및 술폰화 지방 알코올/에틸렌옥사이드 부가물의 염도 포함한다. 술폰화 벤즈이미다졸 유도체는, 바람직하게는 2개의 술포닐기와 탄소수 약 8 내지 22의 지방산 라디칼 한개를 함유한다. 알킬아릴술포네이트는 예컨대 도데실벤젠술폰산, 디부틸나프탈렌술폰산 또는 나프탈렌술폰산과 포름알데히드 축합 생성물의 Na, Ca 또는 트리에탄올아민 염이다. 또한 상응하는 포스페이트, 예컨대 p-노닐페놀과 에틸렌옥사이드 4 내지 14몰과의 부가물의 인산 에스테르의 염도 적합하다.
비이온 계면활성제는 바람직하게는 3 내지 30개의 글리콜에테르기를 함유하며 (지방족)탄화수소 라디칼내의 탄소수가 8 내지 20이고 알킬페놀의 알킬 라디칼내 탄소수가 6 내지 18인 지방족 또는 지환족 알코올, 혹은 포화 또는 불포화 지방산 및 알킬페놀의 폴리글리콜에테르 유도체이다.
그외의 적합한 비이온 계면활성제는 폴리에틸렌옥사이드와 프로필렌글리콜, 에틸렌디아미노폴리프로필렌글리콜 및 알킬사슬내 탄소수가 1 내지 10인 알킬폴리프로필렌글리콜과의 수용성 부가물이며, 이 부가물은 20 내지 250개의 에틸렌글리콜에테르기와 10 내지 100개의 프로필렌글리콜에테르기를 함유한다. 이들 화합물은 보통 프로필렌글리콜 단위 하나당 1 내지 5단위의 에틸렌글리콜을 함유한다. 그 예로는 노닐페놀 폴리에톡시에탄올, 피마자유 폴리글리콜 에테르, 폴리프로필렌/폴리에틸렌 옥사이드 부가물, 트리부틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜및 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 들 수 있다. 다른 적합한 물질은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르이다.
양이온 계면활성제는 바람직하게는 탄소수 8 내지 22인 하나이상의 알킬 라디칼을 N-치환기로서 함유하고 저급 할로겐화 혹은 비치환 알킬, 벤질 또는 저급 히드록시알킬 라디칼을 기타 치환기로서 함유하는 4차 암모늄염이다. 이러한 염은 할라이드, 메틸술페이트 또는 에틸술페이트의 형태인 것이 바람직하다. 그예로서는 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드 또는 벤질디(2-클로로에틸)에틸암모늄 브로마이드를 들 수 있다.
배합기술에서 통상적으로 사용되는 계면활성제는 예컨대 "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual", MC Publishing Corp. Redgewood, N.J., 1979; Dr. Helmut Stache, "Tensid Taschenbuch" (Handbook of Surfactants), Carl Hanser Verlag, Munich/Vienna에 기재되어 있다.
본 발명의 살곤충성 조성물의 다른 특히 바람직한 특성은 식물 및 토양에 투여될 때 활성성분이 지속되는 점에 있다. 활성손실의 가능한 원인은 자외선, 열, 잎 삼출 및 pH에 의한 불활성화이다. 예컨대 높은 pH, 특히 환원제 존재하에서, δ-내독소 결정은 용해되므로 단백질 분해에 의한 불활성화가 보다 용이하게된다. 높은 잎 pH도 또한 잎 표면이 pH 8 내지 10 범위일 수 있을 때 중요하다. 본 발명의 살곤충성 조성물의 배합물은 활성성분의 손실을 방지하고 물질을 활성성분이 불활성화로 부터 보호되도록 캡슐화하는 보조제를 혼입시키는 것에 의해 상기 문제를 해결할 수 있다. 캡슐화는 화학적으로(맥과이어 및 샤샤, J Econ Entomol 85:1425-1433, 1992) 또는 생물학적으로(반스 및 쿠밍스, 1986; EP-A-0 192 319호) 실시할 수 있다. 화학적 캡슐화는 활성성분을 중합체로 피복하는 공정을 포함하는 반면에 생물학적 캡슐화는 δ-내독소 유전자를 미생물에서 발현시키는 것을 포함한다. 생물학적 캡슐화의 경우, 신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 포함하는 미생물을 배합물에서 활성성분으로 사용한다. 자외선 보호제의 부가는 조사 손상을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 열에 의한 불활성화는 적합한 첨가제를 포함하는 것에 의해 제어될 수 있다.
본 발명의 범위내에서 바람직한 것은 식물 세포 형태 또는 바람직하게는 포자 형태의 생존 미생물을 활성성분으로 포함하는 배합물이다. 적합한 배합물은 다가 양이온과 교차결합될 수 있는 중합체 겔로서 이들 미생물을 포함한다. 이것은 중합체 물질로서 알긴산염이 기재된 디.알. 프라벨 일행, Phytopathology, Vol. 75, No. 7, 774-777, 1985에 기재되어 있다. 상기 문헌으로 부터 담체 물질도 또한 사용될 수 있다고 공지되어 있다. 이들 배합물은 천연 또는 합성 겔 형성성 중합체, 예컨대 알긴산염의 용액과 개별 방울 형태의 다가 금속 이온의 염 수용액을 혼합함으로써 대체로 제조되며, 미생물은 2개 이상의 반응 용액중의 하나에 용해된다. 겔 형성은 방울 형태로 혼합함과 동시에 개시된다. 이어 이들 겔 입자를 건조시킨다. 상기 공정을 이오노트로픽 겔화라 칭한다. 건조 정도에 따라서, 다가 양이온을 통하여 구조적으로 가교되고 미생물을 포함하며 균일하게 분포되어 존재하는 담체로 구성된 압축 및 경질 입자가 형성된다. 이 입자의 크기는 5 mm 이하일 수 있다.
미생물 이외에 미세하게 분쇄된 규산을 Ca++이온을 통하여 가교가 일어나는 담체 물질로서 포함하는 부분적으로 가교된 다당류를 기본한 조성물은 EP-A1-0 097 571호에 기재되어 있다. 이 조성물은 물에서 0.3 이하의 활성을 갖는다. 더블유.제잉. 코니크 일행이 논문[New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, 345 내지 372 페이지, 알란 알. 리스, 인코포레이티드 (1990)]에 기재한 바와 같이 다양한 배합계, 질석을 담체로 갖는 과립 및 이오노트로픽 겔화공정에 의해 제조된 압축 알긴삼연 비이드가 언급될 수 있다. 이러한 조성물은 디. 알. 프라벨에 의해 Pesticide Formulations and Application Systems: 11th Volume, ASTM STP 1112 어메리칸 소사이어티 포 테스팅 앤드 머티리얼스, 필라델피아, 1992, 173 내지 179 페이지에 기재되어 있고 또 본 발명에 따른 재조합 미생물을 배합하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 살곤충성 조성물은 약 0.1 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 95%, 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 90%의 활성성분, 약 1 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1 내지 약 99%, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 95%의 고체 또는 액체 보조제, 및 약 0 내지 약 25%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 25%, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 중량%의 계면활성제를 함유한다.
본 발명의 살곤충성 조성물의 바람직한 구체예는 약 0.1 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 95%의 신규 곤충 특이적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 재조합 형태로 함유하는 바실루스 세레우스 또는 바실루스 투린지엔시스 균주와 같은 재조합 바실루스 종 균주 또는 이들과 기타 활성성분의 조합물, 약 1 내지 약 99.9%의 고체 액체 보조제 및 0 내지 25%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20%의 계면활성제를 함유한다.
시판 제품은 농축물로 제형화되는 것이 바람직하지만, 최종 사용자는 실질적으로 저농도의 희석 제제를 사용할 것이다. 살곤충성 조성물은 추가의 성분, 예컨대 안정화제, 소포제, 점도 조절제, 결합제, 점착제 뿐만 아니라 비료 또는 특수한 효과를 얻기 위한 기타 활성 성분을 함유할 것이다.
본 발명의 일개 구체예로서 바실루스 세레우스 미생물은 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 및 디아브로티카 롱기코르니스 바르베리를 치사시킬 수 있도록 단리하였다. 신규 바실루스 세레우스 균주 AB78은 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21058로 기탁되어 있다.
분획 단백질은 바실루스 세레우스 균주로 부터 실질적으로 정제되었다. 이 단백질의 정제는 SDS-PAGE 및 생물학적 활성에 의해 검증되었다. 이 단백질은 약 60 내지 약 1000 kDa, 특히 약 70 내지 약 90 kDa, 보다 특히 약 80 kDa의 분자량을 가지며, 이후 VIP로 칭한다.
아미노 말단 서열분석에 의해 N-말단 아미노산 서열이 다음과 같음을 알았다:
NH2-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro- (SEQ ID NO: 8) 식중에서, Asx는 Asp 또는 Asn이다. 전체 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 7에 나타낸다. SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID NO: 6에 기재되어 있다.
NH2-말단의 아미노산 3-9를 코딩하는 유전자 영역에 대한 올리고뉴클레오타이드 탐침을 생성하였다. 이 탐침은 바실루스 투린지엔시스(Bt) δ-내독소 유전자의 코돈 사용을 기초로 하여 합성하였다. 서던 혼성화에 사용된 올리고뉴클레오타이드 탐침의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같았다:
5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID NO: 9)
식중, N은 임의의 염기이다.
또한 여기에 기재된 Bc AB78 VIP에 대한 DNA 탐침은 VIP-1 유전자(또는 관련 유전자)가 천연적으로 존재하는지 또는 특정 형질전환된 생물이 VIP1 유전자를 포함하는지에 대해 결정하기 위해 다른 바실루스 균주 또는 다른 생물을 스크리닝하는 것을 가능하게한다.
본 발명을 보다 더 자세하게 설명하기 위하여 이하의 실시예를 들어 설명하며 특별히 지시하지 않는한 이들 실시예는 제한을 의미하지 않는다.
본 발명에 의한 단백질의 서열 확인을 기준으로 하여 표준 명명법을 이용하였다. 모출원[미국 특허 출원번호 314594/08호]에서 사용된 이름과 관련한 유전자및 단백질 이름은 다음과 같다:
Figure pct00001
실험
배합 실시예
배합실시예에 사용된 활성성분은 수탁번호 NRRL B-21058을 갖는 바실루스 세레우스 균주 AB78; 수탁번호 NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 및 NRRL B-21439을 갖는 바실루스 투린지엔시스 균주; 및 수탁번호 NRRL B-21228, NRRL B-21229 및 NRRL B-21230을 갖는 바실루스 종 균주이다. 상술한 균주는 본 발명에 따른 곤충 특이적 단백질을 포함하는 천연 단리물이다. 다르게는 상기 단리된 곤충 특이적 단백질은 활성성분 단독으로 또는 상술한 바실루스 균주와 함께 사용된다.
A1. 수화제
a) b) c)
바실루스 투린지엔시스 포자 25% 50% 75%
나트륨 리그노술포네이트 5% 5% --
나트륨 라우릴레이트 3% -- 5%
나트륨 디이소부틸나프탈렌술포네이트 -- 6% 5%
옥틸페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르
(7 내지 8몰의 산화 에틸렌) -- 2% --
고분산 규산 5% 10% 10%
카올린 62% 27% --
포자를 보조제와 완전히 혼합하고 그 혼합물을 적합한 분쇄기에서 완전히 분쇄함으로써 물로 희석되면 소망하는 농도의 현탁액을 생성할 수 있는 수화제를 수득한다.
A2. 유화 농축액
바실루스 투린지엔시스 포자 10%
옥틸페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르
(4 내지 5몰의 산화에틸렌) 3%
칼슘 도데실벤젠술포네이트 3%
피마자 오일 폴리글리콜 에테르
(36몰의 산화 에틸렌) 4%
시클로헥산온 30%
크실렌 혼합물 50%
필요로하는 농도의 유제는 상기 농축액을 물로 희석함으로써 수득할 수 있다.
A3. 살포제
a) b)
바실루스 투린지엔시스 포자 5% 8%
활석 95% --
카올린 -- 92%
상기 활성성분을 담체와 혼합하고 그 혼합물을 적합한 분쇄기에서 분쇄함으로써 즉시사용가능한 살포제를 수득한다.
A4. 압출 과립
바실루스 투린지엔시스 포자 10%
나트륨 리그노술포네이트 2%
카르복시메틸셀룰로오스 1%
카올린 87%
활성성분 또는 이들의 조합물을 보조제와 혼합 및 분쇄하고 그 혼합물을 물로 습윤시킨다. 이 혼합물을 압출하고 과립화한 다음 기류중에서 건조시킨다.
A5. 피복 과립
바실루스 투린지엔시스 포자 3%
폴리에틸렌 글리콜(분자량 200) 3%
카올린 94%
활성성분 또는 조합물을 혼합기에서 폴리에틸렌 글리콜로 습윤된 카올린에 균일하게 도포한다. 이렇게하여 비분진 피복 과립을 수득한다.
A6. 현탁 농축액
바실루스 투린지엔시스 포자 40%
에틸렌 글리콜 10%
노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르
(15몰의 산화 에틸렌) 6%
나트륨 리그노술포네이트 10%
카르복시메틸셀룰로오스 1%
37% 포름알데히드 수용액 0.2%
75% 수용액 형태의 실리콘 오일 0.8%
물 32%
활성성분 또는 조합물을 보조제와 긴밀하게 혼합하여 물로 희석하면 소망하는 농도의 현탁액을 형성할 수 있는 현탁 농축액을 생성한다.
실시예 1. AB78 단리 및 특징화
T3 배지(리터당: 3g의 트립톤, 2g의 트립토오스, 1.5g의 효모 추출물, 0.05M의 인산 나트륨(pH 6.8) 및 0.005g의 MnCl2; 트래버스, 알.에스. 1983)상에서 실험실중의 플레이트 오염원으로서 바실루스 세레우스 균주 AB78을 단리하였다. 로그상 생장을 하는 동안, AB78은 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 현저한 활성을 나타내었다. 그람 양성 바실루스종에 대한 항생물질 활성을 또한 나타내었다(표 12).
[표 12]
AB78 배양 상층액의 항생물질 활성
Figure pct00002
AB78의 형태학적 특징은 다음과 같다:
영양 생장성 막대형 직선, 3.1 내지 5.0 mm 길이 및 0.5 내지 2.0 mm 폭. 원형 단부의 세포로서 단일쇄. 세포당 단일의 말단 부근의 원통형-타원형의 내포자 형성. 연쇄포자 결정은 형성되지 않았음. 콜로니 불투명, 불규칙, 열편 및 평평함. 착색은 형성되지 않았음. 세포는 운동성이 있었다. 편모 존재.
AB78의 생장 특징은 다음과 같다:
21 내지 30℃에서 최적 생장을 나타내는 조건적 혐기성생물. 15, 20, 25, 30 및 37℃에서 생장할 것이다. 40℃ 이상에서는 생장하지 않을 것이다. 5 내지 7% NaCl에서 생장한다.
표 13은 AB78의 생화학적 특성을 제공한다.
[표 13]
비.세레우스 균주 AB78의 생화학적 특징
---------------------------------------------------------------------
L-아라비노오스로 부터 산 - 메틸렌 블루 재산화 +
L-아라비노오스로 부터 가스 - 질산염 환원 +
D-크실로오스로 부터 산 - NO3로 부터 NO2로 환원 +
D-크실로오스로 부터 가스 - VP +
D-글루코오스로 부터 산 + H2O2분해 +
D-글루코오스로 부터 가스 - 인돌 -
락토오스로 부터 산 - 티로신 분해 +
락토오스로 부터 가스 - 디히드록시아세톤 -
수크로오스로 부터 산 - 리트머스 우유산 -
수크로오스로 부터 가스 - 리트머스 우유 응집 -
D-만니톨로 부터 산 - 리트머스 우유 알칼리성 -
D-만니톨로 부터 가스 - 리트머스 우유 렙톤화 -
프로피오네이트 이용 + 리트머스 우유 환원 -
시트레이트 이용 + 카세인 가수분해 +
히푸레이트 가수분해 w 녹말 가수분해 +
메틸렌 블루 환원 + 젤라틴 액화 +
레시티나제 생산 w
---------------------------------------------------------------------
w = 약한 반응
실시예 2. 세균 배양
TB 육즙으로 공지된 이하의 배지를 접종하기 위해 바실루스 세레우스 AB78의 계대배양액을 사용하였다:
트립톤 12 g/l
효모 추출물 24 g/l
글리세롤 4 ml/l
KH2PO42.1 g/l
K2HPO414.7 g/l
pH 7.4
고압솥처리된 육즙을 냉각시킨 후 인산 칼륨을 부가하였다. 250 rpm의 회전 진탕기상에서 플라스크를 30℃에서 24 내지 36시간 동안 배양하면 초기 내지 중간의 로그상 생장을 나타내었다.
상기 과정은 이 기술분야에서 공지된 과정에 의해 대형 발효기에서 용이하게 비례적으로 실시할 수 있다.
영양생장하는 동안, 통상 배양 개시시로 부터 24 내지 36시간 후, 초기 내지 중간정도의 로그상 생장을 나타내는 AB78 세균을 배양 상층액으로 부터 원심분리시켰다. 활성 단백질을 함유하는 배양 상층액을 생물분석법에 사용하였다.
실시예 3. 곤충 생물분석
비. 세레우스 균주 AB78을 이하에 설명한 바와 같은 다양한 곤충에 대하여 시험하였다.
서부, 북부 및 남부 옥수수 뿌리벌레, 디아브로티카 비르지페라 비르지페라, 디. 롱코니르니스 바르베리 및 디. 운데셈푼크타타 호와르디. 24 내지 36시간 생장한 AB78 배양 상층액으로 희석시키고 용융 인공 영양물(마로네 일행(1985)J. of Economic Entomology78: 290-293)과 혼합한 다음 고화시켰다. 고화된 영양물을 절단하고 접시에 놓았다. 신생 유충을 영양물에 놓고 30℃에서 유지시켰다. 6일후 치사율을 기록하였다.
대장균 클론 생물분석: 대장균 세포를 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 육즙내 37℃에서 철야로 생장시켰다. 10 ml 배양물을 20초간 3회 초음파 처리시켰다. 500 ㎕의 초음파 처리된 배양물을 용융 서부 옥수수 뿌리벌레 영양물에 부가하였다.
콜로라도 감자 풍뎅이, 렙티노타르사 데셈리네아타: 24 내지 36시간 생장한 AB78 배양 상층액을 트리톤 X-100으로 희석(최종 농도 0.1% TX-100)시켰다. 5 cm2감자 잎 조각을 상기 희석액에 침지시키고 공기 건조시키며 플라스틱 접시에서 습윤 여과지상에 놓았다. 신생 유충을 상기 잎 조각에 놓고 30℃에서 유지시켰다. 3 내지 5일 후 치사율을 기록하였다.
황색 밀웜, 테네브리오 몰리토르. 24 내지 36시간 생장한 AB78 배양 상층액을 희석시키고, 용융 인공 음식물(바이오서브 #F9240)과 혼합한 다음 고형화시켰다. 고형화된 음식물을 절단하고 플라스틱 접시에 놓았다. 신생 유충을 음식물 위에 놓고 30℃에서 유지시켰다. 6 내지 8일후 치사율을 기록하였다.
유로피언 옥수수 조명충나방, 검거세미, 담배 싹벌레, 담배 잔가지벌레 및 사탕무우 멸강나방; 오스트리니아 누빌라리스, 아그로티스 입실론, 헬리오티스 비레스센스, 만두카 섹스타 및 스포도프테라 엑시구아: 24 내지 36시간 생장한 AB78 배양 상층액을 TX-100으로 희석시켰다(최종 농도 0.1% TX-100 수득). 100 ㎕를 피펫으로 고형화된 인공 음식물(바이오서브 #F9240) 18 cm 표면상에 부가하고 공기건조시켰다. 신생 유충을 상기 음식물의 표면상에 놓고 30℃에서 유지시켰다. 3 내지 6일 후 치사율을 기록하였다.
북부 집파리, 쿨렉스 피피엔스: 24 내지 36시간 생장한 AB78 배양 상층액을 희석시켰다. 100 ㎕를 피펫을 이용하여 30 ml 플라스틱 컵에 든 10 ml 물에 부가하였다. 제 3 영충기 유충을 물에 부가하고 실온에서 유지시켰다. 24 내지 48시간 후 치사율을 기록하였다. AB78의 살곤충 활성 스펙트럼을 하기 표 14에 수록한다.
[표 14]
다양한 곤충 종에 대한 AB78 배양 상층액의 활성
---------------------------------------------------------------------
시험 곤충종 목 활성
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서부 옥수수 뿌리벌레
(디아브로티카 비르지페라 비르지페라) 딱정벌레목 +++
북부 옥수수 뿌리벌레
(디아브로티카 롱기코르니스 바르베리) 딱정벌레목 +++
남부 옥수수 뿌리벌레
(디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디) 딱정벌레목 -
콜로라도 감자 풍뎅이
(렙티노타르사 데셈리네아타) 딱정벌레목 -
황색 밀웜
(테네브리오 몰리토르) 딱정벌레목 -
유로피언 옥수수 자명충나방
(오스트리니아 누빌라리스) 나비목 -
담배 싹벌레
(헬리오티스 비레스센스) 나비목 -
담배 잔가지벌레
(만두카 섹스타) 나비목 -
사탕무우 멸강나방
(스포도프테라 엑시구아) 나비목 -
검거세미
(아그로티스 입실론) 나비목 -
북부 집모기
(쿨렉스 피피엔스) 파리목 -
---------------------------------------------------------------------
새로이 발견된 비.세레우스 균주 AB78은 Bt로 부터 얻은 공지된 딱정벌레 목의 활성 δ-내독소에 비하여 현저히 상이한 살충 활성 스펙트럼을 나타내었다. 특히, AB78은 디아브로티카 종에 대하여 특이적으로 활성을 갖는 점에서 공지의 딱정벌레목의 활성 Bt 균주에 비하여 풍뎅이에 대하여 보다 선택적인 활성을 나타내었다. 보다 특히, AB78 균주는 디. 비르지페라 비르지페라 및 디. 롱기코르니스 바르베리에 대하여 가장 큰 활성을 나타내었지만 디. 운데심푼크타타 호와르디에 대하여는 활성을 나타내지 않았다.
다수의 바실루스 균주를 영양 생장하는 동안 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성에 대해 생물분석하였다(표 15). 결과는 AB78이 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성이 일반적인 현상이 아니라는 점에서 특징을 나타낸다.
[표 15]
서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 다양한 바실루스 종으로 부터 배양 상층액의 활성
---------------------------------------------------------------------
바실루스 균주 WCRW 치사율 %
---------------------------------------------------------------------
비.세레우스 AB78(Bat.1) 100
비.세레우스 AB78(Bat.2) 100
비.세레우스(캐롤라이나 Bio.) 12
비.세레우스 ATCC 11950 12
비.세레우스 ATCC 14579 8
비.미코이데스 (캐롤라이나 Bio.) 30
비.포필리아애 28
비.투린지엔시스 HD135 41
비.투린지엔시스 HD191 9
비.투린지엔시스 GC91 24
물 대조용 4
---------------------------------------------------------------------
서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 AB78의 특정 활성을 하기 표 16에 수록한다.
[표 16]
신생 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 AB78 배양 상층액의 활성
------------------------------------------
배양 상층액 %
농도 (㎕/ml) WCRW 치사율
-------------------------------------------
100 100
25 87
10 80
5 40
2.5 20
1 6
0 0
--------------------------------------------
LC50은 서부 옥수수 뿌리벌레 음식물 ml당 6.2 ㎕의 배양 상층액인 것으로 밝혀졌다.
세포 펠릿을 생물분석하며 WCRW에 대한 활성은 나타내지 않았다. 따라서 상층액에서만 활성이 존재하는 것은 VIP가 외독소라는 것을 의미한다.
실시예 4. 옥수수 뿌리벌레의 단리 및 정제
AB78로 부터 수득한 활성 단백질
세포와 찌꺼기가 없는 배양 배지에 고체 황산 암모늄(472 g/L)을 부가함으로써 70% 포화시켰다. 실온에서 용해시킨 다음 얼음조에서 냉각시키고 또 10,000 X g에서 30분간 원심분리시켜 석출된 단백질인 펠릿을 수득하였다. 상층액을 버리고 펠릿은 20 mM 트리스-HCl(pH 7.5) 원래 부피의 1/10에 용해시켰다. 용해된 펠릿을 20 mM 트리스-HCl, pH 7.5에서 투석시키거나 또는 탈염 칼럼을 통과시킴으로써 탈염시켰다.
탈염된 물질을 20 mM 시트르산 나트륨, pH 2.5를 사용하여 pH 3.5로 만들었다. 이어 실온에서 30분간 배양한 후 용액을 3000 X g에서 10분간 원심분리시켰다. 이 단계에서 상층액은 최대 양의 활성 단백질을 함유하였다.
pH 7.0으로 중화시킨 다음 상층액을 300 mL/분의 유량으로 20 mM 트리스, pH 7.5로써 균형을 이룬 모노-Q 음이온 교환 칼럼에 인가하였다. 이 칼럼을 서서히 20 mM 트리스 pH 7.5중의 40 mM NaCl 직선 구배를 이용하여 전개시켰다.
칼럼 분획의 생물분석 및 SDS-PAGE분석을 이용하여 활성 분획을 확인하였다. SDS-PAGE 분석은 생물학적으로 활성인 단백질이 약 80 kDa 및 50 kDa 범위의 분자량을 갖는 성분이라는 것을 확인하였다.
실시예 5. 옥수수 뿌리벌레 활성 단백질의 서열분석
SDS-PAGE에 의해 단리된 80 kDa 성분을 PVDF막으로 보내고 ABI 470 펄스-액체 서열분석기상에서 반복적인 에드만 주기에 의해 아미노 말단 서열분석처리하였다. 전달은 10% 메탄올 pH 11.0을 사용하여 10 mM CAPS로 실시하였다:
전달 완충액중에서 겔 통과 전기영동법에 의한 배양을 5분간 실시하였다. ProBlott PVDF 막을 100% MeOH로써 습윤시킨 다음 전달 완충액으로 평형유지시켰다. 양극-겔-막-음극 구조를 갖는 여과지 스퀘어와 발포 스폰지 사이에 샌드위치 배열시켰다.
전달은 70 V 정상 전압에서 1시간 동안 실시하였다.
전달한 후 막을 물로 헹구고 50% MeOH중의 0.25% 코마시 블루 R-250으로 2분간 염색하였다.
50% MeOH, 40% 물, 10% 아세트산으로 수회 세척함으로써 탈염시켰다.
탈염시킨 다음 서열 분석하기 위한 밴드를 절단하기 전에 공기 건조시켰다. 블로트카트리지 및 적합한 사이클을 이용하여 최대 효율 및 수율을 얻었다. 모델 610 서열 분석 소프트 웨어를 이용하여 각 서열 주기에 대한 PTH-아미노산 유도체를 동정하고 정량하는 데이타 분석을 실시하였다.
N-말단 서열은 이하와 같은 것으로 결정되었다:
NH2-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro- (SEQ ID NO: 8). Asx는 Asp 또는 Asn을 의미함. 80kDa 성분에 대한 완전한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에 기재되어 있다. SEQ ID NO: 7을 코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID NO: 6에 기재되어 있다.
실시예 6. DNA 탐침의 작성
N-말단 서열의 아미노산 3-9을 코딩하는 유전자 영역(실시예 5)에 대한 올리고뉴클레오타이드 탐침을 제조하였다. 이 탐침은 바실루스 투린지엔시스(Bt) δ-내독소 유전자의 코돈 사용을 기초로하여 합성하였다. 뉴클레오타이드 서열
5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID NO: 9)
을 서던 혼성화에 탐침으로 사용하였다. 표준 수법 및 장치를 이용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
실시예 7. 옥수수 뿌리벌레 활성 단백질의 등전점 결정
5단계 정제 과정으로 부터 정제된 단백질을 파스트겔(Phastgel) 전기영동계(파마시아 제)를 이용하여 3 내지 9 pl 등전 포커싱 겔상에서 분석하였다. 유닛에 대한 표준 작업 과정은 분리 및 은 염색 발색 과정 다음에 실시하였다. pI는 약 4.9였다.
실시예 8. AB78에 대한 PCR 데이타
바실루스 세레우스 균주 AB78이 바실루스 투린지엔시스 또는 바실루스 스파에리쿠스의 살충성 결정 단백질을 함유하지 않는다는 것을 확인하기 위하여 PCR 분석법(예컨대 미국 특허출원 08/008,006호; 및 카로치 일행(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57(11): 3057-3061 참조, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있슴)을 이용하였다(표 17).
[표 17]
AB78에 대하여 PCR에 의해 시험된 바실루스 살충성 결정 단백질 유전자 프라이머
---------------------------------------------------------------------
시험된 프라이머 생산된 생성물
---------------------------------------------------------------------
CryIIIA에 특이적인 2세트 음성
CRyIIIB 음성
CrylA에 특이적인 2세트 음성
CrylA(a) 음성
CrylA(b) 특이적 음성
CrylB 음성
CrylC 특이적 음성
CrylE 특이적 음성
바실루스 스파에리쿠스에 특이적인 2세트 음성
CrylIV에 특이적인 2세트 음성
바실루스 대조용 (PI-PLC) 양성
---------------------------------------------------------------------
실시예 9. 바실루스 세레우스 균주 AB78로 부터 전체 DNA의 코스미드 클로닝
VIP1A(a) 유전자를 이하와 같이 균주 AB78로 부터 제조된 전체 DNA로 부터 클로닝시켰다:
AB78 DNA의 단리는 다음과 같이 실시하였다:
1. 10 ml L-육즙에서 세균을 철야로 생장시켰다. (50 ml 멸균 원심분리관 사용)
2. 25 ml의 새로 제조한 L-육즙과 암피실린(30 ㎍/ml)을 부가하였다.
3. 30℃에서 교반하면서 2 내지 6시간 동안 세포를 생장시켰다.
4. 50 ml 프로필렌 오렌지 캡 튜브내의 세포를 3/4 속도로 IEC 밴치탑 클리니칼 원심분리기에서 회전시켰다.
5. 세포 펠릿을 10 ml TES (TES = 50 mM 트리스 pH 8.0, 100 mM EDTA, 15 mM NaCl)에서 재현탁시켰다.
6. 30 mg 리소자임을 부가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다.
7. 200 ㎕ 20% SDS 및 400 ㎕ 프로테이나제 K 원액(20 mg/ml)을 부가하였다. 37℃에서 배양하였다.
8. 새로이 제조한 200 ㎕ 프로테이나제 K를 부가하였다. 55℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 5 ml TES를 부가하여 최종 부피를 15 ml로 만들었다.
9. 페놀 추출을 2회 실시하였다(10 ml 페놀, 실온에서 3/4 속도로 IEC 벤치탑 클리니칼 원심분리기로 회전시켰다). 상층액(상부 상)을 넓은 입구의 피펫을 이용하여 깨끗한 관으로 전달하였다.
10. 1:1 부피의 페놀:클로로포름/이소아밀 (24:1 비율)로 1회 추출하였다.
11. 동부피의 냉각 이소프로판올을 사용하여 DNA를 석출시켰다. 원심분리하여 DNA를 펠릿화하였다.
12. 5 ml의 TE에 펠릿을 현탁시켰다.
13. 0.5 ml 3M NaOAc pH 5.2 및 11 ml 95% 에탄올을 사용하여 DNA를 석출시켰다. 20℃에서 2시간 동안 방치하였다.
14. 플라스틱 루프를 갖는 관으로 부터 DNA를 걸어올려 미량원심분리관으로 옮기고 회전시켜 과량의 에탄올을 피펫으로 제거하며 진공에서 건조시켰다.
15. 0.5 ml TE에 재현탁시켰다. 65℃에서 90분간 배양하여 DNA를 다시 용액으로 만들었다.
16. 표준 과정을 이용하여 농도를 측정하였다.
AB78의 코스미드 클로닝
특별히 지시하지 않는 한, 모든 과정은 스트라타진 프로토콜, 수퍼코스 1 인스트럭션 매뉴얼, Cat. No. 251301에 따라서 실시하였다.
일반적으로, 과정은 다음과 같았다:
A. AB78 DNA의 Sau 3A 부분적 분해.
B. 벡터 DNA의 제조
C. DNA의 결찰 및 팩케이징
D. 코스미드 라이브러리의 적정
1. 50 ml의 철야 배양물을 0.2% 말토오스를 갖는 5 ml TB에 방치함으로써 HB101 세포 배양을 개시하였다. 37℃에서 3.5 시간 동안 배양하였다.
2. 세포를 회전 제거하여 0.5 ml 10 mM MgSO4에 재현탁시켰다.
3. 100 리터 세포,
10 리터 희석 팩케이징 혼합물
100 리터의 10 mM MgSO4
30 리터의 TB
를 모두 부가하였다.
4. 실온에서 교반하지 않고서 30분간 흡수시켰다.
5. 1 ml TB를 부가하고 부드럽게 혼합하였다. 37℃에서 30분간 배양하였다.
6. 200 리터를 L-amp 플레이트에 플레이팅하였다. 37℃에서 철야로 배양하였다.
400 개 이상의 코스미드 클론을 임의로 선택하여 실시예 3에서 기재한 바와 같은 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성에 대하여 스크리닝하였다. 5개의 활성 클론 및 5개의 비활성 클론으로 부터 얻은 DNA를 서던 혼성화처리에 사용하였다. 결과는 상술한 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용한 혼성화반응이 서부 옥수수 뿌리벌레 활성과 상관 관계가 있다는 것을 예시하였다(표 18).
코스미드 클론 P3-12 및 P5-4는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스 페턴트 컬쳐 콜렉숀(NRRL)에 수탁번호 NRRL B-21061 및 NRRL B-21059로 기탁되어 있다.
[표 18]
서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 AB78 코스미드 클론의 활성
---------------------------------------------------------------------
클론 평균 % 치사율 (N= 4)
---------------------------------------------------------------------
탐침과 혼성화되는 클론
P1-73 47
P1-83 64
P2-2 69
P3-12 85
P5-4 97
탐침과 혼성화되지 않는 클론
P1-2 5
P3-8 4
P3-9 12
P3-18 0
P4-6 9
---------------------------------------------------------------------
실시예 10. 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 6 KB 영역 활성의 동정
P3-12로 부터 얻은 DNA를 제한효소 Sau3A로 부분적으로 분해시켜서 대장균벡터 pUC19에 결찰시키고 80 kDa VIP1A(a) 단백질에 특이적인 DNA 탐침을 P3-12 DNA 부분의 PCR 증식법에 의해 합성하였다. 80 kDa 단백질의 부분적 아미노산 서열을 사용하여 VIP1A(a) 부분에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 MK113 및 MK117을 합성하였다. 콜로니 혼성화에 의해 PCR-생성된 탐침에 대한 플라스미드 서브클론을 동정하고 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성에 대하여 시험하였다. 이러한 한개 클론, PL2는 PCR 생성된 단편과 혼성화되었고 전술한 분석법에서 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성이었다.
pL2로 부터 6 kb Cla I 제한단편을 대장균-바실루스 셔틀 벡터 pHT 3101 (레레클루스, 디. 일행,FEMS Microbiology Letters60: 211-218 (1989))의 Sma I 부위로 클로닝시켜 pCIB6201를 수득하였다. 이 작성물은 바실루스 및 대장균 균주 모두에 대해 항-서부 옥수수 뿌리벌레 활성을 어느 쪽으로든 제공한다. pCIB6022는 pBluescript SK(+)(스트라타진 제조)내에 동일한 6 kb Cla I 단편을 함유하며, 동일한 VIP1A(a) 단백질(웨스턴 블럿에 의해)을 생산하며 또 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 갖는다.
pCIB6022의 뉴클레오타이드 서열은 생거 일행,Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 74: 5463-5467 (1977)에 따른 디데옥시 종결법에 의해 PRISM 레디 리엑션 다이 데옥시 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트 (PRISM Ready Reaction Dye Deoxy terminator Cycle Sequencing Kits) 및 PRISM Sequenase?터미네이터 이중가닥 DNA 시퀀싱 키트를 사용하여 결정하며 ABI 373 오토매틱 서열분석기상에서 분석하였다. 이 서열을 SEQ ID NO: 1에 나타낸다. 6kb 단편은 SEQ ID NO: 1에 기재된 오픈 리딩 프레임에 의해 지시한 바와 같이 VIP1A(a) 및 VIP2A(a)를 코딩한다. VIP2A(a)를 코딩하는 서열을 SEQ ID NO: 4에 기재한다. pCIB6022에서 발견되는 6kb 단편내의 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 사이의 관계를 표 19에 나타낸다. pCIB6022는 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21222로 기탁되어 있다.
실시예 11. VIP1A(a) DNA 영역의 기능 분할
VIP1A(a) 오픈 리딩 프레임(ORF)이 살충 활성에 필수적이라는 것을 확인하기 위하여 유전자내에 번역 프레임 시프트 돌연변이를 만들었다. 제한 효소 Bgl II는 VIP1A(a)의 코딩 영역으로 857 bp로 위치하는 독특한 부위를 인식한다. pCIB6201을 Bgl II으로 분해시키고, 또 단일 가닥의 말단을 DNA 중합효소(클레노 단편) 및 dNTPS를 사용하여 충전시켰다. 플라스미드를 결찰시키고 대장균으로 형질전환시켰다. 생성한 플라스미드, pCIB6203은 VIP1A(a)의 코딩 영역에 4개의 뉴클레오타이드 삽입물을 함유한다. pCIB6203은 WCRW 살충 활성을 부여하지 않으므로 VIP1A(a)는 서부 옥수수 뿌리 활성의 필수 성분이라는 것을 알 수 있다.
VIP1A(a)를 코드화하는데 필요한 영역을 더욱 정의하기 위하여, VIP1A(a) 및 VIP2A(a)(보조 단백질) 영역의 서브 클론을 작성하고 pCIB6203에서 돌연변이를 완성하기 위한 이들의 능력에 대해 시험하였다. pCIB6023은 pBluescript SK(+)(스트라타진 제조)에서 3.7 kb Xba I-EcoRV 단편을 함유한다. 웨스턴 블럿 분석법은pCIB6023이 클론 PL2 및 pCIB6022과 동일한 크기와 양의 VIP1A(a) 단백질을 생산한다는 것을 나타낸다. pCIB6023은 80 kD 단백질을 코딩하는 전체 유전자를 함유한다. pCIB6023은 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21223N으로 기탁되어 있다. pCIB6206은 pBluescript SK(+) (스트라타진 제조)중의 pCIB6022로 부터 4.3 kb Xba I-Cla I 단편을 함유한다. pCIB6206은 또한 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21321로 기탁되어 있다.
pCIB6023, pCIB6206 및 pCIB6203은 개별적으로 시험해보면 눈에 띄는 서부 옥수수 뿌리벌레 활성을 나타내지 않는다. 그러나, pCIB6203(VIP1A(a)-돌연변이 + VIP2A(a))를 함유하는 세포 및 pCIB6023(VIP1A(a)만)을 함유하는 세포의 혼합물은 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 높은 활성을 나타낸다. 유사하게, pCIB6206를 함유하는 세포 및 pCIB6203을 함유하는 세포의 혼합물은 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 높은 활성을 나타낸다.
VIP2A(a)의 한도를 더욱 정의하기 위하여, VIP2A(a) 전체를 함유하지만 대부분의 VIP1A(a) 코딩 영역은 함유하지 않는 pCIB6024를 작성하였다. pCIB6024는 pCIB6022로 부터 얻은 2.2 kb의 Cla I-Sca I 제한 단편을 겔 정제하고, 단일 가닥의 단부를 DNA 중합효소(클레노 단편) 및 dNTPs를 사용하여 충전시키며 또 효소 Eco RV로 분해된 pBluescript SK(+) 벡터(스타라타진 제조)로 단편을 결찰시킴으로써 작성하였다. pCIB6024를 함유하는 세포는 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 전혀 나타내지 않고 또 pCIB6023을 함유하는 세포는 서부 옥수수 뿌리벌레에 대하여 높은 활성을 나타낸다. (표 19 참조).
따라서, pCIB6023 및 pCIB6206은 기능적 VIP1A(a) 유전자 산물을 생산해야하는 반면에 pCIB6203 및 pCIB6024는 기능적 VIP2A(a) 유전자 산물을 생산해야한다. 이들 결과는 최대의 서부 옥수수 뿌리벌레 활성을 부여하기 위해서는 VIP1A(a)와 조합된 VIP2A(a) 영역으로 부터 유전자 산물이 필요하다는 것을 제시한다. (표 19 참조).
[표 19]
pCIB6022의 특징
WCRW에 대한 활성
Figure pct00003
VIP의 기능적 완성
Figure pct00004
박스 모양의 영역은 VIP1A(a) 및 VIP2A(a)의 양을 나타낸다. 백색 박스는 바실루스에서 관찰되는 80 kDa 펩티드를 코딩하는 VIP1의 부분을 나타낸다. 어두운 박스는 DNA 서열 분석에 의해 예상된 VIP1A(a)의 N-말단 "프로펩티드"를 나타낸다. 대문자 'X'는 VIP1A(a)로 도입된 프레이시프트 돌연변이의 위치를 나타낸다. 화살표는 베타-갈락토시다제에 의해 전사된 작성물을 나타낸다.
실시예 12. AB78 항체 생산
게놈 DNA 라이브러리를 제한 스크리닝하기 위해 하이브리도마 세포주의 생산 및 충분한 양의 혈청 생산 가능성 모두가 가능한 2마리 루이스 쥐에서 항체 생산을 개시하였다. 다른 요인은 매우 제한된 양의 유용 항원 및 항원이 PAGE에 의해 정제된 다음 니트로셀룰로오스로 전기전달될 수 있는 사실이다.
니트로셀룰로오스상에서 항원의 제한된 유용성 때문에, 니트로셀룰로오스는 DMSO에서 유화된 다음 동물의 뒷다리에 주사되어 오금 림프절 바로 상류에서 B-세포 생산을 유발한다. 제 1 생산 혈액을 사용한 웨스턴 블럿 분석법으로 판정되는바와 같이 강한 반응성 혈청이 생산되었다. 몇번 연속해서 주사하면 모든 스크리닝을 실시하는데 충분한 양의 생산 혈청을 흘렸다.
이어 쥐중의 하나를 이용하여 하이브리도마 생산을 개시하였다. 오금 림프절을 절단하고, 분쇄하며 생성한 세포를 마우스 골수종 P3x63Ag8.653과 융합하였다. 이어 세포 스크리닝을 이하와 같이 실시하였다. 최고로 유화된 항체 반응을 유발하는 4개의 초기 웰을 선택하여 제한 희석 클로닝에 이용하였다. 추가로 10개 웰을 팽창 동결보존용으로 선택하였다.
ELISA 스크리닝하기 위해 니트로셀룰로오스상의 AB78을 DMSO에서 유화처리시키는 과정
PAGE 처리된 AB78 샘플를 니트로셀룰로오스로 전기전달한 후, 전달된 모든 단백질을 가시화하도록 가역적 균주 Ponceau S를 사용하였다. 이미 동정되고 N-말단 서열결정화된 AB78 독소에 상응하는 밴드를 동정하고 니트로셀룰로오스로 부터 절단하였다. 각 밴드는 유화된 니트로셀룰로오스의 양을 최소화하기 위하여 약 1 mm x 5 mm 크기이다. 250 ㎕의 DMSO를 갖는 미량원심분리관에 단일 밴드를 넣고 플라스틱 막자(콩테, 바인랜드, 뉴저지)를 이용하여 분쇄시켰다. 유화를 용이하게 하기 위하여, DMSO 혼합물을 37 내지 45℃에서 2 내지 3분간 가열하였다. 가열후 몇번의 분쇄가 필요할 수 도 있다. 그러나 모든 니트로셀룰로오스는 유화되어야한다. AB78 샘플가 일단 유화되면, 얼음에 방치한다. 유화된 항원으로 코팅된 마이크로티터 플레이트를 제조하기 위하여, 샘플는 다음과 같이 붕산염 완충염수로 희석되어야한다: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100 및 0. 코팅 항원은 사용되기 바로 전에 새로 제조된 것이어야한다.
ELISA 방법:
1. BBS중의 AB78/DMSO으로 코팅하였다. 4℃에서 철야로 배양하였다.
2. 3 X, 1X ELISA 세정 완충액으로 플레이트를 세정하였다.
3. 실온에서 30분간 블로킹 한다(PBS중에서, 1% BSA 및 0.05% 트윈).
4. 3X, 1X ELISA 세정 완충액으로 플레이트를 세정하였다.
5. 쥐 혈청을 부가하였다. 37℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다.
6. 3X, 1X ELISA 세정 완충액으로 플레이트를 세정하였다.
7. ELISA 희석액중의 2 ㎍/ml 농도로 염소 항-쥐를 부가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
8. 3X, 1X ELISA 세정 완충액으로 플레이트를 세정하였다.
9. ELISA 희석액중의 2 ㎍/ml로 쥐 항-염소 알칼리성 포스파타제를 부가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
10. 3X, 1X ELISA 세정 완충액으로 세정하였다.
11. 기질을 부가하였다. 실온에서 30분간 배양하였다.
12. 30분 후 3N NaOH로 중지시켰다.
VIP2A(a) 항혈청의 제조
부분적으로 정제된 AB78 배양 상층액을 제조자의 지시를 따라서 불연속적 SDS PAGE (노벡스 제조)에 의해 분리하였다. 분리된 단백질을 토우빈 일행(1979)에 의해 기재된 바와 같이 니트로셀룰로오스(S&S #21640)로 전기영동시켰다. 니트로셀룰로오스를 폰세아우 에스로 염색한 다음 VIP2A(a) 밴드를 확인하였다. VIP2A(a) 밴드를 절단하고 주입하기 전에 DMSO에서 즉시 유화시켰다. 쥐를 먼저 약 1:1로 프로인트 완전 보조액과 혼합된 유화된 VIP2A(a)를 사용하여 근육내 주사에 의해 4개의 상이한 지점에서 쥐를 면역화시켰다. 이어, 4주 간격으로 프로인트 불완전 보조제를 사용한 이외에는 처음과 동일하게 면역처리시켰다. 제 1 혈청을 수집한 다음 VIP2A(a) 단백질과 면역 반응시켰다. 상기 항혈청을 사용하여 AB78 배양 상층액의 웨스턴 블럿 분석을 실시하여 전체 길이의 VIP2A(a) 단백질을 확인하였다.
실시예 13. AB78 VIP 클론을 사용한 비 활성 BT 균주의 살충 활성의 활성화
Bt 균주 GC91로 부터 24시간 (초기 내지 중기 로그 상) 상층액과 함께 pCIB6203을 부가하면 디아브로티카 비르기페라 비르기페라에서 100% 치사율을 나타내었다. pCIB6203 및 GC91은 그 자체로 디아브로티카 비르기페라 비르기페라에 대하여 활성이 아니다. 데이타를 하기에 나타낸다:
---------------------------- ------------------
시험 물질 % 디아브로티카 치사율
--------- ------------------ ------------------
pCIB6023 0
GC91 16
pCIB6203 + GC91 100
대조용 0
-----------------------------------------------
실시예 14. 비.세레우스 AB81의 단리 및 생물학적 활성
AB81로 표시한 제 2 비.세레우스 균주를 표준 방법에 의해 곡식 주머니 먼지 샘플로 부터 단리하였다. AB81의 계대배양물을 생장시키고 또 실시예 2에 기재된 바와 같이 생물분석하기 위해 준비하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 생물학적 활성을 평가하였다. 결과를 하기에 나타낸다:
-----------------------------------------------
시험 곤충종 % 치사율
-----------------------------------------------
오스트리니아 누빌라리스 0
아그로티스 입실론 0
디아브로티카 비르기페라 비르기페라 55
-----------------------------------------------
실시예 15. 비.투린지엔시스 AB6의 단리 및 생물학적 활성
AB6으로 표시한 바실루스 투린지엔시스 균주를 이 기술분야에서 공지된 표준 방법에 의해 곡식 주머니 먼지 샘플로 부터 단리하였다. AB6의 계대배양물을 생장시키고 또 실시예 2에 기재된 바와 같이 생물분석하기 위해 준비하였다. 샘플의 1/2을 15분간 오토클레이빙시켜 β-외독소의 존재에 대하여 시험하였다.
생물학적 활성은 실시예 3에 기재된 바와 같이 평가하였다. 결과를 하기에 나타낸다:
-----------------------------------------------------
시험 곤충종 % 치사율
-----------------------------------------------------
오스트리니아 누빌라리스 0
아그로티스 입실론 100
아그로티스 입실론(오토클레이브 처리된 샘플) 0
디아브로티카 비르기페라 비르기페라 0
-----------------------------------------------------
오토클레이브 처리에 의한 배양 상층액의 살충 활성의 감소가 그다지 크지 않은 것은 활성이 β-외독소가 아니라는 것을 의미한다.
균주 AB6는 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21060로 기탁되어 있다.
실시예 16. 비.투린지엔시스 AB88의 단리 및 생물학적 활성
AB88로 표시한 Bt 균주를 표준 방법에 의해 곡식 주머니 먼지 샘플로 부터 단리하였다. AB88의 계대배양물을 생장시키고 또 실시예 2에 기재된 바와 같이 생물분석하기 위해 준비하였다. 샘플의 1/2을 15분간 오토클레이빙시켜 β-외독소의 존재에 대하여 시험하였다. 생물학적 활성은 실시예 3에 기재된 바와 같이 다수의 곤충에 대하여 평가하였다. 결과를 하기에 나타낸다:
--------------------------------------------------------------
배 양 상층액의 % 치 사 율
시험 곤충종 목 오토클레이브 오토클레이브
처리되지 않음 처리됨
---------------------------------------------------------------
아그로티스 입실론 나비목 100 5
오스트리니아 나비목 100 0
누빌라리스
스포도프테라
프루지페르다 나비목 100 4
헬리코베르파 나비목 100 12
제아
헬리오티스 나비목 100 12
비레스센스
렙티노타르사
데셈리네아타 딱정벌레목 0 0
비르기페라
비르기페라 딱정벌레목 0 5
-----------------------------------------------────────
오토클레이브 처리에 의한 배양 상층액의 살충 활성의 감소가 그다지 크지 않은 것은 활성이 β-외독소가 아니라는 것을 의미한다.
델타 내독소 결정이 표준 방법에 의해 균주 AB88로 부터 정제되었다. 아그로티스 입실론에 대하여 생물분석해본 결과 상기 순수한 결정으로 부터 아무런 활성이 관측되지 않았다.
실시예 17. AB88로 부터 VIPS의 정제:
세균 액체 배양액을 TB 배지중 30℃에서 철야[12시간]로 생장시켰다. 세포를 5000 x g 에서 20분간 원심분리시킨 다음 상층액을 유지시켰다. 상층액에 존재하는 단백질을 황산 암모늄(70% 포화)으로 석출시키고 원심분리[5000 x g 에서 15분간]시킨 다음 펠릿을 유지시켰다. 이 펠릿을 원부피의 20mM 트리스 pH7.5에 재현탁시키고 4℃에서 동일 완충액에 대하여 철야로 투석시켰다. AB88 분석물은 AB78로 부터 얻은 대조용 물질에 비하여 훨씬 탁한 것이었다. 이 투석물을 20 mM 시트르산 나트륨(pH 2.5)을 사용하여 pH 4.5로 적정한 다음 실온에서 30분 배양한 후 용액을 3000 x g에서 10분간 원심분리시켰다. 단백질 펠릿을 20mM 비스-트리스-Propane pH 9.0에 재용해시켰다.
AB88 단백질을 등전 포커싱(로토포르, 바이오라드, 허큘레스, 캐니다), pH 4.5에서 석출, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배출 크로마토그래피 및 한외여과등을 비롯한 몇개의 상이한 방법에 의해 분리하였다. 이 단백질을 20 mM 비스-트리스-프로판 pH 9.0중의 0 내지 500 mM NaCl의 직선 구배를 이용하여 4 ml/분의 유량으로 포로스 HQ/N 음이온 교환 칼럼처리시켰다.
유로피언 옥수수 조명충나방(ECB)-활성 단백질은 투석물의 pH 4.5 석출에 의해 수득한 펠릿속에 잔존하였다. pH 3 내지 10 양쪽성 물질을 사용한 투석물상에서 보존적 IEF를 실시할 때, ECB 살충활성은 pH 7 이상인 모든 분획에서 발견되었다. 이들 분획의 SDS-PAGE 분석은 MW ∼60 kDA 및 ∼80kDa의 단백질 밴드를 나타내었다. 포로스-Q 칼럼(퍼셉티브 바이오시스템스, 캠브릿지, 매사추세츠)상에서 음이온 교환 HPLC에 의해 60 kDa 및 80 kDa 밴드를 분리하였다. 약간 상이한 MW를 갖지만 약 60 kDa 크기인 2개의 분획으로 부터 N-말단 서열을 수득하였다. 수득한 서열들은 서로 유사하고 일부 δ-내독소와 유사하였다.
음이온 교환 분획 23 (소형): xEPFVSAxxxQxxx (SEQ ID NO: 10)
음이온 교환 분획 28 (대형): xEYENVEPFVSAx (SEQ ID NO: 11)
ECB-활성 pH 4.5의 펠릿을 포로스-Q 칼럼상에서 음이온 교환에 의해 분리시키면, ∼60kDa의 주 밴드를 함유하는 분획에서만 활성이 발견되었다.
AB88 투석물을 pH 4.5로 만들었을 때 흑거세미 활성 단백질은 펠릿에 잔존하였다. pH 3-10 양쪽성 물질을 사용한 보존적 IEF에서, 활성은 ECB-활성 IEF 분획에서 발견되지 않았다. 대신, pH 4.5-5.0 분획에서 활성이 높았다. 이들 대부분의 성분은 ∼35 내지 ∼80 kDa 분자량을 갖고 있었다.
pH 4.5 펠릿을 음이온 교환 HPLC에 의해 분리하여 35 kDa를 함유하는 분획 및 35 kDa 및 80 kDa를 함유하는 분획을 수득하였다.
실시예 18. AB88 VIP의 특징화
다양한 나비목 곤충 활성 영양 단백질을 함유하는 분획을 실시예 17에 기재한 바와 같이 제조하였다. 살충활성을 갖는 분획은 8 내지 16% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 PVDF 막으로 전달하였다[LeGendere 일행(1989): A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, 마쓰다리아 PT 편찬 (뉴욕 아카데미 프레스 인코포레이티드). 분획의 생물학적 분석은 상이한 VIP가 상이한 나비목 곤충종 활성에 관여하는 것을 나타내었다.
아그로티스 입실론 활성은 80 kDa 및/또는 35 kDa 단백질 단독 또는 조합물에 의한 것이다. 이들 단백질은 공지된 Bt δ-내독소 서열과 서열 상동성이 없는 것으로 볼 때 Bt로 부터 유래한 어떠한 δ-내독소와도 관련이 없다. 균주 AB88로 부터 vip3A(a) 살충 단백질은 AB88배양물의 상층액에 주로(전체의 75% 이상) 존재하였다.
또한 이들 단백질은 AB88 δ-내독소 결정에서 발견되지 않는다. 주요 δ-내독소 단백질의 N-말단 서열을 80 kDa 및 35 kDa VIP의 N-말단 서열과 비교하면 아무런 서열 상동성이 발견되지 않았다. vip3A(a) 살충 단백질의 N-말단 서열은 다수의 양성 하전된 잔류물(Asn2 내지 Asn7)에 이어 소수성 코어 영역(Thr8 내지 Ile34)을 함유한다. 공지된 분비 단백질과는 달리, 균주 AB88로 부터 수득한 vip3A(a) 살충성 단백질은 이동하는 동안 N-말단이 가공되지 않는다.
결과를 이하와 같이 요약한다:
------------------------------------------------------------------------
아그로티스 VIP N-말단 서열 주 δ-내독소 단백질의
N-말단 서열
------------------------------------------------------------------------
130 kDa
MDNNPNINE (SEQ ID NO: 14)
80 kDa 80 kDa
MNKNNTKLPTRALP (SEQ ID NO: 12) MDNNPNINE (SEQ ID NO: 15)
60 kDa
MNVLNSGRTTI (SEQ ID NO: 16)
35kDa
ASENTGKDGGYIVP (SEQ ID NO: 13)
------------------------------------------------------------------------
오스트리니아 누빌라리스 활성은 60 kDa VIP에 기인한 것이고 또 스포도프테라 프루지페르다 활성은 알려지지 않은 크기의 VIP에 기인한 것이다.
바실루스 투린지엔시스 균주 AB88은 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21225로 기탁되어 있다.
실시예 18A. 바실루스 투린지엔시스 AB424의 단리 및 생물학적 활성
AB424로 표시된 바실루스 투린지엔시스 균주는 이 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해 이끼 낀 솔방울 샘플로 부터 단리하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 AB424의 서브클론을 생장시키고 또 생물분석 준비하였다.
실시예 3에 기재된 바와 같이 생물학적 활성을 평가하였다. 결과는 다음과 같다:
-----------------------------------------
시험 곤충종 % 치사율
-----------------------------------------
오스트리니아 누빌라리스 100
아그로티스 입실론 100
디아브로티카 비르기페라 0
비르기페라
-----------------------------------------
균주 AB424는 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21439로 기탁되어 있다.
실시예 18B. 흑거세미에 대하여 활성인 단백질을 코딩하는 VIP3A(a) 및 VIP3A(b) 유전자의 클로닝
AB88 및 AB424 단리물로 부터 전체 DNA를 단리[오수벨 일행 (1988), Current Protocols in Molecular Biology (존 윌리 앤드 선스, 뉴욕)]하고 제한효소 XbaI [바실루스 투린지엔시스 AB88 DNA의 4.0 내지 5.0 Kb 크기 분별된 EcoRI 단편의 라이브러리] 및 EcoRI [바실루스 투린지엔시스 AB424 DNA의 4.5 내지 6.0 Kb 크기 분별 EcoRI 단편의 라이브러리]으로 각각 분해시키고, 동일한 효소로 미리 선형화되고 또 탈인산화된 pBluescript 벡터에 결찰시키며, 또 대장균 DH5α 균주로 형질전환시켰다. 재조합 클론을 니트로세룰로로오스 막으로 블로팅한 다음 아그로티스 입실론(흑거세미)에 대해 활성인 80 kDa 단백질의 11-N 말단 아미노산에 상응하는32P 표지된 33 염기 길이의 올리고뉴클레오타이드로 탐침시켰다. 2 x SSC/0.1% SDS (1 x SSC = 0.15 m NaCl/0.015 M 시트르산 나트륨, pH 7.4)중, 42℃에서 5분간 혼성화를 실시하고 1 x SSC/0.1 SDS중 50℃에서 10분간 2회 혼성화시켰다. 400개 재조합 클론중 4개는 양성이었다. 양성 재조합체의 곤충 생물분석은 AB88 또는 AB242 상층액의 독성에 필적하는 흑거세미 유충에 대한 독성을 나타내었다.
플라스미드 pCIB7104는 AB88 DNA의 4.5 Kb XbaI 단편을 함유한다. 서브클론을 살충 단백질의 코딩 영역을 정의하기 위해 작성되었다.
대장균 pCIB7105는 pCIB7104의 3.5 Kb XbaI-AccI 단편을 pBluescript에 클로닝함으로써 작성하였다.
플라스미드 pCIB7106은 AB424 DNA의 5.0 Kb EcoRI 단편을 함유하였다. 이 단편을 HincII로 분해하여 기능적 살충성 단백질을 코딩하는 2.8 kb EcoRI-HincII 삽입물(pCIB7107)로 만들었다.
AB88로 부터 양성 재조합 클론인 pCIB7104의 뉴클레오타이드 서열 및 AB424로 부터 양성 재조합 클론인 pCIB7107의 뉴클레오타이드 서열은 생거 일행의 디데옥시 말단 방법,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-5467 (1977)에 따라서 PRISM 레디 리엑션 다이 데옥시 터미네이터 사이클 서열결정 키트(Ready Reaction Dye Deoxy terminator Cycle Sequencing Kits) 및 PRISM Sequenase?터미네이터 이중가닥 DNA 서열결정 키트를 이용하여 측정하며 ABI 373 자동 서열분석기를 이용하여 분석하였다.
클론 pCIB7104는 코딩 영역이 SEQ ID NO: 28에 기재된 VIP3A(a) 유전자를 함유하며 코딩된 단백질 서열은 SEQ ID NO: 29에 기재되어 있다. 옥수수에서 고도로 발현되도록 디자인된 코딩 영역의 합성 버젼은 SEQ ID NO: 30에 기재되어 있다. SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 하여 다수의 합성 유전자가 디자인될 수 있다.
클론 pCIB7107은 코딩 영역이 SEQ ID NO: 31에 기재된 VIP3A(b) 유전자를 함유하며 코딩된 단백질 서열은 SEQ ID NO: 32에 기재되어 있다. pCIB7104 및 pCIB7107은 모두 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀(NRRL)에 수탁번호 NRRL B-21422 및 B-21423으로 각각 기탁되어 있다.
VIP3A(a) 유전자는 뉴클레오타이드 732 내지 3105에 이르는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유한다. 이 ORF는 88,500 달톤의 분자량에 상당하는 791 아미노산의 펩티드를 코딩한다. 샤인-달가노(SD) 서열은 제 1 메티오닌 앞의 6개 염기에 존재하며 그의 염기는 바실루스에 대한 강한 SD를 정의한다.
VIP3A(b) 유전자는 VIP3A(a)와 98% 동일하다.
AB88 바실루스 투린지엔시스 세포로 부터 단리된 전체 DNA의 블로스트를 VIP3A-살충성 단백질의 N-말단 영역에 걸친 33 베이스 단편으로 탐침처리시키고 단일의 밴드를 상이한 제한 분해물에서 관측할 수 있다. 그 결과는 유전자의 코딩 영역에 걸친 대형 탐침을 사용하여 확인하였다. GenBank 데이타 베이스의 서치는 공지된 단백질과 상동성을 나타내지 않았다.
실시예 18C. VIP3A 살충성 단백질의 발현
VIP3A(a) 살충성 단백질을 발현시키는데 필요한 시간은 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 바실루스 투린지엔시스 Ab88 배양물의 샘플은 그의 생장곡선 및 포자형성을 통하여 채취하였다. VIP3A(a) 살충성 단백질은 로그상 동안은 배양을 개시한지 15시간 정도에서 AB88 배양물의 상층액에서 확인되었다. 정상기의 초기 단계 동안 최대 수준에 도달하며 포자 형성하는 동안 및 포자 형성후에는 높은 양으로 유지되었다. AB424 바실루스 세레우스 배양물의 상층액을 사용했을 때에도 유사한 결과를 얻을 수 있다. VIP3A(a) 살충성 단백질의 양은 노던 블럿에 의해 측정된 바와 같은 VIP3A(a) 유전자의 발현에 영향을 준다. 포자 형성의 개시는 직접적인 현미경 관찰에 의해 측정되며 세포 펠릿중에서 δ-내독소의 존재를 분석함으로써 결정될 수 있다. Cry-I 유형 단백질은 정상기, 포자형성하는 동안 및 포자 형성후에 검출될 수 있다.
실시예 18D. 혼성화에 의한 신규 VIP3-유사 유전자의 동정
단리된 AB88로 부터 VIP3A(a)과 관련된 유전자를 함유하는 바실루스를 동정하기 위하여, 바실루스 단리물의 콜렉숀을 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 463 바실루스 균주의 배양물을 포자형성할 때 까지 마이크로티터 웰에서 생장시켰다. 96개 핀 콜로니 스탬펠을 사용하여 배양물을 L-한천을 함유하는 150 mm 플레이트로 옮겼다. 배양된 플레이트를 30℃에서 10시간 동안 유지시킨 다음 4℃에서 철야로 배양하였다. 콜로니를 나일론 필터에 블로팅하고 1.2 Kb HindIII VIP3A(a) 유래 단편으로 탐침처리시켰다. 62℃에서 마니아티스 일행이Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982)에 기재한 혼성화 조건을 이용하여 철야로 혼성화를 실행하였다. 필터를 2 x SSC/0.1% SDS를 사용하여 62℃에서 세척하고 또 X-선 필름에 노출시켰다.
스크리닝한 463개 바실루스 균주중 60개가 혼성화에 의해 검출될 수 있는 VIP3-유사 유전자를 함유한다. 이들(AB6 및 AB426)의 특징은 이들의 상층액이 흑거세미에 대하여 활성인 VIP3 단백질과 유사한 BCW 살충성 단백질을 함유한다는 것을 제시한다.
실시예 18E. Cryptic VIP3-유사 유전자를 함유하는 바실루스 투린지엔시스 균주 M2194의 특징화
M2194로 표시된 바실루스 투린지엔시스 균주는 실시예 18C에 기재된 바와 같이 콜로니 혼성화에 의해 VIP3-유사 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. M2194 VIP3 유사 유전자는 세균 생장을 통하여 AB88로 부터 단리된 VIP3A(a) 단백질에 대하여 생긴 폴리클로날 항체를 사용하는 면역블러팅 분석법에 의하거나 또는 실시예 3에 기재된 바와 같이 생물분석법에 의해 세균 생장 상 동안 아무런 발현을 하지않기 때문에 잠재성인 것으로 생각되고 있다.
정제된 VIP3A(a) 살충성 단백질에 대한 항혈청은 토끼에서 생산되었다. 니트로셀룰로오스-결합 단백질(50 ㎍)을 DMSO에 용해시키고 프로인트 완전 보조제(디프코 제조)로써 유화시켰다. 2마리 토끼에 3개월 동안 매월 피하 주사시켰다. 이들을 제 2 및 제 3 주사후 10일 동안 출혈시키고 그 혈청을 혈액 샘플로 부터 회수하였다[해로우 일행 (1988): Antibodies: A Laboratory Manual (콜드 스프링 하버 랩 프레스, 플레인뷰, 뉴욕)].
M2194 VIP3-유사 유전자를 실시예 9에 기재된 바와 같이 pKS에 클로닝하여 pCIB7108을 제조하였다. M2194 VIP3 유전자를 포함하는 pCIB7108을 함유하는 대장균은 흑거세미에 대하여 활성을 나타내며 또 상기 유전자는 살충 활성을 갖는 기능적 단백질을 코딩한다는 것을 나타낸다. 플라스미드 pCIB7108은 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀(NRRL)에 수탁번호 NRRL B-21438로 기탁되어 있다.
실시예 18F. VIP3A 단백질의 살충 활성
VIP3A 살충성 단백질의 활성 스펙트럼은 VIP*A 유전자를 함유하는 재조합 대장균을 유충으로 생장시키는 곤충 생물분석법으로 정량 측정하였다. 이들 시험에서, VIP3A(a) 및 VIP3A(b) 유전자를 함유하는 세포는 아그로티스 입실론, 스포도프테라 프루지페르다, 스포도프테라 엑시구아, 헬리오티스 비레스센스 및 헬리코베르파 제아에 대하여 살충성이었다. 동일한 실험 조건하에서, VIP3A 단백질을 함유하는 세균 추출물은 오스트리니아 누빌라리스에 대하여 활성을 나타내지 않았다.
아그로티스 입실론 유충에 대한 VIP*A 살충성 단백질의 효과
처리 (%) 치사율
TB 배지 5
AB88 상층액 100
Ab424 상층액 100
완충액 7
대장균 pKS 10
대장균 pCIB7104 (AB88) 100
대장균 pCIB7105 (AB88) 100
대장균 pCIB7106 (AB424) 100
대장균 pCIB7107 (AB424) 100
나비목 곤충 유충에 대한 VIP3A 살충 단백질의 효과
처리 곤충 % 치사율
대장균 pKS BCW 10
FAW 5
BAW 10
TBW 8
CEW 10
ECB 5
대장균 pCIB7105
대장균 pCIB7107 BCW 100
FAW 100
BAW 100
TBW 100
CEW 50
ECB 10
BCW = 흑거세미; FAW = 가을 멸강나방; BAW = 사탕무우 멸강나방
TBW = 담배 싹 벌레; CEW = 옥수수 이삭 벌레; ECB = 유로피언 옥수수
조명충 나방
실시예 19. 기타 바실루스 종의 단리 및 생물학적 활성
영양 생장하는 동안 살충 활성을 갖는 단백질을 생산하는 기타 바실루스 종을 단리하였다. 표준 방법에 의해 주위 샘플로 부터 이들 균주를 단리하였다. 단리물을 실시에 2 및 3에 각기 기재한 바와 같이 생물분석용으로 준비하였다. 생물분석에서 아그로티스 입실론에 대하여 활성을 갖는 영양 생장 하는 동안 살충 단백질을 생산하는 단리물을 이하의 표에 나타낸다. δ-내독소 결정의 존재와 영양 살충 단백질 생산 사이에는 아무런 상관관계가 없다.
----------------------------------------------------------------
바실루스 단리물 δ-내독소 결정의 존재 % 치사율
----------------------------------------------------------------
AB6 + 100
AB53 _ 80
AB88 + 100
AB195 - 60
AB211 - 70
AB217 - 83
AB272 - 80
AB279 - 70
AB289 + 100
AB292 + 80
AB294 - 100
AB300 - 80
AB359 - 100
----------------------------------------------------------------
단리물 AB289, AB294 및 AB359는 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀(NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21227, NRRL B-21229 및 NRRL B-21226으로 각각 기탁되어 있다.
영양생장하는 디아브로티카 비르기페라 비르기페라에 대하여 활성을 갖는 살충성 단백질을 생산하는 바실루스 단리물을 이하의 표에 나타낸다.
-----------------------------------------------------
바실루스 단리물 δ-내독소 결정의 존재 % 치사율
------------------------------------------------------
AB52 - 50
AB59 - 71
AB68 + 60
AB78 - 100
AB122 - 57
AB218 - 64
AB256 - 64
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단리물 AB59 및 AB256은 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21228 및 NRRL B-21230으로 각각 기탁되어 있다.
실시예 20. 혼성화에 의해 VIP1/VIP2 유사 유전자의 동정
AB78의 VIP1A(a)/VIP2A(a) 영역에서 발견되는 것과 관련된 유전자를 함유하는 균주를 동정하기 위하여, 바실루스 균주의 콜렉숀을 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 463 바실루스 균주의 독립 배양액을 96개 웰 마이크로티터 접시(전체 5개 플레이트)에서 배양액이 포자 형성할 때 까지 배양하였다. 시험 균주중, δ-내독소 결정의 존재 또는 부재를 기초로하여 288개가 바실루스 투린지엔시스로 확인되며 175개는 바실루스 종으로 확인되었다. 각 마이크로티터 접시에서, 96-핀 콜로니 스탬퍼를 사용하여 약 10 ㎕의 포자 배양액을 L-한천을 함유하는 2개의 150 mm 플레이트로 전달하였다. 접종된 플레이트를 30℃에서 4 내지 8시간 동안 생장시킨 다음 4℃로 냉각시켰다. 콜로니를 나일론 필터로 옮기고 이 기술분야에서 공지된 표준 방법에 의해 세포를 용균시켰다. 필터를 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) DNA 서열 모두를 함유하는 DNA 단편으로 부터 생성된 DNA 탐침에 혼성화시켰다. 혼성화는 처치 및 길버트(처치, 지.엠., 및 더블유. 길버트, PNAS, 81: 1991-1995 (1984))에 의한 혼성화 조건을 이용하여 65℃에서 철야로 실시하였다. 필터를 65℃에서 0.1% SDS를 함유하는 2 x SSC로 세척하고 X-선 필름에 노출시켰다.
스크리닝될 463개 바실루스 균주중, 55개 균주가 VIP1A(a)/VIP2A(a) 탐침에혼성화되는 것으로 동정되었다. DNA를 이들 22개 균주로 부터 단리하고 서던 블럿을 이용하여 VIP1A(a)/VIP2A(a) DNA를 탐침으로 사용하여 분석하였다. 이들 균주를 서던 블럿 패턴을 기준으로 하여 8개 종류로 나누었다. 각 종류는 AB78로 부터 서던 블럿 패턴에서 상이하였다. 1개 종류는 바실루스 투린지엔시스 변종 테네브리오니스로 부터의 VIP1A(a)/VIP2A(a) 상동물과 유사한 패턴을 가지고 있었다. (이하 참조). 22개 균주 각각을 서부 옥수수 뿌리벌레(WCRW)에 대한 활성에 대하여 시험하였다. 3개 균주, AB433, AB434 및 AB435는 WCRW에 대하여 활성인 것으로 밝혀졌다. VIP2A(a) 항혈청을 사용한 웨스턴 블럿 분석법은 균주 AB6, AB433, AB434, AB435, AB444 및 AB445가 VIP2A(a)와 동일한 크기의 단백질을 생산함을 나타내었다.
실시예 15에 기재된 바와 같이 흑거세미(아그로티스 입실론)에 대하여 활성인 VIP를 생산하는 바실루스 투린지엔시스 균주 AB6(NRRL B-21060)가 눈에 띄는 균주로 확인되었다. VIP2A(a)에 대한 폴리클로날 항혈청 및 VIP1A(a)에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용한 웨스턴 블럿 분석법은 AB6이 VIP2A(a) 및 VIP1A(a)와 유사한 단백질을 생산함을 나타낸다. 따라서, AB6은 VIP1A(a) 및 VIP2A(a)와 유사한 VIP를 함유할 수 있지만, 상이한 살충활성 스펙트럼을 갖는다.
실시예 21. 바실루스 투린지엔시스 변종 테네브리오니스로 부터 VIP1A(a)/VIP2A(a) 상동물의 클로닝
앞서 몇개 특징화된 바실루스 균주를 서던 블럿 분석법에 의해 VIP1A(a)/VIP2A(a)에 유사한 DNA의 존재 여부에 대하여 시험하였다. 바실루스 투린지엔시스 균주 AB78, AB88, GC91, HD-1 및 ATCC 10876으로 부터 얻은 DNA를 VIP1A(a)/VIP2A(a) 유사 서열의 존재에 대해 분석하였다. Bt 균주 GC91 및 HD-1 및 BC 균주 ATCC 10876으로 부터 DNA는 VIP2A(a)/VIP1A(a) DNA와 혼성화되지 않으므로 이들이 VIP1A(a)/VIP2A(a) 유전자와 유사한 DNA 서열을 갖지 않음을 지시한다. 유사하게, 살충성 균주 AB88로 부터 DNA(실시예 16)는 VIP1A(a)/VIP2A(a) DNA 영역과 혼성화되지 않는데 이는 이 균주에 의해 생산된 VIP 활성이 VIP1A(a)/VIP2A(a) 상동체로 부터 기인한 것이 아니라는 것을 제시한다. 이와 대조적으로, 바실루스 투린지엔시스 변종 테네브리오니스(Btt)는 VIP1A(a)/VIP2A(a) 영역과 혼성화되는 서열을 함유하였다. 또한 이들의 분석은 Btt가 VIP1A(a)/VIP2A(a) 유사 서열을 함유하는 것을 확인시켜주었다.
VIP2A(a) 및 VIP1A(a)의 Btt 상동체를 확인하기 위하여, 이들 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. 9.5 kb Eco RI 제한 단편으로 확인된 서던 블럿 분석은 상기 상동체에 대한 코딩 영역을 함유할 것이다. 게놈 DNA를 EcoRI으로 분해시키고,약 9.5 kb 길이의 DNA 단편을 겔 정제하였다. 이 DNA를 EcoRI으로 분해된 pBluescript SK(+)에 결찰시키고 대장균으로 형질전환시켜 플라스미드 라이브러리를 생성하였다. 약 10,000개의 콜로니를 VIP2A(a) 상동 서열 존재에 대하여 콜로니 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 28개 양성 콜로니를 동정하였다. 28개 클론이 동일하였고 또 VIP1A(a)/VIP2A(a) 상동체를 함유하였다. 클론 pCIB7100은 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21322로 기탁되어 있다. pCIB7100으로 부터 몇개의 서브클론을 작성하였다. pCIB7100으로 부터 3.8 kb XbaI 단편을 pBluescript SK(+)에 결찰시켜 pCIB7101을 수득하였다. pCIB7100으로 부터 1.8 kb Hind III 단편 및 1.4 kb Hind III 단편을 pBluescript SK(+)에 결찰시켜 pCIB7102 및 pCIB7103을 각각 수득하였다. 서브클론 pCIB7101, pCIB7102 및 pCIB7103은 미국 61604 일리노이, 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페턴트 컬쳐 콜렉숀, (NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 수탁번호 NRRL B-21323, B-21324 및 B-21325로 각각 기탁되어 있다.
VIP2A(a)/VIP1A(a) 상동체를 함유하는 pCIB7100의 영역의 DNA 서열은 디데옥시 사슬 종결법(생거 일행, 1977, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)에 의해서 측정하였다. 반응은 PRISM 레디 리엑션 다이 데옥시 터미네이터 사이클 서열결정 키트 (PRISM Ready Reaction Dye Deoxy terminator Cycle Sequencing Kits) 및 PRISM Sequenase?터미네이터 이중가닥 DNA 서열결정 키트를 사용하여 결정하며 ABI 373 오토매틱 서열분석기상에서 분석하였다. 커스텀 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 특정 영역에서 DNA 서열을 측정하였다. 이 영역의 DNA 서열을 SEQ ID NO: 19에 나타낸다.
SEQ ID NO: 19에 도시한 4 kb 영역은 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하며, 이들은 각기 균주 AB78로 부터 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 단백질과 고도의 유사성을 갖는 단백질을 코딩한다. 표준 명명법을 이용하여 VIP2A(b)로 표시된VIP2A(a) 상동체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:20에서 찾을 수 있고 또 표준 명명법을 따라서 VIP1A(b)로 표시되는 VIP1A(a) 상동체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 21에 기재되어 있다. 이 VIP2A(b) 단백질은 AB78로 부터 VIP2A(a)에 대해 91% 아미노산 상동성을 나타낸다. 2개의 VIP2 단백질의 아미노산 서열의 배열은 표 20에 제시되어 있다. ViP1A(b)단백질은 AB78로 부터 VIP1A(a)에 대하여 77% 아미노산 상동성을 나타낸다. 이들 2개 VIP1 단백질의 배열은 표 21에 제시되어 있다. 표 21에 제시된 배열은 AB78로 부터 VIP1A(b) 및 VIP1A(a) 사이의 유사성을 기재하고 있다. 상기 배열은 2개의 VIP1 다낵질의 아미노 말단 영역이 카르복시 말단 영역에서 보다 아미노 말단 영역에서 훨씬 높은 아미노산 상동성을 갖는다는 것을 나타낸다. 사실, 2개 단백질의 아미노 말단의 2/3(표 21에 제시된 VIP1A(b)의 아미노산 618 까지)는 91% 상동성을 갖는 반면에, 카르복시 말단 1/3 (VIP1A(b)의 아미노산 619-833)은 35% 상동성을 나타낸다.
웨스턴 블럿 분석은 바실루스 투린지엔시스 변종 테네브리오니스(Btt)가 VIP1A(a) 유사 및 VIP2A(a) 유사 단백질을 모두 생산한다는 것을 제시한다. 그러나, 이들 단백질은 웨스턴 옥수수 뿌리 벌레에 대하여 활성을 나타내지 않는 것으로 보인다. 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성에 대한 생물분석은 Btt 또는 대장균 클론 pCIB7100으로 부터 24 시간 배양 상층액(VIP1A(a)/VIP2A(a) 상동체의 전체 영역을 함유)을 사용하여 실시하였다. 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대한 활성은 어떤 경우에서든 관찰되지 않았다.
Btt 및 AB78의 VIP2 단백질 사이의 유사성을 고려하여, AB78로 부터VIP2A(a)를 치환하기 위한 Btt로 부터 VIP2A(b)의 능력을 시험하였다. pCIB6206을 함유하는 세포(AB78VIP1A(a)를 생산하지만 VIP2A(a)단백질은 생산하지 않음)를 Btt 배양 상층액과 혼합하고 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성을 시험하였다. Btt 배양 상층액 및 pCIB6206을 함유하는 세포도 WCRW에 대하여 아무런 활성을 나타내지 않았지만, Btt 및 pCIB6206의 혼합물을 WCRW에 대하여 높은 활성을 나타내었다. 또한 부가적 생물분석은 Btt 클론 pCIB7100은 대장균중의 Btt VIP1A(b)/VIP2A(b) 유전자를 함유하고 또 pCIB6206과 혼합되면 WCRW에 대하여 활성을 제공함을 나타낸다. 따라서 Btt에 의해 생산된 VIP2A(b) 단백질은 AB78에 의해 생산된 VIP2A(a) 단백질에 대하여 기능적 등가물이다.
따라서, 혼성화 탐침으로 VIP DNA를 사용함으로써 살충 활성을 갖는 신규 균주를 확인하는 능력을 나타내었다. 또한 VIP1A(a)/VIP2A(a) 유사 서열을 함유하는 바실루스 균주는 VIP1A(a)/VIP2A(a) 유사 단백질을 생산하지만, 상이한 곤충 해충에 대하여 독성을 나타낸다. 유사한 방법은 VIP1/VIP2 족의 많은 멤버를 확인할 수 있다. 또한 유사한 방법을 사용하면 다양한 종류의 VIP(예컨대 AB88로 부터 VIP)의 동종체를 확인할 수 있다.
[표 20]
바실루스 투린지엔시스 변종 테네브리오니스 (VIP2A(b)) 대 AB78(VIP2A(a))로 부터VIP2 아미노산 서열의 정렬
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 21]
바실루스 투린지엔시스 변종 테네브리오니스(VIP1A(b)) 대 AB78(VIP1A(a))로 부터 VIP1 아미노산 서열의 정렬
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 22. 단일 폴리펩티드를 제조하기 위한 VIP 단백질의 융합
VIP 단백질은 단일 폴리펩티드 또는 2개 또는 그 이상의 상호작용 폴리펩티드로서 천연적으로 생산될 수 있다. 활성 VIP가 2개 이상의 상호작용성 단백질 사슬로 구성되면, 이들 단백질 사슬은 2개(그 이상) VIP 코딩 영역의 융합으로 생긴 유전자로 부터 단일 폴리펩티드 사슬로서 생산될 수 있다. 2개 사슬을 코딩하는 유전자는 유전자의 코딩 영역을 통합함으로써 VIP 폴리펩티드를 코딩하는 단일 오픈 리딩 프레임을 생성한다. 복합체 폴리펩티드는 융합되어 융합 단백질의 NH2말단으로서 소형 폴리펩티드를 생성할 수 있거나, 또는 이들은 융합되어 융합 단백질의 NH2말단으로서 대형의 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 링커 영역은 2개의 폴리펩티드 영역 사이에 경우에 따라 사용될 수 있다. 이러한 링커는 이 기술분야에 공지되어 있다. 이 링커는 경우에 따라 단일 융합 폴리펩티드가 목적하는 곤충에 의해 분해되면 링커 영역을 활성 VIP 분자의 2개 폴리펩티드 성분을 방출하도록 프로테아제 절단 부위를 함유하도록 고안될 수 있다.
바실루스 세레우스 균주 AB78로 부터 VIP1A(a) 및 VIP2A(a)는 이들의 코딩 영역을 융합시킴으로써 융합되어 단일 폴리펩티드를 형성한다. 생성한 DNA는 SEQ ID NO: 22에 제시된 서열을 포함하며 SEQ ID NO: 23에 제시된 단백질을 코딩한다. 유사하게, 기타 융합 단백질도 생산될 수 있다.
VIP1A(a) 및 VIP2A(a)를 코딩하는 유전자의 융합은 분자 생물학의 표준 수법을 이용함으로써 실시할 수 있다. VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 코딩 영역 사이에서 삭제된 뉴클레오타이드는 공지된 돌연변이 수법을 이용하여 결실될 수 있거나, 이와 다르게는 코딩 영역은 PCR 수법에 의해 융합될 수 있다.
융합된 VIP 폴리펩티드는 합성 유전자 또는 부분적 합성 유전자를 사용하여 다른 생물에서 발현될 수 있거나, 또는 다른 숙주에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. 예컨대 상기로 부터 융합된 VIP 폴리펩티드를 옥수수에서 발현시키기 위하여, 각 아미노산에 대한 옥수수 우선 코돈을 이용하여 합성유전자를 제조할 수 있다. 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 EP-A-0618976호 참조. 이들 방법에 따라 제조된 합성 DNA 서열은 SEQ ID NO: 17(100 kDa VIP1A(a) 코딩 서열의 옥수수 최적화된 서열), SEQ ID NO: 18 (80 kDa VIP1A(a) 코딩 서열의 옥수수 최적화된 서열) 및 SEQ ID NO: 24 (VIP2A(a)코딩 서열의 옥수수 최적화된 서열)에 기재되어 있다.
옥수수에서 발현되기에 최적화된 합성 VIP 및 VIP2 유전자는 PCR 수법에 의해 융합될 수 있거나, 또는 합성 유전자는 통상의 제한 부위에서 융합되도록 고안될 수 있다. 이와 다르게는, VIP1 및 VIP2 영역으로 구성된 단일 폴리펩티드를 코딩하도록 합성 융합 유전자가 고안될 수 있다.
융합 단백질의 VIP1 및 VIP2 영역 사이의 펩티드 링커를 부가하는 것은 PCR 돌연변이법, 링커 펩티드를 코딩하는 합성 DNA 링커를 사용하거나, 또는 이 기술분야에서 공지된 다른 방법에 의해 달성될 수 있다.
융합 VIP 폴리펩티드는 1개 이상의 결합 영역으로 구성될 수 있다. 1개 이상의 결합 영역이 융합되어 사용되면, 이러한 융합을 이용하여 다수의 표적 해충을 방제할 수 있다. 기타 결합 영역은 모든 또는 일부의 VIP; 바실루스 투린지엔시스 내독소 또는 이들의 일부; 또는 이러한 결합 단백질로 부터 유도된 표적 해충 또는 적합한 결합 영역과 결합할 수 있는 기타 단백질을 사용함으로써 수득할 수 있다.
N-말단에 있는 VIP2A(a) 및 C-말단에 있는 VIP1A(a)를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬 융합물을 코딩하는 옥수수 최적화된 DNA 서열을 포함하는 융합작성물의 일례는 pCIB5531에 의해 제공된다. 펩티드 서열 PSTPPTPSPSTPPTPS(SEQ ID NO: 47)을 갖는 링커를 코딩하는 DNA 서열을 2개의 코딩 영역 사이에 삽입하였다. 이 링커를코딩하는 서열 및 관련 클로닝 부위는 5'-CCC GGGCCT TCT ACT CCC CCA ACT CCC TCT CCT AGC ACG CCT CCG ACA CCT AGCGAT ATC GGA TCC-3' (SEQ ID NO: 48) 이다. 상부 및 하부 가닥을 대표하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 pUC 벡터에 클로닝한 다음 혼성화시키고 표준 과정에 의해 인산화시켰다. PCR을 이용하여 VIP2A(a)중의 중지 코돈을 제거하고 BglII제한 부위를 Sma I 부위로 대체하였다. pCIB5522(실시예 24)로 부터의 VIPA(a) 유전자의 Bam HI/PstI 단편, VIP2A(a) 유전자(pCIB5522를 작성하기 위해 사용된 것과 동일)의 PstI- 말단 단편을 함유하는 PCR 단편, 5' 말단에서 무딘 부위 및 3' 말단에서 BamHI 부위와 결찰될 수 있는 말단을 갖는 합성 링커 및 이하에 나타낸 pCIB5526(SEQ ID NO: 35 참조)으로 부터 개질된 합성 VIP1A(a)를 결찰시킴으로써 번역 융합물을 제조하였다. 이 융합은 4가지 방법 결찰에 의해 번역 중지 코돈을 갖지 않고 바실루스 분비 시그널이 없는 VIP1A(a) 코딩 영역과 링커를 갖는 VIP2A(a) 유전자를 함유하는 플라스미드를 생성한다. 상기 작성물에 대한 DNA 서열은 SEQ ID NO: 49에 기재되어 있고 SEQ ID NO: 50에 기재된 융합 단백질을 코딩한다. VIP1A(a)가 N-말단이고 또 VIP2A(a)가 C-말단에 존재하는 단일 폴리펩티드 융합물이 유사한 방식으로 제조될 수 있다. 또한 독소 코딩하는 유전자 또는 리포터 유전자와 같은 기타 분자에 5' 또는 3' 말단에서 링커를 갖거나 갖지 않는 번역 융합물에서 하나 또는 2개의 유전자가 연결될 수 있다.
실시예 23. 식물 기관으로 VIP2를 보내기
유전자 산물을 내보내기 위한 다양한 메카니즘이 식물에 존재하는 것으로 알려져 있고 또 이들 메카니즘의 작용을 제어하는 서열들이 자세하게 특징화되어 있다. 예컨대, 유전자 산물을 엽록체로 보내는 것은 다양한 단백질의 아미노 말단에서 발견되는 시그널 서열에 의해 제어된다. 이 시그널은 엽록체로 이동하는 동안 절단되어 성숙 단백질을 수득한다(예컨대 코마이 등, J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). 이들 시그널 서열들은 VIP2와 같은 이질 유전자 산물과 융합되어 상기 산물을 엽록체로 이동하는 것에 영향을 준다(반덴 브로에크 등, Nature 313: 358-363 (1985)). 적합한 시그널 서열을 코딩하는 DNA는 RUBISCO 단백질, CAB 단백질, EPSP 합성효소, GS2 단백질 및 기타 엽록체에 존재하는 것으로 공지된 많은 단백질을 코딩하는 dCNA의 5' 말단으로 부터 단리할 수 있다.
다른 유전자 산물은 미토콘드리아 및 퍼옥시좀과 같은 기타 기관에 위치한다(예컨대 웅거 등, Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). 이들 산물을 코딩하는 cDNA는 VIP2와 같은 이질 유전자 산물을 이들 기관으로 보내기 위해 조작될 수 있다. 이러한 서열의 예는 핵 코딩된 ATPase 및 미토콘드리아에 대한 특정 아스타탐 아미노 전달효소 이소폼이다. 유사하게 세포성 단백질체로 보내는 것은 로저 등에 의해 Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 6512-6516(1985)에 기재되어 있다.
상술한 적합한 표적 서열을 VIP2와 같은 코딩 서열과 융합함으로써 임의 기관 또는 세포 구획으로 직접적으로 트랜스진 산물을 보낼 수 있다. 엽록체를 표적으로 할 경우, 예컨대 RUBISCO 유전자, CAB 유전자, EPSP 합성효소 유전자 또는 GS2 유전자로 부터의 엽록체 시그널 서열을 트랜스진의 아미노 말단 ATG에 융합시킨다. 선택한 시그널 서열은 공지된 절단 부위를 가져야하고 또 융합 작성물은 분해에 필요한 분해 부위 뒤에 임의의 아미노산을 고려해야한다. 일부 경우 상기 요건은 분해 부위와 개시 코돈 ATG 사이에 소량의 아미노산을 부가함으로써 충족될 수 있거나, 또는 코딩 서열 사이의 일부 아미노산을 치환시킴으로써 충족될 수 있다. 엽록체를 표적으로하여 작성된 융합물은 바레트 등에 의해 에델만 등(편찬) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, 1081-1091 페이지 (1982); 와스만 등, Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)에 의해 기재된 수법을 이용하여 전사된 작성물에서 시험관 번역에 이어 엽록체 흡수를 통한 흡수된 엽록체의 효율을 시험할 수 있다. 이들 작성 수법은 이 기술분야에 공지되어 있고 미토콘드리아 및 퍼옥시좀에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.
상술한 세포 표적 메카니즘은 원래의 프로모터와 함께 사용될 수 있을 뿐더러 표적 시그널이 유도하는 프로모터의 발현 패턴과는 상이한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 전사 조절하에서 특정 세포 표적 목표를 실시하도록 이질 프로모터와 함께 사용될 수 있다.
분비 시그널을 코딩하는 DNA 서열은 천연 바실루스 VIP2 유전자에 존재한다. 이 시그널은 LKITDKVEDF (SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 57 내지 66)의 N-말단 서열을 갖는 성숙 단백질에서는 존재하지 않는다. VIP2는 조작되어 식물 세포 밖으로 분비되거나 또는 소포체, 액포, 미토콘드리아 또는 엽록체를 비롯한 색소체와 같은 아세포성 기관으로 보내질 수 있다. 분비 시그널 펩티드를 마커 유전자와 융합함으로써 제조된 하이브리드 단백질은 분비 경로를 통하여 성공적으로 이동되어왔다(Itirriaga G 등,The Plant Cell,1: 381-390 (1989), 데네케 등,The Plant Cell,2: 51-59 (1990)). 아미노 말단 서열은 알레우론 세포로 부터 ER, 아포플라스트 및 세포외 분비시키는데 관련된 것으로 확인되었다.
소포체 또는 액포에 단백질이 함유되기 위해서는 추가적인 시그널이 필요로하다. 소포체에 함유되기 위해서는 단백질의 카르복시 말단에 펩티드 서열 KDEL/HDEL이 필요하다(펠함의 논문,Annual Review Cell Biol.5:1-23 (1989)). 액포에서 단백질을 보유시키기 위한 시그널도 또한 특징화되어 있다. 액포 표적 시그널은 표적 단백질의 아미노 말단부(홀베르다 등,The Plant Cell, 4: 307-318 (1992), 나카무라 등,Plant Physiol.101: 1-5 (1993)), 카르복시 말단부 또는 내부 서열(타구에 등,The Plant Cell, 4: 307-318 (1992), 살바흐 등,The Plant Cell, 3: 695-708 (1991))에 존재할 수 있다. 추가적으로, 카르복시 말단과 조합된 아미노 말단 서열은 유전자 산물을 액포로 보내는데 관여한다(신시 등, Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)). 유사하게, 단백질은 특정 카르복시 말단 시그널 펩티드 융합물을 사용함으로써 미토콘드리아 또는 색소체로 보내질 수 있다(헤이진 등,Eur. J. Biochem., 180: 535-545 (1989), 아르케 및 케그스트라에 의해Plant Molecular Biology, 23: 1105-1115 (1993)).
VIP2를 분비시키거나 또는 다양한 세포이하 구조의 기관으로 이동시키기 위하여, 공지의 시그널 펩티드를 코딩하는 옥수수 최적화된 DNA 서열은 필요에 따라 유전자의 5' 또는 3' 말단에 존재하도록 고안될 수 있다. VIP2를 세포 밖으로 분비시키기 위해서는 PCT 출원번호 IB95/00497호 또는 기타 문헌(이티리아가 등,ThePlant Cell, 1: 381-390 (1989), 데네케 등,The Plant Cell, 2: 51-59 (1990))에 기재된 진핵성 분비 시그널 펩티드 MGWSWIFLFLLSGAAGVHCL (SEQ ID NO: 25)를 코딩하는 DNA 서열이 완전 VIP2 유전자 서열의 5' 말단에 부가될 수 있거나 또는 성숙 단백질을 코딩하도록 절단된 서열 또는 뉴클레오타이드 286에서 절단되거나 또는 아미노산 잔기 94(메티오닌)에서 개시되는 단백질을 코딩하도록 절단된 유전자에 부가될 수 있다. 소포체에 포함될 VIP2를 표적으로 하기 위해, 분비 시그널 이외에 ER 시그널 펩티드 KDEL/HDEL을 코딩하는 DNA 서열이 유전자의 3' 말단에 부가될 수 있다. 액포로 보내기 위해서는 시그널 펩티드 SSSSFADSNPIRVTDRAAST (SEQ ID NO: 3; 홀베르다 등,The Plant Cell, 4: 307-318 (1992))를 코딩하는 DNA 서열은 돔브로우스키 등에 의해The Plant Cell, 5: 587-596 (1993)에 기재된 바와 같이 카르복시 시그널 펩티드를 코딩하는 서열 또는 분비 서열 옆에 인접하도록 디자인될 수 있거나 또는 기능적 변형물이 유전자의 3' 말단에 삽입될 수 있다. 이와 유사하게, VIP2는 필요한 표적 시그널을 코딩하는 서열을 VIP2 서열에 삽입함으로써 엽록체를 비롯한 색소체 또는 미토콘드리아로 보내도록 디자인될 수 있다. VIP2에 존재하는 세균 분비 시그널은 최종 작성물에 포함될 수 있거나 제거될 수 있다.
VIP에 대한 코딩 서열에 융합된 진핵 분비 시그널을 혼입하는 작성물의 일례는 pCIB5528에 의해 제공된다. SEQ ID NO: 25의 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 서열의 상부 및 하부 스트랜드에 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하며 5'-GGATCCACC ATG GGC TGG AGC TGG ATC TTC CTG TTC CTG CTG AGC GGC GCC GCG GGC GTG CAC TGCCTGCAG-3' (SEQ IN NO: 41) 서열을 갖는다. 혼성화되면, 분비 시그널의 5'말단은 BamHI 및 PstI에 상응하는 점착 말단과 유사하였다. 이 올리고뉴클레오타이드를 혼성화하고 인산화시킨 다음 BamHI/PstI으로 분해된 pCIB5527에 표준 수법으로 결찰시켰다(실시예 23A에 기재된 작성). 생성한 옥수수 적합화된 코딩 서열은 SEQ ID NO: 43에 기재된 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 42에 기재되어 있다. 이 코딩된 단백질은 바실루스 분비 시그널 대신 진핵생물 분비 시그널을 포함한다.
VIP에 대한 코딩 서열에 융합된 액포 표적 시그널을 포함하는 작성물의 예는 pCIB5533에 의해 제공된다. SEQ ID NO:3의 액포 표적 펩티드를 코딩하는 서열의 상부 및 하부 스트랜드에 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였고 이것은 5'-CCG CGGGCG TGC ACT GCC TCA GCA GCA GCA GCT TCG CCG ACA GCA ACC CCA TCC GCG TGA CCG ACC GCG CCG CCA GCA CCC TGC AG-3' (SEQ ID NO: 44) 서열을 갖는다. 혼성화되면, 액포 표적 시그널의 5' 말단은 제한 부위 SacII 및 PstI에 상응하는 점착 말단과 유사하였다. 이 올리고뉴클레오타이드를 혼성화하고 인산화시킨 다음 SacII/PstI으로 분해된 pCIB5528에 표준 수법으로 결찰시켰다(상술한 바와 같이 작성). 생성한 옥수수 적합화된 코딩 서열은 SEQ ID NO: 46에 기재된 단백질을 코딩하는 SEQ ID NO: 45에 기재되어 있다. 이 코딩된 단백질은 진핵생물의 분비 시그널 이외에 액포 표적 펩티드를 포함한다.
VIP1 유전자는 유사한 과정에 의하여 서브세포성 기관으로 분비되거나 또는 표적화되도록 고안될 수 있다.
실시예 23A. VIP1A(a) 및 VIP2A(a)로 부터 바실루스 분비 시그널의 제거
VIP1A(a) 및 VIP2A(a)는 균주 AB78이 성정하는 동안 분비된다. 분비 시그널로 작용하는 이 펩티드 서열의 성질은 문헌(시모넨 및 팔바, Microbiological reviews, 페이지 109-137 (1993))에 기재되어 있다. 상기 문헌에 기재된 정보에 따라서, 가상의 분비 시그널을 양쪽 유전자에서 동정하였다. VIP1A(a)에서, 이 시그널은 아미노산 1-33으로 구성된다(SEQ ID NO: 5). 분비 시그널의 가공은 아미노산 33에 있는 세린 이후에 생긴다. VIP2A(a)에서 분비시그널은 아미노산 1-49(SEQ ID NO: 2)로 동정되었다. 이 분비된 성숙 VIP2A(a) 단백질의 N-말단 펩티드 분석은 N-말단이 LTITDKVEDFKEDK임을 나타내었다. 이 서열은 SEQ ID NO: 2중 아미노산 57에서 시작된다. 이들 단백질을 코딩하는 유전자는 바실루스 분비 시그널을 제거함으로써 개질하였다.
33개의 아미노산을 코딩하는 서열, 예컨대 5' 말단으로 부터 제거된 분비 시그널을 갖는 옥수수 최적화된 VIPA(a) 코딩 영역을 작성하였다. 이 개질은 5'-GGA TCC ACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC-3' (SEQ ID NO: 33) 서열을 함유하고 뉴클레오타이드 위치 100에서 옥수수 최적화된 유전자(SEQ ID NO: 26)와 혼성되고 BamHI 제한부위 및 진핵생물 번역 개시 부위 콘센서스 및 개시 코돈이 부가된 포워드 프라이머를 이용하여 PCR법으로 실시하였다. 5'-AAG CTT CAG CTC CTT G-3' (SEQ ID NO: 34) 서열을 포함하는 리버스 프라이머는 뉴클레오타이드 위치 507에서 상보적 가닥에서 혼성화된다. 5' 말단에서 제한 부위 Bam HI 또 3' 말단에서 HindIII 부위를 함유하는 527 bp 증폭 산물을 수득하였다. 이 증폭 산물을 T-벡터(실시예 24에 기재됨)로 클로닝하여 정확한 DNA 서열을 결정하였다. 제한분해에 의해 BamHI/HindIII 단편을 얻고 뿌리 선호 프로모터 카세트에 클로닝된 옥수수 최적화된 VIP1A(a) 유전자의 BamHI/HindIII 단편을 대체하였다. 수득한 작성물을 pCIB5526으로 표기하였다. 바실루스 분비 시그널이 제거된 VIP1A(a)에 대한 옥수수 최적화된 코딩 영역을 SEQ ID NO: 35로서 기재하며 코딩된 단백질을 SEQ ID NO: 36으로 기재되어 있다.
VIP2A(a)의 가공형태를 코딩하는 유전자, 즉 분비 시그널이 제거된 코딩 영역은 VIP1A(a)의 가공 형태를 작성하기 위해 사용된 방법과 유사한 방식으로 작성하였다. 포워드 프라이머 5'-GGA TCC ACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC AC-3' (SEQ ID NO: 37)를 이용하여 PCR법으로 개질하였다. 이 프라이머는 옥수수 최적화된 VIP2A(a) 유전자 (SEQ ID NO: 27)의 뉴클레오타이드 위치 150에서 혼성화된다. 이 프라이머의 뉴클레오타이드 위치 15에서 침묵 돌연변이를 삽입하여 PstI 제한부위를 수득하였다. 리버스 프라이머는 서열 5'-AAG CTT CCA CTC CTT CTC-3' (SEQ ID NO: 38)을 갖는다. 3' 말단에서 HindIII 제한부위로써 259 bp의 생성물을 수득하였다. 이 증폭 산물을 T-벡터에 클로닝하고 서열결정한 다음 옥수수 최적화 VIP2A(a)를 함유하는 BamHI/HindIII 분해된 뿌리 선호 프로머터 카세트에 결찰시켰다. 수득한 작성물을 pCIB5527로 명기하였다. 바실루스 분비 시그널이 제거된 VIP2A(a)에 대한 옥수수 최적화된 코딩 영역은 SEQ ID NO:39에 기재되어 있고 코딩된 단백질은 SEQ ID NO: 40에 기재되어 있다.
실시예 24. VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 옥수수 최적화된 유전자의 작성과 클로닝
디자인: 옥수수에서 가장 흔히 사용되는 코돈을 사용하여 천연의 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 단백질 서열을 역번역함으로써 옥수수 최적화된 유전자를 디자인하였다 (무레이 일행,Nucleic Acid Research, 17: 477-498 (1989)). 클로닝을 실행하기 위하여, 상기 DNA 서열을 매 200 내지 360 뉴클레오타이드 간격으로 독특한 제한부위를 삽입함으로써 개질시켰다. VIP1A(a)는 11개의 단편에 클로닝되게 고안되었고 또 VIP2A(a)는 5개 단편에 클로닝되었다. 개별 단편을 클로닝한 후, 인접하는 단편을 이들 단편에 공통인 제한 부위를 사용하여 결합시켜 완전한 유전자를 수득하였다. 각 단편을 클로닝하기 위하여, DNA의 상부 및 하부 가닥 모두를 표시하도록 올리고뉴클레오타이드(50 내지 85 뉴클레오타이드)를 고안하였다. 제 1 올리고 쌍의 상부 올리고는 다양한 올리고 쌍의 방향과 서열을 주어진 단편내에 들어가도록 인근 올리고쌍의 하부 가닥의 유사한 단일 가닥 영역과 상동인 3' 말단에 15bp의 단일 가닥 영역을 갖도록 고안되었다. 올리고는 단편을 나타내는 모든 올리고가 혼성화될 때, 말단이 형성될 특정 제한 부위에 상응하는 단일 가닥 영역을 갖도록 고안되었다. 각 올리고의 구조는 NBI 인코포레이티드가 제조한 OLIGO 프로그램을 사용하여 헤어핀 구조와 같은 안정한 이차 구조를 갖는지에 대해 조사하였다. 필요할 때 마다 뉴클레오타이드는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 주지 않고 이차 구조의 안정성을 감소시키도록 변화될 수 있다. 식물 리보솜 결합 부위 콘센서스 서열, TAACAATG(죠시 일행,Nucleic Acid Res. 15: 6643-6653 (1987)) 또는 진핵생물 리보솜 결합 부위 콘센서스 서열 CCACCATG(코자크,Nucleic Acid Research, 12: 857-872 (1984))를 유전자의 번역 개시 코돈에 삽입하였다.
클로닝: 올리고는 IDT 인코포레이티드가 제조한 것으로 동결건조된 분말 형태로 공급되었다. 이들을 200 μM 농도로 재현탁시켰다. 각 올리고 포름아미드30 ㎕에 최종 농도 25 내지 50%를 부가하고 또 노벡스로 부터 시판되고 있는 기성품인 10% 폴리아크릴아미드/우레아 겔상에서 분리하기 전에 2분간 가열하였다. 전기 영동시킨 후 겔을 형광 지시제를 함유하는 TLC 판에 놓고 이것을 자외선에 노출시킴으로써 올리고를 UV 샤도잉에 의해 검출하였다. 정확한 크기의 DNA를 함유하는 영역을 절단해내고 잘게 조각낸 겔 단편을 0.4 M LiCl, 0.1mM EDTA를 함유하는 완충액에서 철야로 배양하는 것에 의해 폴리아크릴아미드로 부터 추출하였다. Millipore UFMC 필터를 통하여 원심분리함으로써 겔 잔류물로 부터 DNA를 분리하였다. 추출된 DNA에 2 부피의 무수 알코올을 부가함으로써 에탄올 석출처리시켰다. 원심분리한 후 침전을 dH2O에 2.5 μM 농도로 현탁시켰다. 올리고를 혼성화시킨 다음 적합한 벡터와 결찰시키거나 또는 특정 단편에 대한 모든 올리고의 동량 혼합물을 주형으로 사용하고 말단 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 혼성화된 단편을 증폭시키는 것에 의해 단편을 클로닝하였다.
혼성화 및 결찰에 의한 클로닝: 동종 이중 가닥 올리고쌍은 각 올리고쌍의 상부 및 하부 올리고 5 μl를 1X 폴리뉴클레오타이드 키나제(PNK) 완충액(70 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨(DTT)), 50 mM KCl 및 5% 포름아미드를 최종 부피 50 μl로 함유하는 완충액과 혼합함으로써 수득하였다. 이 올리고를 10분간 끓인 다음 37℃ 또는 실온으로 서서히 냉각시켰다. TAE 완충계(Metaphore?; FMC)에서 4% 아가로오스상에서 분석하기 위해 10μl를 따로 두었다. 각 혼성화된 올리고쌍은 최종 1mM의 ATP, 최종 농도 100 μg/ml의 BSA 및200 단위의 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 1 μl의 10X PNK 완충액을 10 μl 부피로 부가함으로써 키나제처리하였다. 이어 혼성화 및 인산화시키고, 반응을 37℃에서 2시간동안 철야로 배양하였다. 특정 단편에 대한 올리고 쌍 10μl를 최종 부피 50μl로 혼합하였다. 올리고쌍을 80℃에서 10분간 가열함으로써 혼성화처리하고 37℃로 서서히 냉각시킴으로써 혼성화시켰다. 2μl의 올리고를 약 100ng의 적합한 벡터와 혼합하고 50 mM 트리스-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP를 함유하는 완충액을 사용하여 결찰처리하였다. 이 반응을 실온에서 2시간 동안 철야로 배양한 다음 대장균 DH5α 균주로 형질전환시키고 암피실린을 100 μg 농도의 암피실린을 함유하는 L-플레이트에 표준 방법으로 플레이팅하였다. 유니버살 프라이머 "리버스" 및 M13-20을 프라이머로 사용하여 EP-A-061 8976호에 기재된 PCR 미니스크린에 의해 양성 클론을 특징화하고 확인하였다. DNA를 적합한 효소로 분해시킨 다음 서열결정하는 것에 의해 양성 클론을 동정하였다. 기대한 DNA 서열을 갖는 재조합체를 다음 작업을 위해 선별하였다.
PCR 증폭 및 T-벡터로 클로닝:
특정 단편의 상부 및 하부 가닥을 나타내는 모든 올리고의 혼합물을 주형으로 하고 또 특정 단편에 대한 특정 말단 프라이머(최종 농도 2 μM), 200 μM의 각 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP, 10mM 트리스-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% 젤라틴 및 5 단위의 Taq 폴리머라제를 최종 반응 부피 50 μl로 사용하여 PCR 증폭반응을 실시하였다. 이 증폭 반응은 퍼킨 엘머 써모사이클러 9600중, 95℃에서 1분간(1주기), 이어 95℃에서 45초간, 50℃에서 45초, 72℃에서 30초간 배양함으로써 실시하였다. 생성물을 분석하기 전에 72℃에서 5분간 반응을 배양하였다. 10μl의 반응물을 TAE 완충액계중 2.5% Nusieve (FMC)아가로오스 겔상에서 분석하였다. 정확한 크기의 단편을 겔 정제하고 PCR 클로닝 벡터 또는 T-벡터로 클로닝하였다. T-벡터 작성은 마르추크 일행Nucleic Acid Research, 19: 1154 (1991)에 기재되어 있다. pBluescriptsk+ (스트라타진?, Ca)를 친벡터로 사용하였다. 정확한 클론의 형질전환 및 동정은 상기 정의한 바와 같이 실시하였다.
PCR 증폭 생성물을 클로닝함으로써 VIP1A(a)의 단편 1, 3, 4, 5, 6, 8 및 9 및 VIP2A(a)의 단편 2 및 4는 PCR 증폭 생성물을 클로닝함으로써 수득하였다. 한편, VIP1A(a)의 단편 2, 7, 10 및 11 및 VIP2A(2)의 단편 1, 3 및 5는 혼성화/결찰에 의해 수득하였다.
소망하는 서열의 단편을 수득하면, 인접 단편과 클로닝함으로써 완전 유전자를 조리하였다. 완전 유전자를 다시 서열결정하고 뿌리선호 프로모터 및 벼 액틴 프로모터를 함유하는 식물 발현 벡터로 이동시키기 전에 WCRW에 대한 활성을 시험하였다(미국 특허 출원 번호 08/017,209호, 참고문헌으로 포함됨).
이러한 식물 발현 벡터는 pCIB5521이다. 옥수수 최적화된 VIP1A(a) 코딩 영역(SEQ ID NO: 26)은 PEP 카르복실라제 인트론 #9과 함께 5'말단에 뿌리 선호 프로모터를 함유하고 또 3' 말단에 35S 터미네이터를 함유하는 식물 발현 벡터에 클로닝하였다. 상기 플라스미드는 플라스미드 pUC19로 부터의 암피실린 내성 서열을 함유한다. 다른 식물 발현 벡터는 pCIB5522로서 유전자의 5' 말단에 뿌리 선호 프로모터에 융합된 옥수수 최적화된 VIP2A(a) 코딩 영역(SEQ ID NO: 27)과 함께 3'말단에 PEP 카르복실라제 인트론 #9에 이어 35S 터미네이터를 함유하는 pCIB5522이다.
실시예 25. NAD 친화성 크로마토그래피
기질 NAD에 대한 VIP2의 친화성을 기준한 정제방법을 이용하였다. 실시예 4에 기재된 pH3.5 시트르산 나트륨 완충액 처리로 부터 상층액을 20 mM 트리스 pH 7.5에서 철야로 투석하였다. 중화된 상층액을 동일 부피의 세척 NAD 아가로오스에 부가하고 4℃에서 철야로 부드럽게 회전하면서 배양하였다. 수지 및 단백질 용액을 10 ml 일회용 폴리프로필렌 칼럼에 부가하고 단백질 용액을 흐르게하였다. 이 칼럼을 5 칼럼 부피의 20 mM 트리스 pH 7.5로 세척한 다음 2 내지 5 칼럼 부피의 20 mM 트리스 pH 7.5, 100 mM NaCl, 이어 2 내지 5 칼럼 부피의 20 mM 트리스 7.5로 세척하였다. VIP 단백질을 5mM NAD가 보충된 20 mM 트리스 pH7.5에서 용출시켰다. 약 3 칼럼 부피의 용출액을 수집하고 센트리콘-10에서 농축시켰다. 수율은 수지 ml당 약 7 내지 15 ㎍이다.
정제 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 다음 은 염색하면, 2개의 폴리펩티드가 확인되었다. 즉 하나는 약 80,000의 Mr을 가졌고 또 다른 하나는 약 45,000의 Mr을 가졌다. N-말단 서열분석하면 Mr 80,000 단백질은 VIP1A(A)의 단백질 분해 처리된 것에 상당하고 또 Mr 45,000형태는 VIP2A(a)의 단백질 분해처리된 것에 상당한다. VIP1A(a)를 VIP2A(a)를 함께 정제하면 2개의 단백질은 착물을 형성하고 단백질-단백질 상호작용 영역을 갖는다. 이렇게 정제된 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 단백질은 웨스턴 옥수수 뿌리벌레에 대하여 생물학적으로 활성이었다.
실시예 26. 옥수수 최적화된 VIP1A(a) 및 VIP2A(a)의 발현
VIP 유전자를 포함하는 상이한 플라스미드를 함유하는 대장균 균주를 VIP의 발현에 대해 분석하였다. 개별 플라스미드를 갖는 대장균 균주를 L-육즙에서 철야로 배양하고 발현된 단백질을 실시예 3에 기재된 배양액으로 부터 추출하였다. 단백질 발현은 상기 실시예 12에서 기재된 방법과 유사한 이 기술분야에서 공지된 표준 수법을 이용하여 생성된 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석법으로 분석하였다. 발현된 단백질의 살충 활성을 실시예 3에서 방법에 따른 서부 뿌리벌레에 대하여 시험하였다. 대장균 발현 분석의 결과를 이하에 기재하였다.
대장균에서 VIP의 발현
Figure pct00010
이들 플라스미드로 부터 DNA를 사용하여 옥수수 원형질체 발현계에서 VIP를 일시적으로 발현시켰다. 원형질체는 셀룰라제 RS 및 마세라제 R10를 사용하여 적합한 완충액에서 세포벽을 분해시킴으로써 옥수수 2717주 6 현탁배양액으로 부터 단리하였다. 체로 걸러 원심분리함으로써 원형질체를 회수하였다. 약 75 g의 플라스미드 DNA 및 PEG-40을 사용하여 표준 직접 유전자 전달법에 의해 원형질체를 형질전환시켰다. 처리된 원형질체를 실온의 암소에서 철야로 배양하였다. VIP 발현분석은 웨스턴 블럿 분석법에 의해 원형질체 외식편 상에서 실시하였고 또 대장균의 발현에서 상기 기재한 바와 같이 서부 옥수수 뿌리벌레에 대한 살충 활성도 측정하였다. 옥수수 원형질체 발현분석 결과를 이하에 나타낸다.
식물 원형질체에서 VIP의 발현
Figure pct00011
(p) = 지시된 플라스미드로써 형질전환된 원형질체 배양물의 추출물
(e) = 지시된 플라스미드를 갖는 대장균의 추출물
대장균 및 옥수수 원형질체로써 수득한 발현 데이타는 옥수수 최적화된 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 유전자는 천연 VIP1A(a) 및 VIP2A(a) 유전자와 동일한 단백질을 제조하며 또 이 옥수수 최적화된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 천연 유전자에 의해 코딩된 단백질과 기능적으로 동일함을 나타낸다.
본 명세서에서 언급한 모든 문헌과 특허출원은 본 발명이 관련되는 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 것이다. 모든 문헌과 특허 출원은 각 개별 문헌 또는 특허 출원이 특정하게 개별적으로 참고문헌으로 포함된 것과 마찬가지로 동일하게 참고문헌으로 포함된다.
기탁
이하의 기탁물은 미국 61604 일리노이 페오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐랄 리서치 서비스, 페튼트 컬쳐 콜렉숀(NRRL), 노던 리젼날 리서치 센터에 기탁되었다:
Figure pct00012
상술한 발명은 설명을 간결하게하기 위해 예시와 실시예를 들어 자세하게 설명하였지만, 첨부한 특허청구의 범위내에서 특정 변화와 변경을 가할 수 있음도 분명할 것 이다.
Figure pct00013
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Claims (30)

  1. 바실루스종의 영양 생장상 동안 분비되는 영양 살충성 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 31에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 31에 나타낸 서열인 DNA 분자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 식물선호 코돈을 이용하여 합성되는 DNA 분자.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 51에 나타낸 서열인 DNA 분자.
  5. SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 32에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 영양 살충성 단백질을 코딩하는 DNA 분자.
  6. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 따른 DNA 분자에 의해 코딩되는 영양 살충성 단백질.
  7. 결합된 DNA 작성물이 숙주 생물에서 발현되는데 필요한 전사 및 번역 조절 시그널을 비롯한 식물 발현 서열에 기능적으로 연결된 제 39항에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트.
  8. 제7항에 있어서, 조절 서열을 추가로 더 포함하는 발현 카세트.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 숙주 생물이 식물인 발현 카세트.
  10. 제 7항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자.
  11. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 따른 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 분자를 포함하는 숙주 생물.
  12. 제 11항에 있어서, 식물 및 곤충 세포, 세균, 효모, 배큘로바이러스, 원생동물, 선충 및 조류로 구성된 군으로 부터 선택된 숙주 생물.
  13. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 따른 DNA 분자를 포함하며, 종자 보호성피복으로 처리된 식물 증식물질.
  14. 제7항에 따른 발현 카세트가, 이 발현카세트에 의해 코딩되는 영양 살충성 단백질과는 상이한 하나 이상의 제2 살충성 단백질과 함께 식물에서 발현되는 것을 특징으로하는, 곤충 표적 범위를 증가시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 제 2 살충성 단백질이 Bt δ-내독소, 단백질분해효소 억제제, 렉틴, α-아밀라제 및 퍼옥시다제로 구성된 군으로 부터 선택된 방법.
  16. 제 6항에 따른 영양 살충성 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물을 상기 곤충 해충이 생길 수 있는 지역에 심는 것을 포함하는, 곤충 해충에 의해 유발되는 손상으로 부터 식물을 보호하는 방법.
  17. 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 제 7항에 따른 발현 카세트 또는 제 10항에 따른 벡터 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 영양 살충성 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물세포를 생산하는 방법.
  18. 제 6항에 있어서, 상기 단백질이 나비목(lepidopteran) 곤충에 대하여 독성인 영양 살충성 단백질.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 나비목 곤충이 아그로티스(Agrotis), 스포도프테라(Spodoptera), 헬리오티스(Heliothis) 또는 헬리코베르파(Helicoverpa) 속에 속하는 곤충인 영양 살충성 단백질.
  20. 제6항에 있어서, 상기 단백질이 수탁번호 NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21229 및 NRRL B-21439로 부터 선택된 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 균주로부터 분리할 수 있는 영양 살충성 단백질.
  21. 제 6항에 있어서, 상기 단백질이 60 내지 100 kDa의 분자량을 갖는 영양 살충성 단백질.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 단백질이 80 kDa의 분자량을 갖는 영양 살충성 단백질.
  23. 제 6항에 있어서, 상기 단백질이 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 32에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 영양 살충성 단백질.
  24. 바실루스(Bacillus)의 영양 생장상 동안 분비되는 영양 살충성 단백질로서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 32에 나타낸 아미노산 서열과 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을갖는영양 살충성 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 바실루스(Bacillus)가 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)인 영양 살충성 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 바실루스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)가 수탁번호 NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 및 NRRL B-21439로 부터 선택되는 영양 살충성 단백질.
  27. 제24항에 있어서, 상기 바실루스(Bacillus)가 수탁번호 NRRL B-21228, NRRL B-21229 및 NRRL B-21230으로 부터 선택되는 영양 살충성 단백질.
  28. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 나비목(lepidopteran) 곤충에 대하여 독성인 영양 살충성 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 나비목 곤충이 아그로티스(Agrotis), 스포도프테라(Spodoptera), 헬리오티스(Heliothis) 또는 헬리코베르파(Helicoverpa) 속에 속하는 곤충인 영양 살충성 단백질.
  30. (a) 바실루스 균주를 배양액에서 생장시키고;
    (b) 상기 배양물로 부터 상층액을 수득하며;
    (c) 상기 상층액이 부가된 먹이를 곤충 유충에 공급하고; 또
    (d) 곤충 활성을 측정하는 것을 포함하는,
    제120항에 따른 영양 살충성 단백질의 곤충 활성을 확인하는 방법.
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