DE69932332T2

DE69932332T2 - Bacillus thuringiensis toxine und gene zur kontrolle von koleopteren

Info

Publication number: DE69932332T2
Application number: DE69932332T
Authority: DE
Inventors: A. Gregory San Diego BRADFISCH; Del Mar Muller-Cohn; E. Kenneth San Diego NARVA; M. Jenny San Diego FU; Mark San Diego THOMPSON
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: BR9910410A; CA2327350C; US20040006785A1; EP1078067B1; AU747851B2; ATE332972T1; US6344553B1; AR020073A1; CA2327350A1; DE69932332D1; WO1999058687A3; WO1999058687A2; CN100593037C; EP1078067A2; US6710027B2; AU3977199A; ES2268868T3; US5973231A; CN1305528A

Description

Hintergrund der Erfindung
Insekten und andere Schädlinge verursachen in der Landwirtschaft jährlich Kosten in Höhe von Milliarden Dollar aufgrund von Ernteverlusten und Ausgaben bei der Bekämpfung dieser Schädlinge. Die durch Schädlinge im Bereich der landwirtschaftlichen Produktion verursachten Verluste umfassen verminderte Ernten, eine verringerte Erntequalität und erhöhte Erntekosten.
Insekten der Ordnung Coleoptera (Käferartige) stellen eine wichtige Gruppe von landwirtschaftlichen Schädlingen dar, die jedes Jahr umfangreiche Ernteschäden hervorrufen. Es gibt eine Anzahl von Käfern, die erhebliche wirtschaftliche Schäden verursachen. Zu Beispielen hierfür gehören Chrysomelid-Käfer (wie Erdflöhe (flea beetles und Maiswurzelbohrer (corn rootworms)) und Curculioniden (z. B. Luzernblattnager (alfalfa weevils).
Erdflöhe umfassen eine große Anzahl von Gattungen (z. B. Altica, Apphthona, Argopistes, Disonycha, Epitrix, Longitarsus, Prodagricomela, Systena, Psylliodes und Phyllotreta). Phyllotreta striolata umfasst den gestreiften Erdfloh. Phyllotreta cruciferae umfasst den "Canola-Erdfloh", den "Raps-Erdfloh" und den "Kreuzblütler-Erdfloh (crucifer flea beetle). "Canola", auch bekannt als Raps, ist ein Ölsaat-Brassica-Gewächs (z. B. Brassica campestris, Brassica rapa, Brassica napus und Brassica juncea).
Erdflöhe umfassen eine große Anzahl von Käfern, die die Blätter einer Anzahl von Gräsern, Zerealien und Kräutern fressen. Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata und Phyllotreta undulata sind besonders schädliche einjährige Schädlinge, die die Blätter, Stängel, Schoten und Wurzelgewebe von empfindlichen Pflanzen angreifen. Psylliodes chrysocephala, ein "flea beetle" stellt ebenfalls einen zweijährigen Schädling dar, der die Stängel und Blätter von empfindlichen Pflanzen angreift.
Chemische Pestizide ermöglichen eine wirksame Schädlingsbekämpfung. Jedoch sind in der Öffentlichkeit Bedenken wegen der Kontamination von Nahrungsmitteln mit Chemikalienrückständen und wegen der Umweltverschmutzung, einschließlich der Verschmutzung von Boden, Oberflächengewässern und Grundwasser, aufgetreten. Der Einsatz von Pestiziden kann auch Gefahren für Personen mit sich bringen. Strenge neue Beschränkungen bezüglich der Verwendung von Pestiziden und die Tatsache, dass einige wirksame Pestizide vom Markt genommen wurden, könnten die wirtschaftlichen und wirksamen Optionen für die Bekämpfung von kostenträchtigen Schädlingen einschränken.
Ferner kann die regelmäßige Verwendung von Pestiziden für die Bekämpfung von unerwünschten Organismen zur Selektion von resistenten Stämmen führen. Dies ist bei zahlreichen Spezies von wirtschaftlich bedeutenden Insekten und anderen Schädlingen eingetreten. Die Entwicklung einer Pestizidresistenz macht eine ständige Suche nach neuen Bekämpfungsmitteln mit unterschiedlichen Wirkungsarten erforderlich.
Somit besteht ein dringendes Bedürfnis zum Auffinden neuer Verfahren und Zusammensetzungen zur Bekämpfung von Schädlingen, z. B. der zahlreichen unterschiedlichen Typen von Käferartigen, die erhebliche Schäden an empfindlichen Pflanzen hervorrufen.
Bestimmte Stämme des Bodenmikroorganismus Bacillus thuringiensis (B. t.), eines gram-positiven, sporenbildenden Bakteriums, können durch parasporale, kristalline Proteineinschlüsse charakterisiert werden. Diese Einschlüsse treten im Mikroskop häufig als unterscheidungskräftig geformte Kristalle auf. Die Proteine können gegenüber Schädlingen hochgradig toxisch sein und sind in ihrer toxischen Aktivität spezifisch. Diese δ-Endotoxine, die von bestimmten B. t.-Stämmen erzeugt werden, werden durch sporulierende Zellen synthetisiert. Bestimmte Typen von B.t.-Toxinen werden bei Aufnahme durch ein empfindliches Insekt durch Magensaft-Proteasen des Insekts in biologisch aktive Einheiten umgewandelt. Das primäre Ziel liegt bei Zellen des Darmepithels der Insekten, die durch das Toxin rasch zerstört werden.
Es wurden bestimmte Bacillus-Toxin-Gene isoliert und sequenziert. Die Klonierung und Expression eines B. t.-Kristallprotein-Gens in Escherichia coli wurde in der Literatur beschrieben. Ferner werden derzeit unter Anwendung von Genmanipulationstechniken neue Wege zur Abgabe dieser Bacillus-Toxine an eine landwirtschaftliche Umgebung entwickelt, einschließlich der Verwendung von Pflanzen, die mit Toxin-Genen für Insektenresistenz gentechnisch bearbeitet worden sind, und einschließlich der Verwendung von stabilisierten intakten mikrobiellen Zellen als Vehikel der B. t.-Endotoxin-Abgabe. B. t.-Produkte auf der Basis von rekombinanter DNA wurden entwickelt und zur Anwendung zugelassen. Somit erweisen sich isolierte Bacillus-Toxin-Gene für gewerbliche Zwecke als wertvoll.
Bis vor relativ kurzer Zeit war die gewerbliche Anwendung von B. t.-Pestiziden weitgehend auf einen engen Bereich von Schmetterling-(Raupen)-Schädlingen beschränkt. Präparate von Sporen und Kristallen von B. thuringiensis subsp. kurstaki werden seit vielen Jahren als gewerbliche Insektizide für Schmetterling-Schädlinge verwendet. Beispielsweise erzeugt B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 ein kristallines δ-Endotoxin, das für die Larven einer Anzahl von Schmetterling-Insekten toxisch ist.
In den letzten Jahren wurde jedoch eine neue Subspezies von B. t. identifiziert und Forscher haben B. t.-Pestizide mit Spezifitäten für einen wesentlich breiteren Bereich von Schädlingen entdeckt. Beispielsweise werden andere Spezies von B. t., nämlich israelensis und morrisoni (a. k. a. tenebrionis, a. k. a. B. t. M-7, a. k. a. B. t. san diego) gewerblich zur Bekämpfung von Insekten der Ordnungen Diptera bzw. Coleoptera verwendet.
Hörte und Whiteley (H. Hörte, H. R. Whiteley, Microbiological Reviews, Bd. 52(2) (1989), S. 242-255) teilten B. t.-Kristallprotein-Gene in vier Hauptklassen ein. Bei diesen Klassen handelte es sich um CryI (Lepidoptera-spezifisch), CryII (Lepidoptera- und Diptera-spezifisch), CryIII (Coleoptera-spezifisch) und CryIV (Diptera-spezifisch). Die Bezeichnungen CryV und CryVI wurden für eine neue Klasse von gegenüber Nematoden-spezifischen Toxinen vorgeschlagen. Nunmehr wurden weitere Klassen von B. t.-Genen identifiziert.
Das aus dem Jahr 1989 stammende Nomenklatur- und Klassifikationsschema für Kristallproteine von Hörte und Whiteley beruhten sowohl auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz als auch auf dem Wirtsbereich des Toxins. Dieses System wurde so angepasst, dass es 14 verschiedene Typen von Toxin-Genen abdeckte, die in fünf Hauptklassen eingeteilt wurden. Mit der Entdeckung von weiteren Toxin-Genen erwies sich dieses System als unbrauchbar, da festgestellt wurde, dass Gene mit ähnlichen Sequenzen signfikant unterschiedliche insektizide Spezifitäten aufwiesen. Ein revidiertes Nomenklaturschema wurde vorgeschlagen, das nur auf der Aminosäure-Identität beruht (Crickmore et al., Society for Invertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, IIIrd International Colloquium on Bacillus thuringiensis, Universität Cordoba, Cordoba, Spanien (1996), 1.-6. September 1996, Abstract). Die mnemonische Bezeichnung "cry" wurde für alle Toxin-Gene, ausgenommen cytA und cytB, die als getrennte Klasse verbleiben, beibehalten. Römische Ziffern wurden in der primären Beurteilung gegen arabische Ziffern ausgetauscht und die Klammern in der dritten Beurteilungsgruppe wurden entfernt. Viele der ursprünglichen Namen wurden beibehalten (mit den erwähnten Ausnahmen), obgleich eine Anzahl davon neu klassifiziert wurde; vergl. auch "Revisions of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D. R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum und D.H. Dean, Microbiology and Molecular Biology Reviews, Bd. 62 (1998), S. 807-813; und Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum und Dean, "Bacillus thuringinesis toxin nomenclature", httpa/www.biols.sussex.ac.us/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html, (1999). Dieses System bedient sich der frei zugänglichen Software-Anwendungen CLUSTAL W und PHYLIP. Die NEIGHBOR-Anwendung innerhalb des PHYLIP-Pakets bedient sich eines arithmetischen Mittelwert (UPGMA)-Algorithmus.
Das B. t-Isolat PS86A1 ist in den folgenden US-Patenten beschrieben: 4 849 217 (Aktivität gegen Luzernblattnager); 5 208 017 (Aktivität gegen Maiswurzelbohrer; 5 286 485 (Aktivität gegen Schmetterlinge); und 5 427 786 (Aktivität gegen Phyllotreta-Gattungen). Ein Gen von PS86A1 wurde in B. t. MR506 geklont, das im US-Patent 5 670 365 (Aktivät gegen Nematoden) und in der PCT-Veröffentlichung WO-93/04587 (Aktivität gegen Schmetterlinge) beschrieben ist. Die Sequenzen eines Gens und eines Cry6A (CryVIA)-Toxins aus PS86A1 sind in den folgenden US-Patenten beschrieben: 5 186 934 (Aktivität gegen Hypera-Gattungen); 5 273 746 (Läuse); 5 262 158 und 5 424 410 (Aktivität gegen Milben); sowie PCT-Veröffentlichung WP-94/23036 (Aktivität gegen Drahtwürmer). Die US-Patente 5 262 159 und 5 468 636 beschreiben PS86A1, die Sequenz eines Gens und eines Toxins davon und eine allgemeine Formel für Toxine mit Aktivität gegen Blattläuse.
Das B. t-Isolat PS52A1 ist in den folgenden US-Patenten als Wirkstoff gegen Nematoden beschrieben: 4 861 595, 4 948 734, 5 093 120, 5 262 399, 5 236 843, 5 322 932 und 5 670 365. PS52A1 ist ferner in 4 849 217 (a.a.O.) und in der PCT-Veröffentlichung WO-95/02694 (Aktivtät gegen Calliphoridae) beschrieben. Die Sequenzen eines Gens und eines Nematoden-aktiven Toxins aus PS52A1 sind im US-Patent 5 439 881 und in EP-A-0 462 721 beschrieben. PS52A1, die Sequenz eines Gens und eines Nematoden-aktiven Toxins daraus, sowie eine allgemeine Formel für CryVIA-Toxine sind in der PCT-Veröffentlichung WO-92/19739 beschrieben.
Als Ergebnis eingehender Forschungsarbeiten wurden weitere Patente auf neue B. t.-Isolate und neue Verwendungen für B. t.Isolate erteilt. Jedoch bleibt das Auffinden neuer Bacillus-Isolate, -Toxine und -Gene sowie neuer Verwendungsmöglichkeiten bekannter B. t.-Isolate eine empirische Tätigkeit, über deren Erfolg keine Vorhersagen getroffen werden können.
Obgleich von den B. t.-Stämmen PS86A1 und PS52A1 sowie von einem Gen und Toxin davon bekannt war, dass sie eine bestimmte pestizide Aktivität besitzen, waren weitere Gene, die für aktive Toxine kodieren, aus diesen Isolaten bisher nicht bekannt.
Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden neue Gene bereitgestellt, die für pestizide Toxine kodieren. Bevorzugte neue Toxin-Gene der vorliegenden Erfindung werden als 86A1(b) und 52A1(b) bezeichnet. Diese Gene kodieren für Toxine, die gegen Pflanzenschädlinge, vorzugsweise Insekten, insbesondere Käferartige und ganz besonders Erdflöhe der Gattung Phyllotreta aktiv sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzen und Pflanzenzellen, die mit mindestens einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsequenz so transformiert worden sind, dass die transformierten Pflanzenzellen pestizide Toxine in Geweben, die von den Zielschädlingen verzehrt werden, exprimieren. Pflanzen werden auf diese Weise transformiert, um ihnen Schädlingsresistenz zu verleihen. Bei diesen bevorzugten Ausführungsformen gelangen die Schädlinge mit den Toxinen, die von der transformierten Pflanze exprimiert werden, in Kontakt, indem sie die Pflanzengewebe, die das Toxin exprimieren, aufnehmen oder verzehren. Eine derartige Transformation von Pflanzen kann unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren erreicht werden. Auf diese Weise exprimierte Proteine sind besser gegen Abbau- und Inaktivierungserscheinungen durch Umwelteinflüsse geschützt. Ferner gibt es zahlreiche weitere Vorteile bei Anwendung der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen.
In einer alternativen Ausführungsform können erfindungsgemäße B. t.-Isolate oder rekombinante Mikroorganismen, die die hier beschriebenen Toxine exprimieren, zur Bekämpfung von Schädlingen verwendet werden. Somit umfasst der Gegenstand der Erfindung im wesentlichen intakte B. t.-Zellen und rekombinante Zellen, die die erfindungsgemäß exprimierten Toxine enthalten, die so behandelt worden sind, dass sie die pestizide Aktivität verlängern, wenn die im wesentlichen intakten Zellen auf die Umgebung eines Zielschädlings angewandt werden. Die behandelte Zelle wirkt als ein Schutzüberzug für das pestizide Toxin. Das Toxin wird bei Aufnahme durch ein Zielinsekt aktiv.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst synthetische, pflanzenoptimierte B. t.-Gene, die sich besonders gut zur Bereitstellung einer stabilen Aufrechterhaltung und Expression in der transformierten Pflanze eignen.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID NO. 1 ist eine vorwärts-Oligonucleotidsonde für 52A1(b) und 86A1(b).
SEQ ID NO. 2 ist eine Nucleotidsequenz für ein Gen, das für das 86A1(b)-Toxin kodiert.
SEQ ID NO. 3 ist eine Aminosäuresequenz des 86A1(b)-Toxins.
SEQ ID NO. 4 ist eine Nucleotidsequenz eines Gens, das für das 52A1(b)-Toxin kodiert.
SEQ ID NO. 5 ist eine Aminosäuresequenz des 52A1(b)-Toxins.
SEQ ID NO. 6 ist eine Nucleotidsequenz des pflanzenoptimierten MR510-Gens.
SEQ ID NO. 7 ist eine Aminosäuresequenz, die durch das pflanzenoptimierte MR510-Gen kodiert wird.
SEQ ID NO. 8 ist eine bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Toxins von voller Länge.
Im Gen, das für dieses Toxin kodiert (was auch für die Gene gilt, die für die sämtlichen folgenden Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NOS. 9-19 dargestellt sind, kodieren) wurde das Initiatorcodon für Methionin hinzugefügt, so dass die N-terminale Aminosäure Methionin und nicht Leucin ist (Leucin ist die erste Aminosäure im nativen Protein). Dieses geschnittene Produkt und die in SEQ ID NOS. 9-13 dargestellten Proteine weisen N-terminate Deletionen vom nativen Protein auf. Das natürliche 52A1(b)-Ende wird ansonsten in diesen geschnittenen Produkten verwendet. Nach der ersten Aminosäure beginnt dieses geschnittene Toxin mit der Aminosäure 10 des nativen Proteins. Dies bedeutet, dass die ersten 9 Aminosäuren des nativen Proteins durch die einzelne Aminosäure Methionin ersetzt worden sind. Der verbleibende (C-terminale) Teil dieses Toxins ist der gleiche wie beim nativen Protein. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Stoppcodons im Gen, das für dieses Toxin kodiert, sowie in den Genen, die für die folgenden geschnittenen Proteine (SEQ ID NO. 9-19) kodieren, verwendet.
SEQ ID NO. 9 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Dieses Protein umfasst Methionin, das an das native Protein, das mit der Aminosäure 21 des nativen Proteins beginnt, addiert worden ist. Somit sind die ersten 20 N-terminalen Aminosäuren des nativen Proteins durch Methionin ersetzt.
SEQ ID NO. 10 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Produkt sind die ersten 26 N-terminalen Aminosäuren des nativen Proteins durch Methionin ersetzt.
SEQ ID NO. 11 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Produkt sind die ersten 41 N-terminalen Aminosäuren des nativen Proteins durch Methionin ersetzt.
SEQ ID NO. 12 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Produkt sind die ersten 52 N-terminalen Aminosäuren des nativen Proteins durch Methionin ersetzt.
SEQ ID NO. 13 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Produkt sind die ersten 74 N-terminalen Aminosäuren des nativen Proteins durch Methionin ersetzt.
SEQ ID NO. 14 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Produkt (und bei den restlichen geschnittenen Produkten, die in SEQ ID NOS. 15-19 dargestellt sind) wird der natürliche Beginn des 52A1(b)-Proteins verwendet (mit der Ausnahme, dass Leucin durch Methionin ersetzt ist). Somit stellen diese Toxine (und die dafür kodierenden Gene) das Ergebnis der Durchführung von C-terminalen Deletionen am nativen Protein dar. In diesem geschnittenen Protein sind 93 Aminosäuren vom C-Terminus des nativen Proteins entfernt. Somit endet dieses geschnittene Protein mit der Aminosäure 269 des nativen Proteins.
SEQ ID NO. 15 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Protein sind 82 Aminosäuren vom C-Terminus des nativen Proteins entfernt. Somit endet dieses geschnittene Protein mit der Aminosäure 280 des nativen Proteins.
SEQ ID NO. 16 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Protein sind 74 Aminosäuren vom C-Terminus des nativen Proteins entfernt. Somit endet dieses geschnittene Protein mit der Aminosäure 288 des nativen Proteins.
SEQ ID NO. 17 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Protein sind 30 Aminosäuren vom C-Terminus des nativen Proteins entfernt. Somit endet dieses geschnittene Protein mit der Aminosäure 332 des nativen Poteins.
SEQ ID NO. 18 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Protein sind 20 Aminosäuren vom C-Terminus des nativen Proteins entfernt. Somit endet dieses geschnittene Protein mit der Aminosäure 342 des nativen Poteins.
SEQ ID NO. 19 ist eine weitere bevorzugte, geschnittene Version des nativen 52A1(b)-Proteins von voller Länge. Bei diesem geschnittenen Protein sind drei Aminosäuren vom C-Terminus des nativen Proteins entfernt. Somit endet dieses geschnittene Protein mit der Aminosäure 359 des nativen Proteins.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Gene, die für pestizide Toxine kodieren, bereit. Bevorzugte neue Toxin-Gene der Erfindung werden mit 86A1(b) und 52A1(b) bezeichnet. Diese Gene kodieren für Toxine, die gegen Pflanzenschädlinge, vorzugsweise Insekten, insbesondere Käferartige und ganz besonders Erdflöhe (flea beetles) der Gattung Phyllotreta aktiv sind (die zur Bekämpfung dieser Schädlinge verwendet werden können oder die für diese Schädlinge toxisch oder letal sind). Die Verwendung der vorliegenden Gene und Toxine zur Bekämpfung anderer Schädlinge, z. B. von Schädlingen der Gattung Psylliodes, kommt ebenfalls in Betracht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzen und Pflanzenzellen, die mit mindestens einer erfindungsgemäßen Polynucleotidsequenz so transformiert worden sind, dass die transformierten Pflanzenzellen pestizide Toxine in Geweben, die von den Zielschädlingen verzehrt werden, exprimieren. Pflanzen werden auf diese Weise transformiert, um an den Pflanzen eine Resistenz gegen die Schädlinge zu erreichen. Bei diesen bevorzugten Ausführungsformen gelangen die Schädlinge in Kontakt mit den Toxinen, die von der transformierten Pflanze exprimiert werden, indem sie die Pflanzengewebe, die das Toxin exprimieren, aufnehmen oder verzehren. Eine derartige Transformation von Pflanzen kann unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren erreicht werden. Auf diese Weise exprimierte Proteine sind gegen umweltbedingte Abbau- und Inaktivierungserscheinungen besser geschützt. Zahlreiche weitere Vorteile ergeben sich bei Verwendung der erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen.
Bei einer alternativen Ausführungsform können erfindungsgemäße B. t.-Isolate oder rekombinante Mikroorganismen, die die hier beschriebenen Toxine exprimieren, zur Bekämpfung von Schädlingen verwendet werden. Somit umfasst die vorliegende Erfindung im wesentlichen intakte B. t.-Zellen und rekombinante Zellen, die die erfindungsgemäßen exprimierten Toxine enthalten. Diese Zellen können dazu herangezogen werden, die pestizide Aktivität zu verlängern, wenn die im wesentlichen intakten Zellen in die Umgebung eines Zielschädlings ausgebracht werden; vergl. z. B. die US-Patente 4 695 462, 4 861 595 und 4 695 455. Die behandelte Zelle wirkt als Schutzüberzug für das pestizide Toxin. Das Toxin wird bei Aufnahme durch ein Zielinsekt aktiv.
Eigenschaften von Bacillus thuringiensis-Isolaten PS86A1 und PS52A1, wie Kolonienmorphologie, Einschlusstyp und die Größen von alkalilöslichen Proteinen (durch SDS-PAGE) sind beispielsweise im US-Patent 5 427 786 bzw. in WO-95/02694 beschrieben.
Erfindungsgemäß geeignete Isolate lassen sich aus den in verschiedenen US-Patenten beschriebenen Hinterlegungen erhalten. Beispiele für derartige Patente sind ausführlicher im vorstehenden Abschnitt über den Stand der Technik erörtert. Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Kulturen wurden bei der Hinterlegungsstelle Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt.
Tabelle 1
Die vorliegenden Kulturen wurden unter Bedingungen hinterlegt, die den Zugang zu den Kulturen während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung für Personen, die vom Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 37 CFR 1.14 und 35 U.S.C. 122 als berechtigt angesehen werden, gewährleisten. Die Hinterlegungen sind gemäß den Erfordernissen fremder Patentgesetze in Ländern, wo Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung oder davon abgeleitete Anmeldungen eingereicht werden, zugänglich. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Zugänglichkeit einer Hinterlegung keine Lizenz zur Ausübung der vorliegenden Erfindung unter Übertretung von durch behördliche Akte gewährten Patentrechten darstellen.
Ferner werden die vorliegenden Kulturhinterlegungen für die Öffentlichkeit gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zur Hinterlegung von Mikroorganismen aufbewahrt und zugänglich gemacht, d. h. sie werden mit aller erforderlichen Sorgfalt, um sie lebensfähig und unkontaminiert zu halten, für einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren nach der letzten Anfrage zur Lieferung einer Probe einer Hinterlegung und auf jeden Fall für einen Zeitraum von mindestens 30 Jahren nach Hinterlegungsdatum oder für die durchsetzbare Lebensdauer beliebiger entstehender Patente, die die Kulturen beschreiben, aufbewahrt. Der Hinterlegende verpflichtet sich, die Hinterlegungen zu ersetzen, sofern die Hinterlegungsstelle nicht in der Lage ist, aufgrund des Zustands der Hinterlegungen eine Probe zu liefern. Sämtliche Beschränkungen über die Zugänglichkeit der vorliegenden Kulturhinterlegungen für die Öffentlichkeit werden nach Gewährung eines Patents, das diese Kulturen beschreibt, unwiderruflich aufgehoben.
Gene und Toxine. Bestimmte erfindungsgemäße DNA-Sequenzen wurden hier beispielhaft aufgeführt. Diese Sequenzen stellen Beispiele für die vorliegende Erfindung dar. Es ist leicht ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung nicht nur die hier speziell beschriebenen Gene und Sequenzen umfasst, sondern auch Äquivalente, Varianten, Abänderungen, Mutanten, Fusionsprodukte, chimäre Produkte, geschnittene Produkte, Fragmente und kleinere Gene, die die gleichen oder ähnliche Eigenschaften bezüglich der pestiziden Aktivität und der Expression in Pflanzen aufweisen, jeweils verglichen mit den hier speziell beschriebenen Eigenschaften.
Fragmente der hier beispielhaft beschriebenen Gene und Toxine, bei denen die pestizide Aktivität der als Beispiele aufgeführten Toxine erhalten bleibt, fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Erfindungsgemäß geeignete Gene und Toxine umfassen nicht nur die Sequenzen von voller Länge, sondern auch Fragmente dieser Sequenzen, bei denen die charakteristische pestizide Aktivität der hier als spezielle Beispiele aufgeführten Toxine erhalten bleibt.
Variante DNA-Sequenzen fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Die hier verwendeten Ausdrücke "Varianten" und "Äquivalente" beziehen sich auf Sequenzen, die Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Insertionen von Nucleotiden (oder Aminosäuren) aufweisen, die die Expression der vorliegenden Gene und die sich daraus ergebende pestizide Aktivität der kodierten Toxine, insbesondere bei Pflanzen, nicht wesentlich beeinträchtigen. Die hier verwendeten Ausdrücke "Varianten" oder "Variationen" von Genen beziehen sich auf Nucleotidsequenzen, die für die gleichen Toxine kodieren oder die für äquivalente Toxine mit pestizider Aktivität kodieren. Der hier verwendete Ausdruck "äquivalente Toxine" bezieht sich auf Toxine mit der gleichen oder mit im wesentlichen der gleichen biologischen Aktivität gegen die Zielschädlinge, wie sie die beispielhaft aufgeführten Toxine aufweisen.
Gene lassen sich modifizieren und Variationen von Genen lassen sich leicht konstruieren, wie es dem Fachmann geläufig ist. Beispielsweise beschreibt das US-Patent 5 605 793 Verfahren zur Herbeiführung einer zusätzlichen molekularen Diversität, indem man DNA nach willkürlicher Fragmentierung wieder zusammensetzt. Zur Herbeiführung von Punktmutationen sind übliche Techniken verfügbar. Die Anwendung der positionsgerichteten Mutagenese ist aus dem Stand der Technik bekannt. Fragmente der vorliegenden Gene können gemäß üblichen Verfahren unter Einsatz von handelsüblichen Exonucleasen oder Endonucleasen erzeugt werden. Beispielsweise können Enzyme, wie Bal31, dazu verwendet werden, systematisch Nucleotide von den Enden dieser Gene abzuschneiden. Geeignete Gene können unter Verwendung einer Vielzahl von Restriktionsenzymen erhalten werden. Proteasen können dazu herangezogen werden, direkt aktive Fragmente dieser Toxine zu erhalten.
Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes kann eine Vielzahl von unterschiedlichen DNA-Sequenzen für die hier beschriebenen Aminosäuresequenzen kodieren. Der Fachmann ist dazu in der Lage, diese alternativen DNA-Sequenzen, die für die gleichen oder im wesentlichen gleichen Toxine kodieren, zu erzeugen. Diese varianten DNA-Sequenzen fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Der hier verwendete Ausdruck "im wesentlichen die gleiche" Sequenz bezieht sich auf Sequenzen, die Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen oder -insertionen aufweisen, die die pestizide Aktivität nicht erheblich beeinflussen.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass auf der Grundlage der hier dargelegten Sequenzen der Gene und Toxine die erfindungsgemäßen Gene und Toxine auf verschiedenen Wegen erhalten werden können. Beispielsweise können die vorliegenden Gene synthetisch unter Verwendung einer Gen-Synthesevorrichtung konstruiert werden. Die vorliegenden Gene und Toxine können auch von Wildtyp-Genen und -Toxinen aus Isolaten, die bei einer Kulturhinterlegungsstelle gemäß den vorstehenden Angaben hinterlegt worden sind, abgeleitet werden. Äquivalente Toxine und/oder Gene, die für diese äquivalenten Toxine kodieren, lassen sich von Bacillus-Isolaten und/oder DNA-Bibliotheken unter Anwendung der hier gegebenen Lehre ableiten.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass DNA in einer doppelsträngigen Form vorliegen kann. Bei dieser Anordnung ist ein Strang komplementär zum anderen und umgekehrt. Der Ausdruck "Kodierungsstrang" wird im Stand der Technik häufig zur Bezeichnung des Stranges mit einer Reihe von Codons (bei einem Codon handelt es sich um drei Nucleotide, die jeweils in Dreiergruppen zur Bildung einer bestimmten Aminosäure gelesen werden können), die als offener Leseraster (ORF) zur Bildung eines Proteins oder Peptids von Interesse gelesen werden können. Um ein Protein in vivo zu exprimieren, wird ein Strang von DNA typischerweise in einen komplementären Strang von RNA translatiert, der als die Matrize für das Protein verwendet wird. Bei Replikation von DNA in einer Pflanze (beispielsweise) werden zusätzliche komplementäre DNA-Stränge erzeugt. Somit umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung entweder der beispielhaft aufgeführten Polynucleotide, die in der beigefügten Sequenzliste dargestellt sind, oder der komplementären Stränge. RNA und PNA (Peptid-nucleinsäuren), die funktionell mit der beispielhaft aufgeführten DNA äquivalent sind, fallen unter die vorliegende Erfindung. Somit führt in bevorzugten Ausführungsformen die direkte oder indirekte Expression des vorliegenden Polynucleotids direkt oder indirekt zur intrazellulären Erzeugung und Aufrechterhaltung des gewünschten Polypeptids oder Proteins.
Es gibt eine Anzahl von Verfahren, mit denen die pestiziden Toxine der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Beispielsweise können Antikörper gegen die hier beschriebenen und beanspruchten pestiziden Toxine dazu verwendet werden, Toxine aus einem Gemisch von Proteinen zu identifizieren und zu isolieren. Speziell können die Antikörper gegen die Bereiche der Toxine gebildet werden, die besonders konstant sind und die sich von anderen Bacillus-Toxinen am stärksten unterscheiden. Diese Antikörper können sodann zur spezifischen Identifizierung von äquivalenten Toxinen mit der charakteristischen Aktivität verwendet werden, indem man sich der Immunopräzipitation, eines ELISA-Tests (enzymgebundener Immunosorptionstest) oder des Western-Blottings bedient. Antikörper gegen die hier beschriebenen Toxine oder gegen gleichwertige Toxine oder Fragmente dieser Toxine lassen sich leicht unter Anwendung von gemäß dem Stand der Technik üblichen Verfahren herstellen.
Bestimmte Toxine der vorliegenden Erfindung werden hier speziell durch Beispiele belegt. Diese Toxine stellen aber lediglich Beispiele für die Toxine der vorliegenden Erfindung dar. Es ist leicht ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung variante oder äquivalente Toxine (und Nucleotidsequenzen, die für äquivalente Toxine kodieren) mit der gleichen oder einer ähnlichen pestiziden Aktivität des beispielhaft aufgeführten Toxins umfassen. Äquivalente Gene kodieren für Toxine, die eine hochgradige Aminosäure-Identität oder -Homologie mit den Toxinen, die durch die vorliegenden Gene kodiert werden, aufweisen. Äquivalente Toxine weisen eine Aminosäurehomologie mit einem als Beispiel aufgeführten Toxin auf. Diese Aminosäure-Identität beträgt typischerweise mehr als 60 %, vorzugsweise mehr als 75 %, insbesondere mehr als 80 %, ganz besonders mehr als 90 % und am meisten bevorzugt mehr als 95 %. Diese Werte für die Identität werden unter Anwendung üblicher Ausrichtungstechniken bestimmt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität werden von Crickmore et al. (a.a.O.) erörtert. Die Aminosäure-Homologie ist am höchsten in kritischen Bereichen des Toxins, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind oder die an der Festlegung der dreidimensionalen Konfiguration, die letztlich für die biologische Aktivität verantwortlich ist, beteiligt sind. Diesbezüglich sind bestimmte Aminosäuresubstitutionen akzeptabel und lassen sich erwarten, wenn sie sich in Regionen befinden, die für die Aktivität nicht kritisch sind, oder wenn es sich um konservative Aminosäuresubstitutionen handelt, die die dreidimensionale Konfiguration des Moleküls nicht beeinträchtigen. Beispielsweise lassen sich Aminosäuren in folgende Klassen einteilen: unpolar, ungeladen polar, basisch und sauer. Konservative Substitutionen, bei denen eine Aminosäure einer Klasse durch eine andere Aminosäure des gleichen Typs ersetzt ist, fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, sofern die Substitution die biologische Aktivität der Verbindung nicht wesentlich verändert. In Tabelle 2 sind Beispiele für Aminosäuren, die zu den jeweiligen Klassen gehören, aufgeführt.
Tabelle 2
In einigen Fällen können auch nicht-konservative Substitutionen vorgenommen werden. Der kritische Faktor besteht darin, dass diese Substitutionen die biologische Aktivität des Toxins nicht erheblich beeinträchtigen dürfen.
Die hier verwendeten Ausdrücke "isolierte" Polynucleotide und/oder "gereinigte" Toxine beziehen sich auf diese Moleküle, wenn sie nicht mit anderen Molekülen assoziiert sind, mit denen sie in der Natur auftreten und die ihre Verwendung in Pflanzen einschließen würden. Somit bedeutet der Ausdruck "isoliert und gereinigt" einen "Eingriff durch den Menschen" gemäß den vorstehenden Ausführungen. Chimäre Toxine und Gene beinhalten ebenfalls einen "Eingriff durch den Menschen".
B. t.-Toxine von voller Länge lassen sich exprimieren und sodann in aktive, geschnittene Formen umwandeln, indem man geeignete Reagenzien hinzufügt und/oder indem man die Kulturen unter Bedingungen züchtet, die zu einem Zerschneiden der Proteine durch zufällige Einwirkung von endogenen Proteasen führen. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Toxin von voller Länge weiteren Modifikationen unterliegen, die zur aktiven Form des Toxins führen. Eine Einstellung der Solubilisierung des Toxins sowie weiterer Reaktionsbedingungen, z. B. des pH-Werts, der Ionenstärke oder des Redoxpotentials, können vorgenommen werden, um die gewünschte Modifikation des Toxins zu erreichen. Erfindungsgemäß geschnittene Toxine können erhalten werden, indem man das kristalline δ-Endotoxin von Bacillus thuringiensis mit einer Serin-protease, wie Rinder-Trypsin, bei einem alkalischen pH-Wert und vorzugsweise in Abwesenheit von β-Mercaptoethanol behandelt.
Chimäre und/oder Fusionsgene und Toxine (typischerweise erzeugt entweder durch Kombination von Teilen von mehr als einem Bacillus-Toxin oder -Gen oder durch Kombination von Genen und Toxinen von voller Länge sowie Kombinationen davon) können ferner entsprechend der Lehre der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils der Toxine und Gene bei der Herstellung von Fusionsproteinen und Fusionsgenen. Chimäre Toxine können erzeugt werden, indem man Teile von multiplen Toxinen kombiniert.
Es wurden Verfahren entwickelt, um geeignete chimäre Toxine durch Kombination von Teilen von B. t.-Kristallproteinen herzustellen. Die Teile, die kombiniert werden, müssen als solche nicht pestizid sein, sofern die Kombination von Teilen ein chimäres Protein, das pestizid ist, entstehen lässt. Dies kann unter Verwendung von Restriktionsenzymen erfolgen, wie es beispielsweise in folgenden Literaturstellen beschrieben wird: EP-Patent 0 228 838; A. Z. Ge, N. L. Shivarova, D. H. Dean, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 4037-4041; A. Z. Ge, D. Rivers, R. Milne, D. H. Dean J. Biol. Chem., Bd. 266 (1991), S. 17954-17958; H. E. Schnepf, K. Tomczak. J. P. Ortega, H. R. Whiteley, J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 20923-20930; G. Honee, D. Convents, J. Van Rie, S. Jansens, M. Peferoen, B. Visser, Mol. Microbiol., Bd. 5 (1991), S. 2799-2806. Alternativ kann man sich einer Rekombination unter Anwendung zellulärer Rekombinationsmechanismen bedienen, um zu ähnlichen Ergebnissen zu gelangen; vergl. beispielsweise T. Caramori, A. M. Albertini, A. Galizzi, Gene, Bd. 98 (1991), S. 37-44; W. R. Widner, H. R. Whiteley, J. Bacteriol., Bd. 172 (1990), S. 2826-2832; D. Bosch, B. Schipper, H. van der Kliej, R. A. de Maagd, W. J. Stickema, Biotechnology, Bd. 12 (1994), S. 915-918. Eine Anzahl weiterer Verfahren ist aus dem Stand der Technik bekannt, mit denen chimäre DNAs hergestellt werden können. Die vorliegende Erfindung umfasst chimäre Proteine, die sich der in der vorliegenden Anmeldung identifizierten neuen Sequenzen bedienen.
Ferner können erfindungsgemäße Toxine in Kombination miteinander oder mit anderen Toxinen verwendet werden, um eine verstärkte Schädlingsbekämpfung zu erreichen. Selbstverständlich umfasst dies die Verwendung der vorliegenden Toxine zusammen mit anderen Toxinen bei Schädlingsbekämpfungsmaßnahmen, die dazu konzipiert sind, Schädlinge zu bekämpfen, die gegen ein oder mehr Toxine möglicherweise eine Resistenz entwickelt haben.
Mit der hier gegebenen Lehre ist der Fachmann dazu in der Lage, die hier beschriebenen verschiedenen Toxine und Polynucleotidsequenzen leicht zu erzeugen und einzusetzen.
Rekombinante Wirte und andere Anwendungsverfahren. Die erfindungsgemäßen Toxin-kodierenden Gene lassen sich in eine Vielzahl von Mikroorganismen- oder Pflanzenwirten einführen. Der hier verwendete Ausdruck "heterologes" Gen bezieht sich auf ein Gen, das in dem Wirt, der mit dem Gen transformiert wird, nicht von Natur aus vorkommt. Bei bevorzugten Ausführungsformen führt die Expression des Toxin-Gens direkt oder indirekt zur intrazellulären Erzeugung und Aufrechterhaltung des Pestizids.
Wenn die erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen von einem Schädling aufgenommen werden, nehmen die Schädlinge das Toxin auf. Daraus ergibt sich eine Bekämpfung des Schädlings. Zu Vorteilen der in planta-Expression der Toxin-Proteine gehören ein verbesserter Schutz des Pestizids gegen einen Abbau und eine Inaktivierung durch Umwelteinflüsse. Die in planta-Anwendung vermeidet ferner den zeitlichen und finanziellen Aufwand für das Versprühen oder das anderweitige Ausbringen der Organismen und/oder des Toxins auf die Pflanze oder auf den Ort des Schädlings, um einen Kontakt mit dem Zielschädling und dessen Bekämpfung zu erreichen.
Die vorliegenden B. t.-Toxin-Gene können einem Wirt, vorzugsweise einem Pflanzenwirt, über einen geeigneten Vektor zugeführt werden. Es gibt zahlreiche verträgliche Nutzpflanzen von Interesse, einschließlich Mais, Baumwolle und Sonnenblume.
Synthetische, pflanzenoptimierte Gene, die hier beispielhaft aufgeführt werden, eignen sich in besonderer Weise zur Bereitstellung einer stabilen Aufrechterhaltung und Expression des Gens in der transformierten Pflanze.
Bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können transformierte mikrobielle Wirte in vorausgehenden Stufen zur Herstellung von Vorläufern verwendet werden, die schließlich zur Transformation von Pflanzenzellen und/oder von Pflanzen eingesetzt werden. Auf diese Weise transformierte und verwendete Mikroorganismen fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Bei rekombinanten Mikroorganismen kann es sich beispielsweise um B. t., E. coli, oder Pseudomonas (z. B. Pseudomonas fluorescens) handeln. Transformationen lassen sich vom Fachmann unter Anwendung üblicher Techniken durchführen. Materialien, die für diese Transformationen notwendig sind, werden hier beschrieben oder stehen dem Fachmann anderweitig leicht zur Verfügung.
Als eine Alternative zur Verwendung von Pflanzen, die mit einem erfindungsgemäßen Gen transformiert worden sind, können die B. t.-Isolate oder rekombinante Mikroorganismen, die die hier beschriebenen Toxine exprimieren, zur Bekämpfung von Schädlingen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen B. t.-Isolate können unter Verwendung von üblichen Medien und Fermentationstechniken gezüchtet werden. Nach Beendigung des Fermentationszyklus können die Bakterien geerntet werden, indem man zunächst die B. t.-Sporen und -Kristalle aus der Fermentationsbrühe durch bekannte Maßnahmen abtrennt. Die gewonnenen B. t.-Sporen, -Kristalle und/oder -Toxine können zu benetzbaren Pulvern, flüssigen Konzentraten, Granalien oder anderen Präparaten zubereitet werden, indem man oberflächenaktive Mittel, Dispergiermittel, inerte Trägerstoffe und andere Komponenten zusetzt, um die Handhabung und Anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern. Diese Zubereitungs- und Anwendungsmaßnahmen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Mutanten der vorstehenden B. t.-Isolate, die im wesentlichen die gleichen pestiziden Eigenschaften wie die Ausgangs-B. t.-Isolate aufweisen. Mutanten können nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden. UV-Licht und Nitrosoguanidin werden zu diesem Zweck in umfangreichem Maße eingesetzt. Eine asporogene Mutante lässt sich durch Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese des Isolats erhalten.
Geeignete mikrobielle Wirte, z. B. Pseudomonas, die zur Expression von einem oder mehreren Genen der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind, können auf den Ort des Schädlings ausgebracht werden, wo sich der transformierte Wirt vermehren kann und/oder aufgenommen werden kann. Daraus ergibt sich eine Bekämpfung des Schädlings.
Alternativ kann der Mikroorganismus, der das Toxin-Gen aufgenommen hat, unter Bedingungen abgetötet und behandelt werden, die die Aktivität des Toxins verlängern und die Zelle stabilisieren. Die behandelte Zelle, die die toxische Aktivität behält, kann sodann auf die Umgebung des Zielschädlings angewandt werden; vergl. z. B. die US-Patente 4 695 462, 4 861 595 und 4 695 455. Somit umfasst die Erfindung die Behandlung von im wesentlichen intakten B. t.-Zellen und/oder rekombinanten Zellen, die die erfindungsgemäßen exprimierten Gene enthalten und die zur Verlängerung der pestiziden Aktivität behandelt worden sind, wenn die im wesentlichen intakten Zellen auf die Umgebung eines Zielschädlings ausgebracht werden. Eine derartige Behandlung kann durch chemische oder physikalische Maßnahmen oder durch eine Kombination von chemischen oder physikalischen Maßnahmen erfolgen, sofern die Technik nicht die Eigenschaften des Pestizids nachteilig beeinflusst oder das Vermögen der Zellen zum Schutz des Pestizids verringert. Die behandelte Zelle wirkt als Schutzüberzug für das pestizide Toxin. Das Toxin wird verfügbar, so dass es seine Wirkung nach Aufnahme durch ein Zielinsekt entfaltet.
Synthetische, pflanzenoptimierte Gene. Bevorzugte erfindungsgemäße synthetische B. t.-Gene umfassen Nucleotidsequenzen, die folgendes aufweisen: (1) mehr von Pflanzen bevorzugte Codons als das native B. t.-Gen, (2) eine Frequenz der Codonanwendung, die im Vergleich zum nativen B. t.-Gen näher bei der Codonfrequenz des vorgesehenen Pflanzenwirts liegt, oder (3) im wesentlichen sämtliche Codons, die das Codon umfassen, das im vorgesehenen Pflanzenwirt die höchste Frequenz aufweist. Obgleich die vorliegende Erfindung spezielle Ausführungsformen für synthetische Gene, die sich in transformierten Pflanzen besonders eignen, bereitstellt, können zur Transformation von Wirten und insbesondere von Pflanzenwirten auch andere Gene verwendet werden, die funktionell mit den hier beispielhaft aufgeführten Genen gleichwertig sind. Weitere Richtlinien zur Erzeugung von synthetischen Genen zur Verwendung in Pflanzen finden sich beispielsweise im US-Patent 5 380 831.
Polynucleotidsonden. Ein Verfahren zum Identifizieren von geeigneten Toxinen und Genen besteht in der Verwendung von Oligonucleotidsonden. Bei diesen Sonden handelt es sich um nachweisbare Nucleotidsequenzen. Sonden bieten ein rasches Verfahren zum Identifizieren von für Toxine kodierenden Genen. Die Nucleotidsegmente, die als Sonden verwendet werden, können unter Verwendung einer DNA-Synthesevorrichtung und unter Anwendung üblicher Verfahren synthetisiert werden.
Es ist bekannt, dass DNA eine als Komplementarität bezeichnete grundlegende Eigenschaft besitzt. In der Natur liegt DNA üblicherweise in Form von Paaren von antiparallelen Strängen vor, wobei die Basen an jedem Strang aus diesem Strang in Richtung zum gegenüberliegenden Strang vorstehen. Die Base Adenin (A) an einem Strang liegt immer der Base Thymin (T) am anderen Strang gegenüber, während die Base Guanin (G) gegenüber der Base Cytosin (C) liegt. Die Basen werden aufgrund ihrer Fähigkeit, auf diese spezifische Weise Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, in Nachbarstellung gehalten. Obgleich die einzelnen Bindungen jeweils relativ schwach sind, ergibt sich als Nettowirkung zahlreicher benachbarter Basen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen gebunden sind, zusammen mit der Basenstapelwirkung eine stabile Verbindung der beiden komplementären Stränge. Diese Bindungen können durch Behandlungen beispielsweise bei einem hohen pH-Wert oder bei hoher Temperatur aufgebrochen werden. Diese Bedingungen führen zur Dissoziation oder "Denaturierung" der beiden Stränge. Wenn sodann die DNA unter Bedingungen gestellt wird, die die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen der Basen thermodynamisch begünstigen, unterliegen die DNA-Stränge einem Annealing oder einer "Hybridisierung" und stellen die ursprüngliche doppelsträngige DNA wieder her. Bei Durchführung unter geeigneten Bedingungen kann diese Hybridisierung hochgradig spezifisch sein. Dies bedeutet, dass nur Stränge mit einem hohen Maß an Basenkomplementarität dazu befähigt sind, stabile doppelsträngige Strukturen zu bilden. Die Beziehung zwischen der Spezifität der Hybridisierung und den Reaktionsbedingungen ist bekannt. Somit kann die Hybridisierung eingesetzt werden, um zu testen, ob zwei Stücke von DNA in Bezug auf ihre Basensequenzen komplementär sind. Dieser Hybridisierungsmechanismus erleichtert die Verwendung von Sonden, um in einfacher Weise DNA-Sequenzen von Interesse nachzuweisen und zu charakterisieren.
Bei den Sonden kann es sich um RNA, DNA oder PNA (Peptid-nucleinsäure) handeln. Die Sonde weist normalerweise mindestens etwa 10 Basen und vorzugsweise mindestens etwa 17 Basen auf und kann eine Länge bis zu etwa 100 Basen oder mehr besitzen. Längere Sonden lassen sich leicht verwenden. Derartige Sonden können beispielsweise eine Länge von mehreren Kilobasen aufweisen. Die Sondensequenz ist so konzipiert, dass eine zumindest erhebliche Komplementarität mit einem Teil des Gens, das für ein Toxin von Interesse kodiert, besteht. Die Sonde muss mit der Sequenz, mit der sie hybridisiert, nicht perfekt komplementär sein. Die Sonden können unter Anwendung von Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, markiert werden.
Ein Weg zur Verwendung von Sonden umfasst zunächst die Identifizierung sämtlicher DNA-Segmente, die mit den beschriebenen Nucleotidsequenzen homolog sind, mittels einer Southern-Blot-Analyse einer Genbibliothek des Bacillus-Isolats. Somit ist es ohne Zuhilfenahme einer biologischen Analyse möglich, schon vorher Erkenntnisse über die mutmaßliche Aktivität zahlreicher neuer Bacillus-Isolate und der individuellen Genprodukte, die durch ein gegebenes Bacillus-Isolat exprimiert werden, zu gewinnen. Eine derartige Sondenanalyse bietet ein rasches Verfahren zum Identifizieren von Insektiziden Toxin-Genen innerhalb der zahlreichen Subspezies von B. t., die möglicherweise von wirtschaftlicher Bedeutung sind. Die spezielle Hybridisierungstechnik ist nicht wesentlich. Sofern sich Verbesserungen bezüglich der Hybridisierungstechniken ergeben, können diese leicht eingesetzt werden.
Ein geeignetes Hybridisierungsverfahren umfasst typischerweise die anfänglichen Stufen der Isolierung der DNA-Probe von Interesse und deren Reinigung auf chemischem Wege. Es können entweder lysierte Bakterien oder vollkommen fraktionierte Nucleinsäuren, die aus Bakterien isoliert worden sind, verwendet werden. Zellen können unter Anwendung bekannter Techniken behandelt werden, um ihre DNA (und/oder RNA) freizusetzen. Die DNA-Probe kann mit einem geeigneten Restriktionsenzym in Stücke zerschnitten werden. Die Stücke können durch Elektrophorese in einem Gel, üblicherweise Agarose oder Acrylamid, entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden. Die Stücke von Interesse können auf eine immobilisierende Membran übertragen werden.
Die Sonde und die Probe können in einer Hybridisierungspufferlösung vereinigt und bei einer geeigneten Temperatur gehalten werden, bis das Annealing erfolgt. Anschließend wird die Membran von fremden Materialien frei gewaschen, wobei die Probe zurückbleibt und gebundene Sondenmoleküle typischerweise durch Autoradiographie und/oder Flüssigszintillationszählung nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden. Wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, kann dann, wenn das Sondenmolekül und die Nucleinsäuresonde unter Bildung einer starken nicht-kovalenten Bindung zwischen den beiden Molekülen hybridisieren, in begründeter Weise angenommen werden, dass die Sonde und die Probe im wesentlichen identisch sind. Die nachweisbare Markierung der Sonde bietet eine Möglichkeit, in bekannter Weise festzustellen, ob eine Hybridisierung stattgefunden hat.
Bei der Verwendung von Nucleotidsegmenten als Sonden wird die spezielle Sonde mit einer beliebigen geeigneten Markierung, die dem Fachmann geläufig ist, einschließlich einer radioaktiven und einer nicht-radioaktiven Markierung, markiert. Zu typischen radioaktiven Markierungen gehören ³²P, ³⁵S oder dergl. Zu nicht-radioaktiven Markierungen gehören beispielsweise Liganden, wie Biotin oder Thyroxin, sowie Enzyme, wie Hydrolasen oder Peroxidasen, oder verschiedene chemilumineszierende Mittel, wie Luciferin, oder fluoreszierende Verbindungen, wie Fluorescein und dessen Derivate. Die Sonden können von Natur aus fluoreszierend ausgestattet werden, wie es beispielsweise in WO-93/16094 beschrieben ist.
Man kann sich variierender Stringenzgrade der Hybridisierung bedienen, wie nachstehend beschrieben wird. Je stringenter die Bedingungen sind, desto höher ist die Komplementarität, die für die Duplexbildung erforderlich ist. Die Stringenz kann durch die Temperatur, die Sondenkonzentration, die Sondenlänge, die Ionenstärke, die Zeit und dergl. gesteuert werden. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter Bedingungen einer mäßigen bis hohen Stringenz nach bekannten Techniken durchgeführt; vergl. beispielsweise G. H. Keller, M. M. Manak, DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, (1987), S. 169-170.
Eine Hybridisierung von immobilisierter DNA an Southern-Blots mit ³²P-markierten, genspezifischen Sonden kann nach üblichen Verfahren durchgeführt werden (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1982). Im allgemeinen werden die Hybridisierung und anschließende Waschvorgänge unter Bedingungen einer geringen, mäßigen und/oder hohen Stringenz durchgeführt, die einen Nachweis von Zielsequenzen mit Homologie zu den beispielhaften Toxin-Genen ermöglichen. Für doppelsträngige DNA-Gensonden kann eine Hybridisierung über Nacht bei 20-25 °C unter der Schmelztemperatur (Tm) des DNA-Hybrids in 6 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 0,1 mg/ml denaturierter DNA durchgeführt werden. Die Schmelztemperatur wird durch die folgende Formel beschrieben (G. A. Beltz, K. A. Jacobs, T. H. Eickbush, P. T. Cherbas und F. C. Kafatos, Methods of Enzymology, Hrsg. R. Wu, L. Grossman und K. Moldave, Academic Press, New York, Bd. 100 (1983), S. 266-285).
Tm = 81,5 °C+16,6 Log[Na⁺] + 0,41(% G+C)-0,61(% Formamid)-600/Länge des Duplex in Basenpaaren.
Die Waschvorgänge werden typischerweise folgendermaßen durchgeführt:

(1) 2-mal 15 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × SSPE, 0,1 % SDS (Waschvorgang mit niederer Stringenz).
(2) 1-mal 15 Minuten bei Tm –20 °C in 0,2 × SSPE, 0,1 % SDS (Waschvorgang mit mäßiger Stringenz).

Zu Waschvorgängen von niederer Stringenz gehören 6 × SSPE, 0,1 % SDS bei 37 °C oder 2 × SSPE, 0,1 % SDS bei Tm –20 °C.
Für Oligonucleotidsonden kann eine Hybridisierung über Nacht bei einer Temperatur, die 10-20 °C unter der Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids liegt, in 6 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1 % SDS, 0,1 mg/ml denaturierter DNA durchgeführt werden. Der Tm-Wert für Oligonucleotidsonden kann gemäß der folgenden Formel bestimmt werden:
Tm (°C)=2(Anzahl der T/A-Basenpaare)+4(Anzahl der G/C-Basenpaare) (S.
V. Suggs, T. Miyake, E. H. Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura und R. B. Wallace, ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, Hrsg. D. D. Brown, Academic Press, New York, Bd. 23 (1981), S. 683-693).
Die Waschvorgänge werden typischerweise folgendermaßen durchgeführt:

(1) 2-mal 15 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × SSPE, 0,1 % SDS (Waschvorgang mit geringer Stringenz).
(2) 1-mal 15 Minuten bei der Hybridisierungstemperatur in 1 × SSPE, 0,1 % SDS (Waschvorgang mit mäßiger Stringenz).

Im allgemeinen können das Salz und/oder die Temperatur verändert werden, um die Stringenz zu ändern. Ferner können Waschvorgänge mit Formamid oder mit Wasser herangezogen werden. Formamid-Waschvorgänge erfordern eine niedrigere Temperatur als wässrige Waschvorgänge. Mit einem markierten DNA-Fragment mit einer Länge von >70 oder dergl. Basen können die folgenden Bedingungen (wässrige Waschvorgänge) herangezogen werden:
Gering: 1- oder 2-mal SSPE, Raumtemperatur
Gering: 1- oder 2-mal SSPE, 42 °C
Mäßig: 0,2-mal oder 1-mal SSPE, 65 °C
Hoch: 0,1-mal SSPE, 65 °C.
Die Duplexbildung und die Stabilität hängen vom Grad der Komplementarität zwischen den beiden Strängen eines Hybrids ab. Wie vorstehend erwähnt, kann ein gewisser Grad an Fehlpaarungen toleriert werden. Daher können geeignete Sondensequenzen Mutationen (sowohl einfach als auch mehrfach), Deletionen, Insertionen der beschriebenen Sequenzen und Kombinationen davon umfassen, wobei die Mutationen, Insertionen und Deletionen eine Bildung von stabilen Hybriden mit dem Zielpolynucleotid von Interesse ermöglichen. Mutationen, Insertionen und Deletionen lassen sich bei einer gegebenen Polynucleotidsequenz auf zahlreichen Wegen erzeugen. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig, wobei weitere Verfahren möglicherweise in der Zukunft hinzukommen. Diese Varianten können auf die gleiche Weise wie die ursprünglichen Primersequenzen verwendet werden, sofern die Varianten eine wesentliche Sequenzhomologie mit der ursprünglichen Sequenz aufweisen. Der hier verwendete Ausdruck "wesentliche Sequenzhomologie" bezieht sich auf eine Homologie, die dazu ausreicht, es der varianten Sonde zu ermöglichen, die gleiche Funktion wie die ursprüngliche Sonde auszuüben. Vorzugsweise beträgt diese Homologie mehr als 50 %, insbesondere mehr als 75 % und ganz besonders mehr als 90 %. Der Homologiegrad, der es der Variante ermöglicht, die vorgesehene Funktion auszuüben, hängt von der beabsichtigten Verwendung der Sequenz ab. Dem Fachmann ist es geläufig, Mutationen, Insertionen und Deletionen vorzunehmen, die dazu bestimmt sind, die Funktion der Sequenz zu verbessern oder anderweitig zu einem methodischen Vorteil zu führen.
PCR-Technik. Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) handelt es sich um eine wiederholte, enzymatische, unter Verwendung eines Primers ablaufende Synthese einer Nucleotidsäuresequenz. Dieses Verfahren ist dem Fachmann geläufig (vergl. Mullis, US-Patente 4 683 195, 4 683 202 und 4 800 159; Randall K. Saiki, Stephen Schart, Fred Faloona, Kary B. Mullis., Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim, "Enzymatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science, Bd. 230 (1985), S. 1350-1354). Die PCR beruht auf einer enzymatischen Amplifikation eines DNA-Fragments von Interesse, das von zwei Oligonucleotidprimern, die mit gegenüberliegenden Strängen der Zielsequenz hybridisieren, flankiert ist. Die Primer sind so orientiert, dass die 3'-Enden aufeinander zu gerichtet sind. Weederholte Zyklen einer Wärmedenaturierung der Matrize, eines Annealings der der Primer mit ihren komplementären Sequenzen und einer Erweiterung der dem Annealing unterzogenen Primer mit einer DNA-Polymerase führen zur Amplifikation des durch die 5'-Enden der PCR-Primer begrenzten Segments. Da das Erweiterungsprodukt eines jeden Primers als eine Matrize für den anderen Primer dienen kann, wird bei jedem Zyklus im wesentlichen die Menge des DNA-Fragments, das im vorherigen Zyklus erzeugt worden ist, verdoppelt. Dies führt dazu, dass sich in einigen Stunden eine exponentielle Anreicherung des spezifischen Zielfragments bis zu einem Faktor von einigen Millionen erzielen lässt. Unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, wie Taq-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus isoliert worden ist, kann das Amplifikationsverfahren vollständig automatisiert werden. Weitere Enzyme, die verwendet werden können, sind dem Fachmann geläufig.
DNA-Sequenzen können als Primer für die PCR-Amplifikation konstruiert und verwendet werden. Bei der Durchführung der PCR-Amplifikation kann ein bestimmter Grad an Fehlpaarungen zwischen Primer und Matrize hingenommen werden. Daher lassen sich Mutationen, Deletionen und Insertionen (typischerweise Additionen von Nucleotiden am 5'-Ende) bei einem vorgegebenen Primer durch Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, erzeugen.
Nachstehend finden sich Beispiele, die die Verfahren zur Durchführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als Beschränkung anzusehen.
Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und sämtliche Mengenverhältnisse bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1 – Züchtung der erfindungsgemäßen B. t.-Isolate

Eine Subkultur eines B. t.-Isolats kann zur Inokulation des folgenden Mediums (ein Pepton-, Glucose- und Salzmedium, pH-Wert 7,2) verwendet werden:

Bacto-Peptone	7,5 g/Liter
Glucose	1,0 g/Liter
KH₂PO₄	3,4 g/Liter
K₂HPO₄	4,35 g/Liter
Salzlösung	5,0 ml/Liter
CaCl₂-Lösung	5,0 ml/Liter
Salzlösung (100 ml)
MgSO₄·7H₂O	2,46 g
MnSO₄·H₂O	0,04 g
ZnSO₄·7H₂O	0,28 g
FeSO₄·7H₂O	0,40 g
CaCl₂-Lösung (100 ml)
CaCl₂·2H₂O	3,66 g

Die Salzlösung und die CaCl₂-Lösung werden steril filtriert und zum Zeitpunkt der Inokulation der autoklavisierten und abgekochten Brühe zugesetzt. Die Kolben werden 64 Stunden bei 30 °C auf einem Drehschüttler bei 200 U/min inkubiert.
Das vorstehende Verfahren lässt sich auf bekannte Weise leicht einer Maßstabsvergrößerung unter Verwendung von großen Fermentern unterziehen.
Die bei der vorstehenden Fermentation erhaltenen B. t.-Sporen und -Kristalle lassen sich nach bekannten Verfahren isolieren. Ein häufig angewandtes Verfahren besteht darin, die geerntete Fermentationsbrühe durch Trenntechniken, z. B. durch Zentrifugation, aufzutrennen.
Beispiel 2 – Molekulare Klonierung, Expression und Sequenzierung von neuen Toxin-Genen aus den Bacillus thuringiensis-Stämmen PS52A1 und PS86A1
Die gesamte zelluläre DNA aus PS52A1 und PS86A1 Bacillus thuiringiensis (B. t.)-Zellen, die bei 30 °C bis zu einer optischen Dichte von 1,0 bei 600 nm gezüchtet worden waren, wurde präpariert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und in Protoplastenpuffer (20 mg/ml Lysozym in 0,3 M Saccharose, 25 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,0), 25 mM EDTA) resuspendiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Protoplasten durch zwei Einfrier- und Auftauzyklen lysiert. 9 Volumenteile einer Lösung von 0,1 M NaCl, 0,1 % SDS, 0,1 M Tris-Cl (pH-Wert 8,0) wurden zur Vervollständigung der Lysis zugegeben. Das geklärte Lysat wurde 2-mal mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert. Nucleinsäuren wurden mit 2 Volumenteilen Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugation pelletisiert. Das Pellet wurde in TE-Puffer (10 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA) resuspendiert und RNase wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde die Lösung jeweils 1-mal mit Phenol:Chloroform (1:1) und Chloroform, das mit TE gesättigt war, extrahiert. Aus der wässrigen Phase wurde die DNA durch Zugabe von 1/10 Volumenteil 3 M NaOAc und 2 Volumenteilen Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletisiert, mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
Plasmid-DNA wurde ferner aus dem B. t.-Stamm PS86A1 hergestellt. Die B. t.-Zellen wurden bei 30 °C bis zu einer optischen Dichte von 1,0 bei 600 nm gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und in Protoplastenpuffer (20 mg/ml Lysozym in 0,3 M Saccharose, 25 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,0), 25 mM EDTA) resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden 10 Volumenteile Lysis-Puffer (0,085 M NaOH, 0,1 % SDS in TE-Puffer) zugegeben. Das Lysat wurde 30 Minuten vorsichtig bei Raumtemperatur gerüttelt.
Ein halbes Volumenteil 3 M KOAc wurde der Suspension zur Inkubation über Nacht bei 4 °C zugesetzt. Nucleinsäuren wurden mit 1 Volumenteil Isopropanol ausgefällt und durch Zentrifugation pelletisiert, mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Die DNA-Suspension wurde ferner durch einmalige Extraktion mit Phenol:Chloroform (1:1) gereinigt. Die DNA in der wässrigen Phase wurde durch Zugabe von 1/10 Volumenteil 3 M NaOAc und 1 Volumenteil Isopropanol ausgefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletisiert, mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. CsCl wurde in einer gleichen Gewichtsmenge zu 1 Volumenteil DNA-Lösung gegeben. Ethidiumbromid wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt. Die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugation über Nacht von fremden Nucleinsäuren abgetrennt. Die gewonnene Plasmidbande wurde 5-mal mit überschüssigem, wassergesättigtem Butanol extrahiert und gegen TE-Puffer dialysiert. Die DNA wurde auf die vorstehend beschriebene Weise ausgefällt, pelletisiert, gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Auf der Grundlage von N-terminalen Aminosäure-Sequenzierungsdaten des 45 kDa-PS86A1-Polypeptids wurde die folgende "vorwärts"-Oligonucleotsequenz (SEQ ID NO. 1) zur Verwendung bei Southern-Hybridisierungen synthetisiert:
5'-TGGATAAAAAATCWATWACACATGAAGAATTTATWMGACA-3'
wobei W=A oder T und M=A oder C, gemäß üblicher IUPAC-Konvention.
Die gesamte zelluläre PS86A1- und Plasmid-DNA wurden mit ausgewählten Restriktionsendonucleasen verdaut, an einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen, anschließend auf eine Nylonmembran aufgetragen und durch Erwärmen der Membran auf 80 °C immobilisiert. Eine Analyse des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonucleotidsonde durchgeführt. Southern-Blots wurden über Nacht in 6 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1 mg/ml einzelsträngige Träger-DNA und 0,1 % SDS bei 37 °C hybridisiert. Die Blots wurden sodann in 1 × SSPE, 0,1 % SDS bei 37 °C gewaschen, an der Luft getrocknet und sodann auf einen Röntgenfilm aufgelegt. Durch Autoradiographie wurde eine Xbal-Bande von etwa 6,6 kbp in den Blots sowohl der gesamten zellulären DNA als auch der Plasmid-DNA identifiziert, von der angenommen wurde, dass sie die Gesamtheit oder einen Teil des PS86B1(b)-Toxin-Gens enthielt.
Das Xbal-Fragment von etwa 6,6 kbp wurde in pHTBluell (ein E. coli/B. thuringiensis-Shuttle-Vektor aus pBluescript II SK- (Stratagene, La Jolla, Ca) und der Replikationsursprungsstelle aus einem residenten B. t.-Plasmid (Lereclus et al., FEMS Microbiology Letters, Bd. 60 (1989), S. 211-218) kloniert. Eine Kartierung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Feststellung der Tatsache, ob das Fragment das Gen von voller Länge enthielt, wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen "vorwärts"-Oligonucleotidprimers und von Vektorprimern durchgeführt. Der "vorwärts"-Primer ergab in Kombination mit dem Vektorprimer T7 eine Amplifikation eines Fragments mit einer Größe von nur etwa 400 bp, anstelle des erwarteten Gens von 1,0 kbp zur Kodierung eines Proteins mit einer Länge von 45 kDa. Dies bestätigte, dass nur etwa ein Drittel des PS86A1(b)-Toxin-Gens kloniert wurde. Eine weitere Bestätigung ergab sich durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467) unter Verwendung von Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) am Subgen-Konstrukt. Das PCR-Fragment wurde anschließend radioaktiv mit ³²P markiert und als Sonde bei der üblichen Hybridisierung von Southern-Blots und Genbibliotheken von gesamter zellulärer PS86A1- und PS52A1-DNA verwendet.
Eine Genbibliothek wurde aus der gesamten zellulären PS86A1-DNA, die partiell mit Sau3AI verdaut worden war, konstruiert. Partielle Restriktionsverdauungsprodukte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. DNA-Fragmente mit einer Größe von 9,3 bis 23 kbp wurden aus dem Gel ausgeschnitten, durch Elektroelution aus der Gelscheibe gewonnen, an einer Elutip-D-Ionenaustauschersäule (Schleicher und Schuell, Keene, NH) gereinigt und durch Ethanolfällung gewonnen. Die Sau3AI-Inserts wurden in BamHI-verdautes LambdaGem-11 (Promega, Madison, WI) ligiert. Ein rekombinanter Phage wurde gepackt und auf E. coli KW251-Zellen (Promega, Madison, WI) ausgestrichen. Plaques wurden einem Screening durch Übertragung von rekombinanter Phagen-DNA auf Filter und durch Hybridisierung mit der vorstehend beschriebenen PCR-Sonde unterzogen. Eine Hybridisierung wurde über Nacht bei 37 °C in einer Lösung durchgeführt, die aus 6 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 0,1 mg/ml einzelsträngiger Träger-DNA und 0,1 % SDS bestand. Die Filter wurden anschließend in 1 × SSPE und 0,1 % SDS bei 37 °C gewaschen, an der Luft getrocknet und sodann auf einen Röntgenfilm aufgelegt. Der hybridisierende Phage wurde einer Plaquereinigung unterzogen und zur Infektion von flüssigen Kulturen von E. coli KW251-Zellen zur Isolierung von DNA durch übliche Verfahren verwendet (Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1982). Ein Southern-Blot der plaquegereinigten, hybridisierenden Phagen-DNA, die mit ausgewählten Restriktionsendonucleasen verdaut worden war, unter Verwendung der PCR-amplifizierten Sonde und unter Anwendung von Waschbedingungen gemäß denn vorstehenden Angaben ergab ein EcoRV+SalI- Fragment von etwa 2,3 kbp, von dem angenommen wurde, dass es das PS86A1(b)-Gen enthielt.
Zur Subklonierung des PS86A1(b)-Gens, das für das Toxin von etwa 45 kDa kodierte, wurden präparative Mengen von Phagen-DNA mit EcoRV und SalI verdaut. Die Bande von etwa 2,3 kbp wurde in Smal+SalI-verdautes pHTBluell ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von gefrorenen, kompetenten E. coli-NM522-Zellen (ATCC 47000) verwendet. β-Galactosidasenegative Transformanten wurden einem Screening durch Restriktionsverdau von Alkalilysat-Plasmid-Miniprep DNA unterzogen. Das angestrebte Plasmidkonstrukt pMYC2344 enthält das PS86A1(b)-Toxin-Gen. pMYC2344 wurde durch Elektroporation in den akristalliferen (Cry-)-B. t.-Wirt CryB (A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN) eingeführt. Die Expression des Toxins wurde durch sichtbare Kristallbildung bei mikroskopischer Prüfung und durch SDS-PAGE-Analyse nachgewiesen. Das Genkonstrukt pMYC2344 in B. t. wird mit MR509 bezeichnet.
Eine Sequenz des 86A1(b)-Gens ist in SEQ ID NO. 2 dargestellt. Eine abgeleitete Aminosäuresequenz für das 86A1(b)-Toxin ist in SEQ ID NO. 3 dargestellt.
Die PS86A1(b)-Sonden, die Hybridisierung und die Waschbedingungen wurden ferner zur Klonierung eines verwandten Gens, nämlich PS52A1(b), aus Bacillus thuringiensis Stamm PS52A1 verwendet. Eine Genbibliothek wurde durch partiellen Verdau der gesamten zellulären PS52A1-DNA mit Sau3AI konstruiert. Partielle Restriktionsverdauungsprodukte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. DNA-Fragmente mit einer Größe von 9,3 bis 23 kbp wurden aus dem Gel ausgeschnitten, einer Elektroelution aus der Gelscheibe unterzogen, an einer Elutip-D-Ionenaustauschersäule gereinigt und durch Ethanolfällung gewonnen. Die Sau3AI-Inserts wurden in BamHI-verdautes LambdaGem-11 ligiert. Der rekombinante Phage wurde gepackt und auf E. coli-KW251-Zellen ausgestrichen. Plaques wurden einem Screening durch Hybridisierung mit der vorstehend beschriebenen PCR-Sonde unterzogen. Der hybridisierende Phage wurde plaquegereinigt und zur Infektion von flüssigen Kulturen von E. coli KW251-Zellen zur Isolierung von DNA nach üblichen Verfahren verwendet. Durch Southern-Blotting von plaquegereinigter hybridisierender Phagen-DNA, die mit ausgewählten Restriktionsendonucleasen verdaut worden war, unter Verwendung der PCR-Sonde ergab sich ein EcoRV+SalI-Fragment mit etwa 2,3 kbp, von dem angenommen wurde, dass es das PS52A1(b)-Gen enthielt.
Zur Subklonierung des PS52A1(b)-Gens, das für das Toxin von etwa 45 kDa kodierte, wurden präparative Mengen von Phagen-DNA mit EcoRV und SalI verdaut. Die Bande von etwa 2,3 kbp wurde in Smal+SalI-verdautes pHTBluell ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von gefrorenen, kompetenten E. coli NM522-Zellen verwendet. β-Galactosidase-negative Transformanten wurden durch Restriktionsverdau von Alkalilysat-Plasmid-Miniprep-DNA einem Screening unterworfen. Das angestrebte Plasmidkonstrukt, nämlich pMYC2349, enthält das 52A1(b)-Toxin-Gen, das im Vergleich zu anderen Toxin-Genen, die insektizide Proteine enthalten, neu ist. pMYC2349 wurde durch Elektroporation in den akristalliferen (Cry-)-B. t.-Wirt CryB eingeführt. Die Expression des Toxins wurde durch Bestätigung der Kristallbildung bei mikroskopischer Untersuchung und durch SDS-PAGE-Analyse nachgewiesen. Das Genkonstrukt pMYC2349 in B. t.erhielt die Bezeichnung MR510.
Eine Sequenz des 52A1(b)-Gens ist in SEQ ID NO. 4 dargestellt. Eine abgeleitete Aminosäuresequenz für das 52A1(b)-Toxin ist in SEQ ID NO. 5 dargestellt.
Beispiel 3 – Biologischer Test des MR509/86A1(b)-Toxins gegen Phyllotreta
Wilde Phyllotreta cruciferae wurden gesammelt und in Aufzuchtkammern bei 25 °C (Lichtperiode 16 (hell) : 8 (dunkel)) gehalten.5 Canola-Sämlinge (Hyola 401) wurden in übliche Pflanztöpfe ausgepflanzt. Cotyledonen wurden von den Sämlingen abgeschnitten und inB t. MR509-Suspensionen (100 μg Toxin/ml) getaucht, die mit 0,1 % Bond (Bond diente als Haftmittel) zubereitet worden waren. Ein einzelnes behandeltes Cotyledon ließ man trocknen und brachte es in eine Kunststoff-Vertiefung (NuTrend-Tabletts) mit einem Gehalt an etwa 1 ml eines 2%-igen Agargels. Das Agargel diente als Feuchtigkeitsquelle zur Verlängerung der Lebensdauer der abgeschnittenen Cotyledonen. Ein einzelner ausgewachsener Käfer wurde in jede Testvertiefung gebracht. Die Testansätze wurden bei Raumtemperatur aufgewahrt. Die Sterblichkeit und die Schädigung der Pflanzen wurde 4 und 7 Tage nach der Behandlung bestimmt. Die Cotyledonen-Schädigung wurde auf einer Skala von 1-10 bewertet, wobei 10 einer völligen Zerstörung des Pflanzengewebes entsprach.
Verschiedene Behandlungen ergaben eine verringerte Pflanzenschädigung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen und zu mit CryB (ein Kristall-minus B- t-Stamm) behandelten Kontrollen. Es wurde festgestellt, dass das Protein mit etwa 45 kda aus MR509 hochgradig aktiv gegen die getesteten Phyllotreta cruciferae-Schädlinge war. Dieses Toxin wird als das 86A1(b)-Gen bezeichnet.
Beispiel 4
Weitere biologische Tests – MR509/86A1(b) und MR510/52A1(b) gegen Phyllotreta spp.
MR509 und MR510 wurden in den folgenden Tests bewertet. CryB wurde als negative Kontrolle verwendet. Weitere negative Kontrollen bestanden in unbehandelten Blättern und der Bond-Lösung, die als "Spreader-Sticker" zugesetzt wurde.
Frisch ausgetriebene Cotyledonen wurden ausgeschnitten und in die Testsuspensionen getaucht. Nach dem Trocknen wurden die Cotyledonen mit zwei erwachsenen Erdflöhen infiziert. Die Blattschädigung wurde 4 Tage nach dem Befall bewertet. Die Bewertung der Blattschädigung erfolgte auf einer Skala von 0 bis 10, wobei 0 keine Schädigung bedeutet.
Die Klone MR509 und MR510 ergaben klare Anzeichen eines dosisabhängigen Schutzes der Blätter. Diese Aktivität war bei MR510 besonders offensichtlich.
Beispiel 5 – Schneiden der nativen 86A1(b)- und 52A1(b)-Toxine
Unter Anwendung bekannter Techniken, von denen einige vorstehend erörtert wurden, lassen sich die nativen Proteine schneiden. Diese geschnittenen Toxine können vom Fachmann unter Berücksichtigung der hier gegebenen Richtlinien in Verbindung mit den Fachkenntnissen einem Screening auf Aktivität unterzogen werden. Bevorzugte geschnittene Proteine sind in SEQ ED NO. 8-19 dargestellt. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, die für die beispielhaft aufgeführten, geschnittenen Proteine, sowie für andere Schnittprodukte, Fragmente und Varianten der beispielhaft aufgeführten Toxine kodieren, sofern die Schnittprodukte, Fragmente oder Varianten ihre pestizide Aktivität, vorzugsweise gegen Käferartige und insbesondere gegen Erdflöhe behalten.
Zu erfindungsgemäßen geschnittenen Toxinen gehören nicht nur Toxine mit Deletionen in den N-terminalen oder C-terminalen Bereichen, wie sie hier beispielhaft aufgeführt sind, sondern auch Toxine mit Deletionen sowohl an den N-terminalen als auch C-terminalen Bereichen des nativen Proteins. Zu Beispielen für derartige Schnittprodukte gehören Proteine, die sich zur Verwendung beliebiger der hier beispielhaft aufgeführten N-terminalen Deletionen zusammen mit beliebigen der hier beispielhaft aufgeführten C-terminalen Deletionen ergeben.
Beispiel 6 – Weitere Charakterisierung von 86A1(b)- und 52A1(b)-Toxinen
Ein polyklonaler Antikörper gegen das native Toxin 52A1(b) mit der Bezeichnung R#56 wurde entwickelt und gereinigt. Dieser Antikörper erkennt das native 86A1(b)-Toxin. Dieser Antikörper kann in Blotting-Screens (Dot-, Slot- und/oder Western-Blots) zur Feststellung der Tatsache herangezogen werden, ob Homologe der 52A1(b)- und 86A1(b)-Toxine in anderen Stämmen von Bacillus vorhanden sind.
Somit lassen sich gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weitere pestizide Toxine charakterisieren und/oder identifizieren, und zwar in Bezug auf ihr Reaktionsvermögen mit Antikörpern gegen die hier beispielhaft aufgeführten pestiziden Toxine. Antikörper können gegen die speziell als Beispiele aufgeführten Toxine der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Weitere Toxine, die unter den Umfang der Erfindung fallen, können sodann identifiziert und/oder charakterisiert werden, und zwar aufgrund ihrer Reaktivität mit den Antikörpern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Antikörpern um polyklonale Antikörper. Bei dieser Ausführungsform haben Toxine mit der größten Ähnlichkeit mit den 86A1(b)- oder 52A1(b)-Toxinen die höchste Reaktivität mit den polyklonalen Antikörpern. Toxine mit einer größeren Abweichung reagieren mit polyklonalen Antikörpern, jedoch in geringerem Ausmaß.
Beispiel 7 – Insertion von Toxin-Genen in Pflanzen
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Transformation von Pflanzen mit Genen, die für das erfindungsgemäße insektizide Toxin kodieren. Die transformierten Pflanzen sind gegen einen Angriff durch den Zielschädling resistent. Bevorzugte Gene werden in den transformierten Pflanzen und/oder transformierten Pflanzenzellen in stabiler Weise aufrechterhalten und in hohen Konzentrationen exprimiert. Ein Beispiel für ein bevorzugtes, synthetisches, pflanzenoptimiertes Gen ist in SEQ ID NO. 6 dargestellt, bei dem es sich um ein von MR510 abgeleitetes, dicot-optimiertes Gen handelt. Das durch dieses Gen kodierte Protein ist in SEQ ID NO. 7 dargestellt (Aminosäure-Abkürzungen gemäß IUPAC-Konvention).
Gene, die für die hier beschriebenen pestiziden Toxine kodieren, können unter Anwendung einer Vielzahl von Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, in Pflanzenzellen inseriert werden. Beispielsweise steht eine große Anzahl von Klonierungsvektoren, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht, umfassen, für die Bewerkstelligung der Insertion von fremden Genen in höhere Pflanzen zur Verfügung. Der Vektor umfasst beispielsweise pBR322, die pUC-Serie, die M13mp-Serie, pACYC184 und dergl. Demzufolge kann die Sequenz, die für das Bacillus-Toxin kodiert, in den Vektor an einer geeigneten Restriktionsstelle inseriert werden. Das erhaltene Plasmid wird zur Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, sodann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, eine Elektrophorese und/oder andere biochemisch-molekularbiologische Verfahren werden im allgemeinen als Analyseverfahren herangezogen. Nach jedem Manipulationsschritt kann die verwendete DNA-Sequenz abgespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Die einzelnen Plasmidsequenzen können in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Je nach dem Verfahren zum Inserieren der erwünschten Gene in die Pflanze können auch andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid für die Transformation der Pflanzenzelle verwendet wird, dann muss mindestens der rechte Rand, häufig aber der rechte und der linke Rand der Ti- oder Ri-Plasmid T-DNA als die flankierende Region der zu inserierenden Gene verbunden werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde eingehend untersucht und ist in folgenden Literaturstellen hinreichend beschrieben: EP-120 516; Hoekema, The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, (1985), Kapitel 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., Bd. 4, S. 1-46; und An et al., EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 277-287.
Nachdem die inserierte DNA in das Genom integriert worden ist, ist sie relativ stabil. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen unter anderem Resistenz gegen ein Biozid, ein Herbizid, wie Glyphosat oder BASTA, oder ein Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol, verleiht. Der jeweils verwendete Marker sollte dementsprechend die Selektion von transformierten Zellen im Unterschied zu Zellen, die die inserierte DNA nicht enthalten, ermöglichen.
Es steht eine große Anzahl von Techniken zur Insertion von DNA in eine Pflanzenwirtszelle zur Verfügung. Diese Techniken umfassen eine Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacteriuim rhizogenes als Transformationsmittel, eine Fusion, eine Mikroinjektion, ein biolistisches Verfahren (Mikropartikel-Bombardement), eine PEG-vermittelte DNA-Aufnahme oder eine Elektroporation sowie andere mögliche Verfahren. Wenn Agrobacteria für die Transformation verwendet werden, muss die zu inserierende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, nämlich entweder in einen Zwischenvektor oder in einen binären Vektor. Die Zwischenvektoren können in das Ti- oder Ri-Plasmid durch homologe Rekombination aufgrund von Sequenzen, die mit Sequenzen in der T-DNA homolog sind, integriert werden. Das Ti- oder Ri-Plasmid umfasst ferner die vir-Region, die zur Übertragung der T-DNA erforderlich ist. Zwischenvektoren selbst können in Agrobacteria keiner Replikation unterliegen. Der Zwischenvektor kann mittels eines Helferplasmids in Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können von sich aus sowohl in E. coli als auch in Agrobacteria einer Replikation unterliegen. Sie umfassen ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, die durch die rechten und linken T-DNA-Wandregionen eingerahmt sind. Sie können direkt in Agrobacteria transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 163 (1978), S. 181-187). Das als Wirtszelle verwendete Agrobacterium enthält ein Plasmid, das eine vir-Region enthält. Die vir-Region ist für die Übertragung der T-DNA in die Pflanzenzelle erforderlich. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das auf diese Weise transformierte Bakterium wird für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Pflanzenexplantate können in vorteilhafter Weise zusammen mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes zur Übertragung der DNA in die Pflanzenzelle gezüchtet werden. Vollständige Pflanzen können sodann aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stängelsegmente, Wurzeln, jedoch auch Protoplasten oder in Suspension gezüchtete Zellen) in einem geeigneten Medium, das Antibiotika, Herbizide oder Biozide für die Selektion enthalten kann, regeneriert werden. Die auf diese Weise erhaltenen Pflanzen können sodann auf die Anwesenheit der inserierten DNA getestet werden. Keine speziellen Anforderungen ergeben sich für die Plasmide im Fall der Injektion und Elektroporation. Es ist möglich, übliche Plasmide, z. B. pUC-Derivate, zu verwenden. Bei der biolistischen Transformation können Plasmid-DNA oder lineare DNA verwendet werden.
Die transformierten Zellen werden auf übliche Weise zu morphologisch normalen Pflanzen regeneriert. Wenn ein Transformationsereignis eine Keimlinienzelle umfasst, werden die inserierte DNA und das oder die entsprechenden phänotypischen Merkmale auf die Pflanzen der folgenden Generationen übertragen. Derartige Pflanzen können auf übliche Weise gezüchtet und mit Pflanzen gekreuzt werden, die die gleichen transformierten Erbfaktoren oder andere Erbfaktoren aufweisen. Die erhaltenen Pflanzen der folgenden Generationen weisen entsprechend den Regeln der genetischen Segregation die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Pflanzen mit Genen transformiert, wobei die Codonanwendung für Pflanzen optimiert worden ist; vergl. beispielsweise US-Patent 5 380 831. Ferner wird in vorteilhafter Weise DNA, die für ein geschnittenes Toxin kodiert, verwendet. Das geschnittene Toxin kodiert typischerweise für etwa 55 bis etwa 80 % des Toxins von voller Länge. Verfahren zur Erzeugung von synthetischen Bacillus-Genen zur Verwendung in Pflanzen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid, das für ein pestizides Protein kodiert, wobei das Polynucleotid oder sein Komplement nach Waschen mit 0,2 × oder 1 × SSPE bei 65 °C die Hybridisierung mit einer Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 und SEQ ID NO.6 ausgewählt ist, aufrechterhält.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die aus SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 und SEQ ID NO.7 ausgewählt ist.
Polynucleotid nach Anspruch 2, das SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4 oder SEQ ID NO.6 umfasst.
Isoliertes pestizides Protein, das durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, wobei diese Sequenz oder deren Komplement nach Waschen mit 0,2 × oder 1 × SSPE bei 65 °C eine Hybridisierung mit einer Nucleotidsequenz, die aus SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4 oder SEQ ID NO.6 ausgewählt ist, aufrechterhält.
Protein nach Anspruch 4, das SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.5 oder SEQ ID NO.7 umfasst.
Rekombinanter nicht-humaner Wirt, umfassend ein Polynucleotid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert.
Wirt nach Anspruch 6, bei dem es sich um eine Pflanze oder Pflanzenzelle handelt.
Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen, welches das Kontaktieren der Schädlinge mit einem Protein, wie in Anspruch 4 oder 5 definiert, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei den Schädlingen um Coleoptera-Insekten handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Schädlinge zur Gattung Phyllotreta gehören.