DE69534846T2

DE69534846T2 - Neue polypeptide mit toxischer aktivität gegen insekten der familie der dipteren

Info

Publication number: DE69534846T2
Application number: DE69534846T
Authority: DE
Inventors: Armelle Delecluse; Isabelle Thiery
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-08-25
Filing date: 1995-08-24
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2015-08-25
Also published as: JPH10505743A; ATE319831T1; US6071877A; FR2723961B1; EP0777734A2; PT777734E; ES2260763T3; WO1996006171A2; FR2723961A1; DK0777734T3; DE69534846D1; WO1996006171A3; EP0777734B1

Description

Die biologische Bekämpfung von Insekten der Familie der Dipteren, umfassend zum Beispiel die Stechmücken und die Kriebelmücken, Vektoren tropischer Krankheiten, wird vor allem mit Hilfe des Bakteriums Bacillus thuringiensis ser. israelensis (Bti) des Serotyps H14, oder mit Hilfe von Bacillus sphaericus durchgeführt. Diese beiden Bakterien synthetisieren während der Sporulation Proteinansammlungen in Form von Kristallen, die für die Insektenlarven bei Aufnahme toxisch sind. Die Kristalle von B. thuringiensis ser. israelensis sind hauptsächlich aus 4 Polypeptiden, CryIV A (125 kDa), CryIV B (135 kDa), CryIV D (68 kDa) und Cyt A (28 kDa) (Höfte H. et al., 1989 Microbiol. Rev. 53: 242-255) zusammengesetzt. Die Kristalle von B. sphaericus bestehen aus 2 Polypeptiden von 51 und 42 kDa. Diese Proteine haben verschiedene Spezifitäten und jede von ihnen trägt zur Gesamttoxizität bei, wobei sie gegebenenfalls synergetisch wirken. Hinsichtlich des Ziels, das eventuelle Auftreten von gegen die Toxine von Bti resistenten Insekten zu beseitigen, wurde eine Suche nach neuen Stämmen unternommen, die eine Aktivität gegen die Stechmücken zeigen.
Die Stämme von B. thuringiensis, die gegen Stechmücken aktiv sind, können gemäß ihrer larvenabtötenden Aktivität, ihrer Kristallproteinzusammensetzung und der Gegenwart von Genen, die mit jenen des Stamms B. thuringiensis ser. israelensis verwandt sind, in vier Gruppen eingeteilt werden:

(1) die Gruppe 1 enthält die sechs Stämme von B. thuringiensis, die von morrisoni PG14 (H8a8b), beziehungsweise canadiensis 11S2-1 (H5a5c), thompsoni B175 (H12), malaysiensis IMR81.1 (H36), K6 (autoagglutinierend) und B51 (autoagglutinierend) dargestellt werden, und die eine ähnliche larvenabtötende Aktivität und ähnliche Kristall-Polypeptide haben wie B. thuringiensis ser. israelensis,
(2) die Gruppe 2 umfasst die beiden Stämme von B. thuringiensis medellin 163-131 (H30) und jegathesan 367 (H28a28c), die beinahe ebenso toxisch sind wie der Stamm B. thuringiensis ser. israelensis, die jedoch verschiedene Polypeptide herstellen,
(3) die Gruppe 3 umfasst den Stamm darmstadiensis 73E10-2 (H10a10b), der andere Polypeptide synthetisiert als die, die in den Kristallen von B. thuringiensis ser. israelensis gefunden wurden, der jedoch nur im Hinblick auf Stechmücken aktiv ist, und
(4) die Gruppe 4, die die beiden Stämme fukuokaensis (H3a3d3e) und Kyushuensis 74 F6-18 (H11a11c) einschließt, die nur schwach toxisch sind.

Auf Grund der schwachen Toxizität der Stämme der Gruppen 3 und 4 wurden diese Stämme nicht gründlicher untersucht.
Von allen isolierten Stämmen schien der Stamm B. thuringiensis ser. jegathesan 367 (Btjeg), vom Serotyp H28a 28c sowohl von seiner Aktivität als auch von der Polypeptidzusammensetzung seiner Kristalle her interessant zu sein. Dieses Bakterium stellt wie Bti während der Sporulation Kristalle her, die bei Aufnahme für die Larven von Stechmücken toxisch sind. Dieser Stamm wurde in Malaysia von L. LEE isoliert und wie für einen neuen Untertyp üblich identifiziert.
Die Kristalle von B. thuringiensis ser. jegathesan enthalten 7 Haupt-Polypeptide, die ein Molekulargewicht von 80, 72-70, 65, 37, 26 beziehungsweise 16 kDa haben. Das Protein von 37 kDa ist immunologisch mit einem Bestandteil des Kristalls von B. thuringiensis ser. israelensis verwandt, während die anderen Proteine nur schwache und unterschiedliche Kreuzreaktionen ergeben. Es wurde kein Gen in diesem Stamm nachgewiesen, das mit jenen von B. thuringiensis ser. israelensis verwandt ist, was anzeigt, dass die Kristallproteine von einer neuen Klasse von Toxingenen codiert werden könnten.
Die Erfinder haben innerhalb der Gesamt-DNA eines Btjeg 367-Stamms Codierungssequenzen für Polypeptide identifiziert, die in der Lage sind, die toxische Aktivität des Stamms insbesondere gegenüber Insekten der Familie der Dipteren zu induzieren oder an ihr teilzunehmen.
Die Erfindung hat demnach Nucleotidsequenzen zum Ziel, die Polypeptide codieren, die gegenüber Insekten eine toxische Aktivität haben. Ziel-Insekten sind zum Beispiel Insekten der Familie der Dipteren, genauer Stechmücken oder Kriebelmücken, und insbesondere die Larven dieser Insekten. Indessen ist nicht ausgeschlossen, dass die Polypeptide, die ausgehend von Sequenzen der Erfindung erhalten wurden, gegenüber Insekten anderer Familien eine Aktivität zeigen können.
Die Anmeldung betrifft gleichermaßen Polypeptide, die eine larvenabtötende Aktivität gegenüber Insekten haben, oder Polypeptide, die in der Lage sind, an einer solchen toxischen Aktivität teilzunehmen, gegebenenfalls dadurch, dass sie eine synergetische Wirkung mit den Polypeptiden haben, die diese Aktivität bestimmen.
Somit sind die Polypeptide der Erfindung in der Lage, gegenüber einem gegebenen Ziel sowohl die toxische Aktivität zu induzieren, als auch die Menge der Toxizität zu erhöhen.
Gleichermaßen in den Bereich der Erfindung eingeschlossen sind larvenabtötende Zusammensetzungen, umfassend die Polypeptide der Erfindung oder rekombinante Organismen, die in der Lage sind, solche Polypeptide zu exprimieren, gegebenenfalls in Verbindung mit anderen Bestandteilen, zum Beispiel anderen Polypeptiden oder rekombinanten Zellen, die in der Lage sind, die untersuchte toxische Wirkung zu erhöhen, welche gegebenenfalls von anderen Organismen, zum Beispiel von Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, Clostridium bifermentans, abstammen.
Eine erste Gruppe von Sequenzen enthält eine erste Nucleotidsequenz, die dadurch charakterisiert ist, dass sie dem Fragment HindIII von etwa 4,3 kB entspricht, das ausgehend vom Plasmid pJEG80.1, hinterlegt beim CNCM unter der Nummer I-1469 am 23. August 1994, erhalten werden kann, oder das unter stringenten Bedingungen mit diesem Plasmid hybridisieren kann.
Die Restriktionskarte der Sequenz von Btjeg, enthalten im rekombinanten Plasmid pJEG80.1, wird in 3 dargestellt, und zeigt die Startstelle des Gens jeg80, sowie seine Transkriptionsrichtung.
Gemäß einer Realisationsweise, die für die vorliegende Erfindung besonders ist, wird eine Nucleotidsequenz dieser ersten Gruppe in das HindIII-Fragment von etwa 4,3 kB eingeschlossen, das in der 3 dargestellt ist, so wie sie ausgehend vom Plasmid pJEG80.1, hinterlegt bei der CNCM, isoliert werden kann. Ein interessantes Fragment ist zum Beispiel das Fragment HindIII-Ndel von etwa 2,2 kB. Dieses Fragment enthält den Ursprung des Gens jeg80.
Gemäß einer anderen Realisationsweise, die für die Erfindung besonders ist, wird die Nucleotidsequenz, die der vorhergehenden Definition entspricht, außerdem dadurch charakterisiert, dass sie die Verbindung der Nucleotide, die in 4 dargestellt ist, umfasst.
Die Erfindung betrifft außerdem das Gen jeg80, dargestellt in 5A, dessen Codierungssequenz zwischen den Nucleotiden 64 und 2238 eingeschlossen ist.
Die Erfindung zielt auch auf die Nicht-Codierungssequenz des Gens jeg80 stromaufwärts der Codierungssequenz ab, die die Regulierungssequenzen der Expression des Gens enthält. Insbesondere zielt die Erfindung auf das Fragment ab, das zwischen den Nucleotiden 1 und 124 der Verbindung, dargestellt in 4, eingeschlossen ist.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Nucleotidsequenzen, die in Bezug auf vorstehend definierte Sequenzen definiert wurden, zum Beispiel durch Deletion, Addition oder Substitution von Nucleotiden, dadurch charakterisiert, dass sie unter stringenten Bedingungen mit einer der vorstehend identifizierten Sequenzen hybridisieren, und dadurch, dass sie außerdem ein Polypeptid codieren, das eine toxische Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren aufweist, oder an dieser Wirkung beteiligt ist.
Unter den Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung versteht man Peptide, Polypeptide oder Proteine, beziehungsweise ganze Aminosäuresequenzen, die die erforderlichen Eigenschaften haben.
Die festgestellte Toxizitätswirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren soll in keinem Fall als für die Definition der Sequenzen der Erfindung limitierend erachtet werden. Im Gegenteil stellt dieser Bezug auf die Dipteren nur ein Bewertungskriterium von Interesse an einer bestimmten Sequenz dar, wobei man jedoch weiß, dass die Ziel-Insekten hinsichtlich der toxischen Wirkung zu anderen Familien gehören können.
Die bezüglich Insekten der Familie der Dipteren festgestellte Toxizität kann zum Beispiel an Stechmücken oder Kriebelmücken oder an den Larven dieser Insekten getestet werden.
Die toxische Aktivität des Expressionsprodukts einer Nucleotidsequenz der Erfindung kann durch Messen der letalen Dosis erhoben werden, die für die Tötung von 50% einer Probe von Larven getesteter Insekten (LD₅₀) notwendig ist, wenn der Test in 150 ml Wasser mit 5 Larven pro Becher durchgeführt wird, wobei sich die Larven für Aedes aegypti und Culex pipiens im Stadium L4 und für Anopheles stephensi im Stadium L3 befinden. Variable Mengen der Toxine werden den Bechern zugesetzt. Die Larven von Culex und Anopheles werden mit Bierhefe in einem Verhältnis von 50 mg/l ernährt. Die Ablesung des Tests erfolgt nach 24 h und nach 48 h.
Eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das eine toxische Aktivität gegenüber Insekten der Familie der Dipteren gemäß der Erfindung hat, ist zum Beispiel eine Sequenz, die ein Polypeptid codiert, das ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa hat.
Die Erfindung hat auch jedes Fragment, das aus einer Nucleotidsequenz hervorgeht, das einem der vorstehenden Kriterien entspricht und das unter stringenten Bedingungen mit einer dieser Sequenzen hybridisiert, zum Ziel, wobei das Fragment mindestens 9 Nucleotide hat. Solche Fragmente sind vor allem zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder als Startoligonucleotide für die Ausführung von Amplifikations-Kettenreaktionen wie der PCR bestimmt. Eine interessante Nucleotidsequenz ist zum Beispiel die Sequenz j80, die der folgenden Verbindung entspricht:
AATAATATGATIAATTTTCCIATGTA (26-mer).
Der vorliegende Antrag hat ebenfalls eine zweite Gruppe von Nucleotidsequenzen zum Ziel, von denen ein Vertreter zum Beispiel eine Nucleotidsequenz ist, die dadurch charakterisiert wird, dass sie ein Polypeptid codiert, das in Verbindung mit einem Polypeptid, das durch eine vorstehend beschriebene Nucleotidsequenz der ersten Gruppe codiert wird, in der Lage ist, an der toxischen Wirkung der letzteren gegen Insekten der Familie der Dipteren teilzuhaben, wobei diese Sequenz außerdem mit dem Oligonucleotid j66 hybridisiert, das die folgende Sequenz hat:
ATGCATTATTATGGIAATIGIAATGA
Die Definition dieser Nucleotidsequenz schließt in Bezug auf seine Fähigkeit, über eine der Sequenzen der ersten Gruppe an der toxischen Wirkung des codierten Polypeptids teilzunehmen, die Möglichkeit nicht aus, dass diese Nucleotidsequenz ein Peptid codiert, das in isolierter Form eine toxische Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren hat.
Das Interesse an dieser zweiten Gruppe von Nucleotidsequenzen kann sich zum Beispiel daraus ergeben, dass ihre Verbindung mit Polypeptiden, die von der vorstehend definierten ersten Gruppe von Sequenzen codiert wurden, in einer solchen Synergie ablaufen kann, dass die toxische Wirkung der Polypeptidverbindung größer ist als die Summe der individuellen Aktivitäten jedes Polypeptids der Verbindung. Eine besondere Nucleotidsequenz dieser zweiten Gruppe codiert ein Polypeptid von etwa 66 kDa.
Eine dritte Gruppe von Nucleotidsequenzen wird dadurch charakterisiert, dass sie Polypeptide codieren, die in Verbindung mit einem Polypeptid, das durch eine Nucleotidsequenz der ersten Gruppe oder der zweiten Gruppe codiert werden, in der Lage sind, an der toxischen Wirkung dieser Polypeptide gegen Insekten der Familie der Dipteren teilzunehmen, wobei diese Nucleotidsequenzen darüber hinaus dadruch charakterisiert sind, dass sie mit dem Oligonucleotid j37 hybridisieren, das die folgende Sequenz hat:
AATATIGAAATIGCIACAAGAGATTA
Eine bevorzugte Nucleotidsequenz dieser dritten Gruppe ist dadurch charakterisiert, dass sie ein Polypeptid von etwa 37 kDa codiert.
Die Erfindung hat eine vierte Gruppe von Nucleotidsequenzen zum Ziel, die ein Polypeptid codieren, das in Verbindung mit mindestens einem der vorstehenden, ebenfalls in der Lage ist, an der toxischen Wirkung teilzuhaben, die gegen Insekten der Familie der Dipteren beobachtet wurde, wobei die Sequenzen dieser vierten Gruppe ein Polypeptid codieren, das ein Molekulargewicht von etwa 70 kDa hat oder das eine Immunreaktion mit diesem Peptid hervorruft.
Die Hybridisierungsbedingungen mit den Oligonucleotiden sind stringente Hybridisierungsverfahren, die in dem Kit „ECL 3' oligo-labelling detection kit" von Amersham beschrieben sind, wobei die Hybridisierungstemperatur bei 42°C liegt und die zweite Waschung nach der Hybridisierung in 1 × SSC-0,1%SDS durchgeführt wurde.
Die Erfindung hat außerdem die Sequenzen zum Ziel, die die des Gens jeg80 umgeben, das dem ISjeg zwischen den Nucleotiden 2812 und 3618 der Sequenz der 6 und der intergenischen Region zwischen den Nucleotiden 1604 und 284 der 6 entspricht.
Die Erfindung hat auch einen Clonierungs- oder Expressionsvektor zum Ziel, dadurch charakterisiert, dass er eine Nucleotidsequenz umfasst, die den vorstehend angegebenen Definitionen entspricht.
Ein besonders bevorzugter Vektor ist das Plasmid pJEG80.1, hinterlegt bei der CNCM am 23. August 1994 unter der Nr. I-1469.
Der vorliegende Antrag hat auch Polypeptide zum Ziel, die dadurch charakterisiert sind, dass sie in einer rekombinanten Zelle aus mindestens einer der Nucleotidsequenzen der ersten, zweiten, dritten oder vierten Gruppe, so wie sie auf den vorstehenden Seiten definiert wurden, das Expressionsprodukt bilden.
Die Erfindung betrifft insbesondere das Polypeptid Jeg80, das durch das Gen jeg80, das in der 5A dargestellt ist, codiert wird.
Bevorzugte Polypeptide sind zum Beispiel das Polypeptid von etwa 80 kDa, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in 4 dargestellt wird, oder das Polypeptid von etwa 80 kDa, das der Aminosäuresequenz entspricht, die in 5B dargestellt ist, oder jedes Fragment dieses Polypeptids, das mit Antikörpern reagiert, die gegen das Protein von 80 kDa gerichtet sind, das der Sequenz der 5B entspricht und/oder eine toxische Wirkung gegen Insektenlarven der Familie der Dipteren zeigt.
Die Polypeptide der Erfindung können allein oder in Kombination verwendet werden. Diese Kombinationen (oder Gemische) können wie vorstehend beschrieben verschiedene Polypeptide der Gruppen I, II, III oder IV umfassen, und/oder ein Gemisch aus einem oder mehreren dieser Polypeptide mit anderen Polypeptiden, die aus unterschiedlichen Organismen, und insbesondere aus Stämmen von Bti, B. sphaericus oder C. bifermentans hervorgegangen sind, die gleichermaßen eine toxische Wirkung gegen Insekten haben.
Ebenfalls in den Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind rekombinante Zellen, die, wie auf den vorstehenden Seiten beschrieben, durch eine Nucleotidsequenz, oder durch einen Vektor, der eine dieser Sequenzen enthielt, modifiziert wurden.
Diese rekombinanten Wirtszellen sind prokaryotische oder eukaryotische Zellen und es kann sich zum Beispiel um Bakterienzellen handeln, zum Beispiel um Stämme von Bacillus thuringiensis, den Stamm Bti oder um Bacillus sphaericus, sogar um Clostridium bifermentans.
Handelt es sich um B. thuringiensis, so wird Bezug genommen auf die Veröffentlichung von Lereclus D. et al. (1989), FEMS Microbiology Letters 60, 211- 218, in der das Transformationsverfahren (durch Einführen von Genen von Toxinen in Bt) von B. thuringiensis beschrieben wird.
Handelt es sich um B. sphaericus, so bezieht man sich zum Beispiel auf die Veröffentlichung von Taylor L.D. et al (1990) FEMS Microbiology Letters 66, 125-128.
Eine andere Zelle gemäß der Erfindung kann eine eukaryotische Zelle, zum Beispiel eine pflanzliche Zelle sein.
Die rekombinanten Zellen können zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung verwendet werden, sie können jedoch genauso in toxischen Zusammensetzungen gegen Insekten verwendet werden.
Der Antrag hat auch polyclonale Antikörper zum Ziel, die gegen eines der vorstehend definierten Polypeptide gerichtet sind, oder weiterhin ein polyclonales Serum, das gegen ein Gemisch aus mehreren von ihnen gerichtet ist.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung erscheinen in den folgenden Beispielen und Figuren.
1A Kristall-Polypeptid-Zusammensetzung des Stamms Btjeg
Kristalle der natürlichen Stämme Bti und Btjeg und des rekombinanten Stamms 407 (pJEG80.1) wurden gereinigt und auf 10%-SDS-Polyacrylamid-Gel platziert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Molekülmasse (in kDa) der Standardproteine ist rechts dargestellt. Die Molekülmassen der Proteine von Btjeg sind links angezeigt. Quellen: 1, Bti; 2, Btjeg; 3, 407 (pJEG80.1).
1B Analyse der in den Einschlussprodukten enthaltenen Proteine beim Stamm 407 (pJEG80.1).

A: gereinigte Einschlüsse, entsprechend 10 μg Protein, die einer Elektrophorese unterzogen und mit Coomassie-Blau gefärbt sind.
B: gereinigte Einschlüsse, entsprechend 1 μg Protein, die einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrozellulose-Filter überführt wurden. Der Filter wurde mit dem Antiserum (5.000-fach verdünnt) gegen die Gesamt-Kristalle von Bt ser. jegathesan (a), ser. medellin (b), ser. darmstadiensis (c), ser. israelensis (d) oder gegen die gereinigten gelösten Einschlüsse, zusammengesetzt aus CryIVA (e), CryIVB (f), CryIVD (g) oder CytA (h), inkubiert. Die immunreaktiven Polypeptide wurden mit einem zweiten Antikörper offenbart, der mit der Peroxidase (20.000-fach verdünnt) konjugiert war. Die Pfeile zwischen A und B geben die Position von Jeg80 an. Die Zahlen links geben die Molekulargewichte (kDa) der Standardproteine an; Zeile 1: die gereinigten Einschlüsse des Stamms Btjeg 407; Zeile 2: die gereinigten Einschlüsse des Stamms 407 (pJEG80.1).

2 – Sonden, die verwendet wurden, um die Gegenwart von Genen von Toxinen von Bti bei Btjeg zu bestimmen.
3 – Restriktionskarte des Plasmids pJEG80.1

Vektor pHT315
Fragment, das mit dem Oligonucleotid j80 hybridisiert
Start des Gens jeg80 und Richtung der Transkription
DNA-Fragment von Btjeg, das an der Stelle HindIII des Plasmids pHT315 cloniert wurde Restriktionsstelle des Polylinkers Für die folgenden Enzyme wurde keine Restriktionsstelle gefunden: BamHI, BgIII, Clal, EcoRV, Kpnl, Ncol, SacI, SacII, Smal, SphI, XbaI et XhoI H = HindIII; E = EcoRI; K = KpnI; Hp = HpaI; B = BamHI; N = NsiI; Nd = NdeI; P = PstI; Pv = PvuII; Sm = SmaI; Sp = SphI; Ss = SstI; Sl = SalI; Sy = StyI; X = XbaI.

4 – Nucleotidsequenz eines Teils des Gens jeg80 und Aminosäuresequenz entsprechend der Codierungssequenz: die eingerahmte Sequenz entspricht der Aminosäuresequenz, die durch Mikrosequenzierung bestimmt wurde.
5 –

A: Gen jeg80: Die potenzielle Verbindungsstelle am Ribosom ist unterstrichen. Die Start- und Stopcodons der Transduktion sind angezeigt. Die invertierte Wiederholungssequenzen sind durch Pfeile markiert.
B: Aminosäuresequenz des Proteins JEG80.

6 – Nucleotidsequenz des Gens jeg80 (Codierungssequenz eingeschlossen zwischen den Nucleotiden 1352 und 3526) und von ISjeg (Inverted repeat Sequence) (Nucleotide 58 bis 864). Die Start- und Stopcodons der Transduktion sind unterstrichen. Der potenzielle Terminator der Trankription des Gens jeg80 ist durch Pfeile angezeigt. Die Wiederholungssequenzen in umgekehrter Richtung, die das ISjeg eingrenzen, sind eingerahmt.
7 – Vergleich der Sequenzen von Jeg80 und CryIVD. Die identischen Aminosäuren, die sich entsprechen, sind eingerahmt. Die identischen Reste auf dem funktionellen Organismus sind durch Punkte angezeigt (die beibehaltenen Substitutionen sind I, L, V und M; D und E; Q und N; K und R; T und S; G und A; und F und Y). Die ähnlichen Regionen in den Blöcken 1 und 4, die in allen Proteinen, CryI, CryII, und bestimmten CryIV vorhanden sind, sind angezeigt. Die vertikalen Pfeile stellen die Spaltungsstellen für die Proteasen im gelösten CryIVD-Toxin dar (Ref. 11). Die Zahlen zeigen den letzten Rest jeder Zeile für jedes Protein an.
MATERIALIEN UND METHODEN
Bakterienstämme und Plasmide
E. coli TG1 [K12, Δ (lac-proAB) sugE thi hdsD F' traD36 proA^± proB^± lacZ Δ lacl⁹ lacZΔM15)] und PHT315 (Arantès, O. et al. (1991) Gene 108:115-119) wurden als Wirte für die Clonierung beziehungsweise als Vektoren verwendet. B. thuringiensis ser. jegathesan 367 wurde verwendet, um die Kristalle vom Wildtyp und die DNA für die Clonierungsversuche zu reinigen. B. thuringiensis ser. thuringiensis SPL407 (Lereclus D. et al. (1989), FEMS Microbiology Lett. 60, 211-218) wurde als Empfängerstamm für die Transformationsversuche verwendet. Der Stamm B. thuringiensis ser. israelensis 4Q2-81 (pHT640) wurde als Quelle für die Einschlüsse von CryIVD (Poncet, S. et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:3928-3930) verwendet.
B. thuringiensis SPL407 wurde durch Elektroporation gemäß dem Verfahren, das in der vorstehend zitierten Veröffentlichung beschrieben wurde (Lereclus, D. et al.), transformiert, und E. coli wurde gemäß der vorstehend in der Veröffentlichung von Lederberg, E.M. et al. (1974) J. Bacteriol. 119:1072-1074 gegebenen Beschreibung, transformiert. Die Antibiotika-Konzentrationen für die Selektion der Bakterien lag bei 25 μl Erythromycin pro ml und bei 100 μg Ampicillin pro ml.
DNA-Manipulationen
Die Restriktionsenzyme T4 DNA-Ligase und alkalische Kälberdünndarm-Phosphatase wurden gemäß der Beschreibung von Sambrook et al. (Sambrook, J. et al. (1989), A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) und gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet.
Die Gesamt-DNA wurde gemäß der Beschreibung von Delécluse, A. et al. (1991) J. Bacteriol. 173:3374-3381, von B. thuringiensis ser. jegathesan isoliert. Die Plasmid-DNA wurde durch ein alkalisches Standard-Lyseverfahren wie durch Birnboim H.C. et al. (1979), Nucleic Acids Res. 7:1513-1523 beschrieben, aus E. coli extrahiert und ergänzend unter Verwendung des Qiagen Kits (Qiagen GmbH, Deutschland) gereinigt. Die DNA-Fragmente wurden mit dem Prep A Gene DNA-Reinigungs-Kit (BioRad, Hercules, Kalifornien) auf Gelagarose gereinigt.
Die Erfahrungen der Hybridisierung wurden auf Hybond N⁺-Filtern (Amersham, Buckinghamshire, Vereinigtes Königreich) durchgeführt. Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung des ECL 3'-Oligolabeling Oligonucleotid-Markierungssytems (Amersham) mit Fluorescein markiert.
Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) mit dem Sequenase Version 2,0-Kit (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) und α-³⁵S-dATP (>37 TBq/mmol; Amersham) aus denaturierten Plasmiden in alkalischem Medium bestimmt. Eine Reihe von synthetischen Oligonucleotiden (Eurogentec, Belgien) wurde verwendet, um die Sequenz aus zwei Strängen zu bestimmen.
Die Analyse-Software von Sequenzen von Genetics Computer Group wurde verwendet (Universität von Wisconsin, Madison).
WISSENSCHAFTLICHE ERGEBNISSE
1 – Polypeptid-Zusammensetzung und Wirkung von Kristallen von Btjeg
Der Stamm Btjeg 367 wurde im üblichen Glucosemilieu bei 30°C unter Agitation über etwa 72 Stunden bis zur Lyse der sporulierenden Bakterien gezüchtet. Die Gemische von Sporen und Kristallen wurden durch Zentrifugation geerntet, und die Kristalle wurden auf einem Saccharose-Gradienten gemäß dem durch THOMAS und ELLAR beschriebenen Verfahren (THOMAS und ELLAR, 1983, J. Cell. Sci., 60, 181-197) gereinigt. Die Analyse der Polypeptid-Zusammensetzung dieser Kristalle wurde durch Elektrophorese auf Polyacrylamid-SDS-Gel gefolgt von einer Färbung mit Coomassie-Blau ausgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse, die in 1 dargestellt sind, zeigen, dass die Kristalle des Stamms Btjeg aus mehreren Polypeptiden von 80, 72, 70, 66, 50, 37 und 28 kDa bestehen (von denen einige Abbauprodukte sein könnten).
Versuche zum Immunnachweis, die mit Hilfe eines Serums, das gegen die Proteine von Bti gerichtet war, durchgeführt wurden, konnten zeigen, dass das Protein von 37 kDa immunologisch mit den Toxinen von Bti verwandt ist; ein Protein von etwa 100 kDa, das nach Färben mit Coomassie-Blau nicht nachgewiesen wurde, reagiert ebenfalls mit diesem Serum.
Die Kristalle dieses Stamms zeigen auf Larven von Aedes aegypti, Anopheles stephensi und Culex pipiens eine geringere Toxizität als jene, die mit den Kristallen von Bti erhalten wurde, die jedoch nichtsdestoweniger wichtig ist, wie in der folgenden Tabelle gezeigt wird.
2 – Vorkommen von Genen bei Btjeg, die Toxine codieren, die ähnliche Eigenschaften wie jene von Bti haben
Die Gesamt-DNA des Stamms Btjeg 367 wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert (DELECLUSE et al., 1991, J. Bacteriol., 173, 3 374-3 381), danach durch das Enzym EcoRI hydrolysiert. Die erhaltenen Fragmente wurden durch Elektrophorese auf 0,6% Agarosegel getrennt, und danach auf eine Nylonmembran überführt (Hybond N⁺, Amersham).
Darüber hinaus wurden die Gene CryIVA, CryIVD und CytA von Bti nach Hydrolyse der rekombinanten Plasmide pHT606, pHT611 und pCB4 wie in 2 angezeigt, gewonnen. Die DNA-Fragmente, die die Gene von Bti enthielten, wurden nach Trennung auf Agarosegel gereinigt, und dann mit Hilfe des „ELC direct nucleic acid labelling"-Kits (Amersham) an der Peroxidase markiert und in den Hybridisierungsversuchen mit der hydrolysierten Gesamt-DNA des Stamms Btjeg verwendet.
Zwischen der DNA des Stamms Btjeg und den Genen von Bti wurde, zumindest unter den verwendeten Hybridisierungsbedingungen (80% Homologien) keine Hybridisierung erhalten.
3 – Clonierung der Gene des Stamms Btjeg, die Toxine codieren
a) Bestimmung der Aminosäuresequenzen der Proteine von Btjeg
Die aminoterminalen Sequenzen der Proteine von 80, 66 und 37 kDa wurden im Mikrosequenzierungslabor des Institut Pasteur unter Verwendung eines automatischen Sequenzierungsgeräts (Applied Biosystems) bestimmt, danach wurde Protein auf die Problot-Membranen (Applied Biosystems) überführt; die so erhaltene Reihenfolge wird in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Oligonucleotide, die den Proteinen JEG80, JEG66 und JEG37 entsprechen (unterstrichene Sequenzen), wurden unter Verwendung des genetischen Codes, der für mehrere Gene von B. thuringiensis bestimmt wurde und bei jeder Zweideutigkeit unter Einschluss von Inosin synthetisiert. Die Sequenz dieser Oligonucleotide ist in der Tabelle dargestellt.
In diesen Sequenzen stellt „I" das Desoxyinosin dar, das als neutrale Base für alle Positionen verwendet wurde, die drei oder vier Nucleotiden entsprechen könnten.
b) Hybridisierung von Oligonucleotiden auf der Gesamt-DNA des Stamms Btjeg
Hybridisierungsversuche wurden zwischen den mit Fluorescein markierten Oligonucleotiden und der Gesamt-DNA des Stamms Btjeg durchgeführt, die durch EcoRI, HindIII, XbaI oder PstI hydrolysiert worden war. Das Kaltsonden-Verfahren (3'-Oligonucleotid-Markierungssystem, Amersham) wurde verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
Die Sonde hybridisierte bei 42°C spezifisch mit einem einzigartigen HindIII Restriktionsfragment von etwa 4 kB und mit einem einzigartigen EcoRI Restriktionsfragment von etwa 2 kB.
c) Clonierung des codierenden Gens für das Protein JEG80
Unter Verwendung des bifunktionalen Plasmids pHT315 (ARRANTES und LERECLUS, 1991, Gene 108, 115-119) als Clonierungsvektor wurde eine DNA-Bank des Stamms Btjeg in E. coli TGI hergestellt. Die Gesamt-DNA des Stamms Btjeg wurde durch HindIII hydrolysiert, daraufhin einer Elektrophorese auf Agarosegel unterzogen. Fragmente von etwa 2 bis 6 kB wurden gereinigt und in diesen Vektor cloniert. Die Fragmente HindIII von 3 bis 5 kB wurden in die HindIII-Stelle des Transportvektors pHT315 inseriert, der mit alkalischer Phosphatase behandelt war. Die nach Transformation des Stamms E. coli TGI mit den erhaltenen Ligationsgemischen erhaltenen rekombinanten Clone wurden auf ihre Hybridisierung mit dem markierten Oligonucleotid j80 hin getestet. Von 1 000 erhaltenen rekombinanten Clonen zeigten 5 eine positive Reaktion. Ein rekombinanter Clon, JEG80.1, wurde ausgewählt und analysiert. Dieser Clon enthielt ein rekombinantes Plasmid (pJEG80.1) von 10,9 kB; wobei das HindIII-Fragment von DNA in einer Größe von 4,3 kB inseriert war.
4 – Analyse des rekombinanten Clons JEG80.1
a) Bestimmung der Restriktionskarte des Plasmids pJEG80.1
Die Restriktionskarte des Plasmids pJEG80.1 wurde bestimmt und ist in 3 gezeigt. Hybridisierungsversuche, die mit dem Oligonucleotid j80 durchgeführt wurden, erlaubten eine Lokalisierung der Position dieses Oligonucleotids auf dem HindIII-Fragment von 4,3 kB. Darüber hinaus erlaubten PCR-Versuche, die mit Kombinationen aus universellen j80+- und umgekehrten j80+-Oligonucleotiden durchgeführt wurden, eine genauere Lokalisation des Starts des codierenden Gens für das Protein JEG80 (jeg80) sowie seine Transkriptionsrichtung (3).
b) Bestimmung der Sequenz des Gens jeg80
Die Nucleotidsequenz des Gens jeg 80 wird durch das Verfahren von SANGER auf dem Plasmid pJEG80.1, das zuvor durch Soda denaturiert worden war, umgesetzt. Die verwendeten Anfangsstücke sind das Oligonucleotid j80, das umgekehrte Oligonucleotid oder Oligonucleotide, die von den gelesenen Sequenzen abstammen. Ein Teilsequenz (938Bp vom äußersten 5' des Gens wird in 4 mit der entsprechenden Aminosäuresequenz dargestellt.
Die Sequenz pJEG80.1 in der Region, die das Gen für das Protein von 80 kDa (jeg80 genannt) enthält, wurde auf beiden Strängen bestimmt (5). Man fand ein offenes Leseraster, das ein Polypeptid von 724 Resten mit einer Molekülmasse, die auf 81.293 Da berechnet wurde, codierte. Die Sequenz wurde untersucht, um die gesamte Region zu bestimmen, die mit den Promotorstrukturen von B. thuringiensis verwandt sein könnte. In der Sequenz stromaufwärts des Startcodons, die etwa 50 Nucleotide enthielt, wurde keine Promotorsequenz gefunden. Stromabwärts des Stopcodons (Position 2249 bis 2282, 5), wurden invertierte und wiederholte Sequenzen identifiziert, und zwar Sequenzen, die, berechnet nach den von Tinoco et al. definierten Regeln (Tinoco, I. J. et al. (1973) Nature (London) New Biol. 246:40-41, in der Lage sind, eine Schlaufenstruktur mit ΔG = –76,9 kJ/mol zu bilden.
Diese Struktur kann als Terminator der Transkription wirken. 12 Nucleotide stromaufwärts des Startcodons wurde eine Sequenz AAAGAAGAGGG als Bestandteil einer Verbindungsstelle mit dem Ribosom identifiziert (5).
Die Aminosäuresequenz, die von der erhaltenen Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, wurde mit Sequenzen anderer Proteine verglichen, die in der Datenbank Swiss Prot vorhanden waren. Diese Analyse erlaubte es zu zeigen, dass das Protein Jeg80 eine Ähnlichkeit von 67% mit dem N-terminalen Abschnitt des Proteins CryIVD von Bti zeigt; bezogen auf die gesamte Aminosäuresequenz liegt die Ähnlichkeit bei etwa 58% (7) und in einem geringeren Maße (bei 36%) mit den Proteinen CryII von Bt kurstaki.
Von den Toxinen CryI, CryIII und dem größten Teil der Toxine CryIV (Höfte, H. et al. (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255 wurden fünf Blöcke beibehalten. Indessen wurde in Jeg80 nur Block 1 gefunden (7), mit einer veränderten Arginin-Region, die an Block 4 erinnert, und dennoch ähnlich ist (7). Jeg80 zeigt eine Kette von 82 Aminosäuren, die fünf Cysteinreste in ihrem COOH-terminalen Teil umfassen, wobei CryIVD fehlt. Die Region, die auf die Wirkung der Protease von CryIVD empfindlich ist (Dai, S.-M. et al. (1993) Insect. Biochem. Molec. Biol. 23:273-283), die in der Mitte der Proteine lokalisiert wird (Aminosäuren 348-357, 7), ist nicht in Jeg80 erhalten.
c) Expression des Gens jeg80 im Stamm Bt 407 cry- (auch SPL 407 genannt).
Das Plasmid pJEG80.1 wurde durch Elektroporation gemäß dem von LERECLUS beschriebenen Verfahren (LERECLUS et al. 1989, FEMS Microbiol. Lett. 60, 211-218) in den Stamm Bt 407 Cry- eingeführt. Eine Transformante, 407 (pJEG80.1), wurde für die Komplementäranalyse ausgewählt. Dieser Clon produziert während der Sporulation durch optische Mikroskopie sichtbare Einschlüsse. In den Zellen, die nur den Vektor pHT315 enthielten, war kein Einschluss dieses Typs vorhanden. Das Expressionsprodukt von jeg80 wurde durch SDS PAGE mit darauffolgender Färbung mit Coomassie-Brilliantblau analysiert (1). Das Haupt-Polypeptid der Einschlüsse, gereinigt ausgehend von dem rekombinanten Stamm 407 (pJEG80.1), hatte ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa (1, Zeile 3), ebenso wie das des größten Kristall-Polypeptids des Wildstamms 367 (1, Zeile 2). Diese Einschlüsse wurden auf einem Saccharose-Gradienten gereinigt: sie bestehen ausschließlich aus Protein Jeg80 (1). Immunologische Reaktionen wurden zwischen dem Polypeptid Jeg80 und den Kristallproteinen von Bacillus thuringiensis ser. jegathesan, Bacillus thuringiensis ser. israelensis, Bacillus thuringiensis ser. medellin und darmstadiensis getestet. Die Ergebnisse der Immunreaktion sind in 1B dargelegt. Dieses Protein reagiert mit Antikörpern, die gegen die Gesamt-Kristalle von Btjeg gerichtet sind, sowie mit dem Antikristallserum von Bti und den Gesamt-Antikristallen des Stamms Bt medellin (anderer, kürzlich identifizierter Stamm eines neuen Serotyps, H30, der gegen Stechmücken aktiv ist).
d) Larvenabtötende Aktivität des Proteins JEG80
Die gereinigten Kristalle des Stamms 407 (pJEG80.1) wurden, verglichen mit Kristallen, die von dem Stamm Btjeg stammen, die alle Proteine enthalten, auf ihre Wirkung auf Stechmückenlarven getestet. Tests wurden außerdem mit dem Stamm 4Q2-81 (pHT 640) durchgeführt, der nur das Protein CryIVD herstellt. Vorhergehende Ergebnisse lassen annehmen, dass das Protein Jeg80 auf die drei getesteten Stechmückenarten wirkt: A. aegypti, A. stephensi und C. pipiens. Die Toxizität des Proteins Jeg80 ist bei C. pipiens stärker (Tabelle 1). Darüber hinaus ist die Höhe der für das Protein Jeg80 auf A. stephensi erhaltenen Toxizität allein mit jener vergleichbar, die mit den Kristallen von Btjeg beobachtet wurde.
Das Protein Jeg80 ist gegen A. aegypti stärker toxisch als der Wildstamm und gegen C. pipiens und A. stephensi ebenso toxisch wie der Wildstamm. Darüber hinaus und trotz der Ähnlichkeiten mit CryIVD ist das Protein Jeg80 stärker toxisch als CryIVD: etwa 10-Mal stärker gegen A. aegypti und A. stephensi und 40-Mal stärker gegen C. pipiens.
Die toxische Wirkung wurde unter den folgenden Bedingungen getestet: die verwendeten Stechmücken wurde im Labor bei 26°C, bei einer Feuchtigkeit von 80% und während eines Tag-Nacht-Zeitraums von 14h-10h gehalten. Die Larven wurden einer Behandlung mit entchlortem Wasser unterzogen und mit handelsüblichen Katzen-Biskuits ernährt. Die gereinigten Einschlüsse wurden in Plastik-Schälchen gelöst, die 150 ml entionisiertes Wasser enthielten und gegen 25 Larven von A. aegypti und C. pipiens im vierten Stadium und von A. stephensi im dritten Stadium doppelt getestet. Jeder Test wurde mindestens fünfmal wiederholt. Die Mortalität der Larven wurde nach 48 Stunden verzeichnet und die letalen Dosen (LD₅₀) wurden durch Probit-Analyse bestimmt.
Vorstehend wurde die Clonierung und die Charakterisierung eines neuen Gens von B. thuringiensis, das Gen jeg80 des Stamms jegathesan 367, beschrieben. Das Gen jeg80 codiert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 81,293 Da.
Das Protein Jeg80 ähnelt dem larvenabtötenden Toxin gegenüber CryIVD-Stechmücken von B. thuringiensis ser. israelensis. Es handelt sich sogar um das einzige bekannte Protein, das Ähnlichkeiten mit CryIVD zeigt, was annehmen lässt, dass diese beiden Proteine von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen. Das Protein Jeg80 hat ebenfalls eine schwache Ähnlichkeit mit den Proteinen CryII gemein, was mit der bestehenden Ähnlichkeit zwischen CryIV und CryII vergleichbar ist. Jedoch gibt es essenzielle Unterschiede zwischen Jeg80 und CryIVD, vor allem hinsichtlich des Carboxy-terminalen Abschnitts des Proteins. Jeg80 umfasst eine Sequenz aus 82 Aminosäuren, einschließlich 5 Cysteinresten, wobei diese Sequenz bei CryIVD nicht vorhanden ist. Bietlot et al. (Bietlot, H.P. et al. (1990) Biochem. J. 267:309-315) beschrieben die Wichtigkeit derartiger Reste, deren Stabliliät von mehreren δ-Endotoxinen, hergestellt von verschiedenen Stämmen von B. thuringiensis, herrührt. Diese Struktur könnte für die Kristallbildung und die Wirkung des Insektizids essenziell sein. Die Mutagenese könnte für die Identifikation der Rolle dieses ursprünglichen Carboxy-terminalen Abschnitts von Jeg80 verwendet werden. Es gibt ebenfalls wichtige Unterschiede zwischen den Regionen, die die Gene CryIVD und Jeg80 flankieren. Das Gen CryIVD ist das zweite Gen eines Operons, das zwei andere Gene, p19 und p20, enthält (Adams, L.F. et al. (1989) J. Bacteriol. 171:521-530 und Dervyn, E. et al. (1995) J. Bacteriol. 177:2283-2291). Obwohl die entsprechenden Peptide, P19 und P20, für die Expression von CryIVD nicht essenziell sind, könnten sie als Chaperon-Protein für die Stabilisierung bestimmter Bestandteile des Kristalls von B. thuringiensis ser. israelensis wirken (Chang, C. et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59 :815-821; Dervyn, E. et al. (1995) J. Bacteriol. 177 :2283-2291 und Wu, D. et al. (1994) Mol. Microbiol. 13:965-972). Für das Gen jeg80 wurde keine Umgebung diesen Typs erkannt: stromabwärts von jeg80 wurde keine Homologie mit p20 gefunden. Indessen könnte das DNA-Fragment, das in dem Plasmid Jeg80.1 cloniert wurde, zu klein sein, um den Ausgangspunkt eines anderen Gens zu enthalten. Auf ähnliche Weise wurde kein Gen, das mit p19 verwandt war, in dem Fragment von 1 kB stromaufwärts von Jeg80 gefunden. Dagegen wurde in einem Abstand von 550Bp stromaufwärts des Gens jeg80 ein offenes Leseraster identifiziert, das in die entgegengesetzte Richtung orientiert war. Vergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenz mit Hilfe der Swiss Prot Datenbank mit anderen zeigte Ähnlichkeiten mit der Transposase der Insertionssequenz IS240 von B. thuringiensis ser. israelensis (Delécluse, A. (1989) Plasmid 21:71-78). Zwei Kopien von IS240 flankieren das Gen cryIVA in der Varietät israelensis (Bourgouin, C. et al. (1988) J. Bacteriol. 170:3575-3583), keine wurde jedoch in der Nachbarschaft des Gens cryIVD gefunden, obwohl eine Variante IS231 stromabwärts des Gens p20 gefunden wurde (Adams, L.F. et al. (1989) J. Bacteriol. 171:521-530). Insertionselemente können über die Verteilung der Toxingene bei den verschiedenen Stämmen von B. thuringiensis Rechenschaft ablegen. Das Gen cryIVD wird ausgehend von zwei Promotoren transkribiert, die von der ARN-Polymerase, die mit den Faktoren σ35 oder σ28 von B. thuringiensis assoziiert ist, erkannt werden (Dervyn, E. et al. (1995) J. Bacteriol. 177:2283-2291). Die Analyse der Sequenz der Region stromaufwärts des Gens jeg80 zeigte nicht den Promotor-Consensus von B. thuringiensis. Es ist möglich, dass jeg80 ausgehend von einem Promotor transkribiert wird, der von anderen σ-Faktoren als σ35 und σ28 erkannt wird, oder dass der Promotor weit stromaufwärts des Gens jeg80, das heißt aufwärts der Sequenz, die mit der Sequenz IS240 verwandt ist, lokalisiert ist. Das Protein Jeg80 zeigt eine Kreuzreaktion mit Antikörpern, die gegen CryIVD und CryIVA gerichtet sind. Obwohl die Gene jeg80 und cryIVA keine wichtigen Ähnlichkeiten zeigen, können die Proteine dennoch ähnliche Domänen besitzen. Das Protein Jeg80 reagierte ebenfalls mit einem Serum gegen die Gesamtproteine von B. thuringiensis ser medellin. Vorherige Versuche zeigten keine zum Polypeptid CryIVD analogen Polypeptide in diesem Stamm (Orduz, D. et al. (1994) Microbiol. Biotechnol. 40:794-799 und Ragni, A. et al. (zur Veröffentlichung vorgelegt).
Nur die von dem Protein Jeg80 gebildeten Einschlüsse waren gegen die Larven der Stämme C. pipiens und A. stephensis ebenso toxisch wie die Einschlüsse des Wildstamms B. thuringiensis ser jegathesan und gegen die Larven von A. aegypti stärker toxisch als der Wildstamm. Dies stellt das erste Ergebnis der Existenz eines Proteins dar, das eine toxische Wirkung gegenüber Stechmückenlarven hat, und das in isolierter Form in der Lage ist, eine Wirkung zu zeigen, die der eines Gemischs aus verschiedenen Polypeptiden ähnlich ist. Im Fall von B. thuringiensis ser israelensis sind isolierte Polypeptide und sogar Zusammensetzungen aus zwei oder drei Bestandteilen des Kristalls weniger toxisch als die Kristalle des Wildtyps (Angsuthanasombat, C. et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 208:384-389; Delécluse, A. et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 177 :2283-2291 ; Poncet, S. et al. (J. Invertebr. Pathol.: im Druck) und Wu, D. et al. (1994) Mol. Microbiol. 13:965-972). Die starke Wirkung des Stamms israelensis ist auf synergetische Interaktionen zwischen verschiedenen Kristall-Polypeptiden zurückzuführen. Für den Stamm jegathesan sind solche Interaktionen nicht ausgeschlossen, obwohl es scheint, dass das Protein Jeg80 an der Toxizität vorherrschend beteiligt ist. Dennoch ist Jeg80 nicht der Haupt-Bestandteil der Kristalle von jegathesan. Andere Proteine in den Kristallen, wahrscheinlich Proteine von 65kDa oder 37 kDa, oder beide, sind für die komplementäre Wirkung verantwortlich.
Jeg80 ist trotz ihrer starken Ähnlichkeit viel stärker toxisch (nach den getesteten Stechmückenarten 6 bis 40-Mal stärker toxisch) als CryIVD. Dieser Unterschied hinsichtlich der Wirkung könnte unterschiedliche Wirkungsweisen der beiden Toxine wiederspiegeln. Dieser Unterschied könnte bei der Entwicklung von Insektiziden ausgenutzt werden.
Sequenzprotokoll

Claims

Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass es dem HindIII-Fragment von etwa 4,3 kb entspricht, das ausgehend von dem Plasmid pJEG80.1 erhalten werden kann, das am 23. August 1994 unter der Nummer I-1469 bei der CNCM hinterlegt wurde, oder dadurch, dass es in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit dem HindIII-Fragment dieses Plasmids zu hybridisieren.
Polynucleotid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es in dem HindIII-Fragment von etwa 4,3 kb enthalten ist und dadurch, dass es ein Polypeptid codiert, das eine toxische Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren aufweist.
Polynucleotid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Abfolge von Nucleotiden enthält oder die Abfolge umfasst, die in dem Folgenden enthalten ist, enthalten zwischen den Nucleotiden 325 und 1260:
Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass es der Sequenz des Gens jeg80, zwischen den Nucleotiden 64 und 2238, dargestellt in 5A, entspricht.
Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass es unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert, und dadurch, dass es ein Polypeptid codiert, das eine toxische Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren aufweist.
Polynucleotid, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypeptid codiert, das eine toxische Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren aufweist, und dadurch, dass es ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa aufweist.
Polynucleotid aus B. thuringiensis jegathesan, dadurch gekennzeichnet, dass es unter stringenten Bedingungen bei einer Temperatur von 42°C und bei einem zweiten Waschen nach der Hybridisierung in 1 × SSC – 0,1 % SDS mit dem Oligonucleotid j66 mit der folgenden Sequenz: ATGCATTATTATGGIAATIGIAATGA hybridisiert, und dadurch, dass es ein Polypeptid mit etwa 66 kDa codiert, umfassend die Sequenz MHYYGNRNEYDILNA, das, wenn es eine Verbindung mit einem Polypeptid eingeht, das von einem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird, mit dem Letzteren an der toxischen Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren teilhat.
Polynucleotid aus B. thuringiensis jegathesan, dadurch gekennzeichnet, dass es unter stringenten Bedingungen bei einer Temperatur von 42°C und bei einem zweiten Waschen nach der Hybridisierung in 1 × SSC – 0,1% SDS mit dem Oligonucleotid j37 mit der folgenden Sequenz: AATATIGAAATIGCIACAAGAGATTA hybridisiert, und dadurch, dass es ein Polypeptid von etwa 37 kDa codiert, umfassend die Sequenz NIEIATRDY, das, wenn es mit einem Polypeptid eine Verbindung eingeht, das von einem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird, mit dem Letzteren an der toxischen Wirkung gegenüber den Insekten der Familie der Dipteren teilhat.
Clonierungs- oder Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Plasmid pJEG80.1 handelt, das am 23. August 1994 unter der Nummer I-1469 bei der CNCM hinterlegt wurde.
Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Expressionsprodukt eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 handelt.
Polypeptid gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es vom Gen jeg80 codiert wird, das in 5A dargestellt ist.
Polypeptid, das eine toxische Wirkung gegenüber Insekten der Familie der Dipteren aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es der in 5B dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.
Polypeptid gemäß Anspruch 12 oder Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Aminosäuresequenz umfasst, dadurch, dass es ein Molekulargewicht von etwa 80 kDa aufweist und dadurch, dass es eine toxische Wirkung auf Insekten der Familie der Dipteren aufweist:
Zusammensetzung, die eine toxische Wirkung auf Insekten der Familie der Dipteren aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14 umfasst.
Rekombinante prokaryontische oder eukaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Clonierungs- oder Expressionsvektor gemäß Anspruch 9 oder Anspruch 10 enthält.
Verwendung eines Polynucleotids als Sonde oder Primer, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 hybridisiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: – dem HindIII-Fragment von etwa 4,3 kb, das ausgehend von dem Plasmid pJEG80.1 erhalten werden kann, das am 23. August 1994 unter der Nummer I-1469 bei der CNCM hinterlegt wurde, – dem HindIII-Ndel-Fragment von etwa 2,2 kb, das ausgehend vom Plasmid pJEG80.1 erhalten werden kann, – dem Fragment, das zwischen den Nucleotiden 1 und 124 der in 4 dargestellten Abfolge enthalten ist und – dem Fragment jeg80, das der Abfolge AATAATATGATIAATTTTCCIATGTA entspricht.