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Die
vorliegende Erfindung betrifft Materialien, Wirkstoffe und Zusammensetzungen,
die eine Pestizidaktivität
aufweisen und von Bakterien, genauer gesagt von Xenorhabdus-Spezies,
abstammen. Die Erfindung betrifft weiters Organismen und Verfahren,
die solche Verbindungen und Zusammensetzungen einsetzen.
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Es
besteht ein kontinuierlicher Bedarf an Materialien, Wirkstoffen,
Zusammensetzungen und Organismen, die eine Pestizidaktivität aufweisen,
beispielsweise für
den Einsatz im Pflanzenschutz oder für die Bekämpfung von durch Insekten hervorgerufenen
Krankheiten. Neue Materialien sind erforderlich, um das Problem
der Resistenz gegen vorhandene Pestizide zu überwinden. Idealerweise sind
solche Materialien billig in der Herstellung, stabil, weisen eine
hohe Toxizität
auf (wenn einzeln oder in Kombination eingesetzt) und sind wirksam,
wenn sie durch den Zielschädling
oral aufgenommen werden. Demnach wäre jede Erfindung, die Materialien,
Wirkstoffe, Zusammensetzungen oder Organismen bereitstellt, in denen
eine dieser Eigenschaften verbessert wäre, ein Fortschritt auf dem
Gebiet der Erfindung.
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Xenorhabdus-Spezies
stehen in der Natur häufig
in symbiotischer Verbindung mit einem Nematodenwirt, und es ist
bekannt, dass diese Verbindung genutzt werden kann, um Schädlingsaktivität zu bekämpfen. Es
ist beispielsweise bekannt, dass bestimmte Xenorhabdus-Spezies allein
in der Lage sind, einen Insektenwirt zu töten, wenn sie in das Haemocoel
des Wirts injiziert werden.
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Zusätzlich dazu
wurde ein extrazelluläres,
für Insekten
tödliches
Toxin von Photorhabdus luminescens isoliert (diese Spezies wurde
kürzlich
von der Gattung Xenorhabdus entfernt und ist mit den Spezies dieser Gattung
eng verwandt). Dieses Toxin ist nicht wirksam, wenn es aufgenommen
wird, aber es ist höchst
toxisch, wenn es in bestimmte Insektenlarven injiziert wird (siehe
N.E. Beckage et al. (Hrsg.), Parasites and Pathogens of Insects
2, Academic Press (1993)).
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Weiters
sind bestimmte niedermolekulare heterozyklische Verbindungen von
P. luminescens und X. nematophilus bekannt, die antibiotische Eigenschaften
aufweisen, wenn sie intravenös
oder topisch angewandt werden (siehe S.H. Rhodes et al., PCT-WO 84/01775).
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Zusätzlich dazu
offenbart Bowen (1995), Diss. Abs. Bestell-Nr. AAI9608671 [STN-Zugangsnr. 96:33246]
ein weiteres Toxin von P. luminescens, das für mehrere Insektenordnungen
bei Injektion oder bei Aufnahme über
die Nahrung toxisch sein soll.
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Yamanaka
et al., Chem. Abs. 118 (1), 2250 (1993), offenbaren, dass Lebendzellen
und der Überstand von
Kulturen von ATCC 19061 von Xenorhabdus nematophilus bei Injektion
in das Haemocoel von Spodoptera litura toxisch war. Diese Toxizität nahm mit
ansteigender Temperatur ab, jedoch wurde das verantwortliche toxische
Element nicht weiter charakterisiert.
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WO
95/00647 (CSIRO) erläutert
ein Toxingen von X. nematophilus. Seine Verwendung für die Bearbeitung
von Pflanzen und Viren für
Insektenbekämpfung
wird ebenfalls erläutert.
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Toxine
von Bacillus thuringiensis sind ebenfalls bekannt, und es wurde
vorgeschlagen (in
EP
0 238 441 A von CIBA-GEIGY), dass diese in Fusionsproteinen
mit anderen Toxinmaterialien eingesetzt werden könnten.
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WO
98/50427 (Dow Agrosciences et al.) beansprucht ein Prioritätsdatum
vor dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung, und deshalb entspricht
der Gegenstand von WO 98/50427, der Anspruch auf das beanspruchte
Prioritätsdatum
hat, dem Stand der Technik nach Art. 54(3) gegenüber dem Gegenstand der vorliegenden
Anmeldung, der nur den Anspruch auf das Einreichdatum hat, für die Staaten
CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, NL. WO 98/50427 betrifft Proteine
der Gattung Xenorhabdus, die für
Insekten, wenn sie diesen ausgesetzt sind, toxisch sein sollen.
Es wird vorgeschlagen, dass diese Proteintoxine zur Insektenbekämpfung auf die
Nahrung von Insektenlarven und auf Pflanzen angewandt werden könne. WO
98/50427 stellt 3 kurze Aminosäuresequenzen
von diesen Proteinen bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue Pestizidmittel und Zusammensetzungen
von Xenorhabdus-Spezies, Organismen, die solche Verbindungen und
Zusammensetzungen herstellen, und Verfahren, die diese Wirkstoffe,
Zusammensetzungen und Organismen einsetzen, bereit.
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Die
verschiedenen Aspekte der Erfindung sind wie in den nachstehende
Ansprüchen
definiert. Demnach wird gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Töten oder
Bekämpfen
von Schädlingsinsekten
bereitgestellt, das die orale Verabreichung von bestimmten Zellen
von Xenorhabdus-Spezies oder bestimmten Pestizidmaterialien, die
von dieser abstammen oder erhalten werden können, an Schädlinge umfasst.
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Wie
in den Ansprüchen
dargelegt, stellt die Erfindung eine Insektizidzusammensetzung bereit,
die:
- (i) zur oralen Verabreichung an ein Insekt
bestimmt ist;
- (ii) ein von einer Xenorhabdus-Spezies erhältliches proteinartiges Pestizidmaterial
oder ein Pestizidfragment davon oder ein(e) Pestizidvariante oder
-derivat von einem davon umfasst, das/die bei oraler Verabreichung
in jedem Fall toxische Aktivität
aufweist,
worin das Pestizidmaterial Material umfasst, für das die
Nucleotidsequenz aus 2 oder eine Variante oder ein
Fragment davon oder eine Sequenz, die an diese Sequenz hybridisiert,
kodiert.
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Andere
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen den Xenorhabdus-Stamm NCIMB
40886 oder NCIMB 40887 oder den Überstand
von Kulturen von diesen.
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Toxine
können
von Xenorhabdus wie nachstehend veranschaulicht isoliert werden.
Toxische Aktivität wurde
mit dem Material assoziiert, für
das die Nucleotidsequenz in
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2 kodiert.
Demnach umfasst die Zusammensetzung geeigneterweise ein Pestizidmaterial,
für das die
vollständige
Nucleotidsequenz in 2 oder ein Teil davon kodiert.
Pestizidfragmente sowie Varianten oder Derivate solcher Toxine können ebenfalls
eingesetzt werden.
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Die
Sequenz in 2 ist ungefähr 40 kb lang. Es wird angenommen,
dass diese Sequenz für
mehr als ein Protein kodieren kann, wobei jedes dieser Proteine
einzeln oder wenn gemeinsam vorhanden regulieren oder für Insekten
tödlich
sein kann. Es ist eine Routinesache, zu bestimmen, welche Teile
für die
Insektizidaktivität
erforderlich oder ausreichend sind.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Variante" auf Toxine, die eine modifizierte Aminosäuresequenz,
aber eine ähnliche
Aktivität
aufweisen. Bestimmte Aminosäuren
können
durch verschiedene Aminosäuren
ersetzt werden, ohne dass die Natur der Aktivität bedeutend verändert wird.
Das Ersetzen kann durch "konservative
Substitution" erfolgen,
wobei eine Aminosäure
durch eine Aminosäure
ersetzt wird, die weitgehend ähnliche
Eigenschaften aufweist, oder es können einige nicht-konservative Substitutionen
stattfinden. Im Allgemeinen sind die Varianten jedoch zumindest
zu 60 % homolog zu dem nativen Toxin, geeigneterweise zumindest
zu 70 % homolog und noch bevorzugter zumindest zu 90 % homolog.
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Die
Bezeichnung "Derivat" bezieht sich auf
Toxine, die beispielsweise durch chemische oder biologische Verfahren
modifiziert wurden.
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Diese
Toxine sind neu, und sie und die Nucleinsäuren, die für sie kodieren, stellen einen
weiteren Aspekt der Erfindung dar.
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Eine
bevorzugte Xenorhabdus-Spezies ist die Bakterie X. nematophilus.
Besondere Stämme
von X. nematophilus, die im Zusammenhang mit der Erfindung zweckdienlich
sind, sind der ATTC-19061-Stamm, der bei der National Collection
of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland (NCIMB),
erhältlich
ist. Zusätzlich
dazu umfassen geeignete Stämme
zwei neue Stämme
von Xenorhabdus, die bei der NCIMB am 10. Juli 1997 hinterlegt und
mit den Lagernummern NCIMB 40886 und NCIMB 40887 bezeichnet wurden.
Letztere beiden Stämme
bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung und werden als "erfindungsgemäße Stämme" bezeichnet.
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Alle
Stämme
weisen gemeinsame Eigenschaften auf, wie untenstehend in Tabelle
1 angeführt
wird. Tabelle
1
- *NBTA (Oxoid-Nährstoffagar umfassend 0,0025
% Bromthymolblau und 0,004 Tetrazoliumchlorid)
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Vorzugsweise
ist der Zielschädling
ein Insekt, und noch bevorzugter gehört es der Ordnung der Lepidoptera,
insbesondere Pieris brassicae, Pieris rapae oder Plutella xylostella,
oder der Ordnung der Diptera, insbesondere Culex quinquefaciatus,
an.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Zellen von den erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämmen oder
aus diesen entwickelte Wirkstoffe gemeinsam mit Bacillus thuringiensis
als orales Pestizid eingesetzt.
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In
weiteren Ausführungsformen
werden, statt Bacillus thuringiensis selbst zu verwenden, von B.
thuringiensis erhaltbare Pestizidmaterialien (z.B. Deltaendotoxine
oder andere Isolate) gemeinsam mit den erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämmen eingesetzt.
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Die
Bezeichnung "erhältlich von" soll nicht nur Materialien
umfassen, die direkt von dem jeweiligen Bakterium isoliert wurden,
sondern auch jene, die in der Folge in andere Organismen kloniert
und von anderen Organismen produziert wurden.
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Demnach
stellt die unerwartete Erkenntnis, dass Bakterien der Gattung Xenorhabdus
(und von diesen abstammende Materialien) bei Aufnahme eine Pestizidaktivität aufweisen
und dass solche Bakterien und Materialien gemeinsam mit B. thuringiensis
(und von diesem abstammenden Toxinen oder Materialien) vorteilhaft eingesetzt
werden können,
die Grundlage für
einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Die Pestizidaktivität von B.-thuringiensis-Isolaten
allein wurde bereits gut dokumentiert. Jedoch wurde die synergistische
Pestizidaktivität
von diesen Isolaten und Bakterien der Xenorhabdus-Spezies (oder
den davon abgeleiteten Materialien) zuvor noch nicht aufgezeigt.
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In
weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird ein Kulturüberstand der Kulturen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme statt
der Zellen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme eingesetzt.
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Alle
diese Verfahren können
unter anderem für
die Schädlingsbekämpfung eingesetzt
werden.
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Die
Erfindung macht auch Pestizidzusammensetzungen verfügbar, die
Zellen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme in Kombination
mit B. thuringiensis umfas sen. Wie bei den obenstehend erläuterten Verfahren
kann ein Pestizidtoxin von B. thuringiensis (vorzugsweise ein Deltaendotoxin)
als Alternative zu B. thuringiensis in den Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
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Auf ähnliche
Weise kann ein Kulturüberstand
von den Kulturen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme statt
der Zellen von Xenorhabdus-Spezies eingesetzt werden.
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Solche
Zusammensetzungen können
unter anderem für
den Pflanzenschutz, z.B. durch das Besprühen von Pflanzen, oder für den Viehschutz
eingesetzt werden. Zusätzlich
dazu können
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
für die
Vektorsteuerung eingesetzt werden.
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Die
Erfindung umfasst weiters neue Pestizidmittel, wie in den Ansprüchen dargelegt,
die aus Xenorhabdus-Spezies isolilert werden können. Isolationsverfahren für solche
Mittel sind dem Fachmann bekannt.
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Insbesondere
umfassen solche Verfahren die Trennung und Identifizierung von Toxinproteinen
entweder auf der Ebene der Proteine oder der DNA.
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Die
Anmelder haben eine DNA-Region von Xenorhabdus NCIMB 40887 kloniert
und teilweise sequenziert, wobei diese Region für die Insektizidaktivität kodiert
und nachstehend als 2 (Seq.-ID Nr. 1) angeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform
stellt die Erfindung demnach ein Toxin bereit, für das die DNA der Seq.-ID Nr.
1 oder eine Variante oder ein Fragment von dieser kodiert.
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Die
Erfindung stellt auch eine rekombinante DNA bereit, die für ein solches
Toxin kodiert. Die rekombinante DNA der vorliegenden Erfindung kann
die Sequenz aus 2 umfassen oder eine Variante
oder ein Fragment von dieser. Andere DNA-Sequenzen können für ähnliche Proteine kodieren,
als Folge der Degeneration des genetischen Codes. Alle solche Sequenzen
sind Teil des Umfangs der Erfindung.
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Die
hierin bereitgestellte Sequenz reicht aus, um Sonden herstellen
zu können,
die eingesetzt werden können,
um die DNA von Toxingenen zu identifizieren und anschließend zu
extrahieren. Diese DNA kann dann in Vektoren und Wirtszellen kloniert
werden, wie es dem Stand der Technik entspricht.
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DNA,
die die Sequenz aus 2 umfasst oder an diese unter
stringenten Bedingungen hybridisiert, stellt einen weiteren Aspekt
der vorliegenden Erfindung dar.
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Der
Ausdruck "hybridisieren
an" bedeutet, dass
die Nucleotidsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen,
wie den in Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning – A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York, veranschaulichten, an die gesamte Sequenz aus 2 oder
einen Teil von dieser anellieren wird.
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Die
Länge der
für eine
bestimmte analytische Technik eingesetzten Sequenz hängt von
der Natur der Technik, dem Komplementaritätsausmaß der Sequenz, der Natur der
Sequenz und insbesondere dem GC-Gehalt der Sonde oder des Primers
sowie den eingesetzten Hybridisierungsbedingungen ab. Bei hochstringenten Bedingungen
binden nur Sequenzen, die vollständig
komplementär
sind, bei wenig stringenten Bedingungen binden hingegen auch Sequenzen,
die zu 60 % homolog, noch geeigneter zu 80 % homolog, zu der Zielsequenz
sind. Sowohl hochstringente als auch wenig stringente Bedingungen
werden von der hierin verwendeten Bezeichnung "stringente Bedingungen" abgedeckt.
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Geeignete
DNA-Fragmente aus 2, d.h. jene, die für Pestizidmittel
kodieren, können
mittels einer Standardtechnik identifiziert werden. Beispielsweise
können
Transposonmutagenese-Techniken eingesetzt werden, wie beispielsweise
in H.S. Siefert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 735–739, USA
(1986), beschrieben. Vektoren, wie z.B. das Cosmid cHRIM1, können mittels
verschiedener Transposone mutiert werden und dann in Bezug auf den
Verlust der Insektizidaktivität
untersucht werden. Auf diese Weise können DNA-Regionen identifiziert
werden, die für
die für
die toxische Aktivität
verantwortlichen Proteine kodieren.
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Das
Minitransposon mTn3(HIS3) kann
beispielsweise in einen toxischen Xenorhabdus-Klon, wie z.B. cHRIM1
(nachstehend als "Klon
1" bezeichnet),
eingeführt
werden, indem cHRIM1-DNA in E. coli RDP146 (pLB101) elektrophoriert
wird und dieser Stamm mit E. coli RDP146 (pOX38), gefolgt von E.
coli NS2114Sm, gepaart wird. Der Endstamm umfasst cHRIM1-DNA mit
einer einzelnen Insertion des Transposon mTn3(HIS3). Diese Kolonien können kultiviert
werden und ihre Insektizidaktivität wie nachstehend in Beispiel
8 beschrieben getestet werden. Das Erstellen einer Restriktionskarte
oder DNA-Sequenzieren kann eingesetzt werden, um die Insertionsstelle
von mTn3(HIS3) und damit die
DNA-Regionen, die in Toxizität
involviert sind, zu identifizieren. Ähnliche Ansätze können bei anderen Transposonen,
wie z.B. Tn5 und mTn5, eingesetzt werden.
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Ortsgerichtete
Mutagenese von cHRIM1, wie in Maniatis, Fritsch und Sambrook, "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor (1982), erläutert,
kann ebenfalls eingesetzt werden, um die Bedeutung von spezifischen
DNA-Regionen für
die toxische Aktivität
zu untersuchen.
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Alternativ
dazu können
Subklonierungstechniken eingesetzt werden, um Regionen der klonierten
DNA zu identifizieren, die für
Insektizidaktivität
kodieren. In diesem Verfahren werden spezifische kleinere Fragmente
der DNA subkloniert, und ihre Aktivität wird bestimmt. Zu diesem
Zweck kann Cosmid-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten
werden und an eine kompatible Restriktionsstelle auf einem Plasmidvektor,
wie z.B. pUC19, ligiert werden. Das Ligationsgemisch kann in E.
coli transformiert werden, und transformierte Klone können unter
Einsatz eines Selektionsmarkers, wie z.B. Antibiotikaresistenz,
ausgewählt werden,
für den
auf dem Plasmidvektor kodiert wird. Diese Techniken werden detailliert
beispielsweise in Maniatis et al., s.o. (siehe S. 390–391), und
L.G. Davies, M.D. Dibner und J.F. Battey, Molecular Biology, Elsevier (siehe
S. 222–224),
beschrieben.
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Einzelne
Kolonien, die spezifische klonierte Fragmente umfassen, können kultiviert
werden und wie nachstehend in Beispiel 8 beschrieben in Bezug auf
ihre Aktivität
getestet werden. Subklone mit Insektizidaktivität können weiter trunkiert werden,
indem dasselbe Verfahren zur weiteren Identifikation von DNA-Regionen eingesetzt
wird, die für
Aktivität
kodieren.
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Die
Erfindung offenbart auch einen isolierten-Pestizidwirkstoff, der
ein Toxin umfasst, das ein Protein enthält, für das DNA kodiert, die die
Sequenz in 2 oder eine Variante oder ein
Fragment von dieser umfasst. Der Wirkstoff kann von Kulturen von
X. nematophilus oder Varianten davon erhalten werden, weist eine orale
Pestizidaktivität
gegenüber
Pieris brassicae, Pieris rapae und Plutella xylostella auf, ist
bis 55°C
im Wesentlichen hitzebeständig,
wirkt synergistisch mit B.-thuringiensis-Zellen als orales Pestizid
und ist gegenüber Proteolyse
durch Trypsin und Proteinase K im Wesentlichen beständig.
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"Bis 55°C im Wesentlichen
hitzebeständig" bedeutet, dass der
Wirkstoff weiterhin Pestizidaktivität aufweist, wenn er getestet
wird, nachdem er in Suspension 10 in lang auf 55°C erhitzt wurde, und vorzugsweise zumindest
50 % der Aktivität
im unbehandelten Zustand beibehält.
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"Gegenüber Proteolyse
im Wesentlichen beständig" bedeutet, dass der
Wirkstoff weiterhin Pestizidaktivität aufweist, nachdem er 2 h
lang bei 30°C
Proteasen ausgesetzt wurde, und vorzugsweise zumindest 50 % der
Aktivität
im unbehandelten Zustand beibehält.
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"Wirkt synergistisch" bedeutet, dass die
Aktivität
der Kombination von Komponenten größer ist als ausgehend von der
Einzelverwendung der Komponenten zu erwarten wäre. Wenn beispielsweise gemeinsam
mit B.-thuringiensis-Zellen als orales Pestizid verwendet, ist die
Konzentration von B.-thuringiensis-Zellmaterial, die notwendig ist,
um 50 % Mortalität
in P. brassicae zu erreichen, wenn alleine verwendet, um zumindest
80 % reduziert, wenn es in Kombination mit dem Mittel bei einer
Konzentration verwendet wird, die ausreicht, um 25 % Mortatilät zu ergeben,
wenn das Mittel alleine verwendet wird.
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Es
wurde festgestellt, dass die Aktivität des Materials durch 30-kDa-Cut-off-Filter
zurückgehalten,
aber von 100-kDa-Filtern nur teilweise zurückgehalten wird.
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Vorzugsweise
wird der Wirkstoff dadurch weiter charakterisiert, dass die Pestizidaktivität durch
eine Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS – 0,1 % 60 min) und Aceton
(50 %, 60 min) bei 25°C
verloren geht.
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Die
kennzeichnenden Eigenschaften des oben beschriebenen isolierten
Wirkstoffs können
eingesetzt werden, um diesen von Xenorhabdus-Spezies-Zellen und
Kulturmediumüberständen zu
reinigen oder seine Konzentration in diesen anzureichern. Verfahren
zur Reinigung von Proteinen aus heterogenen Gemischen sind auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt (z.B. Ammoniumsulfatfällung, Proteolyse,
Ultrafiltration mit bekannten Molekulargewicht-Cut-oft-Filtern,
Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, etc.). Die orale Pesitizidaktivität stellt
ein angenehmes Verfahren bereit, um den Wirkstoffanteil nach jeder
Stufe oder in jeder Eluent-Probe zu testen. Ein solches Vorgehen
erfordert von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung keine erfinderischen
Bemühungen.
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Die
Erfindung offenbart weiters orale Pestizidzusammensetzungen, die
einen oder mehrere der oben beschriebenen Wirkstoffe umfassen. Solche
Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise ebenfalls andere Pestizidmaterialien
von Nicht-Xenorhabdus-Spezies.
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Diese
anderen Materialien können
so ausgewählt
werden, dass ihre Eigenschaften die der oben beschriebenen Wirkstoffe
ergänzen
oder mit diesen synergistisch zusammenwirken.
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Vorzugsweise
umfasst die orale Pestizidzusammensetzung einen oder mehrere der
oben beschriebenen Pestizidwirkstoffe in Kombination mit B. thuringiensis
(oder mit einem von diesem abstammenden Toxin, vorzugsweise Endotoxin).
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Rekombinante
DNA, die für
die Proteine kodiert, stellt einen weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung dar. Die DNA kann unter Einfluss von geeigneten Steuerungselementen,
wie z.B. Promotoren, Enhancern, Signalsequenzen etc., in einen Expressionsvektor
inkorporiert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung klar ist.
Diese Expressionsvektoren stellen einen weiteren Aspekt der vorliegenden
Erfindung dar. Sie können eingesetzt
werden, um einen Wirtsorganismus zu transformieren, um sicher zu
stellen, dass der Organismus das Toxin produziert.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls einen Wirtsorganismus zur Verfügung, der
eine Nucleotidsequenz umfasst, die für einen oben beschriebenen
Pestizidwirkstoff kodiert.
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Verfahren
zum Klonieren der Sequenz für
ein charakterisiertes Protein in einen Wirtsorganismus sind auf
dem Gebiet der Erfindung bekannt. Das Protein kann beispielsweise
gereinigt und sequenziert werden: Da für das Sequenzieren keine Aktivität erforderlich
ist, kann eine SDS-Gelelektrophorese gefolgt vom Blotting des Gels
eingesetzt werden, um das Protein zu reinigen. Die Proteinsequenz
kann eingesetzt werden, um eine Nucleotidsonde herzustellen, die
wiederum eingesetzt werden kann, um geeignete genomische Fragmente
einer Xenorhabdus-Genbibliothek zu identifizieren. Diese Fragmente
können
dann mittels eines geeigneten Vektors in einen Wirtsorganismus eingeführt werden,
der das Protein exprimieren kann. Der Einsatz eines solchen allgemeinen
Verfahrens ist Routine und für
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung nicht erfinderisch. Solche Techniken
können
für die
Herstellung von anderen Xenorhabdus-Toxinen als die, für die die
Sequenz in 2 kodiert, angewandt werden.
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Es
kann wünschenswert
sein, den Wirkstoff zu manipulieren (z.B. mutieren), indem seine
Gensequenz (und somit Proteinstruktur) verändert wird, um z.B. seine physikalischen
oder toxikologischen Eigenschaften zu optimieren.
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Es
kann ebenfalls wünschenswert
sein, dass der Wirt so bearbeitet oder ausgewählt wird, dass er auch andere
proteinartige Pestizidmaterialien (z.B. Deltaendotoxin von B. thuringiensis)
exprimiert. Ebenso kann es wünschenswert
sein, Wirtsorganismen herzustellen, die Fusionsproteine exprimieren,
die aus dem aktiven Teil des Wirkstoffs und anderen, die Toxizität verstärkenden
Materialien bestehen.
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Ein
Wirt kann ausgewählt
werden, um große
Mengen des Pestizidmaterials zur Reinigung herzustellen, z.B. unter
Einsatz von B. thuringiensis, das mit dem für den Wirkstoff kodierenden
Gen transformiert ist. Vorzugsweise ist der Wirt jedoch eine Pflanze,
die dadurch eine verbesserte Schädlingsresistenz
gewinnen würde.
Geeignete Pflanzenvektoren, z.B. das Ti-Plasmid von Agrobacterium
tumefaciens, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Alternativ
dazu kann der Wirt so ausgewählt
werden, dass er für
die Schädlinge
direkt pathogen ist, z.B. ein Insekten-Baculovirus.
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Die
Lehre und der Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst alle diese
Wirtsorganismen sowie die Wirkstoffe, mutierten Wirkstoffe oder
Wirkstoff-Fusionsmaterialien, die die Wirtsorganismen exprimieren.
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Die
Erfindung stellt demnach Verfahren, Zusammensetzungen, Wirkstoffe
und Organismen bereit, die eine gewerblich anwendbare Pestizidaktivität aufweisen
und besonders für
verbesserten Pflanzenschutz oder die verbesserte Bekämpfung von
durch Insekten hervorgerufene Krankheiten geeignet sind.
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Die
Verfahren, Zusammensetzungen und Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung
werden nun zur Veranschaulichung unter Bezugnahme auf die folgenden
Beispiele und Zeichnungen, die keine Einschränkung darstellen, beschrieben.
Andere Ausführungsformen,
die Teil des Schutzumfangs der Erfindung sind, werden Fachleuten
auf dem Gebiet der Erfindung im Lichte dieser Beispiele und Abbildungen
klar werden.
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ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die Variation im Laufe der Wachstumszeit von X. nematophilus ATCC
19061 und die Aktivität
von Zellen und Überständen gegenüber P. brassicae,
wie in Beispiel 3 beschrieben.
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2 zeigt
die Sequenz des Hauptteils eines klonierten Toxingens von Xenorhabdus.
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3 zeigt
einen Vergleich von Restriktionskarten der klonierten Toxingene
von zwei Xenorhabdus-Stämmen
(oben Klon 1 und unten Klon 3).
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BEISPIELE
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Beispiel 1 – Verwendung
von X.-nematophilus-Zellen als orales Insektizid
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ZELLWACHSTUM:
Eine Subkultur von X. nematophilus (ATCC 19061, Stamm 9965, erhältlich von den
National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen,
Schottland) wurde eingesetzt, um 250-ml-Erlenmeyerkolben zu inokulieren,
die jeweils 50 ml Luria-Nährmedium
umfassten, das 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro Liter
umfasste. Die Kulturen wurden in den Kolben 40 h lang bei 27°C auf einem Rundschüttler kultiviert.
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HERSTELLUNG
EINER ZELLSUSPENSION: Die Kulturen wurden 10 min lang bei 5000 × g zentrifugiert.
Die Überstände wurden
entsorgt, und die Zell-Pellets wurden einmal gewaschen und wieder
in einem gleichen Volumen Phosphatpuffer-Salzlösung (8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g
KH2PO4 pro Liter)
mit pH 7,4 suspendiert.
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AKTIVITÄT DER ZELLSUSPENSION
BEI INSEKTEN: Die Biotests wurden wie folgt durchgeführt: P. brassicae:
Die Larven wurden mit einer künstlichen
Nahrung auf Agarbasis (wie von David und Gardiner, London Nature
207, 882–883
(1965), beschrieben) ernährt,
in die eine Reihe von Verdünnungen
von Zellsuspensionen inkorporiert worden war. Die Biotests wurden
unter Einsatz einer Reihe von 5 Dosen mit mindestens 25 Larven pro
Dosis durchgeführt.
Unbehandelte und hitzebehandelte (10 min lang bei 55°C) Zellen
wurden getestet. Die Mortalität
wurde nach 2 und 4 Tagen aufgezeichnet, wobei die Temperatur auf
25°C gehalten
wurde.
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Aedes
aegypti: Die Larven wurden einer Reihe von 5 verschiedenen Verdünnungen
der Zellsuspension in entionisiertem Wasser ausgesetzt. Die Biotests
wurden unter Einsatz von 2 Dosen pro Verdünnung von 50 ml Zellsuspension
in 9,5-cm-Kunststofftassen
mit 25 Larven im zweiten Larvenstadium pro Dosis durchgeführt. Unbehandelte
und hitzebehandelte Zellen (10 min lang bei 55°C oder 80°C) wurden getestet. Die Mortalität wurde
nach 2 Tagen aufgezeichnet, wobei die Temperatur auf 25°C gehalten
wurde.
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Culex
quinquefaciatus: Die Larven wurden einer einzigen Zellsuspension-Konzentration ausgesetzt, die
4 × 10
7 Zellen/ml umfasste. Die Biotests erfolgten
unter Einsatz von zwei 50-ml-Zellsuspensionen in 9,5-cm-Kunststofftassen
mit 25 Larven im zweiten Larvenstadium pro Tasse. Unbehandelte und
hitzebehandelte (10 min lang bei 55°C oder 80°C) wurden getestet. Die Mortalität wurde
nach 2 Tagen aufgezeichnet, wobei die Temperatur auf 25°C gehalten
wurde. Mortalität
Behandlung | 2
Tage |
Unbehandelt | 100 |
Behandelt
bei 55°C | 100 |
Behandelt
bei 80°C | 0 |
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Demnach
zeigen die Ergebnisse deutlich, dass Zellen von X. nematophilus
als orales Insektizid gegen eine Reihe von Insektenspezies wirksam
sind (und gegen P. brassicae besonders stark). Die Insektizidaktivität hängt nicht
von der Lebensfähigkeit
der Zellen ab (d.h. sie ist weitgehend unbeeinflusst von dem Erhitzen
auf 55°C,
das die Lebensfähigkeit
der Zellen um >99,99
% senkt), wird jedoch durch das Erhitzen auf 80°C stark reduziert, da dadurch
die meisten Proteine denaturiert werden.
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Beispiel 2 – Verwendung
von X.-nematophilus-Überstand
als orales Insektizid
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ZELLWACHSTUM:
Kulturen wurden wie in Beispiel 1 kultiviert.
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HERSTELLUNG
DES ÜBERSTANDS:
Die Kulturen wurden zweimal 10 min lang bei 10000 g zentrifugiert.
Die Zell-Pellets wurden entsorgt.
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AKTIVITÄT DES ÜBERSTANDS
BEI INSEKTEN: Der Biotest war wie folgt: Die Aktivität gegen
neonatale P. brassicae und zwei Tage alte Larven von Pieris rapae
und Plutella xylostella wurde wie für P. brassicae in Beispiel
1 gemessen, wobei jedoch eine Reihe von unbehandelten Verdünnungen
des Überstands
statt der Zellsuspensionen eingesetzt wurde und die Mortalität lediglich
nach 4 Tagen aufgezeichnet wurde.
| LC50
(μl Überstand/g
Nahrung) |
Insektenspezies | 4
Tage |
P.
brassicae | 22 |
P.
rapae | 79 |
P.
xylostella | 135 |
-
Zusätzlich dazu
wurde eine größenreduzierende
Aktivität
(62 % Reduktion in 7 Tagen) gegenüber Mamestra brassicae bei
Larven nachgewiesen, die mit einer künstlichen Nahrung gefüttert wurden,
die X.-nematophilus-Überstand
umfasste (Ergebnisse sind nicht angeführt).
-
Diese
Ergebnisse zeigen demnach deutlich, dass der Überstand von X.-nematophilus-Kulturmedium als
orales Insektizid für
eine Reihe von Insektenspezies wirksam ist und besonders stark gegen
P. brassicae.
-
Das
zehnminütige
Erhitzen der Überstände auf
55°C verursachte
den teilweisen Verlust der Aktivität, während 80°C zu einem vollständigen Aktivitätsverlust
führte.
Die Aktivität
wurde auch durch eine Behandlung mit SDS (0,1 % (Gew./Vol.), 60
min lang) und Aceton (50 Vol.-%, 60 min lang) vollständig verloren,
wurde jedoch durch Triton X-100 (0,1 %, 60 min lang), Nicht-Nahrungs-P40
(0,1 %, 60 min lang), NaCl (1 M, 60 min lang) oder kalte, zweiwöchige Lagerung
bei 4°C
oder –20°C nicht beeinflusst.
All diese Eigenschaften stimmen mit einem proteinartigen Wirkstoff überein.
-
Die
allgemeine Wirkungsweise von X.-nematophilus-Zellen und -Überständen, d.h.
die Reduktion der Larvengröße und deren
Tod innerhalb von 2 Tagen bei hoher Dosierung, und andere Eigenschaften,
z.B. Temperaturbeständigkeit,
scheinen ähnlich
zu sein, was darauf hindeutet, dass ein einzelner Wirkstoff oder
eine einzelne Wirkstoffart für
die oralen Insektizidaktivitäten
von Zellen und Überständen verantwortlich
ist.
-
Beispiel 3 – Zeitmaßstab für das Auftreten
einer Aktivität
eines durch die Nahrung aufnehmbaren Insektizids
-
ZELLWAGHSTUM:
1 ml einer Übernacht-Kultur
von X. nematophilus wurde eingesetzt, um einen Erlenmeyer-Kolben
zu inokulieren. Zellen wurden wie in Beispiel 1 kultiviert. Das
Wachstum wurde durch eine Messung der optischen Dichte bei 600 nm
bestimmt.
-
PRODUKTION
VON ZELLSUSPENSION UND ÜBERSTÄNDEN: Diese
wurden wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt.
-
PRODUKTION
VON ZELLSUSPENSION UND ÜBERSTÄNDEN GEGEN
P. BRASSICAE: Der Zellsuspension-Biotest wurde wie in Beispiel 1
durchgeführt,
je doch wurde eine einzige Dosis suspendierter Zellen eingesetzt,
die 50 μl
Nährmedium/g
Nahrung entsprach, und die Mortalität wurde nach 2 Tagen gemessen.
Der Zellüberstand-Biotest
wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt,
jedoch wurde eine einzige Dosis eingesetzt, die 50 μl Überstand/g
Nahrung entsprach (d.h. mehr als doppelt soviel wie LC50), und die
Mortalität
nach 2 Tagen gemessen wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in 1 angeführt. Demnach zeigen diese Ergebnisse
deutlich, dass die Zellen, die aus einem X.-nematophilus-Kulturmedium
stammen, als orales Insektizid gegen P. brassiacae nach nur 5 h
hochwirksam sind und Überstände nach
20 h hochwirksam sind. Obwohl eine leichte Zelllyse in den ersten
Phasen des Wachstums beobachtet wurde, wurde nach diesem Zeitpunkt
keine bedeutende Zelllyse mehr beobachtet, was darauf hinweist,
dass die Überstandaktivität auf einen
authentischen extrazellulären Wirkstoff
zurückzuführen sein
kann (im Gegensatz zu einem Wirkstoff, der nur nach dem Zellzerfall
freigesetzt wird).
-
Beispiel 4 – Synergie
zwischen X.-nematophilus-Zellen und B.-thuringiensis-Pulverpräparaten
-
ZELLWACHSTUM
UND SUSPENSION: X.-nematophilus-Zellen wurden wie in Beispiel 1
kultiviert und suspendiert. Der B.-thuringiensis-Stamm HD1 (von
Bacillus Genetic Stock Centre, The Ohio State University, Columbus,
Ohio 43210, USA) wurde kultiviert, geerntet und zu einem Pulver
formuliert, wie von Dulmage et al., J. Invertebrate Pathology 15,
15–20
(1970), beschrieben.
-
AKTIVITÄT VON X.-NEMATOPHILUS-ZELLEN
UND B.-THURINGIENSIS-PULVER GEGEN P. BRASSICAE: Die Biotests wurden
unter Einsatz von X. nematophilus und B. thuringiensis in Kombination
oder unter Einsatz von B.-thuringiensis-Zellpulver allein durchgeführt. Die
Biotests wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurden verschiedene
Verdünnungen
von B.-thuringiensis-Pulver statt X. nematophilus eingesetzt. Für das Kombinationsexperiment
wurde eine konstante Dosis X.-nematophilus-Zellsuspension,
die für ein
Ergebnis von 25 % Mortalität
ausreichte, ebenfalls zu der Nahrung zugesetzt. Die Mortalität wurde
nach 2 Tagen aufgezeichnet.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass ein Synergismus zwischen X.-nematophilus-Zellen und B.-thuringiensis-Pulver
besteht, wenn diese als orales Insektizid gegen P. brassicae wirken.
-
Beispiel 5 – Synergie
zwischen X.-nematophilus-Überständen und
B.-thuringiensis-Pulver
-
ZELLWACHSTUM
UND HERSTELLUNG DER ÜBERSTÄNDE: X.-nematophilus-Zellen wurden kultiviert
und Überstände wurden
hergestellt, wie in Beispiel 2. B. thuringiensis wurde wie in Beispiel
4 kultiviert und behandelt.
-
AKTIVITÄT VON X.-NEMATOPHILUS-ÜBERSTÄNDEN UND
B.T.-ZELLPULVER GEGEN P. BRASSICAE: Die Biotests wurden unter Einsatz
von X.-nematophilus-Überständen und
B. thuringiensis in Kombination oder unter alleinigem Einsatz von
B.-thuringiensis-Pulver durchgeführt.
Der Biotest gegen neonatale P. brassicae und 2 Tage alte Larven
von Pieris rapae und Plutella xylostella wurden wie in Beispiel
2 gemessen, jedoch wurden verschiedene Verdünnungen von B. thuringiensis
statt X. nematophilus eingesetzt. Für das Kombinationsexperiment
wurde eine konstante Dosis X.-nematophilus-Überstand, die für ein Ergebnis
von 25 % Mortalität
ausreichte, ebenfalls zu der Nahrung zugesetzt. Die Mortalität wurde
nach 4 Tagen aufgezeichnet.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass ein Synergismus zwischen X.-nematophilus-Überständen und B.-thuringiensis-Pulver
besteht, wenn sie als orales Insektizid gegen verschiedene Insektenspezies
wirken. Die Tatsache, dass X.-nematophilus-Zellen und -Überstände diesen Synergismus aufweisen,
deutet stark darauf hin, dass ein einziger Wirkstoff oder eine einzelne
Wirkstoffart für
die gezeigten Aktivitäten
verantwortlich ist.
-
Beispiel 5 – Charakterisierung
des Insektizidwirkstoffs von X.-nematophilus-Überstand durch Proteolyse
-
ZELLWACHSTUM
UND HERSTELLUNG VON ÜBERSTÄNDEN: X.-nematophilus-Zellen wurden kultiviert
und Überstände wurden
hergestellt, wie in Beispiel 2.
-
PROTEOLYSE
DES ÜBERSTANDS:
Der Kulturüberstand
(50 ml) wurde 48 h lang gegen 0,5 M NaCl (3 × 1 l) bei 4°C dialysiert.
Das Volumen des Überstands
im Dialyseschlauch wurde durch das Bedecken mit Polyethylenglykol
8000 (Sigma Chemicals) um das Fünffache
reduziert. Proben wurden entfernt und mit Trypsin (Sigma T8253 =
10.000 Einheiten/mg) oder Proteinase K (Sigma P0390 = 10 Einheiten/mg)
bei einer Konzentration von 0,1 mg Protease/ml Probe 2 h lang bei
30°C behandelt.
-
AKTIVITÄT VON PROTEASE-BEHANDELTEM ÜBERSTAND
GEGEN P. BRASSICAE: Der Biotest gegen neonatale Larven von P. brassicae
wurde durchgeführt,
indem 25 μl
jeder "Behandlung" auf der künstlichen
Nahrung auf Agarbasis, auf die in Beispiel 1 verwiesen wurde, in
einem Kunststoffbehälter
mit 4,5 cm Durchmesser verteilt wurden. Vier Behälter mit jeweils 10 Larven
wurden für
jede Behandlung eingesetzt. Die Mortalitäten wurden nach 1 und 2 Tagen
aufgezeichnet. Kontrollen, die nur Wasser, Trypsin (0,1 mg/ml) und Proteinase
K (0,1 mg/ml) einsetzten, wurden auf dieselbe Weise getestet.
-
-
Beispiel 6
-
Entomozidische Aktivität von anderen
Xenorhabdus
-
Unter
Einsatz der Vorgehensweise der Beispiele 1 und 2 wurden vier verschiedene
Xenorhabdus-Stämme
gegen Schädlingsinsekten
getestet.
-
Folgende
Ergebnisse wurden erhalten:
- I) Aktivität gegen
Pieris brassicae Es wurde
festgestellt, dass die entomozidische Aktivität der Zellen und des Überstands
bei allen vier Stämmen
um mehr als 99 % reduziert wurde, wenn diese 10 min lang auf 80°C erhitzt
wurden.
- II) Aktivität
gegen Stechmücken
(Aedes aegypti)
Bakterien wurden in einer Rate von 107 Zellen/ml Wasser zugesetzt Außerdem senkten
alle Stämme
das Wachstum von Heliothis virescens signifikant.
-
Beispiel 7
-
Klonieren von Toxingenen
von Xenorhabdus-Stämmen
-
Vollständige Zell-DNA
wurde von NCIMB 40887 und ATCC 19061 unter Einsatz eines genomischen DNA-Reinigungssets
von Quiagen isoliert. Die Zellen wurden in L-Nährmedium
(10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro I) bei 28°C unter Schütteln (150
U/min) bis zu einer optischen Dichte von 1,5 A600 kultiviert. Die
Kulturen wurden durch Zentrifugieren bei 4000 × g geerntet und erneut in
3,5 ml BI-Puffer (50 mM Tris/HCl, 0,05 % Tween 20, 0,5 % Triton
X-100, pH 7,0) suspendiert und 30 min lang bei 50°C inkubiert.
Die DNA wurde von den bakteriellen Lysaten unter Einsatz von Quiagen-100/G-Spitzen
gemäß den Herstellerhinweisen
isoliert. Die resultierende gereinigte DNA wurde bei –20°C in TE-Puffer
(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelagert.
-
Eine
repräsentative
DNA-Bibliothek wurde unter Einsatz von vollständiger DNA von teilweise mit
dem Restriktionsenzym Sau3a verdautem NCIMB 40887 und ATTC 19061
hergestellt. Etwa 20 g DNA von jedem Stamm wurden bei 37°C mit 0,25
Einheiten des Enzyms inkubiert. In Zeitabständen von 10, 20, 30, 45 und
60 min wurden Proben entnommen und 15 min lang auf 65°C erhitzt.
Um die Größe der DNA-Fragmente zu visualisieren,
wurden die Proben einer Elektrophorese auf 0,5 (Gew./Vol.) Agarosegelen
unterzogen.
-
Die
DNA-Proben, die den höchsten
Anteil an 30- bis 50-kb-Fragmenten enthielten, wurden vereinigt und
mit 4 Einheiten alkalischer Shrimps-Phosphatase (Boehringer) 15
min lang bei 37°C
behandelt, wonach eine Hitzebehandlung bei 65°C folgte, um die Phosphatase
zu inaktivieren.
-
Die
aufgrund ihrer Größe ausgewählten DNA-Fragmente
wurden an die BamH1-Stelle
des Cosmidvektors SuperCos! (Stratagent) gebunden und in den Escherichia-coli-Stamm XL Blue
1 verpackt, wobei ein Gigapack-II-Verpackungsset (Stratgene) gemäß den Herstellerhinweisen
eingesetzt wurde.
-
Um
Cosmidklone mit entomozidischer Aktivität auszuwählen, wurden einzelne Kolonien,
die auf L-Agar-Platten, die 25 μg
Ampicillin umfassten, ausgewählt
wurden, in L-Nährmedium
(umfassend 25 μg/ml Ampicillin) über Nacht
bei 28°C
kultiviert. Nährmediumkulturen
(50 μl)
wurden individuell auf der Oberfläche von Insektennahrung in
Behältern
mit 4,5 cm Durchmesser, wie in Beispiel 5 beschrieben, verteilt.
Zu jedem Behälter
wurden 10 neonatale Larven von P. brassicae zugesetzt. Die Larven
wurden nach 24, 72 und 96 h untersucht, wobei Mortalität und die
Größe der überlebenden
Larven untersucht wurde. Insgesamt wurden 220 Klone von NCIMB 40887
getestet, wobei festgestellt wurde, dass zwei eine Reduktion des
Larvenwachstums und den Tod der Larven innerhalb von 72 h hervorrufen.
Von 370 Klonen von ATTC 19061 wurde bei einem festgestellt, dass
er innerhalb von 72 h den Tod der Larven verursachte.
-
Beispiel 8
-
Aktivität von klonierten
Toxingenen gegen Pieris brassicae
-
Die
drei aktiven Klone aus Beispiel 7 wurden in L-Nährmedium, umfassend 25 μg/ml Ampicillin,
24 h lang bei 28°C
auf einem Rundschüttler
bei 150 U/min kultiviert. Die Aktivität der Toxinklone gegenüber neonatalen
Larven wurde durch die Integration von ganzen Nährmediumkulturen in die Insektennahrung,
wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
- *
XL1-Blue-E.-coli-Nährmedium
-
Wenn
die E.-coli-Toxinklone 10 min lang auf 80°C erhitzt wurden und zu der
Nahrung in einer Rate von 100 μl/g
zugesetzt wurden, wurde keine Aktivität gegenüber der Larven beobachtet.
Die Hitzeempfindlichkeit der Toxine wird hervorgehoben.
-
Beispiel 9
-
Seguenzieren
des klonierten Toxins von NCIMB 40887 Cosmid-DNA des oben angesprochenen,
entomozidischen Klons 1 von NCIMB 40887 wurde unter Einsatz eines
Wizard-Plus-SV-DNA-Systems (Promega) gemäß den Herstellerhinweisen gereinigt.
Eine teilweise Karte des klonierten Fragments wurde unter Einsatz
einer Reihe von Restriktionsenzymen, EcoR1, BamH1, HindIII, Sal1
und Sac1, wie in 3 dargestellt, erhalten. Die
DNA-Sequenzierung wurde durch auf pUC18 und pUC19 basierende Subklone
des Cosmids unter Einsatz der Enzyme EcoR1, BamH1, HindIII, EcoRV
und PvuII initiiert. Sequenzlücken
wurden unter Einsatz eines Primer-Walking-Ansatzes auf gereinigter
Cosmid-DNA gefüllt.
Sequenzreaktionen wurden unter Einsatz des "ABI-PRISMTM-Dye-Terminator-Cycle-Sequencing-Ready-Reaction-Sets" mit Ammplitaq-DNA-Polymerase
FS gemäß den Herstellerhinweisen
durchgeführt.
Die Proben wurden durch einen automatischen ABI-Sequenzierungsautomaten
gemäß den Herstellerhinweisen
analysiert. Der Hauptteil der DNA-Sequenz für das klonierte Toxinfragment
wird in 2 dargestellt.
-
Beispiel 10
-
Restriktionskarte von
kloniertem Toxin von Klon 3
-
Cosmid-DNA
des oben genannten, entomozidischen Klons 3 wurde wie in Beispiel
9 beschrieben gereinigt. Eine Restriktionskarte des klonierten Fragments
wurde unter Einsatz der Restriktionsenzyme BamH1, HindIII, Sal1
und Sac1 erhalten und wird in 3 dargestellt.
Wenn ein Vergleich mit der Karte von Klon 1 (3) angestellt
wird, ist durch die einander überlagernden
Regionen deutlich, dass die Restriktionskarten einander sehr ähnlich sind.
Der einzige nachweisbare Unterschied zwischen den beiden Klonen
war eine Reduktion der Größe von zwei
HindIII-Fragmenten in Klon 3, entsprechend den 11,4-kb- und 7,2-kb-HindIII-Fragmenten
in Klon 1, um jeweils 2 kb bzw. 200 bp. Diese Ergebnisse weisen
darauf hin, dass die DNA-Regionen, die
für die
Toxizität
in den beiden Bakterienstämmen
kodieren, insgesamt verwandt sind.
-
Beispiel 11
-
Southern-Blot-Hybridisierungsexperimente
-
Ein
10,3-kb-BamH1-Sal1-Fragment der DNA von Klon 1 wurde als Sonde für die Hybridisierung
von vollständiger,
mit HindIII verdauter DNA der Xenorhabdus-Stämme
ATCC 19061, NCIMB 40886 und NCIMB 40887 eingesetzt. Die Hybridisierung
erfolgte mit 20 ng/ml DIG-markierter DNA-Sonde 18 h lang bei 65°C. Filter
wurden vor dem immunologischen Nachweis zweimal 5 min lang mit 2 × SSC (0,3
M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0)/0,1 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat
bei Raumtemperatur und zweimal 15 min lang mit 0,1 × SSC (15
mM NaCl, 1,5 mM Nat riumcitrat, pH 7,0) mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat
bei 65°C
gewaschen. Die Sonde wurde markiert, und Experimente wurden gemäß den Herstellerhinweisen
durchgeführt,
wobei ein nicht-radioaktives DIG-DNA-Markierungs- und Nachweis-Set
(Boehringer) eingesetzt wurde. Die Sonde wurde an ein HindIII-Fragment
mit etwa 8 kb in allen drei Stämmen
sowie als ein 11,4-kb-Fragment in NCIMB 40887 und ein etwa 9-kb-Fragment in NCIMB
40886 und ATCC 19061 hybridisiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Stämme
NCIMB 40886 und ATCC 19061 DNA umfassen, die eine enge Homologie
mit dem Toxingen des oben genannten Klons 1 aufweist, wodurch die Ähnlichkeit
der von den drei Stämmen
produzierten Toxine bestätigt
wird.