DE3131034A1 - "autonom replizierendes eukaryotisches dna-segment" - Google Patents
"autonom replizierendes eukaryotisches dna-segment"Info
- Publication number
- DE3131034A1 DE3131034A1 DE19813131034 DE3131034A DE3131034A1 DE 3131034 A1 DE3131034 A1 DE 3131034A1 DE 19813131034 DE19813131034 DE 19813131034 DE 3131034 A DE3131034 A DE 3131034A DE 3131034 A1 DE3131034 A1 DE 3131034A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ars
- hybrid
- dna
- gene
- yeast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
vossius-Vossi υ s It-A1QgH He:r :'™ s.u ν em an ν · rauh
PATENTANWÄLTE
SIEBERTSTRASSE A- ■ 8OOO MÜNCHEN 86 - PHONE: (OÖ9) 4-7 4-O 75
CAB-LE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 4-5 3 VOPAT D
u.Z.: R 325· (Vo/ko) 5> August 1981
Case: 5490-26 J ' .
-BOiRO OF TRUSTEES OI LEMHD STANDiORD JR. UNIVERSITY
Encina 105, Standford, California} Y.St.A.
·
" Autonom replizierendes eukaryotisch.es DNA-Segment "
Die Fähigkeit, .extrachromsosomaler DNA-Moleküle zur seXbstän-'digen
Replikation ist dazu "benutzt worden, um prokaryotische
Replikati ons startpunkte zu isolieren. Üblicherweise wird DNA
in Bakterien durch Phageninfektion, Konjugation oder durch
Transformation eingeführt, die durch Calcium ermöglicht wird. Ein "bestimmtes DNA-Molekül vermehrt sich ohne
Integration in das WirtsChromosom nur dann, wenn es eine
Startstelle enthält, welche von den wesentlichen Replikationsenzymen
und -faktoren erkannt wird. Die Vermehrung solcher· extrachromosomaler DNA-Moleküle kann sichergestellt werden
durch Selektion für die Ausprägung eines mit dem Molekül •gekoppelten'Markers, z.B. eines Gens, das für eine Arzneistoffresistenz
codiert oder welches einen genetischen Schaden des Wirts zu komplementieren vermag. Diese Strategie ist
angewandt worden für die Isolierung und Charakterisierung der Replikationsstartpunkte des Ehagen X , des F-Faktors und
von R-Plasmiden sowie der Chromosomen, von Salmonella
thyphimurium und E. coli.
-γ . ·* ?·· . ·· :· 3131D34"1
Die Hefe Saccharomyees cerevisiae ist der einzige Eukaryot,
in welchem ein ähnlicher Selektionsweg- derzeit gangbar, ist.
Zwar können Virions die für die Replikation in Eukaryoten ■
notwendige Replikationsstelle zur Verfügung stellen, doch ist die Einführung von Virions oder von Teilen davon für
viele Anwendungen, die sich der Technolgie der rekombinanten
DNA "bedienen, nicht wünschenswert. Es ist daher von erheblicher Bedeutung, alternative Methoden zur Einführung
extraehromosomaler DNA in eine Eukaryotenzeile zu finden·,
.wobei· die extrahcromosomale DNA zur Selbstreplikation 'befähigt
ist und/oder rasch in das Chromosom integriert»
K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (PNAS) USA,. Bd.
76 (1979),S. 1O35.-1O59, beschreiben ein DNA-Fragment von
Hefe,· welches Hefe mit hoher Ausbeute zu transformieren
vermag und sich wie ein Minichromosom verhält, indem es autonom, ohne Integration in das Genom, repliziert. S.'Scherer
und R.W. Davis,' PNAS, USA, Bd. 76 (1979), S. 4951-4955,- ·
beschreiben eine Methode zur dauerhaften Einführung fremder DNA-Sequenzen in Chromosomen von S. cerevisiae. Die Methode
schließt die Verwendung von Vektoren ein, welche in chromosomale DNA integrieren; vgl. auch D.T. Stinchcomb et al.,
Nature, Bd. 282 (1979), S. 39-43. . ' ·
2^ Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eukaryotische
autonom replizierende DNA-Segmente ·- nachstehend mit ars oder ars-Gen bezeichnet,-· zur Verfügung zu stellen. Diese
eukaryotischen autonom replizierenden (DNA-)Segmente werden
erfindungsgemäß dadurch erhalten, daß man chromosomale Wirts-DNA.fragmentiert und die Fragmente mit einem Marker-Gen
verknüpft. Man erhält auf diese Weise eine Hybrid-DNA, welche die Selektion von Transformanten ermöglicht. Ein ·
schnell wachsender Eukaryot, insbesondere Hefe, wird unter Bedingungen transformiert, welche auf die Ausprägung der
Hybrid-DNA hin selektionieren. Die Hybrid-DNA wird aus den
Transformanten isoliert. Die autonom replizierenden Segmente
L . . J
können weiter modifiziert und als Vektoren verwendet werden, die mit Genen des ¥irts oder einer anderen Quelle verknüpft
sind. Das Hybrid wird sich selbständig replizieren und die
Ausprägung der Gene erlaufen, welche mit dem autonom replizierenden
Segment in· die Zellen eingeführt wurden. Anschließend kann die stabile Integration von einem Gen oder mehreren Genen
in das Wirtschromosom durch entsprechende Konstruktion des Hybrids erreicht werden. - -
10.. Erfindungsgemäß werden Methoden und Komponenten zur Veränderung
eukaryotischer Zellen zur Verfugung gestellt, die zum
'•Ziel haben, Zellen zu erzeugen, welche vermehrungsfähige Kopien
eines zelleigenen Gens enthalten oder welche nichtrevertierende Mutationen tragen, die'den Verlust einer phänotypisehen
Eigenschaft bedingen, oder welche Fremdgene ausprägen,
was zur Herstellung eines Fremdproteins führt. Die geneti- " "
sehe Veränderung kann durch die dauernde Anwesenheit eines autonom replizierenden hybriden DMAr-MoIeküls bedingt sein
oder durch die Integration von einem oder mehreren DHA-Segmenten
in das Wirtschromosom.
Die Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung enthalten ein "autonom replizierendes Segment" (ars) von DlTA, .welches aus
einem Chromosom eines Eukaryoten stammt (und welches weni-
•25 ger als 1000 Basenpaare aufweist, falls es aus Hefe stammt).
Man erhält "das autonom replizierende Segment durch Spaltung
eines Eukaryotenchromosoms und Verknüpfung der erhaltenen
!Fragmente mit einem DEA-S egment, welches ein oder mehrere
geeignete Merkergene trägt, die in einer Eukaryoten- und/oder
'30. Prokaryotenzelle ausgeprägt werden können. Mit der Hybrid-DITA
wird eine geeignete eukaryotische Wirtszelle tränsfor-'
miort, wobei Transformanten aufgrund dor phänotypischen Aus-•
prägung des Markergens selektioniert werden. Wenn eine Eukaroytenzelle transformiert wurde, genügt die aus einem
35' Eukaryotenchromosom" stammende Replikationsstelle für die
Implikation der Hybrid-DNA in der eukaryotischen Transfor-
L _J
-Jr-
"■-■■ β
mante und dient ·gleichzeitig auch als ein Marker.
Die Hybrid-DNA kann dann isoliert werden. Das eukaryotische
DIA-Segment, welches die autonome Replikation erlaubt, kann
präpariert,d.h. isoliert, nach Bedarf modifiziert und dann zur Transformation der Wirtszellen oder anderer ähnlicher
Eukäryotenzellen benutzt werden. . · .
Falls eine DNA-Sequenz, welche zu einem Abschnitt des Wirts-Chromosoms
homolog ist und durch ein oder mehrere Gene un- . terbrochen ist, in der Hybrid-DNA mit dem autonom replizie- '
renden Segment (ars) enthalten ist, so können die zusätzli-.
chen Gene stabil-in das Wirtschromosom integriert werden. ·
Zunächst soll das Verfahren·zur Gewinnung autonom replizierender Segmente (ars) behandelt werden. Eukaryotische DNA
wird fragmentiert,- um Bruchstücke zu erhalten, deren Größe '
ausreicht für ein gesamtes ars. Die Größe der Bruchstücke · beträgt gewöhnlich mindestens etwa 100.Basenpaare, häufi- .
ger mindestens etwa 200 Basenpaare und.vorzugsweise mindestens
etwa 500 Basenpaare. Die Segmente können durch mechanisches Zerkleinern des Chromosoms oder durch enzymatische
,Spaltung mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen er- ·.
zeugt werden. Es sollen solche Restriktionsehzyme gewählt
werden, welche das ars nicht spalten, obwohl Oligomerisie-· ■
rung das ars bei der Bildung der Hybrid-DEA wiederherstellen
würde. Auch Segmente von einem anderen Eukaryoten als Hefe können die. Replikation in Hefe ermöglichen. Somit muß die
erzeugte Hybrid-DITA· nicht eine Replikatorstelle von Hefe
besitzen,und tatsächlich ist es sogar wünschenswert, daß
eine solche Stelle nicht vorhanden ist, wenn das interessierende ars von einem anderen Organismus als von Hefe
stammt·
Wenn das Eukaryoten-Öhromosom mechanisch zerkleinert wird,
müssen die Enden der DNA-Bruchstücke mittels bekannter
L . -J
SlO
Methoden, modifiziert werden, um die legierung an andere DFA-Segmente
bei der Herstellung der Hybrid-DNA zu ermöglichen..
Die Modifikation kann z.B. in einem Exonukleaseabbau "bestehen oder im Anbau kleiner DUA-Sequenzen, entweder durch
Anfügen einzelner Basen oder einer vorgefertigten Sequenz. Wenn Restriktionsenzyme für die Spaltung der DMA verwendet'
·■ werden, so soll das gleiche Enzym sowohl für das Chromosom
als auch für. die Fremd-DFA benutzt werden, um kohäsive' oder
auch stumpfe Enden zu erzeugen, die für die Verknüpfung der chromosomalen. Segmente mit. den anderen DNA-Sequenzen "benutzt
. -werden können. ·
• Zusätzlich zu der ars enthaltenden Sequenz trägt die Hybrid- ·
DiTA einen Marker, welcher die Selektion von Transformanten von Hefe oder ander en. Eukaryo ten erlaubt·. Das Hybrid kann
auch zusätzlich das Replikon von Prokaryoten enthalten, um die Vermehrung in einem prokaryotischen Wirt zu ermöglichen. '
Die zur Selektion verwendeten Marker können vielfältiger Art sein. Zu den üblichen Markern gehören solche, die Resistenz
gegen Antibiotika,wie Tetracyclin, Ampicillin, Penicillin oder Kanamycin, verleihen. Stattdessen können auch Marker
■ verwendet werden, welche in einer auxotrophen Zelle-.,Prototrophie
bewirken. Prototrophie schließt die Bildung von Enzymen ein, welche beteiligt sind an Biosynthesewegen zur Herstellung
von Uukleotiden oder von Purin- oder Pyrimidinvorstufen,
wie Uracil, Adenylsäure, Guanylsäure, Cytidylsäure oder Thymidylsäure, oder zur Herstellung von Aminosäuren,
' wie leucin, Tryptophan oder Histidin, oder zur Aufnahme benötigter Nahrungsstoffe, oder um eine Toxin-Resistenz zu be-
wirken. , ■
Wenn beabsichtigt ist,, ein bestimmtes Gen in das Chromosom
des eukaryotischen Wirts einzubauen, müssen andere Techniken ·angewandt werden. Eine Möglichkeit ist es, daß die
Hybrid-DHA eine veränderte Sequenz eines Gens enthält,
welches auch im Wirtschromosom vorhanden ist, wobei die
L ' ■ ■ . J
Veränderung in der Insertion von einem oder mehreren Genen besteht. Aufgrund der homologen Sequenzen des veränderten
Gens und des Wirtschromosoms können die inserierten. Gene durch Rekombination stabil in das Wirtschromosom eingebaut · " ·
■ 5 werden. Es wurde weiterhin festgestellt, daß man Segreganten
erhalten kann, bei denen mindestens der größere Teil der DNA, welche nicht die veränderte Sequenz darstellt, aus dem .
Chromosom verloren geht. Eine andere Möglichkeit .ist es,
in die Hybrid-DNA neben das zu integrierende Gen ein transponierbares Element einzubauen. Das transponierbares Element
wird in das Wirtschromosom integrieren und dabei gleichzeitig das Gen in das Wirtschromosom mit einbauen. Wenn man die
transformierten Zellen eine Anzahl von Generationen lang '·
züchtet, kann man Segreganten isolieren, welche das gewünschte Gen stabil integriert im Chromosom enthalten.
Autonome Replikation kann mit einem DNA-Pragment erreicht ·
werden, das nur 10. Basenpaare lang ist, häufiger aus m'inde-·
stens etwa 50 Basenpaaren, noch häufiger aus mindestens et—
wa 100 Basenpaaren, besteht. Das "ars-Gen" ist enthalten in einem DNA-Pragment· von mindestens etwa 200 Basenpaaren, gewöhnlich
mindestens etwa 500 Basenpaaren und gewöhnlich weniger als etwa 2000 Basenpaaren. Pur Hefe ist ars ein Pragr
meng von weniger als etwa 1000 Basenpaaren. Das ars-Gen ist
.25 dadurch charakterisiert, daß es mit der chromosomalen Eukaryoten-DNA
hybridisieren kann, von der es stammt', daß es zu ho- · hen Transformationsausbauten führt und daß es den größten
Teil des Wirtschromosoms nicht mehr enthält. Gewöhnlich hat das DNA-Pragment, welches das ars-Gen zusammen mit anderen,
natürlicherweise damit.verbundenen Genen enthält, weniger
als etwa 20 000 Basenpaare, üblicherweise weniger als 10 Basenpaare und vorzugsweise weniger als 5000 Basenpaare. Je
nach Art der Bildung des Fragments mit dem ars-Gen können
andere Gene mit dem ars verbunden sein. Wenn andere Gene·,
insbesondere Strukturgene, dabei sind, ist das ars-Segment
einschließlich solcher Gene größer als etwa 1.000 Basenpaare.
Es gibt viele Situationen^ in denen die Anwesenheit eines anderen
Gens außer ars unerwünscht ist. Die Anwesenheit eines anderen Gens zusammen mit Kontrollgenen für dessen Expression
•kann bei vielen Gelegenheiten unerwünscht sein: Wenn es sich
um die Ausprägung eines unerwünschten Proteins handelt, oder
um unerwünschte Schnittstellen für Restriktionsenzyme, in-•
.stabile Transformanten, unerwünschte Insertionen oder Insertionen
eines unerwünschten Genortes, * und- wenn die Wahrscheinlich-
- - keit erhöht wird, daß die interessierenden Gene durch Rekombinationsereignisse
von ars abgetrennt werden. Es ist daher
wünschenswert, die Anwesenheit anderer DNA-Sequerizen als der
.- des ar3-Gens und der Verknüpfungssequenzen so niedrig wie möglich zu halten. Die anderen Gene können entfernt werden
• durch Restriktionsenzyme, durch Selektion von Fragmenten, welche diese Gene nicht enthalten, durch Entfernung von Ba-.
' sen mittels Exonuklease und durch ähnliche Maßnahmen. Es ist
•·. anzustreben, daß .weniger als 50 %f eher noch weniger als et-.wa-20
% der Basenpaare des anhängenden unerwünschten Gens Bestandteil der ars-haltigen Fragmente sind..
""."·■
In einigen' Fällen können MuItimere der ars-Gene vorliegen,
j Die Anzahl der Einheiten kann im Bereich zwischen 2 und 4
liegen.
j ■ -
j ■ 25 Die Herstellung der .ars-haltigen Hybrid-DHA-Moleküle kann
auf vielfältige Weise geschehen und hängt ab von der Verwendung der Hybrid-DKA, von der Form, in welcher die DFA-Se- ■ .
quenzen vorliegen, von Restriktionsschnittstellen, die bereits vorhanden sind oder die eingeführt- werden sollen, und
' davon, was mit der Transformation beabsichtigt ist, z.B.
Integration in das Chromosom. . "
Es kann hinreichend kartierte ringförmige DHA eines Plasmids,
Phagen, Virus oder von einem Chromosom, verwendet werden, die mindestens eine, besser jedoch zwei oder mehrere verschiedene Schnittstellen für Restriktionsenzyme, aufweist. Die
zirkuläre DNA kann einen oder mehrere .'Marker tragen, besonders
solche, welche Antibiotikaresistenz vermitteln oder für ein in .einem Biοsyntheseweg benötigtes Enzym codieren, oder
es können solche Marker in eine Restriktionsschnittstelle. . eingeführt werden. Je nach Art der Restriktionsstelle kann ' ■
diese verändert werden durch Entfernen·von Basen mittels
Exonukleasen oder durch Anfügen von Basen mit DNA-Polymerasen oder Ligasen. Die Hybrid-DNA kann schrittweise aufgebaut werden
oder durch Vereinigung zweier DNA-Segmente, welche alle interessierenden Gene enthalten. Die Art, nach welcher die
ars-haltigen hybriden DNA-Moleküle hergestellt werden, ist die herkömmliche und ist nicht von entscheidender Bedeutung
für die Erfindung, obwohl in vielen Fällen einem Verfahren der Vorzug vor einem anderen zu geben ist.
Die entstandenen Hybrid-DNA-Moleküle werden dann zur Transrformation
eines geeigneten eukaryotisehen Wirts eingesetzt, .vorzugsweise eines sich rasch vermehrenden Eukaryoten, wie' S.
cerevisiae. Die Transformation wird auf übliche durchgeführt, .20 vorzugsweise unter Anwendung von Calciumionen (Calcium- ·.'
Schock). Zweckmäßigerweise werden Sphäroplasten zur Transformation verwendet. Nach Transformation der Zellen vermehrt
man die Kultur dann in einem'Nährmedium, welches die
Selektion der Transformanten ermöglicht. Die Hybrid-DNA kann dann aus verschiedenen Kolonien isoliert und auf hohe Transformationshäufigkeit
geprüft werdenj welche eine Eigen-' schaft des ars-Gens ist. Die Hybrid-DNA kann auch durch andere Methoden nachgewiesen werden, z.B. durch Hybridisierung
und Autoradiographie.
Hat man erst einmal das ars-haltige Hybrid isoliert, kann es in einer Anzahl verschiedener Weisen modifiziert werden.
Vienn Restriktionsenzyme eingesetzt wurden zur .Herstellung
der DNA-Segmente, aus denen die Hybrid-DNA hervorging, so kann diese Hybrid-DNA mit dem gleichen Enzym gespalten und
das ars-haltige Segment isoliert werden. Wenn es erwünscht
L ■'■■■· . ■ J
ist, kann das Segment durch Restriktionsenzyme weiter verkürzt
werden·, um DKA zu entfernen, die nichts mit dem ars-Gen zu tun hat; oder das Segment kann mit Exonukleasen behandelt
werden,· um überflüssige Endbasen zu entfernen. Das ar3-Gen
kann anschließend benutzt werden zur Herstellung von Hybridmolekülen
für die Transformation des eukaryotischen Wirts, um diesen mit gesteigerten oder neuen genetischen Fähigkeiten
auszustatten. .
Durch geeignete Behandlung kann man ein Hybrid herstellen, welches zur dauerhaften Einführung von einem oder mehreren
• Genen in das Chromosom des eukaryotischen Wirts führt.. Die
Integration dieser Gene in das Chromosom wird durch Verwendung einer DFA-Sequenz erreicht, welche, zu einer DNA-Sequenz
des Wirtsehroraosoms homolog ist. Durch Auswahl einer geeig- '
-' neten Restriktionsschnittstelle in der Sequenz können die Gene",
;^elche in das Wirtsehromosom eingeführt v/erden sollen, zwischen
die Enden der homologen Sequenz inseriert werden. Die so veränderte Sequenz wird dann in einen geeigneten ars-haltigen
Yektor eingesetzt, um die Hybrid-DHA zu ergeben.
Nach Transformation' des eukaryotischen Wirts mit der Hybrid-DMA
kann die homologe Sequenz in das Wirtsehromosom integrieren. Stattdessen-ist die Hybrid-DEA infolge des in ihr
enthaltenen ars-Gens aber auch in der Lager, sich als Minichromosom
in dem eukaryotischen Wirt zu replizieren und die Ausprägung der in der Hybrid-DHA vorhandenen Gene zu ermöglichen.
Wenn es nicht erwünscht ist, die Gene in das Chromosom
zu integrieren, braucht die Hybrid-DSTA keine mit dem Wirts-Chromosom
homologe Sequenz für die Integration zu enthalten. ■ Integration kann jedoch als Polge mitotischer Rekombination,
bedingt durch die ars-Homologie, erfolgen.
Die homologe Sequenz soll wenigstens aus je einem etwa"i000
Basenpaare langen Abschnitt beiderseits des veränderten Gens ·· bestehen, gewöhnlich· einem mindestens etwa 1500 Basenpaare
■ 1 ■ langen Abschnitt, vorzugsweise einem wenigstens etwa 2500 Ba-.
senpaare langen Abschnitt. '
Es ist wünschenswert, daß die homologe Sequenz Gene .oder Ab-•
5 schnitte eines Genoma umfaßt, die keine bekannte Fuktion er-.
füllen, um veränderte Wachstumseigenschaften oder zusätzliche Nährstoffbedürfni'sse für die mutierte OEransformante zu vermeiden.
Hach Integration des veränderten Gens in das Chromosom
würde dann, abgesehen von der Ausprägung der neuen Gene, keine "Veränderung in den phänotypisehen Eigenschaften oder
Wachstumscharakteristiken der mutierten Transformante eintreten,
. Es ist wünschenswert, daß die homologe Sequenz eine hohe Wahrscheinlichkeit
zur Rekombination mit dem Wirtschromosom aufweist. Daher wird-sich für gewisse Sequenzen herausstellen,
daß ihnen wegen der Integrationseffizienz der Torzug zu ge- .
ben ist. Die Integration kann auch weitere DNA-Sequenzen als das veränderte Gen betreffen. Das kann von der Anwesenheit an-·
derer homologer Sequenzen als dem veränderten Gen herrühren, welche als ein Ort für Rekombination dienen, oder von Sequenzen,
die mit dem veränderten Gen gekoppelt sind und zusammen mit diesem inseriert werden.
Um die Zellen besser selektionieren zu können, in denen Integration
erfolgte, kann ein Marker zur gleichzeitigen Integration mit dem interessierenden Gen in. die Hybrid-DEA mit '
eingebaut werden.. Durch Selektion auf diesen Marker kann- die-'Zellpopulation
auf die Zellen reduziert werden, welche transformiert wurden und bei denen die Transformanten instabil ·
sind sowie auf solche Zellen, bei denen Integration erfolg-
. te.. Der Marker wird instabil ausgeprägt-, wenn die DHA nicht
integriert ist und autonom repliziert. Selektion auf stabile Expression reduziert die Zellpopulation auf die Zellen, in
denen die Integration erfolgt ist.
' Aus einer Transformante können Segreganten hervorgehen, aus
deren Chromosomen entweder Teile der integrierten DNA herausgeschnitten sind, welche nicht identisch sind mit dem veränderten Gen einschließlich der komplementären Marker, oder die
.DNA-Sequenz herausgeschnitten ist, welche- den Rekombinationsort
"bereitstellte."
Die Gene, welche in"den eukaryotischen Wirt eingeschleust
und dort ausgeprägt werden können, vermögen die Herstellung
•10 einer "breiten Vielfalt von Proteinen zu bewirken, woraus sich
die erwünschten phänotypischen Eigenschaften ergeben. Die Expression
der. .Gene kann zu Enzymen führen für die Herstellung "
der verschiedensten Nährstoffe, wie Aminosäuren oder Vitamine, für die Durchführung einer großen Vielfalt chemischer Reaktionen,
wie Oxidation, Nitrifikation, Reduktion, Hydrolyse oder Halogenierung, oder sie führt zu den verschiedensten
nicht-enzymatischen Proteinen, wie Hormonen, Globulinen, Albuminen, Kollagen oder Keratin. · .
Der eukaryotische Wirt kann z.B. ein Vertebrat oder Nicht-. • . vertebrat sein, wie z.B. ein Sauger, Insekt, eine Hefe, e.in
Pilz oder Schimmelpilz, oder eine". Pflanze, wie ein Baum, eine Gemüse-, Früchte-, oder Knollenpflanze.
Die folgenden' Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 . ' .
Gewinnung der ars-Gene
Mehrere Pools hybrider Moleküle werden hergestellt durch Ge- .
winnung von Segmenten verschiedener eukaryotischer chromosomaler DNAs mittels Restriktionsenzymen und Insertion derselben in'Y-Ip5 (YIp5 enthält ein' 1100 Basenpaare langes Fragment
' mit-dem Gen ura3, welches durch dG/dC-Homopolymer-Verlängerung
in die Aval-Schnittstelle von pBR322 eingespleißt
• a
wurde; vgl. K. Struhl et al., PMS USA, Bd. 76 (1979), S-.
1035-1059. Die Restriktionsnuklease EcoRI wird verwendet,
um die DIiA von N. crassa, D. discoideum, C. elegans, D. melanogaster
und Z. mays zu fragmentieren. D. melanogaster-DNA wird' auch gleichzeitig mit Hindlll und EcoRI gespalten. I1Ur.
Hefe-DNA wird die Sndonuklease Baml-II verwendet., um Sequenzen
des endogenen Hefeplasmids Scp1 auszuschließen sowie die Cluster der ribosomalen Gene von Hefe, von denen man weiß,
daß sie mit großer Häufigkeit transformieren. Nach Verdauung mit der (den) geeigneten Restriktionsnuklease(n) werden
die YIp5-DNA und die chromosomalen DNAs (ge 15-20 ng
DNA/ml) gemischt und mit 0,1 jig T4-DNA-Ligase in 200 mM NaCl,
50 mM Tris-HCl pH7,4, 10 mM MgSo., 1 mM ATP und 10 mM dTT '
"bei 40O 1 Ms 24 Stunden lang ligiert. Das Ligierungsgemisch
v;ird direkt zur Transformation von Hefezellen eingesetzt.
Der Hefestamm NNY27' (<X trp 1-289 ura3-52 gal2 gal10) wird
mit jedem einzelnen Pool von YIp5-Eukaryoten~DNA-Hybriden
transformiert. Das Verfahren von Hinnen et al., PNAS USA,. Bd. 75 (1978), S. 1929-1933, wird mit folgenden Veränderungen
angewandt.. Durch 30minütige Behandlung Ms 300G von
. 100 ml einer exponentiell wachsenden Kultur mit 300 Einheiten Lycticase werden Sphäroplasteii erzeugt. Nach einer ■
Polyäthylenglykol-Behandlung werden die Zellen-.sofort im
7 8
Regenerationsagar plattiert (10-10 lebensfähige Sphäroplasten
pro.Petrischale). Die Transformation von NNY27 mit
den Hybrid-DNAs, welche sowohl den YIp5-Vektor als auch das
• ars-Gen enthalten, führt zu Ura+-Zellen, welche auf Selektivmedium
sich vermehren können. Die Häufigkeit, mit der NNY27 zu üra+ transformiert wird, schwankt zwischen etwa '
50 Kolonien/pg YIp5-N.crassa- oder YIp5-0. elegans-Hybrid-•
DNA und 2000 Kolonien/ug für den Pool von D. discoideum-Hybriden
(alle Werte stellen Ura+-Transformanten pro YIp5-DNA-Menge
dar, welche in einem Hybrid-Pool vorhanden war, und sind korrigiert nach den verschiedenen Transformationshäufigkeiten, welche mit einem anderen Vektor, YRp12, erT
halten werden). Zwei getrennte Pools von YIp5-D." melänogaster-Hybriden,
welche durch. EcoRI-Spaltung unterschiedlicher DNA-Präparationen
erhalten werden, liefern 800 und 1000 Ura+-
.Transformanten/pg DFA. Ferner bringen XIp5-D. melanogaster-Hybride,
die mit HindiII-Endonuklease hergestellt werden, 600 Ura+-Kolonien/ug Hybrid-DNA nach. Transformation τοη
NNY27 hervor. ■
Die Wachstumsraten der He fetransformanten im· Standard-Hefe»
Minimalmedium werden in einem Klett-Summerson Kolorimeter gemessen. Die Stabilität des transformierten Phänotyps wird
dadurch, festgestellt, daß eine ausgewachsene Kultur 1 : 1000
• in Tollmedium.verdünnt und dann durch zweifache Plattierung
auf nichtselektive und selektive Platten der Prozentsatz der
Zellen "bestimmt wird, die Ura+ geblieben sind. E.' coli-Transformationen,
rasche DNA-Präparationen, Agarose-Gelelektro- ; phorese, Übertragung auf Nitrocellulose-Papier sowie Hy-"bridisierung
mit J P-markierter pHR322-D¥A werden mit geringfügigen
Änderungen nach den publizierten Verfahren ausgeführt (K. Struhl et al., siehe oben; Davis et al., J.
Advanced Bacterial Genetics Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories'Press, Cold Spring Harbor, Ή evr York;
• - E.M. Southern,'J. Mol. BioL,, Bd. 98 (1975), S. 503-517, und
P.W. Rigby-et al., J. Molec. Biol., Bd. 113 (1977), S. 237-
251. '
Zur.raschen Gewinnung von Hefe-DKA wird die Gesamt-Hefe-DNA
von 5 ml Kultur stationärer Zellen präpariert. Die Hefezellen
werden geerntet und resuspendiert in 0,4 ml 0,9M
.30. Sorbit/50 mti Kaliumphosphat, pH 7,5, 14 mM 2-Mercaptoäthanol.
Lyctiease (25 Einheiten) wird zugesetzt und die
Sphäroplastenbildung 30 Minuten lang bei 300C ermöglicht.
In diesem Stadium wird das Verfahren zur raschen Phagen- : DNA-Gewinnung (J.R. Cameron und RiW. Davis, Nucleic Acids
35. Res., Bd. 4 (1977), S. 1429-1448) mit zwei Abweichungen angewandt.
Die Äthanolfällung wird bei Raumtemperatur durch-.
L· ■ .J
geführt und das entstandene Pellet wird in 50 Ms 100 ul
10 mM Tris, pH 7,5/1 mM EDTA mit 0,5 pg Pankreas-RNase aufgenommen.
Diese Präparationen ergeben annähernd 1 ng DNA/ml Originälkultur. Die DM hat ein hohes Molekulargewicht, ist
relativ frei von Einzelstrangbrüchen und kann durch alle Restriktionsenzyme
gespalten werden, die geprüft wurden.
Etwa 10 zufällig ausgewählte Ura+-Transformanten werden von'
jeder Transformation genommen und ihr Phänotyp wird festgestellt. NNY27 hat eine G-enerationszeit von 2,5 Stunden in
Minimalmedium supplementiert mit Uracil. Die 'Verdoppelungszeiten von Stämmen, welche durch YIp5-Hefe-DNA-Hybride zum
Phänotpy Ura+ transformiert worden sind, liegen zwischen 4
und 8,5 Stunden. Der I. crassa-Hybrid-Pool liefert Transformanten,
die sich etwa'schneller vermehren, mit Generationszeiten von 3 bis 4,2 Stunden. Die Verdoppelungszeiten für' ■."
Transformanten, die durch andere Eukaryote'n-DNAs ehtstan- ·
den sind, variieren zwischen 4,5 und 62 Stunden..
Alle Ura+-Transformanten sind instabil. Nach annähernd 10
. Generationen unter nichtselektiven Bedingungen verlieren
95 % oder mehr eines jeden transformierten Stammes die Ura -'
Eigenschaft. Es scheint eine grobe Beziehung zwischen relativer Instabilität und Wachstumsrate zu bestehen. Die Transformanten
mit längeren Verdoppelungszeiten verlieren den ■ Ura+-Phänötyp schneller in einem Tollmedium. . ..
Der Zustand der DNA, die für den Ura -Phänotpy der Trans-. formanten verantwortlich ist, wird festgestellt. Hefe-DNA
wird aus ¥ra+-Transformanten gereinigt. Die ringförmige,
extrachromosomale DNA wird von der linearen chromosomalen DNA mit hohem Molekulargewicht durch Agarose-Gelelektro- ;
phorese abgetrennt. Elektrophorese der unverdauten DNA.wird
in 0,6 % Agarose, 40 mM Tris-OH, 20 mM Essigsäure, 2 mM ■
EDTA, 16 Stunden lang bei 1 Yolt/cm· durchgeführt. Die chromosomale
Hefe-DNA und die endogene Plasmid-DNA wandern in getrennten
Zonen. Das Bandenmuster des Gels wird auf Nitro-
L -J
το
cellulose übertragen und dann mit annähernd 5 χ 10 cpm
52P-markierter pBR322-DNA hybridisiert in 50 % Formamid,
0,9M HaCl, 50 AM Natriumphoaphat pH 7, 5 Ä EDTA, 0,2 % SDS
und· 200 p.g/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Das gewaschene
und getrocknete Nitroeellulosefilter wird zur Belichtung von Kodak- XR-5 Roentgenfilm verwendet. Die Autoradiographie
wird einige Tage bei -70 C in Gegenwart ning Plus Verstärkerfolie durchgeführt.
wird einige Tage bei -70 C in Gegenwart einer DuPont light-
.10 Bei jeder von 65 Transformanten, die Hybrid-DNAs jeder Her-•
kunft repräsentieren, wandern die transformierenden Hybrid-DNA-Moleküle
an jeweils besonderen Positionen, die verschie-
• · den sind von den Positionen der chromosomalen Hefe-DNA und
der DMA des endogenen Hefe-Plasmids. Die mehrfachen Banden
der hybridisierenden DMA können am einfachsten erklärt werden als "supercoiled" DNA-Ringe und als entspannte Ringe von
monomeren, dimeren und (in einigen" Fällen) -trimeren Formen
der. transformierenden DNA. Solche Multimere werden oft durch
die rekombinationsfreudige Hefe er.zeugt; Wiederum konnte
eine Korrelation hergestellt werden- zwischen der Intensität
der DNA-Hybridisierung und der Wachstumsrate einer jeden Transformante. Je schneller die Wachstumsrate, umso besser
die Hybrid!sierung, was andeutet, daß dort mehr Kopien der
Hybridsequenz vorhanden sind, wo die bessere Hybridisierung
beobachtet wird. ' -
• B e i s ρ i e-1 ' 2 ·
■ Integration veränderter DNA-Sequenzen, die in vitro konstruiert werden
•30 ■ . ' .
Im Plasmid YIp1(K. Struhl et al., PNAS USA, Bd. 76 (1976),
S. 1Q35-1O39) wird eine interne Deletion im his3-Gen (K.
Struhl etial., PNAS USA, Bd. 73 (1976), S. 1471-1475) durch
Entferner eines 150 Basenpaare langen Hindlll-Fragmentes in
vitro -erzeugt., YIpI enthält das Hefegen his3' (welches hisB-Mutationen
in E. coli komplementiert) und das Gen für
L · "J"
7Λ
Ämpileillin-Resistenz von pBR322. Die Plasmid-DNA wird mit'.
Hindlll. gespalten und in geringer Konzentration wieder ligiert. Es wird eine Ampicillin-resistente .Transformante von·
E. coli gisB4-63, die His"" geblieben war und das gewünschte
veränderte Plasmid'enthält,isoliert, um daraus DNA·zu gewinnen',
welche zum Schutz gegen die K-Eestriktion modifiziert war. Die Hefe-Sequenzen des so entstandenen Plasmid pBR322-Sc29O3
bewirken keinen selektierbaren Phähotyp in Hefezel-1en.
Daher wird das Hefegen ura3 an die veränderten his3-· •10 Sequenzen ligiert, um die Selektion von Hefetransformanten
zu ermöglichen. YIp5 und "pBR322-Sc29O3 werden mit EcoRI und' \
Sail gespalten. Das Gemisch wird ligiert und damit die pyri?""--Mutante
B. coli MB1OOO transformiert. Infolge der Komplementation
der pyrF-Mutation durch die ura3-Sequenzen von YIp5
konnten Zellen mit den gewünschten Molekülen identifiziert werden durch den Ampicillin-resistenten, Tetracyclin-sensi- ■
tiven Pyr]?+-Phänotyp.
Mit dem so entstandenen Plasmid YIp5-Se29O3 wird ein ura3~-
Stamm (SX1-2o«ura3 trp1 gal10 gal2) transformiert und Ura+-
Zeilen, werden selektioniert. Dieses Plasmid integriert durch
Rekombination zwischen den Sc29O3-DNA-Sequenzen des Plasmids· '
und den homologen DNA-Sequenzen auf dem Chromosom XV. Es wurde nicht beobachtet, daß der Vektor allein, ohne inserierte·
DEA, irgendeinen Stamm mit ura3-52 zu Ura+ transformierte
(weniger als 1 % der Häufigkeit, die mit einem etwas größe- ·
ren his3-Fragment bei Transformationen zum Phänotyp His erhalten
wurden). Die integrierte Struktur wird nachgewiesen durch Hybridisierung an elektrophoretisch aufgetrennte,
EcoRI-gespaltene G-esamt-DNA von Hefe nach der Methode von ·
Southern (siehe oben).
Von Stannduplilcationen. ähnlich der, welche in diesen Transformanten
vorliegt, wurde gezeigt, daß sie instabil sind (K. Struhl et al., siehe .oben) und daß sie Zellen segregieren,
denen die Vektorsequenzen und eine Kopie der Duplikation fehlt.
L · -J
In diesem Pall "befindet sich der selektion!erbare Marker,
nämlich, das ura3-Gen außerhalb der homologen Sequenzen und
segregiert zusammen mit den Vektorsequenzen. Daher fehlen Ura~-Segreganten die .VektorSequenzen. Selektion auf Ura+
■5 wird für 10 Generationen durch Wachstum in Volimedium (YPD)
ausgesetzt. Neunhundert Kolonien dieser Kultur werden auf den Phänotyp üra™ geprüft. Sieben solche Isolate konnten ge-'
funden v/erden. Jedes wird auf die Anwesenheit-von Vektorsequenzen
und auf die DNA-Struktur der his-3-Region unter-
' sucht, ' , . ·
Alle DNA-Proben werden mit BamHI gespalten, in einem 1 % Agarose, Tris-acetat-EDTA-Gel mit 0,6 Volt./cm 36 Stunden
lang miteinander elektrophoretisiert, auf Nitrocellulose '
übertragen, hybridisiert mit pBR322-Se2676-DNA (dem his3
.BamHI-Fragment), die durch nick-Translation markiert worden
war, und bei -7O0C wird Cornex 4-J1Um in Gegenwart einer
. DuPont lightning Plus Verstärkerfolie für einige Stunden belichtet'.
Das Hybridisierungsmuster zeigt eine der Ura+-
Transformanten, welche die erwartete Zusammensetzung von
,transformierender DNA (8100 Basenpaare), der his3-Deletion
(1600 Basenpaare) und der ¥ildtyp-his5-DNA (1750 lasenpaare)
enthält. Ein Ura~-Isolat zeigt weder die Vektorsequenz noch
die Wildtyp-his3-Sequenzen, enthält jedoch die in der trans-■
25 formierenden DNA vorhandenen hisS-Deletions-Sequenzen. Alle
sieben Ura~-Isolate hatten sämtliche VektorSequenzen verloren
und bei dreien ist gefunden worden, daß sie eine De- . • letion beim his3-Iiocus tragen.
Erwartungsgemäß waren diese drei Stämme His" und revertierten
nicht nachweislich für diesen Marker (weniger als 10 ). ■Stämme mit der his3-Deletion sind stabil und können in ähn-"
licher Weise wie jede auf herkömmliche Weise erhaltene his-3-Mutation verwendet werden. Da diese Stamme auch ura3~
sind und keine Vektor-DNA-Sequenzen enthalten, können sie zwecks weiterer Veränderungen erneut transformiert werden.
L . · J
Als -weiterer Test des zugrundeliegenden Verfahrens werden
Galactose-induzierbare Sequenzen in den Bereich der his3-Deletion auf Chromosom XV eingeführt. Es wird ein Hybrid-DHA-Molekül
Tip5--Sc2911 konstruiert, welches ein 2550 Basenpaare
langes HindiII-Fragment enthält, das homolog zu
Galactose-induzierbarer RHA ist (St, John und R.W.' Davis, Gell, Bd. 16 (1979), S. 445-452). Die Konstruktion erfolgte
durch Insertion dieses Fragmentes in.die einzige Hindlll-Schnittstelle
von YIp5-Sc29O3. Mit dieser DHA wird Sx2-2■ transformiert. Sx1-2 wird mit D13-1A (Genotyp: a trp1 his3-532
gal2) gekreuzt, um einen Stamm mit ähnlicher Trans-'
formationseffizienz und entgegengesetztem "mating type" (Geschlecht) zu erhalten. Dieser Stamm ist Sz2-2 (Genotyp:
a ura3. trp1 gal~).Es wird ein Isolaf identifiziert, bei dem die transformierte DHA nahe his3 integriert ist. Mit der
vorliegenden Hybrid-DHA konnte Integration in jeden von
• vier Hefe-DHA-Abschnitten erfolgen, die in der transformierenden DHA enthalten sind.
10 Generationen Wachstum in nicht selektivem Medium genügen,
•um Ura~-Segreganten zu erhalten. Erwartungsgemäß werden His"~-
und His+-Klone gefunden. Die His*"-Isolate enthalten die gal- ·"
Sequenzen in Chromosom 15 inseriert, wobei .ein kleines Stück
des his3-Gens ersetzt wird.
Mit dem oben beschriebenen "Elektrophoreseverfahren werden die DHA-Strukturen der Stämme untersucht, bei denen gal-Sequenzeri
in die his3-Stellen inseriert waren. Von den fünf, untersuchten Stämmen enthielt eine His~-Segregante weder
die Vektörsequenzen (8100 Basenpaare)'noch die Wildtyp-his3-
Sequenzen (1750 Basenpaare), sie enthielt jedoch die his3-•
Deletion und die inserierten gal-Sequenzen (4200 Basenpaare).
Ein Fragment von 1400 Basenpaaren mit ars1 wird aus Frag- ■
menten chromosomaler DHA von der Hefe Saccharomyces cerevisiae.isoliert, die durch Restriktionsnuklease .erhalten
L J
'' '"''"' ■ 313-1Q34"!
werden. Die Fragmente werden in igt-jbi-DNA dadurch inseriert,
finQ. flic I)HA, fiQ0"BakbQriophaßeT7 mit dor Routriktionsnukleaae
KcoRI gespalten wird und die Hefe-, wie die X-DHA-Segmente
mittels E. coli-DNA-Ligase kovalent verbunden werden.-
' Die so entstandene Kollektion hybrider Phagen wird auf Platten
in einem Rasen eines tryptophanbedürftigen Stammes (E.. coli "3110 trpG983O) vermehrt. Die Bakterien werden in M9-'
Medium + 0,2 % Maltose vermehrt. (M9 - Angaben pro Liter: 6 g'Na2HPO4-, 3.g KH2PO4, 1 g NH4Gl, 0,5 g HaCl mit ah- ·
schließender Zugabe von 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2 %
Glucose oder Maltose). Nach Sedimentation (8000 Upm, 5 Minu- · ten) werden die Zellen in soviel 10 mM MgSO, suspendiert,
.daß- etwa 10 Zellen/ml erhalten werden. Die 2.gt-3j3-Hefe-Hybride
(2 X,1O6) werden an 2 χ 109 E. coli ¥3110 trpC9830
. 15 Minuten bei. 370C- adsorbiert und nach Zugabe von 2,5 ml
-M9-Weichagar (0,6 %) plattiert. (M9-Weichagar: Agar in Wasser
autoklavieren und auf 5O0C abkühlen. Für 1 Liter werden
• 100 ml 10 x M9-Salze, 0,1 ml 1M CaCl2, 1 ml 1M MgSO4,
.10 ml 20 % Glucose ναιά. für nichtselektive Aminosäurebedürfnisse
10 ml einer 4 mg/ml-Lösung von jeder Aminosäure zugegeben).
Die Phagen werden 6 bis 40 Stunden lang bei 37°C
bebrütet.. Plaques können nur dann entstehen, wenn der hybride X-Phage die bakterielle Mutation komplementieren
kann. Es zeigte sich, daß ÜL-Hybride mit Hefe-DKA-Pragmenten
die trpC9830-Mutation komplementieren können. Die Hybride
werden mit der Endonuklease EcoRI. behandelt und in einem
Agarosegel (0,7 %) elektrophoretisiert; siehe M. Thomas und
R.W. Davis, J. Mol. Biol., Bd. 91 (1974), S. 315. Eine ge-3Q
meinsame Bande von I4OO Basenpaaren war in allen komplemen- :
tierenden Phagen vorhanden. Das 1400-Basenpaar-Fragment wird
isoliert, und es kann gezeigt werden, daß es mit hoher Ausbeute zu transformieren vermag, was die Anwesenheit des arsT-Gens
beweist. . . ■
- ' ' ■··
Das HOO-Basenpaar-Fragment (Sc410i) wird weiter gespalten
2€Γ
wie im folgenden "beschrieben. Pur die "beiden He strikt ionsnukleasen
Pstl und Hindlll gibt es jeweils nur eine Spalt-*
.stelle in Sc41O1 und im "bakteriellen Vektor. Die Enzymbehandlüng
von YRp7 und· YRp7' (pBR322, "bei dem Sc41O1 in beiden ·
möglichen. Orientierungen inseriert ist) mit anschließender Ringbildung und Ligierung führt zum Verlust eines .Teils der
Hefe-Sequenzen, wodurch.Yp411 und Yp413 (durch Pstl-Spaltung)
und Yp412 und Yp424 (durch Hindlll-Spaltung) entstehen. Fragmente
mit den ura3-.oder his3-Sequenzen werden dann in jede
der vier Deletionen mit Hilfe der gleichen Restriktionsnuklea sen inseriert,und es zeigte sich, daß Yp413/HIS3+ und Yp412/
URA3+ in der Lage sind, his3""- bzw. ura3""-Hefestämme zu trans
formieren. Die ars1-Sequenz liegt daher in den 850 Basenpäaren
zwischen den EcoRI- und Hindlll-Spaltstellen und der Ver-Ί5lust
der 200 Basenpaare zwischen der· Hindlll- und der Pstl— Stelle führt zu einer ars·"!--Mutation.
. Gemäß der Erfindung können Eukaryoten so transformiert werden, daß eine erhöhte genetische Leistungsfähigkeit eines
zelleigenen G-ens erreicht wird: Entweder können sie mutiert
werden^ um die Expression eines endogenen Gens' durch homologe
Rekombination mit einem Allel zu hemmen; oder sie'werden
mit neuen oder fremden genetischen !Fähigkeiten ausgestattet.
Eine oder mehrere der oben erwähnten Veränderungen können entweder dadurch erreicht werden, daß die eukaryotische
Zelle mit einer autonom replizierenden Hybrid-IMA ausgestattet wird oder dadurch, daß für die Integration von
einem oder mehreren Genen aus der Hybrid-DBA in das Chromosom des Eukaryoten gesorgt·wird.
. .
Die Verwendung des autonom replizierenden Segments bringt ' viele.Vorteile mit sich. Erstens kann hohe Transformationsausbeute durch ■ Hybrid-DHAs mit ars-Genen erreicht werden.
Zweitens können fremde DNA-Sequenzen, wie sie bei der Verwendung
viraler Sequenzen als Vektor die Folge sind, vermieden werden, da das ars von dem Wirt oder einem anderen
L · . J
-pc- - '
Eukaryoten erhalten v/erden kann, der mit dem Wirt kompatibel
ist. ■ . - '
Es -war überraschend festzustellen, daß Chromosomen von .
Eukaryoten in.Segmente zerlegt werden und Sequenzen erhalten werden können, die sich wirksam in einem Eukaryoten autonom
replizieren können, und die verschieden von den Wirtschromosomen
sind. Es war bislang unbekannt, daß andere Eukaryoten als Hefe ein ars-G-en zur Verfügung stellen können, welches
-10 die · Replikation des ars-G-ens selbst und anderer damit verbundener DNA-Segmente ermöglichen würde. Sogar bei dem Hefesegment
war jedoch -das ars mit einem Strukturgen trp1 verknüpft. Außerdem wurde auch festgestellt,.daß die Replikationssignale
in anderen Eukaryoten ausreichende Ähnli'chkeiten mit den-Replikationssignalen von S. cerevisiae aufweisen,
um die Replikation hybrider DEA in" Hefe zu erlauben.
Durch Verwendung hybrider DUA, welche das ars-G-en enthält,
kann eine stark erhöhte Integrationshäufigkeit von G-enen erreicht werden. Da die hybride DMA in. den sich vermehren-•
.den Zellen'für eine.Anzahl von G-enerationen erhalten
bleibt, wird die Integrationswahrscheinlichkeit stark erhöht. Die gemeinsame Anwendung beider Techniken - Verwendung
des .ars-G-ens zusammen mit einem .veränderten G-en, wel- ·
ches homologe Sequenzen für die Integration aufweist steht somit eine verbesserte Methode zur'Integration von
DNA-Segmenten in ein Eukaryotenchromoso.m zur Verfügung, wobei ein stabiler Mutantenstamm entsteht. Auch wenn keine
Rekombination erfolgt, kann die Hybrid-DMA unter selektiven "30 Bedingungen durch das ars-G-en dauerhaft beibehalten werden..
L . ■ · ■■ J
Claims (1)
1. Eine DNA-Sequenz' von mindestens 10 Basenpaaren, die ein
autonom replizierendes Segment (ars) eines Eukaryoten beinhaltet, mit der Maßgabe, wenn dieser ISukaxyot Hofe ist, daß ·
ars nicht mehr als ein etwa 1000 Basenpaare langes Segment ist und frei ist von funktioneilen Strukturgenen, die· natürlicherweise mit·ars verbunden sind.
2. DUA-Sequenz nach Anspruoh 1, wobei der Eukaryot ein
Yertebrat ist,
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei der Eukaryot-ein
■ Uicht-Yertebrat ist.
·
4. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei der Eukaryot eine
Pflanze ist.
5. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei der Eukaryot ein ■
anderes Lebewesen als Hefe ist.
Ein autonom replizierendes Segment (ars) von einem ande~ren
eukaryotischen Wirt als Hefe, erhältlich durch (a) , Fragmentierung mindestens eines.Teils des Chromosoms
des eukaryotischen Wirts, welcher ein ars enthält',
(b)· Verknüpfung der erhaltenen ersten Gruppe von DNA-Segmenten
mit einer zweiten Gruppe,.von DNA-Segmenten, welche ein Gen tragen, das in der Lage ist, eine phänotypische
Eigenschaft in Hefe auszuprägen, (c) Transformation von Hefezellen mit den erhaltenen Hybrid-DNAs,
Vermehrung der erhaltenen Hefe-Transformän-
β * * ■
r "-!ayi" " ' 313103A"1
■■';-. ζ ■ ■ ■
ten unter Bedingungen, die selektiv sind für den Phäno-■typ»
(d) Isolierung von Hybrid-DNA- aus der erhaltenen Iransformantenlcultur
sowie
.5 (e) Spaltung der erhaltenen Hybrid-DNAs zur G-ewinnung von
ars'enthaltenden DNA-Fragmenten.
• ·7. Ein ars nach Anspruch 6, wobei die Fragmentierung unter
Bedingungen geschieht, daß ars-haltige DBA-Fragment e erzeugt'
werden, die im wesentlichen frei sind von natürlicher- ' weise vorhandenen funktioneilen Strukturgenen.
8. Eine eukaryotische Zelle, welche Hybrid-DNA mit einem
dieser eukaryotischen Zelle eigenen ars enthält, mit der Maßgäbe,
wenn diese eukaryotische Zelle eine Hefezelle ist, daß ' das ars mit anderen Genen verknüpft ist als. mit Strukturgenen,
die natürlicherweise mit diesem ars in vivo verbun-. den sind, ohne daß ein funktionelles, natürlicherweise verknüpftes
Strukturgen "beeinflußt wird.
9. Eine eukaryotische Zelle nach Anspruch 8, wobei die
Hybrid-DNA ein Gen enthält, welches eine, phänotypische
25. Eigenschaft in. dieser Zelle auszuprägen vermag und dieses
Gen von einem ¥irt .stammt, der mit der Zelle natürlicherweise keine genetische Information austauscht.
10. Verfahren zur Erzeugung einer phänotypischen Eigenschaft
in einem eukaryo'tischen Wirt, gekennzeichnet durch folgende Schritte: .,,\.
(a) Trans formation vo^.-,^ellen dieses eukaryotischen Wirts
mit Hybrid-DNÄ,· welche ein eukaryotisehes ars-Gen sowie
ein Gen enthält, daß .zur Expression in diesem Wirt befähigt ist und die"Jphänotypische Eigenschaft ausprägt,
sowie · --
L . -J
-j&l - ο Io
. ι (b) Vermehrung dieser Zellen unter Bedingungen, in denen die
phänö typische. Eigenschaft ausgeprägt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die phänotypische
' Eigenschaft die Bildung eines Enzyms ist.··
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei dieses Enzym an einem
Biosyntheseweg zur Herstellung eines Stoff Wechselproduktes' be
teiligt ist.
13· Verfahren nach Anspruch 10, wobei die phäno typische Eigenschaft die Bildung eines Proteins ohne Enzymfunktion .
ist. : ■ · ■.■'■..
14. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-DNAm, die zur
autonomen Replikation in einem eukaryotisehen -Wirt befähigt
ist, gekennzeichnet durch folgenden Schritt:
. Verknüpfung eines ars mit komplementären Enden mit einem DITA-•
Segment, welches seinerseits dazu komplementäre Enden aufweist.-' · · -. ·
15. Verfahren nach Anspruch 14» wobei die komplementären .'
• Enden versetzt sind und zusätzlich die komplementären Enden
ligiert werden". ■
. ■ · ·
. ■ · ·
16. Eine Hybrid-DNA, welche ein autonom-replizierendes
Segment (ars) aus einem eukaryotischen Wirt sowie· ein Gen
enthält, das in diesem Wirt ausgeprägt werden kann und aus einer Quelle stammt, welche natürlicherweise nicht mit diesem
Wirt im Austausch genetischer Information steht, mit der Maßgabe, wenn dieser Wirt eine Hefe ist, daß das ars mit
einem anderen Struktürgen als einem natürlicherweise mit .
ars verbundenen verknüpft ist, ohne daß ein funktionsfähiges, natürlicherweise verbundenes Strukturgen beeinflußt
wird.
L- · J
r ■ · ν..— ■..··..· ·„- .:.· 3«] 3 -j ο 3 4 ^
17. Eine Hybrid-ΠΝΆ nach. Anspruch 16, wobei der eukaryotische
Wirt eine Pflanze ist.
18. Eine Hy'brid-DiTA nach Anspruch 17, wobei die Pflanze
Mais ist.
19. Eine Hybrid-DNA nach Anspruch 16, wobei .der eukaryotische Wirt ein Nicht-Vertebrat ist.
20. Eine Hybrid-DRA nach Anspruch 16, wobei der eukaryotische
Wirt eine Vertebrat ist.
21. Eine Hybrid-DETA nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
enthaltend Gen, das eine phänotypische Eigenschaft ausprägt,
15" welche sich zur Selektion eignet. . .
22. Verfahren zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der stabilen Integration eines definierten Gens, das zur Ausprägung
in den Zellen eines eukaryotischen Wirts befähigt ist, in- ein 'Chromosom dieses Wirts, gekennzeichnet durch
folgende Schritte:·
(a) Transformation dieser Zellen mit einer Hybrid-DFA, welche
dieses definierte Gen und eine DSTA-Sequenz enthält,
die - gebunden· an dieses definierte Gen - zur Integra- · tion in das Chromosom befähigt ist,
(b) Vermehrung der Zellen, welche die Hybrid-DÜTA enthalten,
unter' Bedingungen, welche selektiv sind für die Ausprägung des definierten Gens, welches in das Chromosom
■integriert ist, und wobei in der Hybrid-DUA ein ars
enthalten ist.
23, Verfahren nach Anspruch 23, v/obei die Insertionsse-■
. quenz ein transponierbares Element ist..
35. 24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Insertionssequenz
ein transponierbares Element ist·.
L ■· J
sr
1 25. Eukaryotisclie Wirt-szellen-, herstellbar nach.einem der'"
'Ansprüche 22 "bis 24. .' ..
.26. 33ukaryotische Zelle, enthaltend eine durch ärs repli-5
zierfähige Hybrid-ΒΙΤΑ, mit der Maßgabe, wenn die Zelle eine
Hefezelle ist, daß ars mit anderen Genen verknüpft ist als.· mit Sturkturgenen, die natürlicherweise· mit ars in yivo verbunden
sind, ohne daß ein funktionelles, natürlicherweise
verknüpftes Strukturgen beeinflußt wird. 1.0· ■ · . .
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US17554780A | 1980-08-05 | 1980-08-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3131034A1 true DE3131034A1 (de) | 1982-06-16 |
Family
ID=22640660
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19813131034 Withdrawn DE3131034A1 (de) | 1980-08-05 | 1981-08-05 | "autonom replizierendes eukaryotisches dna-segment" |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0045573A3 (de) |
JP (1) | JPS57163395A (de) |
CA (1) | CA1202918A (de) |
DE (1) | DE3131034A1 (de) |
IL (1) | IL63270A0 (de) |
NL (1) | NL8103680A (de) |
SE (1) | SE8104700L (de) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4508823A (en) * | 1980-05-08 | 1985-04-02 | Microlife Technics, Inc. | Gene splicing method and products produced therefrom |
JPS57129691A (en) * | 1980-09-22 | 1982-08-11 | Yunibaashiteii Obu Sazan Karif | Rearranged dna active in nuclear cell and preparation thereof |
IE55817B1 (en) * | 1982-05-19 | 1991-01-30 | Gist Brocades Nv | Cloning system for kluyveromyces species |
GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
NO172595C (no) * | 1983-02-07 | 1993-08-11 | Battelle Memorial Institute | Fremgangsmaate og ekspresjonsplasmid for fremstilling av hemagglutinin under kontroll av drosophila hsp-promoter |
NZ207765A (en) * | 1983-04-15 | 1987-03-06 | Lubrizol Genetics Inc | Plant expression of transferred dna(t-dna)from plasmids associated with agrobacterium sp |
US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
DE3751757T2 (de) * | 1986-07-24 | 1996-11-28 | Daiichi Seiyaku Co | Autonom replizierende DNA Fragmente aus Säugerzellen mit Affinität zu DNA bindenden Proteinen |
US5364761A (en) * | 1986-07-24 | 1994-11-15 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for isolating a DNA encoding an autonomously replicating sequence |
CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
FR2626584B1 (fr) * | 1988-01-28 | 1990-07-13 | Agronomique Inst Nat Rech | Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation |
DK1578771T3 (da) | 2001-10-10 | 2013-06-10 | Novo Nordisk As | Remodellering og glycokonjugering af peptider |
CN105131104B (zh) | 2001-10-10 | 2018-11-16 | 诺和诺德公司 | 肽的重构和糖缀合 |
EP2338333B1 (de) | 2003-04-09 | 2017-09-06 | ratiopharm GmbH | Glycopegylierungsverfahren und durch die Verfahren hergestellte Proteine/Peptide |
EP2380905A1 (de) | 2010-04-19 | 2011-10-26 | Thrombotargets Europe, S.L. | Phospholipidangereicherte Vesikel mit Gewebefaktor mit blutstillenden Aktivitäten sowie Verwendungen davon |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL63035A (en) * | 1980-09-09 | 1985-05-31 | Univ California | Dnas capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote,their preparation and eukaryotic cells comprising them |
JPS57129691A (en) * | 1980-09-22 | 1982-08-11 | Yunibaashiteii Obu Sazan Karif | Rearranged dna active in nuclear cell and preparation thereof |
-
1981
- 1981-07-09 IL IL63270A patent/IL63270A0/xx unknown
- 1981-07-10 EP EP81303155A patent/EP0045573A3/de not_active Withdrawn
- 1981-07-23 CA CA000382368A patent/CA1202918A/en not_active Expired
- 1981-08-04 NL NL8103680A patent/NL8103680A/nl not_active Application Discontinuation
- 1981-08-05 SE SE8104700A patent/SE8104700L/ not_active Application Discontinuation
- 1981-08-05 DE DE19813131034 patent/DE3131034A1/de not_active Withdrawn
- 1981-08-05 JP JP56121992A patent/JPS57163395A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0045573A2 (de) | 1982-02-10 |
IL63270A0 (en) | 1981-10-30 |
NL8103680A (nl) | 1982-03-01 |
SE8104700L (sv) | 1982-02-06 |
JPS57163395A (en) | 1982-10-07 |
EP0045573A3 (de) | 1982-12-01 |
CA1202918A (en) | 1986-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3586858T2 (de) | Transformation von aspergillus niger und dabei zu verwendende plasmide. | |
DE3687734T2 (de) | Stellenspezifische rekombination von dns in hefe. | |
DE3891417C5 (de) | Verfahren zur Veränderung eines L-Threonin produzierenden Mikroorganismus und Verwendung eines so erhaltenen Mikroorganismus zur Herstellung von L-Threonin | |
DE3486216T2 (de) | Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren. | |
DE69922032T2 (de) | Verfahren zur herstellung von insertionsmutanten | |
DE3131034A1 (de) | "autonom replizierendes eukaryotisches dna-segment" | |
DE68924174T2 (de) | Verfahren zur rekombination in vivo von teilweise homologen dns-sequenzen. | |
DE68926892T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Zellen, die stabil integrierte fremde DNS mit hoher Kopiezahl enthalten, durch dieses Verfahren hergestellte Zellen und Verwendung dieser Zellen zur Herstellung von durch diese fremde DNS kodierten Polypeptiden | |
DE3689411T2 (de) | Methode zur erhöten Expression von Polypeptiden in Hefe des Gattung Pichia. | |
DE3888381T2 (de) | Hefevektor. | |
DE69114500T2 (de) | Verfahren zum absuchen einer bibliothek. | |
DE3889021T2 (de) | Verfahren zum Transformieren von Zellen. | |
DE3127361A1 (de) | Herstellung und anwendung von plasmiden mit genen fuer die biosynthese von l-prolin | |
DD208988A5 (de) | Verfahren zum aufbau eines chimaeren plasmids mit einer genkodierung fuer eine thermostabile alpha-amylase | |
DE3789316T2 (de) | Herstellung von human-parathyroidhormon. | |
DE3382607T2 (de) | Plasmide mit konditionalem unkontrolliertem replikationsverhalten. | |
DE10196565B4 (de) | Rekombinantes Human-Parathyroidhormon erzeugender Hefe-Transformant und Verfahren zur Herstellung des Hormons | |
DE60126065T2 (de) | Verfahren zur erzeugung von schnell mutierender hefe | |
EP2205767B1 (de) | Verfahren zur feststellung von frameshift-mutationen in kodierenden nukleinsäuren | |
EP0839211B1 (de) | Verfahren zur herstellung von riboflavin mittels mikroorganismen mit veränderter isocitratlyase-aktivität | |
DE69011183T2 (de) | Hefestämme für die Herstellung von heterologen reifen Proteinen, besonders von Hirudin. | |
DE3320339A1 (de) | Expressionsvektor, verfahren zu seiner herstellung und verwendung des expressionsvektors zur herstellung eines polypeptids | |
DE69535507T2 (de) | Hefe mit geanderter permeabilität | |
DE3534359C1 (de) | Vektoren und deren Verwendung zur Herstellung von cDNA-Genbanken | |
DE3685985T2 (de) | Mutanten von saccharomyces cerevisiae mit stark vermehrter sekretion. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |