DE3889021T2

DE3889021T2 - Verfahren zum Transformieren von Zellen.

Info

Publication number: DE3889021T2
Application number: DE3889021T
Authority: DE
Inventors: Lafonteyne Jean De
Original assignee: Clovis Matton NV; Solvay SA
Current assignee: Clovis Matton NV; Solvay SA
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1988-06-21
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2008-06-22
Also published as: DE3889021D1; EP0299552B1; DK338788D0; ATE104346T1; DK338788A; JPH02461A; US5364779A; NL8701450A; EP0299552A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Transformieren von Zellen und liegt auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik. Die Erbanlagen einer Zelle können künstlich mittels rekombinanter DNA-Techniken durch Einfügung von Fremd-DNA in die zelleigene DNA verändert werden. Diese DNA kann aus anderen Zellen stammen, die mit dem zu transformierenden Organismus in keiner Beziehung stehen müssen.
Ziel dieser Genmanipulation ist es häufig, genetische Eigenschaften aus Zellen mit einem bestimmten erwünschten vererbbaren Merkmal auf Zellen, die nicht über diese gewünschte Anlage verfügen, zu übertragen. Es handelt sich zum Beispiel um die Übertragung einer Resistenz gegen ein gewisses toxisches Produkt, z. B. ein Herbizid, von einer resistenten Pflanzenart auf eine nichtresistente Variante der gleichen Art oder auf eine nichtresistente andere Art innerhalb der gleichen Familie oder sogar auf eine nichtresistente Art einer anderen, mehr oder minder verwandten Familie. Es handelt sich hierbei auch um die Übertragung der Fähigkeit, eine Substanz zu produzieren, die für Arzneimittel oder andere Zwecke nützlich ist, z. B. von Pflanzen, die diese Substanz produzieren, auf Pflanzen, die in anderen Klimaten wachsen und nicht über die Fähigkeit verfügen, die Substanz zu produzieren. Es handelt sich weiterhin um die Transformation tierischer und sogar menschlicher Zelllinien, um sie zur Produktion einer erwünschten Substanz zu verwenden. Genmanipulation bringt häufig große Probleme mit sich, z. B. aufgrund der Unähnlichkeit der Struktur und Organisation von Spender- und Empfängerzelle, insbesondere von deren Genom.
Bei den bis jetzt beschriebenen Verfahren zum Transformieren von Zellen mittels rekombinanter DNA- Techniken wird im allgemeinen folgendermaßen verfahren. Ein für eine bestimmte erwünschte Anlage oder ein bestimmtes Produkt kodierendes Gen (oder eine Gruppe solcher Gene) wird identifiziert und aus einer geeigneten Spenderzelle isoliert. Dieses Gen wird häufig mittels Copy-DNA (cDNA) der hiervon transkribierten Boten-RNA (mRNA) erhalten. Diese DNA wird dann in einem Vektor kloniert, der in einem geeigneten Mikroorganismus vermehrt werden kann. Es ist häufig ein großes Problem, einen Klon mit einer vollständigen Kopie des erwünschten Gens zu erhalten. Hat sich dies als erfolgreich erwiesen, wird das Gen häufig mit geeigneten Regelelementen versehen, die in der Empfängerzelle verwendet werden, wobei sich diese Elemente manchmal stark von den Regelelementen der Donorzelle unterscheiden. Schließlich wird das Gen mit den Regelelementen mittels sogenannter Shuttle-Vektoren oder mittels direkter Transformationsverfahren auf die Empfängerzelle übertragen. Aus der europäischen Patentanmeldung (EP-A-0 163 491) ist ein Vektor mit einem Gen für Resistenz gegen ein Antibiotikum bekannt, das andernfalls eine Hefe- Wirtszelle zu zerstören vermag, wobei das Gen von einer Hefe-Promotorsequenz transkribiert wird und der Vektor in ein Chromosom der Hefe-Wirtszelle integriert werden kann.
Diese bekannten Verfahren zum Transformieren von Zellen sind mit verschiedenen Nachteilen behaftet. Erstens erfordern Isolierung und Bestimmung des zu übertragenen Gens ein beträchtliches Ausmaß an teurer Forschung, die finanziert werden muß, bevor auch nur eine einzige Transformante erhalten wird. Außerdem ist diese Forschung solcher Art, daß hochspezialisierte Laboratorien und hochqualifizierte Arbeitskräfte vonnöten sind, wie sie weltweit nur an einigen Orten zu finden sind.
Zweitens müssen die den Rezeptor betreffenden Regelelemente und -signale äußerst genau untersucht werden. Drittens müssen an den Spender und Rezeptor angepaßte Vektoren und Shuttle-Vektoren konstruiert werden. Für viele Empfängerorganismen wurden bis jetzt noch keine geeigneten Shuttle-Vektoren gefunden bzw. entwickelt.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Verfahren zum Transformieren von Zellen, das nicht die obengenannten Nachteile aufweist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein einfaches, allgemeines, preisgünstiges und dennoch wirksames Verfahren zum Transformieren von Zellen bereitzustellen. Unter Zellen werden im vorliegenden Text jegliche Arten von Zellen verstanden, wie z. B. Zellen pflanzlicher oder tierischer Herkunft, menschlicher Herkunft eingeschlossen, aber auch Mikroorganismen, sowohl prokaryontische Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien, als auch eukaryontische Mikroorganismen, wie z. B. Pilze, Hefen, Algen usw.
Diese Aufgabe läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, das in den anschließenden Paragraphen erläutert werden wird, lösen. Dieses Verfahren besteht darin, daß man ein DNA-Molekül mit einer gewissen Anzahl spezifischer Einheiten, den sogenannten multifunktionellen Linker, verwendet, der ebenfalls ein Bestandteil der Erfindung ist.
Die vorliegende Erfindung besteht weiterhin aus einem Verfahren zur Herstellung der multifunktionellen Linker und deren Bestandteile, die vorher in verschiedenen Kombinationen konstruiert werden können.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Transformieren von Zellen bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man nacheinander:
- hochmolekulare DNA aus einer Spenderzelle isoliert,
- diese DNA mittels einer Endonuklease in Fragmente zerlegt, die mindestens ein vollständiges Gen einschließlich seiner Regelelemente enthalten,
- die erhaltenen Fragmente ringförmig schließt unter Aufnahme eines multifunktionellen Linkers des linearen DNA-Moleküls oder die erhaltenen Fragmente mit einem multifunktionellen Linker des linearen DNA-Moleküls an beiden Enden versieht,
- wobei der multifunktionelle Linker mindestens folgende Elemente enthält:
A) eine DNA-Sequenz, die homolog einem Teil des Rezeptorgenoms ist, um Rekombination zwischen dem Rezeptorgenom und der eingebrachten DNA, die aus dem multifunktionellen Linker und der Spender-DNA besteht, zu ermöglichen,
B) eine Operatorsequenz, die es ermöglicht, DNA, die die Operatorsequenz erhält, wiederzuerkennen und abzutrennen, und
C) eine Sequenz, die Replikation in einem Mikroorganismus gestattet oder eine Sequenz, die integrative Rekombination in einem Vektor ermöglicht, so daß der multifunktionelle Linker mit der daran gekoppelten DNA in einem Wirt multipliziert werden kann,
- die an den multifunktionellen Linker gekoppelten Spender-DNA-Fragmente mittels direkter Transformationsmethoden auf den Rezeptor überträgt, und
- die Rezeptoren auf der Basis der übertragenen Information untersucht.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß Fragmente des Spendergenoms an einen erfindungsgemäßen multifunktionellen Linker gekoppelt werden und direkt auf den Rezeptor übertragen werden. Die Transformation wird mittels Rekombination mit einer Rezeptor-DNA-Sequenz durchgeführt, weil diese Sequenz zu diesem Zweck in den multifunktionellen Linker eingebaut wird. Dementsprechend stehen bereits nach diesem Schritt Transformanten zur Verfügung, aus denen prinzipiell aufgrund der übertragenen Merkmale vorteilhafte Varianten isoliert werden können. Besonders vorteilhaft ist, daß diese Varianten nun direkt verwendet werden können, ohne daß eine genaue Kenntnis der übertragenen DNA-Sequenzen erforderlich ist bzw. ohne daß diese isoliert werden müssen. Die Nutzung dieser Transformanten könnte die finanziellen Mittel zur Durchführung weiterer Forschungsarbeiten zur Verfügung stellen.
Ein nächster Schritt besteht darin, daß man die hochmolekulare DNA aus den transformierten Rezeptorzellen isoliert, diese in Fragmente zerlegt und die die multifunktionellen Linker und die Spender-DNA enthaltenden Fragmente isoliert. Diese Fragmente werden in einem Mikroorganismus kloniert, um eine beschränkte Genbank zu erhalten. Mit diesen Genen werden Rezeptoren transformiert, um die DNA-Sequenzen mit der phenotypischen Expression korrelieren zu können.
In den folgenden Paragraphen sollen das erfindungsgemäße Verfahren und der multifunktionelle Linker sowie dessen Herstellung genauer besprochen werden.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man die hochmolekulare DNA aus der Spenderzelle isoliert. Diese DNA wird dann mittels einer Endonuklease (z. B. eines Restriktionsenzyms) auf solche Art in Fragmente zerlegt, daß Fragmente erhalten werden, die lang genug sind, um ein vollständiges Gen mit seinen Regelelementen zu enthalten. Die entstandenen Fragmente werden nun mittels einer Ligase an den erfindungsgemäßen multifunktionellen Linker gebunden. Bei dem multifunktionellen Linker handelt es sich um ein lineares DNA-Molekül, das zwei verschiedene Formen aufweisen kann: Es kann ein multifunktioneller Linker sein, der die Spender-DNA-Fragmente ringförmig schließen kann oder ein multifunktioneller Linker, der diese Fragmente an beiden Enden mit einer Haarnadelstruktur versehen kann. Dementsprechend ergibt die Ligation ein DNA-Molekül, das die Spender-DNA sowie den multifunktionellen Linker entweder in Form einer linearen Struktur, einer ringförmigen Struktur oder einer linearen Struktur mit Haarnadelenden enthält. Diese Strukturen werden in Fig. 1C, 1D und 1E dargestellt.
Der multifunktionelle Linker enthält mindestens eines der folgenden Elemente:
(A) Eine DNA-Sequenz, die zu einem Teil des Rezeptorgenoms homolog ist, um Rekombination (durch Crossing-over) zwischen dem Rezeptorgenom und der eingebrachten DNA, die aus dem multifunktionellen Linker und der Spender-DNA besteht, zu gestatten. Wie dies noch im Zusammenhang mit der Herstellung des multifunktionellen Linkers beschrieben werden wird, besteht dieser homologe Teil üblicherweise aus mindestens 100 Basenpaaren und stammt aus dem Rezeptorgenom.
(B) Eine Operatorsequenz, mittels der DNA, die die Operatorsequenz enthält, mittels Wechselwirkung mit dem entsprechenden Repressorprotein erkannt und abgetrennt werden kann. Im Prinzip ist hierfür jegliche Operatorsequenz geeignet, sofern das Repressorprotein leicht genug gehandhabt werden kann. Beispiele geeigneter Operatorsequenzen sind der lac-Operator (Lactose), der gal-Operator (Galactose) sowie der trp-Operator (Tryptophan), alle von E. coli.
(C) Eine Sequenz, die Replikation in einem Mikroorganismus erlaubt, vorzugsweise durch integrierende Rekombination in einem Vektor, so daß der multifunktionelle Linker mit der an ihn gekoppelten DNA in einem Wirt multipliziert werden kann. Bei solch einer Sequenz handelt es sich z. B. um die attB-Sequenz, die Integration des bakteriophagen λ in E. coli ermöglicht. Bei der Sequenz attB handelt es sich um: GCTTTTTTATACTAA.
(D) Eine Sequenz, durch die ein Gen in einem Mikroorganismus exprimiert werden kann, um Identifizierung von Transformanten zu ermöglichen, die den multifunktionellen Linker enthalten. Dies kann zum Beispiel dadurch geschehen, daß man (1) ein komplettes Gen mit einem gegebenenfalls kontrollierbaren Promotor einbaut. Eine Expression kann auch durch integrierende Rekombination (2) erreicht werden. Ein gegebenenfalls kontrollierbarer Promotor wird so rechts von der attB-Sequenz so kloniert, daß dieser Promotor ein Gen exprimiert, daß auf dem λ-Vektor links von der attP-Sequenz liegt (Fig. 2). Es wird deutlich, daß die Elemente (B), (C) und (D) in ihrer einfachsten Form sich auf die Struktur attB- Promotor/Operator beschränken können.
Mit dem hier beschriebenen Verfahren kann die auf den Rezeptor übertragene Spender-DNA in einem Mikroorganismus selektiert und multipliziert werden, der keine Rekombinationsfunktionen aufweist, z. B. E. coli recA, wodurch vermieden wird, daß durch diese Rekombinationsfunktionen Deletionen bzw. Änderungen in der Anordnung in der Spender-DNA vorkommen. Ein geeignetes Gen ist das xylE-Gen von Bacillus putida, das - unter der Kontrolle des lac-Operator/Promotors während des Wachstums in der Anwesenheit von Isopropyl-β-D thiogalactosid (IPTG) und Katechin - die Bildung gelber Kolonien bedingt. Beispiele weiterer geeigneter Gene sind das bla-Gen (β-Lactamase), das Resistenz gegenüber Penicillin vermittelt, das aphII-Gen (Kanamycinresistenz) oder das lacZ-Gen (β-Galactosidase).
(E) Eine kurze DNA-Sequenz, die an einem Ende eine geeignete Restriktionssequenz enthält, die mit dem multifunktionellen Linker verbunden werden kann, und am anderen Ende über eine Haarnadelstruktur verfügt, die eine Sequenz verbirgt, die - nur durch Replikation der entfalteten Haarnadelstruktur - ein Substrat für ein bestimmtes Restriktionsenzym oder eine bestimmte Endonuklease bildet.
Das Anfügen von Haarnadelstrukturen an die Enden der Spender-DNA hat den Zweck, daß (1) eine lineare Struktur beibehalten wird, die die Aufnahme durch die Poren der Kernmembran erleichtert, daß (2) die Enden gegen in der Zelle befindliche Exonukleasen geschützt werden, und (3) den Rekombinationsenzymen im Kern die Umwandlung der linearen DNA in ringförmige DNA zu ermöglichen. Es ist einleuchtend, daß hierfür die lineare Spender-DNA den multifunktionellen Linker als direkte Wiederholung an den Enden trägt, wie dies in Fig. 1D dargestellt ist. Spender-DNA-Fragmente, die für eine Replikation im Rezeptor geeigneten, erforderlichen Elemente tragen (Fig. 1E), können im Kern der Rezeptorzelle dimerisiert werden. So werden die Restriktionsstellen, die an der Spitze der Haarnadelstruktur verborgen sind, freigesetzt und können als solche erkannt werden.
Der multifunktionelle Linker enthält vorzugsweise zusätzlich eine das Crossing-over stimulierende Sequenz, eine sogenannte "crossing-over hot-spot instigator"- oder "chi"-Sequenz, wie z. B. die chi-Sequenz von E. coli K12: GCTGGTGG (siehe Smith, G.R. et al., Cell 24, 429-436 (1981)).
Auch Varianten von chi-Sequenzen sind nützlich, obwohl sie gelegentlich eine niedrigere Aktivität aufweisen (Cheng und Smith, J. Mol. Biol. 180, 371-377 (1984)). Es können hier auch chi-Sequenzen anderer Abstammung verwendet werden, z. B. Sequenzen, die vom Menschen stammen (Jeffreys et al., Nature 314, 67-73 (1985)). Schließlich kann man auch eine Sequenz, die in Form von Z-DNA vorliegen kann, einbauen, um die Integration zu fördern.
Weiterhin ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren von Vorteil, wenn der multifunktionelle Linker auch ein Gen enthält, dessen Expression im Rezeptor nachgewiesen werden kann. Obwohl das auf den Rezeptor zu übertragende Merkmal manchmal als solches in dem Schritt verwendet werden kann, in dem die Transformanten untersucht oder selektiert werden, ist es häufig wünschenswert, ein Merkmal mitzuverwenden, das sich direkt für die Untersuchung eignet, insbesondere wenn das zu übertragende Merkmal nicht direkt nachgewiesen werden kann. In diesem Zusammenhang sind bei der Transformation von Zellen Antibiotikaresistenz-Gene geeignet.
Der erfindungsgemäße multifunktionelle Linker weist vorzugsweise die in Fig. 1A oder 1B gezeigte Struktur auf.
Der nächste Schritt beim erfindungsgemäßen Verfahren zum Transformieren von Zellen besteht darin, daß die mit dem multifunktionellen Linker verbundenen Spender-DNA-Moleküle auf die Rezeptorzelle übertragen werden, gegebenenfalls im Anschluß an eine Fraktionierung nach Molekulargewicht. Diese Übertragung kann mittels direkter Transformationsverfahren, wie z. B. Mikroinjektion, Elektroporese oder natürlicher Aufnahme, erfolgen.
Die Rezeptorzellen werden anschließend Wunsch untersucht, und diejenigen Zellen, die an den multifunktionellen Linker gebundene Spender-DNA aufgenommen haben, werden selektiert. Hochmolekulare DNA wird anschließend von diesen Rezeptorzellen isoliert, und diese DNA wird dann mit einer Endonuklease so in Fragmente zerlegt, daß Fragmente erhalten werden, die lang genug sind, um ein vollständiges Gen mit den dazugehörigen Regelelementen und dem multifunktionellen Linker zu enthalten. Um zu verhindern, daß der Linker von der übertragenen DNA abgeschnitten wird, wird vorher sichergestellt, daß die Verbindungsstelle mit dem multifunktionellen Linker keine neue Restriktionsstelle für die Endonuklease bildet, die für die Zerlegung der Spender-DNA in Fragmente verwendet worden war.
Diejenigen Fragmente, die die Operatorsequenz des Linkers enthalten, werden nun aus der Mischung der DNA- Moleküle isoliert. Bei dieser Isolierung wird die hohe Affinität des Repressorproteins zu der entsprechenden Operatorsequenz ausgenutzt. DNA-Fragmente, die Repressorprotein binden, werden nach der Methode von Riggs et al., J. Mol. Biol. 53, 401 (1970) auf Filtern isoliert.
Nach - oder gegebenenfalls vor - der Isolierung werden die DNA-Moleküle mittels einer Ligase ringformig geschlossen.
Um die entstandenen DNA-Moleküle in genügend großer Menge zur Verfügung zu haben, werden diese jeweils getrennt multipliziert. Zu diesem Zweck werden Mikroorganismen mit den betreffenden DNA-Molekülen transformiert. Fragmente, die im multifunktionellen Linker die für Replikation und Selektion benötigten Elemente enthalten, können als solche ein Mikroorganismus multipliziert werden. Fragmente, die im multifunktionellen Linker die Sequenz attB-Promotor-Ooerator aufweisen, können nach Transformation und in-vivo-Integration in einen geeigneten λ-Vektor, z. B. λNM540 xylE, multipliziert und selektiert werden. Enthält der multifunktionelle Linker z. B. die attB-Sequenz, die Integrierung in den Bakteriophagen λ ermöglicht, so können die DNA- Sequenzen, die den multifunktionellen Linker enthalten und vom Rezeptor isoliert sind, in das Genom eines Bakterienstammes integriert werden, der einen lysogenen Phagen λ enthält, wie z. B. E. coli MC 1061 (λNM450 XylE). Nach Induktion des Phagen und Ausplattieren kann mittels Plaques, die Expression des auf dem multifunktionellen Linker anwesenden Gens aufweisen, untersucht werden, wobei das Vorhandensein des Gens in den Mikroorganismen leicht nachgewiesen werden kann. Das Vorhandensein z. B. des xylE-Gens kann leicht durch die Bildung gelber Plaques erkannt werden, wenn man in der Gegenwart von IPTG kultiviert und die Platten mit Katechin besprüht. Die positiven Plaques werden isoliert und einmal durch Impfen und Isolierung von Plaques gereinigt. Kultivierung bei niedrigen Temperaturen ergibt eine Reihe lysogener Stämme, die Klone in λ des multifunktionellen Linkers und auf den Rezeptor übertragene Spendersequenzen darstellen. Auf diese Weise steht eine beschränkte Gen-Bank der auf den Rezeptor übertragenen Spender-DNA zur Verfügung.
Durch erneute Transformation eines Rezeptors mit der DNA eines Klons mittels direkter Transformationsmethoden und Untersuchens anhand von Transformanten können die auf die verschiedenen Klone übertragenen Spender-DNA-Sequenzen mit der phenotypischen Expression im Rezeptor korreliert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es daher, Gene von einem Spender auf einen Rezeptor zu übertragen, ohne vorher genaue und umfangreiche Untersuchungen über die Korrelation zwischen spezifischen Genen und einem phenotypischen Merkmal anstellen zu müssen. Sobald geeignete Transformanten erhalten worden sind, können diese direkt verwendet werden. Der so entstandene finanzielle Gewinn kann in einem nächsten Schritt in weitere Forschungsarbeiten investiert werden, um die Transformanten, insbesondere die übertragenen Gene, genauer zu bestimmen. Hier ist es besonders von Vorteil, daß die ersten Transformanten noch die multifunktionelle Linker-Sequenz enthalten, so daß die übertragene DNA im Rezeptorgenom erkannt und hiervon wiederum durch die Wechselwirkung zwischen der auf dem multifunktionellen Linker vorhandenen Operatorsequenz und dem dazugehörigen Repressorprotein isoliert werden kann.
Nachdem die auf den Rezeptor übertragenen Gene erhalten und bestimmt wurden, kann gegebenenfalls ein Teil der multifunktionellen Linker-Sequenz vom Rezeptorgenom entfernt werden. Dies kann deshalb wünschenswert sein, da einige Elemente des Linkers nach der Transformation überflüssig sind, und es im allgemeinen vorzuziehen ist, überflüssige Veränderungen im Rezeptorgenom zu vermeiden, insbesondere da dies meistens artfremde DNA betreffen wird. Im letztgenannten Fall verwendet man eine kurze Version des multifunktionellen Linkers. Der Teil des multifunktionellen Linkers, der einem Teil des Rezeptorgenoms homolog ist, soll jedoch üblicherweise erhalten bleiben, so daß man, wieder mittels Rekombination, die DNA in das Rezeptorgenom einbringen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich vielseitig anwenden. Die Praxis wird die Grenze der Zusammenhänge aufweisen, in denen das Verfahren noch erfolgreich angewandt werden kann. Die Übertragung von genetischem Material wird zweifelsohne leichter gelingen, da der Zusammenhang zwischen Rezeptor und Spender enger ist. Das Verfahren kann so erfolgreich zum Übertragen spezifischer Merkmale von einer Art auf eine andere Varietät der gleichen Art oder auf eine andere Art der gleichen Familie oder sogar auf eine Art einer anderen Familie verwendet werden.
Wie aus dem experimentellen Teil ersichtlich sein wird, hat sich das Verfahren bereits als erfolgreich bei der Transformation monocotyler Pflanzen mit DNA aus anderen monocotylen Pflanzen erwiesen.
Der multifunktionelle Linker, der ein wesentlicher Teil der Erfindung ist, kann je nach der spezifischen Struktur des Linkers auf verschiedene Weise hergestellt werden. Angesichts der Größe des Linkers, die sich im allgemeinen in der Größenordnung von ungefähr 3600 Basenpaaren bewegt, scheint es uninteressant zu sein, die gesamte Sequenz synthetisch herzustellen. Die Synthese von DNA-Sequenzen macht jedoch solchen rapiden Fortschritt, daß es binnen kurzer Zeit möglich sein kann, solche Sequenzen routinemäßig vollständig synthetisch herzustellen. Teile der Sequenzen können jedoch auf alle Fälle synthetisch hergestellt werden. Angesichts der vielen Möglichkeiten für die Herstellung des erfindungsgemäßen multifunktionellen Linkers und aller seiner Varianten ist es nicht möglich, ein allgemeines Protokoll zu liefern. Meistens werden jedoch Fachleute der DNA-Rekombinationstechnik wissen, wie ein spezifischer multifunktioneller Linker hergestellt wird. Der multifunktionelle Linker und Teile davon können produziert und in Form eines Kits verkauft werden. Zu Erläuterung soll die Herstellung des erfindungsgemäßen multifunktionellen Linkers mit der in Fig. 1 dargestellten Sequenz im folgenden beschrieben werden.

Beispiel I

Herstellung eines multifunktionellen Linkers

A. nach Fig. 1A.

Ein erfindungsgemäßer multifunktioneller Linker mit der in Fig. 1A dargestellten Struktur wird hergestellt. Es wird zum Beispiel angenommen, daß der Linker dazu verwendet werden wird, DNA einer Gerstensorte mit der DNA einer Weizensorte zu transformieren.
Der Linker verfügt über eine Länge von ungefähr 3600 Basenpaaren und enthält die folgenden Elemente:
1. Die Sequenz attB von Escherichia coli K12:
Diese Sequenz genügt, um den Bakteriophagen Lambda zu integrieren, (H.A. Nash, Ann.Rev. Genetics 15, 143-167, 1981).
attB im multifunktionellen Linker dient dazu, den Linker gemeinsam mit der daran kovalent gebundenen genetischen Information, in den Bakteriophagen Lambda zu integrieren. Die vollständige Sequenz lautet:
Diese Sequenz wird in einem DNA-Synthesizer, Modell Applied Biosystems 380 A, chemisch synthetisiert.
Die Sequenz-PstI - attB - BglII - EcoRI wird in Plasmid pBR322 kloniert, das mit PstI und EcoRI geschnitten und zu E. coli HB 101 transformiert wird. Die Integration von pBR322 in dem Bakteriophagen Lambda b506 cI857 (R.W. Davis & J.S. Parkinson 1971. J. Mol. Biol. 56, 403-423) wird durch die Übertragung der Tetrazyklinresistenz in dem E. coli-Stamm C 600 bestätigt, der durch den Phagen Lamda lysogen gemacht wurde. pBR322 (attB) ist das Ausgangsmaterial für die attB-Sequenz mit PstI und BqlII-Enden.
Die Sequenz PstI-attB-BglII wird in das Plasmid pUC8 kloniert, das mit BamHI und PstI geschnitten wird. Die Struktur des Klons und die attB-Funktion wird durch Integration des Ampicillinresistenz-Markers von pUC8 in den Phagen λ cI.857 bestätigt, der anschließend E. coli JM109 lysogen und ampicillinresistent bei 30ºC machen kann. Plasmid pUC8 (attB) ist das Ausgangsmaterial für die Sequenz attB p op lac mit den HaeII und PstI-Enden.
2. Für weiteres Klonieren wird Plasmid Pi AN7 herangezogen, dessen supF-Gen durch das u-Gen von pUC19 ersetzt wird. Zu diesem Zweck werden Pi AN7 mit XmnI und HaeII sowie pUC19 mit AatII und HaeII geschnitten, die Fragmente werden mittels Mungbohnen-Nuklease mit stumpfen Enden versehen und durch Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Das 240-bp-Fragment piAN7 wird mit dem 1560-bp- Fragment pUC19 ligiert und bildet Pi Amp 71, in dem die EcoRI-Stelle des MCS von Pi AN7 restoriert ist und die HaeII-Stelle verschwunden ist. Von den zwei möglichen Orientierungen wird diejenige, die die Replikationssequenz von Col E1 restoriert, behalten. Die Klonierstelle (MCS) von Pi Amp 71 (MCS) lautet folgendermaßen:
EcoRI-XmaI-BamHI-AccI-PstI-BglII-XbaI-HindIII (ori). Der Crossing-over-hot-spot instigator (Chi) von E. coli (G.R. Smith et al. 1981, Cell 24 : 429-436) mit der Sequenz: GCTGGTGG wird mittels eines DNA-Synthezisers, Modell Applied Biosystems 380A, chemisch synthetisiert. Die vollständige synthetisierte Sequenz lautet folgendermaßen: CTCTAGAGATCTGCTGGTGGCGCTCTAGAGC (XbaI- BglII-Chi-HaeII-XbaI). Diese Sequenz, die mit xbaI geschnitten wird, wird in die xbaI-Stelle von Pi Amp71 kloniert. Von den zwei möglichen Orientierungen wird diejenige behalten, die nach Schneiden mit BglII und Neuligierung die HaeII-Stelle verliert. Das erhaltene Plasmid wird ab nun als Pi Amp71 C bezeichnet und verfügt über die folgende Struktur:
(amp) EcoRI-XmaI-BamHI-AccI-PstI-BqIII-XbaI-HaeII-Chi BalII-XbaI-HindIII (ori).
3. Nach Schneiden mit PstI und HaeII wird hierin die PstI-attB-p op lac HaeII-Sequenz kloniert. Auf diese Weise wird ein Plasmid Pi Amp71 ALC erhalten, das über die folgende Struktur verfügt: (amp) EcoRI-XmaI-BamHI- AccI-PstI-attB-p op lac-HaeII-Chi-BqIII-XbaI-HindIII (ori).
4. Pi Amp71 ALC ist allgemein dazu geeignet, Gene, die im Rezeptor selektiert werden können und über eine vom Rezeptor abstammende Sequenz verfügen, zu integrieren. Das hier gewählte Beispiel ist zur Transformation von Gerste mit Weizen-DNA geeignet.
Das Chloramphenicolacetyltransferase-Gen mit den Regelelementen des Nopalinsynthasegens vom Agrobacterium tumefaciens Stamm C58 (M. De Block et al. EMBO J 3 (1984) 1681-1689) wird als ClaI-Fragment in die AccI-Stelle von Pi Amp71 ALC kloniert. Auf diese Weise wird ein Plasmid Pi Amp71 CATALC erhalten, das über die folgende Struktur verfügt:
(amp) EcoRI-XmaI-BamHI-pnos-cat-3'nos-PstI-attB-p op lac- HaeII-Chi-BglII-XbaI-HindIII (ori).
5. Bei der DNA-Sequenz, die zu einem Teil der Gersten- Rezeptor-DNA homolog ist, handelt es sich um eine sogenannte repetitive Sequenz. Gerstenkeim-DNA wird mittels Ultraschall (Ultraschallbehandlung) in Fragmente mit einer Länge von ungefähr 1000 bp zerlegt. Nach Denaturierung und Renaturierung werden diejenigen Fragmente, die über einen Cot ½-Wert von 10E2 verfügen, nach Behandlung mit S1-Nuklease auf Hydroxyapatit als doppelsträngige DNA isoliert. Diese Fragmente werden an den Enden mit Oligo-dC mittels terminaler Transferase verlängert und in-die- PstI-Stelle von pUC19 kloniert, dessen Enden mit Oligo-dG mittels terminaler Transferase verlängert werden. Von den klonierten Fragmenten wird eines mit einer Länge von ungefähr 1000 bp selektiert, das mit ungefähr 1% der anderen Klone hybridisiert und über keine internen Restriktionsstellen für PstI, BamHI oder BglII verfügt. Dieses pUC19-Plasmid dient weiterhin als Quelle für Rezeptoren-Repetitiv-DNA mit PstI-Enden. Es muß festgehalten werden, daß durch die Footprint-Technik überprüft werden kann, ob die klonierten Fragmente in DNA vorkommen, die in einem bestimmten Gewebe (z. B. Mesophyll) exprimiert werden. Hierunter versteht man das Verschwinden von DNA-Sequenzen, die nach Behandlung mit DNAase exprimiert werden, aus Chromatin.
Die repetitive Sequenz wird nun als PstI-Fragment in die PstI-Stelle von Pi Amp71 CATALC integriert. Zwei Orientierungen sind möglich, und beide werden behalten und in Transformationsversuchen verwendet. Dieses Endplasmid enthält einen vollständigen erfindungsgemaßen multifunktionellen Linker mit BamHI- und BglII-Enden.
Dieses Plasmid wird ab jetzt als Pi Amp71 CATRALC bezeichnet. Nach Schneiden aus dem Vektor kann dieser Linker dazu verwendet werden, Spender-DNA-Fragmente mit mit Phosphatase behandelten GATC-Enden ringförmig zu schließen.
6. Die für die Konstruktion linearer Spender- DNA mit multifunktionellen Linkern an den Enden verwendete Haarnadelstruktur verfügt über die folgende Sequenz:
Diese Sequenz wird in einen DNA-Synthesizer, Modell Applied Biosystems 380A, chemisch synthetisiert und in die BamHI-Stelle von pUC 19 kloniert. Das so erhaltene pUC 19H dient als Ausgangsmaterial für die Haarnadelsequenz, indem das kleinste PvuII-Fragment mit Sau3A geschnitten wird.
Die Haarnadelstruktur wird durch Denaturierung und rasche Renaturierung des so erhaltenen Fragmente gebildet und kann sowohl mit dem BamHI- und dem BglII- Ende des multifunktionellen Linkers sowie mit den GATC- Enden der Spender-DNA ligiert werden. Es bilden sich zwei Haarnadelstrukturen, die sich lediglich bezüglich der Basen am oberen Ende unterscheiden: AGG bzw. CCT.
Gegebenenfalls nach Replikation der entfalteten Haarnadelstruktur werden eine AvrII- und eine SfiI- Restriktionssequenz gebildet. Der Unterschied zwischen den beiden Strukturen besteht in der genauen Lokalisierung der AvrII-Stelle, die bei der einen Struktur bezüglich der anderen um drei Nucleotide verschoben ist. Multifunktionelle Linker mit Haarnadelenden werden folgendermaßen hergestellt:
1) rechts vom multifunktionellen Linker.
Pi Amp71 CATRALC wird mit BglII geschnitten und mit dem BclI-Ende der Haarnadelsequenz ligiert. Nach Transformation des Stamms HB101 wird durch Replikation ein kreisförmiges Dimeres gebildet, das nach Isolierung und Schneiden mit BamHI die Haarnadelsequenz zwischen zwei MFL bildet. Denaturierung und rasche Renaturierung bei niedriger Konzentration (1 ug/ml) ergibt die gewünschte Struktur mit BamHI-Enden.
2) links vom multifunktionellen Linker.
Die Haarnadelstruktur links vom MFL wird auf ähnliche Weise dadurch gebildet, daß man Pi Amp71 CATRALC mit BamHI schneidet und anschließend mit den Haarnadelsequenzen ligiert, sowie das in HB101 erhaltene Dimere mit BalII schneidet.
Beide multifunktionellen Linker mit Haarnadelenden werden nun in gleichen Mengen vermischt und mit Spender-DNA-Fragmenten mit GATC-Enden ligiert. Es wird deutlich, daß ein bestimmtes Fragment in vier verschiedenen Formen auftreten kann: invertierte Sequenzwiederholung direkte Sequenzwiederholung
Ungefähr 50% der erhaltenen Moleküle weisen den multifunktionellen Linker als direkte Sequenzwiederholung an den Enden auf, während die anderen Moleküle den Linker als invertierte Sequenzwiederholung aufweisen.
Durch Rekombination kann die erste Variante ringförmig geschlossene Moleküle bilden, die nur eine Kopie des multifunktionellen Linkers enthalten. Die letztere Variante kann nur dann ringförmig geschlossene Moleküle bilden, wenn sie die nötigen Elemente, die Replikation im Rezeptor ermöglichen, enthalten.
B. Nach Fig. 1B.
Der für Multiplikation und Selektion in einem Mikroorganismus geeignete Vektor für die Herstellung des multifunktionellen Linkers wird folgendermaßen hergestellt.
1. Das Plasmid pUC19 wird mit AatII geschnitten und mittels Mungbohnennuklease mit stumpfen Enden versehen. Dann wird es nochmals mit EcoRI geschnitten und mittels T4 DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Durch Ligation des langen Fragments (396- 2617) wird ein puC191 erhalten, bei dem das lacZ-Gen verschwunden ist und die EcoRI-Stelle des MCS restoriert worden ist.
2. Die XbaI-BglII-Chi-HaeII-XbaI-Sequenz wird mit xbaI aus Pi Amp71C herausgeschnitten und in pUC191 kloniert, das von nun an als pUC191COOL bezeichnet wird.
3. Das ClaI-Fragment mit dem Chloramphenicolacetyltransferase-Gen mit den Regelelementen des Nopalinsynthase-Gens vom Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58 wird in die AccI-Stelle von pUC191COOL kloniert.
Dies ergibt das Plasmid pUC191COOLCAT.
4. Die Rezeptor-Sequenzwiederholung wird aus dem Vektor pUC19 mit PstI herausgeschnitten und in die PstI- Stelle von pUC191COOLCAT kloniert. Dieses letztgenannte Plasmid wird von nun an als pUC191COOLCATR bezeichnet und ist als solches eine ringgeschlossene Form des multifunktionellen Linkers nach Fig. 1B.
5. Die Haarnadelstrukturen werden wie für Pi Amp71 CATRALC beschrieben angefügt.

Beispiel II

Übertragung von Weizengenen auf Gerste

Als Spender wird eine Weizensorte mit gutem Backvermögen (Triticum aestivum Cultivar Rektor) verwendet. Die DNA wird aus Chromatin von Embryos isoliert, die in der Mühlerei als Ausgangsstoff zur Weizenkeimbildung erhalten werden. Die Embryos werden zuerst mit Chloroform 15% Ethanol entfettet und im Vakuum getrocknet. Dann werden die Embryos in flüssigem Stickstoff fein gemahlen und bei -20ºC mit Griesbach- Puffer (R.J. Griesbach et al. 1982 Plant Sci Lett 24 : 55-60), zu dem Glyzerol bis auf eine Endkonzentration von 50% gegeben wurde, extrahiert. Die Mischung wird durch ein Nylongewebe (50-Mikron-Gaze) filtriert und dann bei 4000 g abzentrifugiert. Das Chromatin wird von der Stärkefaser getrennt, mehrmals mit Griesbach-Puffer gewaschen und zweimal durch ein 2,3M-Saccharosekissen in Griesbach-Puffer zentrifugiert. Durch Zugabe von NaCl bis auf eine Konzentration von 2M wird die DNA aus dem entstandenen Chromatin freigesetzt und mit einer Mischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (50, 48, 2) entproteinisiert. Hieraus wird die DNA mit einer Lösung aus 0,01M Tris und 0,001M EDTA gefällt und nochmals mit Isopropanol in der Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat gefällt. Die DNA wird anschließend in reinem Wasser gelöst. Ein Teil dieser DNA wird mit BamHI, BqlII, XhoII, Sau3A, BcII oder MboI oder mit einer Mischung aus diesen Restriktionsenzymen geschnitten, wobei alle Restriktionsenzyme ein 5'GATC-Ende ergeben, sich jedoch bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Methylierung der Restriktionssequenz unterscheiden sowie verschiedene Restriktionsstellen schneiden. Die Durchschnittslänge der Fragmente wird bei ungefähr 10 000 bp gehalten.
Die endständigen Phosphatgruppen der entstandenen Fragmente werden mit Phosphatase entfernt (Kälberdarmphosphatase), und die entstandenen Fragmente werden mit dem multifunktionellen Linker so ligiert, daß die Verbindungsstelle zwischen Spender-DNA und Linker zumindest keine BamHI, BglII oder BclI-Stelle enthält (siehe Tabelle 1).
Auf diese Weise werden ringförmig geschlossene Moleküle mit Spender-DNA und multifunktionellem Linker gebildet.
Zur Herstellung von linearen Molekülen mit multifunktionellem Linker und Haarnadelstrukturen werden die Spender-DNA-Fragmente mit einer Mischung aus linksseitigen und rechtsseitigen multifunktionellen Linkermolekülen mit Haarnadelenden ligiert.
Die entstandenen, mit dem multifunktionellen Linker gekoppelten Spender-DNA-Fragmente werden vom Linker aufgrund ihres Molekulargewichts getrennt (2 Mdal im Gegensatz zu 8 bis 10 Mdal). Je nach DNA-Menge kann dies auf einem Agarosegel durch Elektrophorese, durch untersuchende Chromatographie auf Agarose oder durch Gradientenzentrifugation. Die ringförmig geschlossene Spender-DNA und die lineare Spender-DNA mit Haarnadelenden können durch Exonukleasebehandlung gereinigt werden.
Die Rezeptor-Gerstenpflanzen werden im Gewächshaus in Töpfen herangezogen. Ungefähr zum Zeitpunkt der Befruchtung werden die Ähren geöffnet, und ungefähr 10 pL gereinigte, mit multifunktionellem Linker gekoppelte Spender-DNA, entweder ringförmig oder linear, werden mittels einer Eppendorf-Mikrospritze direkt durch die Ovarienwand in den Embryosack injiziert. Die unbehandelten Ovarien werden herauspräpariert, die Spelzen werden wieder geschlossen, und die behandelten Ähren werden mit einem Pergamentbeutel geschützt. Die Samen der so erhaltenen Pflanzen werden auf Resistenz gegen das Antibiotikum, dessen Resistenzgen insertiert worden war (z. B. Chloramphenicol), geprüft. Die resistenten Keime werden je nach Jahreszeit im Gewächshaus oder im Freiland weiter kultiviert. Nun kann man die jungen Blätter der resistenten Pflanzen auf die Anwesenheit der insertierten Spender-DNA dadurch überprüfen, daß man einerseits die Funktionen auf dem multifunktionellen Linker verwendet, und dadurch, daß man feststellt, welche Sequenzen hiermit verbunden sind. Die Gesamt-DNA wird nach dem Verfahren von Lemmers et al. (1980) J. Mol. Biol. 144: (353-376) extrahiert und mit BamHI, BqIII, BcII oder XhoII verdaut, je nachdem, welche Restriktionsenzyme während der Konstruktion der insertierten Spender-DNA verwendet wurde (siehe Tabelle 1). Durch Southern-Hybridisierung mit der Sequenz des multifunktionellen Linkers kann man feststellen, wieviele Fragmente der Spender-DNA im Gerstengenom verblieben sind. Die Länge der Fragmente wird mit einer Southern-Hybridisierung zwischen der für die Mikroinjektion verwendeten, mit demselbem Restriktionsenzym behandelten Spender-DNA und der Sequenz des multifunktionellen Linkers verglichen. Abweichende Längen können Integration der insertierten Spender-DNA anzeigen.
Ein Teil des Endosperms der Samen dieser ersten Generation behandelter Gerstenpflanzen (T1) wird für SDS PAGE entfernt, um feststellen zu können, welche Samen ein unterschiedliches Elektrophoresemuster reverser Proteine bezüglich der Ausgangssorte aufweisen und welche Proteinbanden möglicherweise denen der verwendeten Weizensorte (Rektor) entsprechen.
Der Erhalt einer Gerstensorte mit Weizenproteinen ist ein erstes Ergebnis des bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Verfahrens.

Beispiel III

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Wiederauffindung von Spender-Genen, die in einem Rezeptor exprimiert werden und im Rezeptor auf dieser Grundlage durch Verwendung des multifunktionellen Linkers untersucht oder selektiert werden. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
1. Isolation der DNA aus dem Chromatin des selektierten Rezeptors.
2. Schneiden dieser DNA mit einen Restriktionsenzym gemäß den Beispielen in Tabelle 1.
3. Ringschluß der erhaltenen DNA-Fragmente.
4. Abtrennen der DNA, die den multifunktionellen Linker enthält, durch Verwendung der lac-Operator-Repressorbindung.
5. Transformieren von Mikroorganismen mit der ringförmigen DNA mit oder ohne Verwendung eines Vektors.
6. Untersuchen bzw. Selektieren von Mikroorganismen aufgrund der Expression des Gens auf dem multifunktionellen Linker.
7. Analyse der so erhaltenen beschränkten Gen-Bank vom auf den Rezeptor übertragenen Spender-DNA- Fragmenten.
8. Neuinsertion einzelner Spender-DNA-Fragmente in einen Rezeptor, um die Fragmente mit den selektierten Merkmalen des Rezeptors zu korrelieren.
Das oben beschriebene Verfahren kann auf jede Generation selektierter Rezeptoren angewendet werden. Im Fall von geschlechtlicher Vermehrung ist jedoch offenbar, daß, je mehr Generationen ein bestimmtes Individuum von der behandelten Generation entfernt sind, desto weniger Spender-Gene in diesem Individuum noch gefunden werden. Durch Selektion in verschiedenen Generationen können schließlich Individuen erhalten werden, die lediglich diejenigen Spendergene, für die selektiert wird, behalten haben.
Eine Anwendung des Verfahrens auf die T2- Generation von Gerstenpflanzen aus Beispiel II wird im folgenden beschrieben.

Stufe 1

Die Samen der in der T1-Generation erhaltenen Gerstenpflanzen werden auf Resistenz gegen Chloramphenicol (5 ug/ml) geprüft, die vom pflanzenadaptierten cat-Gen im multifunktionellen Linker kodiert wird. Junge Blätter der resistenten Pflanze werden regelmäßig geerntet und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Blätter jeder Pflanze werden in einem Porzellanmörser mit Hilfe von Sand und einem Stößel gemahlen, wobei mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Chromatin wird mit Griesbach-Puffer, dem 50% Glyzerin zugesetzt worden war, isoliert und auf -20ºC gekühlt. Man filtert die Suspension durch ein Nylongewebe mit einer Maschenweite von 50 um. Das Chromatin wird 30 Minuten bei 4000 g sedimentiert, und das Sediment wird in Griesbach-Puffer suspendiert. Zellabbauprodukte werden bei 15-minütiger Zentrifugation bei 100 g entfernt. Der Überstand wird über ein 2,3M Saccharosekissen in Griesbach-Puffer 2 Stunden lang bei 70 000 g zentrifugiert. Man suspendiert das Sediment, das Chromatin und Stärkekörner enthält, in 2M NaCl, pH 8, wobei die DNA freigesetzt wird.
Die DNA-Lösung wird mit einer Mischung aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (50/48/2) bei pH 8 bewegt.
Nach der Phasentrennung wird die DNA mit kaltem Ethanol (-20ºC) gefällt und mit 96%igem Ethanol und anschließendem Luftstrom getrocknet. Man löst die DNA in 0,01M Tris, 0,001M EDTA, pH 8, und fällt nochmals mit Isopropanol in der Gegenwart von 0,3M Natriumacetat. Nach erneutem Trocknen wird die DNA schließlich in reinem Wasser gelöst.

Stufe 2

Rezeptor-DNA von mit BamHI geschnittenen Spender- DNA-Fragmenten transformierten Pflanzen wird in dieser Stufe ebenfalls mit BamHI unter den Bedingungen geschnitten, die vom Hersteller angegeben sind, wobei angenommen wird, daß die BamHI ster-Aktivität auf ein Minimum beschränkt wird. Die geschnittene DNA wird nochmals mit Phenol behandelt, mit Ethanol gefällt und in reinem Wasser gelöst.

Stufe 3

Ein Teil der erhaltenen DNA wird auf eine Konzentration von 30 ug/ml verdünnt und mittels T4-DNA-Ligase unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen ringförmig geschlossen. Der Prozentsatz der ringförmigen DNA wird elektronenmikroskopisch festgestellt.

Stufe 4

Die in Stufe 3 erhaltene DNA wird in der Gegenwart des lac-Repressorproteins auf einen Filter, wie von Riggs et al. in J. Mol. Biol. 53 : 401 (1970) angegeben, isoliert.

Stufe 5

Hat die Spender-DNA einen multifunktionellen Linker enthalten, der sich für Multiplikation in einem Mikroorganismus eignet, so wird das Filter bei 30ºC mit E. coli MC1061 recA-Bakterien, die nach dem Verfahren von Dagert und Ehrlich (Gene 6: 23-29, 1979) kompetent gemacht wurden, inkubiert. Hat die Spender-DNA einen multifunktionellen Linker enthalten, der sich zur Integration in einem Lambda-Vektor eignet, so verwendet man MC1061 recA-Bakterien, die mit Lambda NM540 A oder X lysogenisiert wurden (N. Murray J. Mol. Biol. 98 : 551 (1975, et seq.)).
Der Phage Lambda NM540 A wird folgendermaßen hergestellt:
Das Aph3'II-Gen wird mit BglII und BamHI aus Plasmid pKC7 (Rao und Rogers Gene 7: 79-82 (1979)) herausgeschnitten und in mit BglII geschnittenem PiAmp71 kloniert. Nach Ligation wird es erneut mit EcoRI und HindIII geschnitten und in pUC8, das mit denselben Enzymen geschnitten wurde, kloniert. kan®-Kolonien in JM109 werden selektiert. Lambda-NM540-DNA verfügt über eine einzige HindIII-Stelle in der Position 27475 links von der attP-Sequenz. Das SalI-Aph3'II-HindIII-Fragment und ein partielles AvaI-Fragment mit den Basenpaaren 1 bis 19397 des Phagen Lambda werden damit zusammenligiert, und nach Transfektion wird der Phage isoliert. Der so erhaltenene Phage Lambda NM540 A verfügt über alle Funktionen, die für die Integration ringförmiger DNA mit der AttB-Sequenz erforderlich sind und kann deren Vermehrung und Infektiosität in einem recA-Stamm erklären. Die NM540 A-DNA verfügt über die folgenden Deletionen: 7000 bp (von AvaI bis SalI), 2300 bp (imm21 anstelle von immλ) und 2800 bp (nin5), insgesamt ungefähr 12.000 bp. Dieser Phage enthält nur 75% des Lambda-Genoms und kann bis zu 20.000 bp Fremd-DNA aufnehmen.
Lambda NM540 X wird auf ähnliche Weise erhalten. Dann wird das SalI-XylE-HindIII-Fragment der RFI-DNA des Phagen ml3 Tg 402 (Zukowski et al. Proc Nat Acad Sci USA 80 : 1101-1105, 1983) verwendet.
Die mit Lambda NM540 A bzw. X lysogenisierten MC1061-recA-Bakterien werden 20 Minuten bei 30ºC mit der an den multifunktionellen Linker gekoppelten ringförmigen Spender-DNA transformiert und anschließend 15 Minuten bei 42ºC induziert. Während der anschließenden Phagenreplikation wird die Spender-DNA aufgrund der attB-Stelle auf dem multifunktionellen Linker in die Phagen-DNA durch integrative Rekombination eingebaut, die durch die Integrase (int) des Phagen Lambda gefördert wird. Durch diesen Vorgang kommt p op lac (Promotor/Operator des lacZ-Gens) vor dem XYIE bzw. Aph3'II-Gen zu liegen. Die Sequenz enthält ein TAA-Stopcodon im lacZ-Leseraster, dem ein ATG-Startcodon des XYlE- oder Aph3'II-Gens folgt (siehe Fig. 2).
Durch die Anwesenheit des λimm2l-N-Genprodukts wird das Lesen durch die RNA-Polymerase von E. coli fortgesetzt.
Phagen, in deren DNA die Spender-DNA und der multifunktionelle Linker eingebaut sind, werden daran erkannt, daß sie bei 30ºC in der Gegenwart von IPTG Katechin in ihrem Wirtsbakterium oxidieren bzw. dem Bakterium Kanamycinresistenz verleihen können.
Das weitere Verfahren hängt vom verwendeten multifunktionellen Linker ab sowie davon, ob die Spender- DNA auf diese Weise in einen Phagen eingebaut ist oder wie ein Plasmid behandelt werden kann.
A. Die Spender-DNA ist in Lambda-NM540 A bzw. X eingebaut. Die Phagen werden bei 42ºC multipliziert, und das Lysat wird mit einem Cäsiumformiatgradienten zentrifugiert. Diejenigen phagenhaltigen Fraktionen des Gradienten, deren Dichte niedriger ist als die des Elternphagen und die daher mehr DNA enthalten, werden dazu verwendet, MC1061-recA-Bakterien bei 30ºC zu lysogenisieren. Man erhält so eine beschränkte DNA-Bank von Spender-DNA-Fragmenten, die ihrem Molekulargewicht bereits in ungefähr dreißig Fraktionen zerlegt worden waren. Der Prozentsatz der xylE&supmin;- oder kanR-Kolonien wird bestimmt, und ein Teil wird mit 20% Glycerin versetzt und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Wie aus dem Schema in Fig. 2 ersichtlich, sind lediglich die lysogenen Bakterien noch zur Produktion von xvlE&supmin;- oder kanR-Kolonien fähig, in die durch int-Rekombination an der PB'-Stelle der Lambda-Vektor eingebaut ist. In denjenigen Bakterien, in die der Lambda-Vektor in die PB'-Stelle eingebaut ist, wird der lac-Promotor/ Operator vom xylE- bzw. kanR-Gen getrennt.
Aus praktischen Gründen verwendet man im weiteren Verlauf des Verfahrens nur die erstgenannten lysogenen Bakterien.
Aufgrund der Induktion,dieser lysogenen Bakterien sind nach 20 Minuten in der Bakterien drei ringförmige DNA-Moleküle erhalten worden: die NM540-A- bzw. -X-DNA; die Spender-DNA, die mit dem multifunktionellen Linker verbunden ist; und das Kointegrat der beiden DNAs. Diese Moleküle können aufgrund ihrer Größe durch Agarosegelelektrophorese oder Saccharosegradientenzentrifugation getrennt werden: 36500bp, 14000 +/-6000bp bzw. 50500+/- 6000 bp (siehe Fig. 2).
B. Aufgrund des multifunktionellen Linkers kann die Spender-DNA wie ein Plasmid in E. coli multipliziert und selektiert werden. Die Länge der Spender-DNA wird in einzelnen ampR-Kolonien nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nuc Ac Res 7 : 1513-1523 (1979)) überprüft. Sind bei der Präparation der Spender-DNA multifunktionelle Linker sowie Haarnadelenden verwendet worden, so wird mit den Restriktionsenzymen für die Stellen in der Haarnadelstruktur, die nur durch Replikation der Spender-DNA entstanden, geschnitten, bevor die Integration in das Rezeptorgenom vorgenommen wird: AvrII und SfiI. Dadurch, daß man die entstandene Spender-DNA wie ein Plasmid mit z. B. xbaI und AvrII und mit xbaI und SfiI schneidet, kann untersucht werden, ob die gleichen Fragmente gebildet werden. Das Auffinden von Spender-DNA-Fragmenten, die über eine zur Replikation im Rezeptor geeignete Sequenz verfügen, ist eindeutig eine Anwendung der hier beschriebenen Erfindung.
Eine weitere Stufe in der Entwicklung dieser Erfindung ist die Verwendung dieser Sequenz im multifunktionellen Linker anstelle der Rezeptorsequenz als Homologiereihe für die Integration.
Die beiden hier beschriebenen Verfahren zur Isolierung von Spender-DNA-Fragmenten, die auf den Rezeptor übertragen sind, haben sowohl Vorteile als auch Nachteile; die Verwendung beider Verfahren gestattet es, Spender-DNA-Konstrukte mit Multifunktionellem Linker und Haarnadelenden nach ihrer Übertragung in den Rezeptor optimal zu bestimmen.
Sowohl die ringförmigen DNA-Moleküle, die wie unter A beschrieben nach der Phageninduktion isoliert wurden, als auch die gemäß B isolierten Plasmide werden einzeln oder in Kombination für die direkte Transformation frischer Gersten-Rezeptorpflanzen verwendet, um eine Korrelation mit z. B. Speicherproteinen der Weizen- Spender-DNA aufzustellen.

Beispiel IV

Übertragung von Resistenz gegen Scizaphis (Toxoptera) granium von einer resistenten Gerstensorte auf eine anfällige Weizensorte.
Als Spender wird eine Gerstensorte verwendet, die gegen Toxoptera resistent ist. Es ist bekannt, daß die resistenten Sorten mehr Benzylalkohol produzieren (P.S. Juneja et al., 1972 Ann Entomol Soc Am65, 961-964). Aus den Keimen einer resistenten Gerstenlinie wird Chromatin isoliert. Zu diesem Zweck werden die Gerstenkörner erst kurz gemahlen, und die Keime werden über ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm gesiebt. Die Keime werden mit Sand in einem Mörser mit Stößel bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff homogenisiert. Das Homogenisat wird in Griesbach-Puffer übergeführt, dem Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 50% bei -20ºC zugesetzt wird (R.J. Griesbach et al.; 1982, Plant Sci. Lett. 24 : 55-60). Die entstandene Suspension wird der Reihe nach durch drei Lagen Gaze, eine Lage Miracloth und ein Nylongewebe mit einer Maschenweite von 60 um filtriert. Man zentrifugiert das Filtrat 15 Minuten bei 10.000 g und wäscht das Sediment dreimal mit 0,15M NaCl, pH 7. Dann zentrifugiert man das Chromatin durch ein 2,3M Saccharosekissen, immer in der Anwesenheit von 0,15M NaCl, pH 7. Anschließend extrahiert man Chromatin und Stärkekörner bei 2M NaCl mit einer Mischung aus Phenol/ Chloroform/Isoamylalkohol (50/48/2). Man zentrifugiert Stärke und organische Phase ab und fällt die DNA mit eiskaltem Ethanol. Nach Auflösen des Niederschlags in 0,01M Tris, 0,001M EDTA, pH 8, wird die DNA erneut mit Isopropanol nach Zugabe von Natriumacetat bis 0,3M gefällt und der Niederschlag in reinem Wasser gelöst. Man verdaut einen Teil der DNA mit BamHI, einen Teil mit BglII und eine dritten mit XhoII. Diese Restriktionsenzyme sind gegen Methylierung der DNA unempfindlich und ergeben Fragmente mit einer Durchschnittslänge von 5000 bp. Ein Teil der Fragmente wird mit dem multifunktionellen Linker bei einer Konzentration von ungefähr 10 ug/ml zur Herstellung von ringförmigen Molekülen ligiert, und ein Teil wird mit multifunktionellem Linker mit Haarnadelenden in einer Konzentration von ungefähr 2 ug/ml zur Herstellung von linearen Molekülen ligiert. Beide Präparationen werden durch Behandlung mit Exonuklease V von nicht ringförmiger DNA bzw. linearer DNA ohne Haarnadelenden gereinigt. Nach Phenolbehandlung, Fällung und erneuter Auflösung in reinem Wasser ist die Spender-DNA fertig und kann injiziert werden.
Die Rezeptor-Weizenpflanzen werden im Gewächshaus herangezogen. Ungefähr zu dem Zeitpunkt, an dem die Befruchtung stattfindet, werden die Ähren geöffnet, und ungefähr 20 pl DNA-Lösung mit einer Konzentration von ungefähr 500 ug/ml werden direkt durch die Ovarienwand in den Embryosack mit Hilfe einer Eppendorf-Mikrospritze injiziert. Nach der Injektion werden die Spelzen wieder geschlossen, und die behandelten Ähren werden mit einem Pergamentbeutel geschützt.
Die halbreifen Samen werden geerntet und einige Male im Laufe von einigen Tagen zum Brechen der Keimruhe einer Kälte/Wärmebehandlung (4ºC und 45ºC) unterzogen. Anschließend wird die Keimfähigkeit der Samen in der Gegenwart von 25 ug/ml Chloramphenicol untersucht, wobei sich das Gen für Chloramphenicolresistenz auf dem multifunktionellen Linker befindet. Die resistenten Samen werden je nach Jahreszeit im Gewächshaus oder im Freiland weiterkultiviert.
Während die Körner auf diesen Pflanzen reifen, werden die Blätter mit Toxoptera granium besiedelt. Die Population wird täglich beobachtet, und die Pflanzen, auf denen sich keine Insekten mehr befinden, werden erneut besiedelt. Die Pflanzen, auf denen sich nach vier Wochen wenige oder überhaupt keine Insekten befinden, werden als resistent bezeichnet. Die Samen der resistenten Pflanzen werden in Ährenreihen angebaut, und die Pflanzen werden genau auf morphologische Merkmale untersucht, die sich von denjenigen der Ausgangssorte unterscheiden. Der Benzylalkoholgehalt wird nach der Methode von P.S. Juneja et al., 1975, Plant Physiol 56 : 385-389 bestimmt.
Das DNA-Fragment, das eine erhöhte Produktion von Benzylalkohol bewirkt, läßt sich anschließend auf die gleiche Weise wie in Beispiel III beschrieben bestimmen.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1A zeigt einen multifunktionellen Linker (MFL), der sich für die Integration in einen Phagen- Lambda-Vektor eignet.
Fig. 1B zeigt einen multifunktionellen Linker, der sich zur Vermehrung und Selektion in einem Mikroorganismus ohne einen Vektor eignet.
Fig. 1C zeigt ringförmig geschlossene Spender- DNA.
Fig. 1D zeigt mit Haarnadelenden versehene lineare Spender-DNA.
Fig. 1E zeigt mit Replikationsfunktionen des Rezeptors sowie Haarnadelenden versehene lineare Spender- DNA.

Die Bezeichnungen haben folgende Bedeutungen:

attB : Integrationsstelle des Phagen Lambda
Chi : crossing-over hot-spot instigator sequence
MSG : Gen, das in einem Mikroorganismus selektiert werden kann
oriM : in einem Mikroorganismus benötigte Replikationsfunktionen
oriR : im Rezeptor benötigte Replikationsfunktionen
p op lac : Promotor/Operator des lac-Gens von E. coli
RS : Sequenz, die einer Rezeptorsequenz homolog ist
RSG : im Rezeptor selektierbares Gen.
Die Pfeile stellen die Orientierung dar.
Fig. 2 zeigt schematisch die Entwicklung im Fall von Expression durch integrative Rekombination.
In dieser Abbildung bedeutet Aal das Galaktoseoperon von E. coli, und bio das Biotinoperon von E coli. TABELLE 1 Spender-DNA geschnitten mit Ende des Linkers Verbindungsstelle kann geschnitten werden mit

Bakterien, Phasen und Plasmide

Bakterien

MC 1061 Casadaban MJ Cohen SN J. Mol. Biol. 138, 179-207, 1980
C600 Appleyard, R. Genetics 39, 429, 1954
MB101 Boyer, H.W., Rolland Dussoix D. J. Mol. Biol. 41, 459-472, 1969
JM109 Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. Gene 33, 103-119, 1985

Phasen

XNM540 Cloning Vectors (Kloniervektoren] P.M. Pauwels, Elsevier 1985
Xb506 CI,857 Davis & Parkinson, 1971
XCI,857 Sussman, R., Jacob, F., Compt. Rend. Acad. Sci Paris 254, 1417, 1962

Plasmide

pBR322
pUC8 Cloning Vectors [Kloniervektoren] P.M. Pauwels,
pUC9 Elsevier 1985
puC19
PiAN7 New England Biolabs Katalog 1986/1987

Claims

1. Verfahren zum Transformieren von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander:

- hochmolekulare DNA aus einer Spenderzelle isoliert,

- diese DNA mittels einer Endonuklease in Fragmente zerlegt, die mindestens ein vollständiges Gen einschließlich seiner Regelelemente enthalten,

- die erhaltenen Fragmente ringförmig schließt unter Aufnahme eines multifunktionellen Linkers des linearen DNA-Moleküls oder die erhaltenen Fragmente mit einem multifunktionellen Linker des linearen DNA-Moleküls an beiden Enden versieht,

wobei der multifunktionelle Linker mindestens folgende Elemente enthält:

A) eine DNA-Sequenz, die homolog einem Teil des Rezeptorgenoms ist, um Rekombination zwischen dem Rezeptorgenom und der eingebrachten DNA, die aus dem multifunktionellen Linker und Spender-DNA besteht, zu ermöglichen,

B) eine Operatorsequenz, die es ermöglicht, DNA, die die Operatorsequenz enthält, wiederzuerkennen und abzutrennen, und

C) eine Sequenz, die Replikation in einem Mikroorganismus gestattet oder eine Sequenz, die integrative Rekombination in einem Vektor ermöglicht, so daß der multifunktionelle Linker mit der daran gekoppelten DNA in einem Wirt multipliziert werden kann,

- die an den multifunktionellen Linker gekoppelten Spender-DNA-Fragmente mittels direkter Transformationsmethoden auf den Rezeptor überträgt, und

- die Rezeptoren auf der Basis der übertragenen Information untersucht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der multifunktionelle Linker auch ein Gen enthält, dessen Expression in einem Mikroorganismus nachgewiesen werden kann.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der multifunktionelle Linker auch eine Rekombination fördernde Sequenz enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombination fördernde Sequenz DNA in Form von Z DNA enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombination fördernde Sequenz eine "cross-over hot-spot instigator" (chi)-Sequenz enthält.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der multifunktionelle Linker auch ein Gen enthält, dessen Expression leicht im Rezeptor nachgewiesen werden kann.

7. Verfahren nach Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der multifunktionelle Linker auch eine Haarnadelstruktur an einem oder beiden Enden aufweist.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die homolog dem Rezeptorgenom ist, mindestens 100 Basepaare umfaßt.

9. Verfahren nach Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Operatorsequenz der lac-Operator von E. coli ist.

10. Verfahren nach Ansprüchen 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, dessen Expression in einem Mikroorganismus nachgewiesen werden kann, das aph3'II-Gen von Transposon 5, das amp-Gen von Transposon 1 oder das xylE-Gen von Bacillus putida ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

- hochmolekulare DNA entweder aus allen oder aus selektierten Rezeptoren isoliert,

- diese DNA mittels einer Endonuklease in Fragmente mit einer Länge in der Größenordnung der überbrachten genetischen Information zerlegt,

- aus dem Gemisch der Fragmente diejenigen Fragmente isoliert, die die auf dem multifunktionellen Linker liegende Operatorsequenz enthalten, indem man die Bindungskraft des entsprechenden Repressorproteins benutzt,

- die isolierten Fragmente ringförmig schließt,

- die ringförmig geschlossenen Fragmente in einem Mikroorganismus multipliziert oder diese wahlweise mittels eines Vektors, in den die Fragmente integrieren können, in einem Mikroorganismus multipliziert, wobei man eine beschränkte Gen-Bank der auf den Rezeptor übertragenen Sequenz erhält, und

- die verschiedenen Sequenzen erneut durch direkte Transformation auf einen Rezeptor überträgt und die Transformanten auf der Basis der übertragenen genetischen Information selektiert, um die Sequenzen mit deren Expression im Rezeptor korrelieren zu können.