JPH04500153A - 遺伝的に形質転換された内乳組織を有する商品価値のあるポリペプチドの産生 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝的に形質転換された内乳組織を有する商品価値のあるポリペプチドの産生 発明の背景 本発明は、外因性のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する内乳組織からな る種子を産生ずる遺伝的に形質転換された単子葉植物の獲得に関する。また、本 発明は、前記内乳組織の、インシュリン、ティシュプラスミノーゲン因子及びヒ ト成長ホルモンのような生物学的に活性な物質を含めた外因性たんばく質を産生 ずるための使用に関する。

単子葉植物の内乳は、アリューロン層と澱粉質の内乳とから構成される。これら の内乳組織は、精細胞核と２個の卵細胞核の融合の産物である単一の二倍体細胞 から発生する。前記融合は、内乳組織を生ずるような融合とは区別される。アリ ューロン細胞は、農業的に重要な穀類を含めた単子葉植物により産生される種子 の澱粉質内乳を取り囲む層を形成する。発芽中、植物胚は、アリューロン層に作 用して特定数の加水分解酵素を大量に合成し分泌するホルモンであるジベレリン 酸（ＧＡ）を分泌する。これらの酵素は、内乳中に保存されている澱粉やたんば く質のような物質を分解し、その結果生長内乳により使用される産物が放出され る。

例えば、オオムギ（ＣＶ、“旧ｍａｌＢｘ″）のわずか１０．５の種子由来のア リューロン層、すなわち約１００万個のアリューロン細胞は、たった２４時間で ３００μｇ以上の加水分解酵素α−アミラーゼを分泌する。ビールの麦芽モルト を産生ずるために使用される他の栽培変種植物はこの量の３倍を分泌する。

この莫大な合成能にもかかわらず、内乳組織は外因性（外来）ＤＮＡを発現させ る目的の実験の対象とはなっていなかった。

］、　Ｃｅ１１．　Ｃｈｅｍ、、　５ｕｐｐｌ、＋２ｃ　（１９８８）の２０７ 頁１こおいて、Ｈｕｌｌｌ及びＢａｕ（ｃｏｒｎｂｅは、小麦α−アミラーゼプ ロモータと酵素β−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ配列とから構成される 遺伝構築物を導入したオート麦アリニーロンプロトプラストにおける制御発現に ついて報告している。発現は一過性にすぎず、外因性ＤＮＡの単プロトプラスト を越えるレベルでのアリューロン特異性発現の方法も機構も示唆されていない。

発明の要旨 したがって、本発明の目的は、アリューロン組織の合成能を利用して有用なたん ばく質を産生ずる方法を提供することにあ本発明の他の目的は、形質転換された 内乳により発現される外因性（外来）ＤＮＡがコードずＳ物質を含む囃子葉植物 の種子を獲ｉ喝する方法を櫂イ汁する、二１１−にオ、る。

本発明の他の目的は、ポリベブ丹ドをコードする外因性ＤＮＡ不二不規発現るべ く遺伝的に形質転換されｌ′コ内乳組織からなる種子を産生ずる単Ｆ葉植物を提 供することにある。

本発明の他の目的は、りを来（外因性）ポリペプチドを産生ずるアリっ、−ロン 組織の存在により特徴付けられる安定的に遺伝性の表現型を有する植物を提供す ることにある。

上記した目的を達成するために、本発明は、遺伝的に形質転換された内乳組織か らなる種子を獲得する方法を提供する。前記方法は、 （Ａ）　（ｉ）内乳細胞において高レベルで発現される制御要素。

（１１）制御要素の転写コニ、・トロール下にある、ポリペプチドをコードする 少なくとも１つのＤＮＡ配列、及び（ｉｉｉ）転写方向に関してＤＮＡ配列の下 流に位置する末端−プロセう・ンゲ信号。

からなる遺伝構築物を作成し、 （Ｂ）前記遺伝構築物を、穀物植物の開花前に該植物の花分聚（＋１ｌｌｅ＋） に注入し、その後、 （Ｃ）注入した植物由来の種子について、その内乳におけるＤＮＡ配列の発現産 物の存在をアッセイＩ−で、遺伝的に形質転換された内乳組織からなる種子を同 定するこ２〜からなる。好ましい態様では、前記方法のステップ（Ｃ）は発現産 物を認識する抗体を使用して発現産物をアッセイすることを含む。他の好ましい 態様では、遺伝構築物のＤＮＡ配列は５０９６以上のグアニン＋ントシン（Ｇ　 ＋　Ｃ）含有量を有する。

本発明は、ポリペプチドを産生ずる方法をも提供する。前記方法は、 （Ａ）上記のような遺伝構築物を発現する遺伝的に形質転換された内乳組織を産 生させ、 （Ｂ）前記内乳をベースとする発現の産物であるポリペプチドを単離することか らなる。１つの好ましい態様では、前記方法は穀物植物の実質的に均質な集合体 から得た種子の内乳由来の外因性たんばく質を単離することを含む。別の好まし い態様では、方法は組織を培養する培養基から遺伝的に形質転換された内乳組織 のポリペプチド発現産物を単離することを含む。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、ポリペプチドをコードする外因 性ＤＮＡ配列を発現すべく遺伝的に形質転換された、アリューロン組織のような 内乳組織を含む種子を産生ずる分化単子葉植物を提供する。好ましい態様では、 植物は、外因性たんばく質を含む内乳からなる種子を産生ずる単子葉植物の実質 的に均質な集合体である。他の好ましい態様では、外因性ＤＮＡ配列は、天然に 存在する遺伝子によりコードされるがグアニン＋シトシン含有量が天然に存在す る遺伝子よりも多いポリペプチドをコードする。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、小麦、大麦、オート麦、モロコ シ、ライ麦、キビ、コメ、トウモロコシ、サトウキビ、ココヤシのような単子葉 植物の種子を提供する。前記種子は外因性ポリペプチドからなる内乳を含む。

本発明の他の目的、特徴及び効果は以下の詳細な記載から明らかであろう。ただ し、詳細な記載及び本発明の好ましい態様を示す特定の実施例は説明のために示 （７たにすぎず、本発明の趣旨及び思想の範囲内の種々の変更及び修正がこの詳 細な記載から当業者には自明であろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明における使用に適した遺伝構築物の製造を示す概略図である。

図２は、対照の（非形質転換の）大麦植物及び本発明により形質転換された植物 のＤＮＡのサザンブロットハイプリダイゼーショ分析を示す。

図３は、対照の大麦植物及び本発明により形質転換された植物より分泌されるた んばく質のゲル電気泳動分析を示す。

図４Ａは、対照の大麦植物及び本発明により形質転換された植物より産生される 染色たんばく質のウェスタンプロットを示す。図４Ｂは、同じウェスタンプロッ トのオートラジオグラフを示す。

図５は、本発明のＧＵＳプローブと使用するのに適した遺伝構築物の製造を示す 概略図である。図５ＡはプラスミドＪＲ１２４の構築を示す。図５Ｂはプラスミ ドＪＲＩ２９の構築を示す。

図５ＢはプラスミドＪＲＩ３３の構築を示す。

図６は、ＪＲＩ２４構築物を注入した芽から得た大麦種子端部のスクリーニング プレートでの培地（図６Ａ）及び抽出物（図６Ｂ）の蛍光を示す２枚の写真であ る。

図７は、ＪＲＩ３３構築物を注入した芽からの大麦種子端部からの組織抽出物の 代表的なアッセイである。

図８Ａは、ＧＵＳコード配列に由来するプローブを用いた、２個のＪＲ１２４構 築形質転換体（１２４−２Ｄ２及び＋２４−２Ｅ４　）からのＤＮＡのハイブリ ダイジングサザンプロットの結果を示す。

図８Ｂは、ＧＵＳフード配列プローブを用いてハイブリダイズしたＪＲＩ３３構 築物を用いて形質転換された植物由来のＤＮＡの異なるダイジェストの結果を示 す。図８０は、２つの植物（２Ｇ７及び２ＧＩＯ）由来のＤＮＡに対して異なる 制限酵素を用いて同様に分析した結果を示す。

図９は、対照大麦ＤＮＡ　（Ｃ）及びタウマチンプローブを用いてハイブリダイ ズしたタウマチン形質転換体１０Ｄ＋及び１２Ｈ２のＦ２世代の子孫のＤＮＡの サザンプロットのオートラジオグラフを示す。

図１０は、形質転換された植物中にＧＵＳ配列を含む構築物の不安定性を証明す る、ザザンブロソトのオートラジオグラフである。

図１１は、ＧＵＳ配列が後で生長したＪＲ＋２４−２Ｄ２植物から採取した組織 からは欠けているがＪＲ１２４−２Ｄ２の最初の芽の種子から発芽した子孫によ り受け継がれていることを証明するサザンプロットオートラジオグラフである。

図１２は、本発明にしたがって形質転換された植物中のハイブリダイズＤＮＡの サザンプロット分析の結果を示す。図１２Ａは、対照ＤＮＡと比較して、２Ｇ６ 中の１３３−シリーズのＧＵＳ−陽性ＷＪＤＮＡフラグメントのメチル化バクー ンを示す。

評価は異なる酵素を用いるダイジェスによる。図１２Ｂは２Ｇ８．４Ｆ１及び４ Ｇｌ中のＧＵＳ−ハイブリダイズＤＮＡの同様なダイジェストの結果を示す。

図１３Ａは、１２４−２Ｄ２＃６のバルクの染色体ＤＮＡから分離したダイジェ ストされていない大きなＧＵＳ−ハイブリダイズ配列のサザンブロットハイプリ ダイゼーションの結果を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍでダイジェストして得られ たこれらのフラグメントと比較して示す。図１３Ｂは、子孫２Ｇ７＃３及び５Ａ ７＃８中のダイジェストされていないＧＵＳ−ハイブリダイズ配列の電気泳動の 結果を、ＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＴでダイジェストしたフラグメントと比較して 示す。

図１４は、ＭｂｏＩ及びＭｓｐ　Ｉを用いて行なった、Ｆ３植物、Ｇ　１２−２ −８及びＦ２植物、１２Ｈ２−４からのＤＮＡ中のタウマチンプローブにハイブ リダイズする２、　５ｋｂのＨｉｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＩフラグメントにおけるメ チル化の結果を示す。

図１５は、ＪＲＨ３構築物を注入した芽から得たオート麦端部のスクリーニング プレートの培養基（図１５Ａ）及び抽出物（図１５Ｂ）における蛍光を示す写真 である。

好適実施態様の詳細な説明 本発明は、外因性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（「構造配列」）と、及 び内乳組織内で該構造配列の発現を行うか又はその発現を制御する少なくとも１ つの制御要素を含み且つ転写方向に関して該構造配列の上流に位置するＤＮＡセ グメントと、を包含する遺伝子構築物を用いて穀物植物もしくは他の単子葉植物 を形質転換することにより、外因性ポリペプチドの産生のために内乳組織の合成 能を利用する。遺伝子構築物はさらに、該構造配列の下流に、生成しつつあるｒ ｎＲＮＡのプロセシングを完了するための末端−プロセシングシグナル（＋ｅｎ ＋１ｎｌｌ−ｐｒｏｃｅ＆ｓｉｎｇ　１１ｇｎ５ｌ）を含有するＤＮＡセグメン トを包含している。

より詳細には、［末端−プロセシングシグナル」なる用語は、１ｎ−ｖ−リーで のｍＲＮＡの転写後過程の間に、前駆体ｍ　ＲＮ　Ａ分子がどの場所で切断され て、成熟ｍＲＮＡ種が生成され、翻訳されるべきかを指示するものとして認めら れているヌクレオチド配列を意味する。末端−プロセシングシグナルを含有する セグメントは、例えばα−アミラーゼ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤又は α−グルカナーゼの如き内乳発現産物をコードするｃＤＮＡを、同じ産物をコー ドするゲノムＤＮＡと比較することにより、該ｃＤＮＡの３′末端を同定するこ とによって得ることができる。上記３′末端のいずれか一方の側に５０〜１００ 塩基対を含むゲノムＤＮＡセグメントを単離すれば、確実に末端−プロセシング シグナルをもつセグメントが得られる。

〈制御要素／構造配列／末端−プロセシングシグナル〉融合体を作製するための 入手可能な慣用技術は、例えば５ｅｈｅｌｌ。

って記載されている。本明細書中、［制御要素（＋ｅｇｕｌａｌｏＢｅｌｅｍｅ ｎｔ）Ｊなる用語は、転写を行うＤＮＡ鋳型に沿ってＲＮＡポリメラーゼ酵素が 移動することに影響を与えることにより、構造配列の転写に影響を及ぼすヌクレ オチド配列を意味する。

好適な制御要素（本明細書中では「プロモーター」と称する）は、（ｉ）結合前 のＲＮＡポリメラーゼ分子とＤＮＡ鎖との間の初期認識部位、　（ロ）ＲＮＡポ リメラーゼ結合部位及び（ｉ　ｉ　ｉ）転写開始部位を含む。

上述したように、本発明に適する制御要素の発現は、特に内乳細胞内で強力であ るか又は該細胞に特異的であるべきである。

１−のよへな制御要素（」、も〜ばらアリニーロン組織中に見出されるかあるい は、葉及び根のいずれかの組織中の対応する量よりも約５０倍以上多い量で、あ る成長期又は活性期の内乳組織中に少なくとも存在するメツセンジャーＲＮＡ分 子（ｍｌｌＮＡ＋　）から調製されたｃＤＮＡを用いて得ることができる。この 種の例示的な好適プロモーターは低ｐＩα−アミラーゼ遺伝子用ブ２５９　：　 １２２３４−１２２４０　（１９８４）］　、］高ｐｉα−アミラーゼ遺伝子用 プロモーター人１１１Ｔ６−４）　［ＫｈｕｓｈｅｅｄとＲｏｇｅｔｓ、Ｉ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６３・１８９５３−１８９６０　（１９８８）］及び大麦チオールプロテア・ −ゼ遺より詳細には、内乳細胞から全ｍＲＮＡを単離し、ポリ（Ａ）ＲＮＡを選 択し、これを使用して例えばＲｏｇｅｔｓ、］、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ２６０：３ ７３１−３８　（１９８５）　［以下ｒＲｏｇｅ＋＋　（１９８５１ｊと称する ］により記載された公知方法による逆転写によってｃＤＮＡを調製することがで きる。Ｒｏｇｅ＋＋　（１９８５）の開示内容は参考として本明細書に含めるも のとする。内乳組織がアリューロン層由来のものである場合には、場合により、 アリューロン細胞をＧＡで長時間に亘り刺激する二とによりＧＡ感受性であ己制 御要素の調節下に転写され、従ってアリューロン細胞内でおそらく発現されるで あろうｍＲＮＡ種の含有量を増大させることによって、全ｍＲＮＡの単離段階を 行うことが可能である。

このようにして調製されたｃＤＮＡを用いて、例えば穀物（小麦、大麦、オート 麦、モロコシ、ライ麦、キビ及び米）、トウモロコシ、サトウキビ又はココヤシ の如き標的単子葉植物から得たゲノムＤＮＡをプローブし、ｃＤＮＡ中に現われ た豊富な数の内乳ｍＲＮＡ種に特徴的な構造配列を同定した。次に、構造配列の ５′末端に隣接するゲノムＤＮＡセグメントを単離し、遺伝子構築物中に組み込 む。この構築物中では、該セグメントは、例えばポリペプチドに出現するエピト ープを認識する抗体を用いて容易に検出し得る「マーカー」ポリペプチドをコー ドする構造配列と融合している。この種のゲノムＤＮＡセグメントは、長さが１ ５００キロベース（ｋｂ）のオーダーであり、本発明において制御要素として用 いることができるプロモーターを少なくとも含んでいると予想される。

作製された構築物は、マーカーの検出がゲノムＤＮＡから上述のようにして単離 されたセグメント中の適切な制御要素の存在を調べるためのアッセイとして使用 し得るように、単子葉植物を形質転換するために使用される。さらに、同じ基本 的手法を用いて、例えば従来起こり得なかったような分化をもつ大麦モルト（ｍ ｌｌｌｉｎｇ　ｂａ＋１ｅＨ）を識別することとの関係において変種を同定する ために、マーカーをコードする配列を植物体内に導入することができる。

より一般的には、上述したように植物形質転換体をスクリーニングするために非 抗生物質マーカーを使用することは、カナマイシン又はある種の他の抗生物質に 対する耐性に基づいて形質転換体をスクリーニングする慣用手法からの逸脱を示 す。後者の慣用手法は、抗生物質が導入される正確に規定された培地中で多数の 苗を成長させるために高価な且つ複雑な設備を必要とする。穀物植物がカナマイ シンのような抗生物質に対して高い固有の耐性をもつことは、形質転換体選択の 感度が低いこと及び誤った陽性率が高まることを意味している。

上述のような形質転換体のスクリーニングと組み合せて、アデニン及びシトシン 塩基におけるメチル化の存在に関して形質転換体をスクリーニングすることも好 ましい。比較的広範囲にわたる配列ＧＡＴＣ中のアデニンメチル化を特徴とする 形質転換体では、安定的に遺伝し得る形質転換性ＤＮＡが維持されることはほと んどないだろう。従って、挿入されたＤＮＡがアデニンのメチル化をほとんど起 こさないが、シトシン残基のメチル化をいくらか示す形質転換体が好ましい。こ れらのメチル化酵素を用いることによって容易に評価される。

本発明による、単子葉植物を形質転換するための好適手段は、標的植物の花分檗 枝（ｆｌｏｒａｌ’　１ｉｌｌｅｎ）中に構築物を注入し、次いで被注入分票技 によって産生された形質転換種子をスクリーニングすることを伴う。この手法に よれば、遺伝子構築物を含有する水溶液のアリコートを、開化前であるが減数分 裂後に、成長しつつある各花序（ｉｎｌｌｏ＋ｅｓｃ！ｎｃｅｌ上部のくぼみ空 間（ｈｏｌｌｏｗ　＋ｐａｃｅ）内に注入する。このとき総注入量は一般に３０ ０μｌである。この方法で注入した後、花分檗技を成熟するまで成長させ、自家 受精によってか又は、自己不和合性の事象内での他の被注入分票技を用いる他家 受粉によって種子を産生させる。この手法により、内乳組織内で外因性ＤＮＡを 発現する遺伝学的に改質された植物の、本明細書中に記載の選択法による、開発 を可能にするのに充分な形質転換出を達成できる。

形質転換技術を使用したものは全て、最初に種子を胚含有部と、胚に対して遠位 にあり種子の約２０％を示す頂端部（ｔｉｐｐｏ＋１ｉｏｎ）とに分離すること によって、推定される形質転換体由来の種子を外来ＤＮＡの発現に関してテスト することができる。後者の頂端部を適切な培地中でインキュベートした後、例え ばＥＬＩＳＡ型アッセイによって分析し、外因性構造配列によりコードされるポ リペプチドの存在を検出する。

所望の発現産物が検出された場合には、種子の胚含有部を植えて、外因性構造配 列を発現する内乳組織を含む種子を最終的に産生じ得る分化した単子葉植物を得 ることができる。慣用の植物繁殖技術により、所望の外因性ＤＮＡ配列を同型接 合体条件下で出現させることができるし、また該ＤＮＡ配列を次の世代に受継が せることも可能である。本発明の好適実施態様では、このような複数の形質転換 種子を播いて、部分（ｓｔａｎｄ）のほとんどの又は全ての植物が所望の外因性 タンパク質を含む種子を産生させる程度に実質的に均質である植物、好ましくは 穀物植物、の部分又はその植物集団を得る。これらの植物を収穫し、他の通常の 農業操作の過程で種子から所望のタンパク質を抽出することができる。

あるいは、本発明の形質転換種子は、適切な培地中で培養するための内乳細胞源 として使用することができ、培養細胞によって合成され分泌された所望のポリペ プチドを培地から抽出することができる。例えば、内乳組織を単離及び培養する ための技術は、ＹｏｍｏとＶａｉｎｅ＋、ＣＬＩＲＲＥＮＴ　ＴＯＰＩＣＳ　Ｉ Ｎ　ＤＥＶＥＬＰＯＭＥＮＴ人ＬＢＩＯＬＯＧＹ、ｌ１ｌ−４４（＾ｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐ＋ｅｓｓ　１９７１）　（アニューロン組織）及び２１（＾ＮＤＢＯＯ Ｋ　ＯＦ　ＰＬＡＮＴ　ＣＥＬＬ　ＣｔｌＬＴＵＲＥ第３章（ｋｔａｃｍｉｌｌ ａｎ１９８４）　（、澱粉質の内乳組織）により証明されるように、昔から入手 可能であった。

本発明に使用され得る構造配列の範囲は、合成配列に加えて、植物により通常産 生される産物をコードする遺伝子又は遺伝子部分を包含する。このような産物の うち典型的なものは、西アフリカ産植物Ｔｈａｕｍｘｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｎ ｉｅｌｌｉｉの果実の仮種被中に見出されたタンパク質タウマチンｆｌｈａｕｍ ａｌｉｎｌ　である。このタンパク質は、最も甘いものとして知られている物質 であり、食品添加物として市販されている。同様に、有用な洗剤成分である種々 の細菌及び糸状菌プロテアーゼをコードする構造配列は本発明による使用に適し ている。

より一般的には、様々な原核生物源及び真核生物源からクローニングされた構造 配列もまた本発明による使用に適している。

このようなりローン化配列の具体例は、インシュリン、ウシ及びヒト成長ホルモ ン、エリスロボエチン、心房性ナトリウム利尿因子、種々のコロニー刺激因子（ Ｍ−ＣＳＦ　、Ｇ−ＣＳＦ、　ＧＭ−ＣＳＦ１インターロイキン−３など）のよ うなホルモン；上皮成長因子、インシュリン様成長因子−１及び−２、神経成長 因子、形質転換性成長因子−α及び−β、血小板由来成長因子のような他の成長 因子及び制御因子：インターフェロンタンパク質Ｉ　ＦＮ−α及びＩＦＮ−β； 並びにインターロイキン−１α、インターロイキン−１β及び組織腫瘍壊死因子 のようなモノカイン、又はインターロイキン−２及びＩＦＮ−γのようなリンホ カインとして分類されるタンパク質、をコードするものである。

形質転換されたアリューロン組織を産生ずるために本発明により使用される、外 因性ポリペプチドをコードするＤＮＡはグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）塩基 に富んでいるべきであり、そのセンス配列内では、そのＤＮＡ配列から決定され るように、ＤＮＡの（Ｇ　＋　Ｃ）含量は５０％を超え、好ましくは６０％〜６ ５％の範囲である。この要求を満たす構造ＤＮＡの種類としては、実際試験され た全てのｃＤＮＡ及び、アリューロン組織内で発現される天然遺伝子を示すゲノ ムクローンが挙げられる。

参照のこと。無傷の形態において（Ｇ　＋　Ｃ）含量に富んでいない他の真核生 物ＤＮＡ及び原核生物ＤＮＡに対しては、天然遺伝子のポリペプチドをコードす るが、（Ｇ　＋　Ｃ）含量が５０％以上、より好ましくは６０％〜６５％に増加 するように改変された合成又は突然変異ＤＮＡセグメントを得ることができる。

ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント配列は、例えばライスコンシン大学 遺伝子コンピューターグループから入手でを使用して改変され、同じポリペプチ ドを依然としてコードしつつ（Ｇ＋Ｃ）含量を増加させることが可能である。所 望のポリペプチドコードＤＮＡ配列が一旦決まると、クローン化ｃＤＮＡもしく はゲノムＤＮＡの突然変異によって［例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯ ＬＳ　ｌｉｔ　ＭＯＬＥＣＵＬ人Ｒ［１ｌＯＬＯＧＹ、第８章（＾ｕｔｅｂ＋１ ら編、１９１１９）参照〕、あるいは長い（＞１００塩基対）合成オリゴヌクレ オチドの連枯を介する合成によってコーＫ　？Ｐ　ｉＦＱ　本今嗟することがで きる。Ａｕ５ｅｂｅｌら、上記文献、第８．２．８〜８２１３頁参照のこと。

本発明により形質転換性アリューロン絹織中で使用される外因性ＤＮＡでは、好 ましくはそのアデノシン塩基がメチル化されるべきでない。従って、使用可能な 量の外因性ＤＮＡを産生させるために、アデニンをメチル化しないクローニング 系ヲ用いるのが好ましい。例えば、全ての腸内細菌は、すべてのＧＡＴＣ部位で アデニンをメチル化するいわゆるｄａｍ制限／メチル化酵素をもっている。この ため、野生型大腸菌株内で増殖する全てのプラスミドは、そのＧＡＴＣ部位が全 てメチル化されてイア−、。ｄａｍ−大腸菌株は、例えば（Ｇ　Ｍ　４８株とし て）　Ｓｌ＋ａｌｅｇｅｎｅ　（Ｌ！　］ｏｌｌａ、　Ｃ人）から市販されてお り容易に入手でき、本発明の外因性ＤＮＡのクローニングに使用し得る。

以下の例示的な実施例に関して、本発明をさらに以下に説明する。

実施例１ シグナルペプチド（つまり、プロタウマチンタンパクをラフな細胞質網状構造（ 小胞体）に移送することに関与する部分））：その峻熟々゛／バ々での最初の７ 個の７；、ノ酸とを除いた、プロタウマチンタンパクの暗号化用ヌクレオチド配 列を、骨格内８番目のタウマチンアミノ酸のコドンにおいて、シグナルペプチド 部分と、Ｍｏｎｄｙ　とＲｏｇｅｒｓ、Ｐｌａｎｌａ　１６９：　５１−６３　 （１９８６）（以後ｒｌＪｕｎｄ７とＲｏｇ！＋＋　（１９８６）　Ｊと称す） に記された。いわゆる「プロバブル　アミラーゼ／プロテアーゼインヒビター」 （ＰＡＰＩ）大麦タンパクの最初の７個のアミノ酸と、をコードする配列に融合 した。これは、マーカーポリペプチドをコードするＤＮＡを形成するためである 。

プロタウマチンｃＤＮＡを、Ｅｄｅｎｓ等Ｇｅｎｅ　１８：ｌ−１２（１９Ｂ２ ）　（以後ｒＥｄｅｎ＋　（１９８２１Ｊと称す）の方法によって生産されたプ ラスミドｐＵＲ５２ｇから、上記の目的のために得た。当該文献の内容は、本明 細書で援用する。プロタウマチン暗号化用ＤＮＡは、ｒ　Ｅｄｅｎｓ　（１９８ ２）Ｊ開示のヌクレオチド鎖から、慣用の方法で合成できる。あるいは、ｐｔｌ Ｒ５２８は、ユニリーバ・リサーチ・ラボラトリ−（ＶＩｘｚｒｄｉＢｃｎ、ネ ーゲルランド）から、得ることもできる。

（５′末端に）公知のα−アミラーゼ構造配列の上流にある穀物（大麦）ゲノム ＤＮＡのセグメントを付け、また（３′末端に）同じα−アミラーゼ配列のため のターミナルプロセッシング信号を含むもう１つのゲノムＤＮＡセグメントを付 けた（ブラケットした）上記マーカー鎖（ｒＪ　ＲＯ７３Ｊと示す）が組み込ま れた遺伝子構造生産用アブロー千法を、第１図に示す。

各構造にとって、調整要素（因子）を含むセグメントは約１５ｋｂの長さであり 、一方ターミナルプロセッシング信号を含むセグメントは約２１５ｂｐであった 。

第１図に示したように、例示構造Ｎｏ、　］ＲＯ８３は、プロモーター（ｒＡｍ ｙ３２ｂＡｍ上−ター」）を含むセグメントを取り込んだ。

そのセグメントは、ＲｏｇｅｒｓとｌＪｉｌｌｉｍａｎ、ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２５９゜１２２３４〜＋２２４０開示の、公知大麦α−アミラーゼ遺伝子の すぐ」−流に位置（７ていた。構造Ｎｏ、　］ＲＩ１７　（図示せず）は、構造 ＮＯ、ＩＲＱ８３と、付加的な実験目的用の外因性ＤＮＡとを含んでいた。

実施例２　遺伝的に装飾された単子葉植物の獲得と、形質転換糊粉組織のための 種子のスクリーニング外因性ＤＮＡの注入と形質転換の分析 第１図に応じて製造されたプラスミドＤＮＡの溶液（蒸留水中１０［１μｇ／ｌ 、全量３００μｍ）を、発育しつつある植物節のすぐ上に注入した。なお、その 構造が、５枚の葉をつけた若木中の３番目の葉にまたはそのすぐ上にあるとき、 上記注入は行った。それに対応する発育時間を形態学上の基準に基づいて、開花 前約２週間に調整した。

注入を受けた若木により生み出された種子を刈り取り、それらの個々を９６個の ウェルを持ったマイクロ滴下皿内のウェル内に入れた。タウマチン生産用のスク リーニングを行うために、各種子の、胚と反対側の先端（種の約１１５容量）を カットし、一対の皿の同一箇所に置いた。種の残りの４７５は、必要とされる利 用のため、つまり植物の発芽と成長のために、保存した。

小さい方の上記フラグメントを７０％エタノール（１分間）と０．２％硝酸銀溶 液（２０分間）とでそれぞれ殺菌した。次に、３０分間風乾した。各ウェルに、 インキュベーシヲンバッファ（２０＋ｎＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５，２） 　、１０ｍＭのＣＩＣＩ２．１０’ＭのＧＡ、１００μＭのロイペプチン、５０ μｇ／ｒａｌのカルベニシリン及び１２５μｇ／ｍｌのＦｏｎｇｉ＋ｏｎｅ　（ 登録商標）、ッまり菌類の生長を禁する抗生物質）の１００μｍを加えた。この ようなインキュベート条件下、糊粉層を活性化すると、激しくα−アミラーゼを 分泌した。

室温・湿潤雰囲気下でのインキュベートを、２．３日間続けた（種々の実験でイ ンキュベート時間が異なるが、これは結果にとって重要でない）。その後、９６ 個のウェルを持った「ドツトプロット」装置（Ｂｅｆｈｅｓｄａ　リサーチ　ラ ボラトリ−）中で、蒸留水で湿らされた（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｕｅｌ ｌ　、ニューノＡンブシャー製）ニトロセルロース膜を挟持することにより形成 された、マイクロ滴下皿のレプリカ上に、各ウェルから５０μｍアリコートを移 送した。すべてのサンプルをニトロセルロースにより濾過した後、個々のウェル をＴＢＳの１５０μｊで洗った。

ＭｕｎｄｙとＲｏｇｅ＋ｓ　（１９８６）の方法に従って、得られたウェスタン ドツトプロットを、抗タウマチン抗血清により認識された材料のための、酵素被 連結アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に供した（下記参照）。呈色反応に供したところ、 陰性対照は呈色を示さないか、非常にわずかの呈色しか示さなかった。

ウェスタンドツトプロットスクリーニングに用いるウサギ抗タウマチン抗血清を 生産するために、タウマチンＩとＨの混合物（以後「タウマチン」と示す）を、 シグマケミカルカンパニアルデヒドでｔＩＢｍｌ？−ラフウマチン■μ■は４５ つのアミノ酸位置で異なっており、ｐｉ’ｓがわずかに異なっている。

より具体的には、３ｍｇのウサギアルブミンを、０．４ｎｌの０，１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１１０，０５Ｍ　トリス−ＨＣｌ溶液（ＴＢＳ　；ｐＨ７，９）に溶かした。

これに、タウマチンが蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌの割合で溶けた溶液の４０μｍを 加え、２１ｍＭのグルタルアルデヒド（シグマケミカルカンパニー製）の１００ μ！を、１時間の間ずっと滴下し続けた。その試験管を１晩室温でインキュベー トに供し、次いで、架橋を受けたタンパクを、６時間４１／２ＣでＴＢＳの１１ に対して透析した。その後、１００μｇを含むそのタンパク溶液のある量を、Ｆ ＋ｔｏｎｄの完全アジュバントの同等量で乳化し、ニューシーラント白ウサギの 皮下の多数箇所に注入した。そのウサギに対して、２週間の間隔でＦ＋ｅｕｎｄ の不完全アジュバント中の抗原を用い、適した抗体力価が得られるまで免疫増強 した。

初期の実験では、得られた抗血清を、形質転換した種子のスクリーニングで、更 なる精製なしに用いた。後に、形質転換した植物により生産されたタンパクの、 ウェスタンプロット分析での非特異的バックグラウンドを最小化するために、抗 タウマチン抗体をアフィニティー精製した。

この精製は、５ｍｇのタウマチン／ｍｌシアノーゲン（ｃｙｓｎｏｇｅｎ）ブロ ム活性化セファロース４Ｂ（シグマケミカルカンパニー製）が充填されたタウマ チンセファ０−スアフイニテイー力ラムで実行した。そして、タンパクのカップ リングをその製造者の指示により行った。ウサギ血清は５６１／２　Ｃ，１５分 間で熱非活性化し、氷で冷却し、次いで室温で上記カラムに通した。流出液のＡ ２８０がバックグラウンドに消えるまでＴＢＳでそのカラムを洗った。具体的に は、吸収されたイムノグロブリンを、０．２Ｍのグリシン／ＭＣＩ　（ｐＨ２， ２）で流出し、ＴＢＳに対して透析し、その後−２０℃でアリコートとして貯え た。

バックグラウンドレベル以上に現われた前述のテストドツトに対応した種子の残 りを植えた。これらの種子の残りから育った植物が、約０．５〜１ｇの葉組織の 除去に耐えられるほど大きくなったときに、その部分を除去し、Ｄｅｌｌｘｐｏ ＋ｆｚ等、モレキュラーバイオロジーオブプラント：ア　ラボラトリ−コースマ ニュアル３６〜３７（コールドスプリング／１−バードラボラトリ−１１９８４ ）による方法に従って、ゲノムＤＮＡを単離した。次に、その単離されたＤＮＡ を制限酵素で消化し、電気泳動し、サザーンプロット分析のためにＺｅｌａｐｒ ｏｂｅ　（登録商標）ナイロン膜（Ｂｉｏ＋ｚｄ）に移した。これは、Ｅｄｔｎ ｓ　（１９８２）のタウマチンコード他用ｃＤＮ人から誘導されたプローブを用 いて、Ｗｂｉｌｌｉｅｔ等、Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５：２５ １５〜３５（１９８７）の方法によった。洗浄条件（０，ＩｘＳＳＣ−０，１％ 　ＳＤＳ、６５１／２　Ｃ）の十分厳格であり、対照ＤＮＡはプローブに融合し なかった。スクリーニングとサザーンプロットの結果を下の表１に示す。

表　１ スクリーン　植えられ　生育能　サザーンされた　た種子　のある　プロット 構造　種子の数　の数　種子の数　陽性の数一対の、代表的なサザーンプロット を、第２図に示す。これらは、平行したゲルからのものである。第２Ａ図と第２ Ｂ図では、ＤＮＡを、旧ｎｄｌｎとＥｃｏＲＩ（つまりブＯモーターー遺伝子− ター；ネーター配列（約２．４ｋｂ）を、周囲ＤＮＡから遊離するように、完全 な構造体から切断する制限酵素）で消化した。

第２　（’図）：、第２１）図では、ｒｌＮ八は社只■仁■番ＲＴで消化した。

植物ＤＮＡ中、これらの酵素に近づきやすいサイトの相対位置に応じて、異なる パターンを、これらの図は示すはずである。

上記プロットを、タウマヂンコード化配列プローブでま「融合した（第２Ａ図と 第２Ｃ図）。かかる膜を、０．０１５ＭのＮａＣ１１０、０００１５Ｍのクエン 酸ナトリウム１０．１％のＳＤＳ溶液の内で６５℃にて、広範囲にわたー〕て洗 浄した後、補強スクリーンに、−８０℃にて、２４時間さらしまた。得た膜を加 熱しく前述のバッファ中、１５分間）、その後、全プローブの除去を完全にする ために、補強スクリーンに、３日間さらした。

その後、その膜を、Ｒｏｇｅ＋＋と１Ｊｉｌｌｉｎｕｎ、！、［１ｉｏ１．　Ｃ ｈｅｍ、２５８　：８１６９〜７４　（１９８３）により記された「クーロンＥ 」に対応する低−ｐ■　α−アミラーゼｃＤＮ人から誘導したプローブで、再融 合した（第２Ｂ図と第２Ｄ図）。このｃＤＮＡはＡｍｙ３２ｂプロモーターを含 む低−ｐ■　α−アミラーゼゲノムクローンに９３％同等である。その配列の同 一性は３′非翻訳領域中で非常に保持されている。それ故、形質転換１．た植物 染色体に導入されたゲノム構造が完全であるなら、上記の酵素を用いて植物ＤＮ Ａから生じた制限７うゲメソトは、々ウマ千ンプローブ＾「クロー・７ＥＪｃＤ Ｎ＾の両方に融合するにちがいない。

上記プロットに用いられたＤＮＡは、［１］　ｒＧ１２Ｊ、つまり　１１７シリ ーズの形質転換体と、（１０個植えられた）Ｇ１２の種子から芽を出した４つの 後継植物の親植物（ｐ）　；　［２］　０８３シリ一ズ形質転換体からのｒｌＯ ＤＩＪとｒ１２Ｈ２Ｊとで示される２つの植物；及び［３コ他の植物のそばで生 長したが形質転換されていない植物（Ｃ）からのものである。全ての例において 、「クローンＥ」を有する内在性アミラーゼ遺伝子の予期した融合は観察され、 適切な量のＤＮＡがフィルターに実際に存在することが示された。しかし、対照 植物からのＤＮＡはタウマチンプローブに融合しなかった。

そのＧ１２親植物と２つの後継植物、Ｎｏ、２とＮ０１７と、植物１０Ｄｌと１ ２Ｈ２とは、全て、タウマチンとクローンＥプローブの両方に融合したフラグメ ントを持ったＤＮＡを生み出した。かくして、これらの植物は形質転換体であっ て、外因性ＤＮＡは第２世代に遺伝することがわかった。

２つの０８３シリ一ズ形質転換体（ＩＯＤＩ　と１２Ｈ２）と、　１１７シリー ズ植物Ｇ１２からのＦ２世代植物（ｒｃ；　＋２−２Ｊ　）とからの種子をテス トした。各植物において、８５個の糊粉層、更に形質転換していない対照物から の層を、「３５Ｓコメチオニンで２４時間ラベルした。タウマチンに遺伝的に関 連する糊粉タンパクを個々の抗タウマチンーセファ０−スアフィニティー力ラム 上の培地から選び出した。

これらのタンパクを、２つの異なる電気泳動システムで連続的に分析した。まず 、それらタンパクを、５μｇのタウマチンマーカー（Ｔ）、対照タンパク、Ｔ、 、ｌ０ＤＩ　、Ｔ、　ＧＩ２−２、Ｔ、１２Ｈ２、Ｔ、Ｔの順で、酸−尿素ゲル 上に載置した。ピロニンＹマーカー色素がゲルの底に達したとき、ゲルを、最も 右の２つのＴマーカーレーンの間で鉛直に切断した。その１つのＴマーカーレー ンを、ポリビニルジフルオライド（ｐＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｏｌｏｎ　［登 録商標］、ミリボア社製）上に、電気プロットし、そのタンパクの位置を同定す るために、クーマシー（ＣｏｏＩＩｘｓｓｉｅ　）ブルーで着色した。そのマー カーレーンの様子を、第３図の左側に示す。そこでは、電気泳動の方向に対応す る配置は、トップが（＋）で、底が（−）である。タウマチンマーカー（シグマ ケミカル社）は、２つの少量成分の先に、電気泳動する主成分を持った、３つの 異なるタンパクを常に含んでいた。

前記ゲルの残りの部分を　（＆）と（ｂ）で示す２つの部分に切断した。（ａ） は、主マーカーバンドの線跡部と２つの少量成分とを含むｌａｗを有し、（ｂ） は、主マーカーバンドとその直前のゲル部分とを含む１ｃｍを有する。次に、こ れらのストリップの各々を、適切なバッファで平衡状態とし、標準ドデシルサル フエイトーポリアクリルアミドナトリウムゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の長い１つ の水平ウェルに置いた。そのストリップ内のタンパクを電気泳動しく（−）から （＋）方向）へ、それらを分子量によって分離した。

別々のウェル内における上記ストリップの、サイド上のどちらかに、タウマチン マーカー（左側）と、異なる分子量の５つの他のマーカータンパク（右側）とを 置いた（そのパネルのいずれかのサイド上の数値は、これらのマーカーの分子量 をキロドルトンで示したものである）。

マーカーがゲルの底に達したときに、電気泳動を終了し、ゲル内容物をＰＶＤＦ 膜に電気プロットした。そこでのタンパクをクーマシーブルで着色し、次いで、 新しく合成したタンパクをオートラジオグラフィーで同定した。

筐３（ａ）間、、Ｉ−填３（ｈ）図の各々は、着色膜（上）とそのオートラジオ グラフィー（下）の代表例を示す。マーカータンパクの位置は、オートラジオグ ラフィーに示される。これらの位置は、上記膜からの適切なバンドを切断し、Ｘ −線フィルム（図示せず）に再露出することによって確認した。（ａ）では、酢 酸−尿素ゲル内でより陽極側に移動する、２つの少量タウマチンマーカーバンド は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でのタウマチン（２２ｋｄ）の塊と大きさは区別できな い。（各々ｒｔＪで示される）これらレーン内の唯一の着色タンパクバンドは、 そのマーカーと共に移動するからである。この結果は、そのバンドは、異なる全 電荷量を持つが実質的に同じ分子量を持ったタウマチン種を示したことを意味す る。つまり、「タウマチン」はわずかに異なった形態の混合物であるという前述 の事実に照らして、予想通りの結果を示している。

上記オートラジオグラフィーによれば、＋２８２サンプルは、タウマチンマーカ ー（矢印）と同様に電気泳動した、ラベルされたタンパクを含んでいることがわ かる。このタンパク（約２２ｋｄ）は、対照（Ｃ）　、ｌ０ＤＩ　、Ｇ１２−２ サンプル中には存在しない。

この〜Ｂｋｄ　Ｉ’ｌＨ２タンパクの特異性の更なる証拠が、糊粉組織内で合成 されたが分泌されないタンパクを分析することによって、得られた。タウマチン は、蓄積（貯蔵）タンパクであり、糊粉細胞中のタンパク質体中に蓄積すること が期待され得る。従って、対照植物（Ｃ）と１２Ｈ２とからの、それぞれ２００ 個の胚がない半（ハーフ）種子からの糊粉層を、ｃ３５　Ｓ　］メチオニンとＧ Ａとの存在下４８時間インキュベートした。その培地を採取した後、糊粉層を蒸 留水で洗浄し、次いで、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライドと　１ ００μＭのロイペプチンと２％の不溶性ポリビニルピロリドンとを含む、２０ｍ １のＴＢＳ溶液（０，１５ＭのＮ　ａ　Ｃｌ　１０．０５Ｍのトリス−Ｉ（ＣＩ 、［ｌＨ７，９）中で、組織ホモジナイザで均質化した。

そのサンプルを、ＴＢＳで５Ｑｉｌに希釈し、ＮＦ２［１に関して０．１％とし た。不溶性残渣を、デスク遠心器による１０分間の遠心分離により除去した。そ して、０．２５ｍ１の２０％ＮＰ４０（シェルオイル社による洗浄化合物）を各 」二清に加えた。回転シェーカー上、１．５ｆｌｌの抗タウマチンーセファ０− スと共に、４１／２Ｃで、各上清を一晩インキユベートした。その１ｍｌは、タ ウマチン−セファロースアフィニティーカラムへの吸着により選んだウサギイム ノグロブリンの約９１を含んでいた。ＴＢＳ−０，１％ＮＰ４０で十分洗浄した 後、そのカラムに特異的に固着するタンパクを、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ　 （ｐＨ２）で流出し、その後１０％のトリクロロ酢酸で析出させた。同様に、タ ンパクは、培地サンプルから選択した。

その析出したタンパクサンプルを、サンプルバッファ中に溶かし、２個の（次に 記す）セット中の酢酸−尿素ゲル上に置いた。その１つのセットには、各サンプ ルの２０％を連続的に入れた。これは、各々５μｇのタウマチンマーカーを含む ２つのウェルを伴っていた。２番目のセットは、いずれかのサイド上の空ウェル によってタウマチンマーカーから分離され、各サンプルの残り８０％からなる。

空気泳動後、上記ゲルを２つの中央タウマチンマーカーレーン間で鉛直に切断し た。サンプルの第１セツトを含むゲル部分をＰＶＤＦ膜上に電気プロットし、移 送したタンパクを可視化するため着色した。

このプロットのオートグラフィーによる代表例を第４Ａ図に示す。ゲルの残り半 分を、２つのストリップ状に水平に切断した。その一方のストリップｒｄＪは０ ．５ｃｍ幅であり、タウマチンマーカーの練込部分を含んでいた。他方のストリ ップｒｃＪは、ストリップｒｄＪのアノード側に隣接する０、５ｃｍのゲルを含 んでいた。ゲルのこれらの２つのストリップは、他のサンプルレーンには認めら れない、＋２８２抽出サンプルレーン中の目立った着色タンパクバンド２つを含 んでいた。

この２つのゲルストリップｒＣＪとｒｄＪを、５ＤＳ−ＰＡＧＥバッファで平衡 化し、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅ分析用２ｍｍ厚ゲルの長いウェル中に、 水平方向から、同時に入れた。ストリップｒｃＪを切断することによって、大麦 タンパクを含む４つのレーンのみを含ませた。ストリップｒｄＪは、大麦タンパ クと共に、４つのレーンにブラケットするタウマチンマーカータンパク含有ゲル 部分を、含んでいた。これらゲルストリップを含む長いウェルのサイドどちらか に、タウマチンマーカープロティン（左側）とタンパクマーカー混合物（右）と を含む単一ウェルがあった。

電気泳動の後に、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのタンパクをＰＶＤＦ膜上に電気プ ロットし、タンパク呈色とオートラジオグラフイーによって可視化した（第４Ｂ 図）。両ストリップ中の１２Ｈ２抽出物からのレーンが、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の 多重バンドに溶けているタンパクを含むことが観察された。ストリップｒｄｌ中 −着色（矢印）によって可視化された主タンパクバンドは、内部タウマチンマー カー（１）と同様に電気泳動した。

オートラジオグラフィーで、このタンパクバンドをｃ３５ｓ］メットでラベルし た。フルオログラフィーに長くさらすことによって、同一サイズのかすかなバン ドカ月２８２培地レーン中が可視化したが、対照レーンではそうでなかった。こ の結果は、第３図に関連して記述された観察結果と一致している。このストリッ プからの全シノーンは、はぼ同等量の、ラベルされたタンパク（＞＋６ｋｄ）を 有していた。対照レーン中ラベルされた他のタンパクがないのは、不適切（不十 分）なサンプル充填に起因していないことを示している。ストリップ「ｃ」中の １２Ｈ２抽出レーンは、タウマチンマーカー（矢印）と同様に、電気泳動した標 識タンパクを含んでいた。

これらの結果によって、損傷を受けていない組み換え遺伝子を明らかに有する植 物、１２Ｈ２は、糊粉層中でタンパクを合成する種子を生み出したことがわかる 。なお、そのタンパクは、電荷に関してはタウマチンに大変似ており（酢酸−尿 素ゲル電気泳動での評価）、大きさに関しては区別不能である（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ上での評価）。糊粉組織内で観察された様子（発現）は、組み換えタウマチン 構造配列に融合したアミラーゼプロモーター配列から予期できるであろうもので ある。その後者の配列によってコードされたタンパクは、抗タウマチン抗体によ り認識され、対照糊粉層からの抽出物中には存在しない。これらの同一特性を有 する、新しく合成されたタンパクは、１２Ｈ２糊粉層からも分泌された。

実施例３．大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の形質転換植物検出のための マーカーとしての使用図５にプラスミドＪ　ＲＩ２４　、Ｊ　Ｒ１２９及びＪＲ １３３の構築をスキームとして示す。ＪＲＩ２４構築物（図５Ａ）においては、 大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコード配列がＲＮＡプロセッシング／ ポリ（Ａ）付加に対するＡｍＹ３２ｂ　３’配列とＡ　ｍｙ３２　ｂプロモータ ー／上流配列によってはさまれている。

ＪＲＩ２９構築物（図５Ｂ）においては、該プロモーター／上流配列及び大麦遺 伝子アリュレイン（Ａｌｅｕｒｇｉｎ）のコード配列の一部をＧｔＪＳコード配 列に融合した。ＪＲ１３３構築物（図５Ｃ）においては、ＧＵＳをコードする配 列を大麦α−アミラーゼ遺伝子、Ａｎｙ　６−４のＮ−末端コーディング配列に 融合した。

完全な構築物は融合したコード配列をＲＮＡプロセッシング／ポリ（Ａ）付加に 対するＡｌ１１７６−４上流／プロモーター領域とＡｎ＋７６−４３’配列との 間に含む。双子葉植物のアゲロバクチニウム−誘導形質転換体中でのＧＵＳの使 用例がＪｅｌｌｅｒ＋ｏｎら実施例２に記したと同様に、大麦の芽（ｌｉｌｌｅ ＋＋ｌ　に精製ｌ、たプラスミドＤＮＡ　（蒸留水中、　１００μｇ／ｍｌ）を 注入した。

ＧＵＳ活性のスクリーニング： 実施例２に記したと本質的には同様に、スクリーニング用の種子を調製した。ス クリーニングすべき穀粒をカミソリの刃で切断して植物の胚の反対側の穀粒の端 を約１７５除去した。次いで、この種子の端部を９６ウエルのマイクロタイター 皿のウェル中に置いた。各種子の胚を含む残部を、後で使用するために、もう一 つの同形の皿の同一の位置に置いた。スクリーニングの開始にあたって、穀粒の 端部をまず７０％ＥｔＯＨで１分間、次いで０．２％Ａ、　ｇ　Ｎ　Ｏ３で２０ 分間洗浄し、マイクロタイター皿のウェルに該溶液を加え、適切に吸引すること によって滅菌した。次いで、種子の端部を滅菌組織培養フード中で完全に乾燥し て菌類の胞子が確実に死滅するようにした。

滅菌した種子端部を有する各々のウェルに、１［１０μｍの培養緩衝液（２０ｅ ＋Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ５，２）　、　１Ｇ−’ＭのＧ＾を含む１０ｍＭ のＣａ　ＣＩ　２．５０　ｕ　ｇ　／　ｍ　Ｉのカルベニシリン、及び１２０μ ｇ／ｉｆのアモホテリシンＢ　（Ｆａｎｇｉｘｏｎｅ、登録商標）］を加えた。

滅菌した種子端部及び対照用種子からの一部の端部（１２）の培養を、加湿チャ ンバー内で室温にて２日間続けた。

ＧＵＳ活性をアッセイするために、最終濃度１１１１Ｍまで、４−メチル−ウン ベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）を培養基サンプルに加えた。次 に、サンプルを室温で一晩、蒸発を防ぐために加湿雰囲気下でインキュベートし た。続いて、培養基サンプルを新しいマイクロタイター皿の同一位置のウェルに 移した。各ウェルの培養基に、５μｍの２Ｎ　ＮａＯＨを加え、静かに混合した 。得られた培養基を長波長（＞３００１１１１）ＵＶ先光上置き、陽性の場合、 青色の螢光を示した。Ｗ「！ｉｔｅｎ＃３フィルターを用いて写真をとった。

各々のウェルに、２５μＩの均一化緩衝液［５ｏｍｈ＋のＮａＰＯ３（ｐ）Ｉ　 ８）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０，１％ＮＰ４０．　０．１％サルコシル。

及び１でＶすＣを含む１−Ｉｕの７二二ルメチル７、ルーニルフルオリド（ＰＩ ＪＳＦ）　］を加えた。その後、アリューロン層の細胞を確実に分離するために 、各々の種子部分をテフロン棒で充分にすりつぶした。各々のウェルに追加の均 一化緩衝液（１００〜１５０μｍ）を加え、サンプルを室温で一晩インキユベー トした。続いて、各々のウェルから５０μｍの培養基を取り、上記と同じ＜　Ｎ ｇＯＲを加えた新しいマイクロタイター皿の同一位置に移し、モしてＵＶ先光下 検査した。

陽性の可能性を確認するために、各穀粒の残部を一晩浸漬吸収させ、植え付け、 実施例２に記したと同様にサウザンープロット分析に十分な量の葉ＤＮＡが生産 されるまで十分に大きく生長させた。

ＧＵＳスクリーニングアッセイでの陽性の結果の代表例二図６は、ＪＲＩ２４を 注入した芽からの種子のスクリーニングプレート＃２での培養基（図６Ａ）と抽 出物（図６Ｂ）を示す。

この結果は、ウェルＤ２は培養基、抽出物共に最も強い螢光を発することを示し 、一方ウエルＥ４も陽性の結果を与える。酵素培養プレートからアルカリ化及び 観察のためのプレートへ移すプロセスにおいて随伴する変動量のデンプン状物質 が、抽出物を有するブｌ、ｋ中の発光ウェルの原因となりうる（図６Ｂ）。これ らの発光ウェルはウェルＤ２およびＥ４（以下の図において、各々　＋２４−２ ０２及び２Ｅ４として示す）における青色の螢光と容易に区別しうる。

構築物ＪＲ１２９を注入した芽からの種子を同時にスクリーニングした。培養基 と抽出物サンプルでの陽性種子１２９−６８３についての螢光が同様に同定され たが、上記１２４陽性のもの（１２４−２Ｄ２及び２Ｅ４）よりも強度が弱かっ た。

図７は、組織抽出物のみについての構築物ＪＲ］３３を注入した芽からの大麦種 子端部の分析結果を示している（種子端部培養物からの培養基はスクリーニング しなかった）。ウェルＧ６゜Ｇ７．Ｇ８及びＧ１０（以下の図中では各々＋３３ −２０６．２Ｇ？、２Ｇｌｌ及び２ＧＩＯと呼ぶ）は、対照の種子（Ｅ　１−７ ）及び空のウェル（Ｆ　５−１２）からの抽出物を含むウェルと比較して、強い 螢光を発した。

スクリーニング陽性植物がインサートされた構築物を有することの証拠： 図８Ａは、ＧＵＳコード配列に由来するプローブを用いて、２つのＪＲ１２４構 築形質転換体、１２４−２１１２及び１２４−２Ｅ４　（Ａ）からのＤＮＡのハ イブリダイジングサウザンプロットの結果を示している。この２つの形質転換植 物からのＤＮＡは、Ｂ　ｘｍＨ■あるいはＥｃｏＲＩで、または両者の酵素の組 合せでダイジェストした。電気泳動、ナイロン膜への移行、及びハイブリダイゼ ーシヨンは上記と同様に行なった。その結果、ＧＵＳプローブは各々のＤＮＡ調 製物中で〜６．５ｋｂ　Ｅ　ｃｏＲＩフラグメントにハイブリダイズしたことが 判った。ＤＮＡが酵素の組合せでダイジェストされた場合、各々の形質転換植物 中でプローブは〜２、ｌｋｂフラグメント（矢印）にハイブリダイズした。これ は、もしオリジナルの構築物が大麦の染色体ＤＮＡ中で不変である場合に、その 構築物から予期されるとおりのことである。互↓Ｈ１でのＤＮＡダイジエスチョ ン（消化物）について、２Ｄ２植物中の２つのフラグメントがハイブリダイズし く〜１２ｋｂ及び〜２．５ｋｂ）、一方、植物２Ｅ４については、１つだけ（〜 ６５ｋｂ）のフラグメントが同定された。この知見は、大麦染色体中のインサー トされた遺伝子の部位及び／または最終配置が異なっていることと一致している 。対照植物からのＤＮＡは、この方法において、ＧＵＳプローブにハイブリダイ ズしなかった。

ＪＲ１２９構築物からのＤＮＡで形質転換した植物（ウェル６Ｂ３）に由来する ＤＮＡで行なった同様の実験において、ＧＵＳプローブはＢａｍＨＩ及びＥｅｏ ＲＴの両者のダイジェスト中において〜６．５ｋｂフラグメントを、またこの制 限酵素の組合せでダイジェストしたＤＮＡ中で〜２．１ｋｂフラグメントを同定 した。

これらの結果はオリジナルの形質転換構築物の構造と矛盾しない。

ＧＵＳスクリーニングアッセイを基に、７つの陽性が推定された形質転換種子（ ２Ｇ６．２Ｇ７．２Ｇ８．　２Ｇ１０．４Ｆ＋、　４ＧＩ及び５＾７）を発芽さ せ、サウザンープロット分析によりインサートされた遺伝子が存在しているかど うか調べた。図８Ｂは、同一のＧＵＳコード配列プローブでハイブリダイズした ＪＲＩ３３構築物の種々のダイジェストについての結果を示す。図８Ｂは、Ｈｉ ｎｄ■とＸｈｏＩの組合せでダイジェストした全ての異なるＤＮＡが〜７．３ｋ ｂのＧＵＳプローブにハイブリダイズしたフラグメントを与え、一方対照ＤＮＡ はこのフラグメントを含まないことを示している。同一サイズのフラグメントは Ｈｉｎ＋Ｉｍのみにより生成した。一方、Ｘｈｏｌはこの手法によって調製され た大麦ＤＮＡを切断しない。

この構築物で予快さねる他の制限酵素部位が存在することを確めるために、さら に２つの種子（２Ｇ７及び２ＧＩＯ）からのＤＮＡをさらにキャラクタライズし た（図８Ｃ）。これらの結果は、酵素−ＢｃｌｌもＤＮＡ調製物を殆ど切断しな いことを示しており、ＧＵＳプローブはＢｃｌｌで処理した各々の調製物中の非 切断ＤＮＡの高分子量不純物（ｓｍｃ　ａ　＋）にハイブリダイズした。このこ とから形質転換ＤＮＡが大きな大麦染色体ＤＮＡに組込まれ、弱いバンドを生成 するゲル中へさらに移動したであろう混入プラスミドＤＮＡを表さないことが判 った。

形質転換ＤＮＡは、大麦染色体ＤＮＡに組込まれる前に、それ自体の縦に並んだ リピートを生成したことを示唆している。この結果はタバコプロトプラストにト ランスフェクトしたＤＮＡ５：１０１〜１１３　（１９８６１を参照されたい。

２Ｇ７からのＤＮＡをダイジェストした結果とは対照的に、孤立２Ｇ１０からの ＤＮＡを同じ制限酵素（ＥｃｏＲＶ）によってゲイジ〒７トする七、里−のバイ ブ１１ダ／でパンｒのみが生成した。さらに、他の相違として、２Ｇ７に対する ＨｉｎｄｌｌＩとＢｃｌｌの組合せによるダイジェストは、大麦ＤＮＡ中の大部 分の部位を切断する上でＢｃｌｌが不能であることに一致する結果を与えた。一 方、２ＧＩＯに対する組合せによるダイジェストは、７、３ｋｂより少し大きい フラグメントと共に、〜２．２ｋｂのより小さいフラグメントを生成した。これ らの結果は、外来遺伝子が染色体ＤＮＡ中の種々の場所に組込まれた種々の形質 転換体で予期されることに対応している。

実施例４．　（Ｇ＋Ｃ）に富む、アリューロンー形質転換構築物によりコードさ れるフェノタイプの安定な遺伝図９は、タウマチン形質転換体１０Ｄ１及び１２ Ｈ２のＦ２世代の子孫に対する対照大麦ＤＮＡ　（Ｃ）のサウザンプロットのオ ートラジオグラフを示す。［遺伝実験に使用した全ての子孫は自己授粉産物であ る。コブロットはタウマチンプローブでハイブリダイズした。結果は、１ＯＤ１ 及び１２Ｈ２子孫が対照には欠損しているタウマチン形質転換マーカーの特徴で ある２、５ｋｂのハイブリダイズバンドを有することを示し、タウマチン配列は 安定に遺伝することが判った。さらに、少なくとも第３繁殖世代までは安定に遺 伝することを明確に示す試験を行なった（１０Ｄ１と１２Ｈ２については２世代 、そして実施例２に記載のＧＩ２植物については３世代）。

実施例５．　（Ａ＋Ｔ）に富む、アリューロンー形質転換構築物によりコードさ れるフェノタイプが安定に遺伝しないこと オリジナルのＤＮＡ調製物を“親”ＧＬＩＳ形質転換体、すなわち第一形質転換 体より作成した。親ＤＮＡは、植物が２つの芽をもち、小さい方の芽が約２ｇは どあると思われた場合に調製した。この段階で、第二の芽（最も小さいもの）を 取って、ＤＮＡ調製物のために使用した。第一の種子が成熟したとき、各々の形 質転換体、！２４−２Ｄ２及び＋３３−２Ｇ？　、−２Ｇ８、−２Ｇ１０、−５ Ａ７からの１２の種子を植えた。これらの種子はすべて、第一の芽（最大のもの ）に由来し、た。というのは、それらが最初に成熟したからである。なお、親か らのＤＮＡを引続いて、子孫−親プロット比較に先立ってさらに調製した。

ＪＲ１３３形質転換体　発芽した植物からのすべてのＤＮＡを分析した。発芽し た２Ｇ８からのただ１つの種子及びそれから生じた植物が陰性であった（データ は示していない）。

全ての２０１０の子孫及び親ＤＮＡのリピート調製物は陰性であった。オリジナ ルの２Ｇ８調製物を後続の調製物と比較した。

さらに、プロットはまた、２ＧＩＯ親ＤＮＡの２つの調製物をも含んでいた（図 １０）。この図は、２Ｇ８親株から最初に調製したＤＮＡが〜７．３ｋｂのＧＵ Ｓ−ハイブリダイズバンドを有し、他の３サンプルは陰性であることを示してい る。同様の分析を、２Ｇ７と５Ａ７の親株及び子孫のＤＮＡについて行なった。

２Ｇ７もしくは５　Ａ、　７の子孫ＤＮＡのいずれも〜７．３ｋｂのハイブリダ イズバンドをもたなかったが１．２Ｇ７＃３及び５Ａ７＃８の各々は、ＧＵＳに 強くハイブリダイズした小さい〜０．５−０．７ｋｂフラグメントをもっていた 。テスト植物の近傍で生育した植物からの対照ＤＮＡをプロット分析に含めたが 、常に陰性でありだ。

ＪＲ１２４−２Ｄ２系統：以前の結果に一致して、後で生長した組織から単離し た親ＤＮＡはハイブリダイズ配列を欠いていた（図１１）。子孫番号４．６及び ７は、ＧＵＳにハイブリダィズし５た見見ＨＩ一旦上り■ダイジェスト上のバン ドを有していた。子孫番号３及び５については、最も強いバンドが予期した２、 １ｋｂのサイズであり、子孫６及び７も大きいハイブリダイズフラグメントをも っていたつこの２．１ｋｂバンド“の強度は単一コピー配列として予期されるよ りも強いものであった。

これらの結果は、親植物で同定されたオリジナルの形質転換ＤＮＡが植物成長（ 進化）の過程で失われることを示している。

この損失は、成熟時に組織が陰性となる分裂細胞（有糸分裂及び細胞分裂の活発 な領域）で生じると考えられる。１３３シリーズでは、オリジナルの形質転換Ｄ ＮＡの小さなレムナンドが２つの子孫として同定されたが、元のままの構築物は 全く存在していなかった。　１２４−２０２については、該ＤＮＡはまた、親株 から失われていたが、いくつかの子孫はＧＵＳにハイブリダイズした大きなフラ グメントを保持していた。全ての子孫は遺伝子再配列の証拠を示しており、２つ の子孫がマーカー遺伝子の多重コピーを有することが判った。

ＪＲ１２９形質転換体：ＧＵＳマーカーＤＮＡはまた、親株から失われており、 テストした子孫は全て陰性であった。

不安定に形質転換された植物中のハイブリダイズＤＮＡの分析二安定性に関する 結果を確かめるために、ハイブリダイズＤＮＡの構造とメチル化パターンを、ｃ 　ｕ　Ｓ−ｍ性の１３３−シリーズの麹株七多重コピーを右すＡと甲わねろ　！ ２４−４１’１２１ｇ　ｎｕ＋、　（＝ついて分析した。これらのメチル化パタ ーンを次に、タウマチンマ・−カーについて陽性であるＦ　及びＦ３世代の植物 由来のものと比較した。さらに、２Ｇ７＃３及び５Ａ７＃８で同定された小さい ハイブリダイズフラグメントの構造を分析した。

まず、２Ｇ６中の１３３−シリーズのＧＵＳ−陽性親ＤＮＡフラグメントのメチ ル化パターンを決定し、次いでＪＲＩ３３プラスミドＤＮＡの里相体遺伝子あた り〜３コピーでスパイクした対照ＤＮＡの同量と比較した。同じ認識部位を有し くいわゆるアイソンゾマー）、その部位の残部のメチル化に対し異なる応答を示 す複数の制限酵素を使用した。２Ｇ６について（図１２Ａ）、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ は〜７．３ｋｂバンドを生成し、このバンドはＨｉｎｄｌＩＩ＋ＭｂｏＩでのダ イジェストを続いて行なっても同じサイズのまま残った。反対に、ＭｂｏＩのア イソシゾマーであるＳｇｕ３ＡＴは予期した５００　ｂｐのハイブリダイズフラ グメントを与えた。

との組合せダイジェストでは、５ａｕ３ＡＩフラグメントはさらに小さいフラグ メントに開裂した。図１２Ａの結果は、２Ｇ６においてはメチル化されていない ことを示している。

ダイジェストしていない２Ｇ６．４Ｆ１及び４Ｇｌ中のＧＵＳ−ハイブリダイズ ＤＮＡはゲルの最上部に高分子ＤＮＡと共に残っていた（示していない）。この 結果は図８０の２Ｇ７及び２Ｇ１０でのデータと一致している。図１２Ｂは、Ｍ ｂｏｌが２Ｇ８．４Ｆ１及び４Ｇｌ中のＧＵＳ〜ハイブリダイズフラグメントを 解き放ち、各々、〜１５ｋｂ及び〜７ｋｂのフラグメントを与きいフラグメント の損失をもたらし、各々〜２００　ｂｐのハイブリダイズフラグメントが生じる 。ただし、４Ｆ１は弱い〜ｌｋｂのハイブリダイズフラグメント（レーン５及び ６）を有し、いくつかのシトシン残基がメチル化されたことを示している。

これらの結果は、テストした全ての１３３親ＤＮＡが、未切断時にゲル電気泳動 で染色体ＤＮＡから分離できない高分子量型で存在するマーカーＤＮＡを有する ことを示している。また、Ｎ−６メチルアデニン感受性酵素、Ｍｂｏｌ及びＢｃ ｌｌは、限られた数の部位だけを切断した（恐らくは、他の部位がメチル化され たため）。ＭｂｏＩは高分子量体からマーカーを解き放ち、各々の例で２つの弱 いフラグメントを与えるため、マーカー配列を取り囲むメチル化の定まった構造 的特徴（トポグラフィ−）が存在する。さらに、２６６中の７．３ｋｂ　Ｈｉｎ ＋ＩフラグメントはＭｂｏｌにより切断されないという事実は、大きいフラグメ ントを解き放つ部位がマーカー配列の外部のフランキングＤＮＡ中にあることを 示している。５−メチルシトシンに感受性の２つの酵素はマーカーＤＮＡを極度 にダイジェストすることができるが、４Ｆ１でみられたような小さな弱いフラグ メントの存在は、い（つかのシトシン残基がメチル化されていることを示しイジ ェストすることなく電気泳動にかけたとき、バルクの染色体ＤＮＡから分離する ２つの大きなフラグメント上に存在し、た−ジョンパターンからサイズ的に区別 できなかった。これらの結果は、大きい方のバンドが、ＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＥｃ ｏＲＩでダイジェストすることにより放出される７ｋｂのハイブリダイズ配列の １１ピー１から成−アいろ、７）−を示１．．ている。、：れらの７ラグメント はＭｂｏＩ抵抗性であるが、ＨｐａＩＩ又はＭｓｐｌのいずれかによって見かけ 上完全にダイジェストされた（示していない）。

２Ｇ７＃３及び５Ａ７＃８中の小さいＧＵＳ−ハイブリダイズフラグメント。

図１３Ｂは、ＧｔＪＳ−ハイブリダイズフラグメントがダイジェストされていな い染色体ＤＮＡを含まず、そのサイズがＢａｆｆ１Ｈ１もしくはＥｃｏＲＩのい ずれでダイジェストしても変らないことを示している。

タウマチンマーカーにハイブリダイズするＤＮＡフラグメント中のメチル化の分 析： Ｆ　植物、Ｇ１２−２−８及びＦ２植物、１２Ｈ２−４からのＤＮＡ中■を用い て行なった（図１４）。制限酵素の組合せてダイジェストした両者のサンプルに ついて、２．５ｋｂのハイブリダイズフラグメントが生成した。引き続いてのＨ ｉ＋＋＋Ｉｍ及びＥｃｏＲｒ＋Ｍｓｐｌでのダイジェストによって、この２．５ ｋｇフラグメントは全くダイジェストされなかった。これらの結果は、ＧＵＳ− 陽性フラグメントについて得られた結果と実質的に異なっており、ターゲットＤ ＮＡ中のＭｂｏ１部位のかなりの部分がその酵素にアクセスでき、一方Ｍｓｐ１ 部位は少なくとも部分的にブロックされていたことを示している。

より一般的には、これらの結果は、安定に遺伝する形質転換タウマチン遺伝子は 大部分の大麦ＤＮＡで予期されるメチル化パターンを有すること、つまり、アデ ニンのメチル化は殆どなく、いくらかのシトシンのメチル化があるということを 示している。反対に、不安定なＪＲＩ３３シリーズの形質転換遺伝子は、見かけ 上染色体ＤＮＡに組み込まれたようにみえても、ＧＡ、ＴＯ配列が生じた６−メ チルアデニンの存在によってマークされ、シトシン残基のメチル化は殆ど見られ ない。不安定な形質転換遺伝子が失われるにつれて、染色体ＤＮＡがなく種々の 欠失が認められる中間形態が同定できた。

一時的な発現は、このように徹底的なアデニンのメチル化によって特徴づけられ る組込みＤＮＡを用いて有効に行なわれた。

しかし、遺伝的に安定な組込みはこのメチル化が最小である場合に達成された。

この原理は、他の遺伝子の選択又は設計において、本発明による安定な発現に適 用できる。

実施例６．　他の穀類（オートムギ）の形質転換（セントルイスのＭｚｎｇｓｌ ｘｄｏｒｆ　５ｅｅｄ　Ｃｏｍｐｕｙから入手した）種子由来のオートムギの芽 に、実施例２でオオムギについて述べたと同様にＤＮＡを注入した。５枚の葉が 出た段階で、かつ、つぼみがほぼ３番目の葉のレベルで触って判るときに、オー トムギの芽に構築物ＪＲ１３３からのＤＮＡを注入した。その後、実施例２でオ オムギについて述べたと同様に種子をスクリーニングした。図１５は、プレート ４（抽出物のみのスクリーニングを示す）、プレート５（培養基のみのスクリー ニングを示す）及びプレート６中の種子についてのスクリーニング結果を示す。

図１５Ａ及び図１５Ｂは、各々、培養基のスクリーニング及び抽出物のスクリー ニングの結果を示している。これらの結果は、培養基及び抽出物の双方において 、ウェル６Ａ４中の種子が形質転換ＤＮＡの存在を示す強い陽性の螢光シグナル を発する一方、他のウェルは陽性のシグナルを与えないことを示している。

ＦＩＧ、ＩＡ υＰ１１４噂（・Ａ−マ　ｌ′ｆｌ　へ　°Ｂ゛ＦＩＧ、１Ｂ ＦＩＧ、１Ｃ ＦＩＧ、２ ０．７− ＦＩＧ、４Ａ ＭＥＭＥ　ＴＭＥＭＥ ＦｌＧ、４Ｂ ＦＩＧ、　５Ａ（１） ＦＩＧ、５Ａ（２） ＦＩＧ、　５Ｂ（２） Ｅ］７リユレＡ−／−＆ＩＪＳ剤九后〉ηの＄１骨之ＦＩＧ、　５Ｇ（１） ＦＩＧ、　５Ｃ（２） ＦＩＧ、　５Ｃ（３） ＦＩＧ、　６４ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、Ｈ □工８へ−、〜−６゜−一−４＾゛ ′＞　％　。

ロ　−　−ゝ ＦＩＧ。１３ ＦＩＧ、Ｉ４ 国際調査報告 １＝”１１１ａ−ＡｌｌＩＮＩＩ１４’ｌ町ＰＣτ／ＵＳ８９１０３１９２国際 調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．遺伝的に形質転換された内乳組織からなる種子を獲得する方法であって、前 記方法は、 （Ａ）（ｉ）内乳細胞中に高いレベルで発現される制御要素；（ｉｉ）前記制御 要素の転写コントロール下にある、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの ＤＮＡ配列；及び（ｉｉｉ）転写方向に関してＤＮＡ配列の下流に位置する末端 −プロセシング信号；からなる遺伝構築物を作成し、 （Ｂ）穀物植物の開花前に前記植物の花分蘖に遺伝構築物を注入し、その後、 （Ｃ）注入した植物からの種子について、前記種子の内乳中のＤＮＡ配列の発現 産物の存在をアッセイして、遺伝的に形質転換された内乳組織からなる種子を同 定することを含む前記方法。
2. ２．ＤＮＡ配列は５０％以上の（Ｇ＋Ｃ）含有量を有する、請求項１記載の方法 。
3. ３．ステップ（Ｃ）が発現産物を認識する抗体を用いて発現産物をアッセイする ことを含む、請求項１記載の方法。
4. ４．制御要素がＡｍｙ３２ｂプロモータ、Ａｍｙ６−４プロモータ及びＡｌｅｕ ｒａｉｎプロモータからなるグループから選択されるプロモータからなる、請求 項１記載の方法。
5. ５．ステップ（Ｂ）で注入される穀類植物が、小麦、大麦、オート麦、モロコシ 、ライ麦、キビ、コメ及びトウモロコシからなるグループから選択される穀物で ある、請求項１記載の方法。
6. ６．ＤＮＡ配列がタウマチンアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする、請求 項１記載の方法。
7. ７．ＤＮＡ配列がタウマチンアミノ酸配列の一部からなる融合産物をコードする 、請求項６記載の方法。
8. ８．ステップ（Ｃ）が種子について前記種子のアリューロン層中のＤＮＡ配列の 発現産物の存在をアッセイすることを含む、請求項１記載の方法。
9. ９．ポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ配列を発現すべく遺伝的に形質転換 された内乳組織からなる種子を産生する分化された単子葉植物。
10. １０．外因性ＤＮＡ配列が真核又は原核構造配列である、請求項９記載の植物。
11. １１．外因性ＤＮＡ配列は５０％以上の（Ｇ＋Ｃ）含有量を有する、請求項１０ 記載の植物。
12. １２．外因性ＤＮＡ配列が、（Ａ）天然に存在する遺伝子がコードするポリペプ チドをコードし、かつ（Ｂ）その（Ｇ＋Ｃ）含有量が天然に存在する遺伝子より も多い、請求項９記載の植物。
13. １３．外因性ＤＮＡ配列がタウマチンアミノ酸配列の少なくとも一部をコードす る、請求項９記載の植物。
14. １４．外因性ＤＮＡ配列がタウマチンアミノ酸配列の一部からなる融合産物をコ ードする、請求項１３記載の植物。
15. １５．発芽したとき、外因性ＤＮＡ配列を発現する内乳組織からなる種子を産生 する植物に生長する種子を産生する、請求項９記載の植物。
16. １６．種子が外因性ＤＮＡ配列を発現すべく遺伝的に形質転換されたアリューロ ン組織からなる、請求項９記載の植物。
17. １７．外因性たんぱく質を含む内乳からなる種子を産生する実質的に均質な単子 葉植物の集合体。
18. １８．植物が穀類植物である、請求項１７記載の植物集合体。
19. １９．植物が外因性たんぱく質を含むアリューロン組織からなる種子を産生する 、請求項１７記載の植物集合体。
20. ２０．外因性ＤＮＡのポリペプチド発現産物から構成される内乳を含む、単子葉 植物の種子。
21. ２１．ポリペプチドの産生方法であって、（Ａ）（ｉ）内乳細胞中に高いレベル で発現される制御要素；（ｉｉ）前記制御要素の転写コントロール下にある、ポ リペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列；及び（ｉｉｉ）転写方向 に関してＤＮＡ配列の下流に位置する末端−プロセシング信号；からなる遺伝構 築物を発現する遺伝的に形質転換された内乳組織を作成し、 （Ｂ）前記ポリペプチドを単離することを含む前記方法。
22. ２２．形質転換された内乳組織が形質転換されたアリューロン組織である、請求 項２１の方法。
23. ２３．ステップ（Ａ）が外因性たんぱく質を含む内乳からなる種子を産生する穀 物植物の実質的に均一な集合体を作成することを含み、ステップ（Ｂ）が種子か ら外因性たんぱく質を単離することを含む、請求項２１の方法。
24. ２４．ステップ（Ａ）がポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ配列を発現すべ く遺伝的に形質転換された内乳組織を培養基中に保持することを含み、ステップ （Ｂ）が培養基からポリペプチドを単離することを含む、請求項２１の方法。