DE102005035888A1 - Thaumatin aus transgenen monokotylen Pflanzen - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Thaumatin aus transgenen monokotylen Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe der Familie Poaceae, insbesondere der Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Secale, Pennisetum, Sorghum, besonders bevorzugt aus Kulturpflanzen, wie Weizen, Hafer, Roggen, Gerste, insbesondere Gerste, daraus erhältliche Extrakte und Produkte, insbesondere Mehl- und Malzprodukte, samt Nahrungs- und Futtermittel für Mensch und Tier.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Thaumatin aus transgenen monokotylen Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe der Familie Poaceae, insbesondere der Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Secale, Pennisetum, Sorghum, besonders bevorzugt aus Kulturpflanzen, insbesondere Gerste, daraus erhältliche Extrakte und Produkte, insbesondere Mehl- und Malzprodukte, samt Nahrungs- und Futtermittel für Mensch und Tier.
- Übergewicht und Diabetes haben dazu geführt, dass die Verbraucher in den Industrieländern verstärkt Produkte wählen, die „low-caloric" Süßungsmitteln enthalten. Dabei spielen gerade die „intense sweeteners" eine zunehmende Rolle (Gibbs B.F. et al. (1996) Nutrition Research 16 (9): 1619-1630; Faus I. (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 145-151). Anders als die Zuckeralkohole werden die Süßstoffe entweder nicht metabolisiert (z.B. Cyclamat, Saccharin) oder aufgrund ihrer im Vergleich zu Saccharose 200- bis 3.000-fachen Süßkraft in einer so geringen Menge zugesetzt, dass der Brennstoffwert zu vernachlässigen ist (z.B. Aspartam, Thaumatin).
- Derzeit werden weltweit hauptsächlich synthetische Süßstoffe in der Nahrungs- und Futtermittelherstellung eingesetzt. In zahlreichen Ländern gelten für diese jedoch Mengenbeschränkungen (ADI = Acceptable Daily Intake), um gesundheitlichen Nebenwirkungen vorzubeugen.
- Der natürliche Süßstoff Thaumatin, ein Proteingemisch aus der Katemfefrucht (Thaumatococcus daniellii) gilt dagegen als unbedenklich. Thaumatin (E959) ist entsprechend der verschiedenen Richtlinien zugelassen in der EU (94/35/EC; 95/2/EC, 2003/115/EG, 88/388/EC), Schweiz, USA, Kanada, Israel, Mexiko, Japan, Korea, Singapur, Hongkong, Australien, Neu Seeland und Südafrika.
- Thaumatin ist zudem klassifiziert als GRAS (Generally recognized as safe, Kriterium der FDA). Thaumatin ist ferner geprüft von JEFCA (Joint Expert Commitee on Food Additives of the FAO/WHO) sowie der European Safety Authority (EFSA) (Gibbs (supra); Faus I. (supra)).
- In der Frucht von Thaumatococcus daniellii konnten sechs Isoformen des Proteins gefunden werden, die allesamt süß sind (Thaumatin I, II, III, a, b, c). Thaumatin I und II stellen die Hauptformen dar, die sich lediglich in 4 Aminosäuren voneinander unterscheiden, und bestehen jeweils aus 207 Aminosäuren. Die dreidimensionale Struktur von Thaumatin I besteht aus drei Domänen, dabei zeichnen sich die Domänen II und III durch Disulfidbrücken-reiche Regionen aus. Insgesamt bildet ein korrekt gefaltetes Thaumatin 8 Disulfidbrücken (aus De Vos et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1985) 82: 1406-1409; Ogata et al., J. Mol. Biol. (1992) 228: 893-908; Masuda et al., Biotechnol. Bioeng. (2004) 85 : 761-9). Die jeweilig bekannten Preprothaumatine zeichnen sich durch eine N- terminale und C-terminale Verlängerung aus, die wahrscheinlich als Signale für die Kompartimentierung in der pflanzlichen Zelle fungieren. Genauere Untersuchungen liegen hier jedoch nicht vor (Van der Wel und Loewe, Eur. J. Biochem. (1972) 272: 14810-14816; Witty M., Biotechnol. Lett. (1990) 12: 131-136; Gibbs B.F. (supra); Faus I. (supra); Faus I. und Sisniega H. (2002) Sweet tasting proteins. In: Biopolymers, Steinbüchel A., Fahnestock S. (eds.); Kant R., Nutrition Journal (2005) 4 (5):1-6). Die Süßkraft von Thaumatin ist im Vergleich zu Saccharose 2.000 bis 3.000-fach höher (auf Gewichtsbasis, auf molarer Basis ca. 100.000-fach), die Süße von Thaumatin wird allerdings etwas verzögert wahrgenommen. Bei sehr hohen Konzentrationen kann Thaumatin, wie auch andere pflanzliche Süßstoffe, einen lakritzähnlichen Nachgeschmack haben (Faus I. (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 145-151). Zur Verbesserung des Geschmacks wurden verschiedene Mutanten hergestellt (Weickmann J.L., Lee J.H., Blair L.C. Ghosh-Dastidar P., Koduri R.K. (1989) In: Gremby T.H., ed, Progress in sweeteners, New York: Elsevier, Seiten 47-69;
EP 0396741 ,US 5221624 , WO 90/05775). - Die Hitzestabilität von Thaumatin hängt von der Matrix ab. Higginbotham berichtete, dass die Süße von Thaumatin I nach einstündigem Kochen und anschließender Abkühlung (auch bei einem pH unter 5.5) erhalten bleibt (Higginbotham J.D. (1986) In: Nabors L.O., Gelardi R.C., eds. Alternative Sweeteners, Marcel Dekker New York: 103-134). Thaumatin ist auf jeden Fall stabil unter pasteurisierenden Bedingungen (Gibbs B.F. et al., Nutrion Research (1996), 16 (9): 1619-1630.) In gereinigter Form aggregiert das Protein und verliert seine Süßkraft bei einer Temperatur von 70°C und einem pH von 7.0 (Kaneko R. und Kitabatake N., J. Agric. Food Chem. (1999) 47 (12): 4950-5). Thaumatin ist in gefriergetrockneter Form stabil, löslich in Wasser und Alkohol und daher geeignet für die Herstellung von Getränken.
- Neben der Süßkraft weist Thaumatin auch geschmacksverstärkende Eigenschaften auf (Gibbs et al., Nutrition Research (1996) 16 (9): 1619-1630;
US6420527 ). Es eignet sich daher hervorragend, um den Beigeschmack mancher Süßungsmittel zu überdecken und das Mundgefühl zu verbessern. Thaumatin wird zur Geschmacksabrundung von Zuckeralkoholen und Süßstoffgemischen zugesetzt (EP0681789 ,EP0847242 ,US6562392 ,US6555146 , WO09708958,EP0658340 , WO0106872,EP1198181 ). Zusätzlich wird Thaumatin unabhängig von der Süße auch zur reinen Geschmacksverstärkung von Saucen und Fleisch eingesetzt (Gibbs et al. (supra),US6420527 ). - Der Strauch Thaumatococcus danielli, aus dessen Früchten Thaumatin gewonnen wird, kommt in den Regenwäldern Westafrikas vor. Die Kultivierung dieses Strauches ist sehr schwierig, da die Pflanzen beschattet werden müssen und von bestimmten Insekten ausschließlich bestäubt werden. Im Feldanbau setzt daher nur ein Viertel der Pflanzen Früchte an (Faus (supra)). Entsprechend werden immer wieder Versuche unternommen, die tropische Pflanze Thaumatococcus daniellii effizienter zu kultivieren. Jedoch werden allerdings für die Produktion von Thaumatin hauptsächlich Früchte eingesetzt, die in den Wäldern gesammelt werden. Der größte Teil des Thaumatins, 20% bis 40% des Trockengewichtes, wird in dem Samenmantel der Früchte angereichert. Der cremigweiße Samenmantel befindet sich am Apex des Samens und ist von einem transparenten Gel umgeben. Die mechanische Trennung dieses Gewebes vom Samen ist relativ aufwendig.
- Thaumatin kann durch eine einfache wässrige Extraktion aus den Früchten gewonnen werden (Van der Wel und Loewe, Eur. J. Biochem. (1972) 31: 221-5). Durch Ultrafiltrationen oder Ionenaustauscher-Chromatographie kann eine weitere Reinigung von Thaumatin erfolgen (
US 4221704 ). Erschwert wird die Reinigung durch das Gel, das den Samenmantel umhüllt, da es bei wässriger Extraktion sehr stark aufquillt. Verschiedene Verfahren zur Vereinfachung der Reinigung von Thaumatin aus Thaumatococcus danielli sind bekannt. Durch Gefriertrocknung der Frucht lässt sich z.B. der Samenmantel einfacher entfernen, und mit Hilfe von Salzen oder Säuren wird das Aufquellen des Gels verhindert und Thaumatin effizienter extrahiert (US 4011206 ,US 4221704 ,EP0003911 ). Die herkömmliche Gewinnung und Anreicherung samt Isolierung von Thaumatin ist daher mit hohem Aufwand verbunden. - Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Thaumatin wird dieser Süßstoff bisher nur in sehr speziellen Produkten zugesetzt. Thaumatin eignet sich jedoch nicht nur zur Geschmacksabrundung von Süßstoffmischungen (z.B. in NATREEN: WO0106872,
EP1198181 ) sondern auch hervorragend für die Süßung von Getränken („soft drinks", Alkoholgetränke, Kaffee- und Kakaogetränke), Milchprodukten (Joghurts, Desserts), Süßigkeiten, Schokolade, Kaugummi und Kautabletten, etc. sowie als Geschmacksverstärker in Saucen und Diätgerichten. Thaumatin wird auch als Aromastoff Futtermitteln (hauptsächlich „pet food") zugesetzt (Etheridge K. (1994) In: Witty: M., Higginbotham J.D., eds. Thaumatin, Boca Raton: CRC Press, pp. 47-59, Tate & Lyle:GB2185674 US6251464 ,EP0929233 , WO9803082,US59324438 EP0684312 ). - Aufgrund der extremen Süßkraft der „intense sweeteners" werden diese nur in äußerst geringen Dosen eingesetzt. Dadurch haben sie den Nachteil, dass sie das Volumen von Zucker oder Zuckeraustauschstoffen nicht ersetzen können. Entsprechend werden für diätetische Produkte häufig Zuckeralkohole als Füllstoff eingesetzt, die mit Hilfe der Süßstoffe aufgesüßt werden. Jedoch können die Zuckeralkohole die Konsistenz und den Geschmack bestimmter Produkte (z.B. Backwaren) verfremden. Zusätzlich enthalten Zuckeralkohole Kalorien, so dass sie nur bedingt für die Herstellung kalorienarmer Produkte geeignet sind.
- Es besteht daher ein hohes Bedürfnis, Thaumatin biotechnisch herzustellen. Ferner besteht ein hohes Bedürfnis, Thaumatin als endogenes Produkt in Nahrungs- und Futtermittel für Mensch und Tier bereitzustellen.
- Im Stand der Technik sind bisher biotechnische Verfahren zur Gewinnung und Anreicherung von Thaumatin in verschiedenen Organismen bekannt. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit des Rohstoffmaterials wurden bereits verschiedene Versuche unternommen, Thaumatin biotechnisch in Mikroorganismen und höheren Organismen herzustellen. Nicht nur die Ausbeute sind in den meisten Fällen unwirtschaftlich niedrig, sondern das Thaumatin ist aufgrund geänderter Faltung nicht süß. Es ist bekannt, dass durch Anpassung der „Codon-usage" oder Herstellung verschiedener Mutanten, aktives Thaumatin in E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces levidans, Aspergillus awamori, Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lactis, Pichia pastoris, etc. hergestellt werden kann (Weickmann J.L., Lee J.H., Blair L.C. Ghosh-Dastidar P., Koduri R.K. (1989) In: Gremby T.H., ed, Progress in sweeteners, New York: Elsevier, pp 47-69,
US4891316 ,EP0003911 ,EP0054330 ,EP0096910 , WO8404538,US5221624 ,EP0396741 ,EP0255823 , WO9005775, WO8703007,US5932438 ,EP0684312 ). - Tabelle 1: Übersicht zu biotechnischen Verfahren zur Herstellung von Thaumatin in verschiedenen Organismen
-
- Die Idee, die natürlichen Süßstoffe Monellin und Thaumatin direkt in den essbaren Geweben höherer Pflanzen zu produzieren, wurde bereits von Fischer et al. 1992 veröffentlicht (WO9201790,
EP0540651 ). Monellin ist ebenfalls ein Protein aus einer tropischen Pflanze (Dioscoreophyllum comminsii), das einen intensiven süßen Geschmack vermittelt. In den Ausführungsbeispielen wurde gezeigt, dass in Tomate durch die Transformation mit dem Monellin-Gen unter Kontrolle des fruchtspezifischen E8-Promotors ein süßerer Geschmack in den Früchten erzielt werden kann. Desweiteren konnte in allen Geweben von Salat, der mit dem Monellin-Gen unter Kontrolle des konstitutiven CaMV35S-Promotors transformiert worden war, ein süßerer Geschmack nachgewiesen werden. Eine nacharbeitbare Offenbarung hinsichtlich transgener monokotyler Pflanzen, insbesondere Getreide, enthaltend Thaumatin ist dem Dokument jedoch nicht zu entnehmen. Ferner sind die offenbarten Promotoren ungeeignet Thaumatin in transgenen Getreide zu erhalten. Zudem lagen 1992 noch keine reproduzierbaren Transformationsprotokolle für die monokotylen Pflanzenarten vor (z.B. für Reis: Hiei et al., Plant J. (1994) 6: 271-82; zum Überblick: Christou P., Rice transformation: bombardment, Plant Mol. Biol. (1997) 35: 197-203; Hiei et al., Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens, Plant Mol. Biol. (1997) 35: 205-18); für Mais z.B. erst ab 1994 über den biolistischen DNA-Transfer (Klein, Biotechnology Agricult. Forestry (1994) 25: 241-251; Brettschneider et al., Theor. Appl. Genet. (1997) 94: 737-748) über Agrobacterium tumefaciens erst ab 1996: Ishida et al., Nature Biotechnology (1996) 14(6):745-750); die Methode zur Transformation von Roggen (De 1a Pena et al., Nature (1988) 325: 274-276) wurde als nicht reproduzierbar zurückgezogen (Langridge et al., Plant J. (1992) 631-638); die reproduzierbare Herstellung von transgenen Roggenpflanzen über einen biolistischen Ansatz gelang erst 1994 (Castillo et al., Biotechnology (1994) 13: 1366-1371), über Agrobacterium tumefaciens erst 2003 (Popelka et al., Molecular Breeding (2003) 11: 203-211); für Weizen wurden entsprechende Transformationsprotokolle in den Jahren 1993 und 1994, bzw. 1997 publiziert (biolistischer DNA-Transfer: Vasil et al., Bio/technology (1993) 11: 1553-1558; Weeks et al., Plant Physiol. (,1993) 102: 1077-1084; Becker et al., Plant J. (1994) 5: 299-307), Transformation über Agrobacterium tumefaciens Cheng et al., Plant Physiol. (1997) 115: 971-980); die Herstellung transgener Haferpflanzen gelang erstmalig 1992 (Somers et al., Bio/Technology (Dec 1992) 10: 1589-1594), die erste transgene Hirse wurde 1993 und 2002 erhalten (Sorghum: Casa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90 (23):11212-11216; Pennisetum: Girgi et al., Mol. Breed. (2002) 10 (4): 243-252), Gerste ließ sich erst im Jahr 1994 reproduzierbar über den biolistischen DNA-Transfer transformieren (Wan und Lemaux, Plant Physiol. (1994) 104: 37-48; Rital et al., Plant Mol. Biol. (1994) 24: 317-25), über Agrobacterium tumefaciens 1997 (Tingay et al., Plant J. (1997) 11: 1369-1376.)). - Witty (1989, supra) transformierte das Thaumatin II- Gen in Kartoffel. Weder für eine Geschmacksverbesserung noch für die wirtschaftliche Produktion von Thaumatin ist die Kartoffel jedoch geeignet. Aufgrund der hohen Süßkraft von Thaumatin ist die Süße bei einer Konzentration von 10E-8 M zu schmecken, dies entspricht ca. 2 μg/l. Die Ausbeute in der Kartoffel liegt zwischen 2 μg/kg und 2 mg/kg (Witty, Methods Enzymol. (1992) 216:441-7).
- In neueren Arbeiten wurden Tomate, Gurke, Apfel und Birne mit dem Thaumatin-Gen zur Geschmacksverbesserung transformiert (Tabelle 1). In Tomate und Gurke konnte in den Früchten ein süßerer Geschmack nachgewiesen werden. D.h. diese genannten Organismen sind nicht als Bioreaktoren für Thaumatin geeignet, sondern werden lediglich zur Geschmacksverbesserung eingesetzt (Bartoszewski et al., Plant Breeding (2003) 122, 347-351; Gajc-Wolska et al., Acta Horticulturae (2003) 604: 449-451; Dolgov et al. (2004), Acta Hort(ISHS) 596: 199-202; Lebedev et al. (2002) Acta Hort. (ISHS) 596 : 199-202).
- Kürzlich wurde zur Produktion von Thaumatin ein virales Expressionssystem in Tabak eingesetzt (www.icongenetics.com). Es konnte bis zu 1,5 g/kg Blattmaterial produziert werden. Für die Produktion von Thaumatin im Großmaßstab ist dieses System jedoch ungeeignet, da die Pflanzen nicht stabil transformiert werden, sondern die viralen Vektoren über Agrobakterien in die Blätter vakuuminfiltriert werden (transiente Expression). Zusätzlich erhält Tabak zahlreiche giftige Inhaltsstoffe, die eine Gewinnung des Süßstoffes für die Nahrungs- und Futtermittelherstellung obsolet machen.
- Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Thaumatin in einem biotechnischen Verfahren in wirtschaftlichen Ausbeuten und in geeigneter Stabilität und Süße herzustellen.
- Zur Lösung der Aufgabe werden als Bioreaktor transgene monokotyle Pflanzen aus den Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Secale, Pennisetum, Sorghum ausgewählt, insbesondere sind die Kulturpflanzen Gerste, Weizen, Hafer, Roggen und Hirse erfindungsgemäß bevorzugt. Besonders bevorzugt ist Gerste. (gemeinsam nachstehend „erfindungsgemäße transgene monokotyle Pflanzen")
- In solchen erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanzen, insbesondere den genannten Kulturpflanzen wurde Thaumatin bisher nicht erfolgreich exprimiert. Ferner konnte kein Thaumatin in solchen erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanzen in hinreichender Süße und Stabilität hergestellt werden.
- Zum diesbezüglichen nicht nacharbeitbaren Offenbarungsgehalt der WO9201790 wird auf obige Ausführungen verwiesen.
- Bekannt ist lediglich die Transformation des Gens für das süße Protein Brazzein aus der Pflanze Pentadiplandra brazzeana in monokotylen Mais. In Mais betragen die Ausbeuten an Brazzein ca. 4% des löslichen Proteins, das entspricht ca. 1 g/kg Kornmaterial (Faus (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 145-15; Lamphear et al. (2005) Plant Biotechnol. Journal 3(1):103-114).
- Überraschender Weise kann Thaumatin in den erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanzen in hohen Ausbeuten unter Erhaltung der Süßkraft und ausreichender Stabilität exprimiert werden (so genanntes „aktives Thaumatin"). Die erzielten Ausbeuten liegen bei mindestens 500 mg, zumeist gar über einem 1 g/kg, ferner 1-3 g/kg oder mehr (Kornmaterial) aktives Thaumatin. Dies entspricht einer Süßkraft von ca. 3-9 kg Saccharose.
- Die Süße und Stabilität des endogen exprimierten Thaumatins kann erfindungsgemäß durch die korrekte Faltung des Thaumatins – also des aktiven Thaumatins – in den erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanze erhalten werden.
- Die genannten hohen Ausbeuten werden im Endosperm der erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanzen, insbesondere in den genannten Kulturpflanzen, vor allem Gerste erzielt.
- Daher betrifft die Erfindung eine erfindungsgemäße transgene monokotyle Pflanze enthaltend Thaumatin oder aktives Thaumatin bzw. ein Protein mit einer Aktivität für Thaumatin. Daher betrifft die Erfindung zum einen geeignete Polynukleotide oder Nukleinsäuren oder andere Analoga (z.B. T-DNA), die für Thaumatin oder für ein Protein mit einer Aktivität für Thaumatin kodieren und erfindungsgemäß geeignet sind mittels eines Vektors monokotyle Pflanzen zu transformieren unter Erhalt solcher transgenen monokotylen Pflanzen. Geeignete Vektoren sind beispielhaft beschrieben in: Hellen und Mullineaux (2000) A guide to Agrobacterium binary TI vectors. Trends in Plant Science 5(19): 446-451. Beispielhafte Vektoren sind ferner in den Beispielen und Figuren offenbart.
- Daher betrifft die Erfindung ebenfalls eine erfindungsgemäße transgene monokotyle Pflanze mit mindestens einem nach seiner Transformation stabil in das Genom integrierten Polynukleotid kodierend für Thaumatin, insbesondere mittels Promotoren und ggfs. weiterer Hilfssequenzen (Enhancer, Terminatoren, Signalsequnenzen etc.) zur kontrollierten Expression von Thaumatin.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Thaumatin gezielt in das Endoplasmatische Retikulum (ER) des Endosperms des Kornmaterials oder Samen dirigiert (Targeting), insbesondere zwecks Erzielung der korrekten Faltung des Thaumatins.
- Es ist bekannt, dass die Protein-Disulfid-Isomerasen eine wesentliche Rolle bei der korrekten Ausprägung der dreidimensionalen Struktur und damit der Stabilität der Proteine spielen. Die Protein-Disulfid-Isomerasen katalysieren die Umordnung der Disulfidbrücken bei der Faltung der Proteine (Wilkinson und Gilbert, Biochim. Biophys. Acta (2004) 1699: 35-44; Sitia und Molteni Sci. STKE (2004) 239: 27).
- Welche Bedeutung diese Enzyme für die Stabilität und damit Anreicherung von Thaumatin haben, zeigen die Untersuchungen in Aspergillus awamori. In diesem nicht-pflanzlichen Organismus konnten z.B. durch eine definierte Überexpression der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) eine fünffach höhere Ausbeute an Thaumatin erzielt werden (Moralejo et al., Mol. Genet. Genomics (2001) 266: 246-253).
- Disulfidbrücken, und damit die korrekte, biologisch aktive Protein-Konformation, können sich unter den reduzierenden Bedingungen, die im Zellinneren aufrecht erhalten werden, prinzipiell nicht bilden. In eukaryontischen Zellen findet daher die Faltung der Proteine und der Aufbau der Disulfidbrücken-Muster unter partiell oxidierenden Bedingungen in bestimmten Kompartimenten, z.B. im Endoplasmatischen Retikulum (ER) statt. Dabei spielen die Protein-Disulfid-Isomerasen (PDI) eine wesentliche Rolle bei der Bildung der komplexen dreidimensionalen Strukturen der Proteine (Boston et al., Plant Mol. Biol. (1996) 32: 191-222; Wilkinson und Gilbert, Biochim. Biophys. Acta (2004) 1699: 35-44).
- In Getreide spielen die Protein-Disulfid-Isomerasen während der Kornentwicklung eine Rolle bei der korrekten Faltung und Akkumulation der Speicherproteine (Shimoni et al., Plant Physiol. (1995) 108: 327-335; Li and Larkins, Plant Mol. Biol. (1996) 30: 673-882; Takemoto et al., Plant Physiol. (2002) 128: 1212-1222). In einer Proteom-Analyse von Gerstensamen wurde zu verschiedenen Stadien der Kornentwicklung eine Anreicherung von Protein-Disulfid-Isomerasen festgestellt (Finnie et al., Plant Physiol. (2002) 129: 1308-1319).
- Das gezielte Targeting heterologer Proteine mit Hilfe von Signalsequenzen der Speicherproteine, z.B. der des Hordein D Gens aus Gerste ist bekannt (Horvath et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 1914-1919). Nicht bekannt ist jedoch das korrekte Endoplasmaische Reticulum (ER)-Targeting des Thaumatins ggfs. mit Hilfe der Thaumatin-eigenen Signalsequenzen samt Nicht-Thaumatin-Signalsequenzen sowie das korrekte Processing dieser Thaumatin-eigenen N- und C-terminalen Sequenzen in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, insbesondere Gerste. Im Ergebnis wird erfindungswesentlich ein korrekt gefaltetes Thaumatin erhalten (aktives Thaumatin).
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist daher bevorzugt, dass erfindungsgemäße Polynukleotide kodierend für Thaumatin unter Kontrolle eines Endosperm-spezifischen Promotors transformiert werden. Solche Endosperm-spezifischen Promotoren sind nicht abschließend Promotoren der Speicherproteine aus Gerste, z.B. die Hordein-B,-C,-D,-G-Promotoren (Hordein-D, vgl. SEQ ID NO: 1, Forde et al., Nucleic Acids Res. (1985) 25: 7327-39; Sörensen et al., Mol. Gen. Genet. (1996) 250: 750-760; Horvath et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 1914-1919; Cameron-Mill und Brandt, Plant Mol. Biol. (1988) 11: 449-461); oder Gamma-Hordothionin-Promotor, wie z.B. in PCT/EP2004/009762 offenbart; oder aus Reis, z.B. der Gt1-Promotor (Okita et al., J. Biol. Chem. (1988) 264: 12573-81; Leisy et al., Plant Mol. Biol. (1990) 14: 41-50); oder aus Weizen, z.B. der Glu-1D-1-Promotor (Zhang et al., Theor. Appl. Genet. (2003) 106: 1139-46).
- Daher ist ein Endosperm-spezifischer Promotor bevorzugt, wobei ebenfalls erfindungsgemäß Protein-Disulfid-Isomerasen gegenwärtig sind, um die korrekte Faltung von Thaumatin zu ermöglichen. Gerade diese Kombination ermöglicht die gewünschte hohen Ausbeuten im Endosperm der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, besonders bevorzugt Gerste.
- In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ferner den Einsatz von Signalsequenzen, zum gezielten Targeting des Thaumatins in das Endoplasmatische Retikulum (ER) der Endosperm-Zellen sowie die korrekte Akkumulation in „protein bodies" dieser Endospermzellen. Hierfür können bevorzugt Signalsequenzen der Speicherproteine der Gerste, z.B. Hordein-B, Hordein-C, Hordein-D, Hordein-G verwendet werden (Forde et al., Nucleic Acids Res. (1985) 25: 7327-39; Sörensen et al., Mol. Gen. Genet. (1996) 250: 750-760; Horvath et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 1914-1919; Cameron-Mill und Brandt, Plant Mol. Biol. (1988) 11: 449-461) oder die Signalsequenz des Gamma-Hordothionins aus Gerste ((PCT/EP2004/009762). Solche Signalsequenzen sind beispielsweise nicht abschließend SEQ ID NO: 2-8 sowie deren Expressionsprodukte SEQ ID NO: 9-15.
- Überraschenderweise führen ebenfalls die Thaumatin-eigenen N- und C-terminalen Signalsequenzen zum gezielten Targeting in das ER und zur korrekten Akkumulation in den „protein bodies". Ebenfalls überraschenderweise werden die Signalsequenzen durch Gersten-spezifische Proteasen korrekt prozessiert. Solche Signalsequenzen sind beispielsweise nicht abschließend SEQ ID NO: 16-17 sowie deren Expressionsprodukte SEQ ID NO: 18 – 19.
- Daher betrifft die Erfindung ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodierend für Thaumatin oder für ein Protein mit Aktivität für Thaumatin, welches Gegenstand eines Konstruktes oder einer Exppressionskassette ist, enthaltend Promotoren und ggfs. weitere Hilfssequenzen zur kontrollierten Expression von Thaumatin, wobei der Promotor vorzugsweise ein Endosperm-spezifischer Promotor (supra) ist sowie besagte Signalsequenzen (supra) zum Targeting in das Endoplasmatische Retikulum (ER) der Endosperm-Zellen.
- Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor enthalten ein solches erfindungsgemäßes Konstrukt oder Expressionskassette sowie eine erfindungsgemäße transgene monokotyle Pflanze, die mittels eines solchen Vektors hergestellt werden. Beispiele eines solchen Konstrukts oder Expressionskassette sind SEQ ID NO: 20-21.
- Es werden erfindungsgemäß transgene Pflanzen, Pflanzenzellen oder Protoplasten mit mindestens einem nach seiner Transformation stabil in das Genom integrierten erfindungsgemäßen Polynukleotid erhalten. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Saatgut, welches aus den transformierten Pflanzen bzw. transgenen Pflanzen erhalten wird.
- Ferner betrifft die Erfindung Kornmaterial bzw. Samen einer transgenen monokotylen Pflanze, welche mindestens 500 mg, vorzugsweise 1g oder mehr, insbesondere 3 g oder mehr Thaumatin in 1 kg Kornmaterial enthält.
- Im Sinne dieser Erfindung ist Thaumatin eine 207 Aminosäuren lange Proteinsequenz mit 8 Disulfidbrücken, welche in den Isoformen I, II nativ vorkommt. Bekannte Sequenzen sind insbesondere SEQ ID NO: 22 – 24 sowie die kodierenden Sequenzen SEQ ID NO: 25 – 27. Ferner mit eingeschlossen sind Proteine mit einer Aktivität für Thaumatin.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung ist erstmalig die native Aminosäuresequenz von Thaumatin I zudem in korrekter Faltung in einem heterologen Organismus, bzw. in einer Pflanze hergestellt worden. Bisher wurde bevorzugt Thaumatin II in den verschiedenen nicht-monokotylen Organismen heterolog exprimiert (siehe Tabelle 1). Thaumatin I wurde bisher nur in Form mutierter Varianten rekombinant hergestellt (
US5221624 , WO9005775,EP0540651 , Lee et al, Biochemistry (1988) 27: 5101-5107). - Es ist bekannt, dass Thaumatin I sowohl über eine höhere Süßkraft (Masuda et al., Biotechnol. Bioeng. (2004)85: 761-9) als auch über eine höhere Thermostabilität verfügt (Higginbotham J.D. (1986) In: Nabors L.O., Gelardi R.C., eds. Alternative Sweeteners, Marcel Dekker New York: 103-134).
- In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, betrifft die Erfindung ein neue Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28, wobei Thaumatin I mit den spezifischen N- und C Terminus aus einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanze, insbesondere Gerste, isoliert werden kann. Es handelt sich bei der dargelegten Sequenz um ein aktives Thaumatin.
- Daher betrifft die Erfindung ebenfalls Polynukleotide codierend für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28, insbesondere gemäß der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 29.
- Der Begriff "transgene Pflanze" betrifft Pflanzen, die mittels rekombinanter Gentechnik und/oder mikrobiologischen Verfahren und nicht mittels herkömmlicher Züchtungsverfahren hergestellt wurden und mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodierend für Thaumatin enthalten. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanze sind beschrieben (Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M., Thorton S. and Brettel R. (1997): Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation. Plant Journal 11, 1369 – 1376; Wan Y. and Lemaux P. (1994): Generation of a large number of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 104; 37 – 48, Stahl R., H.Horvath, J. Van Fleet, M.Voetz, D. von Wettstein & N. Wolf (2002) T-DNA integration into the barley genome from single and double cassette vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2146-2151; Horvath H., J.Huang, O.T. Wong & D.von Wettstein (2002) Experiences with genetic transformation of barley and characteristics of transgenic plants. In: Barley Science. G.A. Slafer, J.L. Molina-Cano, R. Savin, J.L. Araus & I. Romagosa eds. The Harworth Press, New York 2002 pp. 143-176; Horvath H., L.G. Jensen, O.T. Wong, E. Kohl, S.E. Ullrich, J. Cochran, C.G. Kannangara & D. von Wettstein (2001) Stability of transgene expression, field performance and recombination breeding of transformed barley lines. Theor. Appl. Genet. 102, 1-11; Wettstein D. von, G. Mikhaylenko, J.A. Froseth & C.G. Kannangara (2000) Improved barley broiler feed with transgenic malt containing heat-stable (1,3-1,4)-beta-glucanase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13512-13517; Horvath H., J. Huang, O.T. Wong, E. Kohl, T. Okita, C.G. Kannangara & D.von Wettstein (2000) The production of recombinant proteins in transgenic barley grains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1914-1919; Mayerhofer, R., Koncz-Kalman, Z., Nawrath, C., Bakkeren, G., Crameri, A., Angelis, K., Redei, G. P., Schell, J., Hohn, B. & Koncz, C. (1991) EMBO J. 10, 697-704 T-DNA integration: a mode of illegitimate recombination in plants; Deblaere R., Bytebier B., De Greve H., Deboeck F., Schell M., Van Montagu M., Leemans J.; "Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to plants"; Nucleic Acids Res. 13:4777-4788(1985)).
- Eine erfindungsgemäß besonders bevorzugte Pflanze ist Gerste, welche sich leicht zu Malz vermälzen lässt. Durch Röstverfahren kann Malz zusätzliche Geschmackskomponenten erhalten. Malz ist bereits ein Bestandteil verschiedener Nahrungs- und Futtermittel. Malz kann die Aufgabe des Füllstoffes für den Einsatz von Thaumatin übernehmen und ist daher hervorragend als Nahrungs- oder Futtermittel, welches endogenes Thaumatin enthält, geeignet.
- Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Mehlprodukt oder Malzprodukt, ferner Extrakte und Pulver, oder ein Nahrungs- und Futtermittel für Mensch und Tier enthaltend Kornmaterial aus der erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanze, vorzugsweise den Kulturpflanzen Gerste, Weizen, Hafer, Roggen, besonders bevorzugt Gerste.
- Die Erfindung hat zum Gegenstand Nahrungsmittel, kalorienarme oder diätetische Lebensmittel bestehend aus Getränken, Bier, Brot, Kaffee- und Kakaogetränken, Süßwaren, Speiseeis, Fertiggerichten, Milch- und Joghurtprodukten, Getreideprodukten, Süßigkeiten, Schokolade, Kaugummi und Kautabletten, Gebäck, Kuchen, Soßen, Dressing enthaltend ein Extrakt oder Mehl-, Malzprodukt, dessen Extrakte, aus einer erfindungsgemäßen transgenen monokotylen Pflanze oder aus dessen Kornmaterial, vorzugsweise den Kulturpflanzen Gerste, Weizen, Hafer, Roggen, besonders bevorzugt Gerste.
- Herstellung eines Malzpulvers aus einer transgenen monokotylen Pflanze und zwar Gerste:
Das Malzpulver aus erfindungsgemäßen transgenen Gerste kombiniert die Eigenschaften von Thaumatin (Süßung und Geschmacksverstärkung) mit dem Wohlgeschmack von Malz. Das Pulver eignet sich hervorragend als Zusatz sowohl zu Nahrungsmitteln, z.B. Kaffee- und Kakaogetränken, Süßwaren, Speiseeis, Fertiggerichten, Milch- und Joghurtprodukten, Getreideprodukten, Soßen, Dressing als auch zu Futtermitteln. Da Thaumatin im Malz eine sehr große Hitzestabilität aufweist, ist es ebenfalls als Zusatz für die Gebäck- und Kuchenherstellung sehr gut geeignet. Aufgrund der hohen Süßkraft der Thaumatin-Gerste muss zu den Produkten kein weiteres Süßungsmittel zugefügt werden. Das Malzpulver aus der Thaumatin-Gerste kann daher hervorragend zur Herstellung kalorienarmer und diätetischer Produkten eingesetzt werden. Die Herstellung dieser verschiedenen Produkte ist dem Fachmann bekannt, Backmischungen von Keksen werden z.B. bis zu 10 Malzpulver (100 g Malz/kg Backmischung) zugesetzt. Der Zusatz von 100 g Thaumatin-Malz entspricht in Bezug auf die Süßkraft einem Zusatz von 300 g Saccharose/kg Backmischung. - Ebenfalls die Herstellung von Malz-haltigen Getränkepulvern (z.B. NESTOMALT,
EP1068807 ), die mit heißem oder kalten Wasser oder Milch gemischt werden, ist dem Fachmann bekannt. Durch die Verwendung von Malz aus der erfindungsgemäßen transgenen Gerste kann vorzugsweise auf den Zusatz von Zucker oder Zuckeraustauschstoffen vollständig verzichtet werden. Das Thaumatin im Malz vermittelt nicht nur die Süße sondern auch ein angenehmes Mundgefühl, das durch andere Süßstoffe oder Zuckeralkohole nicht vermittelt werden kann. - Mehl und Malz aus der erfindungsgemäßen transgenen Gerste können direkt Futtermischungen zugefügt werden. Eine Tonne Ferkelfutter wird z.B. mit 20-40 kg Laktose gesüßt (z.B. in ANILAC, ANIFIT). Im Vergleich zu Saccharose hat Laktose nur eine 0,6-fache Süßungskraft. Eine entsprechende Süßung kann durch Zugabe von 1,5-2,5 kg des erfindungsgemäßen Thaumatin-Malz, bzw. Mehls pro Tonne Ferkelfutter erzielt werden. Mehl und Malz aus der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen können insbesondere als Geschmacksverstärker in Futtermitteln zugesetzt werden.
- Ferner eignet sich das erfindundungsgemäße Malz aus transgener Gerste enthaltend Thaumatin zur Herstellung eines Malzextraktes, Malzsirup oder eines Instantmalzpulvers. Für die Herstellung von Getränken ist der Einsatz eines Malzextraktes geeignet, um eine 100%ige Löslichkeit zu garantieren. Hier kann weitgehend dem Stand der Technik zur Herstellung von Malzextrakten gefolgt werden. Die Stärke des malzigen Geschmacks kann durch ein Extraktionsverfahren variiert werden (z.B. Owades J.L.: Preparation of a nonalcoholic malt beverage,
US5120557 ). - Extrakte aus dem Malz der Thaumatin-Gerste stellen ferner eine ideale Grundlage für die Herstellung wohlschmeckender, kalorienarmer oder diätetischer Getränke dar. Ein wässriger Extrakt kombiniert die kalorienarme Süßkraft und Geschmacksverstärkenden Eigenschaften des Thaumatins mit dem Wohlgeschmack des Malzextraktes.
- Zur Vereinfachung von Lagerung und Transport des Malzextraktes aus der erfindungsgemäßen Gerste kann nach bekannten Verfahren unter Vakuum ein Sirup oder Extraktpulver oder durch Gefriertrocknung ebenfalls ein Instantpulver hergestellt werden.
- Das gewonnene Malz enthaltend Thaumatin eignet sich hervorragend zur Produktion von schmackhaften Diätbieren. Aufgrund der Süßkraft des Thaumatins ist der Zusatz von Zucker (bis zu 50 g/l) bei der Herstellung von Malzbier nicht notwendig. Der Geschmack von Leichtbieren, die durch die vollständige Vergärung der Maltose keine Süße mehr aufweisen, kann durch Zusatz des Thaumatin-Malzes wesentlich verbessert werden. Thaumatin-Malz ermöglicht damit die Herstellung schmackhafter, kalorienarmer Biere nach dem Reinheitsgebot.
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- Der Malzextrakt enthaltend Thaumatin aus der erfindungsgemäßen transgenen Gerste verfügt dagegen über die intensive Süßkraft des Thaumatins. Nur geringe Mengen des Sirups oder Instantmalzpulvers müssen den Getränken zugesetzt werden, um die gewünschte Süße zu erhalten. Ein Zusatz weiterer Süßungsmittel ist nicht notwendig, so dass der Extrakt, der Sirup, das Pulver oder das Instantpulver sich hervorragend zur Herstellung kalorienarmer, diätetischer Getränke eignen.
- Die Erfindung betrifft ferner einen Geschmacksvertärker bestehend aus einem erfindungsgemäßen Nahrungs- oder Futtermittel, welches einem beliebigen Nahrungs- oder Futtermittel zugesetzt wird.
- Beispiel 1 – Konstruktion eines Hordein-Signal/Thaumatin Konstrukts/Expressionskassette/Vektor:
- Die folgenden Arbeiten wurden nach Standardmethoden ausgeführt, wie sie in Manniatis et al. (supra) beschrieben sind. Mittels PCR wurde mit extrahierter DNA (Maniatis et al.) aus Blättern von Thaumatococcus daniellii die Sequenz für das reife Thaumatin-Gen amplifiziert. Hierzu wurden die Primer X1004 (SEQ ID No. 30) am 5' Ende und X1005 (SEQ ID No. 31) am 3' Ende der Sequenz für das reife Thaumatin Gen verwendet. Mittels Splice by Overlap wurden 120 Bp der Sequenz am 3' Ende der Sequenz des Hordein-D Promoters, sowie die Sequenz für das Hordein-D Signal Peptid an die GC-optimierte Thaumatin Sequenz angehängt. Dieses PCR-Fragment wurde in die SmaI Restriktionsstelle von pUC18 kloniert. Hieraus wurde wiederum ein Fragment mit NcoI/SstI ausgeschnitten und in einen NcoI/SstI geschnittenen Vektor MA 01 (
1a ) kloniert, der den Hordein-D-Promoter, gefolgt von einer SstI Restriktionssite und dem Nos-Terminator enthält. Hierdurch entstand ein Konstrukt, das ein Fragment bestehend aus Hordein-D-Promoter, Hordein-D-Signal Peptid, Thaumatin-Gen und Nos-Terminator enthält. Aus diesem Konstrukt wurde wiederum ein Fragment mit EcoRI und HindIII ausgeschnitten. Die EcoRI Restriktionssite wurde vor der Spaltung mit HindIII mithilfe der T4 Polymerase und Deoxy-Nucleotiden aufgefüllt. Dieses Fragment wurde anschließend in den Vektor MA 02 (1b ) kloniert, der mit NotI, gefolgt von einer Auffüllreaktion mit T4 Polymerase und deoxy-Nucleotiden und in einem weiteren Schritt mit HindIII geschnitten worden war. Anschließend wurde hieraus mit EcoRI und HindIII ein Fragment ausgeschnitten und in MA 03 (1c ) kloniert. Nach der Transformation von E. coli mit dem resultierenden Vektor und einer Plasmidpräparation wurde dieses Plasmid (RS 607,1d ) in AGL 1 Zellen transformiert, die wiederum zur Transformation von unreifen Gerstenembryonen benutzt wurden. Die Gerstentransformation wurde nach Tingay et al (supra) durchgeführt. - Beispiel 2 – Konstruktion eines Thaumatin-Signal/Thaumatin/C-terminales Thaumatin-Signal Konstrukts/Expressionskassette/Vektor:
- Die folgenden Arbeiten wurden nach Standardmethoden ausgeführt, wie sie in Manniatis et al.(supra) beschrieben sind. Mittels PCR wurde mit extrahierter DNA (Maniatis et al., supra) aus Blättern von Thaumatococcus daniellii die Sequenz für das Thaumatin-Gen inkl. der Sequenzen für die N- und C-terminalen Signalpeptide amplifiziert. Hierzu wurden die Primer R1013 (SEQ ID No. 32) am 5' Ende der Sequenz für das N-terminale Signalpeptid und R1014 (SEQ ID No. 33) am 3' Ende der Sequenz für das C-terminalen Signalpeptid des Thaumatins verwendet. Durch eine weitere PCR wurden mittels Splice by Overlapp 120 Bp der 3' Sequenz des Hordein-D-Promoters an die Sequenz für das reife Thaumatin plus der Sequenzen für die N- und C-terminalen Signalpeptide angehängt. Dieses PCR-Fragment wurde in die SmaI Restriktionsstelle von pUCl8 kloniert. Hieraus wurde wiederum ein Fragment mit NcoI/SstI ausgeschnitten und in einen NcoI/SstI geschnittenen Vektor MA 01 (
1a ) kloniert, der den Hordein-D-Promoter, gefolgt von einer SstI Restriktionssite und dem Nos-Terminator enthält. Hierdurch entstand ein Konstrukt, das ein Fragment bestehend aus Hordein-D-Promoter, N-terminales Thaumatin-Signal Peptid, Thaumatin-Gen, C-terminales Signalpeptid und Nos-Terminator enthält. Aus diesem Konstrukt wurde wiederum ein Fragment mit EcoRI und HindIII ausgeschnitten. Die EcoRI Restriktionssite wurde vor der Spaltung mit HindIII mithilfe der T4 Polymerase und deoxy-Nucleotiden aufgefüllt. Dieses Fragment wurde anschließend in den in den Vektor MA 02 (1b ) kloniert, der mit NotI, gefolgt von einer Auffüllreaktion mit T4 Polymerase und deoxy-Nucleotiden und in einem weiteren Schritt mit HindIII geschnitten worden war. Anschließend wurde hieraus mit EcoRI und HindIII ein Fragment ausgeschnitten und in MA 03 (1c ) kloniert. Nach der Transformation von E. coli mit dem resultierenden Vektor und einer Plasmidpräparation wurde dieses Plasmid (RS 608,1e ) in AGL 1 Zellen transformiert, die wiederum zur Transformation von unreifen Gerstenembryonen benutzt wurden. Die Gerstentransformation wurde nach Tingay et al. (supra) durchgeführt. - Beispiel 3 – Herstellung und Analyse transgener Gerstenlinien
- Pro Konstrukt (607 mit Expressionskassette (SEQ ID No. 20), 608 mit Expressionskassette (SEQ ID No. 21), siehe Beispiele 1 und 2) wurden jeweils 50 unabhängige, transgene Gerstenlinien regeneriert und im Gewächshaus bis zur Samenreife kultiviert. Zur Selektion der Linien mit den höchsten Ausbeute an Thaumatin wurden Einzelkornanalysen der reifen Samen durchgeführt.
- Reife Körner der erhaltenen transgenen Gerstenlinien wurden jeweils einzeln fein vermahlen. Das resultierende Mehl wurde in 80 mM Citratpuffer (pH 3,0) suspendiert und 30 min bei 370C inkubiert. Die derart extrahierten Proteine wurden nach Zentrifugation im klaren Überstand erhalten. Die gewonnenen Extrakte wurden neutralisiert, nach Bestimmung der Proteinkonzentration mit Aceton gefällt und in Loading-Buffer aufgenommen und über SDS-PAGE aufgetrennt. Pro Linie wurden jeweils 3-4 Körner analysiert. Die ersten Untersuchungen zur Expression von Thaumatin I in den Gerstenlinien wurden mit Hilfe von Western Blot Analysen durchgeführt (
2a ). Hierfür wurde der Thaumatin-spezifischer Antikörper der Firma Abcam eingesetzt. - Entsprechend der Spaltung der Transgene in den Samen der T0-Linien wurden Körner mit und ohne Thaumatin-Expression identifiziert. Da die Samen der transgenen Gerstenlinien hohe Mengen an Thaumatin akkumulierten, konnte das heterologe Protein bereits in den SDS-Gelen identifiziert werden (
2b ). In weiteren Versuchen wurden die hochexprimierenden Linien daher über SDS-PAGE selektiert. - Hochexprimier wurden weiter vermehrt und homozygote Linien identifiziert. Diese wurden für die weitere Vermehrung, die Entwicklung von Reinigungsverfahren, Analyse des rekombinanten Proteins sowie für die Herstellung von Malzpulver, Malzextrakten und Instantpulver eingesetzt.
- Beispiel 4 – Reinigung von Thaumatin aus der Gerste
- Die Reinigung von reinem Thaumatin aus der erfindungsgemäßen transgenen Gerste kann weitgehend dem Protokoll von Tate & Lyle folgen (
US4011206 ,US4221704 ). Feines Mehl des Kornmaterials der erfindungsgemäßen transgenen Gerste wird mit Wasser (angesäuert durch Zusatz von Phosphor-, Zitronen-, Ameisen-, Ascorbinsäuren u. ä. Säuren, die im Lebensmittelbereich eingesetzt werden, auf pH 2.7-3.0) im Verhältnis 1:4 gemischt. - Durch Filtration oder Sedimentation werden die groben Bestandteile und Stärke entfernt.
- Der Extrakt enthält bereits eine hohe Konzentration an Thaumatin. Reines Thaumatin kann bei Bedarf durch Ultrafiltration oder Ionenaustauscher-Chromatographie gewonnen werden.
- Detailliert:
- Die folgenden Arbeiten wurden nach Standardmethoden durchgeführt, wie beispielsweise in „Methods in Enzymology, 182" Methods in Enzymology Vol. 182: Guide To Protein Purification (M. P. Deutscher, ed.), Academic Press, San Diego, 1990 beschrieben. Reife Körner der erhaltenen transgenen Gerstenlinien (Linie 607, 608, vgl.
3a ) wurden fein vermahlen. Das resultierende Mehl wurde in 80 mM Citratpuffer (pH 3,0) suspendiert und 30 min bei 37°C inkubiert. Die derart extrahierten Proteine wurden nach Zentrifugation im klaren Überstand erhalten. Die gewonnenen Extrakte wurden mittels einer Sephadex G25 M-Gelfiltration entsalzt und in 50 mM BICINE, pH 8,8 umgepuffert. Das thaumatinhaltige Proteingemisch wurde anschließend einer Kationenaustausch-Chromatografie unterzogen. Dazu wurden die Extrakte auf eine SP-Sepharose Fast Flow-Säule appliziert (2b ) und eine Vorelution mit 7 – 8 Säulenvolumina Startpuffer durchgeführt. Die gebundenen Proteine wurden bei steigender Ionenkonzentration (0,1 – 1 M NaCl) unter Beibehaltung des pH-Wertes unter nativen Bedingungen graduell eluiert und in Fraktionen aufgefangen. Thaumatinhaltige Fraktionen wurden mittels diskontinuierlicher SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen identifiziert. - Beispiel 5 – Herstellung von Malzpulver:
- Die Verfahren und die hierbei verwendeten Apparate und Vorrichtungen zur Herstellung von Malz und Maische sind Gegenstand des Studiums des Brauwesens und dem Fachmann bekannt. Hierzu wird insbesondere auf "Die Technologie der Malzbereitung" von Schuster/Weinfurtner/Narziss, 6. Aufl., 1976, und auf "Abriss der Bierbrauerei" von Narziss, 4. Aufl., 1980, verwiesen. Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden die Malzherstellung nach dem Stand der Technik etwas detaillierter beschrieben.
- Bei der Malzherstellung wird Gerste zu Malz verarbeitet, indem in der Mälzerei die Verfahrensschritte Weichen, Keimen, Trocknen und Abdarren verwendet werden. Während des Weichens nehmen die Körner bis zu 48% Wasser auf. Für die anschließende Keimung in vier bis sechs Tagen werden die keimenden Körner mit auf etwa 15°C temperierter Luft unter stetiger Ventilation gekühlt.
- Nach der Keimung spricht der Fachmann von sogenannten Grünmalz. Die Malzkörner weisen einen Wassergehalt von etwa 44% auf.
- Die Keimung wird durch Trocknen auf der Darre beendet. Zuerst wird bei Temperaturen <60°C das Wasser bis auf 12% entzogen und anschließend bei ca. 85°C auf 4,5% Wassergehalt abgedarrt.
- Das abgedarrte Malz mit einem Wassergehalt von etwa 4,5% ist lagerfähig.
- Ein Kilogramm Malz enthält 1-3 g aktives Thaumatin, d.h. die Süßkraft von 1 kg Malz entspricht etwa 3-9 kg Saccharose.
- Für den Zusatz zu Nahrungsmitteln wird als letzter Verfahrensschritt in der Mälzerei das abgedarrte Malz geputzt. Das Malz wird entweder geschält oder in einem Spezialmahlverfahren ein feines spelzenarmes Produkt hergestellt, welches zu 60% löslich ist.
- Das Malzpulver aus der erfindungsgemäßen transgenen Gerste enthält 1-3 kg Thaumatin pro Tonne Malzpulver, d.h. ein Kilogramm verfügt über eine Süßkraft von 3-9 kg Saccharose. Das Malzpulver eignet sich hervorragend als Zusatz zur Herstellung von Diätprodukten. Es kann zur Herstellung von Backmischungen, Kaffee-, Kakaogetränken, Milch- und Schokoladenprodukte, Süßigkeiten, etc. direkt eingesetzt werden. Die gewünschte Süße kann ausschließlich durch den Zusatz des Malzpulvers erzielt werden, zusätzliche Süßungsmittel sind nicht notwendig.
- Beispiel 6 – Herstellung von Malzextrakt, Instantpulver:
- Die Herstellung eines Malzextraktes und Instantpulvers folgt dem Stand der Technik und ist dem Fachmann bekannt.
- Ein Extrakt wird durch die Mischung von Malz und Wasser zum Beispiel im Gewichtsverhältnis 1:5 hergestellt. Um eine optimale Extraktion des Thaumatins aus dem Malz zu erzielen, wird das Wasser durch Zusatz von Säuren, die für Lebensmittel zugelassen sind (Zitronensäure, Ameisensäure, Phosphosäure, etc.) auf einen pH-Wert zwischen 2.7 und 3.0 gebracht.
- Die Herstellung eines Konzentrates aus dem Malzextrakt (Sirup, Pulver) und eines „Instantpulver" erfolgt unter Vakuum, bzw. über Gefriertrocknung nach Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
- Erläuterung der Legende in den
2a ,2b ,3a : -
2a : -
- 607-11, 607-12, 607-28, 607-29, verschiedene transgene Gerstenlinien, die das Thaumatin I Gen unter Kontrolle des Hordein-D-Promotors mit Hordein-D-Signal exprimieren.
- 1, 2, 3, Extrakte aus Einzelkörnern der jeweiligen Linien ML, Kaleidoskop-Marker (Biorad)
- GP, Extrakt aus Körnern einer nicht-transgenen Golden Promise Pflanze (Kontrolle)
- Th, Extrakt aus Körnern einer nicht-transgenen Gerstenlinie gemischt mit 5 ng Thaumatin I + II Gemisch (Sigma)
-
2b : -
- SDS-PAGE verschiedener unabhängiger transgener T0-Linien, die mit dem Konstrukt 607, bzw. 608 transformiert wurden.
- 607-12, 607-13, 607-14, verschiedene transgene Gerstenlinien, die das Thaumatin I Gen unter Kontrolle des Hordein-D-Promotors mit Hordein-D-Signal exprimieren.
- 608-10, 608-12, 608-13, verschiedene transgene Gerstenlinien, die das Thaumatin I Gen unter Kontrolle des Hordein-D-Promotors mit den Thaumatin-eigenen N- und C-terminalen Signalen exprimieren.
- 1, 2, 3, 4, Extrakte aus Einzelkörnern der jeweiligen 607, bzw. 608 Linien
- ML, Kaleidoskop-Marker (Biorad)
- GP, Extrakt aus Körnern einer nicht-transgenen Golden Promise
- Pflanze (Kontrolle)
- Th, Extrakt aus Körnern einer nicht-transgenen Gerstenlinie gemischt mit 4,5 μg Thaumatin I + II (Sigma)
-
3a : -
- Ex, Mehlextrakt (Citratpuffer)
- 3, 4, 13, 14, Aliquots der entsprechenden Eluatfraktionen (SP Sepharose FF)
- Th, Thaumatin I + II (Sigma)
- ML, Proteinstandard
- Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
Claims (28)
- Transgene monokotyle Pflanze ausgewählt aus den Gattungen Triticum, Hordeum, Avena, Secale, Pennisetum, Sorghum enthaltend Thaumatin.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1 enthaltend Thaumatin, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze Gerste, Weizen, Hafer, Roggen, Hirse ist, jedoch vorzugsweise Gerste ist.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend aktives Thaumatin.
- Transgene monokotyle Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 2 enthaltend Thaumatin I.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 1 bis 3 enthaltend enthaltend Thaumatin II.
- Transgene monokotyle Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ein Protein enthält ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID 22 – 24 oder SEQ ID NO: 28.
- Transgene monokotyle Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit mindestens einem nach seiner Transformation stabil in das Genom integrierten Polynukleotid kodierend für Thaumatin.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukletid aus der Gruppe SEQ ID NO: 25 – 27 oder SEQ ID NO: 29 ausgewählt ist.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 7, enthaltend Promotoren und ggfs. weitere Hilfssequenzen zur kontrollierten Expression von Thaumatin.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 8 oder 9, enthaltend Endosperm-spezifische Promotoren.
- Transgene monokotyle Pflanze nach einem der Ansprüche 8 bis 10, enthaltend Endosperm-spezifische Promotoren ausgewählt aus der Gruppe Hordein-B,-C,-D,-G-Promotoren, vorzugsweise aus Gerste; SEQ ID NO: 1; Gamma-Hordothionin-Promotoren, vorzugsweise aus Gerste; oder der Gt1-Promotor, vorzugsweise aus Reis; oder der Glu-1D-1-Promotor, vorzugsweise aus Weizen.
- Transgene monokotyle Pflanze nach einem der Ansprüche 8 bis 11, enthaltend Signalsequenzen zum Targeting in das Endoplasmatische Retikulum der Endosperm-Zellen.
- Transgene monokotyle Pflanze nach einem der Ansprüche 8 bis 12, enthaltend Signalsequenzen ausgewählt aus der Gruppe Hordein-B, Hordein-C, Hordein-D, Hordein-G, Gamma-Hordothionins mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2-8 und/oder N oder C terminale Sequenzen und zwar SEQ ID NO: 16-17.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 12 oder 13, enthaltend Signalsequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO: 9-15.
- Transgene monokotyle Pflanze nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kontrollierte Expression in Gegenwart von Protein-Disulfid-Isomerasen erfolgt.
- Vektor enthaltend ein Konstrukt oder eine Expressionskassette bestehend mindestens aus einem Polynukleotid nach Anspruch 7, mindestens einen Endosperm-spezifischen Promotor nach einem der Ansprüche 10 oder 11, ggfs. Signalsequenzen nach einem der Ansprüche 12 bis 14.
- Vektor nach Anspruch 16 enthaltend ein Konstrukt oder Expressionskassette gemäß SEQ ID NO: 21 – 22.
- Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe oder transformierter Protoplast mit einem nach seiner Transformation stabil in das Genom integrierten Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 17.
- Protein erhältlich aus einer transgenen monokotylen Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit SEQ ID NO: 28.
- Polynukleotide kodierend für ein Protein nach Anspruch 19, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 29.
- Kornmaterial bzw. Samen einer transgenen monokotylen Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, welches mindestens 500 mg, vorzugsweise 1g oder mehr, insbesondere 3 g oder mehr Thaumatin in 1 kg Kornmaterial enthält.
- Malzprodukt, insbesondere Malzpulver oder Malzextrakt, enthaltend ein Thaumatin aus einer transgenen Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einem Kornmaterial bzw. Samen nach Anspruch 21, vorzugsweise aus den Kulturpflanzen Gerste, Hafer, Weizen, Roggen, Hirse, insbesondere Gerste.
- Mehlprodukt, insbesondere Mehlpulver oder Mehlextrakt, enthaltend ein Thaumatin aus einer transgenen monokotylen Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einem Kornmaterial bzw. Samen nach Anspruch 21, vorzugsweise aus den Kulturpflanzen Gerste, Hafer, Weizen, Roggen, Hirse insbesondere Gerste.
- Instantpulver bestehend aus einem Malzpodukt nach Anspruch 22 oder einem Mehlprodukt nach Anspruch 23.
- Nahrungsmittel oder Futtermittel enthaltend ein Kornmaterial bzw. Samen nach Anspruch 21 oder ein Malzprodukt nach Anspruch 22 oder ein Mehlprodukt nach Anspruch 23.
- Diätetisches oder kalorienarmes Lebensmittel enthaltend ein Nahrungsmittel oder Futtermittel nach Anspruch 25.
- Geschmacksverstärker bestehend aus einem Nahrungsmittel oder Futtermittel nach Anspruch 25.
- Nahrungsmittel nach Anspruch 25 oder kalorienarmes/diätetisches Lebensmittel nach Anspruch 26 bestehend aus Getränken, Bier, Brot, Kaffee- und Kakaogetränken, Süßwaren, Speiseeis, Fertiggerichten, Milch- und Joghurtprodukten, Getreideprodukten, Süßigkeiten, Schokolade, Kaugummi und Kautabletten, Gebäck, Kuchen, Soßen, Dressing.
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Citations (1)
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