DE60002683T2 - Mit thioredoxin transformierte pflanzen - Google Patents

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil des Anmeldedatums der Anmeldung laufende Nr. 60/126 736, eingereicht am 29. März 1999, anhängig; der Anmeldung laufende Nr. 60/127 198, eingereicht am 31. März 1999, anhängig; der Anmeldung lauferde Nr. 60/169 162, eingereicht am 6. Dezember 1999, anhängig; der Anmeldung laufende Nr. 60/177 740, eingereicht am 21. Januar 2000, anhängig; und der Anmeldung laufende Nr. 60/177 739, eingereicht am 21. Januar 2000, anhängig, die alle in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme ausdrücklich aufgenommen werden.
  • Anerkennung der Regierungsunterstützung
  • Diese Erfindung wurde mit Regierungsunterstützung unter dem Stipendium 9803835 des U.S. DePartment of Agriculture gemacht. Die Regierung hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Thioredoxine sind kleine (etwa 12 kDa) thermisch stabile Proteine mit katalytisch aktiven Disulfid-Gruppen. Diese Klasse von Proteinen wurde in praktisch allen Organismen gefunden und war an einer Unzahl biochemischer Wege beteiligt (Buchanan et al., 1994). Die aktive Stelle von Thioredoxin hat zwei Redox-aktive Cysteinreste in einer hochgradig konservierten Aminosäure- Sequenz; wenn sie oxidiert werden bilden diese Cysteine eine Disulfid-Brücke (-S-S-), die durch eine Vielzahl spezifischer Reaktionen zur Sulfhydryl (-SH)-Stufe reduziert werden kann. In physiologischen Systemen kann diese Reduktion erreicht werden durch reduziertes Ferredoxin, NADPH, oder andere verwandte Thioredoxin-reduzierende Mittel. Die reduzierte Form von Thioredoxin ist ein hervorragender Katalysator für die Reduktion selbst der widerspenstigsten Disulfid-Bindungen.
  • Im allgemeinen findet man in bakteriellen oder tierischen Zellen nur eine Art von Thioredoxin. Im Gegensatz dazu haben fotosynthetische Organismen drei verschiedene Typen von Thioredoxin. Chloroplasten enthalten ein Ferredoxin/ Thioredoxin-System bestehend aus Ferredoxin, Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase und den Thioredoxinen f und m, die bei der Lichtregulierung photosynthetischer Enzyme wirken (Buchanan, 1991; Scheibe, 1991). Das andere Thioredoxin-Enzym-System ist analog dem für Tiere und die meisten Mikroorganismen erstellten, in dem Thioredoxin (h-Typ in Pflanzen) durch NADPH und NADPH-Thioredoxin-Reduktase (NTR) reduziert wird (Johnson et al., 1987a; Florencio et al., 1988; Suske et al., 1979). Die Reduktion von Thioredoxin h durch dieses System kann durch die folgende Gleichung veranschaulicht werden:
  • Figure 00020001
  • Thioredoxin ist ein Bestandteil von zwei Typen von Enzym-Systemen in Pflanzen. Chloroplasten enthalten ein Ferredoxin/Thioredoxin-System bestehend aus Ferredoxin, Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase und den Thioredoxinen f und m, die an der Lichtregulierung photosynthetischer Enzyme beteiligt sind (Buchanan, 1991; Scheibe, 1991). Das andere Enzym-System, das NADP-Thioredoxin-System oder NTS, ist analog dem für Tiere und die meisten Mikroorganismen erstellten System, in dem Thioredoxin (h-Typ in Pflanzen) durch NADPH und NADPH-Thioredoxin-Reduktase (NTR) reduziert wird (Johnson et al., 1987 a; Florencio et al., 1988; Suske et al., 1979). Thioredoxin h ist in Pflanzengeweben weit verbreitet und liegt in Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und dem Zytosol vor (Bodenstein-Lang et al., 1989, Marcus et al., 1991).
  • Pflanzen-Thioredoxin h ist an einer breiten Vielfalt biologischer Funktionen beteiligt. Das Vorliegen mehrerer Formen des Proteins Thioredoxin h wurde auch bei Pflanzensamen berichtet (Bestermann et al., 1983). Bei Weizen wurden drei verschiedene Thiaredoxine charakterisiert (Vogt and Follman, 1986). Thioredoxin h ist wirksam bei der Reduktion intramolekularer Disulfid-Brücken einer Vielzahl cystin-reicher Proteine niederen Molekulargewichts, einschließlich Thioninen (Johnson et al., 187b), Protease-Inhibitoren und Chloroform/Methanol-löslichen Proteinen (CM-Proteine oder alpha-Amylase-Inhibitoren) (Kobrehel et al., 1991). Es ist wahrscheinlich, dass zytoplasmatische Thioredoxine an Entwicklungsprozessen teilnehmen: beispielsweise wurde für Thioredoxin h gezeigt, dass es als ein Signal zur Steigerung metabolischer Prozesse während des Keimens und der Sämlings-Entwicklung wirkt (Kobrehel et al., 1992; Lozano et al., 1996; Besse et al., 1996). Von Thioredoxin h wurde auch bewiesen, dass es bei Phalaris coerulescens (Li et al., 1995) und bei Brassica napus (Bower et al., 1996) an Eigen-Unverträglichkeit beteiligt ist. Mehrere Wirkungen wurden hypothetisch angenommen für Reis-Thioredoxin h, von dem man glaubt, dass es an der Translokation in Siebröhren beteiligt ist (Ishiwatari et al., 1995.
  • Vom NTS wurde gezeigt, dass es die Teigqualität verbessert. Die Verbesserung der Teigfestigkeit- und Brotqualitäts-Eigenschaften von Weizenmehl schlechter Qualität, die sich beim Zusatz von Thioredoxin ergibt (Wong et al., 1993; Kobrehel et al., 1994), kann der Thioredoxin-katalysierten Reduktion intramolekularer Disulfid-Bindungen in den Mehlproteinen, speziell den Gluteninen, die zur Bildung neuer intermolekularer Disulfid-Bindungen führt, zuzuschreiben sein (Besse and Buchanan, 1997). So fördert der Zusatz von exogenem Thioredoxin die Bildung eines Protein-Netzwerks, das Mehl mit verbesserter Backqualität erzeugt. Kobrehel et al., (1994) haben beobachtet, dass der Zusatz von Thioredoxin h zu Mehl von nicht glutenhaltigen Getreiden wie Reis, Mais und Sorghum die Bildung eines teigartigen Produkts fördert. Daher kann der Zusatz von exogenem Thioredoxin verwendet werden, um Backteig aus nicht glutenhaltigen Getreiden herzustellen.
  • Außerdem wurde gezeigt, dass die Reduktion von Disulfid-Protein-Allergenen in Weizen und Milch durch Thioredoxin ihre allergene Wirkung verringert (Buchanan et al., 1997, del Val et al., 1999). Thioredoxin-Behandlung erhöht auch die Verdaubarkeit des Hauptallergens von Milch (β-Lactoglobulin) (del Val et al., 1999) sowie anderer Disulfid-Proteine (Lozano et al., 1994; Jiao et al., 1992). Daher bietet die Manipulierung des NTS erhebliche Hoffnungen auf die Herstellung von Nährmittelprodukten und pharmazeutischen Produkten. Eine detailliertere Diskussion der Vorteile des Zusatzes von exogenem Thioredoxin zu Nahrungsmittelprodukten wird in dem US-Patent Nr. 5 792 506 von Buchanan et al. präsentiert.
  • Thioredoxin h codierende cDNA-Klone wurden aus einer Anzahl von Pflanzen-Spezies isoliert, einschließlich Arabidopsis thaliana (Rivera-Madrid et al., 1993, Rivera-Madrid et al., 1995), Nicotiana tabacum (Marry and Meyer, 1991, Brugidou et al., 1993), Oryza sativa (Ishiwatari et al., 1995), Brassica napus (Bower et al., 1996), Glycine max (Shi and Bhattacharyya, 1996) und Triticum aestivum (Gautier et al., 1998). In jüngerer Zeit wurden zwei Weizen-Thioredoxin h codierende cDNA-Klone isoliert und charakterisiert (Gautier et al., 1998). Das NTR-Gen von Escherichia coli wurde zuerst isoliert (Russe) and Model, 1988), und die dreidimensionale Struktur des Proteins wurde analysiert (Kuriyan et al., 1991). Einige andere NTR-Gene wurden aus Bakterien, Pilzen und Säugetieren isoliert und sequenziert. Kürzlich berichteten Jacquot et al., 1994) über eine erfolgreiche Isolierung und Sequenzierung von zwei cDNAs, die die NTRs der Pflanze A. thaliana codierten. Die nachfolgende Expression des rekombinanten A. thaliana-NTR-Proteins in E. coli-Zellen (Jacquot et al., 1994) und seine erste eukaryotische Struktur (Dai et al., 1996) wurden ebenfalls berichtet.
  • Hier offenbaren wir wertgesteigerte Eigenschaften bei transgenen Körnern wie Gerste (Cho et al., 1999b), Weizen und Sorghum, die Thioredoxin überexprimieren.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die zur Transformation verwendeten Thioredoxin h-Konstrukte.
  • 2 zeigt das Thioredoxin-Aktivitätsprofil verschiedener mit Weizen-Thioredoxin-Gen (wtrxh) transformierter Gerstenkörner.
  • 3 zeigt die Wirkungen der Wärmebehandlung auf die Thioredoxin-Aktivität von Rohextrakten aus Gerstenkörnern.
  • 4A–B zeigt eine Western-Blot-Analyse eines Extrakts aus segregierendem T1-Gerstenkorn stabiler, wtrxh enthaltender Transformanten.
  • Bahn A: Spuren 1 und 6, Kontroll-Gerstenextrakt (cv. Golen Promise); Spur 2, Brotweizenextrakt (Triticum aestivum, cv. Capitole); Spur 3, Extrakt aus GPdBhss BarWtrx 22; Spur 4, Extrakt aus GPdBhssBarWtrx 29; Spur 5, Extrakt aus GPdBhBarWtrx z. Bahn B: Spur 1, GPdBhBaarWtrx 2; Spur 2, Kontroll-Gerstenextrakt. W, Weizen; B, Gerste.
  • 5 zeigt eine Western-Blot-Analyse von Extrakten von mit wtrxh transformiertem T1-, T2- und T3-Gerstenkorn. 40 Mikrogramm löslicher Proteine, extrahiert aus 10–20 Körnern jeder Linie wurden durch SDS/PAGE fraktioniert. Spur 1, Weizenkeim-Thioredoxin h; Spur 2, nicht-transgene Kontrolle von GP4-96; Spur 3, null-segregantes T2-Korn von GPdBhssBarWtrx-29-11-10; Spur 4, heterozygotes T1-Korn von GPdBhssBarWtrx-29; Spur 5, homozygotes T2-Korn von GPdBhssBarWtrx-29-3; Spur 6, homozygotes T2-Korn von GPdBhssBar/Wtrx-29-3-2; Spur 7, vorgefärbte Standards (Aprotinin, 0,9 kDa; Lysozym, 17,8 kDa; Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, 30,6 kDa; Carboanhydrase, 41,8 kDa; BSA, 71 KDa).
  • 6 zeigt die Nucleinsäure-Sequenz des B1-Hordein-Promotors und die B1-Hordein-Signalsequenz mit 57 Basenpaaren (unterstrichen).
  • 7 zeigt die Nucleinsäure-Sequenz des D-Hordein-Promotors und die D-Hordein-Signalsequenz mit 63 Basenpaaren (unterstrichen).
  • 8A-C zeigt die Wirkung von überexprimiertem Thioredoxin h auf die Pullulanase-Aktivität bei transgenem Gerstenkorn während des Keimens und der Sämlingsentwicklung. Eine homozygote Linie, GPdBhssBarWtrx-29-3, und eine null-segregante, GPdBhssBarWtrx-29-11-10, wurden für die Pullulanase-Bestimmungen verwendet. Bahn A: Pullulanase wurde spektrophotometrisch durch Messung des aus rotem Pullulan-Substrat bei 534 nm freigesetzten Farbstoffs bestimmt. Bahn B: Pullulanase wurde auf natürlichen 7,5%-Polyacrylamid-Gelen, die das rote Pullulan-Substrat enthielten, abgetrennt. Die Aktivität, identifiziert durch Vergleich mit gereinigter Gersten-Pullulanase, sieht man als klare Bereiche, die sich beim Inkubieren des Gels in 0,2 M Succinat-Puffer, pH 6,0, 1 h bei 37°C entwickelten. Bahn C: Das Gel in Bahn B wurde gescannt und analysiert durch Integration der Aktivitätsbanden.
  • 9A-D zeigt die Veränderung der Aktivität und der Häufigkeit von Amylasen in transgenen und null-segreganten Gerstenkörnern während des Keimens und der Sämlings-Entwicklung auf der Basis eines Aktivitätsgels. Bahn A: Häufigkeit von alpha-Amylasen in Null-Segreganten auf der Basis eines Westernblots. Bahn B: Gesamt-Amylase-Aktivität in Null-Segreganten. Bahn C: Häufigkeit von alpha-Amylasen in Thioredoxin überexprimierenden Körnern. Bahn D: Gesamt-Amylase-Aktivität in Körnern mit überexprimiertem Thioredoxin.
  • 10 zeigt die Wirkung von überexprimiertem Thioredoxin h auf die Aktivität der Hauptform von alpha-Amylase während des Keimens und der Sämlings-Entwicklung. Die Größe der Haupt-alpha-Amylase-Aktivitätsbande in 9 wurde durch ihre Mobilitätsrate während der Elektrophorese bestimmt.
  • 11A–B zeigt die Wirkung von überexprimiertem Thioredoxin h auf die Häufigkeit von alpha-Amylase A- und B-Isozymen während des Keimens und der Sämlingsentwicklung. Die Figur stellt Western-Blots von IEF-Gelen, entwickelt für die null-segreganten und die transgenen Gerstenkörner, dar.
  • Bahn A: Null-Segregant. Bahn B: Transgen mit überextprimiertem Thioredoxin.
  • 12 stellt die zur Weizen-Transformation verwendeten DNA-Konstrukte dar.
  • 13 zeigt die endosperm-spezifische Expression des Gersten-D-Hordein-Promotors sgfp (S65T) in transgenen Weizenpflanzen. Transgenes Endosperm ist rechts, transgener Embryo ist links.
  • 14 zeigt die PCR-Analyse von Genom-DNA von transgenen Weizenpflanzen.
  • 15A-B zeigt Weizen-Thioredoxin h überexprimierende Weizen-Linien, gescreent mittels Western-Blot-Analysen. Bahn A: To-Weizen-Linien. Bahn B: Homozygote T3-Linie.
  • 16 zeigt die Wirkung der Thioredoxin-Reduktion auf den Verdau von Weizen-Gluteninen durch Trypsin.
  • 17 zeigt die Wirkung der Thioredoxin-Reduktion auf den Verdau von Weizen-Gluteninen durch Pankreatin.
  • 18 zeigt die Wirkung der NTR auf die Reduktion von Proteinen in Extrakten von transgenem Weizen, der Thioredoxin h überexprimiert, gegenüber einem Null-Segreganten.
  • 19 zeigt die Wirkung von überexprimiertem Thioredoxin h auf die allergene Wirkung von Proteinen des Weizenkorns.
  • 20 zeigt die Nucleotid- und die Aminosäure-Sequenz von Gersten-Thioredoxin h (SEQ ID NO: 24, bzw. SEQ ID NO: 25).
  • 21 zeigt die Wirkung von überexprimiertem Weizen-Thioredoxin h auf die Keimung von null-segreganten und transgenen (homozygoten) Gersten-Körnern.
  • 22 zeigt den relativen Redox-Zustand von Protein-Fraktionen in transgenem Gersten-Korn, das Weizen-Thioredoxin h überexprimiert, im Vergleich zu dem Null-Segreganten im trockenen und keimenden Korn.
  • 23 zeigt die Wirkung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase auf die Reduktion von Proteinen in Extrakten von transgenem Weizen-Korn, das Thioredoxin h überexprimiert, in Anwesenheit von Glucose-6-phosphat und Arabidopsis-NTR: +/- NTR.
  • 24 zeigt die Wirkung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase auf die Reduktion von Proteinen in Extrakten von Extrakten eines von Weizen-Korn, das Thioredoxin h überexprimiert, stammenden Null-Segreganten in Anwesenheit von Glucose-6-phosphat und Arabidopsis-NTR: +/-NTR.
  • Sequenzprotokoll
  • Die Nucleinsäure-und Aminosäure-Sequenzen, die in dem begleitenden Sequenzprotokoll aufgelistet sind, sind unter Verwendung von Standard-Buchstaben-Abkürzungen für Nucleobasen und des Drei-Buchstaben-Codes für Aminosäuren dargestellt. Von jeder Nucleinsäure-Sequenz ist nur ein Strang gezeigt, aber es versteht sich, dass der komplementäre Strang durch jegliche Bezugnahme auf den wiedergegebenen Strang umfaßt ist.
  • SEQ ID NO: 1 zeigt die Nucleinsäure-Sequenz der Gersten-B1-Hordein-Promotor- und Signal-Sequenz. SEQ ID NO: 2 zeigt die Aminosäure-Sequenz der Gersten-B1-Hordein-Signal-Sequenz. SEQ ID NO: 3 zeigt die Nucleinsäure-Sequenz der Gersten-D-Hordein-Promotor- und Signal-Sequenz. SEQ ID NO: 4 zeigt die Aminosäure-Sequenz der Gersten-D-Hordein-Signal-Sequenz. Andere Sequenzen sind unten angegeben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Endung stellt rekombinante, Thioredoxin codierende Nucleinsäuren und Verwendungsverfahren zur Herstellung transgenen, Thioredoxin überexprimierender Pflanzen bereit. Tatsächlich würde man bei der starken reduzierenden Aktivität von Thioredoxin erwarten, dass eine Über-Expression dieses Proteins in einer Pflanzenzelle eine ernste schädliche Wirkung auf die Zelle hauen würde. Die Erfinder haben jedoch herausgefunden, dass Thioredoxin in großer Menge in Pflanzen, insbesondere Getreidekörnern, exprimiert werden kann ohne die Lebensfähigkeit der Zellen, in denen das Protein exprimiert wird, oder der Samen selbst zu beeinträchtigen. Als Beispiel haben die Erfinder in bestimmten Ausführungsformen ein Weizen-Thioredoxin-Gen (wtrxh) in Weizen eingeführt. Samen der transgenen Weizenpflanzen können eine erhöhte Thioredoxin-spezifische Aktivität im Vergleich zu nicht-transgenen Weizenpflanzen zeigen.
  • Die Erfindung stellt daher transgene Pflanzen bereit, bei denen zumindest ein Teil einer Pflanze eine erhöhte Menge an Thioredoxin-Protein und/oder Thioredoxin-spezifischer Aktivität, verglichen mit dem homologen Teil nicht-transgener Pflanzen derselben Spezies, hat. Der Grad an Thioredoxin-spezifischer Aktivität in den Teilen der transgenen Pflanzen kann mindestens etwa zweimal größer sein als in den Teilen nicht-transgener Pflanzen dieser Sepzies. Die Erfindung ist zwar auf jegliche Pflanzen-Spezies anwendbar, aber sie wird besonders vorteilhaft sein, wenn sie auf die Monokotyledone, beispielsweise Getreide-Feldfrüchts einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Reis, Gerste, Weizen, Hafer, Mais, Roggen, Sorghum, Hirse und Triticale, und auf die Dikotyledone einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Sojabohnen, Limabohnen, Tomate, Kartoffel, Sojabohne, Baumwolle, Tabak, angewendet wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Thioredoxin-spezifische Aktivität in den Samen der transgenen Pflanze erhöht.
  • Über-Expression von Thioredoxin in einem gewünschten Teil einer Pflanze, beispielsweise einem Samen, wird erreicht durch Verwendung eines Samen-spezifischen Promotors, der funktionswirksam an die Thioredoxin codierende Sequenz gebunden ist, In diesem Beispiel gibt "Samen-spezifisch" an, dass der Promotor eine erhöhte Aktivität in Samen, verglichen mit anderen Pflanzengeweben, hat; es ist nicht erforderlich, dass der Promotor nur in den Samen aktiv ist. Bei der Natur des Thioredoxin-Proteins kann es jedoch vorteilhaft sein, einen Samen-spezifischen Promotor zu wählen, der in manchen Fällen in anderen Geweben als Samen wenig oder keine Protein-Expression verursacht. Bei bestimmten Ausführungsformen ist der Samen-spezifische Promotor, der gewählt wird, ein Samenreifungs-spezifischer Promotor. Die Verwendung von Promotoren, die eine erhöhte Expression während der Samenreifung verleihen (wie die Gersten-Hordein-Promotoren), kann zu sogar höheren Mengen an Thioredoxin-Expression in dem reifenden Samen führen.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform wird Thioredoxin in der Wurzel, dem Stengel, der Knolle, der Frucht, dem Blatt, der Blüte, den Pollen etc. oder irgendeinem oder mehreren Teilen einer Pflanze, nach der Entscheidung des Praktikers, überexprimiert.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung weisen die bereitgestellten transgenen Pflanzen ein rekombinantes Nucleinsäure-Molekül mit einer Struktur P-T auf, worin P ein Samen-spezifischer Promotor ist und T ein Nucleinsäure-Molekül, das ein Thioredoxin-Polypeptid codiert, ist. Bei besonderen Ausführungsformen ist der Samen-spezifische Promotor ein Gersten-Hordein-Gen-Promotor, wie ein Gersten-B1-Hordein-Promotor, ein Gersten-D-Hordein-Promotor oder ein Mals-Embryo-spezifischer Globulin-Promotor.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung weisen die transgenen Pflanzen ein rekombinantes Nucleinsäure-Molekül mit einer Struktur P-SS-T auf, worin P ein Samen-spezifischer Promotor ist, T ein Nucleinsäure-Molekül, das Thioredoxin-Polypeptid codiert, ist und SS ein Nucleinsäure-Molekül ist, das ein Signalpeptid codiert, das die Expression des Thioredoxin-Polypeptids zu einem intrazellulären Körper als Ziel führt, und worin P, SS und T fuktionswirksam verbunden sind. Ein hierin vorgelegter Beweis zeigt an, dass die Anwesenheit des Signalpeptids die Menge an Thioredoxin-Expression in den transgenen Pflanzen weiter erhöhen kann. Zu geeigneten Signalpeptiden gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Gersten-B1- und -D-Hordein-Signalpeptide.
  • Teile der transgenen Pflanzen, die Thioredoxin überexprimieren, wie sie von der Erfindung bereitgestellt werden, können zur direkten Verarbeitung in Nahrungsmittelprodukte geerntet werden. Beispielsweise können die Samen unter Verwendung konventioneller Mittel zur Herstellung von Mehl gemahlen werden. Alternativ können die Samen oder andere Pflanzenteile als eine Quelle für Thioredoxin verwendet werden, das durch Standard-Proteinextraktionsverfahren aus der unreifen oder reifen transgenen Pflanze extrahiert werden kann. Alternativ kann rohbehandeltes Samenmaterial direkt als eine Quelle für Thioredoxin verwendet werden. So ist ein anderer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Thioredoxin-Protein, wobei das Verfahren das Gewinnen von Thioredoxin aus den Samen einer transgenen Pflanze mit einer erhöhten Menge an Thioredoxin in ihren Samen aufweist.
  • Folglich liefert die Erfindung gemäß einem anderen Aspekt verbesserte eßbare Produkte für menschlichen und tierischen Konsum, beispielsweise erhöhte Verdaubarkeit und/oder verringerte allergene Wirkung, und Teig mit vermehreter Festigkeit und vermehrtem Volumen im Vergleich zu Teig, der aus nicht-transgenen Pflanzen derselben Spezies hergestellt ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verringerter allergener Wirkung, erhöhter Verdaubarkeit, einem erhöhtem Redox-Zustand (erhöhtem SH : SS-Verhältnis) im Vergleich zu einer nicht-transgenen Pflanze derselben Sepzies.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine transgene Pflanze, die eine Nucleinsäure, die A. thaliana-NTR codiert, aufweist.
  • Diese und andere Aspekte der Endung werden durch die folgende Beschreibung und die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • 1. Definitionen
  • Wenn nichts anderes eingegeben ist, werden technische Begriffe gemäß der konventionellen Verwendung benutzt. Definitionen gebräuchlicher Begriffe in der Molekular-Biologie sind zu finden in Lewin, Genes V, herausgegeben von Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al (eds.), The Encyclopedia of Mololecular Biology, herausgegeben von Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02128-9); und Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology, a Comprehensive Desk Reference, herausgeben von VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor, New York.
  • Zur Erleichterung des Überblicks über die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung werden die folgenden Definitionen gegeben:
  • Thioredoxin-Protein oder Thioredoxin-Polypeptid: Eine große Anzahl pflanzlicher, tierischer und mikrobieller Thioredoxin-Proteine oder Polypeptide wurde charakterisiert, und die Gene, die viele dieser Proteine codieren, wurden geklont und sequenziert. Die vorliegende Erfindung betrifft bevorzugt die Verwendung von Thioredoxin h-Proteinen, obwohl auch andere Thioredoxin-Proteine verwendet werden können, um transgene Pflanzen zu erzeugen, wie hierin beschrieben. Unter den Thioredoxin h-Proteinen aus Pflanzen, die bisher beschrieben wurden, sind Thioredoxin h-Proteine von Arabidopsis thaliana (Rivera-Madrid et al., 1993; Rivera-Madrid et al., 1995), Nicotiana tabacum (Marty and Meyer, 1991; Brugidou et al., 1993), Oryza sativa (Ishiwatari et al., 1995), Brassica napus (Bower et al., 1996), Glycine max (Shi and Bhattacharyya, 1996) und Triticum aestivum (Gautier et al., 1998). Die Aminosäure-Sequenzen dieser und anderer Thioredoxin h-Proteine und die Nucleotid-Sequenz von cDNAs und/oder Genen, die diese Proteine codieren, sind in der wissenschaftlichen Literatur und öffentlich zugänglichen Sequenz-Datenbanken verfügbar. Beispielsweise wird eine cDNA, die Thioredoxin h von Picea mariana codiert, unter der Zugangsnummer AF051206 (NID g2982246) von GenBank beschrieben und sie wird ausfindig gemacht durch eine Suche unter Verwendung von Entrez browser/nucleotide sequence search der National Center for Biotechnolgy Infirmation website, www.ncbi.nlm.nih.gov. Die cDNA, die das in den unten beschriebenen Beispielen verwendete Thioredoxin h-Protein von Triticum aestivum codiert, ist in derselben Datenbank unter der Zugansnummer X69915 (NID g2995377) beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung kann ausgeführt werden unter Verwendung von Nucleinsäure-Sequenzen, die Thioredoxin h-Proteine voller Länge sowie von Thioredoxin h abgeleitete Proteine, die Thioredoxin h-Aktivität beibehalten, codieren. Zu von Thioredoxin h abgeleiteten Proteinen, die die biologische Aktivität von Thioredoxin beibehalten, gehören Fragmente von Thioredoxin h, erzeugt entweder durch chemischen (z. B. enzymatischen) Verdau oder durch gentechnologische Mittel; chemisch funktionalisierte Protein-Moleküle, die ausgehend von den angegebenen Protein- oder Nucleinsäure-Sequenzen erhalten wurden, und Protein-Sequenz-Varianten, beispielsweise Allel-Varianten und Mutations-Varianten, wie die durch in vitro-mutagenese Techniken wie Gen-Shuffling erzeugten (Stemmer et al., 1994a, 1994b). So umfaßt der Begriff "Thioredoxin h-Protein" Thioreoxine h-Proteine voller Länge sowie von Thioredoxin h abgeleitete Proteine, die Thioredoxin h-Aktivität beibehalten.
  • Thioredoxin-Protein kann in biologischen Proben (wie Samen) entweder ausgedrückt als Proteingehalt oder ausgedrückt als Thioredoxin-Aktivität mengenmäßig bestimmt werden. Der Thioredoxin-Proteingehalt kann bestimmt werden unter Verwendung einer Western-Blot-Analyse gefolgt von quantitativem Scannen des Abbilds, wie es unten detailliert beschrieben ist. Die Thioredoxin-Aktivität kann unter Verwendung einer Anzahl verschiedener Verfahren, die in der Technik bekannt sind, quantitativ bestimmt werden. Zu bevorzugten Verfahren zur Messung der biologischen Aktivität von Thioredoxin, die Thioredoxin h zuzuschreiben ist, in Pflanzenextrakten gehören die NADP/malat dehydrogenase-Aktivierung (Johnson et al., 1987a, b) und die Reduktion von 2',5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) mittels NADP-Thioredoxin-Reduktase (Florencio et al., 1988; US-Patent Nr. 5 792 506). Wegen der Möglichkeit von Störungen durch Nicht-Thioredoxin h-Enzyme, die NADPH verwenden, sollte die genaue Bestimmung der Aktivität von Thioredoxin h bevorzugt unter Verwendung teilgereinigter Pflanzenextrakte durchgeführt werden. Zur Erzielung dieser Teilreinigung können Standard-Proteinreinigungsverfahren (z. B. (NH4)2-SO-4-Extraktion oder Wärme) verwendet werden. Die Aktivität von Thioredoxin h kann auch ausgedrückt werden als spezifische Aktivität, d, h. Thioredoxin-Aktivität pro Einheit an vorhandenem Protein, wie es unten detaillierter beschrieben ist.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform kann Thioredoxin ausgedrückt werden als Thioredoxin-Gehalt, wie Masse/Gewebemasse (d. h. μg/Gramm Gewebe) oder Masse/Masse an löslichem Protein (d. h. μg/mg lösliches Protein).
  • Promotor:
  • Eine regulatorische Nucleinsäure-Sequenz, typischerweise stromauf (5') eines Gens angeordnet, die i n Verbindung mit verschiedenen zellulären Proteinen für die Regulierung der Expression des Gens verantwortlich ist. Promotoren können die Genexpression in einer Anzahl von Arten regulieren. Beispielsweise kann die Expression gewebespezifisch sein, was bedeutet, dass das Gen in bestimmten Geweben in erhöhter Menge exprimiert wird, oder entwicklungsreguliert sein, so dass das Gen zu bestimmten Zeiten der Entwicklung in erhöhten Mengen exprimiert wird, oder beides.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Transgen der Erfindung in einem eßbaren Teil einer Pflanze exprimiert. Mit "eßbar" ist hierin zumindest ein Teil einer Pflanze, der zum Konsum durch Menschen oder Tiere (Fisch, Krustentiere, Isopoden, Dekapoden, Affen, Rinder, Ziegen, Schweine, Kaninchen, Pferde, Vögel (Hühner, Papageien, etc.)) geeignet ist, gemeint. Dementsprechend umfaßt "eßbarer" Nahrung für menschlichen Konsum und Futter für tierischen Konsum, und dazu gehört beispielsweise Teig, Brot, Plätzchen, Nudelwaren, Torten, Getränke, Bier, Nahrungsmittelzusätze, Verdickungsmittel, Malz, Extrakte, die hergestellt sind aus einem eßbaren Teil von Pflanzen, Tierfutter, und dergleichen. Ein eßbaren Teil einer Pflanze ist beispielsweise eine Wurzel, eine Knolle, ein Same, ein Korn, eine Blüte; eine Frucht, ein Blatt, etc.. Der Fachmann ist sich bewußt, dass eine Expression des Transgens in irgendeinem Gewebe, Organ oder Teil einer Pflanze bewirkt wird durch Verwendung eines Promotors, der in dem gewählten Teil der Pflanze, in dem das Transgen exprimiert werden soll, aktiv ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Transgen in einem Samen exprimiert, bevorzugt unter der Kontrolle eines Samen- oder Korn-spezifischen Promotors.
  • Die Expression eines Transgens in Samen oder Körnern gemäß der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt erreicht durch funktionswirksames Verbinden eines Samen-spezifichen oder Korn-spezifischen Promotors mit dem Nucleinsäure-Molekül, das das Transgen-Protein codiert. In diesem Zusammenhang bedeutet "Samen-spezifisch", dass der Promotor in Samen, im Vergleich zu anderen Pflanzengeweben, eine erhöhte Aktivität hat; es erfordert nicht, dass der Promotor ausschließlich in den Samen aktiv ist. Dementsprechend gibt "Korn-spezifisch" an, dass der Promotor in Körnern, im Vergleich zu anderen Pflanzengeweben, eine erhöhte Aktivität hat; es erfordert nicht, dass der Promotor ausschließlich im Korn aktiv ist. Bevorzugt wird der gewählte Samen- oder Korn-spezifische Promotor zu der Zeit, wenn der Promotor in den Samen am aktivsten ist, eine Expression eines Proteins in dem Samen einer Pflanze hervorrufen, die mindestens etwa zweimal größer ist als die Expression des Proteins, die von demselben Promotor in den Blättern oder Wurzeln der Pflanze hervorgerufen wird. Unter Berücksichtigung der Natur des Thioredoxin-Proteins kann es jedoch vorteilhaft sein, einen Samen- oder Korn-spezifischen Promotor zu wählen, der in anderen Geweben als Samen oder Korn wenig oder keine Protein-Expression verursacht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Promotor spezifisch für Samen- und Korn-Expression, so dass die Expression im Samen und Korn im Vergleich zu ande ren Pflanzengeweben erhöht ist, erfordert aber nicht, dass der Promotor ausschließlich im Korn und Samen aktiv ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor "spezifisch" für eine Struktur oder ein Element eines Samens oder Korns, wie ein Embryo-spezifischer Promotor. Gemäß den oben angegebenen Definitionen hat ein Embryo-spezifischer Promotor eine erhöhte Aktivität in einem Embryo, verglichen mit anderen Teilen eines Samens oder Korns oder einer Pflanze, und erfordert nicht, dass seine Aktivität auf einen Embryo beschränkt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor "reifungsspezifisch" und hat dementsprechend entwicklungsmäßig während der Reifung eines Teils einer Pflanze im Vergleich zu anderen Teilen einer Pflanze eine erhöhte Aktivität, und erfordert nicht, dass seine Aktivität auf die Entwicklung eines Teils einer Pflanze beschränkt ist.
  • Ein Samen- oder Korn-spezifischer Promotor kann eine Expression in verschiedenen Geweben des Samens einschließlich Endosperm, Embryo, und Aleuron oder Korn hervorrufen. Zu diesem Zweck kann irgendein Samen- oder Korn-spezifischer Promotor verwendet werden, wenn es auch vorteilhaft ist, einen Samen- oder Korn-spezifischen Promotor zu wählen, der in dem Pflanzensamen oder -korn eine hohe Expressionsstärke des Proteins hervorruft. Zu bekannten samen- oder kornspezifischen Promotoren gehören jene, die zu Genen gehören, die Pflanzensamen-Speicherproteine codieren, wie Gene, die codieren: Gersten-Hordeine, Reis-Gluteline,-Oryzine oder -Prolamine; Weizen-Gliadine oder -Glutenine; Mais-Zeine oder -Gluteline, Mais-embryospezifischer Promotor; Hafer-Gluteline; Sorghum-Kasirine; Hirse-Pennisetine; oder Roggen-Secaline.
  • Die Gersten-Hordein-Promotoren (unten detaillierter beschrieben) sind samen- oder kornspezifische Promotoren, die in den veranschaulichenden Beispielen verwendet wurden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen ist der gewählte Samen- oder Kornspezifische Promotor ein reifungsspezifischer Promotor. Die Verwendung von Promotoren, die während der Samen- oder Korn-Reifung eine gesteigerte Expression verleihen (wie die Gersten-Hordein-Promotoren), kann zu sogar höheren Mengen an Thioredoxin-Expression in den Samen führen.
  • "Samen- oder Korn-Reifung" bezieht sich hierin auf die mit der Befruchtung beginnende Periode, in der metabolisierbare Nahrungsreserven (z. B. Proteine, Lipide, Stärke, etc.) in dem sich entwickelnden Samen eingelagert werden, insbesondere in Speicherorganen des Samens, wozu das Endosperm, die Samenschale, die Aleuronschicht, der Embryo und das Scutulum-Epithel gehören, was zu einer Vergrößerung und Füllung des Samens führt und mit der Austrocknung des Samens endet.
  • Mitglieder der Grasfamilie, wozu die Getreidekörner gehören, erzeugen trockene, einsamige Früchte. Dieser Typ von Frucht ist genau genommen ein Karyopsis, wird aber üblicherweise ein Kern oder ein Korn genannt. Die Karyopsis hat eine Fruchtschale oder Fruchthülle, die den Samen umgibt und eng an einer Samenschale: haftet. Der Same besteht aus einem Embryo oder Keim und einem Endosperrn, umschlossen von einer Nucellusepidermis und einer Samenschale. Dementsprechend weist das Korn den Samen und seine Schale oder Fruchthülle auf. Der Same weist den Embryo und das Endosperm auf (R. Carl Hoseney in "Principles of Cereal Science and Technology", durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit ausdrücklich aufgenommen).
  • Hordein-Promotor: Ein Gersten-Promotor, der die Transkription eines Hordein-Gens in Gersten-Samen oder -Körner lenkt. Eine Anzahl von Gersten-Hordein-Genen und zugehörigen Promotoren wurde beschrieben und charakterisiert, einschließlich jener für die B-, C-, D- und Gamma-Hordeine (Brandt et al., 1985, Forde et al., 1985; Rasmussen and Brandt; 1986, S⌀rensen et al., 1996). Die Aktivität dieser Promotoren in Tests vorübergehender Expression wurde ebenfalls charakterisiert (Entwistle et al., 1981; Muller and Knudesen, 1993; S⌀arensen et al., 1996). Für diese Erfindung kann zwar irgendein Hordein-Promotor verwendet werden, aber die angegebenen speziellen Beispiele beschreiben die Verwendung der Promotor-Sequenzen von den B1- und D-Hordein-Genen von Gerste. Die Nucleinsäure-Sequenzen der Gersten-B1 und D-Hordein-Gene sind in SEQ ID NOs: 1 bzw. 3 und in den 6 und 7 gezeigt (der Promotor-Bereich enthält nicht Nucleotide, die das Hordein-Signalpeptid, das unterstrichen gezeigt ist, codieren). S⌀rensen et al., (1996) beschreibt Plasmide, die die B1-und D-Hordein-Promotoren enthalten, funktionswirksam gebunden an ein beta-Glucuronidase-Gen (uidA; gus) und die Nopalinsynthase-3'-Polyadenylierungsstelle (nos) von Agrobacterium tumefaciens. Diese Plasmide können konventionell als Quelle für sowohl die Hordein-Promotoren als auch die nos-Polyadenylierungsstelle verwendet werden.
  • Ein Fachmann wird sich bewußt sein, dass die Länge des Hordein-Promotorbereichs auch größer oder kleiner sein kann als die in den 6 und 7 dargestellten Sequenzen. Beispielsweise kann eine zusätzliche 5'-Sequenz vom stromaufwärtigen Bereich des Hordein-Gens zu der Promotor-Sequenz hinzugefügt werden, oder es können Basen von den dargestellten Sequenzen entfernt werden. Jedoch muß jede Hordein-Promotor-Sequenz in der Lage sein, die Transkription einer funktionswirksam gebundenen Sequenz in Pflanzen-Samen oder -Körner zu lenken. Die Fähigkeit eines Gersten-Hordein-Promotors, die Transkription eines Proteins in einen Pflanzen-Samen zu lenken, kann leicht geprüft werden, indem man die Promotor-Sequenz funktionswirksam an einen offenen Leserahmen (ORF, open reading frame), der ein leicht nachweisbares Protein codiert, wie den gus-ORF, bindet, das sich ergebende Konstrukt in Pflanzen einführt und dann die Expression des Proteins in Samen der Pflanze untersucht (siehe S⌀rensen et al., 1996). Ein Hordein-Promotor wird typischerweise samenspezifische Expression verleihen, was bedeutet, dass die Expression des von dem funktionswirksam gebundenen ORF codierten Proteins im allgemeinen in Samen der stabil transfizierten Pflanze, verglichen mit anderen Geweben wie Blättern, mindestens etwa zweimal so hoch sein wird (untersucht auf der Basis der Aktivität). In üblicherer Weise wird der Hordein-Promotor in Samen eine Expression bewirken, die mindestens etwa fünffach höher ist als die Expression in anderen Geweben der Pflanze.
  • Funktionshomologe der hierin offenbarten Gersten-Hordein-Promotoren können von anderen Pflanzen-Spezies wie von anderen Monokotyledonen, einschließlich Weizen, Reis und Mais, erhalten werden. Derartige Homologe können bestimmte Grade an Sequenz-Identität mit den Hordein-Promotoren des Prototyps haben (z. B. mindestens 40% Sequenz-Identität). Die Funktionshomologe behalten die Hordein-Promotorfunktion bei, d. h. sie behalten die Fähigkeit, an funktionswirksam gebundenen ORFs Samen- oder Kornspezifische Expression zu verleihen, wenn sie in Pflanzen eingeführt werden (Marris et al., 1988; Mena et al., 1998). Dementsprechend versteht es sich, dass wenn hierin auf einen Hordein-Promotor Bezug genommen wird, eine solche Bezugnahme nicht nur Nucleinsäure-Moleküle umfaßt, die die Sequenzen der hierin offenbarten Prototyp-Sequenzen (oder Variationen dieser Sequenzen) haben, sondern auch Promotoren von Hordein-Gen-Homologen. Ebenfalls vom Umfang solcher Begriffe umfaßt sind Moleküle, die sich von den offenbarten Prototyp-Molekülen durch kleinere Variationen unterscheiden. Solche Sequenz-Varianten können durch Manipulation der Nucleotid-Sequenz des Hordein-Promotors unter Verwendung von Standardverfahren wie gerichteter Mutagenese oder der Polymerase-Kettenreaktion erzeugt werden. Bevorzugt wird die Samen- oder Korn-Spezifität des Promotors beibehalten. Beispiele für die Dikotyledon-Promotoren, die verwendet werden können, sind beispielsweise Sojabohnen-Glycinine und -con-Glycinine und Phaseolin-Promotoren aus Kidneybohnen.
  • Signalpeptid: Wie in den Beispielen unten beschrieben ist, haben die Erfinder herausgefunden, dass der Thioredoxin-Expressionsgrad in Samen oder Körnern durch die Anwesenheit eines Signalpeptids erhöht werden kann. In einem der unten beschriebenen Beispiele wurde das B1-Hordein-Signalpeptid verwendet. Insbesondere wurde herausgefunden, dass die Expression von Thioredoxin-Protein im Samen oder Korn erhöht wird, wenn der das Protein codierende ORF funktionswirksam sowohl an einen Hordein-Promotor als auch eine Hordein-Signalsequenz, die das Signalpeptid codiert, gebunden ist. (Bequemerweise wird hierin die ein Signalpeptid codierende Nucleinsäure-Sequenz als eine Signalsequenz bezeichnet.) Es wird vorgeschlagen, ohne theoretisch gebunden sein zu wollen, dass das Hordein-Signalpeptid die Expression des Thioredoxin-Proteins zu einem geschützten subzellulären Ort wie einer Vakuole oder einem Proteinkörper lenkt. Es wird außerdem vorgeschlagen, dass zu solchen Vakuolen gelenkte Proteine während bestimmter Stadien der Samen- oder Korn-Reifung gegen Proteolyse geschützt sind. Außerdem kann die Sequestrierung des Thioredoxin-Proteins an einem solchen Ort auch dazu dienen, die reifenden Samen oder Körner gegen schädliche Wirkungen, die mit Thioredoxin-Überexpression einhergehen, zu schützen.
  • Das Hordein-Signalpeptid weist typischerweise etwa die ersten 15 bis 25 Aminosäuren des ORF des Hordein-Gens auf, in üblicherer Weise etwa 18 bis 21 Aminosäuren. Die Nucleotid- und Aminosäure-Sequenzen der Hordein-Signalsequenz und des Hordein-Peptids der B, und D-Hordein-Gene der Prototyp-Gerste sind in SEQ ID NOs: 1–4 und den 6 und 7 gezeigt. Ein Fachmann wird sich bewußt sein, dass zwar in den unten beschriebenen Beispielen die B1-Hordein-Signalsequenz und das B1-Hordein-Signalpeptid verwendet werden, dass aber die Erfindung nicht auf diese speziellen Sequenzen beschränkt ist. Beispielsweise können homologe Sequenzen ebenso wirksam verwendet werden, wie auch Sequenzen, die sich in den genauen Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen unterscheiden, vorausgesetzt, dass solche Sequenzen zu erhöhten Mengen des codierten Proteins im unreifen Samen oder Korn führen. Typischerweise ist eine "erhöhte Expression" eine Expression, die etwa doppelt so hoch ist wie diejenige, die mit einem äquivalenten Konstrukt, dem die Signalsequenz fehlt, beobachtet wird. Dementsprechend umfaßt der Begriff "Hordein-Signalsequenz" und "Hordein-Signalpeptid" nicht nur die speziellen hierin gezeigten Sequenzen, sondern auch Homologe und Varianten dieser Sequenzen.
  • Darüber hinaus ist die Endung nicht auf die Verwendung von Hordein-Signalpeptiden beschränkt. Andere Signalpeptide, die dazu dienen, das Thioredoxin co-translatorisch oder post-translatorisch örtlich auf einen gewählten Samen, Korn oder Zellabschnitt zu beschränken, können verwendet werden. Derartige andere Signalsequenzen umfassen jene, die zu Speicherproteinen in Mais, Reis, Weizen, Sojabohnen, Bohnen und Tabak gehören (siehe beispielsweise: Bagga et al., 1997; Torrent et al., 1997; Wu et al., 1998; Zheng et al., 1995; Grimwade et al., 1996; Conrad et al., 1998; und Takaiwa et al., 1995.) Stärke: Ein Polysaccharid, aufgebaut aus einer Kette von Glucose-Einheiten, die durch alpha-1,4-Bindungen verbunden sind, entweder unverzweigt (Amylose) oder verzweigt (Amylopektin) an alpha-1,6-Bindungen.
  • Dextran: Irgendeines aus einer Vielfalt von Speicher-Polysacchariden, üblicherweise verzweigt, das aus Glucose-Resten, die durch alpha-1,6-Bindungen verbunden sind, aufgebaut ist.
  • Dextrin oder Grenzdextrin: Irgendeines aus einer Gruppe von kleinen, löslichen Polysacchariden, Produkten teilweiser Hydrolyse von Stärke, üblicherweise angereichert an alpha-1,6-Bindungen.
  • Keimen: Eine Wiederaufnahme des Wachstums eines Pflanzenembryos unter günstigen Bedingungen nach Samen-Reifung und -Trocknung (Entfeuchtung) und Austritt eines jungen Schößlings und einer Wurzel aus dem Samen.
  • Allergen: Eine antigene Substanz, die in einem empfänglichen Wirt eine allergische Reaktion bewirkt. Folglich hat ein empfänglicher Wirt einen Immunstatus (Hypersensibilität), der bei einer Allergen-Exposition zu einer abnormen oder schädlichen Immunreaktion führt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform haben die transgenen Körner der Erfindung im Vergleich zu nicht-transgenen Körnern eine verringerte allergene Wirkung. Die Immunreaktion kann unmittelbar oder verzögert, Zell-vermittelt oder Antikörper-vermittelt, oder eine Kombination davon sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die allergische Reaktion eine Hypersensibilität vom Soforttyp.
  • Verdau: Mit "Verdau" ist hierin die Umwandlung eines Moleküls oder einer Verbindung in einen oder mehrere ihrer Bestandteile gemeint. Dementspre chend betrifft "Verdaubarkeit" die Geschwindigkeit und Wirksamkeit, mit der die Umwandlung in einen oder mehrere ihrer Bestandteile geschieht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine "verdaubare Verbindung" beispielsweise ein Nahrungsmittel, das durch chemische oder enzymatische Mittel in seine chemischen Bestandteile umgewandelt wird. Beispielsweise wird Dextran umgewandelt in Dextrin, Polysaccharide, Monosaccharide, Grenzdextrin, etc.; ein Protein wird umgewandelt in Polypeptide, Oligopeptide, Aminosäuren, Ammoniak, etc.; eine Nucleinsäure wird umgewandelt in Oligonucleotide, Nucleotide, Nucleoside, Purin, Pyrimidine, Phosphate, etc.. Bei einer bevorzugten Ausführungsform haben die transgenen Körner der Erfindung eine erhöhte Verdaubarkeit, d. h. sie werden im Vergleich zu nicht-transgenem Korn effizienter oder schneller verdaut.
  • Sequenz-Identität: Die Ähnlichkeit zwischen zwei Nucleinsäure-Sequenzen oder zwei Aminosäure-Sequenzen wird ausgedrückt als Sequenz-Identität (oder für Proteine auch als Sequenz-Ähnlichkeit). Die Sequenz-Identität wird häufig als prozentuale Identität gemessen; je höher der Prozentsatz, desto ähnlicher sind die zwei Sequenzen. Wie oben beschrieben, können bei der vorliegenden Erfindung Homologe und Varianten der Thioredoxin-Nucleinsäure-Moleküle, Hordein-Promotoren und Hordein-Signalpeptide verwendet werden. Homologe und Varianten dieser Nucleinsäure-Moleküle werden einen relativ hohen Grad an Sequenz-Identität besitzen, wenn sie unter Verwendung von Standardverfahren abgeglichen (aligned) werden.
  • Verfahren zum Abgleichen von Sequenzen zum Vergleich sind in der Technik wohl bekannt. Verschiedene Programme und Abgleich-Algorithmen sind beschrieben in: Smith and Waterman (1981); Needleman and Wunsch (1970); Pearson and Lipman (1988); Higgins and Sharp (1988); Higgins and Scharp (1989); Corpet et al., (1988); Huang et al., (1992); und Pearson et al., (1994). Altschul et al., (1994) legt eine genaue Betrachtung von Sequenz-Abgleichverfahren und Homologie-Berechnungen vor.
  • Das NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) ist von mehreren Quellen erhältlich, einschließlich dem National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) und im Internet, zur Verwendung in Verbindung mit den Sequenzanalyse-Programmen blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx. Es ist zugänglich unter http://www.ncbi.nm.nih.gov/ BLAST. Eine Beschreibung, wie die Sequenz-Identität unter Verwendung dieses Programms zu bestimmen ist, ist erhältlich unter http://www.nchi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.help.html.
  • Homologe der offenbarten Protein-Sequenzen sind typischerweise dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 40% Sequenz-Identität besitzen, gezählt über den Abgleich mit der Aminosäure-Sequenz der offenbarten Sequenz über . die volle Länge unter Verwendung des NCBI Blast 2,0-Lücken-Blastp, eingestellt auf Standardparameter. Die anpassbaren Parameter werden bevorzugt auf die folgenden Werte eingestellt: Überlappungsspanne = 1, Überlappungsbruchteil = 0,125, Wortschwelle (T) = 11. Die HSP S- und HSP S2-Parameter sind dynamische Werte und werden vom Programm selbst erstellt, abhängig von der Zusammensetzung der speziellen Sequenz und der Zusammensetzung der speziellen Datenbank, gegen die die Sequenz von Interesse gesucht wird; die Werte können jedoch angepaßt werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Proteine mit sogar größerer Ähnlichkeit mit den Bezugs-Sequenzen werden steigende prozentuale Identitäten zeigen, wenn sie mit diesem Verfahren untersucht werden, wie mindestens etwa 50%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 90% oder mindestens etwa 95% Sequenz-Identität.
  • Homologe der offenbarten Nucleinsäure-Sequenzen sind typischerweise dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens 40% Sequenz-Identität, gezählt durch Abgleich mit der Aminosäure-Sequenz der offenbarten Sequenz über die volle Länge, besitzen, wobei der NCBI Blast 2,0-Lücken-blastn, eingestellt auf Standardparameter, verwendet wird. Ein bevorzugtes Verfahren verwendet das BLASTN-Modul von WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996), eingestellt auf die Standardparameter, mit einer Überlappungs-Spanne und einem Überlappungs-Bruchteil, die auf 1 bzw. 0,125 eingestellt sind. Nucleinsäure-Se quenzen mit sogar größerer Ähnlichkeit mit den Bezugssequenzen werden steigende prozentuale Identitäten zeigen, wenn sie mit diesem Verfahren untersucht werden, wie mindestens etwa 50%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 90% oder mindestens etwa 95% Sequenz-Identität.
  • Der Abgleich kann die Einführung von Lücken in die abzugleichenden Sequenzen beinhalten. Für Sequenzen, die entweder mehr oder weniger Aminosäuren enthalten als das von den Sequenzen der Figuren codierte Protein, versteht es sich außerdem, dass bei einer Ausführungsform der Prozentsatz der Sequenz-Identität auf der Basis der Anzahl identischer Aminosäuren bezogen auf die Gesamtzahl an Aminosäuren bestimmt wird. So wird beispielsweise die Sequenz-Identität von Sequenzen, die kürzer sind als die in den unten diskutierten Figuren gezeigten, bei einer Ausführungsform unter Verwendung der Anzahl an Aminosäuren in der längeren Sequenz bestimmt. Bei Berechnungen der prozentualen Identität wird den verschiedenen Manifestationen von Sequenz-Variation wie Insertionen, Deletionen, Substitutionen, etc. keine relative Gewichtung zugeordnet.
  • Bei einer Ausführunsform werden nur Identitäten positiv (+1) bewertet und allen Formen von Sequenz-Variation einschließlich Lücken wird ein Wert von "0" zugeordnet, was die Notwendigkeit einer gewichteten Skala oder von Parametern, wie sie hierin für Berechnungen der Sequenz-Ähnlichkeit beschrieben sind, erübrigt. Die prozentuale Sequenz-Identität kann beispielsweise berechnet werden durch dividieren der Anzahl übereinstimmender identischer Gruppen durch die Gesamtzahl an Gruppen der "kürzeren" Sequenz in dem abgeglichenen Bereich und Multiplizieren mit 100. Die "längere" Sequenz ist diejenige, die die meisten tatsächlichen Gruppen in dem abgeglichenen Bereich hat.
  • Fachleute werden sich bewußt sein, dass die Sequenzen der vorliegenden Erfindung Sequenzierungsfehler enthalten können, d. h. es kann in irgendeiner der Sequenzen unkorrekte Nucleoside, Rahmenverschiebungen, unbekannte Nucleoside oder andere Arten von Sequenzierungsfehlern geben; die korrekten Sequenzen fallen jedoch unter die hierin angegebenen Homologie- und Stringenz-Definitionen.
  • Vektor: Ein Nucleinsäure-Molekül, eingeführt in eine Wirtszelle, wodurch eine transformierte Wirtszelle erzeugt wird. Ein Vektor kann eine oder mehrere Nucleinsäure-Sequenzen enthalten, die es ihm erlauben, in einer oder mehreren Wirtszellen zu replizieren, wie einen Replikationsursprung oder Replikationsursprünge. Ein Vektor kann auch ein oder mehrere selektierbare Markergene und andere in der Technik bekannte genetische Elemente enthalten.
  • Transformiert: Eine transformierte Zelle ist eine Zelle, in die durch molekularbiologische Techniken ein Nucleinsäure-Molekül eingeführt wurde. Der Begriff Transformation, wie er hierin verwendet wird, umfaßt alle Techniken, durch die ein Nucleinsäure-Molekül in solch eine Zelle, Pflanzen- oder Tier-Zelle, eingeführt werden könnte, einschließlich Transfektion mit viralen Vektoren, Transformation durch Agrobacterium, mit Plasmidvektoren, und Einführung nackter DNA durch Elektroporation, Lipofektion und Teilchenstrahler-Beschleunigung, und umfaßt vorübergehende sowie stabile Transformanten.
  • Isoliert: Ein "isolierter" biologischer Bestandteil (wie eine Nucleinsäure oder ein Protein oder eine Organelle) wurde im wesentlichen abgetrennt oder gereinigt von anderen biologischen Bestandteilen in der Zelle oder dem Organismus, worin der Bestandteil natürlicherweise vorkommt, d. h. anderer chromosomaler oder extra-chromosomaler DNA und RNA, Proteinen und Organellen. Nucleinsäuren und Proteine, die "isoliert" wurden, beinhalten Nucleinsäuren und Proteine, die durch Standard-Reinigungsverfahren gereinigt wurden. Der Begriff umfaßt Nucleinsäuren einschließlich chemisch synthetisierter Nucleinsäuren, und umfaßt auch Proteine, die durch rekombinante Expression in vitro oder in einer Wirtszelle hergestellt wurden und rekombinante Nucleinsäuren wie unten definiert.
  • Funktionswirksam gebunden: Eine erste Nucleinsäure-Sequenz ist mit einer zweiten Nucleinsäure-Sequenz funktionswirksam verbunden, wenn die erste Nucleinsäure-Sequenz in einer funktionswirksamen Beziehung zu der zweiten Nucleinsäure-Sequenz angeordnet ist. Beispielsweise ist ein Promotor funktionswirksam an eine codierende Sequenz gebunden, wenn der Promotor die Transkription oder Expression der codierenden Sequenz beeinflußt. Im allgemeinen sind funktionswirksam verbundene DNA-Sequenzen benachbart und vereinigen nötigenfalls zwei protein-codierende Bereiche im selben Leserahmen. Was Polypeptide betrifft können zwei Polypeptid-Sequenzen durch kovalente Bindung wie durch Peptidbindungen oder Disulfidbindungen funktionswirksam gebunden sein.
  • Rekombinant: Mit "rekombinanter Nucleinsäure" ist hierin eine Nucleinsäure gemeint, die eine Sequenz hat, die nicht natürlich vorkommt, oder die eine Sequenz hat, die durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Sequenz-Abschnitten hergestellt ist. Diese künstliche Kombination wird oft erzielt durch chemische Synthese oder, üblicher, durch die künstliche Manipulation von Nucleinsäuren, z. B. durch gentechnologische Techniken, wie durch die Manipulation mindestens einer Nucleinsäure durch ein Restriktionsenzym, eine Ligase, Rekombinase und/oder eine Polymerase. Nach Einführung in eine Wirtszelle wird eine rekombinante Nucleinsäure von der Wirtszelle repliziert, jedoch für die Zwecke dieser Erfindung bleibt die rekombinante Nucleinsäure, nachdem sie in der Zelle repliziert wurde, eine rekombinante Nucleinsäure. Mit "rekombinantes Protein" ist hierin ein Protein gemeint, das durch ein Verfahren, das eine rekombinante Nucleinsäure verwendet, erzeugt wurde. Wie oben dargelegt, sind "rekombinante Nucleinsäuren" und "rekombinante Proteine" auch "isoliert", wie oben beschrieben.
  • Komplementäre DNA, (cDNA): Ein DNA-Stück, das im Labor durch reverse Transkription einer RNA, bevorzugt einer aus Zellen extrahierten RNA, synthetisiert wird. Aus mRNA erzeugter cDNA fehlen typischerweise interne, nicht codierende Abschnitte (Introns) und regulatorische Sequenzen, die die Transkription bestimmen.
  • Offener Leserahmen (ORF); (open reading frame): Eine Reihe von Nucleotid-Tripletts (Codons), die Aminosäuren codieren, ohne irgendwelche internen Terminations-Codons. Diese Sequenzen sind üblicherweise in ein Peptid translatierbar.
  • Transgene Pflanze: Dieser Begriff, wie er hierin verwendet wird, betrifft eine Pflanze, die rekombinantes genetisches Material enthält, das man normalerweise in Pflanzen dieses Typs nicht findet und das durch menschliche Manipulation in die fragliche Pflanze (oder in Vorgänger der Pflanze) eingeführt wurde. So ist eine Pflanze, die aus einer Pflanzenzelle, in die durch Transformation rekombinante DNA eingeführt wurde, wachsen lassen wurde, eine transgene Pflanze, wie es alle Nachkommen der Pflanze sind, die das eingeführte Transgen enthalten (ob sexuell oder asexuell erzeugt). Es versteht sich, dass der Begriff transgene Pflanze die gesamte Pflanze und Teile der Pflanze, beispielsweise Körner, Samen, Blüten, Blätter, Wurzeln, Früchte, Pollen, Stiele, etc., umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung ist sowohl auf Dikotyledon-Pflanzen (z. B. Tomate, Kartoffel, Sojabohnen, Baumwolle, Tabak, etc.) als auch auf Monokotyledon-Pflanzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, grasartige Monokotyledone wie Weizen (Triticum spp.), Reis (Oryza spp.), Gerste (Hordeum spp.), Hafer (Avena spp.), Roggen (Secale spp.), Mais (Zea mays), Sorghum (Sorghum spp.) und Hirse (Penniseturn spp.), anwendbar. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung mit Gersten-Genotypen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Salome, Steptoe, Klages, Baronesse, und mit Weizen-Genotypen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Yecora Rojo, Bobwhite, Karl und Anza, verwendet werden. Im allgemeinen ist die vorliegende Erfindung besonders brauchbar bei Getreiden.
  • Gereinigt: Der Begriff gereinigt erfordert keine absolute Reinheit; vielmehr ist er als ein relativer Begriff beabsichtigt. So ist beispielsweise ein gereinigtes Präparat von Gersten-Thioredoxin h-Protein eines, in dem das Gersten-Thioredoxin h-Protein angereicherter oder biochemisch aktiver oder leichter nachweisbar ist als es das Protein in seiner natürlichen Umgebung in einer Zelle oder in Pflanzengewebe ist. Dementsprechend umfaßt oder beinhaltet "gereinigt" die Entfernung oder Inaktivierung eines Hemmstoffes eines Moleküls von Interesse. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Präparat von Gersten-Thioredoxin h-Protein so gereinigt, dass das Gersten-Thioredoxin h mindestens 5–10% des gesamten Proteingehalts des Präparats ausmacht. Für bestimmte Anwendungen kann eine höhere Protein-Reinheit erwünscht sein, so dass Präparate, in denen Gersten-Thioredoxin h mindestestens 50% oder mindestens 75% oder mindestens 90% des gesamten Proteingehalts ausmacht, verwendet werden können.
  • Ortholog: Zwei Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen sind Orthologe voneinander, wenn sie eine gemeinsame ererbte Sequenz teilen, und abweichend, wenn eine die ererbte Sequenz tragende Spezies in zwei Spezies, Sub-Spezies, oder Kulturvarietäten aufspaltete. Orthologe Sequenzen sind auch homologe Sequenzen.
  • II. Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Samen-Thioredoxin
  • Zur Erzeugung transgener Pflanzen, die Samen mit einer erhöhten Menge an Thioredoxin-Protein erzeugen, können molekularbiologische Standardverfahren und Pflanzen-Transformationstechniken verwendet werden. Die folgenden Abschnitte geben eine allgemeine Anleitung bezüglich der Auswahl bestimmter Konstrukte und Transformationsverfahren.
  • a) Konstrukte
  • Die vorliegende Erfindung verwendet rekombinante Konstrukte, die dazu geeignet sind, eine erhöhte Expression von Thioredoxin in Pflanzensamen relativ zu nicht-transformierten Pflanzensamen zu erhalten. In ihrer grundlegensten Form können diese Konstrukte dargestellt werden als P-T, worin P ein Samenspezifischer Promotor ist und T eine Thioredoxin codierende Nucleinsäure-Sequenz ist. Bei einer anderen Ausführungsform kann eine Peptid-Signalsequenz, die die Expression des Thioredoxin-Polypeptids zu einem intrazellulären Körper als Ziel führt, verwendet werden. Derartige Konstrukte können dargestellt werden als P-SS-T, worin SS das Signalpeptid ist. Nucleinsäure-Moleküle, die als die Quelle eines jeden dieser Bestandteile verwendet werden können, sind in dem Definitionen-Abschnitt oben beschrieben.
  • Jeder Bestandteil ist funktionswirksam an den nächsten gebunden. Wenn beispielsweise das Konstrukt den Hordein D-Promoter (P), die Hordein D-Signalsequenz (SS), die das Hordein-Signalpeptid codiert, und einen offenen Leserahmen, der bevorzugt das Weizen Thioredoxin h-Protein (T) codiert, aufweist, ist der Hordein-Promotor an das 5'-Ende der die Hordein-Signalsequenz codierenden Sequenz gebunden und die Hordein-Signalsequenz ist funktionswirksam an das 5'-Ende des offenen Leserahmens von Thioredoxin gebunden, so dass das C-Ende des Signalpeptids mit dem N-Ende des codierten Proteins verbunden ist.
  • Das Konstrukt wird typischerweise auch einen Transkriptions-Terminations-Bereich enthalten, der dem 3'-Ende des ORF des codierten Proteins folgt. Beispielhafte Transkriptions-Terminations-Bereiche schließen den nos-Terminator des Agrabacterium Ti-Plasmids und den alpha-Amylase-Terminator von Reis ein.
  • Molekularbiologische Standardverfahren wie die Polymerase-Kettenreaktion, der Restriktionsenzym-Verdau und/oder die Ligation können verwendet werden, um diese Konstrukte, die irgendein Nucleinsäure-Molekül oder irgendeine Nucleinsäure-Sequenz, die ein Thioredoxin-Protein oder -Polypeptid codiert, enthalten, zu erzeugen.
  • b. Allgemeine Prinzipien der Pflanzen-Transformation
  • Die Einführung des gewählten Konstrukts in Pflanzen wird typischerweise unter Verwendung von Standard-Transformationstechniken erreicht. Der grundlegende Weg ist: (a) Das Konstrukt in einen Transformations-Vektor zu clonieren; der (b) dann durch eine aus einer Anzahl von Techniken (z. B. Elektroporation, Mikropartikel-Bombardierung, Agrobacterium-Infektion) in Pflanzenzellen eingeführt wird; (c) die transformierten Pflanzenzellen zu identifizieren; (d) aus den identifizierten Pflanzenzellen wieder vollständige Pflanzen zu erzeugen und (d) Nachkommen-Pflanzen, die das eingeführte Konstrukt enthalten, zu selektieren.
  • Bevorzugt wird sich der gesamte oder ein Teil des Transformations-Vektors stabil in das Genom der Pflanzenzelle integrieren. Der Teil des Transformations-Vektors, der sich in die Pflanzenzelle integriert und der die eingeführte P- T- oder P-SS-T-Sequenz enthält (das eingeführte "Thioredoxin-Transgen"), kann als die rekombinante Expressions-Kassette bezeichnet werden.
  • Die Selektion von Nachkommen-Pflanzen, die das eingeführte Transgen enthalten, kann durchgeführt werden auf der Basis des Nachweises der Überexpression von Thioredoxin oder NTR in Samen, oder auf der Basis einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegen ein chemisches Mittel (wie ein Antibiotikum) als ein Ergebnis der Einbeziehung eines in den Transformations-Vektor inkorporierten, dominanten selektierbaren Markergens.
  • Erfolgreiche Beispiele für die Modifizierung von Pflanzeneigenschaften durch Transformation mit clonierten Nucleinsäure-Sequenzen sind in der technischen und wissenschaftlichen Literatur überreichlich. Ausgewählte Beispiele, die dazu dienen, das Wissen auf diesem technischen Gebiet zu veranschaulichen, sind:
    US-Patent Nr. 5 571 706 ("Plant Virus Resistance Gene and Methods");
    US-Patent Nr. 5 677 175 ("Plant Pathogen Induced Proteins");
    US-Patent Nr. 5 510 471 ("Chimeric Gene for the Transformation of Plants");
    US-Patent Nr. 5 750 386 ("Pathogen-Resistant Transgenic Plants");
    US-Patent Nr. 5 597 945 ("Plants Genetically Enhanced for Disease Resistance");
    US-Patent Nr. 5 589 615 ("Process for the Production of Transgenic Plants with Increased Nutritional Value Via the Expression of Modified 2S Storage Albumins");
    US-Patent Nr. 5 750 871 ("Transformation and Foreign Gene Expression in Brassica Species")
    US-Patent Nr. 5 268 526 ("Overexpression of Phytochrome in Transgenic Plants")
    US-Patent Nr. 5 780 708 ("Fertile Transgenic Corn Plants");
    US-Patent Nr. 5 538 880 ("Method For Preparing Fertile Transgenic Corn Plants");
    US-Patent Nr. 5 773 269 ("Fertile Transgenic Oat Plants");
    US-Patent Nr. 5 736 369 ("Method For Producing Transgenic Cereal Plants");
    US-Patent Nr. 5 610 049 ("Methods For Stable Transformation of Wheat").
  • Diese Beispiele enthalten Beschreibungen für Transformations-Vektor-Auswahl, Transformations-Techniken und den Aufbau von Konstrukten, die dafür ausgelegt sind, ein eingeführtes Transgen zu exprimieren.
  • c. Pflanzen-Typen
  • Die Transgen-exprimierenden Konstrukte der vorliegenden Erfindung können in einem breiten Bereich höherer Pflanzen brauchbar exprimiert werden, um eine Samen- oder Korn-spezifische Expression ausgewählter Polypeptide zu erhalten. Es wird erwartet, dass die Endung insbesondere auf Monokotyledon-Getreidepflanzen, wozu Gerste, Weizen, Reis, Roggen, Mais, Triticale, Hirse, Sorghum, Hafer, Futter- und Rasen-Gräser gehören, anwendbar ist. Insbesondere werden es die hierin beschriebenen Transformationsverfahren erlauben, dass die Erfindung mit Genotypen von Gerste, wozu Morex, Harrington, Crystal, Stander, Moravian III, Galena, Golden Promise, Steptoe, Klages und Baronesse gehören, und mit kommerziell wichtigen Weizen-Genotypen, wozu Yecora Rojo, Bobwhite, Karl und Anza gehören, verwendet wird.
  • Die Erfindung kann auch auf Dikotyledon-Pflanzen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Sojabohne, Zuckerrübe, Baumwolle, Bohnen, Raps/Canola, Luzerne, Flachs, Sonnenblumen, Saflor, Kohl, Baumwolle, Flachs, Erdnuß, Klee; Gemüse wie Salat, Tornate, Kürbisgewächse, Wintermelone, Kartoffel, Möhre, Rettich, Erbse, Linsen, Kohl, Blumenkohl, Broccoli, Rosenkohl, Pfeffer; und Baumfrüchte wie Zitrusfrüchte, Äpfel, Birnen, Pfirsiche, Aprikosen und Walnüsse, angewendet werden.
  • d. Vektor-Konstruktion
  • Es wurde eine Anzahl rekombinanter Vektoren beschrieben, die für eine stabile Transformation von Pflanzenzellen oder für die Herstellung transgener Pflanzen geeignet sind, einschließlich denen, die in Weissbach and Weissbach, (1989), und Gelvin et al., (1990)) beschrieben sind. Typischerweise enthalten Pflanzen-Transformationsvektoren einen oder mehrere ORFs unter der Transkriptionskontrolle von 5'- und 3'-Regulatorsequenzen und einen dominanten selektierbaren Marker mit 5'- und 3'-Regulatorsequenzen. Die Wahl geeigneter 5'- und 3'-Regulatorsequenzen für Konstrukte der vorliegenden Erfindung wird oben diskutiert. Zu dominanten selektierbaren Markergenen, die die einfache Auslese von Transformanten erlauben, gehören jene, die Antibiotika-Resistenzgene (z. B. Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin, Bleomycin, G418, Streptomycin oder Spectinomycin) und Herbizid-Resistenzgene (z. B. Phosphinothricin-Acetyltransferase) codieren.
  • e. Transformations- und Regenerations-Techniken
  • Verfahren zur Transformation und Regeneration von sowohl Monokotyledonals auch Dikotyledon-Pflanzenzellen sind bekannt, und die geeignete Transformations-Technik wird vom Praktiker bestimmt werden. Die Wahl des Ver fahrens wird mit dem zu transformierenden Pflanzen-Typ variieren; Fachleute werden die Geeignetheit bestimmter Verfahren für gegebene Pflanzen-Typen erkennen. Zu geeigneten Verfahren können gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein: Elektroporation von Pflanzen-Protoplasten; Liposom-vermittelte Transformation; Polyethylenglycol (PEG)-vermittelte Transformation; Transformation unter Verwendung von Viren; Microinjektion von Pflanzenzellen; Microprojektil-Beschuß von Pflanzenzellen; Vakuum-Infiltration; und Agrobacterium-vermittelte Transformation. Typische Verfahren zum Transformieren und Regenerieren von Pflanzen sind in den zu Beginn dieses Abschnitts aufgelisteten Patentschriften beschrieben.
  • f. Selektion transformierter Pflanzen
  • Nach der Transformation werden die Transformanten bevorzugt unter Verwendung eines dominanten selektierbaren Markers selektiert. Typischerweise wird ein derartiger Marker den Sämlingen transformierter Pflanzen Antibiotika- oder Herbizid-Resistenz verleihen, und die Selektion von Transformanten kann erreicht werden, indem man die Sämlinge geeigneten Konzentrationen des Antibiotikums oder Herbizids aussetzt. Nach der Auslese der transformierten Pflanzen und ihrem Wachstum bis zur Reife, um einen Samenansatz zu erlauben, können die Samen geerntet und bezüglich Überexpression von Thioredoxin untersucht werden.
  • III. Verwendung von Pflanzen Samen oder Körnern die erhöhte Mengen an ThioHredoxin exprimieren
  • Bei einer Ausführungsform wird das transgene Protein, beispielsweise in Pflanzen, insbesondere Samen oder Körnern, exprimiertes Thioredoxin, unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren zur Herstellung und Synthese von Thioredoxin verwendet. Das von der rekombinanten Nucleinsäure der Erfindung exprimierte Thioredoxin-Transgen kann an irgendeinem Punkt nach Beginn der Expression des Proteins gewonnen werden. Bei der Gewinnung aus beispielsweise dem Seimen oder Korn oder einem anderen Teil einer Pflanze ist es nicht notwendig, dass der Same oder das Korn oder der andere Teil der Pflanze vor der Gewinnung eine Reifung durchgemacht hat. Die Transgen-Expression kann beispielsweise vor der Samen - oder Korn-Reifung auftreten oder vor der Samen- oder Korn-Reifung optimale Mengen erreichen. Das Transgen-Protein kann gewünschtenfalls durch konventionelle Protein-Reinigungsverfahren aus den Samen oder Körnern isoliert werden. Beispielsweise kann der Same oder das Korn gemahlen werden, dann mit einem wässerigen oder organischen Extraktionsmedium extrahiert werden, gefolgt von der Reinigung des extrahierten Thioredoxin-Proteins. Alternativ kann, abhängig von der Art der beabsichtichten Verwendung, das Transgen-Protein teilgereinigt werden, oder der Same oder das Korn kann unmittelbar ohne Reinigung des Transgen-Proteins für die Nahrungsmittel-Verarbeitung oder andere Zwecke verwendet werden.
  • Beispielsweise fördert der Zusatz von Thioredoxin die Bildung eines Protein-Netzwerks, das Mehl mit verbesserter Backqualität erzeugt. Kobrehel et al., (1994) haben gezeigt, dass der Zusatz von Thioredoxin zu Mehl von nicht-glutenhaltigem Getreide wie Reis, Mais und Sorghum die Bildung eines teigartigen Produkts fördert. Daher findet der Zusatz von Thioredoxin, das unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren in Samen exprimiert wurde, Anwendung bei der Herstellung von Mehl mit verbesserter Backqualität wie erhöhter Festigkeit und/oder erhöhtem Volumen.
  • Die gesteigerte Expresion von Thioredoxin erzeugt auch einen Samen mit einer geänderten biochemischen Zusammensetzung. Beispielsweise erzeugt eine gesteigerte Thioredoxin-Expression Samen mit erhöhter enzymatischer Aktivität wie erhöhter Pullulanase und alpha-Amylase A. Eine gesteigerte Thioredoxin-Expression erzeugt auch Samen mit einer frühen alpha-Amylase B-Aktivierung. Pullulanase ("Ent-Verzweigungs-Enzym") ist ein Enzym, das verzweigte Stärke des Endosperms von Getreidesamen spaltet, indem es alpha-1,6-Bindungen hydrolytisch spaltet. Alpha-Amylasen spalten Stärke-1, 4-Bindungen. Pullulanase und Amylasen sind Enzyme, die für die Brau - und Back-Industrie grundlegend sind. Pullulanase und Amylasen sind erforderlich, um Stärke bei Mälz- und bei bestimmten Back-Vorgängen, die in Abwesenheit von zugesetzten Zuckern oder anderen Kohlehydraten durchgeführt werden, zu spalten. Eine passende Aktivität dieser Enzyme zu erhalten ist problematisch, insbesondere in der Mälzindustrie. Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass Dithiothreitol (DTT, ein chemisches Reduktionsmittel, das Thioredoxin reduziert und manchmal ersetzt) Pullulanase von Getreide-Erzeugnissen (z. B. Gersten-, Hafer- und Reis-Mehlen) aktiviert. Ein Verfahren, mit einem physiologisch annehmbaren System die Aktivität von Pullulanase und alpha-Amylase A passend zu erhöhen und die Aktivierungszeit von alpha-Amylase B zu verkürzen, führt zu schnelleren Mälzverfahren und, wegen der erhöhten Zuckerverfügbarkeit, zu alkoholischen Getränken wie Bieren mit verringertem Kohlehydrat-Gehalt.
  • Dementsprechend liefern Samen oder Körner mit gesteigerter Thioredoxin-Expression Vorteile bei der Erzeugung von Malz und durch ein Fermentationsverfahren erzeugte Getränke. Erhöhte Pullulanase und alpha-Amylase A und eine frühere Induktion von alpha-Amylase B im Korn erhöht die Geschwindigkeit und Effizienz der Keimung, was beim Mälzen wichtig ist, wo Malz mit erhöhter enzymatischer Aktivität erzeugt wird, was zu gesteigerter Hydrolyse von Stärke zu fermentierbaren Kohlehydraten führt, wodurch die Wirksamkeit der Fermentierung bei der Erzeugung alkoholischer Getränke, beispielsweise Bier und Scotch Whisky, verbessert wird. Eine frühe Aktivierung von alpha-Amylase B würde die Gesamtzeit zum Mälzen um etwa 20% verringern. Verbesserte Fermentationsverfahren finden auch Verwendung bei der Herstellung von Alkoholen, die nicht für den menschlichen Verbrauch gedacht sind, z. B. Industriealkohole.
  • Bei einer anderen Ausführungsform liefern Samen oder Körner mit gesteigerter Thioredoxin-Expresion Vorteile bei der Verbesserung des Einsetzens und der Effizienz des Keimens.
  • Die Überexpression von Thioredoxin in Samen oder Körnern führt zu einer Vermehrung der Proteine insgesamt. Sie fördert auch die Neuverteilung von Proteinen auf die am meisten lösliche Albumin/Globulin-Fraktion und die Herstellung von Mehl und anderen Nahrungsmittel-Produkten, Futtermitteln und Getränken mit verbesserter Verdaubarkeit im Vergleich zu eßbaren Produkten, die aus nicht-transformierten Körnern hergestellt sind. Derartige eßbare Produkte finden Einwendung bei der Besserung und Behandlung von Nahrungsmittel-Malabsorptionssyndromen, beispielsweise Sprue oder katarrhalischer Dysenterie. Sprue ist ein Malabsorptionssyndrom, herbeigeführt durch die Aufnahme von Gluten enthaltenden Nahrungsmitteln, das sowohl Kinder als auch Erwachsene befällt. Eßbare Produkte, die leichter verdaut werden und leicht absorbiert werden, vermeiden oder bessern die Krankheitssymptome. Eßbare Produkte mit verbesserter Verdaubarkeit bessern oder verringern auch die Symptome, die mit Zöliakie verbunden sind, bei der Speicherproteine, die bei betroffenen Individuen nicht leicht verdaut werden, zu einer Entzündung des GI-Trakts führen.
  • Die Expression von Thioredoxin in Samenkörnern führt zur Erzeugung von Nahrungsmitteln und anderen eßbaren Produkten mit verringerter allergener Wirkung im Vergleich mit eßbaren Produkten, die aus nicht-transformierten Körnern hergestellt sind. Nahrungsmittel-Allergien sind ein erhebliches Gesundheits- und Ernährungs-Problem (Lehrer et al., 1996). Bis zu 2% der Erwachsenen und 8% der Kinder haben eine Nahrungsmittel-Allergie, die ernste Symptome verursacht, einschließlich Tod. Weizen-Protein ist eines der Hauptallergene. Nahrungsmittel-Allergien werden von der American academy of Allergy and Immunology Committee on Adverse Reactions to Food definiert als "eine immunologische Reaktion, die sich aus der Aufnahme eines Nahrungsmittels oder eines Nahrungsmittel-Zusatzes ergibt" (Fenema, 1996; Lasztity, 1996). Die meisten echten allergischen Reaktionen auf Nahrungsmittel-Proteine scheinen von einer Typ I-Immunoglobulin E (IgE)-vermittelten Hypersensibilitäts-Reaktion verursacht zu werden (Sicherer, 1999). Diese Reaktionen können innerhalb von Minuten oder von wenigen Stunden nach dem Essen des beeinträchtigenden Nahrungsmittels auftreten (Furlong-Munoz, 1996). Wenn das beeinträchtigende Nahrungsmittel von allergisch sensiblen Individuen aufgenomen wird setzt der Körper Histamine und andere biochemische Mittel frei, was zu juckenden Augen, Ausschlag oder Nesselsucht; laufender Nase; Anschwellen der Lippen, Zunge und des Gesichts; kratziger oder belegter Kehle Bauchschmerzen; Übelkeit; Diarrhöe; und Kurzatmigkeit führt. Manche Individuen haben schwere, anaphylaktische Reaktionen, was in den Vereinigten Staaten zu näherungsweise 135 Todesfällen pro Jahr führt. In den Vereinigten Staaten stehen über 2.500 Notaufnahme-Besuche pro Jahr mit Allergien in Verbindung. Es gibt keine Heilung für Nahrungsmittel-Allergien, nur eine Vermeidung des Nahrungsmittels verhindert die Symptome. Beispielsweise müssen Patienten mit einer Weizenallergie Weizen- oder Glutenenthaltende Nahrungsmittel meiden; Weizen-Gluten ist eine sehr übliche Zutat in vielen Fertignahrungsmitteln (Marx et al., 1999).
  • Ein vielen Allergenen gemeinsames Merkmal ist die Anwesenheit einer oder mehrerer Disulfid-Bindungen, die zur Widerstandsfähigkeit von Allergenen gegen Verdauung beitragen (Astwood et al., 1996), die ihnen erlaubt, im wesentlichen unversehrt zu sein, wenn sie den Dünndarm erreichen, wo sie Schleimhautzellen präsentiert werden, die eine IgE-Immunantwort aufbauen. Es wurde gefunden, dass die Hauptallergene unlösliche Speicherproteine, Gliadine und Glutenine sind. Die löslichen Speicherproteine, Albumine und Globuline waren beträchtlich schwächer (Buchanan et al., 1997). Die allergene Wirkung dieser Proteine ist nach Thioredoxin-Behandlung und Disulfid-Bindungs-Reduktion wesentlich verringert.
  • Eßbare Produkte, beispielsweise Brot, Plätzchen, Teig, Verdickungsmittel, Getränke, Malz, Nudelwaren, Nahrungsmittel-Zusätze, einschließlich Tierfuttermittel, die unter Verwendung der transgenen Pflanzen oder Teilen einer transgenen Pflanze der Erfindung hergestellt wurden, haben eine verringerte allergene Wirkung und können daher bei der Behandlung einer allergischen Reaktion verwendet werden. Mit "Behandlung" oder "Erleichterung" von Symptomen ist hierin die Verhinderung oder Verminderung der Wahrscheinlichkeit von Symptomen gemeint.
  • Eine erhöhte Verdauharkeit von Samen oder Körnern schafft auch einen breiteren Konsum von Körnern durch Menschen und Tiere, die ansonsten derartige Körner nicht konsumieren können. Sorghum beispielsweise ist, ausgedrückt in metrischen Tonnen, unter den führenden Körnern in der Welt an fünfter Stelle nach Weizen, Reis, Mais und Gerste, und in den Vereinigten Staaten nach Mais und Weizen an dritter Stelle bei der Erzeugung. Die Verwendung von Sorghum ist wegen der Schwierigkeit, die mit der Verdaubarkeit seines Proteins und seiner Stärke im Vergleich mit anderen Körnern verbunden ist, teilweise eingeschränkt. Diese Schwierigkeit mit der Verdaubarkeit von Sorghum-Protein und -Stärke hat mit der Struktur des Samens und der Art, in der die Proteine mit der Stärke verbunden sind, zu tun. Die Verdaubarkeit des Stärkemehls von Sorghum-Kulturvarietäten ist um 15–25% geringer in der Verdaubarkeit als beispielsweise Mais. Vielleicht bemerkenswerter ist die Tatsache, dass die Unverdaubarkeit von unbehandeltem Sorghummehl, anders als bei anderen Körnern, nach Kochen in Wasser, einer üblichen Praxis in Afrika, dramatisch ansteigt. Eine Studie mit Menschen zeigte, dass die Protein-Verdaubarkeit in gekochtem Sorghum-Porridge nur 46% betragen kann, während die prozentuale Verdaubarkeit für gekochten Weizen, Mais und Reis 81%, 73% bzw. 66% betrug (Mertz et al., 1984, MacLean et al. 1981). Exogener Zusatz von Reduktionsmitteln erhöht die Verdaubarkeit der Stärke (Hamaker et al. 1987). Jedoch die Wirksamkeit der Manipulation des Thioredoxin-Systems in vivo in den Samen durch Exprimieren erhöhter Mengen an Thioredoxin in einer Weise, die die Pflanzen-Entwicklung oder -Morphologie nicht ungünstig beeinflußt, war bisher nicht gezeigt worden. Dementsprechend schaffen die transgenen Pflanzen der Erfindung eine breitere Nutzung von Samen oder Körnern als Nahrungsmittelquellen durch Erhöhung der Verdaubarkeit des Stärke- und/oder Protein-Bestandteils. Die transgenen Samen oder Körner der vorliegenden Erfindung schaffen auch den Vorteil, die Verdaubarkeit von Nahrungsmittel-Produkten für den Menschen und Futtermitteln für Tiere, die aus diesen Körnern hergestellt sind, ohne den Zusatz von exogenen Reduktionsmitteln zu erhöhen. Außerdem führt die erhöhte Verdaubarkeit zu einer größeren Ausnutzung des Nahrungsmittels oder Futtermittels, d. h. ein Mensch oder ein Tier, der oder das ein eßbares Produkt konsumiert, das einen transgenen Samen oder ein transgenes Korn der Erfindung oder einen Extrakt daraus aufweist, absorbiert Nährstoffe effizienter und braucht daher im Vergleich mit einem nicht-trarsgenen Nahrungsmittelprodukt weniger zu konsumieren. Bei einer anderen Ausführungsform werden der transgene Samen, das transgene Korn oder Extrakte daraus gemäß der vorliegenden Erfindung und Ex trakte oder Nahrungsmittel-Produkte davon als Nahrungsmittel- oder Futtermittel-Zusätze verwendet. Beispielsweise wird ein aus einem transgenen Samen oder einem transgenen Korn gemäß der Erfindung hergestellter Extrakt oder Mehl oder Malz zu einem nicht-tansgenen Nahrungsmittel- oder Futtermittel-Produkt zugegeben, um die Verdaubarkeit des nicht-transgenen Nahrungsmittel-Produkts zu verbessern oder seine allergene Wirkung zu verringern oder um die Qualität des Nahrungsmittel-Produkts insgesamt zu verbessern, beispielsweise durch Erhöhen der Festigkeit und/oder des Volumens des Nahrungsmittel-Produkts.
  • Veranschaulichende Ausführungsformen der Endung werden unten beschrieben.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Exgression von Weizen-Thioredoxin h (WTRXh) in transgener Gerste
  • Es wurden vier verschiedene DNA Konstrukte hergestellt, von denen jedes ein das 13,5-kDa WTRXh-Protein codierendes 384-bp wtrxh-Fragment enthielt. Die vier Konstrukte sind in 1 veranschaulicht und unten beschrieben. Jedes Konstrukt enthielt das 384-bp wtrxh-Fragment funktionswirksam gebunden an einem Samen-spezifischen Promotor (entweder den Gersten-Endosperm-spezifischen D-Hordein- oder -B1-Hordein-Promotor oder den Mais-Embryo-spezifischen Globulin-Promotor). Ein zusätzliches Konstrukt enthielt das 384-bp wtrxh-Fragment funktionswirksam gebunden an den B1-Hordein-Promotor und die B1-Hordein-Signalsequenz (6). Der verwendete Transforrnationsvektor enthielt das bar-Gen, das Resistenz gegen Bialaphos verleiht. Nach Bialaphos-Selektion wurden 28 unabhängige regenerierbare Gersten-Linien erhalten und alle waren bezüglich des bar-Gens PCR-positiv. Die Anwesenheit des wtrxh-Gens wurde in dem Genom der 28 unabhängigen Linien durch PCR und durch DNA-Hybridisierungs-Analysen bestätigt. Die Expression des WTRXh-Proteins wurde durch Western-Blot-Analyse untersucht, wobei gereinigtes Weizen-Thioredoxin als eine Kontrolle verwendet wurde. Das in transgener Gerste exprimierte WTRXh hatte eine Molekülmasse, die sich vom TRXh natürlicher Gerste unterschied, aber mit WTRXh identisch war. Es wurde gefunden, dass das WTRXh in sich entwickelnden und reifen Samen transgener Gerstenpflanzen hochgradig exprimiert wurde, wenn auch die Expressionsmengen unter den transgenen Ereignissen variierten. Im Mittel wurden in Linien, die mit dem DNA-Konstrukt, das den B1-Hordein-Promotor plus die Signalpeptid-Sequenz enthielt, transformiert waren, höhere Expressionsgrade beobachtet als bei demselben Promotor ohne die Signalpeptid-Sequenz. Es wurde bestätigt, dass das aus transgenem Gerstensamen gereinigte WTRXh biochemisch aktiv war.
  • A. Materialien und Verfahren
  • Pflanzenmaterialien für die Transformation
  • Eine zweireihige Frühlings-Kulturvarietät von Gerste, Golden Promise, wurde in Treibhäusern wachsen lassen wie früher beschrieben (Wan and Lemaux 1994; Lemaux et al., 1996).
  • Konstruktion von Weizen-Thioredoxin h-Expressionsvektoren und DNA-Sequenzierung
  • Es wurden Expressionsvektoren konstruiert, die das Weizen-Thioredoxin h-Gen (wtrxh) enthielten, gesteuert durch den Gersten-Endosperm-spezifischen B1- oder D-Hordein-Promotor oder den Mais-Embryo-spezifischen Globulin-Promotor. Die Plasmide wurden wie folgt konstruiert.
    • (1) pDhWTRXN-2: Ein 384-bp wtrxh codierender Bereich wurde durch PCR von pTaM 13,38 ampilifiziert (Gautier et al., 1998). Dieses Plasmid enthielt eine cDNA von wtrxh, die als eine Matrize verwendet wurde, wobei Xbal- und SacI-Stellen mit den folgenden Primern Wtrxh1 (5'-atatctagaATGGCGGCCTCGGCGGCGA) (SEQ ID No: 5) bzw. Wtrxh2R (5'-atagagctcTTACTGGGCCGCGTGTAG) (SEQ ID No: 6) geschaffen wurden (1). Kleine Buchstaben in dem Primer bezeichnen eine Restriktionsenzym-Stelle zum Subclonieren des DNA-Fragments, das das wtrxh-Gen enthält; unterstrichene Buchstaben bezeichnen wtrxh-Sequenzen. Das ATG-Startercodon für die wtrxh-Expression war in den Wtrxh1-Primen integriert. PCR-Reaktionen wurden an einem Temperaturwechsler (MJ Research Inc., Watertown, MA) unter Verwendung rekombinanter Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einem Reaktionsvolumen von 100 μl durchgeführt. Der Reaktions-Puffer enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton-X-100, und 50 μM jedes Deoxyribonucleosid-triphosphats. Die PCR-Bedingungen verwendeten 25 Zyklen von 1 min lang 94% C, 1 min. lang 55°C und 2 min. lang 72°C, mit einem abschließenden Verlängerungsschrit bei 72°C für 7 min. Das wtrxh-Fragment, das mit den Primern Wtrxh1 und Wtrxh2R amplifiziert worden war, wurde unter Verwendung eines QUIAquick® Gelextraktions-Kits (Quiagen Inc. Chatsworth, CA) von einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt, mit XbaI und SacI verdaut und in XbaI/SacI-vertautes pUC19 ligiert, um das Plasmid pWTRXh-1 zu erzeugen. Die Nucleotid-Sequenzen des PCR-amplifizierten Fragments des codierenden Bereichs von wtrxh wurden durch das Dideoxynucleotid-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von Sequenase nach Herstelleranweisung (United States Biochemical, Cleveland, OH) mit doppelsträngigen Plasmid-Matrizen und regelmäßig beanstandeten Primern bestimmt. pDhWTRXN-2 wurde hergestellt durch Ersetzen des uidA-Gens in pDhGN-2 (enthaltend den Gersten-Endosperm-spezifischen D-Hordein-Promotor (7) und den nos 3'-Terminator) gegen das XbaI/SacI-Fragment, enthaltend die wtrxh-codierende Sequenz von pWTRXh-1, das die PCR-amplifizierte wtrxh-codierende Sequenz in pUC19 enthält. Zum Konstruieren von pDhGN-2 wurde ein 0,4-kb D-Hordein-Promotor durch PCR von pDII-Hor3 amplifiziert (S⌀renson et al., 1996; Cho et al., 1999a). Dieses Plasmid enthielt die D-Hordein-Promotorsequenz, die als eine Matrize verwendet wurde, wobei sphI- und XbaI-Stellen mit den folgenden Primern geschaffen wurden: Dhor1 (5'-ggcgcatgcgaattcGAATTCGATATCGATCTTCGA-3') (SEQ ID No: 23) bzw. Dhor2 (5'-aactctagaCTCGTGGACTGTCAATG-3') (SEQ ID No: 12). Kleine Buchstaben in den Primern enthalten Restriktionsenzym-Stellen zum Subclonieren des DNA-Fragments, das den D-Hordein-Promotor enthält; unterstrichene Buchstaben bezeichnen D-Hordein-Promotorsequenzen. Das PCR-amplifizierte D-Hordein-Promotorfragment wurde mit SphI und XbaI verdaut und durch den Blumenkohl-Mosaik 35S (CaMV 35S)-Promotor in p35SGN-3 ersetzt, um das pDhGN-2-Plasmid zu erzeugen. p35SGn-3 wurde hergestellt durch Ligieren des 3,0-kg SphI-EcoRI-Fragments, das den CaMV 35S-Promotor, das uidA (beta-Glucuronidase, gus)-Gen und nos enthielt, in pUC18, verdaut mit SphI/EcoRI.
    • (2) pdBhWTRX-1: Die Konstruktion von pdBhWTRXN-1 begann mit der Verwendung pBhWTRXN-1. pBhWTRXN-1 wurde hergestellt durch Ersetzen des uidA-Gens in pBhGN-1, das uidA enthält, gesteuert durch den Gersten-Endosperm-spezifischen B1-Hordein-Promotor und beendet durch den nos 3'-Terminator, durch das XbaI/SacI-Fragment von pWTRXh-1, das die wtrxh-codierende Sequenz enthält. Die 120-bp HindIII-5'-B1-Hordein-flanking region wurde aus dem pBhWTRXN-1 entfernt und erneut ligiert, um das pdBhWTRXN-1-Konstrukt herzustellen.
    • (3) pdBhssWTRXN3-8: Die Primer Bhor7 (5'-GTAAAGCTTTAACAACCCACACATTG) (SEQ ID No: 7) und BhorWTRXh1R (5'-CCGACGCCGCTGCATCGTACTTGTTGCCGCAAT) (SEQ ID No: 8), die HindIII- bzw. Acyl-Stellen enthielten, wurden zur Amplifizierung eines 0,49-kb 5'-Bereichs von B1-Hordein verwendet, der die B1-Hordein-Signalpeptid-Sequenz enthielt (6). Ein λ2-4/HindIII-Plasmid, enthaltend einen genomischen Klon von B1-Hordein (Brandt et al., 1985; Cho and Lemaux, 1997), wurde als eine Matrize für die Amplifikation verwendet. Der Primer BhorWtrxh1-Rist ein überlappender Primer, der die wtrxh-codierende Sequenz (unterstrichen) und eine Signalpeptid-Teilsequenz von dem B1-Hordein-Promotor enthält, dem aber das ATG-Startercodon für wtrxh fehlt. pdBhssWTRXN3-8 wurde hergestellt durch Ersetzen des D-Hordein-Promotors (7) in pDhWTRXN-2 durch das 0,49 kb PCR-amplifizierte Hin dIII/Acyl-Fragment, das den B1-Hordein-Promotor, seine Signalpeptid-Sequenz und den Verknüpfungsbereich von dem 5'trxh-Gen enthält. So enthält das Konstrukt pdBhss\NTRXN3-8 den Gersten-Endosperm-spezifischen B1-Hordein-Promotor mit seiner Signalpeptid-Sequenz (6), wtrxh und nos (1). Die Signalpeptid-Sequenz, enthaltend das ATG-Startercodon, wurde unmittelbar mit der Sequenz von wtrxh kombiniert, wobei zwischen die beiden keine zusätzlichen Aminosäure-Sequenzen eingeführt wurden. Dies stellt sicher, dass das WTRXh-Protein eine präzise Spaltstelle im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) hat. Die Authentizität eines PCR-amplifizierten Fragments des chimären Produkts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
    • (4) pGIb1WTRXN-1: Das 1,42-kg HindIII/BamHI-Fragment, enthaltend den Mais-Embryo-spezifischen Globulin-Promotor des ppGIb1GUS-Plasmids (Liu and Kriz, 1996), wurde in pBluescript II KS(+) ligiert, um HindIII- und XbaI-Stellen zu erzeugen. pGIbWTRXN-1 wurde hergestellt durch Restriktion von pDhWTRXN-2 mit HindIII und XbaI, um den 0,49-kb HindIII/XbaI-Gersten-D-Hordein-Promotor aus pDhWTRXN-2 zu entfernen. Anstelle des 0,49-kb HindIII/XbaI-D-Hordein-Promotorfragments (7) wurde der 1,42-kb HindIII/XbaI-Mais-Globulin-Promotor in das durch HindIII/XbaI verdaute pDhWTRXN-2 ligiert, um das Plasmid pGIbWTRXN-1 zu bilden.
  • Stabile Gersten-Transformation
  • Stabile transgene Linien von Gerste, die WTRXh exprimierten, gesteuert von dem B1-Hordein-Promotor mit und ohne die Signalpeptid-Sequenz (6), von dem D-Hordein-Promotor (7) und von dem Mais-Globulin-Promotor wurden erhalten, indem Abwandlungen veröffentlichter Protokolle (Wan and Lemaux, 1994; Lemaux et al.m, 1996; Cho et al., 1998a–c) gefolgt wurde. Vollständige unreife Embryonen (IEs) (1,0–2,5 mm) wurden aseptisch entfernt, mit der Scutellum-Seite nach unten auf ein DC-Callus-Induktionsmedium, das 2,5 mg/L 2,4-D und 5 μM CuSO4 enthielt, gebracht (Cho et al., 1998a–c). Einen Tag nach Inkubation im Dunkeln bei 24 ± 1°C wurden die IEs mit der Scutellum-Seite nach oben auf DC-Medium, das äquimolare Mengen an Mannitol und Sorbitol enthielt, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu ergeben, übertragen. Vier Stunden nach der Behandlung mit dem Osmoticum wurden die IEs zum Beschuß verwendet. Goldteilchen (1,0 μm) wurden mit 25 μg eines 1 : 1-Molverhältnisses von pAHC20 (Christensen and Quail, 1996) und einem der folgenden Plasmide, pdBhWTRXN-1, pdBhssWTRXN3-8, pDhWTRXN-2 und pG1bWTRXN-1 beschichtet. Die Mikroprojektile wurden unter Verwendung einer biolistischen Vorrichtung PDS-1000 He (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) bei 1100 psi verschossen. Beschossene IEs wurden auf DC-Medium mit 5 mg/L Bialaphos 2 bis Monate lang selektiert. Bialaphos-resistente Calli wurden zwischen den Schritten der Selektion [DC-Medium plus Bialaphos (Meiji Seika Kaisha, Ltd., Yokohama, Japan)] und der Regeneration (FHG-Medium; Hunter, 1988) auf ein Zwischenkulturmedium (DBC2; Cho et al. 1998a–c), das 2,5 mg/L 2,4-D, 01 mg/L BAP und 5,0 μM CuSO4 enthielt, übertragen. Die Kultur nach Callus-Induktion und -Selektion auf DC-Medium wurde unter gedämpften Lichtbedingungen durchgeführt (näherungsweise 10 bis 30 μE, 16 h-Licht) (Cho et al., 1998a–c). Regenerierte Schößlinge wurden auf Bewurzelungsmedium (Callus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) enthaltende Magenta-Behälter, die 3 mg/L Bialaphos enthielten, überführt. Wenn die Schößlinge die Oberseite des Behälters erreichten wurden die Pflänzchen in Erde im Gewächshaus überführt.
  • Zytologische Analyse
  • Zur zytologischen Analyse transgener Gerstenpflanzen wurden von jungen, im Gewächshaus gewachsenen Pflanzen gesunde Wurzel-Meristeme gesammelt. Nach Vorbehandlung über Nacht bei 4°C in gesättigter 1-Bromnaphthalin-Lösung wurden die Wurzel-Meristeme in 1 : 3-Eisessig : Ethanol fixiert und bei 4°C gelagert. Die Wurzel-Meristeme wurden 5–7 min. lang bei 60°C in 1 M HCl hydrolysiert, in Feulgen-Lösung gefärbt und auf einem Glas-Objektträger in einem Tropfen von 1%igem Acetocarmin zerdrückt. Die Chromosomen wurden von mindestens fünf gut ausgebreiteten Zellen pro Pflanze gezählt.
  • Herbizid-Anwendung
  • Zur Bestimmung der Herbizid-Empfindlichkeit von T0-Pflanzen und ihrer Nachkommenschaft wurde ein Abschnitt eines Blatts im 4-bis 5-blättrigem Stadium unter Verwendung eines Baumwolltupfers mit 0,25%iger (v/v) Basta-Lösung (Ausgangskonzentration 200 g/L Phophinothricin, Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) plus 0,1% Tween 20 bestrichen. Die Pflanzen wurden eine Woche nach der Herbizid-Aufbringung bewertet.
  • Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und DNA-Blot-Hybridisierung
  • Die gesamte genomische DNA von Blattgeweben wurde gereinigt, wie es von Dellaporto (1993) beschrieben wurde. Zum Testen auf Anwesenheit von wtrxh in genomischer DNA von wahrscheinlich transformierten Linien wurden 250 ng genomischer DNA durch PCR amplifiziert, wobei einer von zwei Primer-Sätzen verwendet wurde:
  • Satz 1:
    Figure 00450001
  • Satz 2:
    Figure 00450002
  • Die Anwesenheit von bar wurde bestimmt unter Verwendung des Primer-Satzes:
  • Figure 00450003
  • Amplifikationen wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt (Cho et al., 1998a–c). Fünfundzwanzig Mi kroliter des PCR-Produkts, mit Farbstoffbeladung, wurden der Elektrophorese in einem 1,0%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid unterzogen und unter Verwendung von UV-Licht-Exposition fotografiert. Die Anwesenheit von 0,4 kb- und 0,14 kb-Fragmenten war in Einklang mit intakten bzw. geschnittenen wtrxh-Fragmenten; ein internes 0,34 kb-Fragment wurde vom bar-Gen mit bar-Primern erzeugt. Für wtrxh homozygote Linien wurden mittels PCR und Western-Blot-Analyse in T2- oder T3-Pflanzen durchgemustert.
  • Für die DNA-Hybridisierungs-Analyse wurden 10 μg der gesamten genomischen DNA von Blattgewebe jeder Linie mit HindIII und SacI verdaut, auf einem 1,0%igen Agarosegel getrennt, auf eine Zeta-Sonden-GT-Membran (Bio-Rad, Hercules, CA) übertragen und mit einer radioaktiv markierten wtrxh-spezifischen Sonde nach Herstelleranweisung hybridisiert. Das wtrxh enthaltende 0,4 kb XbaI-SacI-Fragment von pDhWTRXN-9 wurde mittels QIAEX Gelextraktions-Kit (QUIAGEN, Chatsworth, CA) gereinigt und unter Verwendung willkürlicher Primer mit 32P-dCTP markiert.
  • Western-Blot-Analyse
  • Eine Western-Blot-Analyse wurde mit Samen von ausgewählten transgenen Linien sowie von Kontroll-Gerstensamen von nicht-transgenem Golden Promise, gewachsen unter denselben Bedingungen wie die transgenen Pflanzen, und von Kontroll-Weizensamen einer Hartweizen-Kulturvarietät, cv. Monroe, oder einer Brotweizen-Kulturvarietät, cv. Capitale, durchgeführt. Vollständige Samen wurden unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Für jede Probe wurden 10 bis 20 Samen verwendet; das Volumen des Extraktions-Puffers (50 mM Tris HCl oder Phosphat-Puffer, pH 7,8, 0,5 mM Phenylmethyl-sulfonyl-fluorid [PMSF], 1 mM EDTA) variierte von 2 bis 4 ml, abhängig von der Anzahl verwendeter Samen und der Viskosität des Extrakts. Nach der Puffer-Zugabe wurde das Mahlen eine zusätzliche Minute lang fortgeführt; das Gemisch wurde dann 10 Minuten lang bei 14000 g zentrifugiert, und die Überstand-Lösung wurde als die Albumin-Globulin-Fruktion, die das Thioredoxin enthielt, aufbewahrt.
  • SDS-PAGE der Albumin-Globulin-Fraktion wurde in 12–17%igen Polyacrylamid-Gradientengelen bei pH 8,5 durchgeführt (Laemmli, 1970). Von jeder Probe wurden gleiche Mengen Protein (ungefähr 40 μg), quantitativ bestimmt nach Bradford (1976), in Laemmli-Probenpuffer 1 : 2 v/v verdünnt, 3 min. lang gekocht, auf die Gele geladen und der Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 15 mA unterzogen. Die Proteine wurden bei einer konstanten Spannung von 40 V für 4 Stunden bei 4°C auf Nitrozellulose übertragen, wobei eine Hoefer Transphor-Übertragungseinheit (Alameda, CA) verwendet wurde. Nitrozellulose wurde mit 5% Milchpulver in TBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) blockiert, in primärem Antikörper für 4 Stunden bei RT und in sekundärem Antikörper für 1 Stunde bei RT inkubiert. Der primäre Antikörper war Weizen-anti-Thioredoxin h II Ab (Johnson et al., 1987b), 1 zu 500 verdünnt; der sekundäre Antikörper war Ziege anti-Kaninchen alkalische Phosphatase (Bio-Rad, Hercules CA), 1 : 3000 verdünnt. Die Blots wurden in alkalischem Phosphatase NBT/BCIP-Farbreagenz (gemäß den Bio-Rad-Anweisungen) entwickelt; die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, um die Übertragung sicherzustellen. Die Abbilder wurden unter Verwendung eines Bio-Rad GelDoc 1000 (Hercules, CA) gescannt und unter Verwendung von Bio-Rad Multi Analyst, Version 1.0.2, analysiert. Alle Banden wurden über dieselbe Fläche gescannt, wobei ein Rechteck vergleichbarer Dichte als Hintergrund verwendet wurde; Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als % gescanntes Volumen. Die gezeigte Zahl steht für den Prozentsatz des Gesamtvolumens (Pixel-Dichte × Fläche der gescannten Bande).
  • Messungen der WTRXh-Aktivität
  • Herstellung von Materialien für die Extraktion
  • Reife Körner von verschiedenen heterozygoten und homozygoten transgenen Linien dienten als Ausgangsmaterialien für den Test. Heterozygote Linien mit einem D-Hordein-Promotor waren: GPDhBarWtrx-5, GPDhBarWtrx-9-1 und GPDhBarWtrx-9-2. Heterozygote Linien mit einem B-Hordein-Promotor und ohne Signalsequenz waren: GPdBhBarWtrx-2, -5, -9, -19 und GPdBhBarWtrx-20. Heterozygote Linien mit einem B-Hordein-Promotor plus einer Signalsequenz waren: GPdBhssBarWtrx-2, -7, GPdBhssBarWtrx-29, GPdBhssBarWtrx-20, GPdBhssBarWtrx-14, GPdBhssBarWtrx-22. Homozygote Linie mit einer Signalsequenz waren: GPdßhssBarWtrx-2-17, GPdBhssBarWtrx-2-17-1, GPdBhssBarWtrx-29-3 und GPdBhssBarWtrx-29-3-2. Kontrollmaterialien umfaßten eine von einer nicht-transformierten Gewebekultur stammende Linie, 4-96, eine nur bar enthaltende transformierte Linie, GPBar-I und null-segregante Linien, GPdBhssBarWtrx-29-11 und GPdBhssBar Wtrx-29-11-10, abgeleitet von der Linie GPdBhssBarWtrx-29.
  • Herstellung von (NH4)2SO4-Extrakten für die Gelfiltration
  • Näherungsweise 15 g Gerstenkörner wurden in einer Kaffeemühle zu Pulver gemahlen und mit 80 ml (1 : 4 w/v; w = Gewicht (weight), v = Volumen) Puffer [(50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl-fluorid)], 2 mM e-Amino-n-Capronsäure, 2 mM Benzamidin-HCl extrahiert, indem 3 Stunden lang bei 4°C gerührt wurde. Aufschlämmung plus Spülung wurden 20minütigem Zentrifugieren bei 25400 g unterzogen, die Überstand-Lösung wurde durch Glaswolle dekantiert, die Pellets wurden in einem kleinen Volumen Puffer erneut suspendiert und dann durch Zentrifugieren wie vorher geklärt. Die Überstand-Fraktionen wurden vereinigt, eine Teilmenge wurde entfernt und der Rest wurde der Ansäuerung unterzogen, indem der pH mit 2 N Ameisensäure von 7,83 auf 4,80 eingestellt wurde; denaturierte Proteine wurden vor dem Test wie oben durch Zentrifugieren entfernt. Der pH der angesäuerten Überstandslösung wurde mit 2 N NH4OH wieder auf 7,91 eingestellt, und eine Teilmenge wurde für den Test entfernt. Pulverförmiges (NH4)2SO4 wurde bis zu einer Endkonzentration von 30% zugegeben, und die Probe wurde 20 Minuten lang bei 4°C gerührt, gefolgt von Zentrifugieren wie oben beschrieben. Das Pellet wurde verworfen. Zusätzliches (NH4)2SO4 wurde zugegeben, um die dekantierte Überstand-Lösung auf 90% Sättigung zu bringen; die Probe wurde 16 Stunden lang bei 4°C gerührt, gefolgt von Zentrifugieren wie oben beschrieben.
  • Die Überstand-Lösung wurde verworfen, die 30–90% (NH4)2SO4-Pellets wurden erneut in 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, suspendiert und dann zur Klärung 15 Minuten lang einem Zentrifugieren bei 40000 g unterzogen. Der sich ergebende Überstand (30–90%ige (NH4)2SO4-Fraktion) wurde in einen Dialyseschlauch (6000–8000 MW Rückhaltevermögen) gegeben und bei 4°C fester Sucrose ausgesetzt, um eine 10-fache Volumenverringerung zu erhalten. Eine Teilmenge (1 ml) der geklärten und aufkonzentrierten 30–90%igen (NH4)2SO4-Probe wurde aufbewahrt und die verbleibende Probe wurde mit einer peristaltischen Pumpe bei einer Strömungsrate von 0,5 mL/min. auf eine vor-äquilibrierte (30 mM Tris-HCl, pH 7,9, 200 mM NaCl) Säule mit Sephadex G-50 superfine (2,5 × 90 cm; ungefähr 400 mL Bettvolumen) aufgebracht. Proteine wurden mit demselben Puffer bei derselben Strömungsrate eluiert; es wurden Fraktionen von 150 Tropfen gesammelt. Ausgewählte Fraktionen wurden zur Messung der Extinktion bei 280 nm unter Verwendung eines Pharmacia Biotech Ultrospec 4000 und zur Untersuchung auf TRXh-Aktivität nach dem NADP-MDH-Aktivierungsprotokoll (siehe unten) verwendet. Aktive Fraktionen wurden zusammengegeben, bei 4°C gelagert und dann auf Gesamt-NADP-MDH-Aktivierungsaktivität untersucht.
  • Herstellung wärmebehandelter Extrakte
  • Näherungsweise 10 g Gerstenkörner wurden etwa 30 Sekunden lang in einer Kaffeemühle zu Pulver gemahlen und durch einstündiges Schütteln bei Raumtemperatur in 50 mL Puffer extrahiert wie oben. Die Aufschlämmung plus die Spülung wurden 20 Minuten lang einem Zentrifugieren bei 27000 g unterzogen und die Überstand-Lösung durch Glaswolle dekantiert. Eine 20 ml Teilmenge jeder Probe wurde bei 65°C erhitzt bis die Probentemperatur 60 ± 1°C erreichte (etwa 10 min.). Die Probe wurde zusätzliche 10 Minuten lang bei 60°C gehalten, gefolgt von Kühlen in einem Eis/Wasser-Bad. Die abgekühlte Probe wurde zentrifugiert und die Überstand-Lösung wurde wie oben durch Sucrose aufkonzentriert und bei –20°C gelagert. Gefrorene Proben wurden aufgetaut und durch 10 minütiges Zentrifugieren mit 14.000 Upm bei 4°C geklärt. Die Ge samt-TRXh-Aktivität wurde an den konzentrierten Überstand-Fraktionen bestimmt.
  • NADP-Malat-Dehydrogenase-Aktivierungstest
  • Die Thioredoxin h-Aktivität wurde untersucht wie vorher beschrieben (Florencio et al., 1988; Johnson et al., 1987a). 50 bis 120 μl Extrakt (abhängig von der Aktivität) wurden mit DTT vor-inkubiert, und 0,16 bis 0,32 μl des Vor-Inkubatonsgemisches wurden für den NADP-MDH-Test verwendet. Kontrolltests wurden mit identischen Fraktionen in Abwesenheit von NADP-MDH durchgeführt. Western-Blot-Analyse wurde wie oben durchgeführt, außer dass 10–20%ige SDS-Polyacrylamidgele zur Elektrophorese verwendet wurden und die Übertragung auf Nitrozellulosepapier für 4 Stunden bei 40 V stattfand.
  • Sequentielle Extraktion mehrerer Protein-Fraktionen.
  • 10 g Gerstenkörner wurden sequentiell hinsichtlich Albumin (H2O-löslich), Globulin (Salz-löslich), Hordeinen (Alkohol-löslich) und Glutelinen extrahiert (Shewry et al., 1380). Gersten-Pulver wurde eine Stunde lang bei 25°C mit 0,5 M NaCl gerührt, um salzlösliche Proteine zu entfernen. Aus dem Rückstand wurden mit 50% Propanol in Abwesenheit (Hordein-I) und Anwesenheit (Hordein-II) von 2% (v/v) 2-Mercaptoethanol zwei aufeinanderfolgende Hordein-Fraktionen extrahiert. Gluteline wurden aus dem Rückstand mit 0,05 M Borat-Puffer, pH 10, der 1% (v/v) 2-Mercaptoethanol und 1% (v/v) Natrium-dodecylsulfat enthielt, extrahiert.
  • In vitro-Monobromobimane (mBBr)-Markierung von Proteinen
  • Unreife, reife oder keimende Samen von nicht-transformierten und transgenen Pflanzen wurden in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, gemahlen. Reaktionen wurden nach dem Protokoll von Kobrehel et al., (1992) durchgeführt. Siebzig Mikroliter des Puffer-Gemisches, die eine bekannte Menge Protein enthielten, blieben entweder unbehandelt oder wurden mit DTT bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM behandelt. Nach 20 minütiger Inkubation wurden 100 nMol mBBr zugegeben und die Reaktion wurde weitere 15 Minuten lang fortgeführt. Um die Reaktion zu beenden und überschüssiges mBBr zu derivatisieren wurden 10 μl 10%iges SDS und 100 μl an 100 mM 2-Mercaptoethanol zugegeben. Die Proben wurden auf ein 15% SDS-PAGE-Gel aufgebracht. Die Fluoreszenz von mBBr wurde sichtbar gemacht, indem die Gele auf einen mit einer UV-Lichtquelle (365 nm) ausgestatteten Lichtkasten gelegt wurden. Die Protein-Bestimmung wurde durch das Bradford-Farbstoff-Bindungsverfahren (Bradford 1976) unter Verwendung von Rinder-Serum-Albumin oder Gamma-Globulin als Standards durchgeführt.
  • Untersuchung von Pullulanase und ihrem Inhibitor
  • Zur Messung der Pullulanase-Aktivität wurde Korn in einer Dunkelkammer keimen lassen und für bis zu 5 Tage bei 25°C darin behalten, wie beschrieben (Kobrehel et al., 1992; Lozano et al., 1996). Ein Satz Platten einer jeden Linie wurde jeden Tag zur Extrakt-Herstellung entfernt. Zellfreie Endosperm-Extrakte wurden aus Gruppen von 10–20 gekeimten Körnern von äquivalenter Wurzel- und Koleoptil-Länge innerhalb einer gegebenen Cohorte hergestellt. Das Endosperm wurde von dem Embryo und anderen Geweben getrennt und zu Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,9), ergänzt mit 1 mM EDTA und 0,5 mM PMSF (1 : 3 bis 1 : 6, Gewicht/Volumen-Verhältnis von Gewebe zu Puffer, abhängig vom Entwicklungsstadium), zugegeben. Nach dem Mahlen in einem Mörser auf Eis wurde die Probe durch Zentrifugieren (10 min. bei 24000 g) geklärt; die Überstand-Fraktion wurde zurückgewonnen und in 0,5 ml Teilmengen bei –80°C für spektrofotometrische Untersuchungen oder Gel Untersuchen von Pullulanase gelagert.
  • Die Pullulanase-Aktivität wurde spektrofotometrisch bei 37°C bestimmt, indem der Farbstoff gemessen wurde, der nach 30 Minuten bei 534 nm unter Ver wendung von rotem Pullulan (Megazyme, Bray, Ireland) als Substrat in 50 mM Citratphosphat-Puffer (pH 5,2) freigesetzt wurde (Serre et al., 1990). Pullulanase wurde auch auf Gelen natürlicher Aktivität von 7,5% Acrylamid, 1,5 mm Dicke, die 1% rotes Pullulan enthielten, untersucht (Furegon et al., 1994). Die Gele wurden unter Verwendung eines Bio-Rad Gel Doc 1000 gescannt und unter Verwendung von Bio-Rad MULTI ANALYST, Version 1.0.2, analysiert. Die Pullulanase-Inhibitoraktivität wurde an Fraktionen bestimmt, die zur Inaktivierung von Pullulanase erhitzt worden waren (15 min lang 70°C), indem ihre Fähigkeit gemessen wurde, zugesetzte gereinigte Gerstenmalz-Pullulanase zu hemmen. Es wurde gezeigt, dass die endogene Pullulanase-Aktivität durch diese Hitzebehandlung vollständig beseitigt wurde, während die Inhibitor-Aktivität nicht beeinträchtigt wurde (Macri et al., 1993; Max Gregor et al., 1994).
  • Aktivität von Algha-Amylase in Thioredoxin h überexprimierendem Gerstenkorn
  • Die Amylase-Aktivität der null-segreganten und homozygoten Gerstenkörner wurde während des Keimens und des frühen Sämlingswachstums unter Verwendung von Stärke enthaltenden Gelen analysiert. Natürliche Polyacrylamid-Elektrophoresegele [6% Acrylamid, 1,5 mm dick] wurden bereitet und nach dem Verfahren von Laemmli (1970) entwickelt mit der Ausnahme, dass SDS aus allen Lösungen weggelassen wurde. Das Trenn-Gel enthielt 0,5% lösliche Stärke (Lintner-Kartoffelstärke, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Lyophilisierte Proben wurden in destilliertem H2O gelöst und 1 : 1 mit einem aus 0,25 M Tris-HCl, pH 6,8, 50%Glycerol, 0,04% Bromphenolblau und 3 mM CaCl2 bestehenden Puffer gemischt. 50 Mikrogramm Proben-Protein wurden in jede Spur gebracht. Die Elektrophorese wurde bei 80 Milliampere pro Gel bei 4°C durchgeführt bis die Farbstoff-Front am Rand des Gels war (üblicherweise 4 bis 5 Stunden). Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 1 bis 2 Stunden bei 37°C in 100 ml 0,1 M Succinat-Puffer, pH 6,0, inkubiert. Die Gele wurden dann 5 Minuten in einer Lösung, die 2,5 mM 12 und 0,5 M Kl enthielt, gefärbt. Die Gele wurden in destilliertem H2O gewaschen. Mit Ausnahme der weißen Bereich, die Amylase-Aktivität enthielten, waren die Gele dunkelblau gefärbt.
  • Isoelektrische Fokusierung IEF-Gelen
  • Zur Bestimmung der Isozym-Muster von alpha-Amylase wurden Extrakte sowohl von trockenem als auch von keimendem Korn von transformierter Gerste und Kontrollgerste (nicht-transformiert) durch Elektrophorese bei 4°C getrennt [1,0 mm Dicke, Isoelektrisch fokusierende (IEF) Polyacryamid-Gele, pH 3–10, unter Verwendung des Systems X Zelle II (NOVEX, San Diego, CA)]. Der Kathoden-Puffer enthielt 20 mM Arginin und 20 mM Lysin; der Anoden-Puffer war 7 mM Phosphorsäure. Die Proben wurden 1 : 1 gemischt und 2x IEF Proben-Puffer pH 3–10 (NOVEX). Nach der Proben-Aufbringung (20 μg/Spur) wurden die Gele bei konstanter Spannung entwickelt (1 Std. lang 100 V, 1 weitere Std. lang 200 V, und 30 min. 500 V]. IEF-Standards (Bio-Rad) wurden zur Bestimmung der pH-Gradienten der Gele verwendet.
  • Mehrfache Antikörpensondierung von IEF-Gelen
  • Western-Blot-Analyse von alpha-Amylase-Isozymen wurde unter Verwendung einer Elektrophorese-Übertragungszelle Mini Trans-Blot (Bio-Rad) durchgeführt. Samen-Extrakte der null-segreganten und der homozygoten Linien, die Weizen-Thioredoxin h überexprimierten, wurden wie oben beschrieben durch IEF-Gele getrennt. Die Proteine wurden bei einer konstanten Spannung von 100 V eine Stunde lang bei 4°C unter Verwendung von 0,75% Essigsäure als Blotting-Puffer auf Nitrozellulose übertragen. Die Nitrozellulose wurde mit 5% Milchpulver in Tris-Pufferlösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, ergänzt mit 0,15 M NaCl) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert, 4 Stunden lang bei Raumtemperatur mit primärem Antikörper und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper inkubiert. Der primäre Antikörper war Anti-Gerste alpha-Amylase B, 1 : 1000 verdünnt; der sekundäre Antikörper war Ziege anti-Kaninchen alkalische Phosphatase (Bio-Rad), 1 : 3000 verdünnt. Die Blots wurden in NBT/BClP alkalische Phosphatase-Farbreagenz (gemäß den Anweisungen von Bio-Rad) entwickelt, wodurch sie die kreuzreagierte alpha-Amylase bläulich-purpurn machten. Zur Erzielung völliger Identität der Isozym-Muster wurden die Blots ein zweites Mal mit einem anderen primären Antikörper anti-alpha-Amylase A (1 : 1000 verdünnt) und dem sekundären Antikörper (wie oben) sondiert. Dieses Mal wurden die Blots in Naphthol-Phosphat/Fast Red alkalische Phosphatase-Farbreagenz (gemäß den Anweisungen von Bio-Rad) entwickelt, was der alpha-Amylase A eine rosa Färbung gab. Der gezeigte Blot wurde diesem doppelten Sondierungsverfahren unterzogen.
  • B. Ergebnisse und Diskussion
  • Erzeugung transgener Pflanzen
  • Einen Tag nach dem Beschuß wurden die vollständigen Embryonen auf DC-Medium mit 5 mg/L Bialaphos übertragen. Bei Übertragung auf die zweite Selektionsplatte (5 mg/L Bialaphos) wurde das gesamte Material der einzelnen kallibildenden Embryonen unter Verwendung einer Pinzette in kleine Stücke (2–4 mm) zerteilt und getrennt gehalten. Während der nachfolgenden zwei bis 5 Selektionsdurchgänge an 5 mg/L Bialaphos (in Intervallen von 10–20 d) wurden Kallus-Stücke, die einen Hinweis auf lebhafteres Wachstum zeigten, auf neue Selektionsplatten übertragen. Während der zweiten Selektionsrunde wurden manche Kallus-Stücke in ihrem Wachstum gehemmt und in manchen Fällen wurden die Stücke braun. Im allgemeinen wurden die transformierten Gewebe nach drei oder mehr Selektionsrunden beobachtet. Die Bialaphosresistenten Gewebe wurden auf ein Zwischenmedium, DBC2 oder DBC3 (Cho et al., 1998a–c) mit Bialaphos (5 mg/L) übertragen und vor der Regenerierung auf FHG-Medium, das 3 mg/L Bialaphos enthielt, ein bis zwei Monate lang wachsen lassen. Grüne Pflänzchen wurden in Magenta-Behälter, die 3 mg/L Bialaphos enthielten, übertragen. Nach der Bialaphos-Selektion wurden 28 unabhängige, mutmaßlich transformierte, regenerierbare Linien erzeugt (in Tabelle 1 gezeigt).
  • Tabelle 1: mit Weizen-Thioredoxin h-Gen transformierte transgene Gersten-Linien
    Figure 00550001
  • Analyse von To-Pflanzen und ihrer Nachkommenschaft
  • Es wurde eine PCR-Analyse durchgeführt unter Verwendung zweier Sätze von WTRXh-Primern und eines Satzes BAR-Primern (siehe 1). PCR-Amplifikation führte zu 0,4 kb intaktem wtrxh oder 0,14 kb geschnittenem wtrxh und zu 0,34 kb internen bar-Fragmenten von transgenen Linien. Von den 28 getesteten Linien ergaben 28 bar-Fragmente von T0-Blattgewebe und 26 erzeugten PCR-amplifizierte Fragmente für wtrxh, was eine 93%ige Co-Transformations-Häufigkeit ergab. Neun Linien wurden mit pdBhWTRXN-1 transformiert, 11 mit pdBhssWTRXN-8, fünf mit pDhWTRXN-2 und eine mit pG1bWTRXN-1 (siehe Tabelle 1). Drei Linien (GPdBhBarWtrx-5, GPdBhssBarWtrx-21 und GPDhBarWtrx-22) waren steril. Samen von T1-Pflanzen und ihrer Nachkommenschaft von ausgewählten wtrxh-positiven Linien wurden gepflanzt, um auf homozygote Linien abzusuchen. Homozygote Linien und Null-Segreganten wurden von GPdBhssBarWtrx-2, -29 und GPDhBarWtrx-9 erhalten (siehe Tabelle 1).
  • Zytologische Analyse transgener Pflanzen
  • Chromosomen wurden in Wurzel-Meristemzellen unabhängig transformierter T0-Gerstenpflanzen gezählt. Von den untersuchten 28 unabhängigen transgenen Linien hatten 17 Linien den normalen diploiden Chromosomensatz (2n = 2x = 14), während die verbleibenden 11 Linien tetraploid waren (2n = 4x = 28) (siehe Tabelle 1).
  • Charakterisierung von und Gehalt an WTRXh erzeugt in transgenem Samen
  • Wie oben diskutiert, wurden mehrere stabil transformierte Gerstenlinien erhalten, die Weizen-Thioredoxin h exprimierten. Wie man in 2 sieht, führte die stabile Einführung des wtrxh, gebunden an den B1-Hordein-Promotor mit der Signal-Peptidsequenz, zu stark erhöhter Expression von aktivem WTRXh in transgenem Gerstensamen.
  • Analyse löslicher Protein-Fraktionen der drei Linien, in denen das Thioredoxin-Gen an eine Signalsequenz gebunden war (GPdBhssBarWtrx-22, GPdBhssBarWtrx-29 und GPdBhssBarWtrx-7), mittels Western-Blot zeigte Unterschiede in den Expressionsgraden (gezeigt in Tabelle 2). Die Linie GPdBhssBarWtrx-22, GPdBhssBarWtrx-29 bzw. GPdBhssBarWtrx-7 zeigten 22 mal, 10 mal und 5,5 mal mehr WTRXh-Protein als nicht-transformierte Kontrollsamen. Die Analysen zeigten, dass der Thioredoxin-Gehalt des Null-Segreganten (GPdBhssBarWtrx-29-11) näherungsweise die Hälfte desjenigen der entsprechenden Kontrolle war. Die drei Linien, die aus dem Konstrukt erzeugt wurden, in dem das Thioredoxin-Gen nicht mit einer Signalsequenz verbunden war, wurden auch mit nicht-transformierten Kontroll-Gerstensamen verglichen, und sie zeigten die folgenden Anstiege der TRXh-Mengen, wie durch die Western-Blot-Analysen angezeigt: GPDhBarWtrx-9: 12-fach; GPDhBarWtrx-5: 6,3-fach; GPdBhBarWtrx-2: 6,4-fach. Bei Sondierung auf Western-Blots zeigen die transgenen Linien zwei Banden, während die Kontrollgerste im allgemeinen nur eine Bande und in manchen Fällen eine zweite kleinere Bande zeigt. Außerdem waren die Gewebe von den transgenen Linien durch eine Bande gekennzeichnet, die keiner der Gersten-Banden entsprach, aber Weizen-Thioredoxin h entsprach. Diese Daten zeigen an, dass das durch Transformation eingeführte Protein Weizen-Thioredoxin h ist.
  • Tabelle 2: Western-Blot-Analysen der Überexpression von Weizen-Thioredoxin h in Gerste
    Figure 00570001
  • Tabelle 2: (Fortsetzung)
    Figure 00580001
  • Das Weizen-Thioredoxin h in Gerstenkörnern ist biologisch aktiv
  • Wegen der Beeinflussung durch andere Enzyme, die NADPH oxidieren, kann die Aktivität von TRXh in Rohextrakten nicht genau untersucht werden, was seine Teilreinigung erfordert. Teilgereinigte Extrakte der verschiedenen transgenen und Kontroll-Linien wurden aus 15 g Samen bereitet, wobei Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Gelfiltrations-Chromatografie verwendet wurden. Die Aktivität wurde mit einem NADP-MDH-Aktivierungstext gemessen. Die auf diesen Tests lasierenden Profile zeigen, dass die Aktivität von TRXh in dem transformierten Samen viel höher ist als in der nicht-transformierten Kontrolle (siehe 2). Die Aktivitätsergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
  • Die Gesamt-WTRXF-Aktivität der Samen der zwei Linien, die mit dem B1-Hordein-Promotor und der Signalsequenz transformiert wurden (GPBhssBarWtrx-3; GPdßhssBarWtrx-29), ist etwa 4-fach bzw. bis 10-fach höher als bei dem nicht-transformierten Kontrollsamen. Die Gesamtaktivität einer Linie, die mit dem D-Hordein-Promotor ohne die Signalsequenz transformiert wurde (BGPDhBbarWtrx-5), ist nur leicht höher (1,25-fach) als bei der nicht-transformierten Kontrolle (siehe Tabelle 3). Bei den Transgenen ist die spezifische Aktivität von Thioredoxin im allgemeinen etwa 0,128 A340 nm/min/mg Protein oder etwa 2-fach gegenüber Null-Segreganten.
  • Tabelle 3: Zusammenfassung von mit Puffer extrahiertem Gesamtprotein und Gesamt-Thioredoxin-Aktivität der aktiven Fraktion nach Gel-Filtration.
    Figure 00590001
  • Die bisher analysierten transformierten Gerstenkörner scheinen mehr Pufferextrahiertes Gesamtprotein zu haben als nicht-transformierter Kontrollsame (Tabelle 3).
  • Die transformierten Körner haben einen Thioredoxin-Gehalt von mindestens etwa 10 bis 15 μg Thioredoxin/mg lösliches Protein (etwa 2–8 μg Thioredoxin/mg Gewebe) oder etwa 2-fach höher als der Null-Segregant.
  • Wegen der Mühsamkeit des (NH4)2SO4-Verfahrens und des Erfordernisses großer Mengen an Samen wurde das ursprüngliche Extraktionsverfahren abgewandelt, um einen Wärmebehandlungsschritt zu enthalten. Diese Veränderung basierte auf der Tatsache, dass E.coli-WTRXh nach 10-minütiger Be handlung bei 60°C stabil ist (Mark and Richardson, 1976). Ergebnisse bei WTRX von zwei verschiedenen transgenen Gerstensamen (GPdBhBarWtrx-3, GPdBhssBarWtrx-29) zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Aktivität zwischen den wärmegehandelten und nicht-wärmebehandelten Extrakten (3). Zusätzlich verringerte die Wärmebehandlung die endogene, unspezifische Aktivität in diesem Test, wodurch die Verläßlichkeit der Messungen erhöht wurde.
  • Zehn verschiedene Gersten-Linien (transformiert und nicht-transformiert) wurden unter Verwendung des Wärmebehandlungs-Schritts extrahiert und mit dem NADP-MDH-Test untersucht; die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Im allgemeinen ist die Gesamt-WTRXh-Aktivität in Samen von Linien, die mit dem B-Hordein-Promotor und der an WTRXh gebundenen B-Hordein-Signalsequenz transformiert wurden, viel höher (4- bis 35-fach) als in Samen von Linien, die mit demselben Promotor, aber ohne an WTRXh gebundene Signalsequenz transformiert wurden, oder in Samen von der nicht-transformierten Kontrolle (Tabelle 4). An diesem Punkt ist nicht bekannt, ob das gesamte in Gerstensamen exprimierte Weizen-WTRXh wärmestabil ist.
  • Tabelle 4: Relative Thioredoxin-Gesamtaktivität in verschiedenen transgenen Gersten-Linien.
    Figure 00600001
  • Tabelle 4: (Fortsetzung)
    Figure 00610001
  • 100% von (a) Gesamt-Protein, mg; (b) Gesamt-Aktivität, nmol/min; und (c) spezifischer Aktivität, nmol/min/mg Protein der nicht-transgenen Kontrolle sind: (a) 116,4; (b) 157,38 bzw. (c) 1,52.
  • Bei den stabil transformierten Linien, die Weizen-Thioredoxin h exprimierten, wurde im Mittel gefunden, dass seine Menge in Transformanten, die die Signalpeptid enthaltenden Konstrukte besaßen, höher war als in denen, die sie nicht besaßen (Tabelle 4). Western-Blot-Analyse von Faktionen löslicher Proteine von heterozygoten Gemischen von Samen von drei der Linien, GPdBhssBarWtrx-7, GPdBhssBarWtrx-29 und GPdBhssBarWtrx-22 zeigte 5,5-fach, 22-fach bzw. 10-fach mehr Thioredoxin h als nicht-transformiertes Kontrollkorn (Tabelle 2). Der Thioredoxin-Gehalt des Null-Segreganten (GPdBhssBarWtrx-29-11-10) war etwa die Hälfte desjenigen der entsprechenden, nicht-transformierten Kontrolle.
  • Extrakte aus Gerste zeigten typischerweise eine immunologisch reaktive Bande (in 4A mit B bezeichnet, Spuren 1 und 6), aber in manchen Übertragungen zeigten sie eine zweite schwache, sich schneller bewegende Bande (4B, Spur 2). Gewebe von transgenen Linien, die wtrxh überexprimieren, waren durch eine Bande gekennzeichnet, die keiner der zwei Gegenstücke in Gerste entsprach, sondern vielmehr Thioredoxin h von Weizen. Der Unterschied zwischen dem überexprimierten 13,5-kDa Thioredoxin h von Weizen und dem endogenen 13,1-kDa Thioredoxin h von Gerste ist besonders ausgeprägt in der mit dem Thioredoxin h-Gen, das nicht zielgeführt war, transformierten Gerstenlinie (4A, Spur 5 und 4B, Spur 1). Wiederholte Analysen der verschiedenen transgenen Linien durch SDS/PAGE führten zu dem Schluß, dass die in den 4A–B mit W bezeichnete Bande dem durch Gerste eingeführten Brotweizen wtrxh entspricht. Unabhängige biochemische Tests mit 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) (Florencio et al., 1988) bestätigten die Fähigkeit von Gersten-NTR, Weizen-Thioredoxin h zu reduzieren (Daten nicht gezeigt).
  • Wegen ihres Werts bei der Untersuchung biochemischer Merkmale des Korns wurden homozygote wtrxh-Linien mittels Western-Blot identifiziert und analysiert. Die zwei als homozygot identifizierten Linien zeigten beide eine erhöhte Expression von Thioredoxin h relativ zu derjenigen ihrer heterozygoten Eltern und der nicht-transformierten Kontrollen. Die Analyse von GPdBhssBarWtrx-29-3 ist in 5 gezeigt. Es wird festgestellt, dass der Beweis der Thioredoxin h-Anwesenheit in den nicht-transgenen Kontrollkörnern und den nullsegreganten Körnern (in der in 4 gezeigten Darstellung nicht ersichtlich) Bedingungen erforderte, die zu Überexponierung der angereicherten transgenen Präparate führten. Es wurde gezeigt, dass Thioredoxin in dem heterozygoten Elternkorn biochemisch aktiv war.
  • Pullulanase- und Pullulanase-Inhibitor-Aktivität in Thioredoxin h überexgrimierendem Gerstenkorn.
  • Pullulanase ist ein im Getreidekorn vorliegendes amylolytisches Enzym, das ein Disulfid-Inhibitor-Protein hat (Macri et al., 1993; MacGregor et al., 1994), dessen Aktivität an Thioredoxin gebunden ist (Wong et al., 1995). Von NADPH über NTR reduziertes Thioredoxin reduziert die Disulfid-Bindungen des Inhibitors, was erlaubt, dass das Ziel-Pullulanase-Enzym aktiv ist. Wegen dieser Beziehung war es von Interesse, die Aktivität von Pullulanase in den Thioredoxin h überexprimierenden Transformanten zu bestimmen.
  • Spektrofotometrische Untersuchungen (8A) von Extrakten von transformiertem Korn einer Thioredoxin h über exprimierenden homozygoten Linie (GPdBhssBarWtrx-29-3) zeigten eine 3- bis 4-fache Erhöhung der Pullulanase-Aktivität am fünften Tag nach Beginn der Keimung, relativ zu ihrer null-segreganten. Bestätigungsergebnisse wurden in einem getrennten Experiment mit Gelen natürlicher Aktivität erhalten. Der Anstieg der Aktivität war offenkundig, entweder wenn die Gele direkt betrachtet wurden (8B) oder wenn die Aktivität auf den Gelen durch Scannen und Integrieren der geklärten Banden untersucht wurde (8C). Eine homozygote Linie, die aus einem unterschiedlichen, unabhängigen Transformationsereignis isoliert wurde (GpdBssBarWtrx-2-1-15), zeigte eine ähnliche Reaktion (Daten nicht gezeigt). Die transgenen Pflanzen exprimierten eine Pullulanase-Aktivität von etwa 1 bis 2 Extinktionseinheiten bei 534 nm/30min/mg Protein, was etwa 2-fach höher ist als bei null-segreganten.
  • Die Pullulanase-Inhibitor-Aktivität wurde an Fraktionen bestimmt, die zur Inaktivierung von Pullulanase erhitzt worden waren (70°C für 15 min.), indem die Hemmung der Fraktionen an zugesetzter gereinigter Gerstenmalz-Pullulanase gemessen wurde. Es wurde gezeigt, dass durch diese Wärmebehandlung die endogene Pullulanase-Aktivität vollständig beseitigt wurde, während die Inhibitor-Aktivität nicht beeinflußt wurde (Macri et al., supra; MacGregor et al., supra). Die Analyse vergleichbarer Korn-Extrakte offenbarte, dass der Pullulanase-Inhibitor sowohl bei den Transformanten als auch bei den Null-Segreganten am vierten und fünften Tag nach Wasserzugabe inaktiv war. So zeigen diese Ergebnisse, das; das nach dem dritten Tag beobachtete Anwachsen der Pullulanase-Aktivität nicht durch gesteigerte Inaktivierung des Inhibitors in dem transgenen Korn verursacht wird. Es ist möglich, dass Thioredoxin entweder durch Erhöhen der de novo-Synthese von Pullulanase (Hardie et al., 1975) oder durch Verringern der Bindung des reifen Enzyms an das stärkehaltige Endosperm wirkt. Es gibt einen Hinweis, dass etwas von der Pullulanase des reifen Endosperms in gebundener Form vorliegt und unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert werden kann (Sissons et al., 1993; Sissons et al. 1994).
  • Alpha-Amylase-Akivität in Thioredoxin h überexprimierendem Gerstenkorn
  • Alpha-Amylase, ebenfalls ein amylolytisches Enzym, das wie Pullulanase von Gibberellinsäure induziert wird, wurde lange als der Schlüssel zur Keimung betrachtet. Es ist bekannt, dass die Synthese der Hauptform (B) und der Nebenform (A) dieses Enzyms von dem Hormon Gibberellinsäure (GA) ausgelöst wird. Außerdem wird die alpha-Amylase-Aktivität in vitro durch die reduktive Inaktivierung ihres Disulfid-Inhibitor-Proteins durch Thioredoxin h (in Anwesenheit von NADPH- und NADP-Thioredoxin-Reduktase) erhöht. Die vor- liegenden Ergebnisse mit transformiertem Gerstensamen zeigen, dass die Thioredoxin h-Expression die alpha-Amylase-Aktivität verändert, wie Pullulanase. In diesem Fall wird das Auftreten des Enzyms während der Keimung beschleunigt und seine Häufigkeit und Aktivität sind erhöht.
  • 9A-D zeigt den frühen Anstieg sowohl der Häufigkeit als auch der Akti- vität von alpha-Amylase (Formen A + B) während der Keimung und Sämlingsentwicklung. Basierend auf der Antikörper-Antwort in Western-Blots wurde alpha-Amylase in dem transgenen Korn erstmalig drei Tage nach dem Einsetzen der Keimung nachgewiesen (9C), während das Enzym in dem Null-Segreganten erst am vierten Tag auftrat (9A). Das Einsetzen der Aktivität (auf der Basis von Aktivitätsgel) folgte einem ähnlichen Muster ( 9B und 9D). Die Mobilität des Enzyms in dem Aktivitätsgel spiegelte auch die frühe Induzierung von Aktivität in dem transgenen Korn wieder (10). Dass viel von diesem früh zu sehenden Aktivitätsanstieg der B-Form (Gibberellinsäure-gebundenen Form) zuzuschreiben war, wird durch 11 gestützt. Hier kann man auch sehen, dass in Thioredoxin h überexprimierendem Korn die Menge der Nebenform A des Enzyms (ebenso Gibberellinsäure-abhängig) erhöht war. Wiederum war das Auftreten signifikanter Mengen der alpha-Amylase-Enzym-Hauptform (B-Form) um einen Tag vorverlegt.
  • Keimung von Thioredoxin h überexprimierenden Gerstenkörnern
  • Alle Vorgänge wurden bei 25°C (wenn unten nichts anderes angegeben ist) unter von Kobrehel et al. 1992 und Lozano et al. 1996 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die Körner wurden durch 30-minütiges kontinuierliches Rühren in 0,25%igem Bleichmittel oberflächensterilisiert. Das Bleichmittel wurde durch ausführliches Waschen mit sterilisiertem destilliertem Wasser entfernt. 30 sterilisierte null-segregante (GPdBhssBarWtrx-29-22-10, in denen das Transgen durch Kreuzen mit einer selbstbestäubten Pflanze derselben Linie entfernt worden war) und 30 sterilisierte homozygote (GPdBhssBarWtrx-29-3) Samen wurden jeweils in eine aus einer Reihe von Kunststoff-Petrischalen (12,5 cm Durchmesser), die mit drei Lagen Filterpapier Whatman #1, befeuchtet mit 15 ml sterilem destilliertem Wasser, ausgestattet waren, gebracht. Die Platten wurden mit Aluminiumfolie umwickelt, und das Korn wurde in einer Dunkelkammer bei 20°C bis zu sieben Tage lang keimen lassen. Eine Platte wurde an jedem in 21 gezeigten Zeitpunkt abgelesen. Der Prozentsatz der Keimung wurde am ersten Tag (vom Beginn des Inkubie- rens bis zu 24 Stunden) durch Beobachten des Auftretens des Würzelchens bestimmt. An den nachfolgenden Tagen steht der Prozentsatz der Keimung für das Sämlings-Wachstum, wie es durch Messen der Länge von Koleoptil und Wurzeln der gekeimten Körner bestimmt wird.
  • Die in 21 gezeigte en Ergebnisse geben an, dass die Keimung bei transgener Gerste, die Thioredoxin überexprimiert, bei etwa 25–30% der Samen etwa 16 Stunden nach dem Einsetzen des Inkubierens nachgewiesen wird. Im Gegensatz dazu wurde bei den Null-Segreganten bei 16 Stunden keine Keimung nachgewiesen, sondern wird erstmals 8 Stunden später, am Tag 1, nachgewiesen. Daher ist bei den Transgenen die Keimung um etwa 8 Stunden vorverlegt. Am Tag 1 jedoch wurde die Keimung bei näherungsweise 70% oder etwa der doppelten Anzahl der transgenen Körner verglichen mit ihren nullsegreganten Gegenstücken nachgewiesen. Es ist interessant festzustellen, dass das Einsetzen der Keimung bei den Transgenen dem Einsetzen des Nachweises von alpha-Amylase, wie in 10 gezeigt, parallel läuft.
  • Sequentielle Extraktion von Korn-Proteinen aus transgenen Gerstenkörnern
  • Isoliertes Endosperm von 10 getrockneten Körnern oder Sämlingen (gekeimt wie oben beschrieben) wurde mit Mörser und Pistill bei 4°C mit 3 ml Tris-HCl-Puffer wie unten angegeben gemahlen. Die getrennten Gemische von homozygoten GPdBhssBarWtrx-29-3-Körnern und null-segreganten GPdBhssBarWtrx-29-22-10-Körnern wurden in ein 5 ml-Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen gebracht. Die Körner wurden 30 Minuten lang mechanisch geschüttelt und dann 10 Minuten lang bei 24000 g zentrifugiert. Die Überstand-Fraktion (pufferlöslich) wurde dekantiert und zur Analyse aufbewahrt und der Rückstand wurde nacheinander mit den folgenden Lösungsmitteln für die angegebenen Zeiten extrahiert:[1] 0,5 M NaCl (30 min.); [2] Wasser (30 min.); [3] 2 × 50% Propanol (2 h); [5] 2 × 50% Propanol + 2% 2-Mercaptoethanol (MET) (2 h); und [5] 0,5 M Borat-Puffer, pH 10, 1% SDS und 2% 2-Mercaptoethanol enthaltend (2 h). Die Überstand-Fraktionen aller Extrakte wurden hinsichtlich Volumen und Proteingehalt (mittels Coomassie-Farbstoff-Bindungsverfahren) bestimmt, dann wurden sie bei –20°C bis zum Gebrauch gelagert. Nach Gepflogenheit werden die; Fraktionen bezeichnet: [1] Albumin/Globulin (Puffer/Salz/Wasser); [2] Hordein I (Propanol); [3] Hordein II (Propanol + MET); und [4] Glutelin (Borat/SDS/MET) (Shewri et al., 1980). Diese Fraktionen wurden verwendet, um den Proteingehalt, die Verteilung der Proteine zwischen den wasser-löslichen und -unlöslichen Fraktionen, das insgesamt extrahierbare Protein, und die Reduktion mit NADPH zu bestimmen.
  • Zur Bestimmung des in vivo-Redoxzustands des Proteins von transgenen Gerstenkörnern während der Keimung und Sämlingsentwicklung wurde der Extraktionsvorgang wiederholt mit der Ausnahme, dass in dem Tris-Puffer beim Mahlen 2 mM mBBr enthalten waren und dass das Mahlen unter flüssigem Stickstoff stattfand. Die mBBr-derivatisierten Proteine wurden auf SDS-Polyacrylamid-Gelen (1,5 mm Dicke, 10–20% Gele, pH 8,5 (Laemmli, 1970)) der Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden 60 Stunden lang bei einem konstanten Strom von 8 mA entwickelt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 12%ige (w/v) Trichloressigsäure gebracht und 4 bis 6 Stunden lang mit einem Lösungswechsel, eingeweicht, um die Proteine zu fixieren; die Gele wurden dann für 8 bis 10 Stunden unter Bewegung in eine Lösung von 40% Methanol/10% Essigsäure überführt, um restliches mBBr zu entfernen. Die Fluoreszenz von mBBr (sowohl freiem als auch proteingebundenem mBBr) wurde sichtbar gemacht, indem die Gele auf einen mit einer Ultraviolettlicht- Quelle (365 nm) ausgestatteten Lichtkasten gebracht wurden. Nach der Entfernung von überschüssigem (freiem) mBBr wurden die Bilder der Gele mittels Gel Doc 1000 (Bio-Rad) festgehalten.
  • Zur Feststellung der entsprechenden Proteinmenge der aufgebrachten Extrakte wurden die SDS-Gele mit Coomassie Brilliantblau G-250 in 10%iger Essigsäure 30 Minuten lang gefärbt und mit Hilfe eines Mikrowellenofens in 10%iger Essigsärue 30 Minuten lang entfärbt. Die Gele mit gefärbtem Protein wurden wie oben mittels Gel Doc 1000 festgehalten.
  • Die quantitative Bestimmung der Fluoreszenz (Pixel × mm × mm) und des Proteins (optische Dichte × mm × mm) auf den Gelen wurde mittels eines Software-Programms zur Bildanalyse - Multi-Analyst, Version 1.0 (Bio-Rad) - durchgeführt. Die relative Reduktion wurde ausgedrückt als das Verhältnis von Fluoreszenz zu Protein.
  • Die Ergebnisse von zwei Experimenten, die in Tabelle 5, Tabelle 6 und Tabelle 7 gezeigt sind, veranschaulichen einen Anstieg des Gesamt-Proteins auf der Basis von Korn-Prozent und auf der Basis von Gewichts-Prozent bei der transgenen Gerste im Vergleich zu der null-segreganten. Die transgene hat einen Thioredoxin-Gehalt, der mindestens 2-fach höher ist (10–15 μg/mg lösliches Protein; 2–8 μg/g Gewebe) als bei der null-segreganten. Die Daten zeigen an, dass dieser Anstieg des insgesamt extrahierbaren Proteins das Ergebnis der Neuverteilung des Proteins auf die am meisten lösliche Albumin/ Globulin-Fraktion ist. Der Anstieg der Neuverteilung des Proteins auf die lösliche Fraktion ist bei den Transgenen mindestens 5% höher als bei den Kontrollen.
  • Tabelle 5. Protein-Gehalt verschiedener Fraktionen bei Weizen-Thioredoxin h überexprimierendem transgenen Gerstenkorn
    Figure 00690001
  • Tabelle 6. Protein-Gehalt verschiedener Fraktionen bei Weizen-Thioredoxin h überexprimierendem transgenen Gerstenkorn
    Figure 00690002
  • Tabelle 7 Prozentualer Anstieg des extrahierbaren Proteins in homozygoter Linie
    Figure 00700001
  • Die Analyse des relativen Redox-Zustands (SH : SS) von Protein-Fraktionen bei transgenen und null-segreganten Gerstenkörnern während der Keimung und als trockene Körner sind in 22 gezeigt. Bei trockenem transgenem Korn wurde der größte Anstieg der Reduktion relativ zu dem Null-Segreganten bei der Hordein I-Fraktion beobachtet. Diesem Anstieg parallel lief die Verringerung des relativen Redox-Zustands bei der Hordein II- und der Glutelin-Fraktion, während der relative Redox-Zustand der Albumin/Globulin-Fraktion unverändert war. Der relative Redox-Zustand des Transgenen im Vergleich zu dem Null-Segegranten ist mindestens 5 : 1.
  • Während der Keimung erhöht sich die Albumin/Globulin-Fraktion fortschreitend, wobei sie am Tag 4 ein relatives Redox-Verhältnis von etwa 1,5 erreicht. Der relative Redox-Zustand der Hordein II- und Glutelin-Fraktion stieg während der Keimung ebenfalls an, erreichte aber nur Gleichheit mit dem Null-Segreganten. Im Gegensatz dazu war der relative Redox-Zustand der Hordein I-Fraktion hochgradig veränderlich.
  • Gemäß dem obigen Beispiel werden andere Pflanzen-Typen in ähnlicher Weise transformiert, um Thioredoxin überexprimierende transgene Pflanzen zu erzeugen, wie transgenen Weizen, unten beschrieben, Reis, Mais, Hafer, Roggen, Sorghum (unten beschrieben), Hirse, Triticale, Futtergras, Rasengras, Sojabohnen, Limabohnen, Tomate, Kartoffel, Sojabohne, Baumwolle, Tabak, etc..
  • Außerdem versteht es sich, dass im Zusammenhang mit der Erfindung andere Thioredoxine als Weizen-Thioredoxin oder Thioredoxin h verwendet werden können. Zu solchen Beispielen gehören Spinat h-, Chloroplasten-Thioredoxin m und f, bakterielle Thioredoxine (z. B. E. coli), Hefe, und tierisches und dergleichen.
  • Beispiel 2
  • Thioredoxin h und Arabidopsis NTR überexprimierendes transgenes Weizenkorn
  • A. Materialien und Verfahren
  • Pflanzen-Materialien
  • Frühlings-Kulturvarietäten von Weizen, Bobwhite, Anza und Yecora Rojo, wurden in einem Gewächshaus wachsen lassen wie vorher beschrieben (Wan and Lemaux 1994; Lemaux et al. 1996). 10 bis 14 Tage alte keimende Pflanzen einer Winterweizen-Kulturvarietät, Karl, wurden bei 4°C 45 bis 60 Tage lang im Dunkeln inkubiert zur Vernalisationsbehandlung.
  • Weizen-Exoressionsvektoren
  • Zur Transformation von Weizen wurden das synthetische Gen von grünfluoreszierendem Protein [sfgp(S65T)], Weizen-Thioredoxin h (wtrxh), oder Arabidopsis ntr enthaltende Expressionsvektoren, gesteuert durch Gersten-Endosperm-spezifisches B1 oder D-Hordein, wie folgt konstruiert:
    • (1) pDhSSsGFPN3-4: Das die D-Hordein-Promotor-Signalsequenz sgfp(S65T)-nos enthaltende chimäre DNA-Konstrukt wurde unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens der gerichteten Mutagenese durch PCR erhalten (Cho and Lemaux 1997). Es wurde die Drei-Primer-Strategie verwendet. Ein kürzeres Fragment von 0,5-kb DHORSS wurde durch PCR in der ersten Reaktion erzeugt unter Verwendung der Primer Dhor4 (5'-agaaagcttggtaccCTTCGAGTGCCCGCCGAT-3'; SEQ ID No: 9) und DhorSSsGFP1R (5'-GAACAGCTCCTCGCCTTGCTCACAGCGGTGGTGAGAGCCACGAGGGC-3'; SEQ ID No: 10), wobei die Matrize pHor3-1 einen genomischen Klon von D-Hordein enthielt (S⌀rensen et al., 1996), und dieses erste PCR-Produkt (Megaprimer) wurde 50-fach verdünnt. DhorSSsGFP1 R ist ein überlappender Primer, der die sgfp(S65T)-codierende Sequenz und eine Signal-Peptid-Teilsequenz (unterstrichen) des D-Hordein-Promotors enthält. Für die zweite PCR-Reaktion wurden 5 μl des verdünnten Megaprimers (DHORSS), 20 ng Matrize (pAct1IsGFP-1; Cho et al., 2000) und 40 pmol externe Primer [Dhor4 und Nos1R (5'-cggaaitcGATCTAGTAACATAGATGACA-3'; SEQ ID No: 17)] auf ein Endvolumen von 100 μl in 1X PCR Puffer gemischt; pAct1IsGFP-1 enthält synthetisches gfp-Gen [sgfp(S65T)] (Chiu et al., 1996), gesteuert durch den Reis-Actin 1-Promotor und sein Intron, und wird durch nos terminiert. Das sich ergebende chimäre PCR-Produkt wurde mit Hind II und EcoRI verdaut und in den HindII/EcoRI-verdauten pBluescript II KS(+)-Vektor ligiert, außerdem durch DNA-Sequenzierung des PCR-amplifizierten Fragments [D-Hordein-Promotor mit seiner Signal-Peptid-Sequenz plus dem Verknüpfungsbereich mit 5'sgfp(S65T)] bestätigt und zur stabilen Transformation von Weizen verwendet.
    • (2) pDhWTRXhN-2: Der 384-bp codierende wtrxh-Bereich wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung des Plasmids pTaM13,38 (Lauter et al., 1998), enthaltend einen cDNA-Klon des wtrxh-Gens als eine Matrize zur Erzeugung von XbaI- und SacI-Stellen mit den Primern Wtrxh1 (5'- atatctagaATGGCGGCCTCGGCGGCGA-3'; SEQ ID No: 5) bzw. Wtrxh2R (5'-atagagctcTTACTGGGCCGCGTGTAG-3'; SEQ ID No: 6) (12); kleine Buchstaben enthalten eine Restriktionsenzym-Stelle zum Subklonieren des DNA-Konstrukts, das das wtrxh-Gen enthält, und unterstrichene Buchstaben geben die wtrxh-Sequenzen an. Das ATG-Startercodon für die wtrxh-Expression wurde in den Wtrxh1-Primer integriert. PCR-Reaktionen wurden in einem Temperaturwechsler (MJ Research Inc. Watertown, MA) unter Verwendung rekombinanter Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in einem 100-μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Der Reaktions-Puffer enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2,0,1% Triton-X-100 und 50 μM jedes Deoxyribonucleosid-triphosphats. Die PCR-Bedingungen waren 25 Zyklen von 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten, mit einem abschließenden Extensions-Schritt bei 72°C für 7 Minuten. Das mit den Primern Wtrxh1 und Wtrxh2R amplifizierte wtrxh-Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarose-Gel unter Verwendung des QlAquick® Gelextraktion-Kits (Quiagen Inc., Chatsworth, CA) gereinigt, mit XbaI und SacI verdaut und in pUC19, verdaut mit XbaI/SacI, ligiert, um das Plasmid pWTRXh-1 zu erzeugen. Die Nucleotid-Sequenzen des PCR-amplifizierten wtrxh codierenden Bereichs wurden durch Dideoxynucleotid-Kettenabbruch-Verfahren unter Verwendung von Sequenase nach den Herstelleranweisungen (United States Biochemical, Cleveland, OH) mit doppelsträngigen Plasmid-Matrizen und regelmäßig beabstandeten Primern bestimmt. pDhWTRXN-2 wurde hergestellt: durch Ersetzen des uidA-Gens in pDhGN-2 (enthaltend Gersten-Endosperm-spezifischen D-Hordein-Promotor und nos 3'-Terminator; M.-J. Cho, unveröffentlicht) durch das XbaI/SacI-Fragment, enthaltend die codierende wtrxh-Sequenz von pWTRXh 1.
    • (3) Die pdBhssWTRXhN3-8-Primer Bhor7 (5'-GTAAAGCTTTAACAACCCA-CACATTG-3'; SEQ ID No: 7) und BhorWtrxh1R (5'-CCGACGCCGCTGCATCGTACTTGTTGCCGCAAT-3'; SEQ ID No: 8), die HindIII- bzw. Acyl-Stellen enthalten, wurden zur Amplifikation des die B1-Hordein-5'-Signalpeptid-Sequenz enthaltenden 0,49-kb B1-Hordein 5'-Bereichs verwendet, wobei der das λ2-4/HindIII-Plasmid enthaltende genomische Klon von B1-Hordein (Brands et al., 1985; Cho et al., 1997) als eine Matrize verwendet wurde. Der Primer BhorWtrxhIR ist ein überlappender Primer, der die wtrxh-codierende Sequenz (unterstrichen) und eine Signalpeptid-Teilsequenz des B1-Hordein-Promotors ohne das ATG-Startercodon für wtrxh enthält. pdBhssWTRXhN3-8 wurde hergestellt durch Ersetzen des D-Hordein-Promotors in pDhWTRXN-2 durch das 0,49-kb PCR-amplifizierte HindIII/Acyl-Fragment, enthaltend den B1-Hordein-Promotor mit seiner Signalpeptid-Sequenz plus dem Verknüpfungsbereich mit dem 5'-wtrxh. So enthält das Konstrukt pdBhWTRXN3-8 den Gersten-Endosperm-spezifischen B1-Hordein-Promotor mit seiner Signalpeptid-Sequenz wtrxh und nos (12 ). Die das ATG-Startercodon enthaltende Signalpeptid-Sequenz wurde unmittelbar mit der Sequenz des wtrxh-Gens kombiniert (Gautier et al., 1998), ohne zusätzliche Aminosäure-Sequenzen zwischen den zweien zu haben, um dafür zu sorgen, dass das WTRXh-Protein eine präzise Spaltstelle im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) bereitstellt. Das PCR-amplifizierte Fragment des chimären Produkts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
    • (4) pKBhssWTRXN-2: pBhor-1 wurde mit SphI und SacI verdaut, um die 0,55-kb 5'-flanking region des B1-Gersten-Hordein-Promotors zu erhalten. Das 0,55-kb SphI/SacI-Fragment wurde in pSPORT 1 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) ligiert, um pSPBhor-4 herzustellen. pdBhssWTRXN3-8 wurde mit HindIII/EcoRI verdaut und das HindIII/EcoRI-Fragment, enthaltend den 0,43-kb Gersten-Endosperm-spezifischen B1-Hordein-Promotor plus seine Signalpeptid-Sequenz, wrxh und nos wurden in das HindIII/EcoRI-verdaute pSPBhor-4 ligiert, um das Plasmid pSPBhssWTRXN-4 zu erzeugen. Um das Ampicillin-Resistenzgen zu entfernen wurde das 1,3-kb SphI/EcoRI-Fragment von pSPBhssWTRXN-4 zur Bildung von pKBhssWTRXN-2 in das SphI/EcoRI- verdaute pJKKmf(-)enthaltende Kanamycin-Resistenzgen ligiert. So enthält das Kanamycin-Rückgrat-Konstrukt, pKBhssWTRXN-2, den 0,55-kb 5'-Flankierungsbereich (5'-flanking region) des B1-Gersten-Hordein-Promotors plus seine Signalpeptid-Sequenz, wrxh und nos (12).
    • (5) pDhAtNTR-4: pDfAtNTR-4 wurde hergestellt durch Ersetzen des wtrxh-Gens in pDhWTRXN-2 (oben beschrieben) durch das PCR-amplifizierte XbaI/SacI-Fragment, enthaltend die Arabidopsis ntr-codierende Sequenz von pAtNTR (eine Gabe von Dr. S.Y. Lee). Die Primer AtNTR1 (5'-ggtctagaATGGAAACTCACAAAACC-3'; SEQ ID No: 18) und AtNTR2R (5'-gggagctcTCAATCACTCTTCACCCTC-3'; SEQ ID No: 20) wurden zur Amplifikation des 1,009-kb XbaI/SacI-Fragments, enthaltend die 0,993-kb Arabidopsis ntr-codierende Sequenz, verwendet; kleine Buchstaben enthalten eine Restriktionsenzym-Stelle um Subklonieren des das Arabidopsis ntr-Gen enthaltenden DNA-Konstrukts, und unterstrichene Buchstaben geben die Arabidopsis ntr-Sequenzen an. Das Arabidopsis ntr-Fragment wurde von einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung des QIAquick® Gelextraktions-Kits gereinigt, mit XbaI und SacI verdaut und in XbaI/SacI-verdautes pDhWTRXN-2 ligiert, um das Plasmid pDhAtNTR-4 zu erzeugen. Die Nucleotid-Sequenzen des PCR-amplifizierten Arabidopsis ntr-codierenden Bereichs wurden durch DNA-Sequenzierung bestimmt.
  • Stabile Weizen-Transformation
  • Stabile transgene Linien von Weizen, transfomiert mit pDhSSsGFPN3-4, pdBhssWTRXhN3-8, pKBhssWTRXN-2 oder pDhAtNTR4, wurden unter Verwendung hochgradig regenerativer, grüner Gewebe als Transformationsziele erhalten. Hochgradig regenerative Gewebe haben einen hohen Prozentsatz omnipotenter Zellen, die zu anhaltender Zellteilung in der Lage sind und für eine Regenerierung über lange Zeiträume kompetent sind. Um hochgradig regenerative grüne Gewebe zu erzeugen wurden vollständige unreife Embryonen (IEs; 1,0–2,5 mm) aseptisch entfernt, mit der Skutellumseite nach unten auf DBC3-Medium gebracht (Callus-Induktionsmedium, enthaltend 1,0 mg/L 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,5 mg/L BAP und 5,0 μM CuSO4; Cho et al., 1998a–c). Fünf bis sieben Tage nach dem Beginnen wurden die keimenden Schößlinge und Wurzeln durch manuelles Herausziehen entfernt. Nach drei Wochen Inkubation bei 24 ± 1°C unter gedämpften Lichtbedingungen (näherungsweise 10 bis 30 μE, 16 Stunden Licht) wurden die Gewebe höchster Qualität des Skutellums selektiert und auf DBC3-Medium gehalten. Alternativ wurden hochgradig regenerative grüne Gewebe von Tochtergeweben, eiförmig geformten Geweben mit hochgradig embryogenen Strukturen, die an der Basis keimender Schößlinge oder aus der Außenschicht der Gewebe nahe der Basis keimender Schößlinge herauskamen, erhalten. Sieben bis 14 Tage nach Beginn wurden Tochtergewebe (2–4 mm Länge) von keimenden IEs durch manuelle Entfernung isoliert und auf frisches DBC3-Medium übertragen. Nach zusätzlichen 3 bis 4 Wochen Inkubation wurden die Gewebe erneut selektiert, in 2 bis 4 Stücke von etwa 3 bis 5 mm Größe zerteilt und auf frisches Medium überführt. Die Gewebe wurden auf frischem Medium gehalten, wobei in 3 bis 4 Wochen-Intervallen subkultiviert wurde.
  • Nur Gewebe guter Qualität wurden zum Beschuß ausgewählt. Die hochgradig regenerativen Gewebe (bevorzugt etwa 3–4 mm groß) wurden zur osmotischen Vorbehandlung auf DBC3-Medium, das äquimolare Mengen Mannitol und Sorbitol enthielt, um eine Endkonzentration von 0,4 M zu ergeben, überführt. Vier Stunden nach der Behandlung mit Osmoticum wurden die Gewebe beschoßen, wie vorher beschrieben (Wan and Lemaux 1994; Lemaux et al., 1996). Goldteilchen (1,0 μm) wurden mit 25 μg eines Gemisches von pAct1IHPT-4 (oder pUbiNPTII-1) und einem von vier Plasmiden, pDhSSsGFPDN3-4, pdBhssWTRXhN3-8, pKBhssWTRXN-2 oder pDhAtNTR- 4, in einem Molverhältnis von 1 : 1 oder 1 : 2 beschichtet, gefolgt von Beschuß unter Verwendung einer biolistischen Vorrichtung PDS-1000 He (BioRad, Inc., Hercules, CA) bei 600 oder 900 psi. Das Plasmid pAct1IHPT-4 enthält die Hygromyzin-phosphotrensferase (hpt)-codierende Sequenz unter der Steuerung des Reis-Actin 1-Promotors (Act1), sein Intron und den nos 3'-Terminator (Cho et al., 1998a–c). pUbiINPTII-1 enthält das Neomycin-phosphotransferase (nptII)-Gen unter der Steuerung des Mais-Ubiquitin-Promotors und das erste Intron und wird durch nos abgeschlossen. 16 bis 18 Stunden nach dem Beschuß wurden die beschossenen Gewebe auf DBC3-Medium ohne Osmoticum gebracht und bei 24 ± 1°C unter gedämpften Licht wachsen lassen.
  • Nach dem 10- bis 14-tägigen Kultivierungs-Zeitraum zu Beginn wurde jedes regenerative Gewebe, abhängig von der Gewebegröße, in 1 bis 3 Stücke geteilt und auf DBC3-Medium übertragen, das zur Selektion hinsichtlich hpt mit 20–25 mg/L Hygromycin B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) oder zur Selektion hinsichtlich nptII mit 30 mg/LG418 (Sigma, Saint Louis, MO) ergänzt war. Drei Wochen nach der ersten Selektionsrunde wurden die Kulturen auf frisches DBC3-Medium, das 30 mg/L Hygromycin B oder 40 mg/L G418 enthielt, übertragen. Ab der dritten Selektionsrunde wurde die Gewebe in Intervallen von 3 bis 4 Wochen subkultiviert und auf DBC3-Medium, das 30 mg/L Hygromycin B oder 40 mg/L G418 enthielt, gehalten. Nach der vierten oder fünften Selektionsrunde wurden überlebende Gewebe auf DBC3-Medium ohne Selektionsmittel überführt. Nach der Identifizierung grüner Gewebe mit genügend regenerativen Strukturen auf DBC3 wurden die Gewebe auf Platten mit festem Regenerationsmedium ohne Selektionsmittel gebracht und Licht höherer Intensität ausgesetzt (näherungsweise 45 bis 55 μE). Nach vier Wochen auf Regenerationsmedium (Callus-Induktionsmedium ohne Phytohormone) wurden die regenerierten Schößlinge in Magenta-Behälter, die dasselbe Medium ohne Selektionsmittel enthielten, überführt. Wenn die Schößlinge die Oberseite des Behälters erreichten, wurden die Pflänzchen in den Boden überführt.
  • Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und DNA-Hybridisierung
  • Die gesamte genomische DNA von Blattgeweben wurde gereinigt wie beschrieben (Dellaporta, 1993). Zum Testen auf Anwesenheit von wtrxh in genomischer DNA mutmaßlich transformierter Linien wurden 500 ng genomische DNA durch PCR amplifiziert, wobei einer von zwei Primer-Sätzen, Wtrxh1 (5'-ATATCTAGAATGGCCGCGTCGGCGGCGA-3'; SEQ ID No: 5) und Wtrxh2R (5'-ATAGAGCTCTTACTGGGCCGCGTGTAG-3'; SEQ ID No: 6) oder Wtrxh4 (5'-CCAAGAAGTTCCCAGCTGC-3'; SEQ ID No: 11) und Wtrxh5R (5'-ATAGCTGCGACAACCCTGTCCTT-3'; SEQ ID No: 19) verwendet wurde. Die Anwesenheit von hpt und nptII wurde getestet durch Verwendung jedes der Primer-Sätze, HPT6F (6'-AAGCCTGAACTCACCGCGACG-3'; SEQ ID No: 21) plus HPT5R (5'-AAGACCAATGCGGAGCATATAC-3'; SEQ ID No: 22) (Cho et al., 1998a–c) und NPT1F (5'-CAAGATGGATTGCACGCAGGTTCT-3'; SEQ ID No.: 15) plus NPT2R (5'-ATAGAAGGCGATGCGCTGCGAAT-3'; SEQ ID No.: 16). Amplifikationen wurden mit Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison WI) in einer 25 μl-Reaktion durchgeführt (Cho et al., 1998a–c). 25 μl des PCR-Produkts mit Farbstoffbeladung wurden auf einem 1,0%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid der Elektrophorese unterzogen und unter Verwendung von UV-Licht-Exposition fotografiert. Das Vorliegen von 0,4 kb und 0,14 kb Fragmenten war in Einklang mit einem intakten bzw. geschnittenen wtrxh-Fragmenten; 0,81 kb hpt- und 0,76 kb-nptII-Fragmente für die Plasmide pAct1IHPT-4 und pUhiINPTII-1 wurden mit hpt- bzw. nptII-Primern hergestellt. Für wtrxh homozygote Linien wurden durch PCR-Analyse unter Verwendung von T1-, T1-, oder T3-Pflanzen durchgemustert.
  • GFP-Expressions-Nachweis durch Fluoreszenzmikroskopie
  • Die GFP-Expression wurde bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines Nikon Mikrophot-5A Fluoreszenzmikroskops, ausgestattet mit einem Nikon B-2A-Filterblock, der einen Anregungsfilter 450–490 und einen Emissionssperrfilter BAS20 enthielt, überwacht (Cho et al., 2000).
  • Western-Blot-Analyse
  • Die Western-Blot-Analyse wurde an Samen von ausgewählten transgenen Weizen-Linien sowie von Kontroll-Gegenstücken, die unter denselben Bedingungen wachsen lassen wurden, durchgeführt. Als Referenz wurde Thioredoxin h verwendet, das aus Samen einer Brotweizen-Kulturvarietät, cv. Capitole, gereinigt worden war. Ganze Samen wurden unter flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Für jede Probe wurden 10 Samen verwendet; das Volumen des Extraktions-Puffers [50 mM Tris- HCl oder Phosphat-Puffer, pH 7,8, 0,5 mM Phenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF), 1 mM EDTA] variierte von 2 bis 4 ml in Abhängigkeit von der Anzahl verwendeter Samen und der Viskosität des Extrakts. Nach der Puffer-Zugabe wurde das Mahlen für eine weitere Minute fortgeführt, das Präparat wurde bei 14000 g 10 Minuten lang zentrifugiert und die Überstand-Lösung wurde als die lösliche Albumin-Globulin) Fraktion aufbewahrt. SDS-PAGE der löslichen Fraktion wurde in 12–17% Polyacrylamid-Gradientengelen bei pH 8,5 durchgeführt (Laemmli, 1970). Gleiche Mengen an Protein (40 μg) jeder Probe, quantitativ bestimmt nach Bradford (1976), wurden in Laemmli-Probenpuffer 1 : 2 v/v verdünnt, 3 Minuten lang gekocht, auf Gele aufgebracht und der Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 15 mA unterzogen. Die Proteine wurden auf Nitrozellulose bei einer konstanten Spannung von 40 V bei 4°C für 4 Stunden übertragen, wobei eine Hoefer Transphor Übertragungseinheit (Alameda, CA) verwendet wurde (alle bei 25°C). Nitrozellulose wurde mit 5% Milchpulver in TBS 2 Stunden lang blockiert, in primärem Antikörber 4 Stunden lang und in sekundärem Antikörpter 1 Stunde lang inkubiert. Der primäre Antikörber war Weizen-Anti-Thioredoxin h II (Johnson et al., 1987b), 1 zu 500 verdünnt; der sekundäre Antikörper war Ziege anti-Kaninchen alkalische Phosphatase (Bio-Rad, Hercules, CA), 1 : 3000 verdünnt. Die Blots wurden in NBT/BCIP alkalische Phosphatase-Farbreagenz (Bio-Rad, Hercules, CA) entwickelt. Die Bilder wurden unter Verwendung eines Bio-Rad GelDoc 1000 (Hercules, CA) gescannt und unter Verwendung von Bio-Rad Multi Analyst, Version 1.0.2, analysiert.
  • B. Ergebnisse und Diskussion
  • Konstruktion von Expressionsvektoren
  • Zur Überexpression von sGFP(S65T), WTRXh und AtNTR in Weizensamen wurden fünf Expressions-Konstrukte, enthaltend wtrxh, gesteuert durch Endosperm-spezifische Hordein-Promotoren, pDhSSsGFPN3-4, pDhWTRXN-2, pdBhssWTRXhN3-8, pKBhssWTRXN-2 oder pDhAtNTR-4, hergestellt. Von fünf Konstrukten wurden vier (pDhSSsGFPN3-4, pDBhssWTRXhN3-8, pKBhssWTRXN-2 oder pDhAtNTR-4; 12) zur stabilen Transformation von Weizen verwendet.
  • Erzeugung transgener Pflanzen
  • Hochgradig regenerative Gewebe (mindestens 1 Gewebe, bevorzugt 50 und am meisten bevorzugt 500, von einer Länge von 3–4 mm) wurden beschossen und auf DBC3-Medium während der ersten 10–14 Tage in Abwesenheit einer Selektion kultiviert. Für die zweite Überführung (1. Selektionsrunde) fand die Selektion statt auf DBC3-Medium, zur hpt-Selektion ergänzt mit 25–30 mg/L Hygromycin B, oder zur nptII-Selektion ergänzt mit 30 mg/L G418. Bei der zweiten Selektionsrunde wurde DBC3-Medium mit 30 mg/L Hygromycin B oder 40 mg/L G418 verwendet. Von der vierten Überführung (3. Selektionsrunde) an wurde der Selektionsdruck auf demselben Niveau gehalten. Im allgemeinen wurden in der dritten Selektionsrunde Hygromycin-oder G418-resistente Gewebe mit einigen grünen Bereichen beobachtet. Mutmaßlich transgene Kalli mit grünen Bereichert wurden von nach der vierten oder fünften Selektionsrunde an auf demselben Medium ohne Selektionsmittel gehalten und vermehrt, bis die grünen Bereiche vollständig entwickelte regenerative Strukturen bildeten. Grüne regenerative Gewebe wurden auf Regenerationsmedium regeneriert und die Pflänzchen etwa 3 bis 4 Wochen nach Wachstum auf demselben Medium der Magenta-Behälter in Erde überführt. Unter Verwendung dieses Transformationsprotokolls erhielten wir bisher zwei unabhängige Bobwhite-Linien, vier transgene Anza-Linien, zwei transgene Yecora Rojo-Linien, transformiert mit pdBhssWTRXhN3-8, eine Bobwhite-Linie, transformiert mit pKBhssWTRXN-2 und eine Yecora Rojo-Linie, tansformiert mit pDhAtNTR-4 (Tabelle 8). Wir erhielten auch zwei unabhängige Bobwhite-Linien, transformiert mit pDhSSsGFPN3-4 (Daten nicht gezeigt).
  • Endosperm-spezifische Expression des Gersten-Hordein-Promotors in transgenem Weizen
  • Die Expression von GFP, gesteuert von dem Gersten-D-Hordein-Promotor wurde spezifisch im Endosperm-Gewebe sich entwickelnder Weizenkörner gefunden; in Geweben unreifer Embryonen wurde keine GFP-Expression beobachtet (13).
  • Analyse von T0-Pflanzen und ihrer Nachkommenschaft
  • PCR-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung von zwei Sätzen von WTRXh-Primern und einem Satz AtNTR-Primern. PCR-Amplifikation führte zu 0,4 kb intaktem wtrxh oder 0,14 kb geschnittenem wtrxh (14) und 0,5 kb internen Atntr-Fragmenten transgener Linien. Samen von T, und ihrer Nachkommenschaft einiger wtrxh-positiver Linien wurden gepflanzt, um auf homozygote Linien abzusuchen. Homozygote Linien und Null-Segreganten wurden erhalten von AZHptWTR-1, AZHptWTR-21 und YRHptWTR-1 (Tabelle 8). Andere Linien werden zur Zeit auf homozygote Linien abgesucht.
  • Charakterisierung von in transgenem Korn erzeugtem Weizen-Thioredoxin h
  • Von den stabil transformierten Linien, die Weizen-Thioredoxin h exprimierten, wurde gefunden, dass seine Menge im Durchschnitt in Transformanten höher war. Western-Blot-Analyse löslicher Protein-Fraktionen heterozygoter Gemische von Samen von dreien dieser Linien, AZHptWTR-1, AZHptWTR-21 und YRHptWTR-1, zeigte näherungsweise fünfmal, zwanzigmal bzw. dreißigmal mehr Thioredxoin h als nicht-transformiertes Kontrollkorn (15A). Der Thioredoxin-Gehalt der Null-Segreganten (YRHptWTR-1-2-1 bis -3) war ähnlich demjenigen der entsprechenden, nicht transformierten Kontrolle (15A und B).
  • Tabelle B. Zusammenfassung der Transformations-Experimente für drei Weizen-Kulturvarietäten: Bobwhite, Anza und Yecora Rojo
    Figure 00830001
  • Beispiel 3
  • Auswirkung der Thioredoxin-Reduktion auf den Verdau von Weizen-Gluteninen durch Trypsin und Pancreatin
  • Sequentielle Extraktion von Korn-Proteinen aus transgenen Weizenkörnern
  • Transgenes Korn (YRFIptWTR-1-1) und null-segregantes (YRHptWTR-1-2) Korn wurden mit einer Kaffeemühle bei Raumtemperatur gemahlen. Gemahlenes Pulver von 10 g jeder Linie wurde in ein 250 ml Schraubdeckel-Zentrifugenglas gegeben, und 60 ml jeder unten angegebenen Extraktions-Lösung wurde zugegeben. Dass Gemisch wurde mechanisch geschüttelt und dann 30 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Die Überstand-Fraktion wurde dekantiert und zur Analyse aufbewahrt, und der Rückstand wurde mit der nächsten Lösung gemischt. Das pulverförmige Korn wurde nacheinander mit den folgenden Lösungsmitteln für die angegebenen Zeiten extrahiert: [1] 2 × 0,5 M NaCl (30 min.); [2] 2 × 70% Ethanol (2 h); [3] 2 × 0,1 M Essigsäure (2 h). Die Überstand-Fraktionen aller Extrakte wurden mittels des Coomassie-Farbstoff-Bindungsverfahrens auf Protein hin analysiert (Bradford, 1976) und dann bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. Gewohnheitsmäßig werden Fraktionen bezeichnet: [1] Albumin/Globulin (Wasser/Salz-Wasser): [2] Gliadin (Ethanol); und [3] Glutenin (Essigsäure) (Krüger et al., 1988, Shewry et al., 1986). Diese Fraktionen wurden zum Verdau und für die Haut-Tests im Beispiel 5 unten verwendet.
  • Verdau von Gluteninen
  • Zur Reduktion von Gluteninen, die wie oben aus nicht-transgenen Treibhaus-Pflanzen extrahiert worden waren, wurden 4,2 μg NTR, 2,4 μg Thioredoxin (beide von E. coli) und 1 mM NADPH zu 240 μg Zielprotein zugegeben und 45 Minuten lang in einem Wasserbad von 37° C inkubiert. Mit NTS (NTR/Thioredoxin/NADPH) behandelte und unbehandelte Glutenine wurden in 100 μl simulierter Darmflüssigkeit (SIF; simulated intestinal fluid) (Board of Trustees (ed). 1995, Simulated Gastric Fluid, TS., S. 2053, The United States Pharmacopeia, 23, The National Formulary 18, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD) inkubiert wie unten beschrieben. SIF enthielt 5 μg Trypsin (oder 20 μg Pancreatin), 48,9 mM einbasisches Kaliumphosphat und 38 mM Natriumhydroxid. Nach Zugabe des Enzyms wurde der pH mit 0,2 M Natriumhydroxid auf 7,5 gebracht. Die Verdaue wurden 0,20, 60, oder 80 Minuten lang in einem Wasserbad von 37°C inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion wurden 100 mM PMSF und Leupeptin (1 μg/ml) bei Trypsin-Verdauen und 1 N HCl bei Pancreatin-Verdauen zugegeben. SDS-PAGE-Analyse der verdauten Proben wurde in 8–16%igen Gradientengelen durchgeführt wie von Laemmli (1970) beschrieben. Gele von 1,5 mm Dicke wurden 16 Stunden lang bei einem konstanten Strom von 7 mA entwickelt. SDS-Gele wurden mit Coomassie Brilliantblau R-250 in 10%iger Essigsäure 30 Minuten lang gefärbt und mit Hilfe eines Mikrowellenofens in 10%iger Essigsäure 30 Minuten lang entfärbt. Gele mit gefärbtem Protein wurden mittels Gel Doc 1000 festgehalten. Die quantitative Bestimmung von Protein (optische Dichte × mm × mm) auf den Gelen wurde mit einem Software-Programm zur Bildanalyse-Multi-Analyst, Version 1.0 (Bio-Rad) – durchgeführt. Der relative Verdau wurde als der Prozentsatz an unverdautem Protein zur Null-Zeit ausgedrückt.
  • Die in den 16 und 17 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen, dass Thioredoxin-Reduktion zu erhöhter Empfindlichkeit von Gluteninen für Protease-Verdau durch Trypsin bzw. Pancreatin führt. Die ausgeprägtesten Wirkungen wurden mit Trypsin beobachtet, wo 60 Minuten nach Verdau in der NTS-behandelten Probe etwa 55% Protein verblieben im Vergleich zu etwa 90 –95% verbliebenem Ausgangs-Protein in der nicht-NTS-behandelten Probe. Bei den Trypsin-Verdauen schritt die Proteolyse 60 Minuten lang voran und bildete offensichtlich ein Plateau. Bei den Pancreatin-Verdauen schritt die Proteolyse weniger rasch voran. 80 Minuten nach der Pancreatin-Behandlung verblieben etwa 60% des Ausgangs-Proteins in der NTS-behandelten Probe im Vergleich zu 95% verbleibendem Protein in der nicht-NTS-Probe. So sind die transgenen Körner der vorliegenden Erfindung empfindlicher für Verdau und sind hyperverdaubar. Der Anstieg der Verdaubarkeit beträgt mindestens 5% bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den nicht-transgenen Körnern.
  • Beispiel 4
  • Auswirkung der NTR auf die Reduktion von Proteinen in Extrakten von Thioredoxin h überexprimierenden Weizenkörnern
  • In vitro Reduktion von Proteinen durch NADPH oder NTR oder NADPH und NTR
  • Teilmengen der Albumin/Globulin-Fraktion der Thioredoxin h überexprimierenden homozygoten Linien, wie sie in Beispiel 2 beschrieben sind, und der null-segreganten Linien wurden verwendet. Die Reaktion wurde in 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, ausgeführt. Wie angegeben waren die Behandlungen: (i) Kontrolle, (ii) 1,25 mM NADPH, (iii) 3,0 μg Arabidopsis NTR, (iv) NADPH und NTR vereinigt, und (v) 5 mM Dithiothreitol (DTT). Die obigen Reagenzien wurden zu 70 Mikroliter dieses Puffers, der 60 μg Protein enthielt, zugegeben. Die Gesamtreduktion durch Dithiotreitol (DTT) wurde durch 5 Minuten langes Kochen erreicht. Nacht Inkubation bei 37°C für 60 Minuten wurden 100 nMol mBBr zugegeben und die Reaktion wurde für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur fortgeführt. Um die Reaktion zu beenden und überschüssiges mBBr zu derivatisieren wurden 10 μl 100 mM MET zugegeben. Die reduzierten Proben wurden nach Zugabe von 25 μl 4 × Laemmli Probenpuffer mittels mBBr/SDS-PAGE analysiert wie beschrieben (Kobrehel, K. et al. 1992).
  • Die in 18 gezeigten Ergebnisse geben an, dass die Albumin/Globulin-Proteine in den homozygoten Transgenen, die Thioredoxin h überexprimieren, effizienter reduziert werden als die Albumin/Globulin-Fraktion von Korn ihrer null-segreganten Gegenstücke.
  • Beispiel 5
  • Auswirkung von überexprimiertem Thioredoxin h auf die allergene Wirkung von Proteinen von Weizenkorn
  • Das folgende Protokoll wurde von den zuständigen Komitees sowohl an der University of California-Davis (Animal Use and Care Administrative Advisory Committee, geltend 01/21/99-01/21/00) als auch der University of California-Berkeley (Animal Care and Use Committee, geltend 05/1/99-04/30/00) genehmigt.
  • Hunde von der UC-Cavis sensibilisierten Hunde-Kolonie (Ermel et al. 1997), die gegen handelsüblichen Vollweizenkorn-Extrakt sensibilisiert waren (Bayer) wurden als stark reagierende aus zwei Gruppen ausgewählt: 1) 2 Jahre alt, bezeichnet als "junge Hunde", und 2) 7 Jahre alt, "alte Hunde". Vor Beginn der Hauttests erhielt jedes Tier eine intravenöse Injektion von 5 ml steriler Kochsalz-Lösung, die 0,5% Evans Blue (0,2 ml/kg) enthielt. Nach fünf Minuten wurden die Haut-Tests durchgeführt durch 100 μl intradermale Injektionen von log-Verdünnungen jeder Weizen-Protein-Fraktion in PBS-Puffer an der ventralen Abdomenhaut. Die Menge an injiziertem Protein lag im Bereich von 33 pg bis 10 μg. Die getesteten Fraktionen waren: 1) Salzwasser-löslich (Albumine und Globuline); 2) Ethanol-löslich (Gliadine); Essigsäure-löslich (Glutenine). Nach 20 Minuten wurde die Länge und Breite der Quaddelbereiche von einem Blindstudien-Leser gemessen. Die Gesamtfläche wurde als eine Ellipse berechnet (π/4 × L × W). Die allergene Wirkung des Proteins der nullsegreganten (Kontrolle) und der homozygoten Weizen-Linien wurde erhalten durch Vergleich der von den verschiedenen Verdünnungen jedes Extrakts insgesamt erzeugten Quaddelfläche.
  • Die Reaktionen der Tiere sind in 19 gezeigt und geben an, dass die von dem transgenen Weizen erhaltenen Proteine weniger allergen sind als das von dem Null-Segreganten erhaltene Protein. Für jede getestete Fraktion reagierten sowohl junge als auch alte Tiere weniger auf Proteine von transgenem Weizen. Die allergene Wirkung bei den Transgenen wurde im Vergleich zu den nicht-transgenen Kontrollen um mindestens 5% verringert. Die allergene Wirkung bei den jungen Hunden war im stärkeren Maß verringert, wobei sie im Bereich von 20 bis 32% Verringerung lag. Im Gegensatz dazu war die allergene Wirkung bei älteren Tieren um 8 bis 23% verringert.
  • Zur Darlegung der hypoallergenen Wirkung von aus dem transgenen Weizenkorn hergestelltem Malz wird Malz aus den transgenen Samen gemäß in der Technik bekannten Standardprotokollen erzeugt. Extrakte des Malzes werden nach dem obigen Verfahren erzeugt. Jungen und alten sensibilisierten Hunden, wie oben beschrieben, werden intravenös etwa 5 ml sterile Kochsalzlösung, die 0,5% Evans Blue (0,2 ml/kg) enthält, injiziert. Nach etwa 5 Minuten werden die Haut-Tests durch 100 μl intradermale Injektionen von log-Verdünnungen jeder Malz-Protein-Fraktion in PBS-Puffer an der ventralen Abdominalhaut durchgeführt. Die Menge an injiziertem Protein ist etwa 33 pg bis 10 μg. Die Fraktionen sind wie oben beschrieben. Nach etwa 20 Minuten wird die Länge und Breite der Quaddelflächen von einem Blindstudien-Leser gemessen, und die Gesamtfläche wird als eine Ellipse berechnet. Die allergene Wirkung von Malzprotein von Malz, der aus einer null-segreganten (Kontrolle) erzeugt wurde, und Malz von homozygoten Weizen-Linien wird durch Vergleich der Gesamt-Quaddelfläche wie oben beschrieben erhalten. Die allergene Wirkung bei den jungen Hunden wird erheblicher verringert und liegt im Bereich von etwa 20 bis 30% Verringerung. Die allergene Wirkung bei den älteren Tieren wird um etwa 5 bis 20% verringert.
  • Dementsprechend ist ein Nahrungsmittel-Produkt wie Bier, das aus dem hypoallergenen Malz hergestellt ist, ebenfalls hypoallergen.
  • Beispiel 6
  • Transgenes Sorghum, das Gersten-Thioredoxin h exprimiert
  • A. Samen-Verdaubarkeit
  • Samen von zehn Haupt-Kulturvarietäten von Sorghum vulgare werden unter Verwendung simulierter Magensäfte (Pepsin) und Darmsäfte (Pancreatin) auf eine Thioredoxin abhängige Erhöhung der Verdaubarkeit von Bestandteils-Proteinen abgesucht. Die Kulturvarietäten sind repräsentativ für die in den Vereinigten Staaten, Australien und verschiedenen Teilen von Afrika angebauten.
  • Albumin-, Globulin-, Kafirin- und Glutelin-Protein-Fraktionen werden gemäß ihren verschiedenen Löslichkeiten isoliert. Samen, 3 g, wird in einer Kaffeemühle gemahlen, nacheinander mit 30 ml von: [1] 0,5 M NaCl, [2] 60% (v/v) 2-Propanol, und [3] 0,1 M Natriumborat-Puffer, pH 10, auf einer Schüttelvorrichtung bei 25°C für 30 Minuten, 4 Stunden, bzw. 4 Stunden extrahiert. Die extrahierten Fraktionen entsprechen jeweils [1] Albumin plus Globulin, [2] Kafirin, und [3] Glutelin. Kafirine insgesamt oder vernetzte Kafirine werden mit 60% 2-Propanol plus 1% 2-Mercaptoethanol extrahiert (Shull et al., 1992). Jede Suspension wird durch Zentrifugieren bei 10000 g für 20 Minuten bei 4°C geklärt; es werden drei aufeinanderfolgende Extraktionen mit der Salzlösung durchgeführt, gefolgt von zwei Wäschen mit Wasser. Die verbleibenden Extraktionen werden zweimal wiederholt. Die sich ergebenden Überstand-Lösungen werden zusammengegeben, und die Verdaubarkeit jeder Fraktion wird am selben Tag wie dem der Isolierung getestet.
  • Teilmengen einzelner Sorghum-Protein-Fraktionen werden vor dem Verdau entweder mit dem NADP/Thioredoxin- oder dem NADP-Glutathion-System reduziert, und die Ergebnisse werden mit unbehandelten Kontrollzubereitungen verglichen. Alternativ kann das gesamte mit Natriummyristat, einem nicht-reduzierenden Detergens, das Weizen-Gliadine und -Glutenine in einer biochemisch aktiven Form solubilisiert (Kobrehel and Buchuk, 1978), extrahierte Protein auf Verdaubarkeit getestet werden. Die Reduktion der Disulfid-Bindungen von Proteinen wird unter Verwendung von mBBr/SDS-PAGE wie früher beschrieben (del Val et al., 1999) in einem Volumen von 100 μl durchgeführt mit entweder: (i) dem NADP/Thioredoxin-System, bestehend aus 5 μl 25 mM NADPH, 8 μl 0,3 mg/ml E. coli-Thioredoxin und 7 μl 0,3 mg/ml E. coli-NTR; oder (ü) dem NADP/Glutathion-System, zusammengesetzt aus 5 μl 25 mM NADPH, 10 μl 30 mM Glutathion und 15 μl 0,1 mg/ml Glutathion-Reduktase. Die Reaktionen werden in einer 30 mM physiologischen, gepufferten Kochsalzlösung (PBS), die 50 μg jedes Proteins enthält, durchgeführt. Die Reaktionsgemische werden bei 4°C über Nacht oder bei 37°C und 55°C für 15 Minuten (Kobrehel et al., 1992; del Val et al., 1999) inkubiert. Die Temperatur, von der man findet, dass sie am besten funktioniert, wird für nachfolgende Experimente verwendet. Zur vollständigen Reduktion werden die Proben in PBS mit 5 μl 100 mM DTT inkubiert und 5 Minuten gekocht. Die Proteinfraktionen (Albumin/Globulin, Kafirin, Glutelin: 240 μg Protein), entweder unbehandelt oder mit NADP/Thiredoxin oder NADP/Glutathion reduziert, werden dem simulierten Verdau durch Pepsin (Magensimulation) oder durch Trypsin/Chymotrypsin/ Carboxypeptidase (Pankreatin: Darmsimulation) unterzogen.
  • Pepsin-Test
  • Jede Fraktion, 500 μg Protein, wird zu 100 μl simulierter Magenflüssigkeit [0,32% Pepsin (w/v) und 30 mM NaCl, mit HCl auf pH 1,2 eingestellt] zugegeben (Astwood et al., 1996). Das Reaktionsgemisch wird für bis zu 60 Minuten bei 37° C inkubiert und mit dern 0,375-fachen Volumen an 160 mM Na2CO3, um einen neutralen pH zu ergeben, beendet. Das Proteingemisch wird der SDS-PAGE unterzogen und hinsichtlich Protein mit Coomassie-Blau gefärbt wie unten beschrieben.
  • Pankretain-Test
  • Jede Fraktion, 500 μg Protein, wird zu μl simulierter Darmflüssigkeit (1% Schweine-Pankreatin (w/v), 48,9 mM einbasisches Kaliumphosphat und 38 mM NaOH, mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt) zugegeben (siehe United States Pharmacopeai, 1995). Das Reaktionsgemisch wird für bis zu60 Minuten bei 37° C inkubiert und mit 1/10 Volumen an 100 mM Phenylmethyl-sulfonyl-fluorid (PMSF) plus 1 μg/ml Leupeptin beendet. Das Proteingemisch wird der SDS-PAGE unterzogen und mit Coomassie-Blau wie unten beschrieben gefärbt.
  • Zwei beträchtlich gewachsene Kulturvarietäten, die die am meisten verbesserte Empfindlichkeit für proteolytischen Verdau und Stärke-Verdau nach Reduktion durch das Thioredoxin-System zeigten, werden für die Transformationsarbeit verwendet.
  • B. Isolierung und Verdaubarkeit von Stärke
  • Stärkekörnchen-Isolierung
  • Stärkekörnchen aus trockenem, reifem Sorghumkorn werden extrahiert wie beschrieben (Sun and Henson 1990). Sorghumkorn wird mit destilliertem Wasser gewaschen un 48 Stunden lang in 20 mM Na-acetat-Puffer, pH 6,5, der 0,02% Na-azid enthält, eingeweicht. Die erweichten Körner werden zuerst mit einem Mörser und Pistill und dann 6 Minuten lang mit einem VirTis-Homogenisator bei 80% Maximalgeschwindigkeit gemahlen, und das Mahlgut wird durch zwei Siebe (250 und 75 μm) passiert. Rohstärke, die durch beide Siebe hindurchgeht, wird durch Zentrifugieren (60 g für 2,5 Minuten) durch eine Schicht von 65% (w/v) Sucrose gereingt. Pelletisierte Stärkekörnchen werden unter denselben Bedingungen und in 20 mM Natriumacetat-Puffer, pH 6,5, der 0,02% Natriumazid enthält, erneut suspendiert, ein - oder zweimal erneut zentrifugiert.
  • Stärke-Verdau
  • Stärke-Verdaubarkeit wird gemessen auf der Basis von enzymatischer Hydrolyse unter Verwendung von alpha-Amylase aus Schweinepankreas (Typ VI-B, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Inkubationsgemische, enthaltend 2% (w/v) Stärke 0,5% (w/v) BSA, 0,02% (w/v) Azid, 25 mM NaCl, 5 mM CaCl2 und 10 Einheiten alpha-Amylase in 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,9, werden bei 37° inkubiert. Teilmengen (50–100 μl) des Reaktionsgemisches werden periodisch entfernt zur Bestimmung von Glucose und reduzierenden Zuckern insgesamt, die von den Stärkekörnchen freigesetzt werden. Die Konzentration reduzierender Zucker wird durch das Dinitrosalicylsäure-Verfahren (Bernfeld 1955) und der Gesamtstärkegehalt durch das enzymatische Verfahren von McClear et al. (1994) gemessen.
  • Reduktion von Protein an Stärkekörnchen
  • Teilmengen der isolierten 2%igen (w/v) Stärke werden mit dem NTS-System inkubiert, um die Proteine an der Oberfläche des Körnchens zu reduzieren, wie oben beschrieben (Beispiele 3 und 4). Nach der Reduktion werden die Stärkekörnchen auf Verdaubarkeit durch alpha-Amylase (McCleary et al. 1994) und simulierte Darmflüssigkeit (Board of Trustees 1995) getestet.
  • C. Erzeugung stabil transformierter Sorghum-Linien und T1-Pflanzen, die Gersten-trxh enthalten
  • Unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek von Scutellum-Geweben von Gerste (erstellt von R. Schuurink, UCB) wurde ein Gen für Thioredoxin h in voller Länge (trxh; 20) isoliert und charakterisiert (Calliau, del Val, Cho, Lemeaux, Buchanan, unveröffentlicht). Der cDNA-Klon in seiner Gesamtlänge wurde in Expressionsrektoren gebracht mit den Hordein-Promotoren plus der Zielführungs-Sequenz, wie beschrieben (Cho et al., unveröffentlicht), wird zur Sorghum-Transformation verwendet. Dieser Vektor, pdBhssBTRXN-2, enthält den 0,43 kb B1-Hordein-Promotor plus seine Signalsequenz, Gersten-trxh (btrxh) und nos.
  • Sorghum wird durch die Verfahren von Cho et a. (1998b, 1999b, 1999c, 1999d, 2000) transformiert, um hochgradig regenerative grüne Gewebe entstehen zu lassen. Diese Gewebe enthalten mehrere hellgrüne Schößlings-Meristemartige Strukturen, die als solche in Gerste charakterisiert wurden, weil sie ein Gen im Zusammenhang mit der Aufrechterhaltung des Meristemzustandes des Schößlings, ein knotted I-Homologes, exprimierten (Zhang et al., 1998). Zielgewebe wie diese hochgradig regenerativen Gewebe mit einem hohen Prozentsatz omnipotenter Zellen, die zu anhaltender Zellteilung in der Lage sind und für eine Regeneration über einen langen Zeitraum kompetent sind, stellen ein qualitativ hochwertiges Zielgewebe für die Transformation dar. Sie können mit minimalem Verlust an Regenerierbarkeit für mehr als ein Jahr gehalten werden (Cho et al., 1998b, 1999b, 1999c, 1999d, 2000; Kim et al., 1999; Ha et al., 2000). Außerdem zeigte das Ergebnis genomischer DNA-Methylierungs-Analysen (Zhang et al. 1999b), dass Gerstenpflanzen, die aus diesen hochgradig regenerativen Geweben regeneriert wurden, weniger veränderlich hinsichtlich Methylierungsmuster-Polymorphismus und agronomischer Eigenschaften waren als diejenigen, die aus im embryogenen Zustand gehaltenem Kallus regeneriert wurden.
  • Für die anderen Getreide und Gräser entwickelte Medien werden zur Optimierung des Ansprechens der Sorghum-Varietät TX430 verwendet, um mit Sorghum grüne regenerative Gewebe hoher Qualität ähnlich denjenigen, die bei anderen Getreiden und Gräsern beobachtet werden, zu erzeugen. Derartige Gewebe wurden bei allen getesteten Varietäten erfolgreich zur stabilen Transformation verwendet. In Kürze, dieses Verfahren, die Entwicklung grüner, regenerativer Gewebe, beinhaltet die Initiierung embryogener Kulturen aus unreifen Embryonen der Kulturvarietät TX430. Das Medium, das die Gewebe höchster Qualität ergibt, ist DBC2 und DBC3 (Cho et al., 1998a–c, 1999d). Von derartigen Medien, die Kupfer, Maltose und Cytokinine enthalten, wurde gefunden, dass sie die Qualität und Langzeit-Regenerierbarkeit von Geweben anderer Getreide und Gräser verbessern. Auf diesem Medium entwickeltes Gewebe wird als Transformationsziele unter Verwendung von Beschuß verwendet.
  • Das (die) gewünschte(n), Gersten-trxh enthaltende(n) DNA-Konstrukte) wird (werden) durch Beschuß in Zielzellen eingeführt. Die Selektion zur Identifizierung von Transformanten findet statt über Bialaphos, Kanamycin oder andere geeignete Selektionsnittel gemäß veröffentlichten Verfahren (Cho et al., 1998a–c; Lemaux et al. 1999). Ein kleiner Teil mutmaßlich transformierter Kalli wird durch PCR (Cho et al. 1998a–c) hinsichtlich Gersten-trxh analysiert und transformiertes Gewebe wird zur Regenerierung von Pflanzen behandelt (Cho et al., 1998a–c). Blattgewebe wird, wenn möglich, auf Resistenz gegen das Selektionsmittel getestet und passendenfalls durch PCR hinsichtlich Transgen(en) analysiert. Die Pflanzen werden bis zur Reife wachsen lassen, um T1-Samen und homozygote T2-Pflanzen zu erhalten.
  • D. Bestimmung von Mengen und Aktivität von TRXh in stabil transformiertem Sorghum
  • Die Aktivität des Gersten-Thioredoxin h aus den verschiedenen Erzeugungs-Systemen (mit Zielführung gegenüber ohne Zielführung, d. h. mit bzw. ohne die Signalsequenz) und mit verschiedenen Fraktionierungsverfahren erhalten, wie oben beschrieben, wird unter Verwendung des DTNB [2', 5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure)]-Verfahrens (Florencio et al., 1988) untersucht wie beschrieben (Cho et al., 1999e). Die NTR- und Thioredoxin-Kontrollen werden aus Weizenkörnern hergestellt wie beschrieben von Johnson et al. (1987a, b).
  • Western-Blot-Analyse
  • Western-Blots werden an Extrakten ausgewählter transgener Linien sowie an Kontrollsamen durchgeführt. Gruppen von 10 bis 20 unversehrten Samen werden durch SDS-PAGE- und Western-Blot-Verfahren hinsichtlich Gehalt an TRXh und NTR behandelt und analysiert (Cho et al., 1999e).
  • Herstellung von Samen-Extrakt, Wärmebehandlung und Säulenchromatografie
  • Extrakte werden hergestellt, wärmebehandelt und durch Säulenchromatografie fraktioniert wie beschrieben von Cho et al. (1999e).
  • Messung der Thioredoxin h-Aktivität
  • Thioredoxin h wird mittels des Chloroplasten-NADP-malat-dehydrogenase-Verfahrens, wie es für Gerste angepaßt wurde (Cho et al., 1999), untersucht.
  • Protein-Bestimmung
  • Protein wird gemäß Bradford (1976) unter Verwendung des Coomassie-Blau-Verfahrens mit Gamma-Globulin als Standard bestimmt oder gemessen. Der Protein-Gehalt wird durch Messung von Gesamtstickstoff in einem automatisierten Gasanalysator oder mittels Standard-Mikro-Kjeldahl-Verfahren bestätigt.
  • E. Messungen von Veränderungen der Häufigkeit und des Redox-Zustands von Endosperm-Proteinen
  • Gersten-Thioredoxin h überexprimierende, transgene Sorghum-Samen sind die Ausgangsmaterialien, die verwendet wurden, um zu zeigen, dass erhöhte Mengen dieses Proteins eine geänderte Verdaubarkeit verursachen. Vorbereitende mBBr-Messungen werden ebenfalls mit dem gentechnisch erzeugten Korn durchgeführt. Veränderungen des Redox-Zustands von Endosperm-Protein werden unter Verwendung des mBBr/SDS-PAGE-Verfahrens bestimmt (Krobehel et al., 1992). Da die Sorghum eigenen Haupt-Speicherpro teine bekanntermaßen unlösliche sind, werden bei dem Korn Propanol- sowie die verschiedenen wässerigen Endosperm-Extrakte überwacht. Die Bodensätze werden sequentiell hinsichtlich der verschiedenen Protein-Fraktionen extrahiert wie oben beschrieben (A. Samen-Verdaubarkeit). Die Überstand-Fraktionen jedes Extrakts werden hinsichtlich Protein und Fluoreszenz mittels der mBBr/SDS-PAGE-Technik analysiert.
  • Trockenes Korn, 1 g, von tansgenen und null-segreganten Linien wird mit einem Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff gemahlen. Wenn der flüssige Stickstoff verdampft, werden 3 bis 6 ml 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, der 1 mM EDTA und 1 mM mBBr enthält, zugegeben und eine Minute lang gemischt. Nach dem Auftauen wird der Extrakt 15 Minuten lang inkubiert, zentrifugiert (10 Minuten bei 12000 g), sequentiell mit Salz-, Propanol- und Borat-Lösungen extrahiert wie oben beschrieben (A. Samen-Verdaubarkeit). 60 μg Protein-Proben werden auf ein 10–20% SDS-Polyacrylamid-Gradientengel geladen, wie oben beschrieben. Nach der Elektrophorese (1 h, konstanter Strom von 30 mA) werden die Gele 2 h lang in 12%iger (w/v) Trichloressigsäure eingeweicht und 12 h lang in eine 40% Methanol und 10% Essigsäure enthaltende Lösung überführt, um überschüssiges mBBr zu entfernen. Die Gele werden hinsichtlich Fluoreszenz mit einer UV-Lichtquelle (365 nm) gescannt und hinsichtlich Protein mit Coomassie Blau gefärbt.
  • F. Messungen der Verändeung der Verdaubarkeit und Löslichkeit von Endosperm-Proteinen in heterozygotem T1- und homozygotem T2-Sorghumkorn
  • Parallel zu den in vitro Experimenten (Ori et al., 1995) wird das Ausmaß, in dem Thioredoxin-vermittelte Reduktion in vivo zur Verdaubarkeit und Löslichkeit von Sorghum-Endosperm-Proteinen beiträgt, bestimmt. Das Ausmaß der Solubilisierung von Protein wird unter Verwendung des Verhältnisses des löslichen zum unlöslichen Protein in den Transgenen relativ zu einem Null-Segreganten gemessen. Extrakte werden parallel ohne mBBr-Markierung hergestellt und hinsichtlich Empfindlichkeit für Verdau durch simulierte Magen- und Darm-Flüssigkeiten getestet wie oben beschrieben (Beispiel 3). Die Proteine aus den verschiedenen transgenen Körnern werden auch mit Thioredoxin und Glutathion reduziert wie oben beschrieben (A. Samen-Verdaubarkeit).
  • G. Messungen der Veränderung der Verdaubarkeit von Stärke in heterozygotem T1- und homazygotem T2-Sorghumkorn
  • Wie in dem Fall der Kafirin-Speicherproteine wird die Fähigkeit des überexprimierten Thioredoxin h, die Verdaubarkeit von Stärke mit alpha-Amylase zu erhöhen, bestimmt. Die Stärke wird sowohl aus transgenen und null-segreganten Linien isoliert und ihre Verdaubarkeit in vitro mit alpha-Amylase getestet wie oben beschrieben (B. Isolierung Verdaubarkeit von Stärke). Wegen ihres Zusammenhangs mit Stärkekörnchen wird eine Erhöhung der Verdaubarkeit der Kafirin-Proteine von einer Erhöhung der Verdaubarkeit der Stärke begleitet.
  • H. In Sorghum überexprimiertes Thioredoxin h zur Verbesserung der Verdaubarkeit von Kornprotein
  • Die oben angegebene Verdaubarkeit der verschiedenen Protein-Fraktionen (Albumin/Globulin, Kafirin, Glutelin) wird mit simulierter Magen- und Darm-Flüssigkeit getestet. Die Ergebnisse des transgenen Korns, das Gersten-TRX h überexprimiert, werden mit denen des null-segreganten verglichen, um die Verbesserung der Verdaubarkeit bei dem transgenen Korn zu veranschaulichen.
  • Beispiel 7
  • Verbesserung der Teigqualität
  • In der US-Anmeldung Nr. 08/211 673 (durch Bezugnahme ausdrücklich aufgenommen) wurde die Teigqualität durch Reduzieren der Mehl-Proteine unter Verwendung des NADP/Thioredoxin-Systems verbessert. Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, reduziertes Thioredoxin bricht spezifisch intramolekulare Schwefel-Schwefel-Bindungen, die verschiedene Teile eines Proteins vernetzen und seine Form stabilisieren, auf. Wenn diese Vernetzungen aufgebrochen werden, kann sich das Protein auffalten und vermutlich mit anderen Proteinen im Teig verbinden, wobei ein ineinandergreifendes Gitter, das ein elastisches Netzwerk bildet, geschaffen wird. Der Teig geht auf, weil das Netzwerk hilft, von Hefe während des Fermentierungsprozesses erzeugtes Kohlendioxid einzufangen. Es wurde vorgeschlagen, dass das reduzierte Thioredoxin die Gliadine und Glutenine im Mehl reduziert, wodurch es sie in einer Weise, die den Teig festigt, neu kombinieren läßt. Reduziertes Thioredoxin erleichterte ihre Protein-Netzwerkbildung während der Teigherstellung. Die Behandlung von Weizenmehl mittlerer oder schlechter Qualität (Kulturvarietät Apollo) mit E. coli-Thioredoxin, NADP-Thioredoxin-Reduktase und NADPH zeigte eine Festigung des Teigs (höhere Farinograph-Messungen) und ein verbessertes Laibvolumen und verbesserte Viscoelastizität verglichen mit unbehandeltem Mehl. Höhere Farinograph-Messungen von Teig entsprechen einer verbesserten Teigfestigkeit und verbesserten Backwaren-Eigenschaften wie besserer Krumenqualität, verbesserter Struktur und höherem Laibvolumen.
  • Weizenbrot-Backstudien und Farinogragh-Messungen
  • Die Backtests werden unter Verwendung einer computerbetriebenen PANASONIC Brot-Fertigungsvorrichtung durchgeführt, um die verbesserte Qualität von Teig, der unter Verwendung von aus den transgenen Samen der vorliegenden Erfindung erzeugtem Mehl hergestellt wurde, zu zeigen. Zusammensetzung des Brotes: Kontrolle:
    Mehl 200 g (trocken)
    Wasser: 70% Hydratation
    Salz (NaCl): 5,3 g
    Hefe 4,8 g (S.cerevisiae) (Trockenhefe-Pulver)
  • Experimentelle Bedingungen
    • – Mehl und Salz werden abgewogen und gemischt.
    • – Das Wasservolumen, das zur Erreichung einer Hydratation von 70% erforderlich war, wurde in die Brot-Fertigungsvorrichtung gegeben.
    • – Das Gemisch von Mehl und Salz wird in das Wasser gegeben, und das Backprogramm wird vom Computer gestartet. Das vollständige Programm dauert etwa 3 Stunden, 9 Minuten und 7 Sekunden.
    • – Hefe wird automatisch zugegeben, nachdem 20 Minuten und 3 Sekunden gemischt wurde.
  • Das die Panasonic-Vorrichtung betreibende Programm ist:
  • Figure 01010001
  • Nach der Herstellung des Teigs werden Farinograph-Ablesungen durchgeführt wie in der US-Anmelung Nr. 08/211 673 beschrieben. Das Brotlaib-Volumen wird am Ende des Backens gemessen, wenn die Brotlaibe Raumtemperatur erreichen.
  • Farinograph-Ablesungen von Teig, der aus Mehl, das aus erfindungsgemäßem transgenem Weizensamen gemacht wurde, hergestellt wurde, sind mindestens etwa 10–20% höher und werden etwa 40% länger gehalten als bei Teig, der aus Mehl hergestellt wurde, das aus nicht-transgenen Samen gemacht wurde. Brot, das aus Mehl hergestellt wurde, das aus erfindungsgemäßen transgenen Seimen gemacht wurde, hat ein mindestens etwa 5% und bis zu etwa 20% höheres Volumen im Vergleich zu Brot, das aus Mehl herge stellt wurde, das aus nicht-transgenen Samen gemacht wurde. Brotartige Produkte, die aus transgenem Mehl von Getreiden, die normalerweise ein nicht-glutenhaltiges Mehl erzeugen, beispielsweise Reis, gemacht wurden, halten besser zusammen und halten Gas besser fest als Produkte, die aus dem Mehl ihrer nicht-transgenen Gegenstücke gemacht wurden. Sie zeigen auch eine mindestens 3%ige Erhöhung des Laibvolumens, wenn sie mit ihren nicht- transgenen Gegenstücken verglichen werden.
  • Beispiel 8
  • Auswirkung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase auf die Reduktion von Proteinen in Extrakten aus homozygotem gegenüber null-segregantem Weizenkorn, das Thioredoxin h überexprimiert
  • Die Proben waren von den Salz-löslichen Fraktionen (Albumin und Globulin) des Weizen-Thioredoxin h überexprimierenden, transgenen und null-segreganten Weizenkorns. Die Reaktionen wurden in einem 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, bei einem Endvolumen von 100 μl ausgeführt. Das vollständige Reaktionsgemisch enthielt 10 μmol Glucose-6-phosphat, 0,25 μmol NADP, 2 Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (Bäckerhefe, Typ XV,Sigma, St. Louis, MO), plus oder minus 1,5 μg NTR (Arabidopsis) und 80 μg Protein. Andere Behandlungen, wie Weglassen einer Komponente oder zweier Komponenten des NADPH-erzeugenden Systems, waren wie angegeben. Die negative Kontrolle war das extrahierte Protein alleine. Als eine positive Kontrolle wurde NADPH anstelle von NADP/Glucose-6-phosphat/Glucose-6-phosphat-dehygronase verwendet.
  • Nach 60-minütiger Inkubation bei 37°C wurden zu dem Reaktionsgemisch 100 nmol mBBr zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten lang fortgeführt. 10 μl 100 mM 2-Mercaptoethanol wurden zugegeben, um die Reaktion beenden und überschüssiges mBBr zu derivatisieren. Eine geeignete Menge an 4 x Laemmeli-Probenpuffer wurde zugegeben, und die Proben wurden in Anwesenheit von SDS auf 10–20%-iges Polyacrylamidgel aufgebracht. Die Elektrophorese wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur bei 7 mA/Gel durchgeführt. Die Fluoreszenz von Sulfhydryl enthaltenden Proteinen auf den Gelen wurde mittels Gel Doc 1000 (Bio-Rad) festgehalten, Protein wurde durch 0,025% Coomassie Brilliantblau G-250 in 10%iger Essigsäure gefärbt.
  • Zum Sichtbarmachen der Auswirkung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (23): In Anwesenheit von NTR, Vergleich der Spuren 2 gegenüber 4 (-NADP) und der Spuren 5 gegenüber 7 (+NADP) (+NTR-Gel an der linken Seite); in Abwesenheit von NTR, vergleiche Spuren 1 gegenüber 3 (-NADP) und Spuren 2 gegenüber 4 (+ NADP) (-NTR-Gel an der rechten Seite). Die maximale Erhöhung der durch Glucose-6-phosphat-dehydrogenase bewirkten Reduktion wurde in Anwesenheit von NTR, ohne NADP beobachtet (Spur 2 gegenüber Spur 4, Gel an der linken Seite ). Man beachte auch die größere Reduktion von NTR in Spur 4 gegenüber Spur 2.
  • Bei dem Null-Segreganten (24) beachte man die größere Reduktion von NTR in Anwesenheit von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (Spur 4 gegenüber Spur 2), aber ein geringeres Ausmaß an Reduktion der kleineren Zielproteine (Spur 4) verglichen mit der entsprechenden Behandlung (Spur 4) mit dem transgenen Extrakt (23).
  • Diese Erfindung wurde sowohl durch Beispiele als auch durch Beschreibung erläutert. Es sollte offensichtlich sein, dass ein Durchschnittsfachmann auf dem entsprechenden Gebiet in der Lage wäre, Äquivalente zu der Erfindung, wie sie in den folgenden Ansprüchen beschrieben ist, die aber im Sinne der voranstehenden Beschreibung und Beispiele wären, zu überlegen. Man sollte sich im klaren sein, dass jene Äquivalente und verschiedene Abwandlungen, wie sie für Fachleute auf dem Gebiet, das die Erfindung betrifft, offensichtlich sein mögen, ebenfalls in den Umfang der Erfindung, wie sie durch die angefügten Ansprüche definiert ist, fallen. Alle hierin zitierten Patente, Patentanmeldungen, Veröffentlichungen, Verweisstellen und darin zitierten Verweisstellen werden hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
  • LITERATUR
  • Alle Verweisstellen, Patente, Patentanmeldungen, Veröffentlichungen und darin zitierte Veröfentlichungen werden hierin ausdrücklich durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
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Claims (10)

  1. Transgene Monokotyledon-Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Teil der Pflanze eine rekombinierte Nucleinsäure aufweist, die einen in dem Teil aktiven Promoter, der funktionswirksam an eine ein Thioredoxin-Polypeptid codierende Nucleinsäure gebunden ist, aufweist, wobei die rekombinierte Nucleinsäure außerdem eine Nucleinsäure, die ein Signalpeptid zur Zielführung des Thioredoxins zu einer Vakuole oder einem Proteinkörper codiert, aufweist, wobei das Signalpeptid funktionswirksam an den Promotor und das ein Thioredoxin-Protein codierende Nucleinsäure-Molekül gebunden ist.
  2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Teil ein Same ist.
  3. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Teil ein Korn ist.
  4. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein samenentwicklungsspezifischer oder kornentwicklungsspezifischer Promotor ist.
  5. Transgene Pflanze nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Reis-Glutelin-, Reis-Oryzin-, Reis-Prolamin-, Gersten-Hordein-, Weizen-Gliadin-, Weizen-Glutelin-, Mais-Zein-, Mais-Glutelin-, Hafer-Glutelin-, Sorghum-Kasirin-, Hirse-Pennisetin-, Roggen-Secalin- und maiskimspezifischen Globulin-Promotoren.
  6. Transgene Pflanze nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Gersten-Hordein-Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus B1 Hordein- und D Hordein-Promotoren.
  7. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Monokotyledon-Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Reis, Gerste, Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Sorghum, Hirse, Trticale, Rasengras und Futtergras.
  8. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Thioredoxin Thioredoxin h ist.
  9. Transgene Pflanze nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Thioredoxin h ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Gersten-, Weizen- und Reis-Thioredoxin h.
  10. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Signalpeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus B1 Hordein- und D Hordein-Signalpeptiden.
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