JP2002539824A - チオレドキシンを用いて形質転換した穀粒および種子の価値付加特性 - Google Patents

チオレドキシンを用いて形質転換した穀粒および種子の価値付加特性

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Abstract

(57)【要約】 価値付加特性を有するトランスジェニック植物を作出および使用するための組成物および使用方法を本明細書に提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、1999年３月29日出願の出願番号第60/126,736号（係属中）、1999年
３月31日出願の出願番号第60/127,198号（係属中）、1999年12月６日出願の出願
番号第60/169,162号（係属中）、2000年１月21日出願の出願番号第60/177,740号
（係属中）及び2000年１月21日出願の出願番号第60/177,739号（係属中）の出願
日の利益を主張するものである。これらの出願は全て参照によりその全文を完全
に組み入れるものとする。
【０００２】政府による支援 本発明は、アメリカ合衆国農務省から認可第9803835号として政府の支援をう
けてなされたものである。従って合衆国政府は本発明に対し一定の権利を有する
。
【０００３】発明の背景 チオレドキシンは、触媒活性を有するジスルフィド基を含有する熱安定性の小
さな（約12kDa）タンパク質である。このクラスのタンパク質は、事実上全ての
生物において見出されており、無数の生化学経路に関係していると示されている
（Buchananら、1994）。チオレドキシンの活性部位は、高度に保存されたアミノ
酸配列に２つの酸化還元活性を有するシステイン残基を有し、酸化されるとこれ
らのシステインがジスルフィド架橋（-S-S-）を形成して、種々の特異的な反応
によってスルフヒドリル（-SH）レベルに還元されうる。生理学的系において、
この還元は、還元フェレドキシン、NADPHまたは他の関連するチオレドキシン還
元剤により達成されうる。還元型チオレドキシンは、最も扱い難いジスルフィド
結合でさえも還元する優れた触媒である。
【０００４】 一般的には、細菌または動物細胞においてはほんの１種のチオレドキシンが見
出されているにすぎない。対照的に、光合成生物は、３種の異なるタイプのチオ
レドキシンを有する。葉緑体は、フェレドキシン、フェレドキシン-チオレドキ
シンレダクターゼならびにチオレドキシンfおよびmからなるフェレドキシン／チ
オレドキシン系を含有し、これは光合成酵素の光調節において機能する（Buchan
an、1991；Scheibe、1991）。他のチオレドキシン酵素系は、動物および大部分
の微生物に関して確立されているものと類似しており、該系では、チオレドキシ
ン（植物ではh型）はNADPHおよびNADPH-チオレドキシンレダクターゼ（NTR）に
より還元される（Johnsonら、1987a；Florencioら、1988；Suskeら、1979）。こ
の系によるチオレドキシンhの還元は、以下の式で示すことができる： チオレドキシンは、植物における２種の酵素の成分である。葉緑体は、フェレ
ドキシン、フェレドキシン-チオレドキシンレダクターゼならびにチオレドキシ
ンfおよびmからなるフェレドキシン／チオレドキシン系を含有し、これは光合成
酵素の光調節に関与している（Buchanan、1991；Scheibe、1991）。他のチオレ
ドキシン酵素系であるNADP-チオレドキシン系、すなわちNTSは、動物および大部
分の微生物に関して確立されている系と類似しており、該系では、チオレドキシ
ン（植物ではh型）はNADPHおよびNADPH-チオレドキシンレダクターゼ（NTR）に
より還元される（Johnsonら、1987a；Florencioら、1988；Suskeら、1979）。チ
オレドキシンhは、植物組織において広く分布しており、ミトコンドリア、小胞
体（ER）およびサイトゾルに存在する（Bodenstein-Langら、1989；Marcusら、1
991）。
【０００５】 植物チオレドキシンhは、多種多様な生物学的機能に関与している。植物種子
において複数の形態のチオレドキシンhタンパク質が存在することが報告されて
いる（Bestermannら、1983）。コムギでは、３種の異なるチオレドキシンが特性
決定されている（VogtおよびFollman, 1986）。チオレドキシンhは、種々の低分
子量システインリッチタンパク質、例えばチオニン（Johnsonら、1987b）、プロ
テアーゼインヒビターおよびクロロホルム／メタノール可溶性タンパク質（CMタ
ンパク質またはαアミラーゼインヒビター）（Kobrehelら、1991）の分子内ジス
ルフィド架橋の還元に作用する。細胞質チオレドキシンは、発育過程に関与して
いると考えられる。例えば、チオレドキシンhは、発芽および実生成長過程の代
謝プロセスを増強するシグナルとして機能することが示されている（Kobrehelら
、1992；Lozanoら、1996；Besseら、1996）。チオレドキシンhはまた、クサヨシ
（Phalaris coerulescens）（Liら、1995）およびアブラナ（ブラシカ・ナパスB
rassica napus）（Bowerら、1996）における自家不和合性に関与していることが
証明されている。いくつかの機能がイネチオレドキシンhに関して仮定されてお
り、これは師管の転流に関与していると考えられている（Ishiwatariら、1995）
。
【０００６】 NTSは、ドー（dough）の品質を改善することが示されている。チオレドキシン
添加による品質の悪い小麦粉のドー強度およびパンの品質といった特性の改善（
Wongら、1993；Kobrehelら、1994）は、粉末タンパク質、具体的にはグルテニン
中の分子内ジスルフィド結合のチオレドキシン触媒性還元によって生じる新たな
分子間ジスルフィド結合の形成に起因しうるものである（BesseおよびBuchanan,
1997）。従って、外因性チオレドキシンの添加によって、ベーキング品質が強
化された粉末を生成するタンパク質ネットワークの形成が促進される。Kobrehel
ら（1994）は、チオレドキシンhをイネ、トウモロコシおよびソルガム等の非グ
ルテン性穀物の粉末に添加することによってドー様生成物の形成が促進されるこ
とを観察した。それゆえ外因性チオレドキシンの添加を利用して非グルテン性穀
物からベーキングドーを製造しうる。
【０００７】 さらに、チオレドキシンによるコムギおよびミルク中のジスルフィドタンパク
質アレルゲンの還元によってアレルゲン性が低減することが見出された（Buchan
anら、1997; del Valら、1999）。またチオレドキシン処理によって、ミルクの
主要なアレルゲン（β-ラクトグロブリン）（del Valら、1999）、ならびに他の
ジスルフィドタンパク質（Lozanoら、1994；Jiaoら、1992）の消化性が高まる。
従って、NTSの操作は、栄養補給食品および医薬品の製造に顕著な見込みを与え
る。外因性チオレドキシンを食料品に添加する利点に関して、より詳細な説明は
米国特許第5,792,506号（Buchananらに付与されている）に記載されている。
【０００８】 チオレドキシンhをコードするcDNAクローンは、例えば以下に示す数種の植物
種から単離されている；シロイヌナズナ（アラビドプシス・サリアナArabidopsi
s thaliana）（Rivera-Madridら、1993；Rivera-Madridら、1995）、タバコ（Ni
cotiana tabacum）（MartyおよびMeyer, 1991；Brugidouら、1993）、イネ（Ory
za sativa）（Ishiwatariら、1995）、アブラナ（Brassica napus）（Bowerら、
1996）、ダイズ（Glycine max）（ShiおよびBhattacharyya, 1996）ならびにコ
ムギ（Triticum aestivum）（Gautierら、1998）。より最近になって、コムギチ
オレドキシンhをコードする２つのcDNAクローンが単離され特性決定された（Gau
tierら、1998）。大腸菌NTR遺伝子は最初に単離され（RusselおよびModel, 1988
）、タンパク質の３次元構造が解析されている（Kuriyanら、1991）。他の細菌
、真菌および哺乳動物由来のいくつかのNTR遺伝子が単離され、配列決定されて
いる。Jacquotら（1994）は最近、植物のシロイヌナズナ（アラビドプシス・サ
リアナ A. thaliana）NTRをコードする２つのcDNAの単離および配列決定に成功
し、これを報告している。続いて、大腸菌細胞における組換えアラビドプシスNT
Rタンパク質の発現（Jacquotら、1994）および最初の真核生物由来のタンパク質
の構造（Daiら、1996）が報告された。
【０００９】 本明細書では、例えばオオムギ（Choら、1999b）、コムギおよびソルガムなど
の、チオレドキシン過剰発現トランスジェニック穀粒における価値付加特性を開
示する。
【００１０】発明の概要 本発明は、チオレドキシンをコードする組換え核酸ならびにチオレドキシン過
剰発現トランスジェニック植物の作出への方法を提供する。実際には、チオレド
キシンの強力な還元活性によって、植物細胞における該タンパク質の過剰発現が
該細胞に重大な有害作用を及ぼすことが予想されていた。しかしながら、本発明
者は、チオレドキシンが、植物、特に穀物の穀粒において高レベルで発現され得
、該タンパク質が発現される細胞または種子自体の生存力に影響を及ぼさないこ
とを発見した。例えば特定の実施形態において、本発明者はコムギチオレドキシ
ン遺伝子（wtrxh）をコムギに導入した。トランスジェニックコムギ植物の種子
は、非トランスジェニックコムギ植物と比較して高いチオレドキシン比活性を示
しうる。
【００１１】 すなわち、本発明は、植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニッ
ク植物の相同部分と比較してチオレドキシンタンパク質および／またはチオレド
キシン比活性のレベルが高められたトランスジェニック植物を提供する。トラン
スジェニック植物の一部分におけるチオレドキシン比活性のレベルは、その種の
非トランスジェニック植物の該部分よりも少なくとも約２倍高いものでありうる
。本発明は任意の植物種に利用しうるが、単子葉植物、例えば限定するものでは
ないが、イネ、オオムギ、コムギ、オートムギ、トウモロコシ、ライムギ、ソル
ガム（sorghum）、ミレット（millet）およびライコムギなどの穀物、ならびに
双子葉植物、限定するものではないが、ダイズ、リマビーン(lima bean)、トマ
ト、ジャガイモ、ダイズ、綿花、タバコなどに利用すると特に有益であり得る。
好ましい実施形態において、チオレドキシン比活性はトランスジェニック植物の
種子において高められている。
【００１２】 植物の所望の部分、例えば種子におけるチオレドキシン過剰発現は、チオレド
キシンのコード配列と機能しうる形で連結された種子特異的プロモーターを使用
することにより達成する。ここで「種子特異的」とは、該プロモーターが、他の
植物組織と比較して種子において活性を高めるものであることを示し、プロモー
ターが種子において単に活性を有することを必要とするものではない。しかしな
がら、チオレドキシンタンパク質の性質を考慮すると、種子以外の他の組織にお
いてはほとんどまたは全くタンパク質が発現されない場合には、種子特異的プロ
モーターを選択することが有利でありうる。特定の実施形態において、選択する
種子特異的プロモーター は、種子の成熟特異的プロモーターである。種子の成
熟過程で増大発現を付与するプロモーター（オオムギホルデインプロモーターな
ど）を使用することにより、成熟中の種子であってもチオレドキシンが高レベル
で発現されうる。
【００１３】 他の実施形態において、チオレドキシンは、根、幹、塊茎、果実、葉、花、花
粉などまたは発明実施者の裁量による植物の１以上の任意の部分において過剰発
現される。
【００１４】 本発明の一実施形態においては、P-T構造を有する組換え核酸分子を含むトラ
ンスジェニック植物が提供される。該構造において、Pは種子特異的プロモータ
ー、Tはチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子である。特定の実施
形態において、種子特異的プロモーターは、オオムギホルデイン遺伝子プロモー
ター（例えばオオムギB1-ホルデインプロモーター、オオムギD-ホルデインプロ
モーター）、またはトウモロコシ胚特異的グロブリンプロモーターである。
【００１５】 本発明の他の実施形態において、トランスジェニック植物はP-SS-T構造を有す
る組換え核酸分子を含むものである。該構造においてPは種子特異的プロモータ
ー、Tはチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子、SSは細胞内体（int
racellular body）に対しチオレドキシンポリペプチドの発現をターゲティング
するシグナルペプチドをコードする核酸分子であり、P、SSおよびTは機能しうる
形で連結されている。本明細書において提示する証拠は、シグナルペプチドの存
在が、トランスジェニック植物におけるチオレドキシン発現レベルをさらに強化
しうるということを示すものである。適切なシグナルペプチドとしては、限定す
るものではないが、オオムギB1-およびD-ホルデインシグナルペプチドが挙げら
れる。
【００１６】 本発明により提供されるチオレドキシン過剰発現トランスジェニック植物の一
部分は、直接食料品に加工するために採取されうる。例えば、種子は慣例的な手
段を用いて挽くことにより粉末を製造しうる。あるいは、種子または他の植物部
分をチオレドキシン源として使用することができ、未成熟または成熟トランスジ
ェニック植物から標準的なタンパク質抽出法によりチオレドキシンを抽出しても
よい。あるいはまた、粗処理した種子材料をチオレドキシン源として直接使用す
ることもできる。従って本発明の他の態様は、チオレドキシンタンパク質の製造
方法である。該方法には、種子におけるチオレドキシンレベルが高められたトラ
ンスジェニック植物の種子からチオレドキシンを採取することが含まれる。
【００１７】 従って、本発明の他の態様は、ヒトおよび動物が消費する改良食用品を提供す
る。該食用品は、例えば、同種の非トランスジェニック植物から作製されたドー
と比較して、消化性が高められたおよび／またはアレルゲン性が低減した、なら
びに強度および容量が高められたドーである。
【００１８】 さらに他の態様において、本発明は、同種の非トランスジェニック植物と比較
して、アレルゲン性が低減した、消化性が高められた、酸化還元状態が高められ
た（SH：SS比が高められた）トランスジェニック植物の作出方法を提供する。
【００１９】 また他の態様において、本発明は、アラビドプシスNTRをコードする核酸を含
むトランスジェニック植物を提供する。
【００２０】 本発明の上記態様および他の態様は、以下の説明および実施例でさらに説明す
る。
【００２１】発明の詳細な説明 I.定義 特に記載しない限り、技術用語は慣例的な用法に従って使用する。分子生物学
において一般的な用語の定義は、Lewin、Genes V（Oxford University Press発
行）, 1994（ISBN 0-19-854287-9）；Kendrewら（編） The Encyclopedia of Mo
lecular Biology（Blackwell Science Ltd.発行）, 1994（ISBN 0-632-02182-9
）；Robert A. Meyers（編）Molecular Biology and Biotechnology. a Compreh
ensive Desk Reference（VCH Publishers, Inc.発行）, 1995 （ISBN 1-56081-5
69-8）；Ausubelら（1987）Current Protocols in Molecular Biology, Green P
ublishing；Sambrookら（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor, New Yorkに示されている。
【００２２】 本発明の種々の実施形態の検討を容易にするために、以下に定義を提供する。
【００２３】チオレドキシンタンパク質またはチオレドキシンポリペプチド： 多数の植物、動物および微生物のチオレドキシンタンパク質またはポリペプチ
ドが特性決定されており、その多くは該タンパク質をコードする遺伝子がクロー
ニングされ、配列決定されている。本発明は、好ましくはチオレドキシンhタン
パク質の使用に関するものであるが、他のチオレドキシンタンパク質もまた本明
細書に記載のようなトランスジェニック植物を作出するために使用しうる。現在
までに報告されている植物由来のチオレドキシンhタンパク質には、シロイヌナ
ズナ（アラビドプシス・サリアナ Arabidopsis thaliana）（Rivera-Madrid ら
、1993；Rivera-Madridら、1995）、タバコ（Nicotiana tabacum）（Martyおよ
びMeyer, 1991；Brugidouら、1993）、イネ（Oryza sativa）（Ishiwatariら、1
995）、アブラナ（Brassica napus）（Bowerら、1996）、ダイズ（Glycine max
）（ShiおよびBhattacharyya, 1996）、ならびにコムギ（Triticum aestivum）
（Gautierら、1998）に由来するチオレドキシンhタンパク質がある。上記および
他のチオレドキシンhタンパク質のアミノ酸配列、ならびに上記タンパク質をコ
ードするcDNAおよび／または遺伝子のヌクレオチド配列は、科学文献および公的
にアクセス可能な配列データベースにおいて入手可能である。例えば、トウヒ（
ピケア・マリアナ、Picea mariana）由来のチオレドキシンhをコードするcDNAは
GenBankにアクセッション番号AF051206（NID g2982246）で記載されており、こ
れは、Entrez browser/ nucleotide sequence search of the National Center
for Biotechnology Information website（www. ncbi. nim. nih. gov）を用い
て検索することにより場所を特定できる。以下に記載する実施例で使用するコム
ギ（Tritium aestivum）チオレドキシンhタンパク質をコードするcDNAは、上記
データベースにアクセッション番号X69915（NID g2995377）で記載されている。
【００２４】 本発明は、全長チオレドキシンhタンパク質、ならびにチオレドキシンh活性を
保持するチオレドキシンh由来タンパク質の核酸配列を用いて実施することがで
きる。チオレドキシンの生物学的活性を保持するチオレドキシンh由来タンパク
質としては、化学的（例えば酵素による）消化または遺伝子操作手段により作製
されたチオレドキシンhの断片；例示するタンパク質または核酸配列で出発して
得られる化学的に断片化したタンパク質分子；ならびにタンパク質配列変異体、
例えば対立遺伝子変異体および突然変異変異体（in vitro突然変異誘発法、例え
ば遺伝子シャフリング（Stemmerら、1994a, 1994b）により作製されたものなど
）が挙げられる。従って、「チオレドキシンhタンパク質」という用語は、全長
チオレドキシンhタンパク質、ならびにチオレドキシンh活性を保持するチオレド
キシンh由来タンパク質などを包含する。
【００２５】 チオレドキシンタンパク質は、生物学的サンプル（種子など）においてタンパ
ク質レベルまたはチオレドキシン活性に関して定量しうる。チオレドキシンタン
パク質レベルは、以下に説明するように、ウエスタンブロット分析、続いて画像
の定量的走査を行うことにより測定しうる。チオレドキシン活性は、当技術分野
で公知の複数の種々の方法を用いて定量しうる。植物抽出物中のチオレドキシン
hに起因するチオレドキシンの生物学的活性を測定する好ましい方法としては、N
ADP/マレイン酸デヒドロゲナーゼ活性化（Johnsonら、1987a, b）およびNADP-チ
オレドキシンレダクターゼによる2',5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）
の還元（Florencioら、1988；米国特許第5,792,506号）が挙げられる。NADPHを
利用する非チオレドキシンh酵素による妨害の可能性のために、チオレドキシンh
活性の正確な測定は、好ましくは部分的に精製された植物抽出物を用いて行う必
要がある。標準的なタンパク質精製法（例えば(NH4)2SO4抽出または加熱）を利
用して上記部分精製を達成することができる。チオレドキシンh活性はまた、以
下に詳細に説明するような比活性、すなわち存在するタンパク質１単位当たりの
チオレドキシン活性として表わしうる。
【００２６】 他の実施形態において、チオレドキシンは、チオレドキシン含量、例えば質量
/組織質量（すなわち、μg/g組織）または質量/可溶性タンパク質質量（すなわ
ち、μg/mg可溶性タンパク質）で表わしうる。
【００２７】プロモーター： 調節核酸配列であり、典型的には、種々の細胞タンパク質に関連して遺伝子の
上流（5’）に位置し、該遺伝子の発現の調節に関与するものである。プロモー
ターは、複数の方法により遺伝子発現を調節しうる。例えば、発現は組織特異的
でありうる。これは、遺伝子が、特定の組織において増大したレベルで発現され
ることを意味する。または発現は発生段階で調節されて、該遺伝子が発生過程の
特定の時期において増大したレベルで発現される。あるいは、上記の両者をとり
うる。
【００２８】 好ましい実施形態において、本発明のトランスジーンは、植物の食用部分にお
いて発現される。本明細書において「食用」とは、ヒトまたは動物（魚類、甲殻
類、等脚類、十脚類、サル、ウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ウマ、鳥類（ニワトリ
、オオムなど））が消費するのに適している植物の少なくとも一部分を意味する
。従って「食用」にはヒトが消費する食料および動物が消費する飼料が含まれ、
例えば、ドー、パン、クッキー、麺類、ペストリー、飲料、ビール、食品添加物
、増粘剤、麦芽、植物の食用部分から調製された抽出物、動物用飼料などが挙げ
られる。植物の食用部分としては、例えば、根、塊茎、種子、穀粒、花、果実、
葉などが挙げられる。当業者であれば、トランスジーンを、該トランスジーンを
発現させようとする選択した植物の部分において活性を有するプロモーターを使
用することにより植物の任意の組織、器官または部分で発現可能であることがわ
かる。好ましい実施形態において、トランスジーンは、種子において、好ましく
は種子または穀粒に特異的なプロモーターの制御下にて発現される。
【００２９】 本発明の種子または穀粒におけるトランスジーンの発現は、好ましくはトラン
スジーンタンパク質をコードする核酸分子に種子特異的または穀粒特異的プロモ
ーターを機能しうる形で連結することにより達成する。ここで「種子特異的」と
は、該プロモーターが他の植物組織と比較して種子において活性を増大するもの
であることを指すが、該プロモーターが種子においてのみ活性を有する必要はな
い。従って、「穀粒特異的」とは、該プロモーターが他の植物組織と比較して穀
粒において活性を増大するものであることを指すが、該プロモーターが穀粒にお
いてのみ活性を有する必要はない。好ましくは、選択する種子または穀粒特異的
プロモーターは、該プロモーターが種子において最も活性を有する時点で、植物
の種子において該植物の葉または根における同プロモーターにより引き起こされ
るタンパク質発現よりも少なくとも２倍高くタンパク質を発現するものである。
しかしながら、チオレドキシンタンパク質の性質を考慮すると、種子または穀粒
以外の他の組織においてはほとんどまたは全くタンパク質が発現されない場合に
は、種子または穀粒特異的プロモーターを選択することが有利でありうる。好ま
しい実施形態において、プロモーターは種子および穀粒の発現に特異的であり、
その結果、種子および穀粒における発現が、他の植物組織と比較して増大するこ
とになるが種子および穀粒においてのみプロモーターが活性を有することを必要
としない。好ましい実施形態において、プロモーターは、胚特異的プロモーター
のように、種子または穀粒の構造またはエレメントに対し「特異的」である。上
述した定義によると、胚特異的プロモーターは、種子または穀粒の他の部分と比
較して胚において活性を増大させるものであり、胚に限定した活性を必要としな
い。好ましい実施形態において、プロモーターは、「成熟特異的」であり、それ
ゆえ植物の他の部分と比較して植物のある部分の成熟過程において発育のために
活性を増大させるものであり、植物の一部分の発育に限定された活性を必要とし
ない。
【００３０】 種子または穀粒特異的プロモーターは、種子の種々の組織、例えば胚乳、胚お
よびアリューロン、または穀粒において発現を引き起こしうる。種子または穀粒
特異的プロモーターであれば本発明の目的のために使用しうるが、植物種子また
は穀粒においてタンパク質を高レベルで発現する種子または穀粒特異的プロモー
ターを選択することが有利でありうる。既知の種子または穀粒特異的プロモータ
ーとしては、植物種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子、例えばオオムギホル
デイン、イネグルテリン、イネオリジン（oryzin）もしくはイネプロラミン；コ
ムギグリアジンもしくはコムギグルテリン；トウモロコシゼインもしくはトウモ
ロコシグルテリン；トウモロコシ胚特異的プロモーター；オートムギグルテリン
；ソルガムカフィリン（kafirin）；ミレットペニセチン（pennisetin）または
ライムギセカリン（secalin）をコードする遺伝子に関連するものが挙げられる
。
【００３１】 オオムギホルデインプロモーター（以下に詳述する）は、例示的な実施例にお
いて使用した種子または穀粒特異的プロモーターである。
【００３２】 ある特定の実施形態においては、選択される種子または穀粒特異的プロモータ
ーは、成熟特異的プロモーターである。種子または穀粒の成熟過程で増大した発
現を与えるプロモーター（オオムギホルデインプロモーターなど）の使用によっ
て、種子においてさらに高いレベルのチオレドキシンが発現されうる。
【００３３】 本明細書において「種子または穀粒の成熟」は、受精から始まり、代謝可能な
食物貯蔵物（例えば、タンパク質、脂質、デンプンなど）が発育中の種子に、特
に、胚乳、種皮、糊粉層、胚および胚盤表皮などの種子の保存器官に蓄えられ、
種子が膨張および充実し、そして種子乾燥をもって終結する期間を意味する。
【００３４】 穀類の穀粒を含む草木植物科のメンバーは、乾燥した単種子の果実を産する。
このタイプの果実は、厳密に言えば穎果であるが、通常、カーネルまたは穀粒と
呼ばれる。種子を覆う外皮もしくは果皮の穎果は、種皮に密着している。種子は
、珠心表皮（nucellar epidermis）および種皮により囲まれた胚もしくは胚芽と
胚乳とからなる。従って、穀粒は、種子およびその外皮もしくは果皮を含む。種
子は胚と胚乳を含む（特に、参照によりその全文が組み入れられるR. Carl Hose
ney “Principles of Cereal Science and Technology（穀類の科学と技術の原
理）”）。
【００３５】ホルデインプロモーター： オオムギ種子もしくは穀粒中のホルデイン遺伝子の転写を指令するオオムギプ
ロモーター。複数のオオムギホルデイン遺伝子および関連するプロモーターが記
載されかつ特性決定されており、B-、C-、D-およびγ-ホルデインのものが挙げ
られる（Brandtら, 1985；Fordeら, 1985；RasmussenおよびBrandt, 1986；Sore
nsenら, 1996）。一過性発現アッセイにおける上記プロモーターの活性もまた特
性決定されている（Entwistleら, 1991；MullerおよびKnudesen, 1993；Sorense
nら, 1996）。本発明ではホルデインプロモーターであればいずれのものでも使
用できるが、提供する特定の実施例では、オオムギB1-およびD-ホルデイン遺伝
子由来のプロモーター配列の使用を記載する。オオムギB1-およびD-ホルデイン
遺伝子の核酸配列をそれぞれ配列番号1および3、ならびに図6および7に示す（プ
ロモーター領域は、下線で示すホルデインシグナルペプチドをコードするヌクレ
オチドを含まない）。Sorensennら(1996)は、βグルクロニダーゼ遺伝子（uidA
；gus）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefac
iens）ノパリンシンターゼ3’ポリアデニル化部位（nos）と機能しうる形で連結
されたB1-およびD-ホルデインプロモーターを含有するプラスミドを記載してい
る。これらのプラスミドは、ホルデインプロモーターおよびnosポリアデニル化
部位の両方の供給源として便利に使用することができる。
【００３６】 当業者であれば、ホルデインプロモーター領域は図6および7に記載の配列より
大きくれもよいしまたは小さくてもよいことが理解できる。例えば、ホルデイン
遺伝子上流領域からさらに5’側の配列をプロモーター配列に付加してもよいし
、または記述した配列から数塩基を除去してもよい。しかし、いずれのホルデイ
ンプロモーター配列も植物種子もしくは穀粒中の機能しうる形で連結された配列
の転写を指令できるようにしなければならない。植物種子においてタンパク質の
転写を指令するオオムギホルデインプロモーターの能力は、該プロモーター配列
をgusORFなどの容易に検出可能なタンパク質をコードするオープンリーディング
フレーム（ORF）と機能しうる形で連結して、得られた構築物を植物中に導入し
、次いで植物種子における該タンパク質の発現を評価することによって、容易に
評価することができる（Sorensenら(1996)参照）。ホルデインプロモーターは典
型的には種子特異的発現を付与する、すなわち、機能しうる形で連結されたORF
がコードするタンパク質の発現は、安定してトランスフェクトされた植物の種子
において、葉などの他の組織と比較して一般的に少なくともほぼ2倍高く（活性
基準で評価する）でありうる。より通常では、ホルデインプロモーターは、種子
において、植物の他の組織における発現よりも少なくともほぼ5倍高い発現を引
き起こしうる。
【００３７】 本明細書に開示されたオオムギホルデインプロモーターの機能的相同体は、コ
ムギ、イネおよびトウモロコシ（corn）を含む他の単子葉植物などの他の植物種
から得ることができる。このような相同体は、原型ホルデインプロモーターと特
定のレベルの配列同一性（例えば、40%以上の配列同一性）を有しうる。機能的
相同体は、ホルデインプロモーター機能、すなわち、植物中に導入された際に、
機能しうる形で連結されたORFに対し種子または穀粒特異的発現を付与する能力
を保持する（Marrisら, 1988；Menaら, 1998）。従って、本明細書においてホル
デインプロモーターを参照する場合、本明細書に開示された原型配列（またはこ
れらの配列の変異体）の配列を有する核酸分子だけを含むのではなく、ホルデイ
ン遺伝子相同体由来のプロモーターも含むと理解されたい。また、上記用語の範
囲内には、開示された原型分子とはマイナーな変異が異なる分子も含まれる。こ
のような変異配列は、部位指定突然変異誘発法またはポリメラーゼ連鎖反応など
の標準的方法を利用してホルデインプロモーターのヌクレオチド配列を遺伝子操
作することにより作製することができる。好ましくは、プロモーターの種子また
は穀粒特異性が保持されている。使用し得る双子葉植物プロモーターの例として
は、例えば、ダイズのグリシニンおよびコングリシニン(con-glycinin)、ならび
にインゲンマメのファゼオリンのプロモーターが挙げられる。
【００３８】シグナルペプチド： 以下の実施例に記載するように、本発明者らは、種子または穀粒のチオレドキ
シンの発現レベルがシグナルペプチドの存在によって増強され得ることを発見し
た。以下に記載する一実施例においては、B1-ホルデインシグナルペプチドを使
用している。特に、タンパク質をコードするORFがホルデインプロモーターおよ
びホルデインシグナルペプチドをコードするホルデインシグナル配列の両方に機
能しうる形で連結されている場合には、種子または穀粒中のチオレドキシンタン
パク質の発現が増強されることを発見した。（便宜上、本明細書ではシグナルペ
プチドをコードする核酸配列をシグナル配列と呼ぶ。）理論により拘束されるも
のではないが、ホルデインシグナルペプチドは、液胞もしくはタンパク粒などの
保護された細胞小器官の位置にチオレドキシンタンパク質の発現を指令すること
が提唱されている。さらに、このような液胞などに導かれるタンパク質は、種子
または穀粒の成熟のある特定の段階ではタンパク分解から保護されることが提唱
されている。さらにまた、このような位置にチオレドキシンタンパク質を隔離す
ることによって、成熟種子または穀粒をチオレドキシンの過剰発現に関連する有
害な影響から保護することにもなりうる。
【００３９】 ホルデインシグナルペプチドは、典型的に、ホルデイン遺伝子ORFの最初のほ
ぼ15〜25個のアミノ酸、より通常には、ほぼ18〜21個のアミノ酸を含むものであ
る。原型的オオムギB1-およびD-ホルデイン遺伝子のホルデインシグナル配列お
よびペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号1-4ならびに図6お
よび7に示す。以下で記載する実施例ではB1-ホルデインシグナル配列およびシグ
ナルペプチドを利用したが、当業者であれば本発明がこれらの特定の配列に限定
されないことを理解しうる。例えば、相同配列は、正確なヌクレオチドまたはア
ミノ酸配列が異なる配列であっても、その配列がコードされたタンパク質の未成
熟種子または穀粒においてレベルを増大するのであれば、効果的に使うことがで
きる。典型的には、「増加した発現」は、該シグナル配列を欠く等価構築物で観
察される発現のほぼ2倍の発現でありうる。従って、用語「ホルデインシグナル
配列」および「ホルデインシグナルペプチド」は本明細書に示された特定の配列
だけでなく、これらの配列の相同体および変異体も含む。
【００４０】 さらに、本発明は、ホルデインシグナルペプチドの使用に限定されるものでは
ない。チオレドキシンを翻訳と同時にまたは翻訳後に、選択した種子、穀粒また
は細胞区画に局在化させる作用のある他のシグナルペプチドを使用してもよい。
そのような他のシグナル配列としては、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、
マメおよびタバコの貯蔵タンパク質に関連したシグナル配列が挙げられる（例え
ば、Baggaら, 1997；Torrentら, 1997；Wuら, 1998；Zhengら, 1995；Grimwade
ら, 1996；Conradら, 1998；およびTakaiwaら, 1995、を参照）。
【００４１】デンプン： α-1,6-結合で直鎖状（アミロース）または分枝鎖状（アミロペクチン）のα-
1,4結合により結合したグルコース単位の鎖からなる多糖。
【００４２】デキストラン： α-1,6結合により結合したグルコース残基からなる、通常は分枝鎖状の様々な
貯蔵多糖の任意のもの。
【００４３】デキストリンまたは限界デキストリン： 低分子可溶性多糖、通常はα-1,6-結合に富む、デンプンの部分加水分解産物
のグループの任意のもの。
【００４４】発芽（germination）： 種子成熟および乾燥（dessication）の後、都合の良い条件下における植物胚
の成長の再開、ならびに種子からの若いシュートおよび根の発生。
【００４５】アレルゲン： 感受性の高い宿主においてアレルギー反応を誘発する抗原性物質。従って、感
受性の高い宿主は、アレルゲンに暴露した際に異常なもしくは有害な免疫反応を
引き起こす免疫状態（過敏症）を有する。好ましい実施形態においては、本発明
のトランスジェニック穀粒は非トランスジェニック穀粒と比較してアレルゲン性
が低減している。免疫反応は、即時にもしくは遅れて起こりるか、細胞が介在も
しくは抗体が介在するか、またはそれらの組み合わせでありうる。好ましい実施
形態においては、アレルギー反応は即時に起こるタイプの過敏症である。
【００４６】消化： 本明細書では、用語「消化」は、分子または化合物が1以上のその構成要素に
変換することを意味する。従って、用語「消化性」は、1以上のその構成要素へ
の変換が起こる速度および効率に関する。好ましい実施形態においては、用語「
消化性化合物」は、例えば、食物であって、化学的もしくは酵素的方法によって
その化学的構成要素に変換されるものである。例えば、デキストランはデキスト
リン、多糖、単糖、限界デキストリンなどに変換され；タンパク質は、ポリペプ
チド、オリゴペプチド、アミノ酸、アンモニウムなどに変換され；核酸は、オリ
ゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジン、リン酸な
どに変換される。好ましい実施形態においては、本発明のトランスジェニック穀
粒は消化性が高められており、すなわち、非トランスジェニック穀粒と比較して
、より効率的にまたは迅速に消化されるものである。
【００４７】配列同一性： 2つの核酸配列または2つのアミノ酸配列間の類似性は、配列同一性によって（
または、タンパク質に関しては配列類似性によって）表わされる。配列同一性は
、同一性％によって測定されることが多く、その％が高いほど2つの配列はより
類似性が高い。上記したように、本発明においては、チオレドキシン核酸分子、
ホルデインプロモーターおよびホルデインシグナルペプチドの相同体および変異
体を用いることができる。これらの核酸分子の相同体および変異体は、標準的方
法を用いてアライメントをとると、比較的高い程度の配列同一性を有しうる。
【００４８】 比較のための配列のアライメント方法は当業界で周知である。様々なプログラ
ムおよびアライメントアルゴリズムが、SmithおよびWaterman (1981)；Needlema
nおよびWunsch (1970)；PearsonおよびLipman (1988)；HigginsおよびSharp (19
88)；HigginsおよびSharp (1989)；Corpetら(1988)；Huangら(1992);ならびにPe
arsonら(1994)に記載されている。Altschulら(1994)は、配列アライメント方法
および相同性計算法に関して詳細な考察を報じている。
【００４９】 配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと組み合
わせて使用するためのNCBI Basic Local Alignment Search Tool（NCBI基本ロー
カルアライメントサーチツール）（BLAST）(Altschulら, 1990)が、National Ce
nter for Biotechnology Information（米国国立バイオ技術情報センター）(NCB
I, Bethesda, MD)などの複数の供給元から、およびインターネット上で入手する
ことができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTにアクセスしてもよい。こ
のプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/BLAST/blast.help.htmlで入手可能である。
【００５０】 開示したタンパク質配列の相同体は、典型的には、デフォールトパラメータを
設定したNCBI Blast 2.0、ギャップ付きblastpを使用して、開示した配列のアミ
ノ酸配列との全長アライメントにわたって算出した配列同一性を少なくとも40%
有することを特徴とする。調節しうるパラメータは、好ましくは次の値に設定す
る：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップ分率＝0.125、文字列閾値（T）
＝11。HSP SおよびHSP S2パラメータは動的な値であって、目的の配列を検索す
る対象である特定の配列構成および特定のデータベース構成に応じてプログラム
自身が確立する；しかし、その値は、感度が増大するように調節してもよい。こ
の方法によって評価すると、参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパ
ク質は、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約7
5%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の配列同一性
などの同一性％の増大を示しうる。
【００５１】 開示した核酸配列の相同体は、典型的には、デフォールトパラメータを設定し
たNCBI Blast 2.0、ギャップ付きblastnを使用して、開示した配列のアミノ酸配
列との全長アライメントにわたって算出した配列同一性を少なくとも40%有する
ことを特徴とする。好ましい方法は、WU-BLAST-2のBLASTNモジュール(Altschul
ら, 1996)を利用し、デフォールトパラメータを、オーバーラップスパンおよび
オーバーラップ分率をそれぞれ1および0.125に設定する。この方法によって評価
すると、参照配列に対してさらに高い類似性を有する核酸配列は、少なくとも約
50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%
、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の配列同一性などの同一性％の増大
を示しうる。
【００５２】 アライメントは、アライメントしようとする配列内へのギャップの導入を含む
。さらに、図に示す配列によりコードされるタンパク質より多いかもしくは少な
い数のアミノ酸を含有する配列について、一実施形態においては、配列同一性％
は、アミノ酸の総数に関して同一アミノ酸の数に基づいて決定しうると理解され
たい。従って、一実施形態においては、例えば、以下に考察する図で示されるも
のよりも短い配列の配列同一性は、長い方の配列のアミノ酸数を用いて決定され
うる。同一性％の計算において、挿入、欠失、置換などのような配列変異の様々
な事象に対して、相対的重み（relative weight）は割当てられない。
【００５３】 一実施形態においては、同一性だけを正に（+1）スコアし、そして、ギャップ
を含む全ての配列変異形態には「0」の値を割当てて配列類似性計算のための本
明細書に記載した重み付け尺度（weighted scale）またはパラメータに必要でな
いとした。配列同一性％は、例えば、一致する同一残基の数を、アライメントし
た領域の「短い方の」配列の残基の総数で除して100を乗ずることによって計算
することができる。「長い方の」配列は、アライメントした列領域において最大
の事実上の残基を有する配列である。
【００５４】 当業者であれば理解できるように、本発明の配列は配列決定誤差（sequencing
error）を含み得る。すなわち、いずれかの配列において、正確ではないヌクレ
オシド、フレームシフト、未知のヌクレオシドまたは他のタイプの配列決定誤差
がありうる。しかし、正確な配列が本発明における相同性およびストリンジェン
シーの定義の範囲内に入るであろう。
【００５５】ベクター： 宿主細胞中に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を作製する核酸
分子。ベクターは、1以上の宿主細胞において複製を可能にする、1以上の複製起
点などの核酸配列を含みうる。ベクターはまた、1以上の選択マーカー遺伝子お
よび当業界で周知の他の遺伝子エレメントを含んでもよい。
【００５６】形質転換された： 形質転換された細胞とは、分子生物学技術により核酸分子が導入されている細
胞である。本明細書に使用する形質転換という用語は、核酸分子を植物または動
物細胞などの細胞中に導入するための全ての技術を包含し、例えばウイルスベク
ターを用いるトランスフェクション、アグロバクテリウム（Agrobacterium）に
よるプラスミドベクターを用いる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、
リポフェクションおよび粒子銃加速による裸のDNAの導入が挙げられ、そして一
過性ならびに安定した形質転換体を含む。
【００５７】単離された： 「単離された」生物学的成分（核酸もしくはタンパク質または細胞小器官など
）とは、細胞または生物中に天然に存在する他の生物学的成分、すなわち他の染
色体のおよび染色体外のDNAおよびRNA、タンパク質ならびに細胞小器官から実質
的に分離されまたは精製されていて、それらを含まないものである。「単離され
た」核酸およびタンパク質には、標準の精製方法によって精製された核酸および
タンパク質が含まれる。該用語は、化学的に合成された核酸などの核酸を包含し
、また、in vitroもしくは宿主細胞内で組換え体発現により調製されたタンパク
質および以下に規定した組換え核酸も包含する。
【００５８】機能しうる形で連結された： 第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関係をもって配置されている場合に、
第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能しうる形で連結されている。例えば、プロ
モーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合には、プロモーター
はコード配列と機能しうる形で連結されている。一般的に、機能しうる形で連結
されたDNA配列は、隣接しており、必要な場合には、2つのタンパク質コード領域
は同じリーディングフレームで連結されている。ポリペプチドについては、2つ
のポリペプチド配列は、ペプチド結合またはジスルフィド結合などを介して共有
結合により機能しうる形で連結されていてもよい。
【００５９】組換え体： 本明細書では、「組換え核酸」とは、天然に存在しない配列を有するかまたは
2つの分離した配列のセグメントを人工的に組合わせて作製した配列を有する核
酸を意味する。この人工的組合わせは、化学合成、またはより通常的では、人工
的な核酸操作により、例えば、制限酵素、リガーゼ、リコンビナーゼおよび／ま
たはポリメラーゼによる少なくとも1つの核酸の操作などの遺伝子工学技術によ
って実施されることが多い。組換え核酸は宿主細胞中に導入されると宿主細胞に
より複製されるが、細胞内で複製された組換え核酸は本発明の目的のための組換
え核酸として保持される。本明細書では、「組換えタンパク質」とは、組換え核
酸を使用する方法によって産生されるタンパク質を意味する。以上に概要を述べ
たように、「組換え核酸」および「組換えタンパク質」はまた、上記のごとく「
単離」されている。
【００６０】相補的DNA（cDNA）： RNA、好ましくは細胞から抽出されたRNAの逆転写によって研究室で合成される
DNAの1片。mRNAから作製されたcDNAは、典型的には、内部、非コードセグメント
（イントロン）および転写を決定する調節領域を欠く。
【００６１】オープンリーディングフレーム（ORF）： 内部終止コドンを含有しない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリ
プレット（コドン）。これらの配列は通常はペプチドに翻訳可能である。
【００６２】トランスジェニック植物： 本明細書に使われるこの用語は、通常はあるタイプの植物に見出されない組換
え遺伝子物質を含有する植物を意味し、該組換え遺伝子物質は人的操作により対
象の植物中に（またはその植物の前駆体中に）導入されている。従って、形質転
換により組換えDNAを導入した植物細胞から成長した植物、ならびに導入された
トランスジーンを含有するその植物の全ての子孫（有性または無性生殖により作
製されたを問わない）は、トランスジェニック植物である。トランスジェニック
植物という用語は、植物全体および該植物の一部分、例えば穀粒、種子、花、葉
、根、果実、花粉、茎などを包含すると理解されたい。
【００６３】 本発明は、双子葉植物（例えば、トマト、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、タバコ
など）および単子葉植物、例えば限定するものでないが、コムギ(Triticum spp.
)、イネ(Oryza spp.)、オオムギ(Hordeum spp.)、オートムギ(Avena spp.)、ラ
イムギ(Secale spp.)、トウモロコシ(Zea mays)、ソルガム(Sorghum spp.)およ
びミレット(Pennisetum spp)などの草食性（graminaceous）単子葉植物を含む単
子葉植物に適用することができる。例えば、本発明は、限定するものでないが、
Morex、Harrington、Crystal、Stander、Moravian III、Galena、Salome、Stept
oe、Klages、Baronesseなどのオオムギ遺伝子型、ならびに、限定するものでな
いが、Yecora Rojo、Bobwhite、KarlおよびAnzaなどのコムギ遺伝子型に利用す
ることができる。一般的に、本発明は特に穀類に有用である。
【００６４】精製された： 精製されたという用語は絶対的な純度を要求するものでなく、むしろ、相対的
な用語として意図している。従って、例えば、精製されたオオムギチオレドキシ
ンhタンパク質調製物は、オオムギチオレドキシンhタンパク質が、そのタンパク
質が細胞または植物組織内の自然環境にあるよりも、濃縮されているまたは生化
学的活性があるまたは容易に検出されうるものである。従って、用語「精製され
た」は、目的の分子のインヒビターの除去または不活性化を包含するかまたは含
むものである。好ましい実施形態においては、オオムギチオレドキシンhタンパ
ク質の調製物は、オオムギチオレドキシンhが調製物の全タンパク質含量の少な
くとも5-10%になるように精製される。特定の用途のためには、より高いタンパ
ク質純度が望ましい場合もあるが、オオムギチオレドキシンhが全タンパク質含
量の少なくとも50%、または少なくとも75%、または少なくとも90%である調製物
を使用しうる。
【００６５】オルソログ体（ortholog）： 祖先の配列を担持する１つの種が2つの種、亜種もしくは品種に分化したとき
、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が共通の祖先の配列を共有しかつ分岐
（diverge）していれば、上記ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は互いにオルソ
ログ体である。オルソログ配列はまた相同配列でもある。
【００６６】II.種子チオレドキシンが増大した植物の作出 標準の分子生物学的方法および植物形質転換技術を使って、チオレドキシンタ
ンパク質レベルが増大した種子を産生するトランスジェニック植物を作出するこ
とができる。以下の節では、特定の構築物および形質転換方法の選択に関する一
般的手引きを提供する。
【００６７】a.構築物 本発明は、非形質転換植物種子と比較して植物種子において増加したチオレド
キシン発現を得るために適当である組換え構築物を使用する。最も基本的な形態
においては、これらの構築物はP-Tとして表現することができ、ここでPは種子特
異的プロモーターであり、Tはチオレドキシンをコードする核酸配列である。他
の実施形態においては、チオレドキシンポリペプチド発現を細胞内体にターゲテ
ィングするペプチドシグナル配列を使用することができる。そのような構築物は
、P-SS-Tとして表現することができ、ここでSSはシグナルペプチドである。これ
らの各構成要素源として使用しうる核酸分子は、上の定義の節に記載している。
【００６８】 それぞれの構成要素は次の構成要素と機能しうる形で連結されている。例えば
、構築物が、ホルデイン D-プロモーター（P）、ホルデインシグナルペプチドを
コードするホルデイン D-シグナル配列（SS）、および、好ましくはコムギチオ
レドキシンhタンパク質（T）をコードするオープンリーディングフレームを含む
場合には、ホルデインプロモーターはホルデインシグナル配列をコードする配列
の5'末端と連結され、かつホルデインシグナル配列は上記チオレドキシンオープ
ンリーディングフレームの5'末端と機能しうる形で連結されて、シグナルペプチ
ドのC末端がコードされるタンパク質のN末端に結合されるようにする。
【００６９】 上記構築物はまた、典型的には、コードされるタンパク質ORFの3'末端の後に
転写終止領域を含みうる。転写終止領域の例としては、アグロバクテリウムTiプ
ラスミド由来のnosターミネーターおよびイネαアミラーゼターミネーターが挙
げられる。
【００７０】 ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素消化および／またはライゲーションなどの標
準的な分子生物学的方法を使用し、チオレドキシンタンパク質またはポリペプチ
ドをコードする任意の核酸分子または配列を含む構築物を作製することができる
。
【００７１】b.植物形質転換の一般的原理 選択した構築物の植物への導入は、典型的には、標準的な形質転換技術を使っ
て達成する。基本的方法は、：(a)構築物を形質転換ベクター中にクローニング
し、(b)次いで、該ベクターをいくつかの技術（例えば、エレクトロポレーショ
ン、微粒子ボンバードメント、アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染）の1
つによって植物細胞中に導入し；(c)形質転換した植物細胞を同定し；(d)同定し
た植物細胞から全植物を再生し；そして(d)導入した構築物を含有する子孫植物
を選択することである。
【００７２】 形質転換ベクターの全てまたは一部分を、安定して植物細胞のゲノム中に組み
込むことが好ましい。植物細胞中に組込まれ、導入されたP-TまたはP−SS-T配列
（導入された「チオレドキシントランスジーン」）を含有する形質転換ベクター
の部分を、組換え発現カセットと呼ぶことにする。
【００７３】 導入されたトランスジーンを含有する子孫植物の選択は、種子におけるチオレ
ドキシンもしくはNTR過剰発現の検出、または形質転換ベクター中に組込まれた
優性選択マーカー遺伝子を挿入した結果として増強された化学剤（抗生物質など
）耐性に基づいて行うことができる。
【００７４】 クローニングした核酸配列を用いた形質転換による植物特性の改変の成功例は
、科学技術文献に数多く記載されている。この技術分野の知識を説明するために
選んだ例として、次のものが挙げられる： 米国特許第5,571,706号（"Plant Virus Resistance Gene and Methods(植物ウイ
ルス耐性遺伝子および方法)"）； 米国特許第5,677,175号（"Plant Pathogen Induced Proteins(植物病原体誘導タ
ンパク質)"）； 米国特許第5,510,471号（"Chimeric Gene for the Transformation of Plants(
植物の形質転換用のキメラ遺伝子)"）； 米国特許第5,750,386号（"Pathogen-Resistant Transgenic Plants(病原体耐性
トランスジェニック植物)"）； 米国特許第5,597,945号（"Plants Genetically Enhanced for Disease Resistan
ce(遺伝的に疾患耐性が増強された植物)"）； 米国特許第5,589,615号（"Process for the Production of Transgenic Plants
with Increased Nutritional Value Via the Expression of Modified 2S Stora
ge Albumins(改変された2S貯蔵アルブミンの発現により栄養価が高められたトラ
ンスジェニック植物の作出方法)"）； 米国特許第5,750,871号（"Transformation and Foreign Gene Expression in Br
assica Species(アブラナ属植物種における形質転換と外来遺伝子発現)"）； 米国特許第 5,268,526号（"Overexpression of Phytochrome in Transgenic Pla
nts(トランスジェニック植物におけるフィトクロムの過剰発現)"）； 米国特許第 5,780,708号（"Fertile Transgenic Corn Plants(稔性トランスジェ
ニックトウモロコシ植物)"）； 米国特許第 5,538,880号（"Method For Preparing Fertile Transgenic Corn Pl
ants(稔性トランスジェニックトウモロコシ植物の作製方法)"）； 米国特許第 5,773,269号（"Fertile Transgenic Oat Plants(稔性トランスジェ
ニックオートムギ植物)"）； 米国特許第 5,736,369号（"Method For Producing Transgenic Cereal Plants(
トランスジェニック穀類植物の作製方法)"）； 米国特許第 5,610,049号（"Methods For Stable Transformation of Wheat(コム
ギの安定した形質転換方法)"） これらの例は、形質転換ベクターの選択、形質転換技術および導入トランスジ
ーンを発現するよう設計された構築物の構築を含む。
【００７５】C. 植物型 本発明のトランスジーンを発現する構築物を広範囲の高等植物において発現さ
せ、選択されたポリペプチドの種子または穀粒特異的な発現を達成することは有
用である。本発明は特に、オオムギ、コムギ、イネ、ライムギ、トウモロコシ、
ライコムギ、ミレット、ソルガム、オートムギ、飼料用草および芝草を含む単子
葉穀類植物への応用が期待される。特に、本明細書に記載した形質転換方法によ
って、本発明が、Morex、Harrington、Crystal、Stander、Moravian III、Galen
a、Golden Promise、Steptoe、KlagesおよびBaronesseなどのオオムギ遺伝型、
ならびにYecora Rojo、Bobwhite、KarlおよびAnzaなどの商業的に重要なコムギ
遺伝型に対して利用可能となる。
【００７６】 本発明はまた、限定するものでないが、ダイズ(soybean)、サトウキビ(sugar
beat)、ワタ(cotton)、マメ(beans)、アブラナ／キャノーラ(rape/canola)、ア
ルファルファ)alfalfa)、アマ(flax)、ヒマワリ(sunflower)、ベニバナ(safflow
er)、ブラシカ属植物(brassica)、ワタ(cotton)、アマ(flax)、ピーナッツ(pean
ut)、クローバ(clover)；レタス(lettuce)、トマト(tomato)、ウリ科植物(cucur
bits)、カッサバ(cassava)、バレイショ(potato)、ニンジン(carrot)、ダイコン
(radish)、エンドウマメ(pea)、ヒラマメ(lentils)、キャベツ(cabbage)、カリ
フラワー(cauliflower)、ブロッコリー(broccoli)、メキャベツ(Brussels sprou
ts)、コショウ(peppers)などの野菜；ならびに柑橘類(citrus)、リンゴ(apples)
、西洋ナシ(pears)、モモ(peaches)、アンズ(apricots)およびクルミ(walnuts)
などの樹果を含む双子葉植物にも適用することができる。
【００７７】d．ベクター構築物 植物細胞の安定した形質転換またはトランスジェニック植物の確立のために適
当な複数の組換えベクターが記載されており、例えばWeissbachおよびWeissbach
(1989)ならびにGelvinら(1990)の記載などがある。植物形質転換用ベクターは、
典型的には、5'および3'調節配列の転写制御下にある1以上のORFならびに5'およ
び3'調節配列を有する優性選択マーカーを含む。本発明の構築物に適当な5'およ
び3'調節配列の選択は上述している。形質転換体の選択を容易にする優性選択マ
ーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン、カナ
マイシン、ブレオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシ
ン）および除草剤耐性遺伝子（例えば、ホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ）をコードするものが挙げられる。
【００７８】e．形質転換および再生技術 単子葉および双子葉植物の形質転換および再生の方法は公知であり、実施者は
適当な形質転換技術を決定しうる。その方法の選択は、形質転換される植物のタ
イプによって変化しうるが、当業者であれば所与の植物タイプに関して適当な特
定の方法がわかる。適当な方法には、限定するものでないが、植物プロトプラス
トのエレクトロポレーション；リポソームを介する形質転換；ポリエチレングリ
コール（PEG）を介する形質転換、ウイルスを用いる形質転換；植物細胞のマイ
クロインジェクション；植物細胞の微粒子発射ボンバードメント；減圧浸潤；お
よびアグロバクテリウムを介する形質転換が含まれる。植物を形質転換および再
生する典型的な方法は、本節の最初に掲げた特許文書に記載されている。
【００７９】f．形質転換植物の選択 形質転換後、形質転換体は、好ましくは優性選択マーカーを使って選択する。
そのようなマーカーは、典型的には、抗生物質または除草剤耐性を、形質転換植
物の実生に付与し、形質転換体の選択は実生を適当な濃度の抗生物質または除草
剤に曝すことによって達成することができる。形質転換植物を選択し、成熟させ
て種子セットができるまで成長させたら、その種子を収穫し、チオレドキシンの
過剰発現についてアッセイすることができる。
【００８０】III．増大したレベルのチオレドキシンを発現する植物、種子または穀粒の使用 一実施形態においては、本明細書に記載の方法を使って、植物、特に種子また
は穀粒において発現されるトランスジーンタンパク質、例えばチオレドキシンを
、チオレドキシンの生産および合成に使用する。本発明の組換え核酸により発現
されるチオレドキシントランスジーンは、該タンパク質の発現が始まった後、任
意の時点で収穫することができる。例えば種子もしくは穀粒または植物の他の部
分から収穫するとき、種子もしくは穀粒または植物の他の部分は収穫前に成熟し
終わっている必要はない。例えば、トランスジーン発現は、種子もしくは穀粒の
成熟前に起りうるし、または種子もしくは穀粒の成熟前に最適レベルに到達する
場合もある。トランスジーンタンパク質は、所望であれば、通常のタンパク質精
製法によって種子もしくは穀粒から単離することができる。例えば、種子もしく
は穀粒を粉砕し、次いで水性または有機抽出媒質を用いて抽出し、続いて抽出し
たチオレドキシンタンパク質を精製することができる。あるいは、意図する用途
の性質によっては、トランスジーンタンパク質を部分的に精製するか、または種
子もしくは穀粒をトランスジーンタンパク質を精製せずに直接、食品加工または
他の目的に使用してもよい。
【００８１】 例えば、チオレドキシンの添加によって、ベーキング品質が改善された粉末を
産するタンパク質ネットワークの形成が促進する。Kobrehelら(1994)は、チオレ
ドキシンを、イネ、トウモロコシおよびソルガムなどの非グルテン質穀類の粉末
に添加するとドー様（dough-like）産物の形成が促進されることを示している。
従って、本明細書に記載の方法を使って種子において発現したチオレドキシンの
添加は、増大した強度および／または容量などのベーキング品質が改良された粉
末の生産に有用である。
【００８２】 チオレドキシンの増大発現はまた、改変された生化学組成を有する種子も産生
する。例えば、チオレドキシン発現の増大によって、増加したプルラナーゼおよ
びαアミラーゼAなどの酵素活性が増大した種子が産生される。チオレドキシン
発現の増大はまた、初期のαアミラーゼB活性化を伴なう種子を作製する。プル
ラナーゼ（「脱分枝酵素」）は、穀類種子の胚乳の分枝鎖状デンプンを加水分解
によりα-1,6-結合を切断して破壊する酵素である。αアミラーゼはデンプン1-4
結合を破壊する。プルラナーゼおよびαアミラーゼは醸造およびベーキング工業
に必須の酵素である。プルラナーゼおよびアミラーゼは、糖類または他の炭水化
物を添加せずに行う麦芽製造および特定のベーキング過程においてデンプンを破
壊するために必要である。これらの酵素の十分な活性を得ることは、特に醸造工
業において問題がある。以前から、ジチオトレイトール（DTT、チオレドキシン
を還元し、それと置き換わることもある化学還元剤）が穀類調製物（例えば、オ
オムギ、オートムギおよびイネ粉末）のプルラナーゼを活性化することが知られ
ている。生理学的に許容しうる系によりプルラナーゼおよびαアミラーゼA活性
を十分増大しかつαアミラーゼBの活性化時間を短縮する方法によって、醸造方
法がより迅速になり、また、糖類利用可能性が増加するために、炭水化物含量の
低いビールなどのアルコール飲料が得られる。
【００８３】 従って、チオレドキシン発現が増大された種子もしくは穀粒は、発酵法による
麦芽および飲料の生産法に利益をもたらす。穀粒におけるプルラナーゼおよびα
-アミラーゼAの増強ならびにα-アミラーゼBのより早い誘導によって、麦芽製造
に重要な発芽速度および効率が増加し、そして酵素活性が増大した麦芽を作って
、デンプンの発酵可能な炭水化物への加水分解を増進し、それによって、アルコ
ール飲料、例えば、ビールおよびスコッチウィスキーの生産における発酵効率を
改良する。早いαアミラーゼB活性化によって麦芽作製の全時間がほぼ20%低減す
るであろう。増強した発酵法はまた、ヒト消費用でないアルコール、すなわち、
工業用アルコールの生産にも有用である。
【００８４】 他の実施形態においては、チオレドキシン発現が増大した種子または穀粒は、
発芽の開始および効率を増進するという利益を提供する。
【００８５】 種子もしくは穀粒のチオレドキシンの過剰発現によって、全タンパク質が増加
する。それによりまた、最可溶性アルブミン／グロブリン画分へのタンパク質の
再分布、ならびに、非形質転換穀粒から作られる食用製品と比較して、消化性が
改良された粉末、その他の食料品、飼料および飲料の生産が促進される。このよ
うな食用製品は、食物吸収不全症候群、例えば、スプルー（sprue）またはカタ
ル性赤痢の改善および治療に有用である。スプルーは児童および成人の両方を冒
す吸収不全症候群であり、グルテンを含有する食物の摂取により誘発される。よ
り容易に消化されかつ容易に吸収される食用製品は、該疾患症候群を回避もしく
は改善する。消化性が改良された食用製品はまた、患者において容易に消化され
ない貯蔵タンパク質が消化管経路（Gl tract）の炎症をもたらす腹腔疾患に関連
する症候群を改善もしくは低減する。
【００８６】 種子穀粒におけるチオレドキシンの発現によって、非形質転換穀粒から作られ
た食用製品と比較して、アレルゲン性が低減された食品および他の食用製品を生
産しうる。食物アレルギーは重要な健康および栄養問題である（Lehrerら, 1996
）。成人の2%および児童の8%までが、死亡を含む重篤な症候群を起こす食物アレ
ルギーを有する。コムギタンパク質は主なアレルゲンの1つである。食物アレル
ギーは米国アレルギー免疫学会の食物有害反応委員会（American academy of Al
lergy and Immunology Committee on Adverse Reactions to Food）により「食
物または食物添加剤の摂取から生じる免疫反応（an immunological reaction re
sulting from the ingestion of a food or a food additive）」として定義さ
れている(Fenema, 1996；Lasztity, 1996)。食物タンパク質に対するほとんどの
真のアレルギー応答は、免疫グロブリンE（IgE）が介在するI型過敏症反応によ
り誘発されるようである（Sicherer, 1999）。これらの応答は、原因となる食物
を食べた後、数分もしくは数時間内に起りうる（Furlong-Munoz, 1996）。アレ
ルギー過敏性の個人が原因となる食物を摂取すると、身体はヒスタミンおよび他
の生化学物質を放出して、眼、発疹もしくは蕁麻疹のかゆみ；鼻汁の流れ；唇、
舌および顔面の腫れ；喉のかゆみもしくは締付け；腹部の痛み；吐き気；下痢；
および呼吸の逼迫をもたらす。重篤なアナフィラキシー性反応を起こす個人もい
て、米国では毎年135人が死亡している。米国では、毎年2,500を超える緊急入院
（emergency room visits）がアレルギーに関連している。食物アレルギーに対
する治療法はなく、食物の回避のみが症候群を予防しうる。例えば、コムギアレ
ルギーの患者はコムギまたはグルテン含有食物を避けなければならない。小麦グ
ルテンは多くの加工食物に含まれるごく普通の成分である（Marxら, 1999）。
【００８７】 多くのアレルゲンに共通する特徴は、アレルゲンの消化に対する抵抗性に寄与
する1以上のジスルフィド結合の存在であり（Astwoodら, 1996）、それによって
IgE免疫応答をしかける粘膜細胞にアレルゲンが提示される小腸と反応するとき
にほとんど無傷でありうる。多くのアレルゲンは不溶性貯蔵タンパク質、すなわ
ちグリアジンおよびグルテニンであることがわかっている。可溶性貯蔵タンパク
質、すなわちアルブミンおよびグロブリンはかなり弱いものである（Buchananら
, 1997）。これらのタンパク質のアレルゲン性は、チオレドキシン処理およびジ
スルフィド結合還元後、実質的に低下する。
【００８８】 本発明のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部分を使
って作った食用製品、例えば、パン、クッキー、ドー、増粘剤、飲料、麦芽、麺
類、食品添加物は、動物用飼料を含めて、アレルゲン性が低減されているため、
アレルギー応答の治療に使用しうる。本明細書では、症候群の「治療」または「
軽減」は、症候群の予防または確率の低減を意味する。
【００８９】 また種子もしくは穀粒の消化性の増大によって、そのような穀粒を消費できな
いヒトおよび動物が穀粒をより広く消費しうる。例えば、ソルガム（sorghum）
は、メートルトンで表してコムギ、イネ、トウモロコシ、およびオオムギに次ぎ
世界第5位の主要穀粒であって、米国の生産ではトウモロコシおよびコムギに次
いで第3位である。ソルガムの使用が制約される理由の一部は、他の穀粒と比較
してそのタンパク質およびデンプンの消化性に関連する困難にある。ソルガムタ
ンパク質およびデンプンの消化性の困難は、種子の構造およびタンパク質がデン
プンと結合する様式に関係がある。ソルガム品種からのデンプン粉末の消化性は
、例えばトウモロコシよりも15-25%低い。多分、さらに顕著な事実は、他の穀粒
と異なり、未加工のソルガム粉末の不消化性は、アフリカで通常実施される水中
での煮沸後に著しく増加する。ヒト被験者についての研究では、調理したソルガ
ム粥のタンパク質消化性は46%と低いが、調理したコムギ、トウモロコシおよび
イネの消化率（％）はそれぞれ81%、73%および66%であった（Mertzら, 1984, Ma
cLeanら, 1981）。外因性の還元剤添加によって、デンプンの消化性が増加する
（Hamakerら, 1987）。しかし、増加したチオレドキシン量を植物発生または形
態学に悪影響を与えない方法で発現させることによる種子におけるin vivoでの
チオレドキシン系操作の有効性は、今まで実証されてなかった。従って、本発明
のトランスジェニック植物は、デンプンおよび／またはタンパク質成分の消化性
を増加することにより、食物源としての種子もしくは穀粒のより広い使用を提供
する。本発明のトランスジェニック種子もしくは穀粒はまた、外因性還元剤を添
加することなく、これらの穀粒から作られるヒト用食品および動物用飼料の消化
性を増加する利点を提供する。さらに、消化性の増大によって、食物または飼料
の利用性が高まり、すなわち、本発明のトランスジェニック種子もしくは穀粒を
含有する食用製品またはそれらの抽出物を消費するヒトまたは動物は、栄養をよ
り効率的に吸収し、従って非トランスジェニック食品と比較して必要な消費量は
少ない。他の実施形態においては、本発明のトランスジェニック種子、穀粒また
はそれらの抽出物およびそれらの抽出物または食品を、食品または飼料の添加物
として使用する。例えば、本発明のトランスジェニック種子もしくは穀粒から作
った抽出物または粉末もしくは麦芽を非トランスジェニック食品または飼料製品
に添加して、非トランスジェニック食品の消化性を改良しもしくはアレルゲン性
を低減するか、または食品の強度および／もしくは容積を増加するなどにより食
品全体の品質を改良する。
【００９０】 本発明の実施形態の例を以下に記載する。
【００９１】実施例 実施例１ トランスジェニックオオムギにおけるコムギチオレドキシンh(WTRXh)の発現 それぞれ13.5-KDa WTRXhタンパク質をコードする384-bp wtrxh断片を含有する
4つの異なるDNA構築物を作製した。4つの構築物を図1に図解しかつ以下に説明す
る。それぞれの構築物は、種子特異的プロモーター（オオムギ胚乳特異的D-ホル
デインもしくはB1-ホルデインプロモーターまたはトウモロコシ胚特異的グロブ
リンプロモーター）と機能しうる形で連結された384-bp wtrxh断片を含むもので
ある。さらに追加の構築物は、B1-ホルデインプロモーターおよびB1-ホルデイン
シグナル配列と機能しうる形で連結された384-bp wtrxh断片を含むものである（
図6）。使用する形質転換ベクターは、ビアラホス（bialaphos）耐性を与えるba
r遺伝子を含む。ビアラホス選択後に28の独立した再生可能なオオムギ系統を得
て、それらは全てbar遺伝子に対してPCR-ポジティブであった。PCRおよびDNAハ
イブリダイゼーション分析によって、28の独立系統のゲノム中にwtrxh遺伝子の
存在を確認した。WTRXhタンパク質の発現は、ウェスタンブロットにより、精製
コムギチオレドキシンを対照として使って評価した。トランスジェニックオオム
ギ中に発現されたWTRXhは、天然のオオムギTRXhとは異なるがWTRXhとは同一の分
子量を有した。WTRXhはトランスジェニックオオムギ植物の発育および成熟種子
中に高度に発現されることを見出したが、発現レベルはトランスジェニック事象
間で異なっていた。平均して、B1-ホルデインプロモーター＋シグナルペプチド
配列を含有するDNA構築物を用いて形質転換した系統の方が、シグナルペプチド
配列を含有しない同じプロモーターの場合よりも高い発現レベルが観察された。
トランスジェニックオオムギ種子から精製したWTRXhは生化学的に活性であるこ
とを確認した。
【００９２】A.材料および方法 形質転換のための植物材料 2列のオオムギ春品種、Golden Promiseを、先に記載されたように（Wanおよび
Lemaux 1994；Lemauxら, 1996）育成室で育てた。
【００９３】コムギチオレドキシンh発現ベクターの構築およびDNA配列決定 オオムギ胚乳特異的B1-もしくはD-ホルデインプロモーターまたはトウモロコ
シ胚特異的グロブリンプロモーターにより駆動されるコムギチオレドキシンh遺
伝子（wtrxh）を含有する発現ベクターを構築した。プラスミドは次のとおり構
築した。
【００９４】 (1)pDhWTRXN-2：384-bpのwtrxhコード領域を、pTaM13.38（Gautierら, 1998）か
ら、PCRにより増幅した。wtrxhのcDNAを含有するこのプラスミドをテンプレート
として使い、次のプライマーWtrxh1（5'-atatctagaATGGCGGCGTCGGCGGCGA）（配
列番号5）およびWtrxh2R (5'-atagagctcTTACTGGGCCGCGTGTAG)（配列番号6）をそ
れぞれ用いてXbaIおよびSacI部位を作製した（図1）。プライマーの小文字はwtr
xh遺伝子を含有するDNA断片のサブクローニング用の制限酵素切断部位を記し、
下線を引いた文字はwtrxh配列を記す。wtrxh発現のためのATG開始コドンはWtrxh
1プライマーに含まれる。PCR反応はサーモサイクラー(MJ Research Inc., Water
town, MA)で、組換えTaq DNAポリメラーゼ（Promega. Madison, WI）を使い、10
0μl反応容積で実施した。反応バッファーは10mM Tris-HCl(pH 9.0)、50mM KCl
、1.5mM MgCl2、0.1% Triton-X-100および50μMの各デオキシリボヌクレオシド
三リン酸を含有していた。PCR条件は、94℃で1分間、55℃で1分間および72℃で2
分間の25サイクル、ならびに72℃で7分間の最終伸長工程を使用した。プライマ
ーWtrxh1およびWtrxh2Rを用いて増幅したwtrxh断片を、0.7%アガロースゲルから
QIAquick（登録商標）ゲル抽出キット（Qiagen Inc., Chatsworth, CA）を使っ
て精製し、XbaIおよびSacIを用いて消化し、XbaI/SacIで消化したpUC19中にライ
ゲートしてpWTRXh-1プラスミドを作製した。PCR増幅したwtrxhコード領域断片の
ヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチドのチェーンターミネーション法に
より、製造者（United States Biochemical, Cleveland, OH）の指示に従ってSe
quienaseを使用して、2本鎖プラスミドテンプレートおよび規則的に間隔をおい
たプライマーを使って決定した。
【００９５】 pDhWTRXN-2は、pDhGN-2（オオムギ胚乳特異的D-ホルデインプロモーター（図7
）およびnos 3'ターミネーターを含有する）中のuidA遺伝子を、wtrxhコード配
列を含有するpWTRXh-1（pUC19中にPCR増幅したwtrxhコード領域を含有する）か
らのXbaI/SacI断片と置き換えることにより作製した。pDhGN-2を構築するために
、0.4-kbのD-ホルデインプロモーターをpDII-Hor3(Sorensonら, 1996；Choら, 1
999a)からPCRにより増幅した。このプラスミドは、テンプレートとして使われた
D-ホルデインプロモーター配列を含有し、次のプライマー：Dhorl（5'-ggcgcatg
cgaattcGAATTCGATATCGATCTTCGA-3'）（配列番号23）およびDhor2（5'-aactctaga CTCGGTGGACTGTCAATG -3'）（配列番号24）をそれぞれ用いてSphIおよびXbaI部位
を作製した。プライマー中の小文字はD-ホルデインプロモーター含有DNA断片の
サブクローニングのための制限酵素切断部位を含有し、下線を引いた文字はD-ホ
ルデインプロモーター配列を記す。PCR増幅したD-ホルデインプロモーター断片
をSphIおよびXbaIで消化し、p35SGN-3中のカリフラワーモザイク35S(CaMV 35S)
プロモーターと置き換えてpDhGN-2プラスミドを作製した。p35SGN-3は、CaMV 35
Sプロモーターを含有する3.0-kbのSphI-EcoRI断片、uidA（β-グルクロニダーゼ
、gus）遺伝子およびnosをSphI/EcoRI消化したpUC18中にライゲートすることに
より作製した。
【００９６】 (2)pdBhWTRX-1：pdBhWTRXN-1の構築は、pBhWTRXN-1を使って開始した。pBhWTR
XN-1は、オオムギ胚乳特異的B1-ホルデインプロモーターにより駆動されそしてn
os 3'ターミネーターにより終止するuidAを含有するpBhGN-1中のuidA遺伝子を、
wtrxhコード配列を含有するpWTRXh-1からのXbaI/SacI断片と置き換えることによ
って作製した。pBhWTRXN-1から、120-bpのHindIII-5' B1-ホルデインフランキン
グ領域を除去し、再びライゲートしてpdBhWTRXN-1構築物を作製した。
【００９７】 (3)pdBhssWTRXN3-8：HindIIIおよびAcyl部位をそれぞれ含有するプライマーBh
or7(5'-GTAAAGCITTAACAACCCACACATTG) (配列番号7)およびBhorWtrxh1R (5'-CCGA CGCCG CTGCAATCGTACTTGTTGCCGCAAT) (配列番号8)を、B1-ホルデインシグナルペプ
チド配列を含む0.49-kbのBl-ホルデイン 5’-領域（図6）の増幅のために使った
。B1-ホルデインのゲノムクローンを含有するλ2-4/HindIIIプラスミド（Brandt
ら, 1985；ChoおよびLemaux, 1997）をテンプレートとして増幅のために使った
。プライマーBhorWtrxh1 Rは重複するプライマーであり、wtrxhコード配列(下線
部)およびB1 ホルデインプロモーター由来の部分的シグナルペプチド配列を含有
するが、wtrxhのATG開始コドンを欠損する。pdBhssWTRXN3-8は、pDhWTRXN-2中の
D-ホルデインプロモーター(図7)を、B1-ホルデインプロモーター、そのシグナル
ペプチド配列および5' trxh遺伝子からの結合領域を含有する0.49-kbのPCR増幅H
indIII/AcyI断片と置き換えることにより作製した。このようにして、構築物pdB
hssWTRXN3-8は、オオムギ胚乳特異的B1-ホルデインプロモーターならびにそのシ
グナルペプチド配列（図6）、wtrxh、およびnosを含有する（図1）。ATG開始コ
ドンを含有するシグナルペプチド配列はwtrxh配列と直接結合し、2つの間に他の
アミノ酸配列は導入されなかった。これにより、WTRXhタンパク質が小胞体（ER
）内腔で正確な切断部位を有することが保証される。キメラ産物からのPCR増幅
断片の確実性はDNA配列決定により確認した。
【００９８】 (4)pGlb1WTRXN-1：ppGlb1 GUSプラスミド(LiuおよびKriz, 1996)からのトウモ
ロコシ胚特異的グロブリンプロモーターを含有する1.42-kbのHindIII/BamHI断片
を、pBluescript II KS(+)にライゲートしてHindIIIおよびXbaI部位を作製した
。pGlbWTRXN-1は次のように作製した。pDhWTRXN-2から0.49-kb HindIII/XbaIオ
オムギD-ホルデインプロモーターを除去するために、pDhWTRXN-2をHindIIIおよ
びXbaIを用いて制限酵素切断した。次に、0.49-kbのHindIII/XbaI D-ホルデイン
プロモーター断片（図7）の代わりに、1.42-kbのHindIII/XbaIトウモロコシグロ
ブリンプロモーターを、HindIII/XbaIで消化したpDhWTRXN-2中にライゲートして
pGlbWTRXN-1プラスミドを作製した。
【００９９】安定したオオムギ形質転換 シグナルペプチド配列を持つおよび持たないB1-ホルデインプロモーター（図6
）により、D-ホルデインプロモーター（図7）により、およびトウモロコシグロ
ブリンプロモーターにより駆動されるWTRXhを発現するオオムギの安定したトラ
ンスジェニック系統を、開示されたプロトコル（WanおよびLemaux 1994；Lemaux
ら, 1996；Choら, 1998a-c）の変法により取得した。未熟胚（IE）全体（1.0-2.
5mm）を無菌条件で除去し、胚盤側を下方にして、2.5mg/Lの2,4-Dおよび5μMのC
uSO4を含有するDCカルス誘導培地（Choら, 1998a-c）上に置いた。24±1℃にて
暗所におけるインキュベーションの１日後に、IEを胚盤側上方にして、マンニト
ールおよびソルビトールの等モル量を含有するDC培地に移して最終濃度0.4Mとし
た。浸透圧調節物質を用いた処理の4時間後に、IEをボンバードメントに使った
。金粒子（1.0μm）を、pAHC20（ChristensenおよびQuail, 1996）と次のプラス
ミド：pdBhWTRXN-1、pdBhssWTRXN3-8、pDhWTRXN-2およびpGlbWTRXN-1の1つとの1
:1モル比の混合物25μgを用いてコーティングした。微粒子発射（microprojecti
le）をPDS-1000 He 微粒子銃（biolistic）デバイス（Bio-Rad, Inc., Hercules
, CA）を使って1100 psiでボンバードメントした。ボンバードメントしたIEを、
DC培地上で5mg/Lビアラホスを用いて2〜3か月かけて選択した。選択[DC培地＋ビ
アラホス(明治製菓株式会社、横浜、日本)]と再生(FHG培地；Hunter, 1988)工程
の間では、ビアラホス耐性カルスを、2.5 mg/L 2,4-D、0.1 mg/L BAPおよび5.0
μM CuS04を含有する中間培地（DBC2；Choら, 1998a-c）へ移した。カルス誘導
および選択後のDC培地での培養は、薄暗い光条件（約10〜30μE、16時間-光） (
Choら, 1998a-c)のもとで実施した。再生したシュートは、ビアラホス3mg/Lを含
有する発根培地（植物ホルモンを含まないカルス誘導培地）を含有するマジェン
タ（Magenta）ボックスに移した。シュートがボックスの頂部に到達したときに
、小植物を温室の土壌に移した。
【０１００】細胞学的分析 トランスジェニックオオムギ植物の細胞学的分析のために、健康な根分裂組織
(root meristem)を温室で育てた若い植物から採集した。４℃にて飽和1-ブロモ
ナフタレン溶液中で一晩前処理した後、根分裂組織を１：３の氷酢酸:エタノー
ル中で固定し、４℃にて保存した。根分裂組織を、1M HCl中で、60℃にて５〜７
分間、加水分解し、フォイルゲン(Feulgen)溶液で染色し、1滴の1%アセト-カル
ミンを加えてガラススライド上で押しつぶした。植物当たり少なくとも5つの十
分広げた細胞から、染色体を数えた。
【０１０１】除草剤適用 T0植物およびそれらの子孫の除草剤感度を決定するため、４〜５葉段階の葉身
のセクションを、綿棒を使い、0.25%(v/v) BastaTM溶液(開始濃度200g/Lホフィ
ノトリシン(phophinothricin, Hoechst AG, Frankfurt, Germany))＋0.1% Tween
20を塗布した。除草剤適用の一週間後に植物を切断した。
【０１０２】ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびDNAブロットハイブリダイゼーション 葉組織からの全ゲノムDNAを、Dellaporta(1993)が記載したように精製した。
形質転換したと推定される系統のゲノムDNA中のwtrxhの存在を試験するために、
250ngのゲノムDNAをPCRにより次の2つのプライマーセットのうちの１つを使って
増幅した： セット1： Wtrxh1 (5'-ATATCTAGAATGGCGGCGTCGGCGGCGA) (配列番号5)および Wtrxh2R (5'-ATAGAGCTCTTACTGGGCCGCGTGTAG) (配列番号6)；または セット2： Wtrxh4 (5'-CCAAGAAGTTCCCAGCTGC) (配列番号11)および Wtrxh5R (5'-ATAGCTGCGACAACCCTGTCCTT) (配列番号19)。
【０１０３】 barの存在を次のプライマーセットを使って確認した： BAR5F (5'-CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC3') (配列番号13)および BAR1R (5'-ATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCG) (配列番号14)(Lemauxら、1996)。
【０１０４】 Taq DNAポリメラーゼ(Promega, Madison, WI)を含む反応液25μlを用いて増幅
した(Choら、1998a-c)。ローディング色素を加えたPCR産物25μlを、エチジウム
ブロミドを加えた1.0%アガロースゲル中で電気泳動にかけ、紫外線に曝露して写
真を撮影した。0.4および0.14kb断片の存在は、無傷および末端切断wtrxh断片と
それぞれ一致した；内部0.34kb断片がbar遺伝子からbarプライマーを用いて作製
された。wtrxhに対するホモ接合系統を、T2またはT3植物についてPCRおよびウェ
スタンブロット分析によりスクリーニングした。
【０１０５】 DNAハイブリダイゼーション分析については、各系統の葉組織からの全ゲノムD
NA 10μgをHidIIIおよびSacIを用いて消化し、1.0%アガロースゲル上で分離し、
Zeta-Probe GT膜(Bio-Rad, Hercules, CA)へ移し、そして放射性標識したwtrxh
特異的プローブと製造者の指示に従ってハイブリダイズさせた。pDhWTRXN-9から
のwtrxhを含有する0.4kb XbaI-SacI断片を、QlAEXゲル抽出キット(QIAGEN, Chat
sworth, CA)により精製して、32P-dCTPでランダムプライマーを使い標識した。
【０１０６】ウェスタンブロット分析 ウェスタンブロット分析を、選択したトランスジェニック系統からの種子、な
らびにトランスジェニック植物と同じ条件下で育てた非トランスジェニックGold
en Promiseからの対照オオムギ種子およびデュラムコムギ(durum wheat)種cv. M
onroeもしくはパンコムギ種cv. Capitaleの対照コムギ種子からの種子について
行った。全種子を、液体窒素下で乳鉢および乳棒を使って微粉に粉砕した。各サ
ンプル用に10〜20個の種子を使った；抽出バッファー(50mM Tris HClまたはリン
酸バッファー、pH 7.8、0.5 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド[PMSF]、1m
M EDTA)の容積は、使用する種子数および抽出物の粘度によって２〜４mlで変化
した。粉砕をバッファー添加後、さらに1分間続けた；次に混合物を14,000×gで
10分間遠心分離して、上清溶液をチオレドキシンを含有するアルブミン-グロブ
リン画分として保存した。
【０１０７】 アルブミン-グロブリン画分のSDS-PAGEを、12〜17%ポリアクリルアミド勾配ゲ
ルでpH 8.5にて行った(Laemmli, 1970)。それぞれのサンプルからBradford(1976
)に従って定量した等量のタンパク質(約40μg)を、Laemmliサンプルバッファー
中に１：２ v/vで希釈し、３分間煮沸し、ゲルに載せ、15mAの定電流で電気泳動
にかけた。タンパク質を、40Vの定電圧で４時間４℃にてHoefer Transphor Tran
sferユニット(Alameda, CA)を使ってニトロセルロースに移行させた。ニトロセ
ルロースを粉ミルク5%を含むTBSを用いて2時間、室温(RT)にてブロックし、１次
抗体とともに４時間室温で、また２次抗体とともに１時間室温でインキュベート
した。１次抗体は１:500に希釈したコムギ抗チオレドキシンh II Ab(Johnsonら
、1987b)；２次抗体は１:3000に希釈したヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ(
Bio Rad, Hercules CA)であった。ブロットはNBT/BCIPアルカリホスファターゼ
発色剤中でBio-Radの指示に従って発色させ；ゲルはクーマシーブルーを用いて
染色し移行を確認した。画像はBio-Rad GelDoc 1000 (Hercules, CA)を使ってス
キャンし、Bio-Rad Multi Analyst, version 1.0.2を使って分析した。全てのバ
ンドはバックグラウンドとして比較しうる密度の矩形を使い、同じ面積にわたっ
てスキャンした；結果はスキャン容積の%として表現した。数字は全容積のパー
セントを表す(ピクセル密度×スキャンしたバンドの面積)。
【０１０８】WTRXh活性測定 抽出用材料の調製 様々なへテロ接合およびホモ接合トランスジェニック系統由来の成熟子実をア
ッセイの開始材料とした。D-ホルデインプロモーターをもつヘテロ接合系統は、
GPDhBarWtrx-5、GPDhBarWtrx-9-1、およびGPDhBarWtrx-9-2であった。B-ホルデ
インプロモーターをもちシグナル系統をもたないヘテロ接合系統は、GPdBhBarWt
rx-2、-5、-9、-19およびGPdBhBarWtrx-20であった。B-ホルデインプロモーター
＋シグナル系統をもつヘテロ接合系統は、GPdBhssBarWtrx-2、-7、GPdBhssBarWt
rx-29、GPdBhssBarWtrx-20、GPdBhssBarWtrx-14、GPdBhssBarWtrx-22であった。
シグナル配列をもつホモ接合系統は、GPdBhssBarWtrx-2-17、GPdBhssBarWtrx-2-
17-1、GPdBhssBarWtrx-29-3およびGPdBhssBarWtrx-29-3-2であった。対照物質は
、非形質転換組織培養由来の系統、4-96、barだけを含有する形質転換系統、GPB
ar-l、ならびにヌル分離体系統、GPdBhssBarWtrx-29系統から誘導されたGPdBhss
BarWtrx-29-11およびGPdBhssBarWtrx-29-11-10を含んだ。
【０１０９】ゲル濾過用の(NH4)2SO4抽出物の調製 約15gのオオムギ子実をコーヒーグラインダーで粉末に粉砕し、バッファー[(5
0mM Tris-HClバッファー、pH7.9、1mM EDTA、0.5mM PMSF(フェニルメチルスルホ
ニルフルオリド)]、2mM θ-アミノ-n-カプロン酸および2mM ベンズアミジン-HCl
の80ml(１：４ w/v)を用いて、3時間、４℃で攪拌して抽出した。スラリーとリ
ンス液を合せて25,400×gで20分間、遠心分離にかけ、上清溶液をデカントして
グラスウールを通過させ、ペレットを小容積のバッファー中に再懸濁し、次いで
遠心分離により前述のように清澄化した。上清画分を合わせて、アリコートを取
り除き、残りをpH7.83から4.80に2Nギ酸を用いて調節して酸性化し；変性したタ
ンパク質を上記のように遠心分離によってアッセイの前に除去した。酸性化した
上清溶液のpHを、2N NH4OHを用いて7.91に再調節し、アッセイのためのアリコー
トを取り除いた。粉末(NH4)2SO4を最終濃度30%まで加え、サンプルを20分間、４
℃にて攪拌し、次いで上記のように遠心分離した。ペレットを捨てた。さらに(N
H4)2SO4を加えてデカントした上清溶液を90%飽和にして；サンプルを16時間、４
℃にて攪拌して、次いで上記のように遠心分離した。
【０１１０】 上清溶液を捨て、30〜90% (NH4)2SO4ペレットを30mM Tris-HCl、pH7.9のバッ
ファー中に再懸濁し、次いで40,000×gで15分間遠心分離にかけて清澄化した。
得た上清(30〜90% (NH4)2SO4画分)を透析チューブ(6,000〜8,0000MWカットオフ)
に加え、４℃にて固体スクロースに曝して容積を1/10倍とした。清澄化しかつ濃
縮した30〜90%(NH4)2SO4サンプルのアリコート(1ml)を保存し、残りのサンプル
は、予め平衡化した(30mM Tris-HCl、pH7.9、200mM NaCl)Sephadex G-50スーパ
ーファインカラム(2.5×90cm；〜400mL床容積)にペリスタポンプ(peristaltic p
ump)を用いて0.5mL/minの流速で装入した。タンパク質を、同じバッファーを用
いて同じ流速で溶出させて；１画分あたり150滴を採集した。選択した画分を使
い、Pharmacia Biotech Ultrospec 4000を使って280nmでの吸収を測定し、NADP-
MDH活性化プロトコル(以下を参照)に従ってTRXh活性をアッセイした。活性画分
をプールし、４℃にて保存し、次いで全NADP-MDH活性化活性をアッセイした。
【０１１１】熱処理抽出物の調製 約10gのオオムギ子実をコーヒーグラインダーで約30秒間粉砕して粉末とし、
１時間、室温にて上記のバッファー50mL中で振とうして抽出した。スラリーとリ
ンス液を合せて27,000×gで20分間、遠心分離にかけ、上清溶液をデカントして
グラスウールを通過させた。各サンプルのアリコート20mLを65℃にてサンプル温
度が60±1℃(〜10min)に達するまで加熱した。サンプルを60℃にてさらに10分間
保持し、次いで氷／水浴内で冷却した。冷却したサンプルを遠心分離し、上清溶
液を上記のようにスクロースによって濃縮し、-20℃にて保存した。凍結サンプ
ルを解凍し、遠心分離により14,000rpmにて10分間４℃にて清澄化した。全TRXh
活性を濃縮した上清画分について評価した。
【０１１２】NADP-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性化アッセイ チオレドキシンh活性を先の記載(Florencioら、1988；Johnsonら、1987a)に従
ってアッセイした。抽出物50〜120μl(活性に依存して)をDTTと一緒にプレイン
キュベートし、プレインキュベーション混合物0.16〜0.32μlをNADP-MDHアッセ
イに使った。対照アッセイは、NADP-MDH不在の同一画分について行った。ウェス
タンブロット分析は、電気泳動に10〜20% SDSポリアクリルアミドゲルを使い、
ニトロセルロース紙への移行は４時間、40Vとした点を除くと、上記のように行
った。
【０１１３】多重タンパク質画分の連続抽出 オオムギ子実10gをアルブミン(水溶性)、グロブリン(塩可溶性)、ホルデイン(
アルコール可溶性)およびグルテリン(Shewryら、1980)について順に抽出した。
オオムギ粉末に0.5M NaClを加えて1時間、25℃で攪拌し、塩可溶性タンパク質を
除去した。残留物から、２つの連続ホルデイン画分を、2%(v/v) 2-メルカプトエ
タノールの不在(ホルデイン-I)および存在(ホルデイン-II)のもとで50%-プロパ
ノールを用いて抽出した。残留物から、グルテリンを、1%(v/v)2-メルカプトエ
タノールおよび1%(v/v)ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.05Mホウ酸バッファ
ー、pH10を用いて抽出した。
【０１１４】タンパク質のin vitroモノブロモビマン(Monobromobimane；mBBr)標識 非形質転換およびトランスジェニック植物からの未成熟、成熟、または出芽種
子を、100mM Tris-HClバッファー、pH7.9中で粉砕した。反応を、Kobrehelら、(
1992)のプロトコルに従って行った。既知量のタンパク質を含有するバッファー
混合物70μlを、無処理のまま、またはDTTを用いて最終濃度0.5mMで処理した。2
0分間のインキュベーション後に、mBBr 100nmolを加え、反応をさらに15分間続
行した。反応を停止しかつ過剰のmBBrを誘導体化するために、10% SDS 10μlお
よび100mM 2-メルカプトエタノール 100μlを加えた。サンプルを15% SDS-PAGE
ゲルにアプライした。mBBrの蛍光は、ゲルを紫外線光源(365nm)を備えた光箱上
に置いて可視化した。タンパク質定量は、Bradford色素結合法(Bradford 1976)
によって行い、ウシ血清アルブミンまたはγグロブリンを標準として使用した。
【０１１５】プルラナーゼおよびインヒビターのアッセイ プルラナーゼ活性を測定するために、子実を暗箱で出芽させ、５日間25℃にて
記載(Kobrehelら、1992；Lozanoら、1996)のように保持した。各系統からのプレ
ートのセットは、それぞれの日の抽出物調製時に取り出した。細胞を含まない胚
乳抽出物は、所与の同齢集団(cohort)に属する同等の根および子葉鞘長をもつ10
〜20個の出芽子実のロットから調製した。胚乳を胚および他の組織から分離し、
1mM EDTAおよび0.5mM PMSFを補充したTris-HClバッファー(50mM、pH7.9)に加え
た(成長段階に依存して、組織対バッファーの重量／容積比で１：３〜１：６)。
氷上の乳鉢内で粉砕した後、サンプルを遠心分離(24,000×gにて10分間)により
清澄化し；上清画分を回収し、プルラナーゼ分光光度アッセイまたはゲルアッセ
イ用に0.5mlアリコートを-80℃にて保存した。
【０１１６】 プルラナーゼ活性は、50mMクエン酸-リン酸バッファー(pH 5.2)中で、レッド
プルラン(Megazyme, Bray, Ireland)を基質として使い、30分後に遊離した色素
を534nmにて分光光度法により37℃で測定して決定した(Serreら、1990)。また、
プルラナーゼはまた、7.5%アクリルアミド、厚さ1.5mmの1%レッドプルランを含
有する非変性活性ゲルを使ってアッセイした(Furegonら、1994)。ゲルをBio-Rad
Gel Doc 1000を使ってスキャンし、Bio-Rad MULTIANALYST, version 1.0.2を使
って分析した。プルラナーゼインヒビター活性は、プルラナーゼを加熱して(70
℃にて15分間)不活性化した画分について、加えた精製オオムギ麦芽プルラナー
ゼを阻害する活性を測定して決定した。内因性プルラナーゼ活性は、この熱処理
により完全に消失するが、インヒビター活性は影響を受けないことがわかってい
る(Macriら、1993；MacGregorら、1994)。
【０１１７】チオレドキシンhを過剰発現するオオムギ子実のα-アミラーゼ活性 ヌル分離体およびホモ接合オオムギ子実からのアミラーゼ活性を、出芽および
初期実生成長の間、デンプンを含有するゲルを使って分析した。非変性ポリアク
リルアミド電気泳動ゲル(6%アクリルアミド、1.5mm厚)を調製し、全溶液からSDS
を除いたこと以外はLaemmli(1970)の方法により展開した。分離ゲルは0.5%可溶
性デンプン(Lintner potato starch, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含
有した。凍結乾燥したサンプルを蒸留水に溶解し、0.25M Tris-HCl、pH6.8、50%
グリセロール、0.04%ブロモフェノールブルー、および3mM CaCl2からなるバッフ
ァーと１：１で混合した。サンプルタンパク質50μgを各レーンに加えた。電気
泳動は、ゲル当たり80ミリアンペアで４℃にて、色素の前線がゲルの末端にくる
まで(通常４〜５時間)行った。電気泳動の後に、ゲルを、0.1Mコハク酸バッファ
ー、pH 6.0 100ml中で１〜２時間、37℃にてインキュベートした。次いでゲルを
５分間、2.5mM I2および0.5M KIを含有する溶液中で染色した。ゲルを蒸留水中
で洗浄した。アミラーゼ活性を含有する白色領域を除いて、ゲルは暗青色に染ま
った。
【０１１８】等電点電気泳動(IEF) αアミラーゼアイソザイムのパターンを決定するために、形質転換したオオム
ギおよび対照(形質転換してない)オオムギの乾燥および出芽子実からの抽出物を
、４℃にて電気泳動[X cell IIシステム(NOVEX, San Diego, CA)を使い、1.0mm
厚、pH３〜10等電点電気泳動(IEF)ポリアクリルアミドゲルにて]により分離した
。カソードバッファーは20mMアルギニン、および20mMリシンを含有し；アノード
バッファーは7mMリン酸であった。サンプルを１：１および２×IEFサンプルバッ
ファーpH ３〜10(NOVEX)と混合した。サンプル適用(20μg／レーン)後、ゲルを
定電圧［100Vで1時間、200Vでさらに１時間、および500Vで30分間］で展開した
。IEF標準(BioRad)を使ってゲルのpH勾配を決定した。
【０１１９】IEFゲルの多重抗体プローブ探索(probing) αアミラーゼアイソザイムのウェスタンブロット分析を、Mini Trans-Blot El
ectrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad)を使って行った。ヌル分離体およびコ
ムギチオレドキシンhを過剰発現するホモ接合系統からの種子抽出物を、IEFゲル
により上記のように分離した。タンパク質を、定電圧100Vで１時間、４℃にて0.
75%酢酸をブロッティングバッファーとして使い、ニトロセルロースに移行させ
た。ニトロセルロースを、粉ミルク5%を含むTrisバッファー溶液(20 mM Tris HC
l、pH7.5、0.15M NaClを補充した)を用いて１時間室温にてブロックし、１次抗
体とともに４時間室温にて、次いで２次抗体とともに１時間室温にてインキュベ
ートした。１次抗体は１:1000に希釈した抗オオムギαアミラーゼB；２次抗体は
１:3000に希釈したヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ(Bio Rad)であった。ブ
ロットをNBT/BCIPアルカリホスファターゼ発色剤中でBio-Radの指示に従って発
色させ、それにより交差反応したα-アミラーゼを青紫色にした。アイソザイム
パターンの完全な同一性を達成するために、ブロットをもう１回、別の１次抗体
、抗αアミラーゼA(１:1000に希釈)および２次抗体(上記の通り)を用いてプロー
ブ探索した。今回はブロットをナフトールリン酸／ファストレッドアルカリホス
ファターゼ発色剤中でBio-Radの指示に従って発色させ、これによりαアミラー
ゼAをピンクに染色した。示したブロットはこの２重の探索方法にかけたもので
ある。
【０１２０】B．結果と考察 トランスジェニック植物の作製 ボンバードメントの1日後に、全胚を5mg/Lビアラホスを含むDC培地に移した。
第2選択プレート(5mg/Lビアラホス)への移行時に、個々のカルス胚からの全物質
を鉗子を使って小片(２〜４mm)に砕き、分離して保持した。続いての5mg/Lビア
ラホスでの２〜５選択継代(10〜20日間隔)の間に、より力強い成長の確証を示す
カルス片を新しい選択プレートに移した。２回目の選択中に、いくつかのカルス
片は成長が抑制され、またカルス片が褐色になった場合もあった。一般的に形質
転換組織は３回以上の選択後に観察された。ビアラホス耐性組織をビアラホス(5
mg/L)を含む中間培地、DBC2またはDBC3(Choら、1998a-c)に移し、１〜２ヶ月間
成長させた後に3mg/Lビアラホスを含有するFHG培地で再生させた。緑色の小植物
を3mg/Lビアラホスを含有するマジェンタボックスに移した。ビアラホス選択後
に、28の独立した形質転換と推定される再生可能な系統を作製した(表１)。
【０１２１】
【表１】 T0植物およびそれらの子孫の分析 ２セットのWTRXhプライマーおよび１セットのBARプライマー(図１参照)を使い
PCR分析を行った。PCR増幅は、トランスジェニック系統から0.4-kb無傷wtrxhま
たは0.14kb末端切断wtrxh、および0.34-kb内部bar断片をもたらした。試験した2
8系統のうち、28はT0葉組織からbar断片を生じ、26はwtrxhに対するPCR増幅断片
を産生し、93%の同時形質転換頻度を与えた。９系統はpdBhWTRXN-1により、11系
統はpdBhssWTRXN-8により、５系統はpDhWTRXN-2により、そして１系統はpG1bWTR
XN-1により形質転換された(表１)。３系統(GPdBhBarWtrx-5、GPdBhssBarWtrx-21
およびGPDhBarWtrx-22)は不稔であった。選択されたwtrxhポジティブ系統からの
T1植物の種子およびその子孫を、ホモ接合系統をスクリーニングするために植え
た。ホモ接合系統およびヌル分離体を、GPdBhssBarWtrx-2、-29およびGPDhBarWt
rx-9から得た(表１)。
【０１２２】トランスジェニック植物の細胞学的分析 独立して形質転換したT0オオムギ植物の根分裂組織中の染色体を数えた。試験
した28の独立トランスジェニック系統のうち、17系統は正常な２倍体染色体補体
(2n=2×=14)を有したが、残りの11系統は４倍体(2n=4×=28)であった(表１)。
【０１２３】トランスジェニック種子で作製されたWTRXhの特性決定および含量 以上考察したように、コムギチオレドキシンhを発現する複数の安定して形質
転換したオオムギ系統を得た。図２に示したように、シグナルペプチド配列を有
するB1-ホルデインプロモーターと連結したwtrxhの安定した導入により、トラン
スジェニックオオムギ種子の活性WTRXhの発現が大きく増加された。
【０１２４】 チオレドキシン遺伝子がシグナル配列と連結された３系統(GPdBhssBarWtrx-22
、GPdBhssBarWtrx-29およびGPdBhssBarWtrx-7)の可溶性タンパク質画分のウェス
タンブロット分析により、発現レベルの差が示された(表２に示した)。系統GPdB
hssBarWtrx-22、GPdBhssBarWtrx-29およびGPdBhssBarWtrx-7は、非形質転換対照
よりも、それぞれ22倍、10倍および5.5倍多いWTRXhタンパク質を示した。分析は
、ヌル分離体(GPdBhssBarWtrx-29-11)のチオレドキシン含量は対応する対照の約
半分であることを示した。また、チオレドキシン遺伝子がシグナル配列と結合し
ていない構築物から作製した3系統を非形質転換対照オオムギ種子と比較したが
、それらはウェスタンブロット分析の結果としてのTRXhレベルで、次の通りの増
加を示した：GPDhBarWtrx-9：12倍；GPDhBarWtrx-5：6.3倍；GPdBhBarWtrx-2：6
.4倍。ウェスタンブロットで探索すると、トランスジェニック系統は2つのバン
ドを示すが、対照オオムギは一般的に１つのバンドのみ、また場合によっては第
2の少量のバンドを示す。さらにトランスジェニック系統からの組織は、オオム
ギのバンドのいずれにも対応しないがコムギチオレドキシンhに対応する１つの
バンドによって特徴づけられた。これらのデータは、形質転換により導入された
タンパク質がコムギチオレドキシンhであることを示す。
【０１２５】
【表２】 オオムギ子実中のコムギチオレドキシンhは生物学的に活性である NADPHを酸化する他の酵素からの妨害があるため、TRXhの活性は粗製抽出物中
で正確にアッセイできないので、その部分的精製が必要である。様々なトランス
ジェニックおよび対照系統の部分的に精製された抽出物を、種子15gから、硫酸
アンモニウム分画およびゲル濾過クロマトグラフィーを使って調製した。活性を
NADP-MDH活性化アッセイを用いて測定した。これらのアッセイに基づくプロフィ
ールは、形質転換種子中のTRXhの活性が非形質転換対照より遥かに高いことを示
した(図２参照)。活性結果を表３にまとめた。
【０１２６】 B1-ホルデインプロモーターおよびシグナル配列を有して形質転換した２つの
系統(GPBhssBarWtrx-3；GPdBhssBarWtrx-29)の種子からの全WTRXh活性は、対照
の非形質転換種子の活性より、それぞれ約４倍、約10倍高かった。シグナル配列
を有さずD-ホルデインプロモーターを有して形質転換した系統(BGPDhBbarWtrx-5
)からの全活性は、非形質転換対照の活性よりわずかに(1.25倍)高いのみであっ
た(表3を参照)。トランスジェニック体において、チオレドキシンの比活性は、
全般的に約0.182 A340nm/min/mgタンパク質、またはヌル分離体を約２倍上回っ
ていた。
【０１２７】
【表３】 分析した限りでは、形質転換したオオムギ子実は、対照、非形質転換種子より
多くの全バッファー抽出タンパク質を有すると思われる。
【０１２８】 形質転換された子実は、少なくとも約10〜15μgチオレドキシン/mg可溶性タン
パク質(約２〜８μgチオレドキシン/mg組織)、またはヌル分離体より約２倍高い
チオレドキシン含量を有する。
【０１２９】 (NH4)2SO4過程は時間がかかり、かつ大量の種子を必要とするので、元来の抽
出方法を改変して熱処理工程を含ませた。この変更は、大腸菌(E.coli)WTRXhが6
0℃にて10分間の処理後に安定であるという事実(MarkおよびRichardson, 1976)
に基づいていた。２つの異なるトランスジェニックオオムギ種子(GPdBhBarWtrx-
3、GPdBhssBarWtr-29)由来のWTRXについての結果は、熱処理および非熱処理抽出
物間の活性に有意差がないことを示した(図３)。さらに熱処理は、このアッセイ
における内因性、非特異的活性を低下し、それによって測定の信頼性を高めた。
【０１３０】 10の異なるオオムギ系統(形質転換されたおよび形質転換されてないもの)を熱
処理工程を使って抽出し、NADP-MDHアッセイによりアッセイして、その結果を表
4にまとめた。一般的に、B-ホルデインプロモーターおよびwtrxhと連結されたシ
グナル配列を有して形質転換された系統からの種子の全WTRXh活性は、wtrxhと連
結された同じプロモーターをシグナル配列無しで有して形質転換された系統から
の種子または非形質転換対照からの種子の活性よりはるかに高かった(４〜35倍)
(表4)。この時点では、オオムギ種子中で発現されたコムギWTRXh全てが熱安定で
あるか否かは知られていない。
【０１３１】
【表４】 コムギチオレドキシンhを発現する安定した形質転換系統のうち、平均して、
そのレベルはシグナルペプチドを含有する構築物を有する形質転換体において、
該構築物を有しない形質転換体より高いことが見出された(表４)。GPdBhssBarWt
rx-7、GPdBhssBarWtrx-29、およびGPdBhssBarWtrx-22の3系統に由来する種子の
ヘテロ接合混合物からの可溶性タンパク質画分をウェスタンブロット分析したと
ころ、非形質転換対照より、それぞれ5.5倍、22倍、および10倍多いチオレドキ
シンhが示された(表２)。ヌル分離体(GPdBhssBarWtrx 29-11-10)のチオレドキシ
ン含量は対応する非形質転換対照の約半分であった。
【０１３２】 オオムギからの抽出物は、典型的には、１つの免疫学的反応性バンド(図4A、
レーン１および６において「B」で同定)を示したが、複数の移行では第2の微か
な、より速やかに移動するバンド(図４、レーン２)を示した。wtrxhを過剰発現
するトランスジェニック系統からの組織は、オオムギの２つの等価物のいずれと
も対応せず、コムギ由来のチオレドキシンhに対応するバンドによって特徴づけ
られた。過剰発現された13.5-kDaコムギおよび内因性13.1-kDaオオムギチオレド
キシンhの間の差は、特に、非標的チオレドキシンh遺伝子を用いて形質転換した
オオムギ系統において顕著である(図4A、ライン５および図4B、レーン１)。SDS/
PAGEにより様々なトランスジェニック系統を反復分析した結果、図4A-BでWによ
り同定されたバンドはオオムギにより導入されたパンコムギwtrxhに対応すると
いう結論を得た。5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DNTB)を用いる独立した
生化学アッセイ(Florencioら、1988.)では、オオムギNTRのコムギチオレドキシ
ンhを還元する能力を立証した(データは示してない)。
【０１３３】 子実の生化学的属性を評価する上で価値があるので、ホモ接合wtrxh系統を同
定し、ウェスタンブロットにより分析した。ホモ接合と同定された２つの系統は
、両方とも、それらのヘテロ接合の親および非形質転換対照と比較して、増加し
たチオレドキシンhの発現を示した。GPdBhssBarWtrx-29-3の分析を図5に示す。
非トランスジェニック対照およびヌル分離体子実に存在するチオレドキシンh(図
4に示された曝露では明らかでない)の実証には、強化したトランスジェニック調
製物の過剰曝露をもたらす条件が必要であることが認められた。親ヘテロ接合子
実中のチオレドキシンは生化学的に活性であることが示された。
【０１３４】チオレドキシンhを過剰発現するオオムギ子実におけるプルラナーゼおよびプル
ラナーゼインヒビター活性 プルラナーゼは、ジスルフィドインヒビタータンパク質を有する穀類の子実に
存在するデンプン分解酵素であり(Macriら、1993.；MacGregorら、1994.)、プル
ラナーゼの活性はチオレドキシンと関連している(Wongら、1995.)。NTR経由でNA
DPHにより還元されたチオレドキシンは、インヒビターのジスルフィド結合を還
元し、標的のプルラナーゼ酵素を活性化する。この関係があるので、チオレドキ
シンhを過剰発現する形質転換体中のプルラナーゼの活性を測定することは意味
がある。
【０１３５】 チオレドキシンhを過剰発現するホモ接合系統(GPdBhssBarWtrx-29-3)の形質転
換された子実からの抽出物の分光光度アッセイ(図8A)により、そのヌル分離体と
比較して、出芽開始の５日後のプルラナーゼ活性が３〜４倍の増加することが示
された。非変性活性ゲルを用いた別の実験でこれを確証する結果を得た。ゲルを
直接目視しても(図8B)、またゲルの活性を明白なバンドをスキャンし積分して評
価しても(図8C)活性の増加は明らかであった。異なる独立した形質転換事象から
単離したホモ接合系統(GPdBssBarWtrx-2-1-15)は類似した応答を示した(データ
は示してない)。トランスジェニック植物は、534nmにて約１〜２吸収ユニット/30m
in/mgタンパク質のプルラナーゼ活性を発現し、この値はヌル分離体より約2倍高
かった。
【０１３６】 加熱(70℃にて15分間)してプルラナーゼを不活性化した画分について、プルラ
ナーゼインヒビター活性を、添加した精製オオムギ麦芽プルラナーゼに対する該
画分の抑制効果を測定することによって決定した。内因性プルラナーゼ活性は、
この熱処理により完全に消失するが、インヒビター活性は影響されないことが示
された(Macriら、前掲；MacGregorら、前掲)。比較しうる子実抽出物の分析によ
り、形質転換体およびヌル分離体の双方において、水添加の４日後および５日後
にプルラナーゼインヒビターが不活性であることが判明した。このように、これ
らの結果は３日後に観察されたプルラナーゼ活性の増加はトランスジェニック子
実中のインヒビターの高レベルの不活性化により引起されたのでないことを実証
する。チオレドキシンが、プルラナーゼのde novo合成(Hardieら、1975)を増加
することによって、または成熟酵素のデンプン胚乳との結合を低下することによ
って、作用することが考えられる。成熟胚乳のプルラナーゼの一部は結合した形
で存在し、還元条件により可溶化され得ることは立証されている(Sissonsら、19
93.；Sissonsら、1994)。
【０１３７】チオレドキシンhを過剰発現するオオムギ殻粒中のαアミラーゼ活性 プルラナーゼのように、同様のデンプン分解性酵素であって、ジベレリン酸に
より誘導されるαアミラーゼは、長年、出芽に重要であると考えられてきた。こ
の酵素の主要な(B)型および少数の(A)型の合成は、ホルモン、ジベレリン酸(GA)
が引き金となることが分かっている。さらに、αアミラーゼ活性はin vitroでチ
オレドキシンhによるそのジスルフィドインヒビタータンパク質の還元不活性化(
NADPHおよびNADP-チオレドキシンレダクターゼの存在のもとで)により増加する
。形質転換されたオオムギ種子についての本実施例の結果は、プルラナーゼのよ
うに、チオレドキシンh発現がαアミラーゼ活性を改変することを示す。この場
合、出芽の間、酵素の出現は加速されかつその存在量および活性は増加する。
【０１３８】 図9A〜Dは、出芽および実生成長中のαアミラーゼ(A型＋B型)の存在量と活性
の両方に初期増加があることを示す。ウェスタンブロットにおける抗体応答に基
づくと、トランスジェニック殻粒においてはαアミラーゼは出芽開始の３日後に
最初に検出された(図9C)が、ヌル分離体においては酵素は４日後まで現れなかっ
た(図9A)。活性の開始(活性ゲルに基づいて)は類似したパターンで後を追った(
図9Bおよび図9D)。活性ゲル中の酵素移動度もまた、形質転換された殻粒におけ
る活性の初期誘導を反映した(図10)。初期に現れる活性のこの増加の大部分がB(
ジベレリン酸と連結した型)に起因することは、図11により支持される。ここで
、酵素の少数のA型(これもジベレリン酸に依存する)のレベルが同様に、チオレ
ドキシンhを過剰発現する殻粒中で増加したことが観察される。再び、主要な(B
型)αアミラーゼ酵素の顕著なレベルでの出現が１日早まった。
【０１３９】チオレドキシンhを過剰発現するオオムギ殻粒の出芽 以下、特に言及しない限り、全ての操作は25℃にてKobrehelら、1992およびLo
zanoら、1996が記載した条件下で行った。殻粒は、0.25%漂白剤中で30分間連続
攪拌して表面を無菌化した。無菌蒸留水を用いてよく洗浄して、漂白剤を除去し
た。30個の無菌化したヌル分離体(GPdBhssBarWtrx-29-22-10、このトランスジー
ンは自家受粉植物と交雑することによって同系統から除去された)の種子および3
0個の無菌化ホモ接合(GPdBhssBarWtrx-29-3)の種子を、無菌蒸留水15mlを用いて
湿らせたワットマン#1濾紙を３層備えた一連のプラスチック製ペトリ皿(直径12.
5cm)それぞれの中に置いた。プレートをアルミニウム箔で包み、殻粒を暗箱内で
20℃にて７日まで出芽させた。図21に示した各時点において、１枚のプレートを
読んだ。最初の日(インキュベーション開始から24時間まで)のパーセント出芽は
、幼根の出現を観察することによって決定した。後続する日については、パーセ
ント出芽は、出芽殻粒の子葉鞘および根の長さを測定することにより決定した実
生成長を表す。
【０１４０】 図21に示した結果は、コムギチオレドキシンhを過剰発現するトランスジェニ
ックオオムギにおける出芽は、インキュベーション開始の約16時間後に、種子の
約25〜30%で検出されることを示す。対照的に、ヌル分離体においては、出芽は1
6時間に検出されず、１日目の８時間で初めて検出された。従って、トランスジ
ェニック体では、出芽は約８時間早まった。しかし、第１日に、出芽は、約70%
、またはヌル分離体対応物と比較して約２倍の数のトランスジェニック殻粒で検
出された。トランスジェニックの出芽開始が図10に示したαアミラーゼの検出開
始と平行するのが認められることは興味深い。
【０１４１】トランスジェニックオオムギ殻粒からの殻粒タンパク質の連続抽出 10個の乾燥殻粒または実生(上記の出芽したもの)から単離した胚乳を乳鉢およ
び乳棒により４℃にてTris-HClバッファー 3mlを加えて以下に示すように粉砕し
た。ホモ接合GPdBhssBarWtrx-29-3およびヌル分離体GPdBhssBarWtrx-29-22-10殻
粒の個別の混合物を、5-mlスクリュートップの遠心チューブ中に置いた。殻粒を
機械的に30分間振とうし、ついで10分間24,000×gにて遠心分離した。上清画分(
バッファー可溶性)をデカントして分析用に保存し、残留物を逐次的に、次の溶
媒を用いて表示した時間にわたり抽出した：[1]0.5M NaCl(30分間)；[2]水(30分
間)；[3]２×50%プロパノール(2時間)；[4]２×50%プロパノール+2% 2-メルカプ
トエタノール(MET)(2時間)；および[5]1% SDSと2% 2-メルカプトエタノールを含
む0.5Mホウ酸バッファー、pH 10(2時間)。抽出物全ての上清画分の容積およびタ
ンパク質含量(クーマシー色素結合法により)を測定し、次いで使用するまで-20
℃にて保存した。便宜上、画分を次のように名付ける：[1]アルブミン／グロブ
リン(バッファー／塩／水)；[2]ホルデインI(プロパノール)；[3]ホルデインII(
プロパノール＋MET)；および[4]グルテリン(ホウ酸／SDS／MET)(Shewryら、1980
)。これらの画分を使って、タンパク質含量、水溶性および不溶性画分間のタン
パク質分布、全可抽出性タンパク質、およびNADPHを用いる還元を測定した。
【０１４２】 出芽中および実生成長中のトランスジェニックオオムギ殻粒からのタンパク質
のin vivo酸化還元状態を決定するために、2mM mBBrをTris粉砕バッファー中に
含ませかつ粉砕を液体窒素下で実施するという改変をして、前述の抽出過程を繰
り返した。mBBr誘導体化したタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル(1.5mm厚
、10〜20%ゲル、pH8.5)(Laemmli, 1970)上で電気泳動にかけた。ゲルを16時間、
定電流8mAにて展開した。電気泳動の後、ゲルを12%(w/v)トリクロロ酢酸中に置
き、4〜6時間、溶液を1回変えて浸漬し、タンパク質を固定した；次いでゲルを4
0%メタノール/10%酢酸の溶液に移して8〜10時間振とうし、残留mBBrを除去した
。ゲルを紫外線光源(365nm)を備えた光箱上において、mBBrの蛍光(遊離およびタ
ンパク質結合したmBBr)を可視化した。過剰(遊離)mBBrの除去後、ゲルの画像をG
el Doc 1000 (Bio-Rad)によりキャプチャーした。
【０１４３】 泳動させた抽出物の等価タンパク質量を確かめるために、SDSゲルをクーマシ
ーブリリアントブルーG-250を含む10%酢酸を用いて30分間染色し、続いて電子レ
ンジを使い10%酢酸を用いて30分間脱染色した。蛋白質染色されたゲルを上記のG
el Doc 1000によりキャプチャーした。
【０１４４】 ゲル上の蛍光(ピクセル×mm×mm)およびタンパク質(光学密度×mm×mm)の数値
化を、画像解析用ソフトウェアプログラム、Multi Analyst、バージョン1.0 (Bi
o-Rad)によって行った。相対的還元は蛍光のタンパク質に対する比として表され
た。
【０１４５】 表5、表6、および表7に示された2つの実験結果は、ヌル分離体と比較して、パ
ーセント殻粒およびパーセント重量基準で、トランスジェニックオオムギにおけ
る全タンパク質の増加を示す。トランスジェニック体は、ヌル分離体より少なく
とも2倍高いチオレドキシン含量(10〜15μg/mg可溶性タンパク質；２〜８μg/g
組織)を有する。データは、抽出し得る全タンパク質の増加は、最も可溶性の高
いアルブミン／グロブリン画分への該タンパク質の再分布の結果であることを示
す。トランスジェニック体におけるタンパク質の可溶性画分への再分布の増加は
、対照より少なくとも５%高い。
【０１４６】
【表５】
【０１４７】
【表６】
【０１４８】
【表７】
【０１４９】 出芽中の殻粒および乾燥殻粒での、トランスジェニックおよびヌル分離体オオ
ムギ殻粒に含まれるタンパク質画分の相対的酸化還元状態(SH:SS比)の分析結果
を図22に示す。乾燥トランスジェニック殻粒においては、ヌル分離体と比較して
の、還元状態の最高の増加はホルデインI画分で観察された。この増加は、ホル
デインIIおよびグルテリン画分の相対的酸化還元状態の減少と平行したが、アル
ブミン/グロブリン画分の相対的酸化還元状態は不変であった。トランスジェニ
ック体の相対的酸化還元状態は、ヌル分離体と比較して少なくとも5:1であった
。
【０１５０】 出芽中に、アルブミン/グロブリン画分は次第に増加し、第４日に約1.5の相対
的酸化還元比(SH:SS比)に到達する。ホルデインIIおよびグルテリン画分の相対
的酸化還元状態も同様に出芽中に増加するが、ヌル分離体と同程度に達するのみ
である。対照的にホルデインI画分の相対的酸化還元状態の変化は大きい。
【０１５１】 以上の例に従って、他種の植物を類似した方法で形質転換すると、チオレドキ
シンを過剰発現するトランスジェニック植物、例えば、トランスジェニックコム
ギ(以下に記載)、イネ、トウモロコシ、カラスムギ、ライムギ、ソルガム(以下
に記載)、ミレット、ライコムギ、飼料作物、芝草、ダイズ、リママメ、トマト
、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、タバコなどが作製される。さらに、コムギチオレ
ドキシンまたはチオレドキシンh以外のチオレドキシンを本発明の概念に沿って
使用できるのも理解される。このような例は、ホウレンソウh、葉緑体チオレド
キシンmおよびf、細菌チオレドキシン(例えば、大腸菌(E.coli))、酵母、および
動物などが含まれる。
【０１５２】実施例２ チオレドキシンhおよびシロイヌナズナ（Arabidopsis）NTRを過剰発現するトラ
ンスジェニックコムギ穀粒 A．材料および方法 植物材料 コムギの春品種、Bobwhite、AnzaおよびYecora Rojoを、先の記載（Wanおよび
Lemaux 1994；Lemauxら, 1996）のように温室で栽培した。冬コムギ品種、Karl
の10〜14日齢の出芽植物を4℃にて45〜60日、暗所でインキュベートして春化処
置した。
【０１５３】コムギ発現ベクター コムギ形質転換のため、オオムギ胚乳特異的B1-またはD-ホルデインにより駆
動される、合成緑色蛍光タンパク質遺伝子[sfgp(S65T)]、コムギチオレドキシン
h（wtrxh）またはシロイヌナズナ（Arabidopsis）ntr発現ベクターを次のとおり
構築した： (1)pDhSSsGFPN3-4：D-ホルデインプロモーター-シグナル配列-sgfp(S65T)-nos
を含有するキメラDNA構築物を、PCRによる部位指定突然変異誘発(ChoおよびLema
ux 1997)の改変法を使って、取得した。3つのプライマー手順を使った。より短
い0.5-kbの断片DHORSSを、PCRにより第1反応で、プライマー、Dhor4（5'-agaaag
cttggtaccCTTCGAGTGCCCGCCGAT-3'；配列番号9)およびDhorSSsGFP1R（5'-GAACAGC
TCCTCGCCCTTGCTCACAGCGGTGGTGAGAGCCACGAGGGC-3'；配列番号10）を使い、D ホル
デインのゲノムクローンを含有するテンプレートpHor3-1（Sorensenら, 1996）
を用いて作製し、そしてこの第1PCR産物（メガプライマー）を50倍希釈した。Dh
orSSsGFP1Rはオーバーラッピングプライマーで、D-ホルデインプロモーターから
のsgfp(S65T)コード配列および部分シグナルペプチド配列（下線部）を含有する
。第2PCR反応のために、希釈したメガプライマー（DHORSS）5μl、テンプレート
（pAct1IsGFP-1；Choら, 2000）20ngおよび外部プライマー[Dhor4およびNos1R(5
'-cggaattcGATCTAGTAACATAGATGACA-3'：配列番号17)]40pmolを1 X PCRバッファ
ー中で混合して最終容積100μlとした。pAct1IsGFP-1は、コメアクチン1プロモ
ーターおよびそのイントロンにより制御されてnosにより終止する合成gfp遺伝子
[sgfp(S65T)]（Chiuら, 1996）を含有する。得たキメラPCR産物をHindII および
EcoRIを用いて消化し、HindII/EcoRIで消化したpBluescript II KS(+)ベクター
に連結して、さらにPCR増幅断片[そのシグナルペプチド配列＋5' sgfp(S65T)と
の接合部領域をもつD-ホルデインプロモーター]のDNA配列決定により確認し、そ
してコムギの安定した形質転換のために使った。
【０１５４】 (2)pDhWTRXhN-2：384-bp wtrxhコード領域はwtrxh遺伝子のcDNAクローンを含
有するプラスミドpTaM13.38（Gautierら, 1998）をテンプレートとして利用して
PCRにより増幅し、プライマーWtrxh1（5'-atatctagaATGGCGGCGTCGGCGGCGA-3'；
配列番号5）およびWtrxh2R（5'-atagagctcTTACTGGGCCGCGTGTAG-3'；配列番号6）
をそれぞれ用いてXbaIおよびSacI部位を作製した（図12）；小文字はwtrxh遺伝
子を含有するDNA構築物のサブクローニング用の制限酵素切断部位を含有し、下
線部の文字はwtrxh配列を示す。wtrxh発現のためのATG開始コドンはWtrxh1プラ
イマーに含まれていた。PCR反応は、サーモサイクラー（thermocycler）(MJ Res
earch Inc., Watertown, MA)上で、組換えTaq DNA ポリメラーゼ(Promega, Madi
son, WI)を使い、100μl反応容積中で実施した。反応バッファーは、10mM Tris-
HCl (pH 9.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1% Triton-X-100、および各デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸 50μMを含有した。PCR条件は、94℃で1分間、55℃で
1分間および72℃で2分間の25サイクル、ならびに72℃で2分間の最終伸長工程で
あった。プライマーWtrxh1およびWtrxh2Rを用いて増幅したwtrxh断片は、0.7%ア
ガロースゲルからQlAquick(登録商標)ゲル抽出キット(Qiagen Inc., Chatsworth
, CA)を使って精製し、XbaIおよびSacIを用いて消化し、XbaI/SacIで消化したpU
C19中に連結して、pWTRXh-1プラスミドを作製した。PCR増幅したwtrxhコード領
域のヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法により、シーケナー
ゼ（Sequenase）を製造者(United States Biochemical, Cleveland, OH)の指示
に従って使い、2本鎖プラスミドテンプレートおよび規則的に配置されたプライ
マーを用いて決定した。pDhWTRXN-2は、pDhGN-2 中のuidA遺伝子（オオムギ胚乳
特異的D-ホルデインプロモーターおよびnos 3'ターミネーターを含有する；M.-J
. Cho未発表）をpWTRXh 1からのwtrxhコード配列を含有するXbaI/SacI断片と置
き換えることによって作った。
【０１５５】 (3)pdBhssWTRXhN3-8：HindIIIおよびAcyI部位をそれぞれ含有するプライマーB
hor7(5'-GTAAAGCTTTAACAACCCACACATTG-3'；配列番号7)およびBhorWtrxh1R (5'-C CGACGCCG CTGCAATCGTACTTGTTGCCGCAAT-3'；配列番号8)を使い、B1-ホルデインの
ゲノムクローンを含有するλ2-4/HindIIIプラスミド(Brandsら, 1985；Choら, 1
997)をテンプレートとして使って、B1-ホルデインシグナルペプチド配列を含む0
.49-kb B1-ホルデイン5'領域を増幅した。プライマーBhorWtrxh1Rはオーバーラ
ッピングプライマーであり、wtrxhコード配列（下線部）およびwtrxh用ATG開始
コドンなしのB1-ホルデインプロモーターからの部分的シグナルペプチド配列を
含有する。pdBhssWTRXhN3-8は、pDhWTRXN-2中のD-ホルデイン プロモーターを、
そのシグナルペプチド配列＋5'wtrxhとの接合領域を伴なうB1ホルデインプロモ
ーターを含有する上記0.49-kb PCR-増幅HindIII/Acyl断片と置き換えて作った。
従って、構築物pdBhWTRXN3-8は、そのシグナルペプチド配列を伴なうオオムギ胚
乳特異的B1-ホルデインプロモーター、wtrxhおよびnosを含有する（図12）。ATG
開始コドンを含有するシグナルペプチド配列を、直接wtrxh遺伝子の配列と結合
させ（Gautierら, 1998）、2つの間に余分なアミノ酸配列をもたないのは、WTRX
hタンパク質が小胞体（ER）内腔で正確な切断部位を提供するためであった。キ
メラ産物のPCR増幅断片をDNA配列決定により確認した。
【０１５６】 (4)pKBhssWTRXN-2：B1-オオムギホルデインプロモーターの0.55-kb 5'フラン
キング領域を得る目的で、pBhor-1をSphIおよびSacIを用いて消化した。0.55-kb
SphI/SacI断片をpSPORT 1 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)中に連結してpSPBho
r-4を作った。pdBhssWTRN3-8をHindIII/EcoRIを用いて消化し、0.43kbオオムギ
胚乳特異的B1-ホルデインプロモーター＋そのシグナルペプチド配列を含有する
該HindIII/EcoRI断片、wrxhおよびnosをHindIII/EcoRIで消化したpSPBhor-4中に
連結してpSPBhssWTRXN-4プラスミドを作製した。アンピシリン耐性遺伝子を除去
する目的で、pSPBhssWTRXN-4の1.3-kb SphI/EcoRI断片を、SphI/EcoRIで消化し
たカナマイシン耐性遺伝子を含有するpJKKmf(-)中に連結してpKBhssWTRXN-2を作
製した。こうして、カナマイシン-主鎖構築物、pKBhssWTRXN-2は、B1-オオムギ
ホルデインプロモーターの0.55-kb 5'-フランキング領域＋そのシグナルペプチ
ド配列、wrxhおよびnosを含有する（図12）。
【０１５７】 (5)pDhAtNTR-4：pDhAtNTR-4は、pDhWTRXN-2中のwtrxh遺伝子（上記）を、pAtN
TR（Dr. S.Y. Leeから入手)からのシロイヌナズナntrコード配列を含有するPCR
増幅したXbaI/SacI断片と置き換えて作った。プライマーAtNTR1（5'-ggtctagaAT GGAAACTCACAAAACC -3'；配列番号18)およびAtNTR2R（5'-gggagctcTCAATCACTCTTAC CCTC -3'；配列番号20)を使って0.993-Kb シロイヌナズナntrコード配列を含有す
る1.009-Kb XbaI/SacI断片を増幅した；小文字はシロイヌナズナntr遺伝子を含
有するDNA構築物のサブクローニング用の制限酵素切断部位を含有しかつ下線部
の文字はシロイヌナズナntr配列を示す。シロイヌナズナntr断片を、0.7%アガロ
ースゲルからQIAquick（登録商標）ゲル抽出キットを使って精製し、XbaIおよび
SacIを用いて消化し、XbaI/SacI消化したpDhWTRXN-2中に連結してpDhAtNTR-4プ
ラスミドを作製した。PCR増幅したシロイヌナズナntrコード領域のヌクレオチド
配列をDNA配列決定により決定した。
【０１５８】安定したコムギ形質転換 高度に再生性の（regenerative）緑色組織を形質転換ターゲットとして使い、
pDhSSsGFPN3-4、pdBhssWTRXhN3-8、pKBhssWTRXN-2またはpDhAtNTR4を用いて形質
転換した安定な小麦のトランスジェニック系統を得た。高度に再生性の組織は、
持続した細胞分裂能力および長期間にわたる再生能力をもつ分化全能性細胞を高
いパーセントで有する。高度に再生性の緑色組織を誘導する目的で、全未熟胚（
IEs：1.0-2.5mm）を無菌的に除去し、DBC3培地（1.0mg/L 2,4-ジクロロフェノキ
シ酢酸、0.5mg/L BAPおよび5.0μM CuSO4を含有するカルス誘導培地；Choら, 19
98a-c）上に胚盤側を下方にしておいた。開始後5〜7日に、出芽シュートおよび
根を手で切除した。24±1℃にて淡い光条件（ほぼ10〜30μE、16時間-光）下で
のインキュベーションの3週間後に、胚盤から最高品質の組織を選択しDBC3培地
上で維持した。あるいは、高度に再生性の緑色組織は、娘組織、すなわち出芽シ
ュートの根でまたは出芽シュートの基底近傍組織の外層から現れる高度に胚形成
構造をもつ卵形状組織から得た。開始後7〜14日に、娘組織（2-4mm長）を出芽IE
sから手で切除して単離し、新鮮なDBC3培地に移した。さらに3〜4週のインキュ
ベーション後、組織を再び選択し、サイズでほぼ3〜5mmの2〜4片に壊して新鮮培
地に移した。組織を新鮮培地上で維持し、3〜4週間隔で継代培養した。
【０１５９】 良い品質の組織だけをボンバードメント用に選んだ。高度に再生性の組織（好
ましくはサイズでほぼ3〜4mm）を、浸透圧前処理のために、等モル量のマンニト
ールおよびソルビトールを含有するDBC3培地に移し、0.4Mの最終濃度とした。浸
透圧調節物質を用いた処理の4時間後に、組織を先に記載のように（WanおよびLe
maux 1994；Lemauxら, 1996）ボンバードした。金粒子（1.0μm）をpAct1IHPT-4
(またはpUbilNPTII-1)および4つのプラスミド、pDhSSsGFPN3-4、pdBhssWTRXhN3
-8、pKBhssWTRXN-2またはpDhAtNTR-4の1つとの1:1または1:2モル比混合物25μg
を用いてコートし、次いでPDS-1000 He 微粒子銃（biolistic）デバイス（Bio-R
ad, Inc., Hercules, CA）を使って600または900 psiでボンバードメントを加え
た。プラスミドpAct1IHPT-4は、コメアクチン1プロモーター（Act1）の制御下の
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）コード配列、そのイントロ
ンおよびnos 3'ターミネーターを含有する（Choら, 1998a-c）。pUbiINPTII-1は
、トウソルガムユビキチンプロモーターおよび第1イントロンの制御下にありnos
により終止するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（nptII）を含有
する。ボンバードメントの16〜18時間後に、ボンバードした組織を浸透圧調節物
質を含まないDBC3培地に移し、淡い光のもとで24±1℃にて育てた。
【０１６０】 最初の10〜14日の培養期間後に、再生性の各組織を組織サイズによって1〜3片
に分割し、hpt選択のための20-25mg/LハイグロマイシンB(Boehringer Mannheim,
Mannheim, Germany)またはnptII選択のための30 mg/L G418 (Sigma, Saint Lou
is, MO)を補充したDBC3培地に移した。初回の選択の3週間後に、培養物を30 mg/
LハイグロマイシンBまたは40 mg/L G418を含有する新鮮なDBC3培地に移した。第
3回目の選択から、組織を3〜4週間間隔で継代培養し、30 mg/L ハイグロマイシ
ンBまたは40 mg/L G418を含有するDBC3培地に維持した。第4または第5回目の選
択後に、生存組織を選択剤を含まないDBC3培地に移した。DBC3上で十分な再生性
の構造をもつ緑色組織を確認した後に、組織を、選択剤を含まない固体再生培地
に移して、より高い強度の光（ほぼ45-55μE）に曝した。再生培地（植物ホルモ
ンを含まないカルス誘導培地）上で4週間後に、再生したシュートを選択剤を含
まない同じ培地を含有するマジェンタボックスに移した。シュートがボックスの
頂部に到達したとき、小植物を土壌に移した。
【０１６１】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーション 葉組織からの全ゲノムDNAを記載（Dellaporta, 1993）のように精製した。形
質転換したと推定される系統のゲノムDNA中のwtrxhの存在を試験するために、50
0ngのゲノムDNAを、PCRにより、次の2つのプライマーセット、Wtrxhl（5'-ATATC
TAGAATGGCGGCGTCGGCGGCGA-3';配列番号5)およびWtrxh2R（5'-ATAGAGCTCTTACTGGG
CCGCGTGTAG-3'；配列番号6)またはWtrxh4（5'-CCAAGAAGTTCCCAGCTGC-3'；配列番
号11)およびWtrxh5R（5'-ATAGCTGCGACAACCCTGTCCTT-3';配列番号19）のいずれか
を使って増幅した。hptおよびnptIIの存在を、それぞれ、次のプライマーセット
、HPT6F（5'-AAGCCTGAACTCACCGCGACG-3';配列番号21）＋HPT5R（5'-AAGACCAATGC
GGAGCATATAC-3';配列番号22)（Choら, 1998a-c）およびNPT1 F（5'-CAAGATGGATT
GCACGCAGGTTCT-3'；SEQ I D NO: 15）＋N PT2R（5'-ATAGAAGGCGATGCGCTGCGAAT-3
';配列番号 16)を使って試験した。増幅はTaq DNAポリメラーゼ（Promega, Madi
son, WI）を含む反応液25μlを用いて実施した（Choら, 1998a-c）。染料を加え
たPCR産物25μlを、エチジウムブロミドを含む1.0%アガロースゲル上で電気泳動
し、紫外光へ暴露して写真撮影した。0.4および0.14kb断片の存在は、無傷およ
び末端切断したwtrxh断片とそれぞれ一致し；pAct1IHPT-4およびpUbiINPTII-1プ
ラスミドの0.81-kb hptおよび0.76-kb nptII断片が、それぞれhptおよびnptIIプ
ライマーによって作製された。wtrxhに対するホモ接合系統を、T1、T2またはT3
植物を使い、PCR分析によってスクリーニングした。
【０１６２】蛍光顕微鏡によるGFP発現検出 450-490励起フィルターおよびBAS20発光バリヤーフィルターを含むNikon B-2A
フィルターブロックを備えたNikon Microphot-5A蛍光顕微鏡を使い、GFP発現を
より高い拡大率でモニターした。
【０１６３】ウェスタンブロット分析 ウェスタンブロット分析を、同じ条件下で育った選択されたトランスジェニッ
クコムギ系統からならびに対照対応体からの種子について実施した。パンコムギ
種、cv. Capitoleの種子から精製したチオレドキシンhを参照物質に使った。全
種子を、液体窒素下で乳鉢および乳棒によって破砕して微粉にした。各サンプル
に対して10個の種子を使った；抽出バッファー[50mM Tris HClまたはリン酸バッ
ファー、pH 7.8、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、1mM EDTA]
の容積は、使用する種子数および抽出物の粘度によって2から4mLまで変えた。粉
砕をバッファー添加後、さらに1分間続け、調製物を14,000xgで10分間遠心分離
して、上清溶液を可溶性画分（アルブミン-グロブリン）として保存した。可溶
画分のSDS-PAGEを、12-17%ポリアクリルアミドグラディエントゲル中でpH 8.5に
て実施した（LaemmLi, 1970）。Bradford(1976)に従って定量した各サンプルの
同じ量のタンパク質（40μg）を、LaemmLiサンプルバッファー中に1:2 v/vで希
釈し、3分間煮沸し、ゲルにロードして、15mAの定電流で電気泳動にかけた。タ
ンパク質を、40Vの定電圧で4時間4℃にてHoeferトランスホアトランスファーユ
ニット（Hoefer Transphor Transfer Unit）(Alameda, CA)を使ってニトロセル
ロースにトランスファーした。（全て25℃にて）ニトロセルロースを5%粉ミルク
を含むTBSを用いて2時間ブロックし、1次抗体中で4時間および2次抗体中で1時間
インキュベートした。1次抗体は1:500に希釈したコムギ抗チオレドキシンh II（
Johnsonら, 1987b）であって；2次抗体は1:3000に希釈したヤギ抗ウサギアルカ
リホスファターゼ(Bio Rad, Hercules CA)であった。ブロットをNBT/BCIPアルカ
リホスファターゼ発色剤（Bio Rad, Hercules CA）中で展開した。画像をBio-Ra
d GelDoc 1000(Hercules, CA)を使って走査し、Bio-Rad Multi Analyst, versio
n 1.0.2を使って分析した。
【０１６４】B．結果と考察 発現ベクターの構築 sGFP(S65T)、WTRXhおよびAtNTRをコムギ種子中に過剰発現するために、次の胚
乳特異的ホルデインプロモーター、pDhSSsGFPN3-4、pDhWTRXN-2、pdBhssWTRXhN3
-8、pKBhssWTRXN-2またはpDhAtNTR-4により駆動されるwtrxhを含有する、5つの
発現構築物を作った。5つの構築物のうち、4つ（pDhSSsGFPN3-4、pdBhssWTRXhN3
-8、pKBhssWTRXN-2またはpDhAtNTR-4；図12）を安定したコムギの形質転換に使
った。
【０１６５】トランスジェニック植物の作製 高度に再生性の組織（3-4mm長の少なくとも1組織、好ましくは50組織、そして
最も好ましくは500組織）をボンバードし、DBC3培地上で最初の10〜14日は選択
なしに培養した。第2の移行（第1回の選択）に対して、選択は、hpt選択のため
の25-30mg/LハイグロマイシンBまたはnptII選択のための30 mg/L G418を補充し
たDBC3培地上で行った。第2回の選択では、30 mg/L ハイグロマイシンBまたは40
mg/L G418を含むDBC3培地を使った。第4回の移行（第3回の選択）から以後は、
選択圧は同じレベルに維持した。一般的に、複数の緑色セクターを有するハイグ
ロマイシンまたはG418耐性組織が第3回選択で観察された。第4または第5回の選
択後から、緑色セクターをもつ推定トランスジェニックカルスを選択剤を含まな
い同じ培地上で維持して育て、緑色セクターは完全に発生した再生性構造体を形
成した。緑色再生性組織を再生培地上で再生させ、マジェンタボックスの同じ培
地上で育成後、ほぼ3〜4週間目に、小植物を土壌に移した。本発明者らは、今ま
でこの形質転換プロトコールを使って、pdBhssWTRXhN3-8を用いて形質転換した2
つの独立したBobwhite系統、4つのトランスジェニックAnza系統、2つのトランス
ジェニックYecora Rojo系統、pKBhssWTRXN-2を用いて形質転換した1つのBobwhit
e系統およびpDhAtNTR-4を用いて形質転換した1つのYecora Rojo系統を得た（表8
）。本発明者らはまた、pDhSSsGFPN3-4を用いて形質転換された2つの独立したBo
bwhite系統も得た（データは示してない）。
【０１６６】トランスジェニックコムギ中のオオムギホルデインプロモーターの胚乳特異的発 現 オオムギD-ホルデインプロモーターにより駆動されるGFPの発現は、発生中の
コムギ穀粒の胚乳組織中に特異的に見出され；GFPは未熟胚組織中には観察され
なかった（図13）。
【０１６７】T0植物およびそれらの子孫の分析 2セットのWTRXhプライマーおよび1セットのAtNTRプライマーを使い、PCR分析
を実施した。PCR増幅は、トランスジェニック系統から、0.4-kb無傷のwtrxhまた
は0.14-kb末端切断wtrxh（図14）および0.5-kb内部Atntr断片を生じた。複数のw
trxhポジティブ系統からのT1およびそれらの子孫の種子を植えてホモ接合系統を
スクリーニングした。ホモ接合系統およびヌル分離体は、AZHptWTR-1、AZHptWTR
-21およびYRHptWTR-1（表8）から得た。他の系統は現在ホモ接合系統をスクリー
ニング中である。
【０１６８】トランスジェニック穀粒中に産生したコムギチオレドキシンhの特性決定 コムギチオレドキシンhを発現した安定して形質転換した系統のレベルについ
ては、平均して、形質転換体においてより高いことが見出された。これらの3系
統、AZHptWTR-1、AZHptWTR-21およびYRHptWTR-1からの種子のヘテロ接合混合物
から得た可溶性タンパク質画分のウェスタンブロットの分析値は、非形質転換対
照穀粒よりそれぞれほぼ5倍、20倍、および30倍多いチオレドキシンhを示した（
図15A）。ヌル分離体（YRHptWTR-1-2-1〜-3）のチオレドキシン含量は対応する
非形質転換対照のそれと類似した（図15AおよびB）
【表８】 実施例3 コムギグルテニンのトリプシンおよびパンクレアチンによる消化に及ぼすチオレ ドキシン還元の影響 トランスジェニックコムギ穀粒から得た穀粒タンパク質の逐次抽出 トランスジェニック穀粒(YRHptWTR-1-1)とヌル分離体の穀粒(YRHptWTR-1-2)を
室温でコーヒー挽き機で破砕した。各系統の10gを破砕して得た粉を250mLのねじ
蓋つき遠心管に入れ、下記の抽出溶液各60mLを添加した。混合液を機械的に振盪
した後、5,000 x gで30分間遠心した。上清画分を傾斜して取り、分析用に保存
し、残査を次の溶液と混合した。粉に挽いた穀粒は次の溶媒を用い、示した時間
かけて逐次抽出した：(1) 2 x 0.5M NaCl(30分間)；(2) 2 x 70% エタノール(2
時間)；(3)2 x 0.1M 酢酸(2時間)。全抽出物の上清画分についてクーマシー色素
結合法(Bradford, 1976)でタンパク質を分析し、使用まで−20℃で保存した。約
束ごととして、各画分は次のように名付けている：(1)アルブミン/グロブリン(
水/塩-水)；(2)グリアジン(エタノール)；および(3)グルテニン(酢酸)(Krugerら
, 1988; Shewryら, 1986)。これらの画分を下記の実施例5の消化試験および皮膚
試験に用いた。
【０１６９】グルテニンの消化 非トランスジェニック温室植物から上述のとおり抽出したグルテニンを還元す
るために、4.2μg NTR、2.4μg チオレドキシン(双方とも大腸菌(E.coli)から)
、および1mM NADPHを240μgのターゲットタンパク質に添加し、37℃のウォータ
ーバス中で45分間インキュベートした。NTS(NTR/チオレドキシン/NADPH)で処理
したグルテニンおよび無処理のグルテニンを100μLの人工腸液(SIF)(Board of T
rustees(編), 1995, Simulated Gastric Fluid, TS., p2053, The United State
s Pharmacopeia, 23, The National Formulary 18, United States Pharmacopei
al Convention, Inc. Rockville, 米国メリーランド州)中で下記のとおりインキ
ュベートした。人工腸液には5μgのトリプシン(または20μgのパンクレアチン)
、48.9mMのリン酸2水素カリウム、および38mMの水酸化ナトリウムを含有させた
。酵素を添加した後、0.2M 水酸化ナトリウムでpHを7.5に上げた。消化物を37℃
のウォーターバス中で0、20、60、もしくは80分間インキュベートした。その反
応を停止させるために、トリプシン消化物には100mM PMSFおよびロイペプチン(1
μg/mL)を添加し、パンクレアチン消化物には1N HClを添加した。消化したサン
プルのSDS-PAGE分析を8〜16%グラディエントゲル中でLaemmLi(1970)が報告して
いるとおり行った。1.5mm厚のゲルを16時間、7mAの定電流で展開した。10%酢酸
中でSDSゲルをクーマシーブリリアントブルーR-250で30分染色し、電子レンジを
利用して10%酢酸で30分間脱色した。タンパク質が染色されたゲルをGel Doc 100
0で捕捉した。ゲル上のタンパク質の定量は(吸光度 x mm x mm)、画像分析用の
ソフトウェアプログラムであるMulti-Analyst, version 1.0(Bio-Rad)で行った
。相対的な消化率は０タイムでの未消化タンパク質に対する百分率として表した
。
【０１７０】 図16および17に示したこれらの実験の結果からは、チオレドキシンの還元によ
って、トリプシンおよびパンクレアチンそれぞれによるプロテアーゼ消化に対す
るグルテニンの感受性が増強されることが示された。最も著明な影響が見られた
のはトリプシンであり、NTSで処理していないサンプルでは約90〜95%の出発時の
タンパク質が残存したのに対して、NTS処理サンプル中では約55%のタンパク質が
消化60分後にも残存した。トリプシン消化では蛋白質の分解は60分間進行し、明
らかにプラトーに達した。パンクレアチン消化では、タンパク質分解はより遅く
進行した。パンクレアチン処理の80分後、NTSで処理していないサンプルでは95%
のタンパク質が残存しているのに対して、NTS処理サンプル中には約60%の出発時
のタンパク質が残存していた。このように、本発明のトランスジェニック穀粒は
消化に対してより感受性が高く、高度消化性である。非トランスジェニック穀粒
に対してトランスジェニック植物における消化され易さの増加は少なくとも5%で
ある。
【０１７１】実施例4 チオレドキシンhを過剰発現しているコムギ穀粒の抽出物中のタンパク質の還元
に及ぼすNTRの影響 NADPHもしくはNTRもしくはNADPH&NTRによるタンパク質のin vitroでの還元 実施例2に記載の、チオレドキシンhを過剰発現しているホモ接合体系統から、
およびヌル分離体系統から得たアルブミン/グロブリン画分のアリコートを用い
た。反応は30mM Tris-HClバッファー pH7.9中で行った。処理方法は次のとおり
：(i) 対照、(ii) 1.25mM NADPH、(iii) 3.0μg シロイヌナズナ NTR、(iv) NAD
PH&NTRの組み合わせ、および(v) 5mM ジチオスレイトール(DTT)。上記の試薬を
、60μgのタンパク質を含有しているこのバッファーの70μL中に添加した。ジチ
オスレイトール(DTT)による還元を完全とするために5分間の煮沸を行った。37℃
で60分間インキュベートした後、100ナノモルのmBBrを添加して反応を室温でさ
らに15分間続けた。反応を停止させ過剰のmBBr を誘導体化するために、10μLの
100mM METを添加した。還元したサンプルは、25μLの4x LaemmLiサンプルバッフ
ァーを添加した後、報告されている方法で(Kobrehel, K.ら, 1992) mBBr/SDS-PA
GEで分析した。
【０１７２】 図18に示した結果では、チオレドキシンhを過剰発現している同系接合トラン
スジェニック体中のアルブミン/グロブリンタンパク質は、対応するヌル分離体
から得た穀粒のアルブミン/グロブリン画分よりも効率よく還元されることを示
している。
【０１７３】実施例5 コムギ穀粒から得たタンパク質のアレルゲン性に及ぼすチオレドキシンh過剰発
現の影響 下記のプロトコールが、2つの大学の双方の適切な委員会で承認されたが、そ
れらはUniversity of California-Davis(Animal Use and Care Administrative
Advisory Committee, 1999年1月21日から2000年1月21日まで有効)およびUnivers
ity of California-Berkeley(Animal Care and Use Committee, 1999年5月1日か
ら2000年4月30日まで有効)であった。
【０１７４】 市販の全粒コムギ穀粒抽出物(Bayer)で感作したUC-Davisのイヌのコロニー(Er
melら, 1997)の次の2群から、強く応答するイヌを選択した：1) 「若年イヌ」と
名付けた2才のイヌの群、および2)「老年イヌ」と名付けた7才のイヌの群。皮膚
試験を開始する前に、各動物には0.5%エバンスブルー(0.2mL/kg)を含有する5mL
の滅菌食塩水を静脈内注射した。5分後、PBSバッファー中に各コムギタンパク質
画分を対数希釈したもの100μLを腹部皮膚に皮内注射することによって行った。
注射したタンパク質の量は33pgから10μgの範囲であった。試験した画分は：1)
塩水可溶性(アルブミンおよびグロブリン)；2)エタノール可溶性(グリアジン)；
酢酸可溶性(グルテニン)である。20分後、膨疹エリアの長さと幅を、ブラインド
とした測定者が測定した。総面積は楕円形(Π/4 x L x W)として計算した。ヌル
分離体(対照)およびホモ接合体コムギ系統のタンパク質のアレルゲン性は各抽出
物の種々の希釈によって作製された総膨疹エリアを比較することによって得られ
た。
【０１７５】 イヌの応答は図19に示したが、それはトランスジェニックコムギから得られた
タンパク質がヌル分離体から得られたタンパク質よりもアレルゲン性が低いこと
を示している。試験した各画分で、若年および老年のイヌの双方ともトランスジ
ェニックコムギから得たタンパク質に対しては応答性がより低かった。トランス
ジェニックのものは非トランスジェニックのものと比較すると少なくとも5%アレ
ルゲン性が低減していた。若年のイヌでのアレルゲン性はより大きく低減され、
その範囲は20〜32%の低減であった。これに対して老年のイヌではそのアレルゲ
ン性は8〜23%の低減であった。
【０１７６】 トランスジェニックコムギ穀粒から作られた麦芽の低アレルゲン性を示すため
に、トランスジェニック種子から当業界で既知の標準的なプロトコールに従って
麦芽を作製する。麦芽からの抽出物は上述の方法にしたがって作製する。上述の
若年および老年イヌに0.5%エバンスブルー(0.2mL/kg)含有の約5mLの滅菌食塩液
を静脈内に注射する。約5分後、 PBSバッファー中の各麦芽タンパク質画分を対
数希釈したもの100μLを腹部皮膚に皮内注射することによって皮膚試験を行う。
注射したタンパク質の量は約33pgから10μgの範囲である。試験した画分は上述
のとおりである。約20分後、膨疹エリアの長さと幅を、ブラインドとした測定者
が測定し、総面積を楕円として計算する。ヌル分離体(対照)から作製された麦芽
、およびホモ接合体コムギ系統から作製された麦芽の麦芽タンパク質のアレルゲ
ン性は、上述のとおり総膨疹エリアを比較することによって得られる。若年のイ
ヌでのアレルゲン性はより大きく低減され、その範囲は約20〜30%の低減である
。老年のイヌではそのアレルゲン性は約5〜20%の低減である。
【０１７７】 従って、低アレルゲン性麦芽から製造したビールなどの食品もまた低アレルゲ
ン性である。
【０１７８】実施例6 オオムギチオレドキシンhを発現しているトランスジェニックソルガム A. 種子の消化され易さ Sorghum vulgareの10種の主要な栽培品種から得た種子について、人工胃液(ペ
プシン)、および人工腸液(パンクレアチン)を用いて構成タンパク質の消化され
易さのチオレドキシン依存性の増加をスクリーニングする。これらの栽培品種は
米国、オーストラリア、およびアフリカの種々の地域で栽培されているものを代
表しているものである。
【０１７９】 アルブミン、グロブリン、カフィリン、およびグルテリンタンパク質画分をそ
れらの示差溶解性に従って単離する。種子3gをコーヒー挽き機で破砕し、次の液
30mLずつで逐次抽出する：(1)0.5M NaCl、(2)60%(v/v) 2-プロパノール、および
(3)0.1M ホウ酸ナトリウムバッファー pH10、これらを25℃で振盪機上でそれぞ
れ30分間、4時間、および4時間で抽出する。抽出された画分はそれぞれ(1)アル
ブミン＋グロブリン、(2)カフィリン、および(3)グルテリンに対応する。総カフ
ィリンもしくは架橋されたカフィリンは60% 2-プロパノール＋1% 2-メルカプト
エタノールで抽出される(Shullら, 1992)。各懸濁液を4℃で10,000 x g、20分間
遠心して清澄化し、その後3回の抽出を塩溶液、その後2回水で洗うことによって
行う。残りの抽出は2回繰り返す。この結果得られる上清溶液をプールし各画分
の消化され易さを単離したその日に試験する。
【０１８０】 個々のソルガムタンパク質画分のアリコートをNADP/チオレドキシンもしくはN
ADP/グルタチオン系で消化前に還元し、結果を非処理の標品と比較する。あるい
はまた、ミリスチン酸ナトリウムで抽出した総タンパク質について消化され易さ
を試験することができるが、ミリスチン酸ナトリウムはコムギグリアジンおよび
グルテニンを生化学的に活性な形で可溶化する非還元性界面活性剤である(Kobre
helとBuchuk, 1978)。タンパク質のジスルフィド結合の還元はmBBr/SDS-PAGEを
用いて既に報告されている方法で(del Valら, 1999)、100μLの液量で：(i)5μL
の25mM NADPH、8μLの0.3mg/mL大腸菌(E.coli)チオレドキシン、および7μLの0.
3mg/mL大腸菌(E.coli)NTRからなるNADP/チオレドキシン系；もしくは(ii)5μLの
25mM NADPH、10μLの30mM グルタチオン、および15μLの0.1mg/mLグルタチオン
レダクターゼからなるNADP/グルタチオン系のいずれかを用いる。反応は各タン
パク質を50μg含有する30mMのPBS中で行う。反応混液は4℃で一晩、もしくは37
℃および55℃で15分間インキュベートする(Kobrehelら, 1992; del Valら, 1999
)。その後の実験では、温度は最もよく作用することが見出された温度を用いる
。完全に還元させるには、サンプルをPBS中で5μLの100mM DTTとインキュベート
し、5分間煮沸する。タンパク質画分(アルブミン-グロブリン、カフィリン、グ
ルテリン：240μgタンパク質)、それは非処理であるかもしくはNADP/チオレドキ
シンもしくはNADP/グルタチオンで還元したものであるが、それをペプシン(胃液
をシミュレート)もしくはトリプシン/キモトリプシン/カルボキシペプチダーゼ(
パンクレアチン：腸液をシミュレート)で人工的に消化させる。
【０１８１】ペプシンアッセイ 各画分の500μgタンパク質を100μLの人工胃液(0.32%ペプシン(w/v)および30m
M NaCl、HClでpHを1.2に調整)(Astwoodら, 1996)に添加する。反応混液を37℃で
60分までインキュベートし、0.375倍の容量の160mM Na２CO３で中性pHとして反
応を停止させる。そのタンパク質混液をSDS-PAGEにかけ、クーマシーブルーで下
記のとおりタンパク質を染色する。
【０１８２】パンクレアチンアッセイ 各画分の500μgタンパク質を100μLの人工腸液(1% ブタパンクレアチン(w/v)
、48.9mM リン酸2水素カリウム、および38mM NaOH、NaOHでpHを7.5に調整)(Unit
ed States Pharmacopoeia, 1995を参照されたい)に添加する。反応混液を37℃で
60分までインキュベートし、1/10の容量の100mM フェニルメチルスルホニルフル
オリド(PMSF)＋1μg/mLのロイペプチンで反応を停止させる。そのタンパク質混
液をSDS-PAGEにかけ、クーマシーブルーで下記のとおり染色する。
【０１８３】 チオレドキシン系による還元後にタンパク質分解性およびデンプンの消化に対
しての感受性が最も改善されていることを示した、2種類の広く栽培されている
栽培品種を形質転換の研究に用いる。
【０１８４】B. デンプンの単離と消化され易さ デンプン顆粒の単離 乾燥した成熟ソルガム穀粒由来のデンプン顆粒は既に報告されている方法(Sun
とHenson, 1990)で抽出する。ソルガム穀粒を蒸留水で洗い、0.02%アジ化ナトリ
ウム含有の20mM酢酸ナトリウムバッファー pH6.5中で48時間浸漬する。柔軟化し
たカーネルをまず乳鉢と乳棒で破砕し、次いでVirTisホモジナイザーで全速の80
%で6分間破砕し、穀粉を2種のふるい(250および75μm)を通過させる。2つのふる
いを通過した粗製デンプンを65%(w/v)ショ糖層を通過させつつ遠心して(60 x g,
2.5分間)精製する。ペレット化したデンプン顆粒を同一条件下で1回または2回
再遠心し、0.02%アジ化ナトリウム含有の20mM酢酸ナトリウムバッファー pH6.5
中に再懸濁する。
【０１８５】デンプンの消化 デンプンの消化され易さはブタ膵臓α-アミラーゼ(Type VI-B, Sigma Chemica
l Co. St.Louis, 米国ミズーリ州)を用いて酵素的加水分解に基づいて測定する
。2%(w/v)デンプン、0.5%(w/v)BSA、0.02%アジド、25mM NaCl、5mM CaCl２、お
よび10ユニットのα-アミラーゼを10mMのリン酸ナトリウムバッファー pH6.9中
に含むインキュベーション混液を37℃でインキュベートする。反応混液のアリコ
ート(50〜100μL)を定期的に取り出して、デンプン顆粒から放出されるブドウ糖
および総還元糖を測定する。還元糖濃度はジニトロサリチル酸法(Bemfeld, 1955
)で測定し、総デンプン含量はMcClearら(1994)の酵素的方法で測定した。
【０１８６】デンプン顆粒上のタンパク質の還元 単離した2%(w/v)デンプンのアリコートをNTS系とインキュベートして、上述の
(実施例3および4)顆粒表面上のタンパク質を還元させる。還元させた後、デンプ
ン顆粒の消化され易さをα-アミラーゼ(McClearyら, 1994)、および人工腸液(Bo
ard of Trustees 1995)で調べた。
【０１８７】C. オオムギのtrxhを含んでいる、安定的に形質転換されたソルガム系統およびT １植物の産生 オオムギの胚盤組織から得たcDNAライブラリー(UCBのR.Schuurinkが構築)を用
いてチオレドキシンhの完全長の遺伝子(trxh、図20)を単離し特徴を調べた(Call
iau, de Val, Cho, Lemeaux, Buchanan、未発表)。完全長のcDNAクローンをホル
デインプロモーター＋ターゲット配列と共に発現ベクター中に置き(Choら, 未発
表)、ソルガムの形質転換に用いる。このベクターpdBhssBTRXN-2は、0.43kbのB
１-ホルデインプロモーター＋そのシグナル配列、オオムギtrxh(btrxh)およびno
sを含んでいる。
【０１８８】 ソルガムをChoらの方法(1998b、1999b、1999c、1999d、2000)で形質転換して
高度に再生性の緑色組織を作製する。これらの組織は多数の明緑色のシュート生
長点様構造を含んでおり、それらはオオムギでそのように特徴づけられたが、そ
れはそれらの組織がシュート生長点状態の維持に関与する遺伝子、knotted I 相
同体を発現するからである(Zhangら, 1998)。高度に再生性の組織などのターゲ
ット組織、それは持続的細胞分裂が可能な全能性細胞を高率に含み長期間にわた
って再生ができるものであるが、それは形質転換のための高品質なターゲット組
織であることを示している。それらの組織は再生性のロスを最小限にしつつ1年
間以上維持することができる(Choら, 1998b、1999b、1999c、1999d、2000; Kim
ら, 1999; Haら, 2000)。さらに、ゲノムDNAメチル化分析(Zhangら, 1999b)から
得られた結果は、これらの高度に再生性の組織から再生されたオオムギの(成長
した)植物がメチル化パターンの多型性および栽培学的な能力に関して胚形成性
状態で維持されたカルスから再生されたものと比べて変動の少ないものであるこ
とが示された。
【０１８９】 他の穀類および草のために開発された培地をソルガムの変種TX430の応答を最
適化するために用いて、他の穀類および草で観察されたものと類似の高品質の、
緑色再生性組織を産生させる。そのような組織は試験した変種の全てで安定な形
質転換に用いて好結果が得られている。簡潔に述べれば、この方法、つまり緑色
、再生性組織の生長には、栽培品種TX430の未熟な胚から胚形成性培養が開始さ
れることが含まれる。最高品質の組織が得られる培地はD'BC2およびDBC3(Choら,
1998a-c, 1999d)である。銅、麦芽糖、およびサイトカイニンを含んでいるその
ような培地は、他の穀類および草から得た組織の品質および長期間の再生性を改
善することが見出されている。この培地上で成長させた組織を、ボンバードメン
トを用いる形質転換のターゲットとして用いる。
【０１９０】 オオムギtrxhを含む所望のDNA構築物をボンバードメントによってターゲット
細胞中に導入する。形質転換体を同定するための選択はビアラホス、カナマイシ
ン、もしくはその他の適切な選択剤を公表されている方法(Choら, 1998a-c; Lem
auxら, 1999)にしたがって行う。形質転換されたと推定されるカルスの小部分に
ついてPCRでオオムギtrxhを分析し(Choら, 1998a-c)、形質転換された組織を操
作して植物を再生させる(Choら, 1998a-c)。葉の組織について選択剤に対する耐
性を、可能であれば試験し、適切であればPCRで導入遺伝子を分析する。植物を
生育させて成熟させT１種子およびホモ接合体のT２植物を得る。
【０１９１】D. 安定的に形質転換されたソルガムの量と活性の測定 異なる産生系(ターゲットとしたもの 対 ターゲットとしなかったもの、すな
わち、それぞれシグナル配列を持つものもしくは持たないもの)から異なる分画
法で得たオオムギチオレドキシンhの活性をDTNB法(2',5'-ジチオビス(2-ニトロ
安息香酸))(Florencioら, 1988)で、報告されているとおり(Choら, 1999e)アッ
セイする。NTRおよびチオレドキシン対照品はJohnsonら(1987a,b)が報告してい
るとおりにコムギ穀粒から調製する。
【０１９２】ウエスタンブロット分析 選択されたトランスジェニック系統ならびに対照の種子からの抽出物について
ウエスタンブロットを行う。無傷の種子の10から20ロットを加工して、TRXhおよ
びNTR含量をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法(Choら, 1999e)で分析する。
【０１９３】種子抽出物の調製、加熱処理、およびカラムクロマトグラフィー 抽出物をChoらが報告しているとおり(1999e)調製し、加熱処理し、カラムクロ
マトグラフィーで分画する。
【０１９４】チオレドキシンh活性の測定 チオレドキシンhはクロロプラストNADP-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ法で、オオ
ムギで適用された方法(Choら, 1999)でアッセイする。
【０１９５】タンパク質の測定 タンパク質はガンマグロブリンを標準品に用いてクーマシーブルー法を用いて
Bradford(1976)の方法に従って測定する。タンパク質含量は、自動ガスアナライ
ザーでの総窒素の測定、もしくは標準的なミクロケールダール法によって確認す
る。
【０１９６】E. 胚乳タンパク質の量および酸化還元状態の変化の測定 オオムギチオレドキシンhを過剰発現しているトランスジェニックソルガムの
種子は、このタンパク質のレベルの増加が消化され易さを変えることを示すため
に用いる出発材料である。予備的なmBBr測定も遺伝子操作された穀粒で行う。胚
乳タンパク質の酸化還元状態の変化はmBBr/SDS-PAGE法(Krobehelら, 1992)を用
いて測定する。ソルガムの主たる生来の貯蔵タンパク質は不溶性であることが知
られているので、穀粒中のプロパノール可溶性ならびに種々の水溶性の胚乳抽出
物をモニターする。残査は上述のとおり(A. 種子の消化され易さ、参照)種々の
タンパク質画分を逐次抽出する。各抽出物の上清画分はmBBr/SDS-PAGE技法によ
ってタンパク質および蛍光を分析する。
【０１９７】 トランスジェニックおよびヌル分離体系統から得た乾燥穀粒1gを乳鉢と乳棒を
用いて液体窒素中で破砕する。液体窒素が蒸発したら、1mM EDTAおよび1mM mBBr
を含有する30mM Tris-HCl, pH7.9バッファーを3〜6mL添加し1分間混合する。抽
出物を融解した後、15分間インキュベートし、遠心し(12,000 x gで10分間)、塩
、プロパノール、およびホウ酸溶液で上述のとおり(A. 種子の消化され易さ、参
照)逐次抽出する。60μgのタンパク質サンプルを10〜20%のSDS-ポリアクリルア
ミドグラディエントゲル上に上述のとおり、ロードする。電気泳動(1時間、定電
流30mA)後、ゲルを2時間、12%(w/v)トリクロロ酢酸中に浸漬し、40%メタノール
および10%酢酸含有の溶液に12時間移し過剰のmBBrを除去する。ゲルをUV照射源(
365nm)を用いて蛍光に対して走査し、クーマシーブルーを用いてタンパク質を染
色する。
【０１９８】F. T１ヘテロ接合体およびT２ホモ接合体のソルガムの穀粒中の胚乳タンパク質
の消化され易さおよび溶解性の変化の測定 in vitroでの実験(Oriら, 1995)と並行して、in vivoでチオレドキシンが介在
する還元がソルガム胚乳タンパク質の消化され易さおよび溶解性に寄与する程度
を測定する。タンパク質の可溶性の程度はトランスジェニック種子中の可溶性タ
ンパク質の不溶性タンパク質に対する比をヌル分離体種子と比較して用いて測定
する。抽出物をmBBr標識のないものを並行して調製し、上述のとおり(実施例3)
人工胃液および人工腸液による消化に対する感受性を試験する。種々のトランス
ジェニック穀粒から得たタンパク質もチオレドキシンおよびグルタチオンを用い
ると上述のとおり(A. 種子の消化され易さ、参照)還元される。
【０１９９】G. T１ヘテロ接合体およびT２ホモ接合体ソルガム穀粒中のデンプンの消化され
易さの変化の測定 カフィリン貯蔵タンパク質の場合と同様、過剰発現されたチオレドキシンhの
、デンプンのα-アミラーゼによる消化のされ易さを増大させる能力を測定する
。デンプンをトランスジェニックおよびヌル分離体系統の双方から単離し、上述
のとおり(B. デンプンの単離と消化され易さ、参照)α-アミラーゼを用いてin v
itroでその消化され易さを試験する。カフィリンタンパク質はデンプン顆粒と会
合しているので、カフィリンタンパク質の消化され易さの増大はデンプンの消化
され易さの増大に伴っている。
【０２００】H. 穀粒タンパク質の消化され易さを改善する、ソルガム中で過剰発現されたチ
オレドキシンh 上述した消化され易さを様々なタンパク質画分(アルブミン/グロブリン、カフ
ィリン、グルテリン)について人工胃液および人工腸液で試験する。トランスジ
ェニック穀粒での消化され易さの改善を示すために、オオムギTRXhを過剰発現し
ているトランスジェニック穀粒での結果をヌル分離体での結果と比較する。
【０２０１】実施例7 パンのドーの品質の改良 米国特許出願第08/211,673号(参照に本明細書に組み入れることとする)中では
、パンのドーの品質は小麦粉タンパク質をNADP/チオレドキシン系を用いて還元
することによって改良されたとされている。何らかの理論には拘束されないが、
還元されたチオレドキシンは、あるタンパク質内の異なる部分を架橋しそのタン
パク質の形状を安定化させている分子内S-S結合を特異的に切る。それらの架橋
が切られると、そのタンパク質は折り畳みが解かれパンのドー内の他のタンパク
質と連結するものと推測され、弾性のある編み目構造を形成する重なり合った格
子が作られる。発酵過程で酵母によって産生される二酸化炭素を捕捉することを
その編み目構造が助けるのでパンのドーが膨らむ。還元されたチオレドキシンが
小麦粉中のグリアジンおよびグルテニンを還元しそれらがパンのドーを強化する
ように再結合されるのではないかとの説が出された。還元されたチオレドキシン
はグリアジンおよびグルテニンがパンのドー作製過程でタンパク質の編み目構造
を形成することを容易にした。品質が中程度のもしくは低い小麦粉(栽培品種 A
pollo)を大腸菌(E.coli)チオレドキシン、NADP-チオレドキシンレダクターゼ、
およびNADPHで処理すると、非処理の小麦粉と比較して、パンのドーの強化(ファ
リノグラフ測定値がより高くなる)ならびにパンの塊の容積および粘弾性の改良
が認められた。パンのドーのファリノグラフ測定値がより高いことは、パンのド
ーの強度の改良および焼いた際の良好な特性、例えばパン粉の品質がよりよいこ
と、舌触りの改良、およびパンの塊の容積がより大きくなることと対応している
。
【０２０２】コムギパン焼き研究およびファリノグラフ測定 本発明のトランスジェニック種子から調製した小麦粉を用いて作製したパンの
ドーの品質が改良されていることを示すために、パン焼き試験をコンピューター
で働くPANASONICパン焼き機を用いて行った。
【０２０３】 パンの組成：対照 ： 穀物粉＊： 200gm(乾燥重量) 水： 70% 水和 塩(食塩)： 5.3g 酵母： 4.8g (S.cerevisiae)(ドライイーストパウダー) ＊穀物粉サンプルはトランスジェニックおよび非トランスジェニックコムギ
(栽培品種Thesee, Apollo, Arbon, およびその他の動物飼料用グレードのものお
よびその他のパン焼きの品質が低いものから良好なものまでのグレードのもの)
、ソルガム、トウソルガム、およびコメから得たものである。
【０２０４】実験条件 − 穀物粉および塩の重量を測定し混合する。
【０２０５】 − 70%の水和に達するために必要な量の水をパン焼き機に入れる。
【０２０６】 − 穀物粉と塩の混合物をその水の中に入れ、コンピューターによってパン焼
きプログラムを開始させる。そのプログラムが完了するまでに3時間9分7秒を要
する。
【０２０７】 − 酵母は混合開始の20分3秒後に自動的に添加される。
【０２０８】 Panasonic装置を作動させるプログラムは以下の通りである； 混合 セグメント 時間 条件 加熱 混合 00:00:03 T1 オフ 混合 00:05:00 T2 オフ 混合 00:05:00 T1 オフ 休み 00:10:00 TO オフ 混合 00:17:00 T2 オフ 混合 00:07:00 T1 オフ 休み 00:30:00 TO 32℃まで上げる 混合 00:00:04 T1 32℃ 休み 01:15:00 TO 32℃ パン焼き 00:14:00 TO 180℃まで上げる パン焼き 00:26:00 TO 180℃ 混合条件：TO＝混合なし(モーター休止) T1＝通常の混合 T2＝3秒間の混合、3秒間の休みを交互に
【０２０９】 パンのドーを作った後、ファリノグラフの測定は米国特許出願第08/211,673号
で述べられているとおり行う。パンの塊の容積はパン焼きの最後にそれが室温に
戻ってから測定する。
【０２１０】 本発明のトランスジェニックコムギ種子から製造した小麦粉から作ったパンの
ドーのファリノグラフの測定値は、非トランスジェニック種子から製した小麦粉
から作ったパンのドーよりも少なくとも約10〜20%高く、約40%長く維持される。
本発明のトランスジェニック種子から製した小麦粉から作ったパンは非トランス
ジェニック種子から製造した小麦粉から作ったパンと比較して少なくとも約5%か
ら約20%までその容積が増加した。通常は非グルテン性穀物粉を産生する穀類、
例えばコメのトランスジェニック穀物粉から作ったパン様の産物は、それの非ト
ランスジェニックなものの穀物粉から作った産物よりもよくまとまりガスを保持
する。その産物はまた、非トランスジェニック対応物と比較すると塊の容積の少
なくとも3%の増加を示す。
【０２１１】実施例8 チオレドキシンhを過剰発現している、ホモ接合体 対 ヌル分離体コムギ穀粒の
抽出物中におけるタンパク質の還元に及ぼすグルコース-6-リン酸デヒドロゲナ
ーゼの影響 コムギチオレドキシンhを過剰発現しているトランスジェニックおよびヌル分
離体コムギ穀粒の塩可溶性画分(アルブミンおよびグロブリン)からサンプルを採
取した。反応は30mM Tris-HClバッファー pH7.9中で最終液量を100μLとして行
った。最終反応混液中には10μmolのグルコース-6-リン酸、0.25μmolのNADP、2
ユニットのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(Bakers Yeast, Type XV, Sig
ma, St. Louis, 米国ミズーリ州)、プラスもしくはマイナス1.5μgのNTR(シロイ
ヌナズナ)、ならびに80μgのタンパク質を含んでいた。その他の処理法、それは
NADPH生成系の1つもしくは2つの構成成分を欠くものであるが、それらについて
は示したとおりであった。陰性対照は抽出したタンパク質単独としたものであっ
た。NADP/グルコース-6-リン酸/グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの替わり
にNADPHを用いたものを陽性対照とした。
【０２１２】 37℃で60分間インキュベートした後、100 nmolのmBBrを反応混液中に添加し、
反応を15分間継続した。10μLの100mM 2-メルカプトエタノールを添加して反応
を停止させ、過剰のmBBrを誘導体化した。適切な量の4 x Laemmeliサンプルバッ
ファーを添加し、そのサンプルをSDSが存在している10〜20%ポリアクリルアミド
ゲル上にアプライした。電気泳動は室温で7mA/ゲルで16時間行った。ゲル上のス
ルフヒドリルを含有しているタンパク質の蛍光をGel Doc 1000(Bio-Rad)で捕捉
し、タンパク質は10%酢酸中に0.025%クーマシーブリリアントブルーG-250を含ん
だ液で染色した。
【０２１３】 グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの影響の可視化には(図23)：NTRの存在
下でレーン2対4(−NADP)およびレーン5対7(＋NADP)の比較(＋NTRゲルが左側にあ
る)；NTRの不在下で、レーン1対3(−NADP)およびレーン2対4(＋NADP)(−NTRゲル
は右側)。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼによる還元効果の最大の増加は
NTR存在下でNADPがない(レーン2対4、左側のゲル)状態の時に観察された。レー
ン4対レーン2で最大のNTRの還元であったことに注目すべきである。
【０２１４】 ヌル分離体(図24)では、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの存在下ではN
TRの還元がより大きく起こるが(レーン4対2)、より小さなターゲットタンパク質
(レーン4)は、トランスジェニック抽出物(図23)を用いて処理した対応するもの(
レーン4)と比較してその還元の程度がより低かったことに注目すべきである。
【０２１５】 本発明は実施例および説明により詳細に示されている。当業者であれば前記の
特許請求の範囲中に述べられている本発明内容と等価のものを推測することがで
きるであろうが、そのようなものも前述の説明および実施例の精神の範囲内にあ
ることは明白である。本発明が属する業界の当業者にはおそらく明白な、等価の
ものおよび種々の改変も、添付の特許請求の範囲で定義した本発明の範囲内に含
まれるものである。本明細書で引用した特許、特許出願、公表物、参照物および
それらの中で参照されている参照物は本明細書中にそれらの全体を参照により組
み入れることとする。
【０２１６】参照文献 本明細書に引用する参照文献、特許、特許出願および刊行物は全てその全文を
参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０２１７】 Altschulら（1990）J. Mol. Biol. 215: 403-10. Altschulら（1994）Nature Genet. 6: 119-29. Altschulら（1996）Methods in Enzymology 266: 460-480. Astwoodら（1996）Nature Biotech. 14: 1269-1273. Ausubelら（1987）Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最
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barley （Hordeum vulgare L.）（トウモロコシおよびオオムギにおけるin vitr
o腋芽成長点成長および不定芽成長点形成過程におけるCDC2ZmおよびKNOTTED1の
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and barley （Hordeum vulgare L.） using in vitro shoot meristematic cul
tures derived from germinated seedlings（発芽実生から誘導したin vitroシ
ュート分裂組織培養物を用いたオートムギおよびオオムギの商業用栽培品種の遺
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【０２１８】
【配列表フリーテキスト】
配列表に挙げた核酸配列およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に関しては
標準的な略字を、アミノ酸に関しては３文字略号を用いて示す。各核酸配列の一
方の鎖のみを示すが、示す鎖を参照することによりその相補鎖が含まれることを
理解されたい。
【０２１９】 配列番号１：オオムギB1-ホルデインプロモーターおよびシグナル配列の核酸配
列を示す。
【０２２０】 配列番号２：オオムギB1-ホルデインシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
【０２２１】 配列番号３：オオムギD-ホルデインプロモーターおよびシグナル配列の核酸配列
を示す。
【０２２２】 配列番号４：オオムギD-ホルデインシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
【０２２３】 他の配列は明細書中で特定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 形質転換に使用するチオレドキシンh構築物を示す。
【図２】 コムギチオレドキシン遺伝子（wtrxh）を用いて形質転換した種々のオオムギ
穀粒のチオレドキシン活性プロフィールを示す。
【図３】 オオムギ穀粒からの粗抽出物のチオレドキシン活性に及ぼす熱処理の影響を示
す。
【図４】 図４A-Bは、分離したwtrxhを含有するT1オオムギ穀粒の安定な形質転換体から
の抽出物のウエスタンブロット分析を示す。 パネルA：レーン１および６は対照オオムギ抽出物（cv. Golden Promise）であ
る；レーン２はパンコムギ抽出物（Triticum aestivum, cv. Capitole）である
；レーン３はGPdBhss BarWtrx 22からの抽出物である；レーン４はGPdBhssBarWt
rx 29からの抽出物である；レーン５はGPdBhBarWtrx 2からの抽出物である。 パネルB：レーン１はGPdBhBaarWtrx 2である；レーン２は対照オオムギ抽出物で
ある。Wコムギ；Bオオムギ。
【図５】 wtrxhで形質転換したT1、T2およびT3オオムギ穀粒の抽出物のウエスタンブロ
ット分析を示す。各系統の10-20個の穀粒から抽出された40μgの可溶性タンパク
質をSDS/PAGEで分画した。レーン１、コムギ胚芽チオレドキシンh；レーン２、G
P4-96の非トランスジェニック対照；レーン３、GPdBhssBarWtrx-29-11-10のヌル
分離体T2穀粒；レーン４、GPdBhssBarWtrx-29のヘテロ接合体T1穀粒；レーン５
、GPdBhssBarWtrx-29-3のホモ接合体T2穀粒；レーン６、GPdBhssBarWtrx-29-3-2
のホモ接合体T2穀粒；レーン７、予備染色基準（アプロチニン 9 kDa; リゾチー
ム 17.8 kDa; ダイズトリプシンインヒビター 30.6kDa; 炭酸脱水素酵素 41.8 k
Da ; BSA 71 kDa）。
【図６】 B1-ホルデインプロモーターおよび57塩基対のB1-ホルデインシグナル配列（下
線）の核酸配列を示す。
【図７】 D-ホルデインプロモーターおよび63塩基対のD-ホルデインシグナル配列（下線
）の核酸配列を示す。
【図８】 図８A-Cは、トランスジェニックオオムギ穀粒における、発芽および実生発育
過程のプルラナーゼ活性に及ぼす過剰発現したチオレドキシンhの影響を示す。
ホモ接合体系統 GPdBhssBarWtrx-29-3およびヌル分離体GPdBhssBarWtrx-29-11-1
0をプルラナーゼアッセイに使用した。 パネルA：プルラナーゼを、分光測光法で赤色プルラン基質から放出される色素
を534 nmにおいて測定することによりアッセイした。 パネルB：プルラナーゼを、赤色プルラン基質を含有する天然7.5％ポリアクリル
アミドゲル上で分離した。精製オオムギプルラナーゼと比較して同定された活性
は、0.2 M コハク酸バッファー, pH 6.0中で37℃にて１時間にわたりゲルをイン
キュベートして展開した領域に明らかに見られる。 パネルC：パネルBのゲルを活性バンドの集積化によりスキャンし、分析した。
【図９】 図９A-Dは、活性ゲルに基づく、発芽および実生発育過程におけるトランスジ
ェニックおよびヌル分離体オオムギ穀粒中のアミラーゼの活性および存在量の変
化を示す。 パネルA：ウエスタンブロットに基づくヌル分離体中のαアミラーゼの存在量。 パネルB：ヌル分離体中の総アミラーゼ活性。 パネルC：チオレドキシン過剰発現穀粒中のαアミラーゼの存在量。 パネルD：チオレドキシン過剰発現穀粒中の総アミラーゼ活性。
【図１０】 発芽および実生発育過程のαアミラーゼの主要形態の活性に及ぼす過剰発現し
たチオレドキシンhの影響を示す。図９に示す主要なαアミラーゼ活性バンドの
サイズは、その電気泳動における移動速度により評価した。
【図１１】 図１1A-Bは、発芽および実生発育過程のαアミラーゼAおよびBのアイソザイム
の存在量に及ぼす過剰発現したチオレドキシンhの影響を示す。図は、ヌル分離
体およびトランスジェニックオオムギ穀粒に関して展開したIEFゲルのウエスタ
ンブロットを示す。パネルA：ヌル分離体。パネルB：チオレドキシンを過剰発現
するトランスジェニック。
【図１２】 コムギ形質転換に使用するDNA構築物を示す。
【図１３】 トランスジェニックコムギ植物におけるオオムギD-ホルデインプロモーターsg
fp（S65T）の胚芽特異的発現を示す。トランスジェニック胚芽を右側に示し、ト
ランスジェニック胚を左側に示す。
【図１４】 トランスジェニックコムギ植物からのゲノムDNAのPCR分析を示す。
【図１５】 図１5A-Bは、ウエスタンブロット分析でスクリーニングしたコムギチオレドキ
シンh過剰発現コムギ系統を示す。パネルA：T0コムギ系統。パネルB：T3ホモ接
合体系統。
【図１６】 トリプシンによるコムギグルテニンの消化に及ぼすチオレドキシン還元の影響
を示す。
【図１７】 パンクレアチンによるコムギグルテニンの消化に及ぼすチオレドキシン還元の
影響を示す。
【図１８】 チオレドキシンh過剰発現トランスジェニックコムギとヌル分離体の抽出物中
のタンパク質の還元に及ぼすNTRの影響を示す。
【図１９】 コムギ穀粒からのタンパク質のアレルゲン性に及ぼす過剰発現したチオレドキ
シンhのす影響を示す。
【図２０】 オオムギチオレドキシンhヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ配
列番号２５、配列番号２６）を示す。
【図２１】 ヌル分離体およびトランスジェニック（ホモ接合体）のオオムギ穀粒の発芽に
及ぼす過剰発現したコムギチオレドキシンhの影響を示す。
【図２２】 乾燥および発芽穀粒に関して、ヌル分離体と比較した場合のコムギチオレドキ
シンh過剰発現トランスジェニックオオムギ穀粒中のタンパク質画分の相対酸化
還元状態を示す。
【図２３】 グルコース-6-リン酸およびシロイヌナズナNTR: +/- NTRの存在下にて、チオ
レドキシンh過剰発現トランスジェニックコムギ穀粒の抽出物中のタンパク質の
還元に及ぼすグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの影響を示す。
【図２４】 グルコース-6-リン酸およびシロイヌナズナNTR: +/- NTRの存在下にて、チオ
レドキシンh過剰発現コムギ穀粒に由来するヌル分離体の抽出物中のタンパク質
の還元に及ぼすグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの影響を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｇ 3/00 Ａ２３Ｇ 3/00 ４Ｂ０３２ Ａ２３Ｋ 1/14 Ａ２３Ｋ 1/14 ４Ｂ０３５ 1/16 ３０３ 1/16 ３０３Ｆ ４Ｂ０４６ ３０４ ３０４Ｃ ４Ｂ０５０ Ａ２３Ｌ 1/03 Ａ２３Ｌ 1/03 ４Ｂ０６４ 1/16 1/16 Ｚ ４Ｂ０６５ 1/30 1/30 Ｂ ４Ｃ０８８ Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ６１Ｋ 35/78 Ｕ Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ１２Ｃ 1/18 Ｃ１２Ｃ 1/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/02 9/02 Ｃ１２Ｐ 7/06 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 7/06 5/00 Ｃ (31)優先権主張番号 ６０／１６９，１６２ (32)優先日 平成11年12月６日(1999．12．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７７，７３９ (32)優先日 平成12年１月21日(2000．1．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７７，７４０ (32)優先日 平成12年１月21日(2000．1．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブキャナン、ボブ、ビー． アメリカ合衆国 94708 カリフォルニア 州、バークレー、タマルパイス ロード 19 (72)発明者 ウォン、ジョシュア アメリカ合衆国 94080 カリフォルニア 州、サンフランシスコ、ヴューモント テ ラス ９ (72)発明者 マークス、コリーナ アメリカ合衆国 94610 カリフォルニア 州、オークランド、サニー スロープ 407 Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AD08 CA15 CA17 CA19 2B150 AA01 AA02 AA03 AA05 AA07 AA08 AA20 AB20 CE01 DC23 DD31 4B014 GB11 GG02 GG03 GG04 4B018 LB01 LB02 LB08 MD49 ME07 4B024 AA01 AA05 AA08 AA10 BA08 CA02 DA01 EA04 FA02 FA18 GA11 4B032 DB01 DB05 DB21 DG01 DG02 DG04 DG05 DG07 DG08 4B035 LC06 LG34 4B046 LA01 LC07 LG27 LG28 LG29 LG30 4B050 CC03 DD13 EE10 FF20 LL02 LL10 4B064 AC03 CA06 CA11 CA19 CC24 CD19 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA41 CA42 CA43 CA53 4C088 AB73 MA34 MA52 NA14 ZB13

Claims (111)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニック植
    物の同じ部分と比較してチオレドキシン比活性が高められているトランスジェニ
    ック植物。
  2. 【請求項２】 チオレドキシン比活性が同種の非トランスジェニック植物の
    チオレドキシン比活性の少なくとも２倍である請求項１記載のトランスジェニッ
    ク植物。
  3. 【請求項３】 チオレドキシン比活性が同種の非トランスジェニック植物の
    チオレドキシン比活性の少なくとも５倍である請求項１記載のトランスジェニッ
    ク植物。
  4. 【請求項４】 チオレドキシン比活性が同種の非トランスジェニック植物の
    チオレドキシン比活性の少なくとも10倍である請求項１記載のトランスジェニッ
    ク植物。
  5. 【請求項５】 チオレドキシンがチオレドキシンhである請求項１記載のト
    ランスジェニック植物。
  6. 【請求項６】 チオレドキシンhが、オオムギ、コムギ、アラビドプシス属
    植物、タバコ、イネ、ブラシカ属植物、ピケア属植物またはダイズのチオレドキ
    シンhである、請求項６記載のトランスジェニック植物。
  7. 【請求項７】 チオレドキシン比活性が少なくとも0.128 A340nm/分/mgタン
    パク質である、請求項１記載のトランスジェニック植物。
  8. 【請求項８】 植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニック植
    物の同じ部分のチオレドキシンタンパク質と比較してチオレドキシンタンパク質
    の含量が高められているトランスジェニック植物。
  9. 【請求項９】 チオレドキシンタンパク質がチオレドキシンhタンパク質で
    ある請求項８記載のトランスジェニック植物。
  10. 【請求項１０】 チオレドキシンhタンパク質が、オオムギ、コムギ、アラ
    ビドプシス属植物、タバコ、イネ、ブラシカ属植物、ピケア属植物またはダイズ
    のチオレドキシンhである、請求項８記載のトランスジェニック植物。
  11. 【請求項１１】 チオレドキシンタンパク質の含量が少なくとも10μg/mg可
    溶性タンパク質である請求項８記載のトランスジェニック植物。
  12. 【請求項１２】 植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニック
    植物の同じ部分と比較してSH：SS比が高められているトランスジェニック植物。
  13. 【請求項１３】 SH：SS比が少なくとも５：１である請求項１２記載のトラ
    ンスジェニック植物。
  14. 【請求項１４】 植物が、イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ、オート
    ムギ、ライムギ、ソルガム、ミレット、ライコムギ、ならびに飼料用草および芝
    草からなる群より選択されるものである、請求項１、８または１２記載のトラン
    スジェニック植物。
  15. 【請求項１５】 植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニック
    植物の同じ部分と比較してアレルゲン性が低減されているトランスジェニック植
    物。
  16. 【請求項１６】 アレルゲン性が過敏性であり、該過敏性が少なくとも５％
    低い、請求項１５記載のトランスジェニック植物。
  17. 【請求項１７】 植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニック
    植物の同じ部分と比較して消化性が高められているトランスジェニック植物。
  18. 【請求項１８】 消化性が少なくとも５％高められたものである請求項１７
    記載のトランスジェニック植物。
  19. 【請求項１９】 イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、ラ
    イムギ、ソルガム、ミレット、ライコムギ、ならびに飼料用草および芝草からな
    る群より選択される、請求項１５または１７記載のトランスジェニック植物。
  20. 【請求項２０】 植物の少なくとも一部分が、同種の非トランスジェニック
    植物の同じ部分と比較してジベレリン酸誘導性酵素の発現が早期に開始するおよ
    び／または高められているトランスジェニック植物。
  21. 【請求項２１】 酵素がプルラナーゼである請求項２０記載のトランスジェ
    ニック植物。
  22. 【請求項２２】 プルラナーゼが、534 nm/30分/mgタンパク質において少な
    くとも１〜２吸光度単位の比活性を有するものである請求項２１記載のトランス
    ジェニック植物。
  23. 【請求項２３】 酵素がαアミラーゼである請求項２０記載のトランスジェ
    ニック植物。
  24. 【請求項２４】 αアミラーゼが同種の非トランスジェニック植物における
    発現の少なくとも８時間前に発現される、請求項２３記載のトランスジェニック
    植物。
  25. 【請求項２５】 αアミラーゼがαアミラーゼAである請求項２３記載のト
    ランスジェニック植物。
  26. 【請求項２６】 αアミラーゼがαアミラーゼBである請求項２３記載のト
    ランスジェニック植物。
  27. 【請求項２７】 トランスジェニック植物がオオムギである請求項２０記載
    のトランスジェニック植物。
  28. 【請求項２８】 一部分が食用に適した部分である請求項１、８、１２、１
    ５、１７または２０記載のトランスジェニック植物。
  29. 【請求項２９】 食用に適した部分が穀粒である請求項２８記載のトランス
    ジェニック植物。
  30. 【請求項３０】 食用に適した部分が種子である請求項２８記載のトランス
    ジェニック植物。
  31. 【請求項３１】 トランスジェニック植物の一部分がチオレドキシンポリペ
    プチドを発現する組換え核酸を含むものである、請求項１、８、１２、１５、１
    ７または２０記載のトランスジェニック植物。
  32. 【請求項３２】 植物の少なくとも一部分が組換え核酸を含み、該組換え核
    酸はチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子と機能しうる形で連結さ
    れ、該部分において活性を有するプロモーターを含むものである、トランスジェ
    ニック植物。
  33. 【請求項３３】 一部分が種子である請求項３２記載のトランスジェニック
    植物。
  34. 【請求項３４】 一部分が穀粒である請求項３２記載のトランスジェニック
    植物。
  35. 【請求項３５】 プロモーターが種子または穀粒の成熟に特異的なプロモー
    ターである請求項３２記載のトランスジェニック植物。
  36. 【請求項３６】 プロモーターが、イネグルテリン、イネオリジン（oryzin
    ）、イネプロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン、コムギグルテリ
    ン、トウモロコシゼイン、トウモロコシグルテリン、オートムギグルテリン、ソ
    ルガムカフィリン、ミレットペニセチン、ライムギセカリンおよびトウモロコシ
    胚特異的グロブリンプロモーターからなる群より選択されるものである、請求項
    ３５記載のトランスジェニック植物。
  37. 【請求項３７】 オオムギホルデインプロモーターがB1ホルデインプロモー
    ターおよびDホルデインプロモーターからなる群より選択されるものである、請
    求項３６記載のトランスジェニック植物
  38. 【請求項３８】 イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、ラ
    イムギ、ソルガム、ミレット、ライコムギ、芝草および飼料用草からなる群より
    選択される、請求項３２記載のトランスジェニック植物。
  39. 【請求項３９】 チオレドキシンがチオレドキシンhである請求項３２記載
    のトランスジェニック植物。
  40. 【請求項４０】 チオレドキシンhが、オオムギ、コムギ、タバコ、イネ、
    ブラシカ属植物、アラビドプシス属植物、ピケア属植物またはダイズのチオレド
    キシンhである、請求項３９記載のトランスジェニック植物。
  41. 【請求項４１】 組換え核酸が、プロモーター及びチオレドキシンタンパク
    質をコードする核酸分子に機能しうる形で連結されたシグナルペプチドをコード
    する核酸分子をさらに含むものである、請求項３２記載のトランスジェニック植
    物。
  42. 【請求項４２】 シグナルペプチドが細胞内体に対しチオレドキシンポリペ
    プチドの発現をターゲティングするものである、請求項４１記載のトランスジェ
    ニック植物。
  43. 【請求項４３】 シグナルペプチドが、オオムギB1ホルデインシグナルペプ
    チドおよびDホルデインシグナルペプチドからなる群より選択されるものである
    、請求項４２記載のトランスジェニック植物。
  44. 【請求項４４】 同種の非トランスジェニック種子または穀粒と比較してチ
    オレドキシン比活性が高いトランスジェニック種子または穀粒。
  45. 【請求項４５】 チオレドキシン比活性が、同種の非トランスジェニック種
    子または穀粒のチオレドキシン比活性の少なくとも２倍である、請求項４４記載
    のトランスジェニック種子または穀粒。
  46. 【請求項４６】 チオレドキシン比活性が、同種の非トランスジェニック種
    子または穀粒のチオレドキシン比活性の少なくとも５倍である、請求項４４記載
    のトランスジェニック種子または穀粒。
  47. 【請求項４７】 チオレドキシン比活性が、同種の非トランスジェニック種
    子または穀粒のチオレドキシンの活性の少なくとも10倍である、請求項４４記載
    のトランスジェニック種子または穀粒。
  48. 【請求項４８】 チオレドキシンがチオレドキシンhである請求項４４記載
    のトランスジェニック種子または穀粒。
  49. 【請求項４９】 チオレドキシンhが、オオムギ、コムギ、タバコ、ダイズ
    、アラビドプシス属植物、ピケア属植物またはブラシカ属植物のチオレドキシン
    hである、請求項４８記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  50. 【請求項５０】 チオレドキシン比活性が少なくとも0.128 A340nm/分/mgタ
    ンパク質である請求項４４記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  51. 【請求項５１】 チオレドキシンポリペプチドの含量が同種の非トランスジ
    ェニック種子または穀粒と比較して高いものであるトランスジェニック種子また
    は穀粒。
  52. 【請求項５２】 チオレドキシンポリペプチド含量が少なくとも10μg/mg可
    溶性タンパク質である請求項５１記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  53. 【請求項５３】 チオレドキシンポリペプチドがチオレドキシンhポリペプ
    チドである請求項５１記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  54. 【請求項５４】 チオレドキシンhポリペプチドが、オオムギ、コムギ、タ
    バコ、イネ、ブラシカ属植物、ピケア属植物、ダイズまたはアラビドプシス属植
    物のチオレドキシンhタンパク質である、請求項５３記載のトランスジェニック
    種子または穀粒。
  55. 【請求項５５】 SH：SS比が同種の非トランスジェニック種子または穀粒と
    比較して高いものであるトランスジェニック種子または穀粒。
  56. 【請求項５６】 SH：SS比が少なくとも５：１である請求項５５記載のトラ
    ンスジェニック種子または穀粒。
  57. 【請求項５７】 イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、ラ
    イムギ、ソルガム、ミレット、ライコムギ、飼料用草および芝草からなる群より
    選択されるものである、請求項４４、５１または５５記載のトランスジェニック
    種子または穀粒。
  58. 【請求項５８】 同種の非トランスジェニック種子または穀粒と比較してア
    レルゲン性が低いものであるトランスジェニック種子または穀粒。
  59. 【請求項５９】 アレルゲン性が過敏性であり、該過敏性が少なくとも５％
    低減した請求項５８記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  60. 【請求項６０】 同種の非トランスジェニック種子または穀粒と比較して消
    化性が高いものであるトランスジェニック種子または穀粒。
  61. 【請求項６１】 消化性が少なくとも５％高いものである請求項６０記載の
    トランスジェニック種子または穀粒。
  62. 【請求項６２】 コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、オートムギ、ラ
    イムギ ソルガム、ミレット、ライコムギ、飼料用草または芝草の種子または穀
    粒である、請求項５８または６０記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  63. 【請求項６３】 同種の非トランスジェニック種子と比較して早期発現およ
    び／または増大した発現のジベレリン酸誘導性酵素を含む、チオレドキシンタン
    パク質を過剰発現するトランスジェニック種子または穀粒。
  64. 【請求項６４】 種子または穀粒が発芽したものでありかつ酵素がプルラナ
    ーゼである、請求項６３記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  65. 【請求項６５】 プルラナーゼが534 nm/30分/mgタンパク質において少なく
    とも１〜２吸光度単位の比活性を有するものである、請求項６４記載のトランス
    ジェニック種子または穀粒。
  66. 【請求項６６】 酵素がαアミラーゼである請求項６３記載のトランスジェ
    ニック種子または穀粒。
  67. 【請求項６７】 αアミラーゼが同種の非トランスジェニック植物の発現の
    少なくとも８時間前に種子または穀粒で発現される、請求項６６記載のトランス
    ジェニック種子または穀粒。
  68. 【請求項６８】 αアミラーゼがαアミラーゼAである請求項６６記載のト
    ランスジェニック種子または穀粒。
  69. 【請求項６９】 αアミラーゼがαアミラーゼBである請求項６６記載のト
    ランスジェニック種子または穀粒。
  70. 【請求項７０】 同種の非トランスジェニック種子または穀粒と比較して発
    芽速度が大きいトランスジェニック種子または穀粒。
  71. 【請求項７１】 同種の非トランスジェニック種子または穀粒の発芽開始の
    少なくとも８時間前に発芽が開始するトランスジェニック種子または穀粒。
  72. 【請求項７２】 同種の非トランスジェニック種子または穀粒よりも５％効
    率的に発芽するトランスジェニック種子または穀粒。
  73. 【請求項７３】 オオムギ種子である、請求項６３、７０、７１または７２
    記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  74. 【請求項７４】 種子または穀粒のタンパク質が、同種の非トランスジェニ
    ック種子または穀粒と比較して少なくとも５％多く可溶性画分に再配分されるも
    のである、チオレドキシンを過剰発現するトランスジェニック種子または穀粒。
  75. 【請求項７５】 コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、オートムギ、ラ
    イムギ、ソルガム、ミレット、ライコムギ、飼料用草または芝草の種子または穀
    粒である、請求項７４記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  76. 【請求項７６】 トランスジェニック種子または穀粒がチオレドキシンポリ
    ペプチドを発現する組換え核酸を含むものである、請求項４４、５１、５５、５
    ８、６０、６３、７０、７１、７２または７４記載のトランスジェニック種子ま
    たは穀粒。
  77. 【請求項７７】 組換え核酸を含むトランスジェニック種子または穀粒であ
    って、該組換え核酸はチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子と機能
    しうる形で連結され、種子または穀粒において活性を有するプロモーターを含む
    ものである組換え核酸を含むトランスジェニック種子または穀粒。
  78. 【請求項７８】 プロモーターが種子または穀粒の成熟特異的プロモーター
    である請求項７７記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  79. 【請求項７９】 プロモーターが、イネグルテリン、イネオリジン、イネプ
    ロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジン、コムギグルテリン、トウモ
    ロコシゼイン、トウモロコシグルテリン、オートムギグルテリン、ソルガムカフ
    ィリン、ミレットペニセチン、ライムギセカリンおよびトウモロコシ胚特異的グ
    ロブリンからなる群より選択されるものである、請求項７８記載のトランスジェ
    ニック種子または穀粒。
  80. 【請求項８０】 オオムギホルデインプロモーターがB1ホルデインプロモー
    ターおよびDホルデインプロモーターからなる群より選択されるものである請求
    項７９記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  81. 【請求項８１】 イネ、オオムギ、トウモロコシ、コムギ、オートムギ、ラ
    イムギ、ソルガム、ミレットおよびライコムギの種子または穀粒からなる群より
    選択されるものである、請求項８０記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  82. 【請求項８２】 チオレドキシンポリペプチドがチオレドキシンhである請
    求項７７記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  83. 【請求項８３】 チオレドキシンhが、オオムギ、コムギ、タバコ、イネ、
    ダイズ、ブラシカ属植物、ピケア属植物またはアラビドプシス属植物のチオレド
    キシンhである、請求項８２記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  84. 【請求項８４】 組換え核酸が、プロモーターおよびチオレドキシンタンパ
    ク質をコードする核酸分子と機能しうる形で連結されたシグナルペプチドをコー
    ドする核酸分子をさらに含むものである、請求項７７記載のトランスジェニック
    種子または穀粒。
  85. 【請求項８５】 シグナルペプチドが細胞内体に対しチオレドキシンポリペ
    プチドの発現をターゲティングするものである請求項８４記載のトランスジェニ
    ック種子または穀粒。
  86. 【請求項８６】 シグナルペプチドがオオムギB1ホルデインシグナルペプチ
    ドおよびDホルデインシグナルペプチドからなる群より選択されるものである請
    求項８５記載のトランスジェニック種子または穀粒。
  87. 【請求項８７】 請求項４４、５１、５５、５８、６０、６３、７０、７１
    、７７または８４記載のトランスジェニック種子または穀粒から作製された食料
    、飼料または飲料製品。
  88. 【請求項８８】 粉末、ドー、パン、麺類、クッキー、ケーキ、増粘剤、ビ
    ール、麦芽飲料または食品添加物である請求項８７記載の食料、飼料または飲料
    製品。
  89. 【請求項８９】 アレルゲン性が低減されたものである請求項８７記載の食
    料、飼料またはビール製品。
  90. 【請求項９０】 消化性が高められたものである請求項８９記載の食料、飼
    料または飲料製品。
  91. 【請求項９１】 ドーが、同種の非トランスジェニック種子または穀粒から
    作製されたドーと比較して強度および容量が増大したものである請求項８８記載
    の食料品。
  92. 【請求項９２】 ドーが、同種の非トランスジェニック種子または穀粒から
    作製されたドーと比較して容量が少なくとも３％増大したものである請求項９１
    記載の食料品。
  93. 【請求項９３】 請求項４４、５１、５５、５８、６０、６３、７０、７１
    、７７または８４記載の種子または穀粒から作出されるトランスジェニック植物
    。
  94. 【請求項９４】 請求項４４、５１、５５、５８、６０、６３、７０、７１
    、７７または８４記載のトランスジェニック種子または穀粒を栽培することを含
    むトランスジェニック植物の作出方法。
  95. 【請求項９５】 植物の少なくとも一部分が同種の非トランスジェニック植
    物と比較してチオレドキシン比活性が高められたトランスジェニック植物の作出
    方法であって、該部分において活性を有する転写調節エレメントと機能しうる形
    で連結されたチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え核
    酸を該部分において発現させることを含む上記方法。
  96. 【請求項９６】 植物の少なくとも一部分が同種の非トランスジェニック植
    物と比較してチオレドキシンタンパク質含量が高められたトランスジェニック植
    物の作出方法であって、該部分において活性を有する転写調節エレメントと機能
    しうる形で連結されたチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子を含む
    組換え核酸を該部分において発現させることを含む上記方法。
  97. 【請求項９７】 植物の少なくとも一部分が同種の非トランスジェニック植
    物と比較してSH：SS比が高められたトランスジェニック植物の作出方法であって
    、該部分において活性を有する転写調節エレメントと機能しうる形で連結された
    チオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え核酸を該部分に
    おいて発現させることを含む上記方法。
  98. 【請求項９８】 植物の少なくとも一部分が同種の非トランスジェニック植
    物と比較してアレルゲン性が低いトランスジェニック植物の作出方法であって、
    該部分において活性を有する転写調節エレメントと機能しうる形で連結されたチ
    オレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え核酸を該部分にお
    いて発現させることを含む上記方法。
  99. 【請求項９９】 植物の少なくとも一部分が同種の非トランスジェニック植
    物と比較して消化性が高められたトランスジェニック植物の作出方法であって、
    該部分において活性を有する転写調節エレメントと機能しうる形で連結されたチ
    オレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え核酸を該部分にお
    いて発現させることを含む上記方法。
  100. 【請求項１００】 植物の少なくとも一部分が同種の非トランスジェニック
    植物と比較してジベレリン酸誘導性酵素の発現が改変されているトランスジェニ
    ック植物の作出方法であって、該部分において活性を有する転写調節エレメント
    と機能しうる形で連結されたチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子
    を含む組換え核酸を該部分において発現させることを含む上記方法。
  101. 【請求項１０１】 一部分が種子または穀粒である請求項９５〜１００のい
    ずれか１項に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 種子または穀粒の発芽特性を改変する方法であって、該
    種子または穀粒において活性を有する転写調節エレメントと機能しうる形で連結
    されたチオレドキシンポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え核酸を含
    む種子を発芽させることを含む上記方法。
  103. 【請求項１０３】 吸収不良症候群またはアレルギーを軽減または予防する
    方法であって、請求項４４、５１、５５、５８、６０、６３、７０、７１、７７
    または８４記載のトランスジェニック種子または穀粒から作製された食料品を、
    該症候群またはアレルギーを患う患者に給餌することを含む上記方法。
  104. 【請求項１０４】 請求項４４、５１、５５、５８、６０、６３、７０、７
    １、７７または８４記載のトランスジェニック種子または穀粒を発酵することを
    含むアルコールの製造方法。
  105. 【請求項１０５】 請求項４４、５１、５５、５８、６０、６３、７０、７
    １、７７または８４記載のトランスジェニック種子または穀粒を麦芽が生じるよ
    うな条件下にて発芽させることを含む麦芽の製造方法。
  106. 【請求項１０６】 チオレドキシンの精製方法であって、同種の非トランス
    ジェニック植物と比較してチオレドキシンタンパク質が増大しているトランスジ
    ェニック植物の抽出物を加熱し、それにより該抽出物のNADPH酸化が低減してチ
    オレドキシンが精製されることを含む上記方法。
  107. 【請求項１０７】 チオレドキシンタンパク質が活性なチオレドキシンタン
    パク質である請求項１０６記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 トランスジェニック植物の一部分または該部分の抽出物
    を含む食料、飼料または飲料であって、該部分が、該部分において機能しうる転
    写調節配列と機能しうる形で連結されたチオレドキシンをコードする配列を含む
    組換え核酸を含むものである、上記食料、飼料または飲料。
  109. 【請求項１０９】 非常に消化しやすいタンパク質を含有するものである請
    求項１０８記載の食料、飼料または飲料。
  110. 【請求項１１０】 非常に消化しやすいデンプンを含むものである請求項１
    ０８記載の食料、飼料または飲料。
  111. 【請求項１１１】 低アレルギー誘発性のものである請求項１０８記載の食
    料、飼料または飲料。
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