CN112707956B - 一种玉米穗行数相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种玉米穗行数相关蛋白及其编码基因和应用，具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的玉米蛋白质Zm00001d016075及其编码基因在提高玉米穗行数中的应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过敲除玉米中Zm00001d016075蛋白质的编码基因，来获得穗行数显著增加的玉米植株，达到增产的目的，为创制玉米突变体植株和/或玉米育种提供了更精准、高效、省时、省力、安全，无外源DNA插入的技术方法，具有潜在的育种价值。

Description

一种玉米穗行数相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种玉米穗行数相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是世界上最重要的谷类作物之一，用途广泛，在维系粮食安全、促进畜牧业发展、满足工业原料需求等方面具有举足轻重的作用。但随着我国人口增加和工业化与城镇化的发展，耕地面积减少的趋势已不可逆转。因此，提高玉米单产水平成为保障玉米有效供给的根本途径。穗粒数、粒重和单位面积穗数是玉米产量构成的基本要素，穗粒数由穗行数和行粒数决定，而穗行数对玉米穗粒数具有重要的决定作用。研究表明玉米穗行数是多基因控制的数量性状，其与玉米产量呈显著正相关关系，并且由于穗行数是在雌穗分化过程中决定的，因此，其遗传力较高且受外界环境条件影响较小，通过选育适宜的穗行数，是进一步提高玉米产量的有效途径之一。穗行数作为重要的产量构成因子之一，同时也是重要的驯化性状，在玉米的进化过程中经历了由少到多的巨大变化，对调控穗行数的基因进行挖掘可帮助我们进一步了解其遗传基础并为构建玉米产量性状协调表达体系、提高玉米育种效率提供更多的基因资源。在此条件下，加强穗行数的遗传与发育研究，对玉米育种具有重要意义。

近年来发展起来的基因编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良强有力的手段之一。基因编辑育种具有精准、高效、省时、省力和安全等特点，基于基因编辑的新一代遗传育种技术为农业技术革命提供了新契机，也是各国现代农业发展争夺的焦点。CRISPR系统的基因编辑技术正在创造新型的健康食物，实现传统转基因作物向基因编辑作物概念性的转变。传统的转基因是将外源DNA序列插入作物的基因组中，而基因编辑的概念则是精确地编辑、改良和改造作物中原来基因组中特定的基因，人为地强化自然赋予植物的优良性状。其中，CRISPR/Cas9是继TALLEN、ZFN之后的一种新型高效定点编辑基因的新技术，其可以通过对植物自身基因的快速、定点改变，实现对作物性状的精准改良，其被誉为“下一代的育种技术”。CRISPR/Cas9系统主要由引导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白结构域组成，在识别、切割目标DNA双链后，通过同源重组或非同源末端连接修复途径产生DNA突变。通过该技术可以促进商业化玉米育种进程，克服传统育种的短板，具有缩短育种周期和不影响其他性状等优点，在玉米分子育种过程中将发挥越来越重要的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高玉米穗行数。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了与玉米穗行数相关的蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控玉米穗行数或提高玉米穗行数中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控玉米穗行数或提高玉米穗行数的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育高产玉米的产品中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在玉米育种中的应用；

调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

所述蛋白质来源于玉米，其名称为Zm00001d016075，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的Zm00001d016075蛋白质，为与SEQ ID No.1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的Zm00001d016075蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的Zm00001d016075蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的Zm00001d016075蛋白质。

本发明还提供了与Zm00001d016075蛋白质相关的生物材料的应用，所述应用为下述任一一种：

D1)与Zm00001d016075蛋白质相关的生物材料在调控玉米穗行数或提高玉米穗行数中的应用；

D2)与Zm00001d016075蛋白质相关的生物材料在制备调控玉米穗行数或提高玉米穗行数的产品中的应用；

D3)与Zm00001d016075蛋白质相关的生物材料在制备培育高产玉米的产品中的应用；

D4)与Zm00001d016075蛋白质相关的生物材料在玉米育种中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码Zm00001d016075蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码序列(CDS)是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码Zm00001d016075蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的Zm00001d016075蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码Zm00001d016075蛋白质且具有Zm00001d016075蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本发明还提供了一种提高玉米穗行数的方法，包括通过敲除玉米中Zm00001d016075蛋白质的编码基因来提高玉米穗行数。

上述方法中，所述敲除利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向Zm00001d016075蛋白质的编码基因的sgRNA的载体。

上述方法中，所述Zm00001d016075sgRNA片段的靶标可为SEQ ID No.2的第367-389位。

上述方法中，所述玉米包括玉米自交系。

本发明还提供了一种蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

E1)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控玉米穗行数或提高玉米穗行数中的应用；

E2)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控玉米穗行数或提高玉米穗行数的产品中的应用；

E3)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育高产玉米的产品中的应用；

E4)蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在玉米育种中的应用；

所述蛋白质为如下F1)、F2)或F3)：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；

F2)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)或F2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

F3)在F1)或F2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述应用中，所述SEQ ID No.7的蛋白质相关的生物材料的应用，为下述任一一种：

G1)与SEQ ID No.7的蛋白质相关的生物材料在调控玉米穗行数或提高玉米穗行数中的应用；

G2)与SEQ ID No.7的蛋白质相关的生物材料在制备调控玉米穗行数或提高玉米穗行数的产品中的应用；

G3)与SEQ ID No.7的蛋白质相关的生物材料在制备培育高产玉米的产品中的应用；

G4)与SEQ ID No.7的蛋白质相关的生物材料在玉米育种中的应用；

所述生物材料为下述H1)至H7)中的任一种：

H1)编码SEQ ID No.7的蛋白质的核酸分子；

H2)含有H1)所述核酸分子的表达盒；

H3)含有H1)所述核酸分子的重组载体、或含有H2)所述表达盒的重组载体；

H4)含有H1)所述核酸分子的重组微生物、或含有H2)所述表达盒的重组微生物、或含有H3)所述重组载体的重组微生物；

H5)含有H1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有H2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

H6)含有H1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有H2)所述表达盒的转基因植物组织；

H7)含有H1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有H2)所述表达盒的转基因植物器官。

H1)所述核酸分子可为如下M1)或M2)或M3)或M4)所示的DNA分子：

M1)编码序列是SEQ ID No.8所示的DNA分子；

M2)核苷酸序列是SEQ ID No.8所示的DNA分子；

M3)与M1)或M2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求8中所述蛋白质的DNA分子；

M4)在严格条件下与M1)或M2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求8中所述蛋白质的DNA分子。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

本发明还提供了所述提高玉米穗行数的方法在创制玉米突变体植株和/或玉米育种中的应用。所述的玉米育种可为玉米穗行数筛选育种。

本发明所述基因Zm00001d016075经过基于CRISPR-Cas9系统的敲除实验成功获得了该基因的敲除转基因事件，收获转基因阳性植株和野生型C01的自交果穗进行穗行数表型鉴定和比较的结果表明敲除目的基因可增加玉米自交系的穗行数，从而证明基因Zm00001d016075在穗行数形成和发育过程中具有重要的生物学功能。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)对本发明基因Zm00001d016075进行基因敲除后，穗行数显著增加。

(2)基于CRISPR-Cas9技术，本发明提供了一个新的靶基因，现有技术中没有对其进行相应基因敲除的技术教导。

(3)本发明为创制玉米突变体植株和/或玉米育种提供了更精准、高效、省时、省力、安全，无外源DNA插入的技术方法，实现了对玉米穗行数性状的精准改良，可以促进商业化玉米育种进程，克服传统育种的短板，缩短育种周期同时不影响其他性状。

附图说明

图1为基因Zm00001d016075敲除事件的穗行数表型观察示意图。

具体实施方式

下述实施例中的玉米自交系C01来源于国家种质资源库(网址为：http://www.cgris.net/),公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人处)获得。HuangJ,Lu G,Liu L,et al.The kernel size-related quantitative trait locus qKW9encodes a pentatricopeptide repeat protein that aaffects photosynthesis andgrain filling.Plant Physiology.2020,183:1696-1709.

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、敲除Zm00001d016075基因提高玉米穗行数

1、Zm00001d016075基因的克隆

从玉米Maize sequence数据库(http://www.maizesequence.org)下载参考基因组B73对应的候选基因序列，在基因组5’UTR和3’UTR区域利用Primer5软件设计引物，以玉米自交系C01幼苗基因组DNA为模板扩增候选基因组全长DNA，得到Zm00001d016075的基因组基因。Zm00001d016075的基因组基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，该基因只有一个外显子Zm00001d016075，其CDS如序列表中序列2所示。将该基因编码的蛋白质命名Zm00001d016075，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2、CRISPR-Cas9重组载体构建及转化玉米自交系C01

(1)CRISPR-Cas9载体线性化。该载体名称为CRISPR/Cas9-CPB，来源于中国农业科学院作物科学研究所玉米基因编辑育种研究组，CRISPR/Cas9-CPB是文献1中第1573页左栏Materials and methods中Construction of the RNA-guided Cas9vector的第1-7行构建的载体，即将改造后的SpCas9(Cong et al.,2013)编码序列插入CPB载体的玉米ubiquitin启动子后并将SV40核定位信号序列(NLS)和nucleoplasmin核定位信号序列(NLS)分别插入Cas9编码序列的两端得到的重组载体。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得CRISPR/Cas9-CPB，以重复本发明的实验用。文献1：Li CX,Liu CL,Qi XT,et al.RNA-guided Cas9 as an in vivo desired-target mutator in maize.Plant Biotechnol J,2017,15(12):1566-1576。

用HindIII内切酶37度水浴切割载体CRISPR/Cas9-CPB。体系如表2：

表2

37度水浴1h，之后切胶回收。

(2)Zm00001d016075sgRNA片段设计

利用CRISPR-P_2.0网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)设计靶标位点，将基因Zm00001d016075的外显子序列上传到CRISPR-P_2.0网站，选择参考基因组为玉米基因组，获得临近5’-NGG的潜在编辑位点为：5’-CCTCGGTTGGATCTTAAGTTATC-3’(sgRNA的靶点序列，是序列2的第367-389位，SEQ ID No.3)。

(3)之后连接载体线性片段和sgRNA片段的编码DNA片段，所述sgRNA片段的编码DNA片段如SEQ ID No.4所示，体系如表3：

表3

轻轻混合，50度反应15分钟。

(4)转化

在冰上融化Trans1-T1感受态细胞，在50μl感受态细胞中加入10μl的重组产物，轻轻弹动离心管混匀，冰上放置30分钟，之后42度水浴中热激30秒，之后马上转移至冰上冷却2分钟，加入500μl常温的LB培养基，之后37度摇床中180rpm培养1小时，之后取100μl细胞均匀涂在具有卡那霉素抗性的LB平板上，在37度培养箱中过夜培养。之后进行阳性克隆筛选，测序正确的菌液提取质粒待用。得到用于敲除Zm00001d016075基因的sgRNA的表达载体，将其命名为CRISPR-Cas9-sgRNA1，其表达靶向于Zm00001d016075基因外显子中的5’-CCTCGGTTGGATCTTAAGTTATC-3’(sgRNA的靶点序列，序列2的第367-389位)的sgRNA。

(5)采用农杆菌侵染玉米幼胚转化方法进行玉米自交系C01的遗传转化实验，具体方法如下：

1)将CRISPR-Cas9-sgRNA1载体转化农杆菌EHA105感受态，得到含有CRISPR-Cas9-sgRNA1的重组农杆菌，命名为CRISPR-Cas9-sgRNA1/EHA105。

2)用CRISPR-Cas9-sgRNA1/EHA105侵染玉米自交系C01的幼胚50-100个，利用除草剂双丙氨膦选择T0、T1、T2代阳性植株并自交。获得T3代转基因种子，种植后进行基因型鉴定。将其中的一个株系命名为K0-1。

分别以转基因植株K0-1和玉米自交系C01(野生型植株，WT)的基因组DNA为模板，用5’-CGTAGGGATACTTCAGGGTTTGT-3’(SEQ ID No.5)(该引物在基因ATG前，可在网址http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Gene/Sequence？db＝core；g＝Zm00001d016075；r＝5:143109304-143111205；t＝Zm00001d016075_T001上查询)和5’-CGAGGCGTTCCTTTCATTTAC-3’(SEQ ID No.6)(该引物在基因TAG后面，反向互补后可在网站http://ensembl.gramene.org/Zea_mays/Gene/Sequence？db＝core；g＝Zm00001d016075；r＝5:143109304-143111205；t＝Zm00001d016075_T001上查询)PCR扩增包括剪切位点的基因组DNA片段，对扩增产物进行测序检测Zm00001d016075基因的敲除情况。结果发现，目的基因Zm00001d016075基因在阳性转基因事件中被敲除，表明成功获得了目的基因的敲除转基因事件。基因型鉴定结果如下：

转基因植株的扩增产物与野生型植株扩增产物的核苷酸序列比对结果如表4所示，转基因植株在Zm00001d016075基因相应区域缺失了4个核苷酸“TTGG”(对应于序列2的第373-376位)，造成翻译提前终止，从而将Zm00001d016075基因敲除。将具有表4的基因型的植株称为转基因阳性植株KO-1。

表4

上述突变后的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码序列如SEQ IDNo.8所示。

籽粒成熟后，收获36株转基因阳性植株KO-1和24株野生型玉米自交系C01的自交果穗进行穗行数表型鉴定。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05表示与野生型玉米自交系C01相比具有显著性差异。结果表明，转基因阳性植株KO-1的穗行数为17.56±0.25行/穗，野生型玉米自交系C01的穗行数为14.83±0.23行/穗，与转化受体玉米自交系C01植株相比，目的基因Zm00001d016075基因敲除转基因植株KO-1的穗行数增加(图1，p＝0.6107×10^-8)。可以看出，敲除目的基因Zm00001d016075基因可增加玉米自交系的穗行数，从而证明目的基因Zm00001d016075基因在穗行数形成和发育过程中具有重要的生物学功能。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种玉米穗行数相关蛋白及其编码基因和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 633

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 1

Met Glu Pro Arg His Gly Arg Ser Ala Phe Thr Ile Ser Phe Ser Asn

1 5 10 15

Pro Asn Gly Phe Ala Asn Gln Cys Thr Ala Ile Pro Ala Val Ser Tyr

20 25 30

Ser Ala Ala Gly Ser Ser Gln Leu Asp Val Leu Ala Pro Thr Arg Gly

35 40 45

Cys Lys Arg Lys Trp Thr Glu Leu Ala Leu Gly Leu Gly Asp Thr Ser

50 55 60

Ser Ser Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met Gly Thr Gly Cys Thr Val Ser

65 70 75 80

Ser Leu Lys Gly Ser Asp Asp Val Ser Cys Met Asp Tyr Asp Ile Ser

85 90 95

Phe Lys Leu Ser Leu Gly Asn Glu Asp Thr Ser Lys Leu His Lys Gln

100 105 110

Ala Cys Gly Ser Lys Arg Thr Met Glu Lys Pro Arg Leu Asp Leu Lys

115 120 125

Leu Ser Leu Ala Pro Ser Gln Ser Asp Val Thr Asp Ala Asp Leu Ile

130 135 140

Arg Ser Ser Ala Pro Gln Asp Met Phe Val Gln Pro Tyr Leu Met Ser

145 150 155 160

Ser Val Pro Thr Val Asp Glu Gly Ser Thr Ser Ala Arg His Pro Ser

165 170 175

Gly Gly Met Val Val Ser Phe Leu Asn Gln Ala Gly Ile Ser Pro Asn

180 185 190

Gln Leu Pro Pro Leu Asn Ser His Leu Val Gln Gly Pro Ala Cys Ser

195 200 205

Ala Pro Thr Val Leu Gln Leu Pro Lys Ser Ser Ala Ala Thr Ser Ser

210 215 220

Gly Phe Val Arg Pro Gln Gln Arg Asn Gly Ser Thr Lys Ile Cys Ser

225 230 235 240

Glu Pro Gly Cys Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ser Gly Arg Cys Ile

245 250 255

Ala His Gly Gly Gly Arg Arg Cys Gln Lys Glu Gly Cys Asn Lys Gly

260 265 270

Ala Glu Gly Arg Thr Ile Phe Cys Lys Ala His Gly Gly Gly Lys Arg

275 280 285

Cys Glu Arg Leu Gly Cys Thr Lys Ser Ala Glu Gly Arg Thr Asp Phe

290 295 300

Cys Ile Ala His Gly Gly Gly Arg Arg Cys Ser His Asp Gly Cys Lys

305 310 315 320

Arg Ala Ala Arg Gly Arg Ser Gly Leu Cys Ile Lys His Gly Gly Gly

325 330 335

Lys Arg Cys Gln Thr Leu Asn Cys Thr Lys Ser Ala Glu Gly Arg Ser

340 345 350

Gly Met Cys Ile Ala His Gly Gly Gly Arg Arg Cys Gln Tyr Ala Gly

355 360 365

Cys Gly Lys Gly Ala Gln Gly Ser Thr Asn Phe Cys Lys Ala His Gly

370 375 380

Gly Gly Lys Arg Cys Thr His Pro Asp Cys Ser Lys Gly Ala Glu Gly

385 390 395 400

Ser Thr Ala Phe Cys Lys Ala His Gly Gly Gly Lys Arg Cys Ser Ala

405 410 415

Asp Gly Cys Thr Lys Ser Val His Gly Gly Thr Gln Phe Cys Val Ala

420 425 430

His Gly Gly Gly Lys Arg Cys Val Val Glu Gly Cys Gly Lys Ser Ala

435 440 445

Arg Gly Arg Thr Asp Arg Cys Val Gly His Gly Gly Gly Lys Arg Cys

450 455 460

His Ser Ala Gly Cys Gly Lys Ser Ala Gln Gly Ser Thr Asp Phe Cys

465 470 475 480

Lys Ser His Gly Gly Gly Arg Arg Cys Ser Trp Gly His Pro Gly Ser

485 490 495

Asp Leu Gly Ser Gly Gly Ala Pro Cys Asp Arg Leu Ala Arg Gly Lys

500 505 510

Lys Gly Leu Cys Asp Arg His Asn Pro Leu Val His Asp Asn Ser Val

515 520 525

His Gly Gly Ala Ser Phe Gly Gly Phe Ser Val Val Ser Ala Ala Ala

530 535 540

Leu Ser Glu Gly Asp Gly Ser Pro Ser Pro Gly Thr Glu Thr Ser Met

545 550 555 560

Arg Ser Phe Phe Met His Ala Val Glu Ala Pro Arg Cys Val Ala Ala

565 570 575

Ser Ala His Glu Gly Arg Val His Gly Gly Asn Phe Met Pro Ile Met

580 585 590

Leu Asp Gly Gly Val Gly Leu Gly Lys Arg Pro Ala Asp Asn Ala Asp

595 600 605

Ala Gly Ala Ser Ala Pro Pro Arg Ser Trp Lys Ser Met Glu Lys Ala

610 615 620

Cys Gly Ser Ala Pro Arg Ser Trp Leu

625 630

<210> 2

<211> 1902

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 2

atggaaccca ggcatgggcg ttcagcattc actataagtt tctcaaatcc aaatggcttt 60

gctaatcagt gcaccgccat tccagccgtc agttattcag cggctggttc tagccaactt 120

gatgtgctgg ctcctactag aggttgcaag agaaagtgga ctgagttggc tctaggtctg 180

ggtgacacat caagctcaga cagcagcaag cagagcatgg gtactggctg cactgtttct 240

tctctcaagg gaagcgatga tgtctcatgt atggattacg acataagttt caagttatct 300

cttggcaatg aagatacttc caagctgcat aaacaggctt gtggttctaa aaggactatg 360

gagaagcctc ggttggatct taagttatct ttggctccat ctcaatccga tgtaactgac 420

gcggatctaa tcagaagcag tgcacctcag gacatgtttg tgcagccgta cttgatgtcc 480

tcagtgccaa cagtcgatga aggatctaca tctgctcgac atccatctgg aggcatggtg 540

gtttccttcc ttaaccaggc tgggatttct ccgaaccagt tgcccccact taactctcat 600

ctggtccagg gtccagcttg ttcagcacca acagtgctcc aactgccaaa aagttcagct 660

gccacttctt ctgggtttgt ccgcccacag caacgcaacg gtagcacaaa gatctgttca 720

gagccaggtt gtgcaaaagg agccaggggt tcatctgggc ggtgcattgc ccacggtggg 780

ggcagaaggt gccagaaaga aggctgcaac aaaggagccg aggggaggac catcttctgt 840

aaagcccatg gagggggcaa gcgctgtgag cgccttggat gcaccaaaag tgccgaaggc 900

cggacagatt tctgcatagc tcacggcggc gggcggcgtt gcagtcatga cgggtgcaag 960

agggcggcgc gaggcagatc gggcctgtgt atcaagcatg gtggcgggaa gaggtgccaa 1020

acgctgaact gcacaaagag cgcggaaggg cggtcaggca tgtgcatcgc tcatggtggc 1080

gggcggcgct gccagtacgc tggctgcggg aagggagccc agggcagcac aaacttctgc 1140

aaggcccacg gcggcggcaa gagatgcacg caccccgact gctccaaggg cgcggagggg 1200

agcacggcgt tctgcaaagc ccacggaggc ggcaagcgct gctcggctga cggctgcacg 1260

aagagcgtgc acggcgggac ccagttctgc gtcgcgcacg gaggcgggaa gaggtgcgtg 1320

gtggaagggt gcgggaagag cgcgagaggc aggaccgacc gctgcgtcgg ccatggcggg 1380

ggcaagcggt gccactccgc cggctgcggg aagagcgcgc aggggagcac cgatttctgc 1440

aagtcccacg gcggtggcag gcgctgctcg tgggggcacc ctggctcaga cctcgggtct 1500

ggtggcgctc cctgcgaccg gctggcgaga ggcaagaagg ggctgtgcga ccggcacaac 1560

ccgctggtcc atgacaacag cgtgcatggg ggtgcgtcgt tcggtggctt cagtgtcgtc 1620

agtgccgccg ccctttctga gggagatggc tctccatctc caggcaccga gacaagcatg 1680

cgcagcttct tcatgcacgc ggtggaggct cctcgctgtg tggcggcctc ggcccatgaa 1740

ggccgggtgc atgggggcaa cttcatgcct atcatgctcg acggtggcgt gggactcggg 1800

aagaggccgg ccgacaacgc tgatgctggt gcctctgccc ctcctcgcag ctggaaaagt 1860

atggagaagg cctgtggatc tgcgccgcgc agctggctgt ag 1902

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 3

cctcggttgg atcttaagtt atc 23

<210> 4

<211> 637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgcactgcac aagctgctgt ttttgttagc cccatcgaat ccttgacata atgatcccgc 60

ttaaataagc aacctcgctt gtatagttcc ttgtgctcta acacacgatg atgataagtc 120

gtaaaatagt ggtgtccaaa gaatttccag gcccagttgt aaaagctaaa atgctattcg 180

aatttctact agcagtaagt cgtgtttaga aattattttt ttatatacct tttttccttc 240

tatgtacagt aggacacagt gtcagcgccg cgttgacgga gaatatttgc aaaaaagtaa 300

aagagaaagt catagcggcg tatgtgccaa aaacttcgtc acagagaggg ccataagaaa 360

catggcccac ggcccaatac gaagcaccgc gacgaagccc aaacagcagt ccgtaggtgg 420

agcaaagcgc tgggtaatac gcaaacgttt tgtcccacct tgactaatca caagagtgga 480

gcgtacctta taaaccgagc cgcaagcacc gaattcctcg gttggatctt aagttatcgt 540

tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 600

caccgagtcg gtgctttttt taagcttggc actggcc 637

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtagggata cttcagggtt tgt 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgaggcgttc ctttcattta c 21

<210> 7

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Glu Pro Arg His Gly Arg Ser Ala Phe Thr Ile Ser Phe Ser Asn

1 5 10 15

Pro Asn Gly Phe Ala Asn Gln Cys Thr Ala Ile Pro Ala Val Ser Tyr

20 25 30

Ser Ala Ala Gly Ser Ser Gln Leu Asp Val Leu Ala Pro Thr Arg Gly

35 40 45

Cys Lys Arg Lys Trp Thr Glu Leu Ala Leu Gly Leu Gly Asp Thr Ser

50 55 60

Ser Ser Asp Ser Ser Lys Gln Ser Met Gly Thr Gly Cys Thr Val Ser

65 70 75 80

Ser Leu Lys Gly Ser Asp Asp Val Ser Cys Met Asp Tyr Asp Ile Ser

85 90 95

Phe Lys Leu Ser Leu Gly Asn Glu Asp Thr Ser Lys Leu His Lys Gln

100 105 110

Ala Cys Gly Ser Lys Arg Thr Met Glu Lys Pro Arg Ile Leu Ser Tyr

115 120 125

Leu Trp Leu His Leu Asn Pro Met

130 135

<210> 8

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggaaccca ggcatgggcg ttcagcattc actataagtt tctcaaatcc aaatggcttt 60

gctaatcagt gcaccgccat tccagccgtc agttattcag cggctggttc tagccaactt 120

gatgtgctgg ctcctactag aggttgcaag agaaagtgga ctgagttggc tctaggtctg 180

ggtgacacat caagctcaga cagcagcaag cagagcatgg gtactggctg cactgtttct 240

tctctcaagg gaagcgatga tgtctcatgt atggattacg acataagttt caagttatct 300

cttggcaatg aagatacttc caagctgcat aaacaggctt gtggttctaa aaggactatg 360

gagaagcctc ggatcttaag ttatctttgg ctccatctca atccgatgta a 411

Claims (10)

1.蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

D1)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在提高玉米穗行数中的应用；

D2)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在制备提高玉米穗行数的产品中的应用；

D3)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育高产玉米的产品中的应用；

D4)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在玉米育种中的应用；

所述蛋白质为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)在A1)的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述任一一种：

D1)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在提高玉米穗行数中的应用；

D2)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备提高玉米穗行数的产品中的应用；

D3)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育高产玉米的产品中的应用；

D4)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在玉米育种中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。

4.一种提高玉米穗行数的方法，包括通过敲除玉米中权利要求1中所述的蛋白质的编码基因来提高玉米穗行数。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述敲除利用CRISPR/Cas9系统进行。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述玉米包括玉米自交系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向权利要求1中所述的蛋白质的编码基因的sgRNA的载体。

8.蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

E1)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在提高玉米穗行数中的应用；

E2)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在制备提高玉米穗行数的产品中的应用；

E3)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育高产玉米的产品中的应用；

E4)蛋白质或下调所述蛋白质活性或含量的物质在玉米育种中的应用；

所述蛋白质为如下F1)或F2)：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.7的蛋白质；

F2)在F1)的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质。

9.与权利要求8中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述任一一种：

G1)与权利要求8中所述蛋白质相关的生物材料在提高玉米穗行数中的应用；

G2)与权利要求8中所述蛋白质相关的生物材料在制备提高玉米穗行数的产品中的应用；

G3)与权利要求8中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育高产玉米的产品中的应用；

G4)与权利要求8中所述蛋白质相关的生物材料在玉米育种中的应用；

所述生物材料为下述H1)至H7)中的任一种：

H1)编码权利要求8中所述蛋白质的核酸分子；

H2)含有H1)所述核酸分子的表达盒；

H3)含有H1)所述核酸分子的重组载体、或含有H2)所述表达盒的重组载体；

H4)含有H1)所述核酸分子的重组微生物、或含有H2)所述表达盒的重组微生物、或含有H3)所述重组载体的重组微生物；

H5)含有H1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有H2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

H6)含有H1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有H2)所述表达盒的转基因植物组织；

H7)含有H1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有H2)所述表达盒的转基因植物器官。

10.权利要求4-7任一所述的方法在创制玉米突变体植株或玉米育种中的应用。

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