CN114907461B - 灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1及其编码基因和应用 - Google Patents

灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1，来自于玉米自交系齐319记为ZmPMT1qi319为如下(a1)或(a2)，来自于玉米自交系掖478记为ZmPMT1ye478为如下(b1)或(b2)所示的蛋白质。本发明通过转基因技术，获得了转ZmPMT1基因的玉米植株，验证了玉米基因ZmPMT1的抗灰斑病功能。分别增加两个蛋白的表达量均可以提高玉米对灰斑病的抗性。本发明对于培育玉米抗灰斑病品种具有重要应用价值。

Description

灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程和抗病育种领域，具体地说，涉及灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1及其编码基因和应用。
背景技术
玉米灰斑病是由尾孢菌引起的真菌性叶部病害，在世界各地普遍发生，在我国玉米产区也危害较重(刘文奎等，2013)。最经济有效的防病途径是以种植抗病品种为主的综合防治，因此抗灰斑病已经成为玉米品种选育的主要育种目标之一。已有研究结果表明，玉米种质中抗灰斑病基因资源相对匮乏，所以挖掘优异的抗灰斑病种质，克隆种质中抗病基因(徐秀德等，2003；董怀玉等，2005；吕香玲等，2011；Lv等)，解析抗病基因对病原菌的抗性机制，进而借助分子育种技术进行种质的抗性改良，对培育抗灰斑病品种，防治玉米灰斑病具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1及其编码基因和应用。
本发明的目的可以采用以下的技术措施来进一步实现：
为了实现本发明目的，本发明首先提供了一种灰斑病抗性相关蛋白 ZmPMT1，来自于玉米自交系齐319记为ZmPMT1qi319为如下(a1)或(a2)，来自于玉米自交系掖478记为ZmPMT1ye478为如下(b1)或(b2)：
(a1)由序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
(b1)由序列表中的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)在(b1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
ZmPMT1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
进一步地，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
编码ZmPMT1蛋白的基因命名为ZmPMT1；具体编码ZmPMT1qi319蛋白的基因命名为ZmPMT1qi319；和编码ZmPMT1ye478蛋白的基因命名为 ZmPMT1ye478基因。
进一步地，在一优选实施例中，扩增所示核酸分子的引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
所述ZmPMT1qi319和ZmPMT1ye478核酸分子为如下(c1)或(c2)或(c3) 或(c4)的DNA分子：
(c1)、SEQ ID NO：5所示的核苷酸；或
(c2)、SEQ ID NO：6所示的核苷酸；或
(c3)、编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸的核苷酸；或
(c4)、与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸，该核苷酸所编码蛋白质具有ZmPMT1糖醇转运功能。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的ZmPMT1基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的ZmPMT1基因具有90％或者更高同一性的核酸，只要编码ZmPMT1蛋白且具有ZmPMT1蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
进一步地，本发明还提供了含有所述ZmPMT1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官或重组微生物均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有ZmPMT1基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。
所述表达盒自上游至下游依次包括启动子、ZmPMT1基因和终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，诱导型启动子。
在本发明的实施例中，所述ZmPMT1基因表达盒中启动所述ZmPMT1 基因转录的启动子为Ubi启动子。
所述重组微生物的出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。
所述转基因植物组织或所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还保护ZmPMT1蛋白的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)调控玉米植物的抗病性；
(d2)提高玉米的抗病性。
其中，所述抗病性指抗玉米灰斑病的抗病性。
更进一步地，本发明还提供了一种提高玉米对灰斑病抗性的方法，所述方法是通过转入抗病相关基因ZmPMT1获得抗玉米灰斑病的抗性，进而提高玉米的灰斑病抗性的能力。
本发明的优点及有益效果：
本发明通过转基因技术，获得了转ZmPMT1基因的玉米植株，验证了玉米基因ZmPMT1的抗灰斑病功能。分别增加两个蛋白的表达量均可以提高玉米对灰斑病的抗性。本发明对于培育玉米抗灰斑病品种具有重要应用价值。
附图说明
图1本发明实施例3获得EMS诱变ZmPMT1突变体和突变植株的发病情况；
图2本发明实施例3利用Crispr-Cas9载体获得突变体和突变植株发病的情况；
图3本发明实施例4获得的表达载体CUB-GFP-3XFLG和抗病植株情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1ZmPMT1qi319和ZmPMT1ye478蛋白序列的获得
利用抗病亲本齐319与感病亲本掖478构建定位群体，获得抗病候选基因ZmPMT1qi319和ZmPMT1ye478。以抗病亲本齐319与感病亲本掖478的cDNA 作为模板，设计扩增引物序列3和序列4进行分别扩增获得来自于齐319的基因序列，记为序列5；来自于感病亲本掖478的基因序列，记为序列6。
实施例2植株抗性鉴定
2.1利用玉蜀黍尾胞菌制成悬浮液，孢子浓度为2.5×103/ml；
2.2于玉米大喇叭口期利用菌液注射法对转基因阳性植株与阴性植株进行接种鉴定，每株接种上述步骤1悬浮液10ml；
2.3并于授粉后20天对接种效果进行鉴定；分为5级标准：1、3、5、 7、9级，分别代表高抗HR、抗病R、中抗MR、感病S、高感HS，各级标准：1级为病斑面积占叶片总面积比例<5％，3级为病斑面积介于6％-10％之间，5级为病斑面积介于11％-30％之间，7级为病斑面积介于31％-70％之间，9级为全株叶片基本枯死。病级数调查时间为授粉后20天。
实施例3获得以玉米自交系B73和B104为受体的ZmPMT1突变体
3.1搜索玉米EMS突变体库网站 (http://elabcaas.cn/memd/public/index.html#/)获得ZmPMT1编码蛋白提前终止的突变体(图1A,B)，并进一步与野生型B73回交获得BC1F2:3子代用于灰斑病抗性鉴定，结果表明zmpmt1基因突变后玉米B73变得更加感病，如图(图1C,D)。
3.2利用Crispr-Cas9技术以B104为受体编辑ZmPMT1获得突变体，后代经PCR测序检测并分离出后代Crispr-Cas9载体获得突变体(图2A,B)。获得的突变体进行接菌鉴定，结果表明该基因编辑后的B104相对于野生型更加感病(图2C,D)。
实施例4以玉米自交系B104为受体的转基因玉米植株获得
4.1将序列5和序列6分别构建到表达载体CUB-GFP-3XFLG载体的多克隆位点，获得表达载体(图3A,B)；
4.2将步骤1得到的重组质粒导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌；
4.3将步骤2获得的重组农杆菌转化玉米受体B104的幼胚，获得T0植株；
4.4将上述步骤3获得的T0植株自交得到T1种子；
4.5将上述步骤5获得T1种子种植后，利用bar试纸条检测阳性的植株用于鉴定灰斑病抗性。
4.6相对于野生型自交系B104，转基因株系OE-ZmPMT1Qi319-1, OE-ZmPMT1Qi319-2,OE-ZmPMT1Qi319-3,OE-ZmPMT1Ye478-1，OE-ZmPMT1Ye478-2，OE-ZmPMT1Ye478-3在接种玉蜀黍尾胞菌后表现更抗病(图3C,D)，平均病级数分布在4-5之间，如图3E中红色和黄色柱形图，低于对照野生型B104，如图3E中蓝色柱形图。
应用：
本发明的发明人提供了ZmPMT1蛋白及其编码基因，该基因突变后使玉米对玉蜀黍尾胞菌更加感病。过表达转基因试验结果表明，其能显著的降低玉米灰斑病的病级数。本发明对于玉米的抗灰斑病育种具有很大的应用价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
(1)董怀玉,姜钰,王丽娟,徐秀德.玉米种质资源抗灰斑病鉴定与评价[J].植物遗传资源学报,2005(04):441-443.DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.2005.04.017.
(2)刘庆奎,秦子惠,张小利,江凯,陈茂功,武小菲,何月秋,王桂清,晋齐鸣,王晓鸣.中国玉米灰斑病病原菌的鉴定及其基本特征研究[J].中国农业科学,2013,46(19):4044-4057.
(3)吕香玲,李新海,陈阳,史振声,李凤海,傅俊范.玉米种质抗灰斑病鉴定与评价[J].玉米科学,2011,19(06):125-128.DOI:10.13597/j.cnki.maize.science.2011.06.015.
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序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1及其编码基因和应用
<130> 2022003
<141> 2022-03-30
<160> 6
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ttcgagaagg ctgggcttag gtcgaacaac aactctttgg gcgagaccat ggcggtgggc 1020
gcgaccaaga cgctgttcat cctggtggcc acgttcttcc tcgaccgcgt cgggcggaga 1080
ccgctgctgc tcacaagcgc gggcgggatg gtggtgtcgc tggtgacgct ggcctcggcg 1140
ttgcgcgcca tcgaccggct cccagagggc caggcgacgc cgctggcggg cgtgagcatc 1200
gcggcggttc tcacgttcgt ggcgtccttc tccatcggca tgggcccgat cgcgtgggtg 1260
tacagctcgg agatattccc actgcggctc cgcgcgcagg gctgcgcact cggcacggcg 1320
atgaaccggg tcatgagcgg caccatcacc atgtccttca tctcgctcta caaggccatc 1380
accttcgccg ggagcttcta cttgtatgca ggcattgctg ctgctgggtg gctgttcatg 1440
ttcttcttcc tgccggagac gaggggcagg aacctagagg acaccgagaa gctcttcggc 1500
ggtggcgacc acgacgtcga cgaggacaag gaagatggac acgatgcgca gaagtccact 1560
gagttgagta gtagccaaca gtga 1584
<210> 6
<211> 1575
<212> DNA
<213> ye478人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
atgtccaact ccaagcagca cgacgccgcc gacggcggca tcccagcccc cgaggcgccg 60
gcaaagcgcc caccgcttaa caagtacgcc ctcgcctgcg ccgtcctcgc ttccatgaac 120
tccatcctcc ttggctacga tgtgtcggtg atgagcggag cgcagctatt catgaagcag 180
gacctcaaga tcacggacac gcagatcgag atcctcgccg gcatcatcaa tatctactcg 240
ctcgtcggct cgctcgcggc gggccggacg tccgactggc tcggccggcg gtacaccatg 300
gtgctcgcgg cggccatctt cttcgcgggc gcgctcatca tgggcctcgc cccgagctac 360
acgatcctca tgcttggccg cttcgtggcg ggcgtcggcg tcggatacgc gctcatgatc 420
gcacccgtgt acacggccga ggtctcgccc acgtcggcgc gcggcctgct cacgtccttc 480
ccggaggtgt tcatcaacac gggggtgctc ctcgggtatg tctccaacta cgccttccac 540
ggcctccccg tgcacctcag ctggcgcgtc atgttcctcg tcggcgccgt cccgcctatc 600
ttcctcgcac tgggggtcct cgccatgccg gagtcgccgc ggtggctcgt catgcagggg 660
cgcatcggcg acgcgcgccg cgtgctggcc aagacctcca actcccccgc cgaggccgag 720
gagcggctcg ccgacatcaa gaatgccatc ggcgtcccag acggcgtcgg cgacaacgac 780
gacgacgtgg tggtggtcgc ccgcaggaac aagggcagcc atggcgaagg ggtgtggagg 840
gacctcctca tccgcccgac gccgcccgtc cgccgcatac tcatcgcctg cctcggcctc 900
cagttcttcc agcaggcctc cggcatcgac tccgtggtgc tgtacagccc gcgggtgttc 960
gagaaggctg gccttaggtc gaacaacaac tctttgggcg ccaccatggc ggtgggcgcg 1020
accaagacgc tgttcatcct ggtggccacg ttcttcctcg accgcgtcgg gcggagaccg 1080
ctgctgctca caagcgcggg cgggatggtg gtgtcgctgg tgacgctggc ctcggcgttg 1140
cgcgccatcg accggctccc agagggacag gcgacgtcgc tggcgggcgt gagcatcgcg 1200
gcggttctca cgttcgtggc gtccttctcc atcggcatgg gcccgatcgc gtgggtgtac 1260
agctcggaga tattcccact gcggctccgc gcgcagggct gcgcactcgg cacggcgatg 1320
aaccgggtca tgagcggcac catcaccatg tccttcatct cgctctacaa ggccatcacc 1380
ttcgccggga gcttctactt gtatgcaggc attgctgctg ccgggtggct gttcatgttc 1440
ttcttcctgc cggagacgag gggcagcaac ctagaggaca ccgagaagct cttcggcggt 1500
ggcgaccacg acgaggacaa ggaagatgga cacgatgcgc agaagtccac tgagttgagt 1560
agtagccaac agtga 1575

Claims (7)

1.灰斑病抗性相关蛋白ZmPMT1，来自于玉米自交系齐319记为ZmPMT1qi319为如下（a1）或（a2）：
（a1）由序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子ZmPMT1 qi319 。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述ZmPMT1 qi319 核酸分子为如下（c1）或（c2）的DNA分子：
(c1)、SEQ ID NO：5所示的核苷酸；或
(c2)、编码SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸。
4.含有权利要求3所述ZmPMT1 qi319 核酸分子的重组表达载体、表达盒、或重组微生物。
5.含有权利要求3所述ZmPMT1 qi319 核酸分子的表达盒，其自上游至下游依次包括玉米Ubi启动子、ZmPMT1 qi319 基因和终止子。
6.权利要求1所述蛋白质，或权利要求2-3所述的核酸分子，或权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、重组微生物的应用，为如下（d1）或（d2）：
（d1）调控玉米灰斑病的抗病性；
（d2）提高玉米灰斑病的抗病性。
7.一种提高玉米灰斑病抗性的方法，其特征在于，所述方法是通过转入抗病权利要求2所述核酸分子ZmPMT1 qi319 获得抗玉米灰斑病的抗性，进而提高玉米抗灰斑病的能力。
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