CN101730748A - 玉米中对灰色叶斑病的抗性 - Google Patents

玉米中对灰色叶斑病的抗性 Download PDF

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CN101730748A CN200780035800A CN200780035800A CN101730748A CN 101730748 A CN101730748 A CN 101730748A CN 200780035800 A CN200780035800 A CN 200780035800A CN 200780035800 A CN200780035800 A CN 200780035800A CN 101730748 A CN101730748 A CN 101730748A
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Abstract

本发明属于植物育种和疾病抗性领域。更具体地，本发明包括育种玉米植物的方法，所述植物含有与针对灰色叶斑病的抗性相关的数量性状座位，所述灰色叶斑病是与尾孢属(Cercospora)种相关的真菌疾病。本发明还包括含有数量性状座位(QTL)的种质和该种质的用途，所述数量性状座位在针对灰色叶斑病的抗性的育种程序中赋予基因渗入至原种种质中的疾病抗性。

Description

玉米中对灰色叶斑病的抗性
序列表的引入
在此将序列表纸件拷贝以及含有文件名为“序列表.txt”、大小为28,672字节(在Windows XP中测量)并在2007年9月19日记录在光盘上的序列表计算机可读形式通过援引的方式引入。
发明领域
本发明属于植物育种和疾病抗性领域。更具体地，本发明包括育种玉米植物的方法，所述植物含有与针对灰色叶斑病的抗性相关的数量性状座位，所述灰色叶斑病是与尾孢属(Cercospora)种相关的真菌疾病。本发明还包括含有数量性状座位(QTL)的种质和该种质的用途，所述数量性状座位在针对灰色叶斑病的抗性的育种程序中赋予基因渗入至原种种质中的疾病抗性。
发明背景
玉米中最重要的、降低产量的疾病之一是灰色叶斑病(GLS)，其主要由玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)(Cz)Tehon & E.Y.Daniels引起(由Ward等，1999 Plant Dis.83：884-895综述)。GLS是全球性问题，除了在非洲、中美州和南美洲流行外，其已经在过去的10-15年传播遍及大多数美国的玉米带。真菌在田地岩屑中过冬，并且需要水分，通常以重雾、露水或雨的形式传播其孢子并感染玉米。已将渐增的遍布与免耕作业相联系，其促进真菌诸如Cz在土地中的保留(Paul等.2005Phytopathology 95：388-396)。症状包括矩形坏死斑，其可以融合为更大的受感染区域，并且症状通常在生长季节晚期显现。玉米中的GLS诱发增加的资源分配到损坏的叶组织，导致根和茎腐烂的风险的增加，其最终导致甚至更高的农作物损失(Ward等，1999；Saghai-Maroof等1996Theor.Appl.Genet.93：539-546)。如果症状严重且很早显现的话，与GLS相关的产量损失可以很高，有报道损失超过50％(Ward等，1999)。此外，即使应用了作物管理策略，诸如应用杀真菌剂以降低土壤中Cz的发生率，但仍然存在从附近土地获得感染的风险。明显地，Cz可以通过风很容易地传播(Latterell等，1983 Plant Dis.67：842-847)。因此，有培育GLS抗性玉米的切实需要。
分子标记协助育种的出现增强了疾病抗性至原种原种种质的基因渗入，其不仅显著地升高了农业性状中的遗传获得量，还导致了对于第二性状的标记性状关联的鉴定。Wisser等最近综述了这一方法在玉米中对于疾病抗性育种的效率(Wisser等.2006 Phytopathology 96：120-129)。这一综述也突出了在许多这些报道中遗传解析的缺乏，并且因为不充分的取样和作图群体不充分而对许多历史上的疾病抗性作图研究的精确性提出了质疑。一般而言，由于能在野外试验发生的病原体感染的不一致性，疾病抗性作图是很困难的。此外，由于限制使用病原体的条例以及在冬季苗圃中筛选病原体的经济原因，导致仅仅在夏季苗圃中筛选材料，这使得筛选疾病抗性是困难的任务。
此外，最近的工作已经鉴定了存在至少两种Cz的姐妹种，以及潜在的能引起GLS的其它尾孢属(Cercospora)分离株(Carson等，2006Maydica 51：89-92；Carson等.2002 Plant Dis.86：1088-109)。由于不同的种类具有不同的流行病学，这影响到用作这些作图研究基础的GLS表型方法学，带来了对许多所谓的GLS抗性QTL的本质的疑问。
本发明提供并包括了应用Cz的地方株和单核苷酸多态性(SNP)标记技术筛选并选择包含源于巴西作图种群的GLS抗性QTL的玉米植物的方法。
发明概述
本发明包括将等位基因基因渗入到玉米植物的方法，其包括(A)将至少一种包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的第一玉米植物与至少一种第二玉米植物杂交，以形成分离群；(B)用一种或更多种核酸标记筛选该分离群，以确定来自该分离群的一种或更多种玉米植物是否含有该核酸序列，以及(C)从该分离群中选择包含选自SEQID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的一种或更多种玉米植物。
本发明包括将等位基因基因渗入到玉米植物的方法，其包括：(A)将至少一种灰色叶斑病抗性玉米植物与至少一种灰色叶斑病敏感玉米植物杂交，以形成分离群；(B)用一种或更多种核酸标记筛选所述分离群，以确定来自该分离群的一种或更多种玉米植物是否含有灰色叶斑病抗性等位基因，其中所述的灰色叶斑病抗性等位基因选自1、2、3或4GLS抗性座位，其中在一种或更多种这些座位上的一种或更多种等位基因选自GLS抗性等位基因1、GLS抗性等位基因2、GLS抗性等位基因3、GLS抗性等位基因4、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因6、GLS抗性等位基因7、GLS抗性等位基因8、GLS抗性等位基因9、GLS抗性等位基因10、GLS抗性等位基因11、GLS抗性等位基因12、GLS抗性等位基因13。
本发明包括包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的原种玉米植物。
本发明包括基本上纯化的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：78及其互补序列的核酸序列。
本发明包括包含GLS抗性座位1的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位4的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位2和1的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位3和1的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位4和2的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位3和4的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位1和4的玉米植物。
本发明包括包含GLS抗性座位1或4的玉米植物。
核酸序列简述
SEQ ID NO：1是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位1的基因组序列。
SEQ ID NO：2是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位1的基因组序列。
SEQ ID NO：3是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位2的基因组序列。
SEQ ID NO：4是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位2的基因组序列。
SEQ ID NO：5是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：6是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：7是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：8是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：9是源于玉米(Zea mays L)  的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：10是源于玉米(Zea mays L)的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：11是源于玉米(Zea mays L)的相应于GLS抗性座位3的基因组序列。
SEQ ID NO：12是源于玉米(Zea mays L)的相应于GLS抗性座位4的基因组序列。
SEQ ID NO：13是源于玉米(Zea mays L)的相应于GLS抗性座位4的基因组序列。
SEQ ID NO：14是相应于SEQ ID NO：1的正向PCR引物。
SEQ ID NO：15是相应于SEQ ID NO：1的反向PCR引物。
SEQ ID NO：16是相应于SEQ ID NO：2的正向PCR引物。
SEQ ID NO：17是相应于SEQ ID NO：2的反向PCR引物。
SEQ ID NO：18是相应于SEQ ID NO：3的正向PCR引物。
SEQ ID NO：19是相应于SEQ ID NO：3的反向PCR引物。
SEQ ID NO：20是相应于SEQ ID NO：4的正向PCR引物。
SEQ ID NO：21是相应于SEQ ID NO：4的反向PCR引物。
SEQ ID NO：22是相应于SEQ ID NO：5的正向PCR引物。
SEQ ID NO：23是相应于SEQ ID NO：5的反向PCR引物。
SEQ ID NO：24是相应于SEQ ID NO：6的正向PCR引物。
SEQ ID NO：25是相应于SEQ ID NO：6的反向PCR引物。
SEQ ID NO：26是相应于SEQ ID NO：7的正向PCR引物。
SEQ ID NO：27是相应于SEQ ID NO：7的反向PCR引物。
SEQ ID NO：28是相应于SEQ ID NO：8的正向PCR引物。
SEQ ID NO：29是相应于SEQ ID NO：8的反向PCR引物。
SEQ ID NO：30是相应于SEQ ID NO：9的正向PCR引物。
SEQ ID NO：31是相应于SEQ ID NO：9的反向PCR引物。
SEQ ID NO：32是相应于SEQ ID NO：10的正向PCR引物。
SEQ ID NO：33是相应于SEQ ID NO：10的反向PCR引物。
SEQ ID NO：34是相应于SEQ ID NO：11的正向PCR引物。
SEQ ID NO：35是相应于SEQ ID NO：11的反向PCR引物。
SEQ ID NO：36是相应于SEQ ID NO：12的正向PCR引物。
SEQ ID NO：37是相应于SEQ ID NO：12的反向PCR引物。
SEQ ID NO：38是相应于SEQ ID NO：13的正向PCR引物。
SEQ ID NO：39是相应于SEQ ID NO：13的反向PCR引物。
SEQ ID NO：40是相应于SEQ ID NO：1的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：41是相应于SEQ ID NO：1的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：42是相应于SEQ ID NO：2的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：43是相应于SEQ ID NO：2的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：44是相应于SEQ ID NO：3的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：45是相应于SEQ ID NO：3的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：46是相应于SEQ ID NO：4的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：47是相应于SEQ ID NO：4的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：48是相应于SEQ ID NO：5的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：49是相应于SEQ ID NO：5的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：50是相应于SEQ ID NO：6的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：51是相应于SEQ ID NO：6的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：52是相应于SEQ ID NO：7的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：53是相应于SEQ ID NO：7的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：54是相应于SEQ ID NO：8的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：55是相应于SEQ ID NO：8的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：56是相应于SEQ ID NO：9的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：57是相应于SEQ ID NO：9的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：58是相应于SEQ ID NO：10的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：59是相应于SEQ ID NO：10的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：60是相应于SEQ ID NO：11的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：61是相应于SEQ ID NO：11的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：62是相应于SEQ ID NO：12的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：63是相应于SEQ ID NO：12的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：64是相应于SEQ ID NO：13的GLS抗性座位的探针1。
SEQ ID NO：65是相应于SEQ ID NO：13的GLS抗性座位的探针2。
SEQ ID NO：66是相应于SEQ ID NO：1的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：67是相应于SEQ ID NO：2的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：68是相应于SEQ ID NO：3的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：69是相应于SEQ ID NO：4的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：70是相应于SEQ ID NO：5的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：71是相应于SEQ ID NO：6的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：72是相应于SEQ ID NO：7的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：73是相应于SEQ ID NO：8的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：74是相应于SEQ ID NO：9的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：75是相应于SEQ ID NO：10的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：76是相应于SEQ ID NO：11的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：77是相应于SEQ ID NO：12的GLS抗性等位基因基序。
SEQ ID NO：78是相应于SEQ ID NO：13的GLS抗性等位基因基序。
发明详述
本发明提供了位于之前没有与GLS抗性相关联的玉米基因组公共箱(public bins)中的两种GLS抗性座位：箱1.03中的GLS抗性座位1和箱7.04中的GLS抗性座位4。具有落在箱1.06和1.07的标记的GLS抗性座位2，和具有落在箱3.03和3.04的标记的GLS抗性座位3。本发明还提供了能够赋予针对GLS的抗性的QTL等位基因。提供了位于GLS抗性座位1、GLS抗性座位2、GLS抗性座位3和GLS抗性座位4的等位基因。
在本发明中，GLS抗性座位1位于染色体1上。用于监测GLS抗性座位1的基因渗入的SNP标记包括选自NC0018320和NC0105022的那些。可以应用如SEQ ID NO：14至17所标出的引物，用如SEQ ID NO：40至43标出的探针扩增示范性GLS抗性座位1SNP标记DNA序列(SEQID NO：1至2)。
在本发明中，GLS抗性座位2位于染色体1上。用于监测GLS抗性座位2的基因渗入的SNP标记包括选自NC0109328、NC0016724和NC0031264的那些。可以应用如SEQ ID NO：18至23所标出的引物，用如SEQ ID NO：44至49标出的探针扩增这些示范性标记DNA序列(SEQ ID NO：3至5)。
本发明中提供了GLS抗性座位3，其位于染色体3上。用于监测GLS抗性座位3的基因渗入的示范性SNP标记可以选自NC0021154、NC0022590、NC0106769、NC0105291、NC0143268和NC0071496。可以应用如SEQ ID NO：24至35所标出的引物，用如SEQ ID NO：50至61标出的探针扩增这些示范性标记DNA序列(SEQ ID NO：6至11)。
在本发明中，GLS抗性座位4位于染色体7上。可以用于监测GLS抗性座位4的基因渗入的示范性SNP标记选自NC0081460和NC0015184。可以应用如SEQ ID NO：36至39所标出的引物，用如SEQID NO：62至65标出的探针扩增这些示范性标记DNA序列(SEQ ID NO：12至13)。
本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：68至SEQ ID NO：78及其互补序列的核酸序列的玉米植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：13、其片段、以及两者的互补序列的核酸序列的玉米植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：65、其片段、以及两者的互补序列的核酸序列的玉米植物。一方面，该玉米植物包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78及其互补序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种核酸序列。另一方面，该玉米植物包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：13、其片段、以及两者的互补序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种核酸序列。另一方面，该玉米植物包含选自SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：65、其片段、以及两者的互补序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种核酸序列。
本发明还提供了包含1、2、3或4种GLS抗性座位的玉米植物，其中在一种或更多种这些座位上的一种或更多种等位基因选自GLS抗性等位基因1、GLS抗性等位基因2、GLS抗性等位基因3、GLS抗性等位基因4、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因6、GLS抗性等位基因7、GLS抗性等位基因8、GLS抗性等位基因9、GLS抗性等位基因10、GLS抗性等位基因11、GLS抗性等位基因12、GLS抗性等位基因13。一方面，提供了包含GLS抗性等位基因1的玉米植物。另一方面，提供了包含GLS抗性等位基因4的玉米植物。另一方面，提供了包含GLS抗性等位基因2和1的玉米植物。另一方面，提供了包含GLS抗性等位基因3和1的玉米植物。一方面，提供了包含GLS抗性等位基因4和2的玉米植物。另一方面，提供了包含GLS抗性等位基因3和4的玉米植物。另一方面，提供了包含GLS抗性等位基因1和4的玉米植物。另一方面，提供了包含GLS抗性等位基因1或4的玉米植物。此类等位基因可以是纯合或杂合的。
本文所使用的GLS是指任何灰色叶斑病变体或分离株。本发明的玉米植物可以是对能够引起或诱导GLS的一种或多种真菌具有抗性。一方面，本发明提供了对GLS具有抗性的植物，以及用于筛选对由尾孢属引起的GLS具有抗性或易感的玉米植物的方法和组合物。在优选的方面，本发明提供了用于筛选对玉蜀黍尾孢菌(C.zeea-maydis)具有抗性或易感的玉米植物的方法和组合物。另一方面，本发明提供了对玉蜀黍尾孢菌(C.zeea-maydis)株“I型”具有抗性的植物，以及用于筛选对玉蜀黍尾孢菌(C.zeea-maydis)株“I型”具有抗性或易感的玉米植物的方法和组合物。另一方面，本发明提供了对玉蜀黍尾孢菌(C.zeea-maydis)株“II型”具有抗性的植物，以及用于筛选对玉蜀黍尾孢菌(C.zeea-maydis)株“II型”具有抗性或易感的玉米植物的方法和组合物。另一方面，本发明提供了对高粱尾孢菌maydis变种(C.sorghivar.maydis)具有抗性的植物，以及用于筛选对高粱尾孢菌maydis变种(C.sorghi var.maydis)具有抗性或易感的玉米植物的方法和组合物。
一方面，该植物选自玉蜀黍属(Zea)。另一方面，该植物选自玉米(Zeamays)种。另一方面，该植物选自玉米Mays亚种(Zea mays L.ssp.Mays)。另一方面，该植物选自玉米mays Indentata亚种(Zea mays L.ssp.maysIndentata)群，其也被称为马齿玉米。另一方面，该植物选自玉米maysIndurata亚种(Zea mays L.ssp.mays Indurata)群，其也被称为硬质玉米。一方面，该植物选自玉米mays Saccharata亚种(Zea mays L.ssp.maysSaccharata)群，其也被称为甜玉米。另一方面，该植物选自玉米maysAmylacea亚种(Zea mays L.ssp.mays Amylacea)群，其也被称为粉质玉米。另一方面，该植物选自玉米mays Everta亚种(Zea mays L.ssp.maysEverta)群，其也被称为爆裂玉米。玉蜀黍属植物包括杂种、近交种、部分近交种、或经定义或未经定义群的成员。
本发明的植物可以是非常抗性、抗性、相当大抗性、中度抗性、相当抗性、部分抗性、中度易感或易感的。
在优选的方面，本发明提供了用于测定对GLS的抗性或敏感性的玉米植物，其通过任何方法确定玉米植物是否非常抗性、抗性、相当大抗性、中度抗性、相当抗性、部分抗性、中度易感或易感。
在这一方面，通过利用捕获在数字图像中的来自在GLS导致的死亡之前在黑色层和衰老之间的发育阶段的穗以上部分的每株植物3片叶子进行叶组织图像分析，而测定植物的GLS抗性或易感性。实施图像分析以确定组织损伤的百分比，并获得如表1所述的疾病等级。平均每群应用5株植物。所使用的图像分析软件和用于在二维或三维中量化光学差异的方法为(Bright 1987 J.Microscopy 148(pt.1)：51-87；Bickmore等1999Geol.Mat.Res.1(5)：1-19)中阐述的那些。
本发明所使用的“相当大抗性”是少于或等于30％的叶面积受感染。本发明所使用的“部分抗性”是少于或等于50％的叶面积受感染。本发明所使用的“抗性”是1％至40％的叶面积受感染。本发明所使用的“中度抗性”是40％至50％的叶面积受感染。本发明所使用的中度易感是50％至60％的叶面积受感染。本发明所使用的易感是60％至100％的叶面积受感染。本发明所使用的“非常抗性”是0％至5％的叶面积受感染。
另一方面，玉米植物能够显示出与非抗性对照玉米植物相当的抗性。在这一方面，对照玉米植物将优选是除了所讨论的等位基因或GLS抗性等位基因外遗传上类似的。此类植物可在具有等价或近似等价的对病原体的暴露的类似条件下生长。在这一方面，抗性植物具有少于25％、15％、10％、5％、2％或1％的叶面积受感染。
可将本发明的疾病抗性QTL引入到原种玉米近交系中。“原种系”是从为原种农业性能的育种和选择中得到的任何系。原种近交系的实例是对农民或玉米育种者来说可商业获得的系，诸如ZS4199、ZS02433、G3000、G1900、G0302、G1202、G2202、G4901、G3601、G1900(AdvantaTechnology Ltd.，大不列颠)；6TR512、7RN401、6RC172、7SH382、MV7100、3JP286、BE4207、4VP500、7SH385、5XH755、7SH383、11084BM、2JK221、4XA321、6RT321、BE8736、MV5125、MV8735、3633BM(Dow，Michigan，USA)；8982-11-4-2、8849、IT302、9034、IT201、RR728-18、5020、BT751-31(FFR Cooperative，Indiana，USA)；1874WS、X532Y、1784S、1778S、I880S(Harris Moran Seed Company，California，USA)；FR3351、FR2108、FR3383、FR3303、FR3311、FR3361(IllinoisFoundation Seeds，Inc.，Illinois，USA)；NR109、JCRNR113、MR724、M42618、CI9805、JCR503、NR401、W60028、N16028、N10018、E24018、A60059、W69079、W23129(J.C.Robinson Seed Company，Nebraska，USA)；7791、KW4773、KW7606、KW4636、KW7648、KW4U110、KWU7104、CB 1、CC2(KWS Kleinwanzlebener Saatzucgt AG，德国)；UBB3、TDC1、RAA1、VMM1、MNI1、RII1、RBO1(Limagrain GeneticsGrande Culture S.A.，法国)；LH284、7OLDL5、GM9215、90LDI1、90LDC2、90QDD1、RDBQ2、01HG12、79314N1、17INI20、17DHD7、83INI8、83InI14、01INL1、LH286、ASG29、ASG07、QH111、09DSQ1、ASG09、86AQV2、86ISI5、ASG25、01DHD16、ASG26、ASG28、90LCL6、22DHD11、ASG17、WDHQ2、ASG27、90DJD28、WQCD10、17DHD5、RQAA8、LH267、29MIFI2、RQAB7、LH198Bt810、3DHA9、LH200BT810、LH172Bt810、01IZB2、ASG10、LH253、86ISI27、91ISI5、22DHQ3、91INI12、86ISI26、01IUL6、89ADH11、01HGI4、16IUL2、F307W、LH185Bt810、F351、LH293、LH245、17DHD16、90DHQ2、LH279、LH244、LH287、WDHQ11、09DSS 1、F6150、17INI30、4SCQ3、01HF13、87ATD2、8M116、FBLL、17QFB1、83DNQ2、94INK1A、NL054B、6F545、F274、MBZA、I389972、94INK1B、89AHD12、I889291、3323、16IUL6、6077、I014738、7180、GF6151、WQDS7、I465837、3327、LH176Bt810、181664、I362697、LH310、LH320、LH295、LH254、5750、I390186、I501150、I363128、I244225、LH246、LH247、LH322、LH289、LH283BtMON810、85DGD1、I390185、WDDQ1、LH331(Monsanto Co.，Missouri，USA)；PH1B5、PH1CA、PHOWE、PH1GG、PH0CD、PH21T、PH224、PH0V0、PH3GR、PH1NF、PH0JG、PH189、PH12J、PH1EM、PH12C、PH55C、PH3EV、PH2V7、PH4TF、PH3KP、PH2MW、PH2N0、PH1K2、PH226、PH2VJ、PH1M8、PH1B8、PH0WD、PH3GK、PH2VK、PH1MD、PH04G、PH2KN、PH2E4、PH0DH、PH1CP、PH3P0、PH1W0、PH45A、PH2VE、PH36E、PH50P、PH8V0、PH4TV、PH2JR、PH4PV、PH3DT、PH5D6、PH9K0、PH0B3、PH2EJ、PH4TW、PH77C、PH3HH、PH8W4、PH1GD、PH1BC、PH4V6、PH0R8、PH581、PH6WR、PH5HK、PH5W4、PH0KT、PH4GP、PHJ8R、PH7CP、PH6WG、PH54H、PH5DR、PH5WB、PH7CH、PH54M、PH726、PH48V、PH3PV、PH77V、PH7JB、PH70R、PH3RC、PH6KW、PH951、PH6ME、PH87H、PH26N、PH9AH、PH51H、PH94T、PH7AB、PH5FW、PH75K、PH8CW、PH8PG、PH5TG、PH6JM、PH3AV、PH3PG、PH6WA、PH6CF、PH76T、PH6MN、PH7BW、PH890、PH876、PHAPV、PHB5R、PH8DB、PH51K、PH87P、PH8KG、PH4CV、PH705、PH5DP、PH77N、PH86T、PHAVN、PHB6R、PH91C、PHCWK、PHC5H、PHACE、PHB6V、PH8JR、PH77P、PHBAB、PHB1V、PH3PR、PH8TN、PH5WA、PH58C、PH6HR、PH183、PH714、PHA9G、PH8BC、PHBBP、PHAKC、PHD90、PHACV、PHCEG、PHB18、PHB00、PNCND、PHCMV(Pioneer Hi-Bred International，Inc.，Iowa，USA)；GSC3、GSC1、GSC2、NP2138、2227BT、ZS02234、NP2213、2070BT、NP2010、NP2044BT、NP2073、NP2015、NP2276、NP2222、NP2052、NP2316、NP2171、WICY418C、NP2174、BX20010、BX20033、G6103、G1103、291B、413A、G1704(Syngenta Participations AG，瑞士)。原种植物是来自原种系的任何植物。可通过在一种或两种亲本近交株中存在的等位基因将GLS抗性提供给例如杂交植物。
可将本发明GLS抗性QTL导入原种玉米植物，所述植物包含一种或更多种赋予除草剂耐性、增加产量、昆虫防治、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、支原体疾病抗性、改进的油生产、高油生产、高蛋白生产、发芽和秧苗生长控制、增强的动物和人体营养、低棉子糖、环境应力抗性、增加的可消化性、工业酶、药物蛋白、肽和小分子、改善的加工特性、改善的香味、固氮作用、杂种种子生产、减少的变应原性、生物聚合物、以及生物燃料的转基因。一方面，除草剂耐性选自草甘膦、麦草畏、草铵膦(glufosinate)、磺酰脲、溴苯腈和达草灭(norflurazon)除草剂。可通过植物生物技术方法如玉米中的转基因提供这些特性。
可以将一种或复数种疾病抗性QTL等位基因从任何含有这些等位基因的植物(供体)导入到任何受体玉米植物。一方面，该受体玉米植物可以含有其它的GLS抗性座位。另一方面，该受体玉米植物可以含有转基因。另一方面，在维持导入的QTL的同时，可以通过回交或其它合适的方法减少提供疾病抗性QTL的植物的遗传贡献。一方面，在玉米植物中源于供体材料的核遗传材料可以少于或约50％、少于或约25％、少于或约13％、少于或约5％、3％、2％或1％，但该遗传材料含有一种或复数种感兴趣的GLS抗性座位。
含有一种或更多种所描述的GLS抗性座位的植物可以是供体植物。可以例如通过应用能够检测与抗性相关的标记多态性的核酸分子筛选含有抗性座位的玉米植物。一方面，供体植物是SH 4802(布达佩斯条约保藏号PTA-8007)。在优选的方面，供体植物是GLS抗性座位2至4的来源。另一方面，供体植物是玉米近交32843(布达佩斯条约保藏号PTA-8006)。在另一优选的方面，供体植物是GLS抗性座位1的来源。供体植物可以是易感系。一方面，供体植物也可以是受体玉米植物。
应当进一步理解，本发明玉米植物可以表现出任何相对成熟组的特征。一方面，该成熟组选自RM90-95、RM 95-100、RM 100-105、RM 105-110、RM 110-115和RM 115-120。
QTL的等位基因当然可以包含多基因或其它遗传因子，甚至在连续基因组区域或连锁群例如单元型中。本文所使用的疾病抗性座位的等位基因因此可以包含超过一种基因或其它遗传因子，其中每种单个基因或遗传元件还能够展示出等位基因变异，且其中每种基因或遗传元件还能够引起对所讨论的数量性状的表型效果。在本发明的一方面，QTL等位基因包含一种或更多种也能够展示出等位基因变异的基因或其它遗传因子。因此术语“QTL等位基因”的应用并不意图排除包含超过一种基因或其它遗传因子的QTL。特别地，本发明中的“QTL等位基因”可以表示在单元型窗口中的单元型，其中表型可以是疾病抗性。单元型窗口是可以用一种或更多种多态性标记的组定义并追踪的连续基因组区域，其中该多态性通过遗传表明身份。可以通过在每一标记上的等位基因的唯一指纹定义在该窗口内的单元型。本文所使用的等位基因是占据染色体上给定座位的基因的若干种替代形式之一。当在染色体给定座位上存在的所有等位基因是相同的，则该植物在该座位上是纯合的。当在染色体给定座位上存在的等位基因是不同的，则该植物在该座位上是杂合的。本发明的植物在任何特定GLS座位上，或对于特定多态性标记可以是纯合或杂合的。
本发明还提供了本发明植物的部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明特别优选的方面，该植物部分是种子。
本发明还提供了玉米容器(container)，其中超过50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的种子包含1、2、3或4种GLS抗性座位，其中在一种或更多种它们的座位上的一种或更多种等位基因选自GLS抗性等位基因1、GLS抗性等位基因2、GLS抗性等位基因3、GLS抗性等位基因4、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因6、GLS抗性等位基因7、GLS抗性等位基因8、GLS抗性等位基因9、GLS抗性等位基因10、GLS抗性等位基因11、GLS抗性等位基因12、GLS抗性等位基因13。
该玉米种子容器可以含有任意数量、重量或体积的种子。例如，容器可以含有至少、或超过约10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、80、90、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或更多种种子。另一方面，容器可以含有约或超过约1克、5克、10克、15克、20克、25克、50克、100克、250克、500克、或1000克的种子。或者，该容器可以含有至少或超过约0盎司、1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅、10磅、15磅、20磅、25磅、或50磅或更多的种子。
玉米种子容器可以是本领域可获得的任何容器。例如，容器可以是箱子、袋子、罐、包、囊(pouch)、带卷、桶或管。
另一方面，玉米种子容器中包含的种子可以是经处理的或未经处理的玉米种子。一方面，可以处理该种子以改善发芽，例如通过引发该种子、或通过消毒以免受种子天生的病原体感染。另一方面，可以用任何可获得的涂层包被种子，以例如改善可种植性、出苗以及使其免受种子天生的病原体感染。种子涂层可以是任何形式的种子涂层，  包括但不限于颗粒化、薄膜包衣以及包壳。
还可以在培养物中培养以及再生本发明的植物或其部分。用于从各种组织类型再生玉米(Zea mays)植物的方法和用于组织培养玉米的方法是本领域公知的(例如，Bhaskaran等.1990 Crop Sci.30：1328-1336)。对于植物诸如玉米的再生技术可以将多种组织或细胞类型用作起始材料。具体到玉米，已经开发了用某些分化的组织类型诸如分生组织开始的再生方法(Sairam等，2003 Genome 46：323-3)。也已经报道了通过器官再生和胚胎形成从组织培养物再生成熟玉米植物(Wang 1987 Plant Cell.Rep.6：360-362；Chang 1983 Plant Cell.Rep.2：18-185；Green等，1975Crop Sci.15：417-421)。最近，也报道了从剖开的种子再生玉米(Al-Abed等，2006 Planta 223：1355-1366)。
本发明还提供了通过筛选玉米植物中的疾病抗性或易感性选择的疾病抗性玉米植物，该选择包括探询基因组核酸中与QTL等位基因遗传上相关联的标记分子的存在，其中所述的QTL等位基因与玉米中的疾病抗性相关，其中该QTL等位基因也位于与疾病抗性玉米相关的连锁群中。
将等位基因基因渗入到玉米植物的方法包括(A)将至少一种包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的第一玉米植物与至少一种第二玉米植物杂交，以形成分离群；(B)用一种或更多种核酸标记筛选该分离群，以确定来自该分离群的一种或更多种玉米植物是否含有该核酸序列，以及(C)从该分离群种选择包含选自SEQ ID NO：66至SEQID NO：78的核酸序列的一种或更多种玉米植物。
本发明还包括将等位基因基因渗入到玉米植物的方法，其包括：(A)将至少一种灰色叶斑病抗性玉米植物与至少一种灰色叶斑病敏感玉米植物杂交，以形成分离群；(B)用一种或更多种核酸标记筛选所述分离群，以确定来自该分离群的一种或更多种玉米植物是否含有灰色叶斑病抗性等位基因，其中所述的灰色叶斑病抗性等位基因是选自GLS抗性座位1、GLS抗性座位2、GLS抗性座位3和GLS抗性座位4的等位基因。
本发明包括核酸分子。此类分子包括能够检测与GLS座位遗传上或物理上连接的多态性的核酸分子。此类分子可以称为标记。可通过可利用的技术获得与GLS抗性座位1、GLS抗性座位2、GLS抗性座位3和GLS抗性座位4连接的其它标记。一方面，该核酸分子能够检测距离GLS少于50、40、30、20、10、5、2、1厘摩的标记的存在与否。另一方面，应用Qgene版本2.23(1996)和缺省参数测量，对于GLS，标记展现出2或更高、3或更高、或4或更高的LOD得分。另一方面，该核酸分子能够检测在选自GLS抗性座位1、GLS抗性座位2、GLS抗性座位3和GLS抗性座位4的座位上的标记。另一方面，核酸分子选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：78、其片段、其互补序列和能够与这些核酸分子的一种或更多种特异性杂交的核酸分子。
在优选的方面，本发明的核酸分子包括在中等严格条件下，例如在约2.0xSSC和约65℃下将与一种或更多种SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：78所示核酸分子或其互补序列或任一的片段特异性杂交的那些。在特别优选的方面，本发明的核酸在高严格条件下将与一种或更多种SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：78所示核酸分子或其互补序列或任一的片段特异性杂交。在本发明的一个方面，本发明优选的标记核酸分子具有SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：78所示核酸序列或其互补序列或任一的片段。在本发明的另一方面，本发明优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1至SEQID NO：78所示核酸序列或其互补序列或任一的片段具有80％至100％或90％至100％的序列同一性。在本发明的另一方面，本发明优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：78所示核酸序列或其互补序列或任一的片段具有95％至100％的序列同一性。在本发明更优选的方面，本发明优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：78所示核酸序列或其互补序列或任一的片段具有98％至100％的序列同一性。
核酸分子或其片段能够在特定环境中与其它核酸分子特异性杂交。如在本文所使用的那样，如果两种分子能够形成反向平行的双链核酸结构，则该两种核酸分子能够彼此特异性杂交。如果它们表现出完全的互补性，则一种核酸分子是另一核酸分子的“互补序列”。如在本文所应用的那样，当一种分子的每个核苷酸与另一种分子的核苷酸互补，则分子显示出“完全的互补性”。如果它们能够以在至少常规的“低严格度”条件下允许它们维持彼此退火的足够的稳定性彼此杂交，则两个分子是“最低限度的互补”。类似地，如果它们能够以在常规的“高严格度”条件下允许它们维持彼此退火的足够的稳定性彼此杂交，则该分子是“互补的”。Sambrook等在分子克隆：实验手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，以及Haymes等在Nucleic Acid Hybridization，A PracticalApproach，IRL Press，Washington，DC(1985)中描述了常规的严格条件。因此背离完全的互补性是可允许的，只要此类背离没有完全地妨碍分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子能够作为引物或探针，只需要序列中具有能够在所应用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构的充分的互补性。
如本文所使用的那样，基本上同源的序列是能够与该核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列，其中其在高严格条件下与所述核酸相比较。本发明的核酸探针和引物能够在严格条件下与靶DNA序列杂交。术语“严格杂交条件”被定义为这样的条件，即在该条件下探针或引物特异地与靶序列杂交，但不与非靶序列杂交，如可以凭经验确定的那样。术语“严格条件”是由Sambrook等，1989，9.52-9.55中讨论的特定杂交方法关于核酸探针与靶核酸的杂交(即，与特定的感兴趣的核酸序列杂交)所作的功能性定义，也参见，Sambrook等，1989，9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa 1984 Nucl.Acids Res.12：203-213；和Wetmur等，1968 J.Mol.Biol.31：349-370。合适的促进DNA杂交的严格条件例如是：在约45℃下的6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃用2.0xSSC洗涤，这是本领域技术人员公知的或可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中找到。例如，可以从在50℃下约2.0xSSC的低严格度至在50℃下约0.2xSSC的高严格度选择洗涤步骤中的盐浓度。此外，洗涤步骤中的温度可从室温(约22℃)的低严格条件升高至约65℃的高严格条件。温度和盐两者都可以变化，或者可以维持温度或盐浓度不变而改变另一变量。
例如，对于严格条件，可以在65℃在6xSSC、0.5％SDS、5x登哈特试剂(Denhardt’s)、100μg/mL非特异DNA(例如超声处理的鲑精DNA)中应用DNA或RNA探针或引物杂交，并在65℃的0.5xSSC、0.5％SDS中洗涤。
预期较低严格杂交条件诸如较低的杂交和/或洗涤温度可以用于鉴定具有较低的序列类似度的相关序列，如果保持探针或引物与靶序列的特异性的话。相应地，可以针对它们选择性地与DNA、RNA或cDNA片段的互补片段形成双链体分子的能力应用本发明的核苷酸序列。
核酸分子片段可以是任意大小的片段，且示范性片段包括SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：78所示核酸序列及其互补序列的片段。一方面，片段可以是15至25、15至30、15至40、15至50、15至100、20至25、20至30、20至40、20至50、20至100、25至30、25至40、25至50、25至100、30至40、30至50、30至100之间。另一方面，该片段可以超过10、15、20、25、30、35、40、50、100或250个核苷酸。
可以应用其它的遗传标记以选择具有QTL等位基因的植物，其中所述QTL等位基因与本发明的玉米真菌疾病抗性相关。公共标记数据库的实例包括：玉米基因组数据库，农业研究服务，美国农业部(MaizeGenome Database，Agricultural Research Service，United StatesDepartment of Agriculture)。
本发明的遗传标记包括“显性”或“共显性”标记。“共显性标记”揭示两种或更多种等位基因(每二倍体个体两种)的存在。“显性标记”仅仅揭示单个等位基因的存在。显性标记表型的存在(例如，DNA带)表明一种等位基因在纯合或杂合条件中存在。显性标记表型的不存在(例如，不存在DNA带)仅仅是“某些其它的”未定义等位基因存在的证据。在其中个体主要是纯合的且座位主要是二态的群体的情况下，显性和共显性标记是同样重要的。随着群体变得更为杂合且多等位基因，共显性标记通常能比显性标记提供更多的基因型信息。
可以利用与本发明的QTL等位基因遗传上连接或关联的标记，诸如单序列重复标记(SSR)、AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、表型标记、SNP、同工酶标记、微阵列转录谱(Walton，1993；Burow等，1988)。分离此类标记的方法是本领域公知的。
可以通过应用核酸扩增方法帮助检测DNA、RNA或cDNA样本中的多态性位点。此类方法特异地增加跨越该多态性位点、或包括该位点以及位于该位点远端或近侧的序列的多核苷酸的浓度。可以通过凝胶电泳、荧光检测方法或其它手段很容易地检测此类经扩增的分子。
实现此类扩增的一种方法应用聚合酶链式反应(PCR)(Mullis等，1986 Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；以及美国专利4,683,194)，其应用能够与近侧序列杂交的引物对，所述近侧序列在其双链形式中定义了多态性。
为了QTL作图的目的，所包括的标记应该是为了得到关于随后群体的推断而对起源具有诊断性的。SNP标记对于作图是理想的，因为特定SNP等位基因源于特定物种现存群体中独立来源的可能性很低。因此，SNP标记能用于追踪及协助QTL的基因渗入，特别是在单元型的情况下。
可通过基因作图模型建立其它标记分子的遗传连锁，所述基因作图模型诸如但不限于：Lander等报道的侧翼标记模型(Lander等，1989Genetics，121：185-199)、以及基于描述于其中的最大似然法，且在软件包MAPMAKER/QTL中实现的间距作图(Lincoln和Lander，MappingGenes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL，WhiteheadInstitute for Biomedical Research，Massachusetts，(1990)。其它软件包括Qgene，版本2.23(1996)，植物育种和生物统计学系，266 Emerson Hall，康奈尔大学，Ithaca，NY)。应用Qgene软件是特别优选的方法。
计算标记存在的最大似然估计(MLE)、以及假定没有QTL效应的MLE，以避免假阳性。如下计算优势比的log10(LOD)：LOD＝log10(存在QTL的MLE/设定没有连接的QTL的MLE)。该LOD得分实质上表明该数据呈现的QTL存在相对于其不存在的假设更高的可能性有多少。具有给定置信度(假设95％)为避免假阳性的LOD阈值取决于标记的数量和基因组的长度。标明LOD阈值的图表由Lander等(1989)提出，并由Arús和Moreno-González，Plant Breeding，Hayward，Bosemark，Romagosa(编辑)Chapman & Hall，London，第314-331页(1993)进一步描述。
可以应用其它模型。已经报道了许多对间距作图的改进或替代方法，包括应用非参数方法(Kruglyak等，1995 Genetics，139：1421-1428)。还可以应用多重回归方法或模型，其中该特性在大量的标记上回归(Jansen，Biometrics in Plant Breed，van Oijen，Jansen(编辑)Proceedingsof the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding，The Netherlands，第116-124页(1994)；Weber和Wricke，Advances inPlant Breeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。Jansen等(Jansen等，1994Genetics，136：1447-1455)和Zeng(Zeng 1994 Genetics 136：1457-1468)报道了结合间距作图和回归分析的方法，由此该表型回归到给定标记间距上的单个推定QTL之上，且同时回归到许多作为“辅因子”的标记之上。一般地，辅因子的应用降低了估计的QTL位置的偏差值和取样误差(Utz和Melchinger，Biometrics in Plant Breeding，van Oijen，Jansen(编辑)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics inPlant Breeding，The Netherlands，pp.195-204(1994))，由此改善了QTL作图的精确性和效率(Zeng 1994)。可将这些模型扩展至多重环境实验以分析基因型-环境相互作用(Jansen等，1995 Theor.Appl.Genet.91：33-3).
选择合适的作图群体对于图谱构建是很重要的。合适的作图群体的选择取决于所应用的标记系统的类型(Tanksley等，Molecular mapping inplant chromosomes.chromosome structure and function：Impact of newconcepts J.P.Gustafson和R.Appels(编辑).Plenum Press，纽约，第157-173页(1988))。必须考虑到在作图群体中所应用的亲本的来源(适应的vs外来的)。染色体配对和重组率在宽杂交(适应的×外来的)中严重地被扰乱(抑制)，并且一般地极大地降低了连锁距离。宽杂交通常将提供分离群，当与窄杂交(适应的×适应的)后代相比较时，该分离群具有相对大的多态性阵列。
F2群体是产生杂交种子后自交的第一代。通常将单个F1植物自交，以产生以孟德尔(1∶2∶1)方式分离所有基因的群体。应用共显性标记系统从完全分类的F2群体获得最大的遗传信息(Mather，Measurement ofLinkage in Heredity：Methuen and Co.，(1938))。在共显性标记的情况下，需要进行后代测试(例如F3、BCF2)以鉴定杂合子，由此使得其与完全分类的F2群体等价。然而，由于在后代测试中涉及的费用和时间，该方法通常是禁止的。F2个体的后代测试通常用于其中表型不一致地反应基因型(例如，疾病抗性)或其中性状表达受到QTL控制的图谱构建中。来自后代测试群体(例如F3或BCF2)的分离数据可用于图谱构建。然后可将标记协助的选择在标记-性状图谱关联(F2，F3)的基础上应用于杂交后代，其中连锁群未被重组事件完全分离(即，最大不平衡)。
可将重组近交系(RIL)(遗传上相关的系；通常＞F5，从连续自交的F2系向纯合性发展)用作作图群体。可通过应用RIL最大化从显性标记得到的信息，因为所有的座位都是纯合的或接近纯合。在紧密连锁(即，约＜10％重组)的条件下，在RIL群体中评估的显性和共显性标记比在回交群体中的任一标记类型提供了每一个体的更多的信息(Reiter等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：1477-1481)。然而，随着标记之间的距离变得更大(即，座位变得更独立)，RIL群体中的信息急剧下降。
可将回交群体(例如，产生自成功的变种(回归亲本)和携带有前者中不存在的性状的另一变体(供体亲本)的杂交)用作作图群体。可以制造一系列与回归亲本的回交以恢复大多数其期望的性状。因此，产生了由这样的个体组成的群体，所述个体与回归亲本非常类似但每一个体携带有不同量或嵌合的来自供体亲本的基因组区域。如果在回归亲本中的所有座位是纯合的且该供体和回归亲本具有截然不同的多态性标记等位基因，则回归群体对于作图显性标记是有用的(Reiter等，1992)。应用共显性或显性标记从回交群体得到的信息比从F2群体得到的信息要少，因为每一株植物取样了一种而不是两种重组配子。然而，当与RIL相比较时，回交群体具有更多的信息(在低标记饱和度上)，因为在RIL群体中连接的座位之间的距离增加了(即，约15％重组)。增加的重组对于紧密连锁的分离是有益的，但在具有低标记饱和度的图谱构建中可能是不期望的。
通过许多回交以产生个体阵列而产生的近亲等基因系(NIL)可用作作图群体，其中所述的个体除了所探询的性状或基因组区域外在遗传组成中是接近同一的。在用NIL的作图中，对于选择的区域仅仅期望将部分多态性位点作图。
混合分离群体法(BSA)是开发用于快速鉴定标记和感兴趣的性状之间的连锁的方法(Michelmore等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：9828-9832)。在BSA中，从源自单杂交的分离群体中获得两个混合DNA样本。这些混合体含有对于特定性状(对特定疾病的抗性或易感)或基因组区域是同一的，但在非连接区域是任意(即，杂合的)的个体。在BSA中，未与靶区域连接的区域不会在多种个体的混合样本之间有所不同。
本发明的植物可以是育种程序的部分或由育种程序产生。育种方法的选择取决于植物生殖的方法、待改进的性状的遗传率以及商业上应用的栽培品系的种类(例如，F1杂交栽培品系、纯系栽培品系等)。栽培品系是有意地选择并通过栽培维持的植物种的品种或变种。
对于育种本发明植物的选择的非限制性方法阐述如下。可应用在任意杂交后代上的标记协助选择(MAS)提高育种程序。应当理解本发明的核酸标记可用于MAS(育种)程序。还应当理解任意商业或非商业的栽培品系可用于育种程序中。因素诸如出苗活力、营养势、应激耐受力、疾病抗性、发枝、开花、结实(seed set)、种子大小、种子密度、站立能力和打谷能力等将通常影响选择。
对于高遗传性状，在单座位上评价原种的个体植物的选择是有效的，而对于具有低遗传性的性状，选择应当基于获自相关植物科的平行评估的平均值。流行的选择方法通常包括家系选择、改进的家系选择、混合选择和轮回选择。在优选的方面，采用回交或轮回育种程序。
遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种可用于将高度可遗传性状的一种或少许几种的有利基因转移至期望的栽培品系。这一方法被广泛地用于育种疾病抗性栽培品系。各种轮回选择技术被用于改善由多种基因控制的数量遗传性状。
可以在商业目标区域的典型环境中对两代或更多代的育种系进行测试并与合适的标准比较。最佳的系是新商业栽培品系的候选者；在性状中仍然有缺陷的那些可以作为亲本以产生新的群体用于进一步选择。
新原种玉米杂种的开发需要原种近交系的开发和选择、所述系的杂交和原种杂交的选择。可通过选择的雄性可育亲本之间的人工杂交或通过应用雄性可育系统产生杂交种子。亲本系的其它数据、以及杂种的表型影响育种者是否继续特定杂交的决定。
家系育种和轮回选择育种方法可以用于从育种群体开发栽培品系。育种程序将来自两种或更多种栽培品系或各种广谱来源的期望性状合并至育种库中，通过自交并选择期望的表型从所述的育种库中开发栽培品系。可以评估新的栽培品系以确定哪种具有商业潜力。
已经将回交育种用于将简单遗传的高度可遗传性状的基因转移至期望的纯合栽培品系或近交系，其为回归亲本。待转移性状的来源称为供体亲本。在最初杂交后，选择拥有供体亲本表型的个体并反复地与回归亲本杂交(回交)。预期得到的植物具有回归亲本(例如，栽培品系)的大部分的属性，并且另外具有从供体亲本转移的期望性状。
严格意义上的单种子世系方法是指栽培分离群、每个植物收获一个种子样本，并且应用该一个种子样本以栽培下一代。当将该群体从F2发展至期望的近交水平时，每种其来源的植物都将上溯到不同的F2个体。群体中的植物数量每一代都下降，因为一些种子不能发芽或一些植物不能产生至少一个种子。结果，当完成世代发展时，并不是所有在群体中最初取样的F2植物都能用后代表示。
通常用于不同性状和不同作物的其它育种方法的描述可以在若干种参考书中找到(Allard，“Principles of Plant Breeding，”John Wiley &Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles ofcrop improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“Plant breeding perspectives，”Wageningen(编辑)，Center forAgricultural Publishing and Documentation，1979；Fehr，In：Soybeans：Improvement，Production and Uses，第二版，Manograph.，16：249，1987；Fehr，“Principles of variety development，”Theory and Technique，(卷1)以及Crop Species Soybean(卷2)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376，1987)。
传统QTL作图的替代包括通过单元型对单个标记作图达到更高的分辨率(Fan等，2006 Genetics 172：663-686)。这一方法追踪称为单元型(如通过多态性标记定义的那样)的DNA块，其被假设为在作图群体中通过遗传是相同的。这一假设导致了更大的有效样本大小，提供了QTL的更高分辨率。用于确定表型和基因型(在这一情况下是单元型)之间关联的统计显著性的方法可通过本领域公知的统计测试和应用所需要的统计显著性的任意可接受阈值确定。特定方法和显著性阈值的应用是本领域普通技术人员公知的。
还应当理解，本发明提供了包含本发明核酸分子的细菌、病毒、微生物、昆虫、哺乳动物和植物细胞。
本文所使用的“核酸分子”是天然存在的分子，或如果期望的话，可以是“基本上纯化的”，其是指基本上从通常与其天然状态相关的所有其他分子中分离的分子。更优选的，基本上纯化的分子是制品中存在的主要种类。基本上纯化的分子可以是超过60％、优选75％、更优选90％、以及最优选95％无天然混合物中存在的其他分子(除溶剂之外)。术语“基本上纯化的”不意图包含以它们天然状态存在的分子。
本发明的试剂优选为对于任一结构属性为“生物活性的”，诸如核酸与另一核酸分子杂交的能力，或蛋白质被抗体结合的能力(或与另一分子竞争此类结合的能力)。或者，此类属性可以是催化性，并且因此涉及该试剂介导化学反应或应答的能力。
本发明的试剂还可以是重组的。本文所使用的术语重组的意思是其为间接来自核酸分子的人工操作、或从核酸分子的人工操作间接得到的试剂(例如，DNA、肽等)。
可用利于检测试剂的试剂(例如，荧光标签(Prober等，1987 Science238：336-340；Albarella等，欧洲专利144914))、化学标签(Sheldon等，美国专利4,582,789；Albarella等，美国专利4,563,417)、经修饰的碱基(Miyoshi等，欧洲专利119448)标记本发明的试剂。
一般性地描述了本发明后，通过参考以下实施例将更容易理解它们，所述实施例是通过示例的方式提供的，并且除非明确说明之外，不意图限制本发明。
实施例
实施例1：GLS作图研究
为作图对GLS的推定的QTL，使抗性系(SH4802；布达佩斯条约保藏号PTA-8007)与易感性系(32843；布达佩斯条约保藏号PTA-8006)杂交。为进行作图，在4种环境中评估GLS抗性表型(表1)：IraídeMinas-MG(Minas Gerais，海拔：951m；19°00’S e 47°05’W)，其中在两种不同的巴西种植季节收集数据：十月种植(safra)和三月种植(safrinha)；以及在Montividiu-GO(海拔：821m；17°04’S e 51°02’W)和Jataí-GO(Goiás，海拔：708m；17°52’S e 51°42’W)，在这两种位置仅有十月种植(safra)。
表1：用于GLS表型的等级的描述。ILA＝受感染的叶面积
                等级     症状
非常抗性        1        0％的叶面积受感染，没有可见损害
非常抗性        2        ILA＜1％；几乎没有损害，分散在较低的叶片
抗性            3        1％≤ILA＜20％
抗性            4        20％≤ILA＜40％
中度抗性        5        40％≤ILA＜50％；损害到达穗部叶，在穗以上
                         的叶中具有稀少的损害
中度易感        6        50％≤ILA＜60％；损害到达穗以上的叶
易感            7        60％≤ILA＜75％
易感            8        75％≤ILA＜90％
易感            9        ＞90％叶面积受感染，具有在形成黑色层之前
                         的植物过早死
在两年中进行这些试验：2000(safra)和2001(safrinha)。土地是2行5米长，行之间0.7m。在种植90-95天后目测评估疾病抗性。在所有实验中的感染是天然的，没有人工接种。
除了上述表型，还用126种多态性SNP和SSR标记联合测定了每一群体的基因型。评估了SNP标记基因型和GLS抗性表型(得分1-9)之间的关联，如表2所示。
表2.应用玉米近亲等基因系(NIL)的GLS抗性座位确认。报道了作为基于表1中1-9等的疾病等级下降的NIL中的效果。
表3列出了用于GLS抗性座位1至4的诊断标记组。发现与GLS抗性座位1高度连锁不平衡的SNP标记是NC0018320和NC0105022，如SEQ ID NO：1至2所示(表3)。发现与GLS抗性座位2高度连锁不平衡的SNP标记是NC0109328、NC0016724和NC0031264，如SEQ ID NO：3至5所示(表3)。发现与GLS抗性座位3高度连锁不平衡的SNP标记是NC0021154、NC0022590、NC0106769、NC0105291、NC0143268和NC0071496，如SEQ ID NO：6至11所示(表3)。发现与GLS抗性座位4高度连锁不平衡的SNP标记是NC0081460和NC0015184，如SEQ ID NO：12至13所示(表3)。
同样，表3还列出了相应于这些SNP标记、以及对于每一上述双等位基因标记的抗性和易感等位基因的所有PCR扩增引物的序列，如SEQID NO：14至39所示，以及探针序列，如SEQ ID NO：40至65所示。每一种标记分子均含有可以用所述引物对扩增并用相应的探针对检测的SNP(表3)。此外，表3中标出了对于每一标记的抗性和易感等位基因。
所有终点
Figure G2007800358005D00252
分析均由AB Biosystem生产。用于分析检验和基因分型的试剂购自AB Biosystem。根据来自AB Biosystem的操作指南完成PCR扩增和等位基因访问(calling)。
表3.对于GLS抗性座位1-4的SNP标记列表，其具有对于每一所指出的标记的抗性和易感等位基因，其中“＊”表示一个碱基对缺失。
Figure G2007800358005D00261
接下来，应用玉米近交32843作为GLS抗性座位1的来源以及玉米近交系SH4802作为GLS抗性座位2至4的来源，为每一在染色体1(2个座位)和3(1个座位)上的推定的GLS抗性座位产生近亲等基因系(NIL)。测试并确认这些以验证每一区域单独赋予抗性(表2，4)。对于NIL评估(QTL确认)，在两个位置进行种植试验：2002年(十月种植)在Iraíde Minas-MG和Mineiros-GO(与上述相同的位置)。如上面那样，试验植物经受自然感染的攻击。土地为一行，3米长，且每一块土地的侧翼是非常易感系(疾病增加者)。在Mineiros种植63、76、92、99和108天(dap)后、和在Iraí中在种植77、87、95和110天后评估疾病抗性。
将疾病进展曲线下的面积(AUDPC)与所有的目测评估相关联，结果显示，对于种植后第99天的Mineiros和第95天的Iraí来说，AUDPC和目测评估之间的关联分别为0.98和0.91。
表4.对于源于玉米近交系32843和SH4802的18种NILs(每种位置n＝3)的单种位置和复数种位置的平均GLS得分，标出了GLS抗性座位1-3的存在(1)或不存在(0)
                                                 平均GLS
                GLS                              得分-      平均GLS得   总平均GLS
NIL             得分    座位1  座位2    座位3    Mineiros   分-Iraí    得分
1   3GP07024    7.0     0      0        1        7.0        7.0         7.0
2   3GP07125    5.0     0      0        1        5.3        6.7         6.0
3   3GP07054    4.0     1      1        1        4.3        5.3         4.8
4   3GP07058    2.5     1      1        1        3.0        2.0         2.5
5   3GP07076    6.0     0      1        0        5.3        6.0         5.7
6   3GP07117    6.0     0      1        0        6.3        6.3         6.3
7   3GP07034    4.0     0      1        0        4.7        5.0         4.8
8   3GP07100    8.0     0      0        0        7.3        8.0         7.7
9   3GP07056    7.0     0      0        0        7.0        7.0         7.0
10  3GP07027    3.0     0      1        1        3.0        2.3         2.7
11  3GP07062    3.0     0      1        1        3.7        3.3         3.5
12  3GP07121    6.0     1      1        0        6.0        6.7         6.3
13  23GP60PL2   3.0     1      1        0        3.3        3.3         3.3
14  3GP07008    6.0     1      0        0        6.0        6.0         6.0
15  3GP07095    6.0     1      0        0        5.0        4.0         4.5
16  23GP64PL21  3.0     1      0        0        3.7        4.0         3.8
17  3GP07063    4.0     1      0        1        4.3        3.0         3.7
18  3GP07071    5.0     1      0        1        5.0        3.3         4.2
应用QTL Cartographer(Basten等，1995)评估了对于GLS抗性座位1至4的标记-GLS抗性关联的统计学显著性。这一分析将数据拟合至简单的线性回归模型：
y＝b0+b1x+e
结果给出对于每一标记的b0、b1和F统计量的估计值。通过评估b1与0是否显著不同而确定标记是否与QTL连接。F统计量比较假设的H0:b1＝0与替代的H0:b1不为0。pr(F)表征对H0支持度的度量。较小的pr(F)表明对H0的支持较少，以及因此对H1的支持更多。分别用*、**、***和****标记在5％、1％、0.1％和0.01％水平上的显著性。此外，表5还显示了LOD值。
 表5.分析4种种植的标记-GLS抗性关联的结果。
 GLS抗性座位3的以下标记没有包括在这一分析中：NC0106769、NC0105291和NC0143268。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001。
           GLS                                         Iraíde
           抗性    Iraíde Minas  Jataí   Montividiu  Minas       各位置中的平均值
           座位    safra          safra    safra       safrinha
                   pr(F)          pr(F)    pr(F)       pr(F)      pr(F)      LOD
NC0018320 1    0.395              0.297   0.005**     0.163       0.011*    1.44
NC0105022 1    0.671              0.223   0.011*      0.154       0.028*    1.06
NC0109328 2    0.802              0.020*   0.001**     0.212       0.005**   1.74
NC0016724 2    0.954              0.002**  0.002**     0.076       0.002**   2 .16
NC0031264 2    0.778              0.141   0.642       0.002**     0.073    0.71
NC0021154 3    0.000****            0.002**  0.030*      0.12        0.000***   3.01
NC0022590 3    0.000****            0.000**** 0.011*      0.000***     0.000***   5.80
NC0071496 3    0.003**             0.001**  0.113       0.478      0.001***   2.14
NC0081460 4    0001**              0.013*  0.169       0.013*     0.000***   3.06

Claims (39)

1.将等位基因基因渗入到玉米植物的方法，其包括
(A)将至少一种包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的第一玉米植物与至少一种第二玉米植物杂交，以形成分离群；
(B)用一种或更多种核酸标记筛选所述的分离群，以确定来自所述分离群的一种或更多种玉米植物是否含有所述的核酸序列，以及
(C)从所述分离群中选择包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的一种或更多种玉米植物。
2.权利要求1的方法，其中所述的选择的一种或更多种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第二序列。
3.权利要求2的方法，其中所述的选择的一种或更多种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第三序列。
4.权利要求3的方法，其中所述的选择的一种或更多种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第四序列。
5.权利要求4的方法，其中所述的选择的一种或更多种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第五序列。
6.权利要求1的方法，其中所述的选择的玉米植物表现出对诱导灰色叶斑病的真菌的至少部分的抗性。
7.权利要求1的方法，其中所述的选择的玉米植物表现出对诱导灰色叶斑病的真菌的至少相当大的抗性。
8.权利要求7的方法，其中所述的诱导灰色叶斑病的真菌选自玉蜀黍尾孢菌株I型和II型。
9.将等位基因基因渗入到玉米植物的方法，其包括：
(A)将至少一种灰色叶斑病抗性玉米植物与至少一种灰色叶斑病敏感玉米植物杂交，以形成分离群；
(B)用一种或更多种核酸标记筛选所述分离群，以确定来自所述分离群的一种或更多种玉米植物是否含有灰色叶斑病抗性等位基因，其中所述的灰色叶斑病抗性等位基因选自1、2、3或4GLS抗性座位，其中在一种或更多种这些座位上的一种或更多种等位基因选自GLS抗性等位基因1、GLS抗性等位基因2、GLS抗性等位基因3、GLS抗性等位基因4、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因5、GLS抗性等位基因6、GLS抗性等位基因7、GLS抗性等位基因8、GLS抗性等位基因9、GLS抗性等位基因10、GLS抗性等位基因11、GLS抗性等位基因12、GLS抗性等位基因13。
10.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记位于所述抗性等位基因的10cM内。
11.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记位于所述抗性等位基因的5cM内。
12.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记位于所述抗性等位基因的2cM内。
13.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记位于所述抗性等位基因的1cM内。
14.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记显示出灰色叶斑病抗性的超过2.0的LOD得分。
15.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记显示出灰色叶斑病抗性的超过2.5的LOD得分。
16.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记显示出灰色叶斑病抗性的超过3.0的LOD得分。
17.权利要求9的方法，其中至少一种所述的一种或更多种标记显示出灰色叶斑病抗性的超过4.0的LOD得分。
18.包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的核酸序列的原种玉米植物。
19.权利要求18的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物显示出转基因性状。
20.权利要求19的原种玉米植物，其中所述的转基因性状选自除草剂耐性和抗虫性。
21.权利要求20的原种玉米植物，其中所述的除草剂耐性选自草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲、溴苯腈和达草灭除草剂。
22.权利要求18的原种玉米植物，其中所述的核酸序列在所述原种玉米植物中作为单拷贝存在。
23.权利要求18的原种玉米植物，其中所述的核酸序列在所述原种玉米植物中以两拷贝存在。
24.权利要求18的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第二序列。
25.权利要求24的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第三序列。
26.权利要求25的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第四序列。
27.权利要求26的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物还包含选自SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：78的第五序列。
28.权利要求18的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物表现出对诱导灰色叶斑病的真菌的至少部分的抗性。
29.权利要求18的原种玉米植物，其中所述的原种玉米植物表现出对诱导灰色叶斑病的真菌的至少相当大的抗性。
30.权利要求29的原种玉米植物，其中所述的诱导灰色叶斑病的真菌选自玉蜀黍尾孢菌株I型和II型。
31.基本上纯化的包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：78及其互补序列的核酸序列的核酸分子。
32.包含GLS抗性座位1的玉米植物。
33.包含GLS抗性座位4的玉米植物。
34.包含GLS抗性座位2和1的玉米植物。
35.包含GLS抗性座位3和1的玉米植物。
36.包含GLS抗性座位4和2的玉米植物。
37.包含GLS抗性座位3和4的玉米植物。
38.包含GLS抗性座位1和4的玉米植物。
39.包含GLS抗性座位1或4的玉米植物。
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