BRPI0717151A2 - Processo de introgressão de um alelo em uma planta de milho - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE INTROGRESSÃO DE UM ALELO EM UMA PLANTA DE MILHO".

Incorporação da Listagem de Seqüência

Uma cópia em papel da Listagem de Seqüência e uma forma que pode ser lida em computador da listagem de seqüência sobre disco compacto, contendo o arquivo denominado "SequênciaListing.txt", que tem 28.672 bites de tamanho (medido em Janelas XP) e que foi gravado em 19 de setembro de 2007 encontram-se aqui incorporados como referência. Campo da Invenção

A presente invenção situa-se no campo da reprodução de

plantas e de resistência a doenças. Mais especificamente, a invenção inclui um método para a reprodução de plantas de milho que contém Ioci de características quantitativas que estão associados à mancha cinzenta da folha, uma doença provocada por fungos associada com Cercospora spp. A invenção também inclui germoplasma e o uso de Ioci de características quantitativas (QTL) no germoplasma que confere resistência à doença para introgressão em germoplasma de elite em um programa de reprodução para resistência à mancha cinzenta da folha. Antecedentes da invenção Uma das doenças mais importantes, que reduz o rendimento no

milho é a mancha cinzenta da folha (GLS), causada principalmente por Cercospora zeae-maydis (Cz) Tehon & Ε. Y. Daniels (revisto por Ward e outros, 1999 Plant Dis. 83: 884-895). GLS é um problema global e, além da prevalência na África, na América Central e na América do Sul, espalhou-se através de grande parte do "cinturão do milho" nos EUA durante estes últimos 10-15 anos. O fungo passa o inverno nos restos no campo e requer umidade, habitualmente na forma de névoas pesadas, orvalhos ou chuvas, para espalhar os seus esporos e infectar o milho. O aumento da expansão foi ligado a práticas de nenhum preparo do cultivo que promovem a retenção de fungos, tal como Cz, no solo (Paul e outros. 2005 Phytopathology 95: 388-396). Os sintomas incluem uma lesão necrótica retangular que pode coalescer a maiores regiões afetadas e os sintomas surgem habitualmente posteri- ormente na estação de plantio e germinação. A GLS no milho provoca uma maior distribuição de recursos ao tecido da folha danificado, levando a um elevado risco para a raiz e o caule apodrece, o que resulta definitivamente em perdas ainda maiores da safra (Ward e outros. 1999; Saghai-Maroof e outros. 1996 Theor. Appl. Genet. 93: 539-546). A perda de rendimento asso- ciada à GLS pode ser alta se os sintomas forem graves e surgiram prematu- ramente, com perdas relatadas excedendo 50 % (Ward e outros. 1999). A- lém disso, mesmo se forem empregadas estratégias de controle da safra, tal como aplicação de fungicida, para reduzir a incidência de Cz no solo, ainda há um risco de adquirir a infecção dos campos próximos. Notavelmente, o Cz pode ser facilmente disperso pelo vento (Latterell e outros. 1983 Plant Dis. 67: 842-847). Desse modo há uma necessidade substancial do desen- volvimento de milho resistente a GLS.

A introgressão do germoplasma de elite de resistência à doença foi melhorada pelo advento de reprodução auxiliada por marcador molécular, que não teve apenas um ganho genético drasticamente aumentado nos as- pectos agronômicos ma também levou à identificação e associações de marcador- aspecto para os aspectos secundários. A eficiência desta aborda- gem para a reprodução da resistência à doença no milho foi recentemente revista por Wisser e outros. (Wisser e outros. 2006 Phytopathology 96: ΙΣΟ- Ι 29). Esta revisão também ressaltou a falta de resolução genética em muitos destes relatórios e questionou a acurácia a acurácia de muitos estudos de mapeamento da resistência histórica à doença devida à amostragem inade- quada e ao mapeamento das imperfeições da população. Em geral, o mape- amento da resistência à doença é difícil devido às incoerências da infeção pelo patógeno que possa ocorrer em experiências no campo. Além disso, a seleção de materiais somente em viveiros de verão devido a regulamentos que restringem o uso de patógenos e a economia da seleção para patóge- nos em viveiros de verão torna a seleção para resistência à doença uma ta- refa difícil.

Além disso, um trabalho recente identificou que há pelo menos duas espécies irmãs de Cz, assim como potencialmente outros isolados de Cercospora, capazes de causar LS (Carson e outros. 2006 Maydica 51: 89- 92; Carson e outros, 2002 Plant Dis. 86: 1088-109). Pelo fato de que diferen- tes raças têm epidemiologias distintas, isto tem ligação com a metodologia de fenotipagem de GLS usada como a base para estes estudos de mapea- mento, o que coloca em dúvida a verdadeira natureza dos muitos assim chamados QTL de resistência à GLS. A presente invenção fornece e inclui um processo para a escolha e seleção de uma planta de milho que compre- ende QTL para resistência à GLS que foram derivados de populações de mapeamentos brasileiros utilizando cepas endêmicas de Cz e a tecnologia de marcadores de polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP). Sumário da invenção

A presente invenção inclui um processo de introgressão de um alelo em uma planta de milho que compreende (A) o cruzamento de pelo menos uma primeira planta de milho que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 até SEQ ID N°: 78 com pelo menos uma segunda planta de milho para formar uma população segregante, (B) selecionando a população segregante com um ou mais marcadores de ácido nucléico para determinar se uma ou mais plantas de milho da população segregante contém a seqüência da popula- ção segregante contém a seqüência de ácido nucléico e (C) selecionando na população segregante uma ou mais plantas de milho que compreendem a seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 até SEQ ID N°: 78. A presente invenção inclui um método de intro- gressão de um alelo em uma planta de milho que compreende: (A) cruza- mento de pelo menos uma planta de milho resistente à mancha cinzenta na folha com menos uma planta de milho sensível á mancha cinzenta na folha para formar uma população segregante; (B) selecionando a dita população segregante com um ou mais marcadores de ácido nucléico para determinar se uma ou mais plantas da dita população segregante contém um alelo re- sistente à mancha cinza na folha, que o dito alelo resistente à mancha cinza na folha é um alelo selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3 ou 4 Ioci resistentes a GLS onde um ou mais alelos em um ou mais de seus Ioci são selecionados do grupo que consiste em alelo resistente a GLS 1, alelo resis- tente a GLS 2, alelo resistente a GLS 3, alelo resistente a GLS 4, alelo resis- tente a GLS 5, alelo resistente a GLS 5, alelo resistente a GLS 6, alelo resis- tente a GLS resistente 7, alelo resistente a GLS 8, alelo resistente a GLS 9, alelo resistente a GLS 10, alelo resistente a GLS 11, alelo resistente a GLS 12, alelo resistente a GLS 13.

A presente invenção inclui uma planta de milho de elite que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 até SEQ ID N°: 78. A presente invenção inclui uma molécula de ácido nucléico subs-

tancialmente purificada que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 até SEQ ID N°: 78 e complementos das mesmas.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende um lócus resistente a GLS 1.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende um lócus resistente a GLS 4.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende Ioci resistentes a GLS 2 e 1. A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende

Ioci resistentes a GLS 3 e 1.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende Ioci resistentes a GLS 4 e 2.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende Ioei resistentes a GLS 3 e 4.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende Ioei resistentes a GLS 1 e 4.

A presente invenção inclui uma planta de milho que compreende um lócus resistente a GLS 1 ou 4. Breve Descrição de Seqüência de Ácidos Nucléicos

A SEQ ID N°: 1 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 1. A SEQ ID Ν°: 2 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 1.

A SEQ ID N°: 3 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 2.

A SEQ ID N°: 4 é uma seqüência genômica derivada de Zea

mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 2.

A SEQ ID N°: 5 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3.

A SEQ ID N°: 6 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3.

A SEQ ID N°: 7 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3.

A SEQ ID N°: 8 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3. A SEQ ID N°: 9 é uma seqüência genômica derivada de Zea

mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3.

A SEQ ID N°: 10 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3.

A SEQ ID N°: 11 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 3.

A SEQ ID N0: 12 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 4.

A SEQ ID N°: 13 é uma seqüência genômica derivada de Zea mays L correspondente a um lócus de resistência à GLS 4. A SEQ ID N0: 14 é um iniciador de PCR para adiante correspon-

dente à SEQ ID N°: 1.

A SEQ ID N°: 15 é um iniciador de PCR reverso correspondente à SEQ ID N°: 1.

A SEQ ID N°: 16 é um iniciador de PCR para adiante correspon- dente à SEQ ID N°: 2.

A SEQ ID N°: 17 é um iniciador de PCR reverso correspondente à SEQ ID N°: 2. A SEQ ID Ν°: 18 é um dente à SEQ ID N°: 3.

ASEQ ID N°: 19 é um à SEQ ID N°: 3.

A SEQ ID N0: 20 é um

dente à SEQ ID N°: 4.

ASEQ ID N°: 21 é um à SEQ ID N°: 4.

A SEQ ID N°: 22 é um dente à SEQ ID N0: 5.

A SEQ ID N°: 23 é um à SEQ ID N°: 5.

A SEQ ID N0: 24 é um dente à SEQ ID N°: 6. A SEQ ID N°: 25 é um

à SEQ ID N°: 6.

A SEQ ID N°: 26 é um dente à SEQ ID N°: 7.

A SEQ ID N°: 27 é um à SEQ ID N°: 7.

A SEQ ID N°: 28 é um dente à SEQ ID N°: 8.

A SEQ ID N°: 29 é um à SEQ ID N°: 8. A SEQ ID N0: 30 é um

dente à SEQ ID N0: 9.

A SEQ ID N°: 31 é um à SEQ ID N°: 9.

A SEQ ID N°: 32 é um dente à SEQ IDN0: 10.

A SEQ ID N°: 33 é um à SEQ ID N°: 10.

6

iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente iniciador de PCR para adiante correspon- iniciador de PCR reverso correspondente A SEQ ID Ν°: 34 é um iniciador de PCR para adiante correspon- dente à SEQ ID N°: 11.

A SEQ ID N°: 35 é um iniciador de PCR reverso correspondente à SEQ ID N°: 11.

A SEQ ID N°: 36 é um iniciador de PCR para adiante correspon-

dente à SEQ IDN°: 12.

A SEQ ID N°: 37 é um iniciador de PCR reverso correspondente à SEQ ID N°: 12.

SEQ ID N°: 38 é um iniciador de PCR para adiante correspon- dente à SEQ ID N°: 13.

A SEQ ID N0: 39 é um iniciador de PCR reverso correspondente à SEQ ID N°: 13.

A SEQ ID N°: 40 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID A SEQ ID N°: 41 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 42 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 43 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 44 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 45 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID A SEQ ID N0: 46 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de

resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 47 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 48 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 49 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID A SEQ ID Ν°: 50 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N0: 51 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID A SEQ ID N°: 52 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de

resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 53 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 54 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 55 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 56 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID A SEQ ID N°: 57 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de

resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 58 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID

A SEQ ID N°: 59 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID.

A SEQ ID N°: 60 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID.

A SEQ ID N0: 61 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID. A SEQ ID N°: 62 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de

resistência à GLS de SEQ ID.

A SEQ ID N°: 63 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID.

A SEQ ID N°: 64 é uma sonda 1 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID.

A SEQ ID N°: 65 é uma sonda 2 correspondente ao lócus de resistência à GLS de SEQ ID. A SEQ ID N0: 66 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 1.

A SEQ ID N°: 67 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 2.

A SEQ ID N°: 68 é um motivo de alelo de resistência à GLS que

corresponde à SEQ ID N°: 3.

A SEQ ID N0: 69 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N0: 4.

A SEQ ID N°: 70 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 5.

A SEQ ID N°: 71 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 6.

A SEQ ID N°: 72 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 7. A SEQ ID N°: 73 é um motivo de alelo de resistência à GLS que

corresponde à SEQ ID N°: 8.

A SEQ ID N°: 74 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 9.

A SEQ ID N°: 75 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 10.

A SEQ ID N°: 76 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 11.

A SEQ ID N°: 77 é um motivo de alelo de resistência à GLS que corresponde à SEQ ID N°: 12. A SEQ ID N°: 78 é um motivo de alelo de resistência à GLS que

corresponde à SEQ ID N°: 13. Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece dois Ioci de resistência à GLS que estão Iocusizados em bases de dados públicas no genoma de milho que não foram associados anteriormente à resistência à GLS:

Lócus de resistência à GLS 1 em base de dado 1.03 e lócus de resistência à GLS 4 em base de dado 7.04. lócus de resistência à GLS 2, com marcadores localizados em bases de dados 1.06 e 1.07 e lócus de re- sistência à GLS 3, com marcadores localizados em bases de dados 3.03 e 3.04. A presente invenção também é responsável por alelos QTL capazes de conferir resistência à GLS. São fornecidos alelos que estão localizados em lócus de resistência à GLS 1, lócus de resistência à GLS 2, lócus de resis- tência à GLS 3 e lócus de resistência à GLS 4.

Na presente invenção, um lócus de resistência à GLS 1 está lo- calizado no cromossomo 1. Os marcadores SNP usados para monitorar a introgressão do lócus de resistência à GLS 1 incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em NCOOI 8320 e NC0105022. As seqüências de DNA marcadoras de SNP do lócus 1 de resistência à GLS ilustrativas (SEQ ID N°: 1 a 2) podem ser amplificadas usando-se os iniciadores indicados como SEQ ID N0: 14 a 17 com sondas indicadas como SEQ ID N°: 40 a 43. Na presente invenção, um lócus de resistência à GLS 2 está localizado no cromossomo 1.

Os marcadores SNP usados para monitorar a introgressão de lócus de resistência à GLS 2 incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em NC0109328, NC0016724 e NC0031264. Estas seqüências ilus- trativas de marcador de DNA (SEQ ID N°: 3 a 5) podem ser amplificadas usando-se os iniciadores indicados como SEQ ID N°: 18 a 23 com sondas indicadas como SEQ ID N°: 44 a 49.

A presente invenção fornece um lócus de resistência à GLS 3, que está localizado no cromossomo 3. Os marcadores de SNP ilustrativos usados para monitorar a introgressão de lócus de resistência à GLS 3 po- dem ser selecionados do grupo que consiste em NC0021154, NC0022590, NC0106769, NC0105291, NC0143268 e NC0071496. Estas seqüências de DNA marcadoras ilustrativas (SEQ ID N°: 6 a 11) podem ser amplificadas usando-se os iniciadores indicados como SEQ ID N°: 24 a 35 com sondas indicadas como SEQ ID N°: 50 a 61. Na presente invenção, um lócus de resistência à GLS 4 está lo-

calizado no cromossomo 7. Os marcadores de SNP ilustrativos que podem ser usados para monitorar a introgressão de lócus de resistência à GLS 4 são selecionados do grupo que consiste em NC0081460 e NC0015184. Es- tas seqüências de marcador de DNA ilustrativas (SEQ ID N°: 12 a 13) po- dem ser amplificadas usando-se os iniciadores indicados como SEQ ID N°: 36 a 39 com sondas indicadas como SEQ ID N°: 62 a 65.

A presente invenção também fornece uma planta de milho que

compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 68 a SEQ ID N0: 78 e complementos das mesmas. A presente invenção também fornece uma planta de milho que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 13, fragmentos das mesmas e complementos de ambas. A presente invenção também fornece uma planta de milho que com- preende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID N°: 14 a SEQ ID N°: 65, fragmentos das mesmas e comple- mentos de ambas. Em um aspecto, a planta de milho compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 seqüências de ácido nucléicos selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78 e complementos das mesmas. Em um outro aspecto, a planta de milho compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 seqüências de ácido nucléico selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 13, fragmentos das mesmas e complementos de ambas. Em um outro aspecto, a planta de milho compre- ende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 seqüências de ácido nucléico se- lecionadas do grupo que consiste em SEQ ID N°: 14 a SEQ ID N°: 65, frag- mentos das mesmas e complementos de ambas.

A presente invenção também fornece uma planta de milho que compreende 1, 2, 3 ou 4 Ioci resistentes a GLS que um ou mais alelos em um ou mais de seus Ioci são selecionados do grupo que consiste em alelo resistente à GLS 1, alelo resistente à GLS 2, alelo resistente à GLS 3, alelo resistente à GLS 4, alelo resistente à GLS 5, alelo resistente à GLS 5, alelo resistente à GLS 6, alelo resistente à GLS 7, alelo resistente à GLS 8, alelo de resistência à GLS 9, alelo de resistência à GLS 10, alelo de resistência à GLS 11, alelo de resistência à GLS 12, alelo de resistência à GLS 13. Em um aspecto, é fornecida uma planta de milho que compreende um alelo re- sistente à GLS 1. Em um outro aspecto, é fornecida uma planta de milho que compreende um alelo resistente à GLS 4. Em um outro aspecto, é fornecida uma planta de milho que compreende alelos resistentes à GLS 2 e 1. Em um aspecto adicional, é fornecida uma planta de milho que compreende alelos resistentes à GLS 3 e 1. Em um aspecto, é fornecida uma planta de milho que compreende alelos resistentes à GLS 4 e 2. Em um outro aspecto, é fornecida uma planta de milho que compreende alelos resistentes à GLS 3 e 4. Em um outro aspecto, é fornecida uma planta de milho que compreende alelos resistentes à GLS 1 e 4. Em um aspecto adicional, é fornecida uma planta de milho que compreende alelos resistentes à GLS 1 ou 4. Tais alelos podem ser homozigóticos ou heterozigóticos.

Como usado neste caso, GLS refere-se a qualquer variante ou isolado de Mancha Cinzenta da Folha. Uma planta de milho da presente in- venção pode ser resistente a um ou mais fungos capazes de provocar ou de induzir GLS. Em um aspecto, a presente invenção GLS1 causada pelo gêne- ro Cercospora. Em um aspecto preferido, a presente invenção fornece mé- todos e composições para seleção de plantas de milho para resistência ou suscetibilidade a C. zeea-maydis.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece plantas resis- tentes e métodos e composições para a seleção de plantas de milho para resistência ou suscetibilidade a C. zeea-maydis cepa do "Tipo I." Em um ou- tro aspecto, a presente invenção fornece plantas resistentes e métodos e composições para a seleção de plantas de milho para resistência ou susce- tibilidade a C. zeea-maydis cepa do "Tipo II." Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece plantas resistentes e métodos e composições para a seleção de plantas de milho para resistência ou suscetibilidade a C. sorghi var. maydis.

Em um aspecto, a planta é selecionada do gênero Zea. Em um outro aspecto, a planta é selecionada entre as espécies Zea mays. Em um outro aspecto, a planta é selecionada entre as subespécies Zea mays L. ssp. mays. Em um aspecto adicional, a planta é selecionada do grupo Zea mays L. subsp. mays Indentata, também denominada milho indentado. Em um ou- tro aspecto, a planta é selecionada do grupo Zea mays L. subsp. mays Indu- rata, também denominada milho duro. Em um aspecto, a planta é seleciona- da do grupo Zea mays L. subsp. mays Saccharata, também conhecida como milho verde. Em um outro aspecto, a planta é selecionada do grupo Zea mays L. subsp. mays Amylacea, também conhecida como milho para fari- nha. Em um outro aspecto, a planta é selecionada do grupo Zea mays L. subsp. mays Everta, também conhecida como milho de pipoca. As plantas Zea incluem híbridos, produtos de cruzamentos consaguíneos, produtos de cruzamentos consaguíneos parciais ou membros de populações definidas ou não definidas. As plantas da presente invenção podem ser uma planta de milho que seja muito resistente, resistente, substancialmente resistente, me- dianamente resistente, comparativamente resistente, parcialmente resisten- te, medianamente suscetível ou suscetível.

Em um aspecto preferido, a presente invenção fornece uma planta de milho a ser dosada para resistência ou suscetibilidade a GLS por qualquer método para determinar se uma planta de milho é muito resistente, resistente, substancialmente resistente, medianamente resistente, compara- tivamente resistente, parcialmente resistente, medianamente suscetível ou suscetível.

Neste aspecto, uma planta é dosada para resistência ou susce- tibilidade à GLS por análise da imagem de tecido da folha usando-se 3 fo- lhas por planta acima da espiga um estágio de desenvolvimento entre a ca- mada negra e a senescência, antes da morte em conseqüência de GLS, são capturadas em um imagem digital. A análise da imagem é conduzida para determinar a percentagem de danos ao tecido e fornecem uma classificação da doença como descrito na Tabela 1. É usada uma média de cinco plantas por população. O programa de computador e métodos de análise da imagem usados para avaliar quantitativamente as diferenças visuais em duas ou três dimensões são aqueles apresentados em (Bright 1987 J. Microscopy 148 (parte I): 51-87; Bickmore e outros. 1999 Geol. Mat. Res. 1(5): 1-19).

Como usado neste caso, "substancialmente resistente" é menor do que ou igual a 30 % da área da folha infectada. Como usado neste caso, "parcialmente resistente" é menor do que ou igual a 50 % da área da folha infectada. Como usado neste caso, "resistente" está entre 1 % e 40 % da área da folha infectada. Como usado neste caso, "medianamente resistente" está entre 40% e 50% da área da folha infectada. Como usado neste caso, medianamente suscetível está entre 50% e 60% da área da folha infectada. Como usado neste caso, "suscetível" está entre 60% e 100% da área da folha infectada. Como usado neste caso, "muito resistente" exibe entre 0 % e 5% da área da folha infectada.

Em um outro aspecto, a planta de milho pode apresentar uma resistência comparativa em relação a uma planta de milho de controle não resistente. Neste aspecto, uma planta de milho de controle será de preferên- cia geneticamente similar exceto para o alelo resistente à GLS ou os alelos questão. Tais plantas podem ser cultivadas sob condições similares com exposição equivalente ou quase equivalente ao patógeno. Neste aspecto, a planta ou as plantas resistentes têm menos do que 25%, 15%, 10%, 5%, 2% ou 1% da área da folha infectada.

Um QTL de resistência à doença da presente invenção pode ser introduzido em uma linhagem de reprodução intracruzada de milho de elite. Uma "linhagem de elite" é qualquer linhagem que resultou da reprodução e da seleção para um desempenho superior em agronomia. Exemplos de li- nhagens intracruzadas de elite são linhagens que são comercialmente dis- poníveis para fazendeiros ou para plantadores de milho tais como ZS4199, ZS02433, G3000, G1900, G0302, G1202, G2202, G4901, G3601, G1900 (Advanta Technology Ltd., Great Britain); 6TR512, 7RN401, 6RC172, 7SH382, MV7100, 3JP286, BE4207, 4VP500, 7SH385, 5XH755, 7SH383, 1 1084BM, 2JK221, 4XA321, 6RT321, BE8736, MV5125, MV8735, 3633BM (Dow, Michigan, USA); 8982-1 1-4-2, 8849, IT302, 9034, IT201, RR728-18, 5020, BT751 -31 (FFR Cooperative, Indiana, USA); 1874WS, X532Y, 1784S, 1778S, I880S (Harris Moran Semente Company, Califórnia, USA); FR3351, FR2108, FR3383, FR3303, FR3311, FR3361 (Illinois Foundation Sementes, Inc., Illinois, USA); NR109, JCRNRI 13, MR724, M42618, CI9805, JCR503, NR401, W60028, N16028, N10018, E24018, A60059, W69079, W23129 (J.C. Robinson Semente Company, Nebraska, USA); 7791, KW4773, KW7606, KW4636, KW7648, KW4U110, KWU7104, CBI1 CC2 (KWS Klein- wanzlebener Saatzucgt AG, Alemanha); UBB3, TDCI, RAAI, VMMI, MNII, Rlll, RBOI (Limagrain Genetics Grande Culture S.A., França); LH284, 70LDL5, GM9215, 90LDI1, 90LDC2, 90QDD1, RDBQ2, 01HG12, 79314N1, 17INI20, 17DHD7, 83INI8, 83M14, 01INL1, LH286, ASG29, ASG07, QH111, 09DSQ1, ASG09, 86AQV2, 861SI5, ASG25, 01DHD16, ASG26, ASG28, 90LCL6, 22DHD1 1, ASG17, WDHQ2, ASG27, 90DJD28, WQCDIO, 17DHD5, RQAA8, LH267, 29MIFI2, RQAB7, LH198Bt810, 3DHA9, LH200BT810, LH172Bt810, 01IZB2, ASGIO, LH253, 86ISI27, 91ISI5, 22DHQ3, 91 INI 12, 86ISI26, 01 IUL6, 89ADH 11, 01 HGI4, 16IUL2, F307W, LH 185Bt810, F351, LH293, LH245, 17DHD16, 90DHQ2, LH279, LH244, LH287, WDHQI 1, 09DSS1, F6150, 17INI30, 4SCQ3, 01HF13, 87ATD2, 8MI 16, FBLL1 17QFB1, 83DNQ2, 94INK1A, NL054B, 6F545, F274, MBZA, 1389972, 94INK1B, 89AHD12, 1889291, 3323, 16IUL6, 6077, 1014738, 7180, GF6151, WQDS7, 1465837, 3327, LH176Bt810, 181664, 1362697, LH310, LH320, LH295, LH254, 5750, 1390186, 1501 150, 1363128, 1244225, LH246, LH247, LH322, LH289, LH283BtMON810, 85DGD1, 1390185, WDDQI, LH331 (Monsanto Co., Missouri, USA); PH1B5, PHICA, PHOWE, PHIGG, PHOCD, PH21T, PH224, PHOVO, PH3GR, PHINF, PHOJG, PH189, PH12J, PHIEM, PH12C, PH55C, PH3EV, PH2V7, PH4TF, PH3KP, PH2MW, PH2N0, PH1K2, PH226, PH2VJ, PH1M8, PH1B8, PHOWD, PH3GK, PH2VK, PHIMD, PH04G, PH2KN, PH2E4, PHODH, P- HICP, PH3P0, PHIWO, PH45A, PH2VE, PH36E, PH50P, PH8V0, PH4TV, PH2JR, PH4PV, PH3DT, PH5D6, PH9K0, PH0B3, PH2EJ, PH4TW, PH77C, PH3HH, PH8W4, PHIGD, PHIBC, PH4V6, PH0R8, PH581, PH6WR, PH5HK, PH5W4, PHOKT, PH4GP, PHJ8R, PH7CP, PH6WG, PH54H, PH5DR, PH5WB, PH7CH, PH54M, PH726, PH48V, PH3PV, PH77V, PH7JB, PH70R, PH3RC, PH6KW, PH951, PH6ME, PH87H, PH26N, PH9AH, PH51H, PH94T, PH7AB, PH5FW, PH75K, PH8CW, PH8PG, PH5TG, PH6JM, PH3AV, PH3PG, PH6WA, PH6CF, PH76T, PH6MN, PH7BW, PH890, PH876, PHAPV, PHB5R, PH8DB, PH51 Κ, PH87P, PH8KG, PH4CV, PH705, PH5DP, ΡΗ77Ν, ΡΗ86Τ, PHAVN, PHB6R, PH91C, PHCWK1 PHC5H, PHA- CE1 PHB6V, PH8JR, ΡΗ77Ρ, PHBAB, PHBIV1 PH3PR, ΡΗ8ΤΝ, PH5WA, PH58C, PH6HR, ΡΗ183, ΡΗ714, PHA9G, PH8BC, PHBBP, PHAKC, PHD90, PHACV, PHCEG, PHB 18, PHBOO, PNCND, PHCMV (Pioneer Hi-Bred In- ternational, Inc., Iowa1 USA); GSC3, GSCI, GSC2, NP2138, 2227BT, ZS02234, NP2213, 2070BT, NP2010, NP2044BT, NP2073, NP2015, NP2276, NP2222, NP2052, NP2316, NP2171, WICY418C, NP2174, BX20010, BX20033, G6103, Gl 103, 29 IB, 413A, Gl 704 (Syngenta Partici- pations AG, Suíça). Uma planta de elite é qualquer planta proveniene de uma linhagem de elite. Uma resistência à GLS pode ser fornecida, por e- xemplo, a uma planta híbrida por alelos presentes em um ou em ambos in- tracruzamentos parentais.

Um QTL de resistência a GLS da presente invenção também pode ser introduzido em uma planta de milho de elite que compreende um ou mais transgenes que conferem tolerância a herbicida, maior rendimento, controle de insetos, resistência à doença provocada por fungos, resistência a vírus, resistência a nematódios, resistência a doença bacteriana, resistência a doença por micoplasma, produção de óleos modificados, alta produção de óleo, alta produção de proteína, controle da germinação e do crescimento da muda, nutrição melhorada para animais e seres humanos, baixa rafinose, resistência a estresse ambiental, maior digestibilidade, enzimas industriais, proteínas farmacêuticas, peptídeos e pequenas moléculas, traços de pro- cessamento melhorados, sabor melhorado, fixação de nitrogênio, produção de semente híbrida, alergenicidade reduzida, biopolímeros e biocombustí- veis, entre outros. Em um aspecto, a tolerância a herbicida é selecionada do grupo que consiste em herbicidas glifosato, dicamba, glufosinato, sulfonilu- réia, bromoxinil e norflurazon. Estas características podem ser fornecidas por métodos de biotecnologia de vegetais como transgenes em milho.

Um alelo ou alelos de QTL de resistência a doenças pode ser introduzido de qualquer planta que contenha aquele alelo (doador) a qual- quer planta de milho receptora. Em um aspecto, a planta de milho receptora pode conter Ioci adicionais resistentes a GLS. Em um outro aspecto, a planta de milho receptora pode conter um transgene. Em um outro aspecto, en- quanto se mantém o QTL introduzido, a contribuição genética da planta que fornece o QTL resistente à doença pode ser reduzida por retrocruzamento ou por outra abordagens adequadas. Em um aspecto, o material genético nuclear derivado do material do doador em uma planta de milho pode ser menor do que ou em torno de 50%, menor do que ou em torno de 25%, me- nor do que ou em torno de 13%, menor do que ou em torno de 5%, de 3%, de 2% ou de 1%, porém aquele material genético contém o lócus resistente a GLS ou Ioei de interesse. As plantas que contenham Ioci resistentes a GLS descritas podem ser plantas doadoras.

As plantas de milho que contêm Ioci resistentes podem ser, por exemplo, selecionadas pela utilização de uma molécula de ácido nucléico capaz de detectar um polimorfismo marcador associado com a resistência. Em um aspecto, uma planta doadora é SH 4802 (Número de Depósito pelo Tratado de Budapeste PTA-8007). Em um aspecto preferido, uma planta doadora é a fonte para Ioci de resistência GLS 2 a 4. Em um outro aspecto, uma planta doadora é o intracruzamento de milho 32843 (Número de Depó- sito pelo Tratado de Budapeste PTA-8006). Em um outro aspecto preferido, uma planta doadora é a fonte para lócus de resistência a GLS 1. Uma planta doadora pode ser uma linhagem suscetível. Em um aspecto, a planta doado- ra pode também ser uma planta de milho receptora.

Também é entendido que uma planta de milho da presente in- venção pode inibir as características de qualquer grupo de maturidade relati- va. Em um aspecto, o grupo de maturidade é selecionado do grupo que con- siste em RM 90 - 95, RM 95 - 100, RM 100 - 105, RM 105 - 110, RM 110 - 115, e RM 115-120.

Um alelo de um QTL pode, evidentemente, compreender múlti- plos genes ou outros fatores genéticos mesmo dentro de uma reigão genô- mica contígua ou de um grupo de ligação, tal como um haplotipo. Como u- sado neste caso, um alelo de um lócus de resistência a doença pode portan- to abranger mais do que um gene ou outro fator genético que cada gene ou componente genético individual seja capaz de exibir variação alélica e em que cada gene ou fator genético também seja capaz de provocar um efeito fenotípico sobre a característica quantitativa em questão. Em um aspecto da presente invenção o alelo de um QTL compreende um ou mais genes ou outros fatores genéticos que também sejam capazes de exibir variação aléli- ca. O uso do termo "um alelo de um QTL" desse modo não pretende excluir um QTL que compreende mais do que um gene ou outro fator genético. Es- pecificamente, um "alelo de um QTL" na presente invenção pode representar um haplótipo dentro de uma janela de haplótipo que um fenótipo pode ser resistência à doença. Uma janela de haplótipo é uma região genômica contí- gua que pode ser definida e rastreada com um conjunto de um ou mais mar- cadores polimórficos que os polimorfismos indicam identidade por descen- dência. Um haplótipo dentro daquela janela pode ser definido pelo fingerprint exclusivo sem comparação de alelos em cada marcador. Como usado neste caso, um alelo é uma das diversas formas alternativas de um gene que ocu- pa um dado lócus em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um dado lócus em um cromossomo forem os mesmos, aquela planta é homozigótica naquele lócus. Se os alelos presentes em um dado lócus em um cromossomo diferem, aquela planta é heterozigótica naquele lócus. As plantas da presente invenção podem ser homozigóticas ou heterozigóticas em qualquer lócus GLS em particular ou para um marcador polimórfico em particular.

A presente invenção também é responsável por partes das plan- tas da presente invenção. As partes de plantas, sem limitação, incluem se- mente, endosperma, óvulo e pólen. Em um aspecto particularmente preferi- do da presente invenção, a parte da planta é uma semente.

A presente invenção também fornece uma embalagem com mi- lho em que mais do que 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % das sementes que compreendem 1, 2, 3 ou 4 Ioci resistentes a GLS em que um ou mais alelos em um ou mais de seus Ioci são selecionados do grupo que consiste em alelo resistente à GLS 1, alelo resistente à GLS 2, alelo resis- tente à GLS 3, alelo resistente à GLS 4, alelo resistente à GLS 5, alelo resis- tente à GLS 5, alelo resistente à GLS 6, alelo resistente à GLS 7, alelo resis- tente à GLS 8, alelo de resistência à GLS 9, alelo de resistência à GLS 10, alelo de resistência à GLS 11, alelo de resistência à GLS 12, alelo de resis- tência à GLS 13.

A embalagem de sementes de milho pode conter qualquer nú- mero, peso ou volume de sementes. Por exemplo, um recipiente pode conter pelo menos ou mais do que, em torno de 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 80, 90, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 ou mais sementes. Em um outro aspecto, a embalagem pode conter aproximada- mente ou mais do que aproximadamente, 1 grama, 5 gramas, 10 gramas, 15 gramas, 20 gramas, 25 gramas, 50 gramas, 100 gramas, 250 gramas, 500 gramas ou 1000 gramas de sementes. Alternativamente, a embalagem po- de conter pelo menos ou mais do que, aproximadamente 0 onça, 0,028 kg (1 onça), 0,142 kg (5 onças), 0,28 kg (10 onças), 0,454 kg (1 libra), 0,907 kg (2 libras), 1,362 kg (3 libras), 1,816 (4 libras), 2,27 kg (5 libras), 4,54 kg (10 libras), 6,8 kg (15 libras), 9,08 kg (20 libras), 11,35 kg (25 libras) ou 50 libras ou mais sementes.

As embalagens de sementes de milho podem ser qualquer em- balagem disponível na técnica. Por exemplo, a embalagem pode ser uma caixa, um saco, uma lata, um pacote, uma bolsa, um rolo de tira, um balde ou um tubo.

Em um outro aspecto, as sementes contidas nas embalagens de sementes de milho podem ser sementes de milho tratadas ou não tratadas. Em um aspecto, as sementes podem ser tratadas para melhorar a germina- ção, por exemplo, por revestimento das sementes ou por desinfecção para protegê-las contra patógenos contidos na semente. Em um outro aspecto, as sementes podem ser revestidas com qualquer revestimento disponível para melhorar, por exemplo, capacidade de ser plantada, a emergência da se- mente e a proteção contra patógenos contidos na semente. O revestimento da semente pode ser qualquer forma de revestimento da semente inclusive, porém não limitado a formação de pelota, revestimento com filme e revesti- mentos em geral.

As plantas ou partes das mesmas da presente invenção também podem ser cultivada em cultura e regenerada. Os métodos para a regenera- ção de plantas de Zea mays de vários tipos de tecido e métodos para a cul- tura de tecido de Zea mays são conhecidos na arte (por exemplo, Bhaskaran e outros. 1990 Crop Sei. 30: 1328-1336). As técnicas de regeneração para plantas tal como de Zea mays podem usar como o material de partida uma variedade de tipos de tecido ou de célula. Com Zea mays em particular, fo- ram desenvolvidos processos de regeneração que começam com certos ti- pos de tecido diferenciado tais como meristemas, (Saíram e outros. 2003 Genome 46: 323-3). Também foi relatada a regeneração de plantas maduras de Zea mays de cultura de tecido por organogênese e embriogênese (Wang 1987 Plant Cell. Rep. 6: 360-362; Chang 1983 Plant Cell. Rep. 2: 18-185; Green e outros. 1975 Crop Sei. 15: 417-421). Recentemente, a regeneração de milho de plantas divididas também foi relatada (Al-Abed e outros. 2006 Planta 223: 1355-1366). A presente invenção também fornece uma planta de milho resis-

tente a doenças selecionada por escolha para resistência a doenças ou sus- cetibilidade em uma planta de milho, a seleção compreendendo interrogar os ácidois nucleícos genômicos para a presença de uma molécula de marcador que está geneticamente ligada a um alelo de um QTL associado com resis- tência a doenças em uma planta de milho, que o alelo de um QTL também está localizado sobre um grupo de ligação associado com o milho resistente a doenças. Um método de introgressão de um alelo em uma planta de milho que compreende (A) cruzamento de pelo menos uma primeira planta de mi- lho que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N0: 66 até SEQ ID N°: 78 com pelo menos uma segunda planta de milho para formar uma população segregante, (B) sele- cionoando a população segregante com um ou mais marcadores de ácido nucléico para determinar se uma ou mais plantas de milho provenientes da população segregante contém a seqüência de ácido nucléico e (C) selecio- nando na população segregante uma ou mais plantas de milho que compre- enda uma seqüência de ácido nucléico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 até SEQ ID N0: 78. A presente invenção também inclui um método de introgressão de um alelo em uma planta de milho que compreende: (A) cruzamento de pelo menos uma planta de milho resistente à mancha cinzenta na folha com pelo menos uma planta de milho sensível á mancha cinzenta na folha para formar uma população segregante; (B) selecionando a população segregan- te com um ou mais marcadores de ácido nucléico para determinar se uma ou mais plantas de milho provenientes da população segregante contém um alelo resistente à mancha cinzenta da folha, que o alelo resistente à mancha cinzenta da folha é um alelo selecionado do grupo que consiste em lócus resistente a GLS 1, lócus resistente a GLS 2, lócus resistente a GLS 3 e ló- cus resistente a GLS 4.

A presente invenção inclui moléculas de ácido nucléico. Tais mo- léculas incluem aquelas moléculas de ácido nucléico capazes de detectar um polimorfismo geneticamente ou fisicamente ligado a um lócus GLS. Tais moléculas podem ser denominadas marcadores. Podem ser obtidos marca- dores adicionais que estejam ligados a lócus de resistência a GLS 1, lócus de resistência a GLS 2, lócus de resistência a GLS 3 ou lócus de resistência a GLS 4 por técnicas disponíveis. Em um aspecto, a molécula de ácido nu- cléico é capaz de detectar a presença ou a ausência de um marcador Iocali- zado a menos de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2 ou 1 centimorgans de um GLS. Em um outro aspecto, um marcador exibe um pontuação de LOD de 2 ou mais, de 3 ou mais ou de 4 ou mais com GLS, medindo-se com a utilização de Qgene Versão 2.23 (1996) e parâmetros predeterminados. Em um outro as- pecto, a molécula de ácido nucléico é capaz de detectar um marcador em um lócus selecionado do grupo de lócus de resistência a GLS 1, lócus de resistência a GLS 2, lócus de resistência a GLS 3 e lócus de resistência a GLS 4. Em um outro aspecto, uma molécula de ácido nucléico é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 até SEQ ID N°: 78, fragmentos das mesmas, complementos das mesmas e moléculas de ácido nucléico capa- zes de se hibridizar especificamente a uma ou mais destas moléculas de ácido nucléico.

Em um aspecto preferido, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção inclui aquelas que irão se hibridizar especificamente a uma ou mais das moléculas de ácido nucléico apresentadas na SEQ ID N0: 1 até a SEQ ID N°: 78 ou complementos das mesmas ou fragmentos de uma delas sob condições moderadamente rigorosas, por exemplo em torno de 2,0 χ SSC e aproximadamente a 65° C. Em um aspecto particularmente pre- ferido, um ácido nucléico da presente invenção irá se hibridizar especifica- mente a uma ou mais das moléculas de ácido nucléico apresentadas na SEQ ID N°: 1 até SEQ ID N0: 78 ou complementos das mesmas ou fragmen- tos de uma delas sob condições altamente rigorosas. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de marcador de ácido nucléico preferida da presente invenção tem a seqüência de ácido nucléico apresentada na SEQ ID N°: 1 até SEQ ID N0: 78 ou complementos das mesmas ou fragmen- tos de uma delas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécu- la de marcador de ácido nucléico preferida da presente invenção compartilha entre 80 % e 100 % ou 90 % e 100 % de identidade de seqüência com a se- qüência de ácido nucléico apresentada na SEQ ID N°: 1 até SEQ ID N°: 78 ou complementos das mesmas ou fragmentos de uma delas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de marcador de ácido nucléico preferida da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência apresentada na SEQ ID N°: 1 até SEQ ID N°: 78 ou complemento ou complementos das mesmas ou fragmentos de uma delas. Em um outro aspecto mais preferido da presente invenção, uma mo- lécula de marcador de ácido nucléico preferida da presente invenção com- partilha entre 98% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência de ácido nucléico apresentada na SEQ ID N0: 1 até SEQ ID N°: 78 ou comple- mentos das mesmas ou fragmentos de uma delas. As moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das mesmas são capazes de se hibridizar especifi- camente a outras moléculas de ácido nucléico sob certas circunstâncias. Como usado neste caso, duas moléculas de ácido nucléico são capazes de se hibridizar especificamente entre si se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico antiparalela, de fita dupla. Uma molécula de ácido nucléico é o "complemento" de uma outra molécula de ácido nucléico se elas exibirem complementaridade. Como usado neste ca- so, as moléculas exibem "complementaridade completa" quando cada nu- cleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da ou- tra. Duas moléculas são "minimalmente complementares" se elas podem se hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas perma- neçam aneladas entre si sob pelo menos condições convencionais de "baixa restrição". Similarmente, as moléculas são "complementares" se elas podem se hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas per- maneçam aneladas entre si sob condições convencionais de "alta restrição". As condições convencionais de restrição são descritas por Sambrook e ou- tros, em: Molécular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova York (1989) e por Haymes e ou- tros., em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Wa- shington, DC (1985). São, portanto, permissíveis, desvios de complementa- ridade completa, desde que tais desvios não impeçam completamente a ca- pacidade de as moléculas formarem uma estrutura de fita dupla. Para que uma molécula de ácido nucléico sirva como um iniciador ou uma sonda esta precisa somente ser suficientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar uma estrutura estável em fita dupla sob as concentrações em particular de solvente e de sal empregadas.

Como usado neste caso, uma seqüência substancialmente ho- móloga é uma seqüência de ácido nucléico que irá especificamente se hibri- dizar ao complemento da seqüência de ácido nucléico à qual ela está sendo comparada sob condições de alta restrição. As sondas e iniciadores de ácido nucléico da presente invenção podem se hibridizar sob condições de restri- ção a uma seqüência de DNA alvo. O termo "condições de hibridização rigo- rosas" é definido como condições sob as quais uma sonda ou um iniciador se hibridiza especificamente com uma sequência(s)-alvo e não com seqüên- cias que não sejam alvo, como pode se determinar empiricamente. O termo "condições rigorosas" é definido funcionalmente em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucléico a um ácido nucléico alvo (isto é, a uma se- qüência de ácido nucléico de interesse em particular) pelo procedimento es- pecífico de hibridização discutido em Sambrook e outros, 1989, a 9.52-9.55. Ver também, Sambrook e outros, 1989 a 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa 1984 Nucl. Acids Res. 12: 203-213 e Wetmur e outros. 1968 J. Mol. Biol. 31: 349-370. As condições de restrição apropriadas que promoven hibridização de DNA são, por exemplo, 6,0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em torno de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 χ SSC a 50°C, são conheci- das dos peritos na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por exem- plo, a concentração na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma bai- xa restrição em torno de 2,0 χ SSC a 50°C até uma alta restrição em torno de 0,2 χ SSC at 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa restrição à temperatura ambiente, em torno de 22°C, até condições de alta restrição em torno de 65°C. Tanto a temperatura como o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concen- tração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é muda- da.

Por exemplo, a hibridização que usa sondas ou iniciadores de DNA ou de RNA pode ser realizada a 65°C em 6 χ SSC, 0,5% de SDS, 5 χ Denhardfs, 100 μg/mL de DNA não específico (por exemplo, DNA de es- perma de salmão tratado com ondas sonoras) com lavagem a 0,5 χ SSC, 0,5% SDS a 65°C, para alta restrição.

É considerado que condições de menor restrição, tais como mais baixas temperaturas de hibridização e/ou de lavagem, podem ser usa- das para identificar seqüências relacionadas que tenham um mais baixo grau de similaridade de seqüência se a especificidade de ligação da sonda ou do iniciador à(s) sequência(s)-alvo for preservada. Consequentemente, as seqüências de nucleotídeo da presente invenção podem ser usadas por sua capacidade de formar seletivamente moléculas duplex com esticamen- tos complementares de fragmentos de DNA, de RNA ou de cDNA. Um fragmento de uma molécula de ácido nucléico pode ser

qualquer fragmento dimensionado e fragmentos ilustrativos incluem frag- mentos de seqüência de ácido nucléicos apresentados na SEQ ID N°: 1 até SEQ ID Ν°: 78 e complementos das mesmas. Em um aspecto, um fragmento pode estar entre 15 e 25, 15 e 30, 15 e 40, 15 e 50, 15 e 100, 20 e 25, 20 e 30, 20 e 40, 20 e 50, 20 e 100, 25 e 30, 25 e 40, 25 e 50, 25 e 100, 30 e 40, e 50, e 30 e 100. Em um outro aspecto, o fragmento pode ser maior do que 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100 ou 250 nucleotídeos.

Os marcadores genéticos adicionais podem ser usados para se- lecionar plantas com um alelo de um QTL associado à resistência à doença de milho provocada por fungos da presente invenção. Exemplos de bancos de dados públicos de marcador incluem, por exemplo: Maize Genome Data- base, Agricultural Research Service, United States Department of Agricultu- re.

Os marcadores genétidos da presente invenção incluem marca- dores "dominantes" ou "codominantes". "Os marcadores codominantes" re- velam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diplóide). Os "marcadores dominantes" revelam a presença de apenas um único alelo. A presença do fenótipo marcador dominante (por exemplo, uma faixa de DNA) é uma indicação de que um alelo está presente na condição homozigótica ou heterozigótica. A ausência do fenótipo marcador dominante (por exemplo, a ausência de uma faixa de DNA) é simplesmente uma prova de que "algum outro" alelo não definido está presente. No caso de populações que os indi- víduos são predominantemente homozigóticos e os Ioci são predominante- mente marcadores dimórificos, dominantes e codominantes podem ser i- gualmente valiosos. As populações se tornam mais heterozigóticas e multia- lélicas, os marcadores codominantes muitas vezes se tornam mais informa- tivos do genótipo do que os marcadores dominantes.

Os marcadores, tais como os marcadores de repetição de se- qüência simples (SSR), marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marca- dores de RAPD, marcadores fenotípicos, SNPs, marcadores de isozima, per- fis de transcrição de microssistema que estejam geneticamente ligados a ou correlacionados com alelos de um QTL da presente invenção podem ser utilizados (Walton, 1993; Burow e outros. 1988). Os métodos para isolar tais marcadores são conhecidos na técnica. A detecção dos sítios polimórficos em uma amostra de DNA, de RNA ou de cDNA pode ser facilitada pelo uso de métodos de amplificação de ácido nucléico. Tais métodos especificamente aumentam a concentração de polinucleotídeos que abrangem o sítio polimórfico ou incluem aquele sítio e as seqüências localizadas distantes ou próximas ao mesmo. Tais molécu- las amplificadas podem ser facilmente detectadas por eletroforese em gel, por método de detecção com fluorescência ou por outros meios.

Um processo de se conseguir tal amplificação emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis e outros. 1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 : 263-273; Patente Européia 50.424; Patente Européia 84.796; Patente Européia 258.017; Patente Européia 237.362; Patente Eu- ropéia 201.184; Patente U.S. 4.683.202; Patente U.S. 4.582.788; e Patente U.S. 4.683.194), usando pares de iniciadores que sejam capazes de se hi- bridizar às seqüências próximas que definem um polimorfismo em sua forma de fita dupla.

Com a finalidade de mapeamento de QTL, os marcadores inclu- ídos deviam ser de origem diagnostica para que sejam feitas deduções a respeito de populações subsequentes. Os marcadores SNP são ideais para mapeamento porque a probabilidade de que um alelo de SNP, em particular, seja derivado de origens independentes nas populações existentes de uma espécie em particular é muito baixa. Como tal, os marcadores de SNP são úteis para rastrear e auxiliar a introgressão de QTLs, particularmente no ca- so de haplótipos.

A ligação genética de moléculas de marcador adicional pode ser estabelecida por um modelo de mapeamento de gene tal como, sem limita- ção, o modelo de marcador de flanqueamento relatado por Lander e outros. (Lander e outros. 1989 Genetics, 121 : 185-199) e o mapeamento do interva- lo, baseado nos métodos de probabilidade máxima ali descritos e implemen- tados no programa de computador MAPMAKER/QTL (Lincoln e Lander, Mapping Genes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL, Whi- tehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990). Um pro- grama de computador adicional inclui Qgene, Version 2.23 (1996), Depart- ment of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, lthaca, NY). O uso do programa de computador Qgene é uma abordagem particularmente preferida.

Uma estimativa de probabilidade máxima para a presença de um marcador é calculada, juntamente com um MLE supondo-se nenhum efeito QTL1 para evitar falsos resultados positivos. A Iogio de uma proporção de razões de chances (LOD) é então calculado como: LOD = Iogi0 (MLE para a presença de QTL/MLE dado nenhum QTL ligado). O pontuação de LOD in- dica essencialmente qual a probabilidade de os dados terem surgido supon- do a presença de um QTL versus em sua ausência. O valor limite de LOD para evitar um resultado falso positivo com uma dada segurança, digamos de 95%, depende do número de marcadores e do comprimento do genoma. Gráficos que indicam limites de LOD são apresentados em Lander e outros. (1989) e também descritos por Arús e Moreno-Gonzalez, Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa (eds.) Chapman & Hall, Londres, pp. 314- 331 (1993).

Podem ser usados modelos adicionais. Foram relatadas muitas modificações e abordagens alternativas ao mapeamento do intervalo, inclu- sive o uso de métodos não paramétricos (Kruglyak e outros, 1995 Genetics, 139: 1421-1428). Também podem ser usados múltiplos métodos ou modelos de regressão, em que a característica sofre regressão em um grande núme- ro de marcadores (Jansen, Biometrics in Plant Breed, van Oijen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Holanda, pp. 116-124 (1994); Weber e Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlim, 16 (1994)). Os procedimentos que combi- nam o mapeamento do intervalo com análise de regressão, que o fenótipo é regredido sobre um único QTL putativo a um dado interval de marcador e ao mesmo tempo sobre um número de marcadores que servem como "cofato- res" foram relatados por Jansen e outros. (Jansen e outros. 1994 Genetics, 136: 1447-1455) e Zeng (Zeng 1994 Genetics 136: 1457-1468). Geralmente, o uso de cofatores reduz a inclinação e o erro de amostragem das posições de QTL estimadas (Utz e Melchinger, Biometrics in Plant Breeding, van Oi- jen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Seetion Biometries in Plant Breeding1 Holanda, pp. 195-204 (1994), melhorando des- se modo a precisão e a eficiência do mapeamento de QTL (Zeng 1994). Es- tes modelos podem ser estendidos a experimentos de multi-ambiente para analisar as interações de genótipo-ambiente (Jansen e outros. 1995 Theor. Appl. Genet. 91 : 33-3).

A seleção de mapeamento apropriado de populações é impor- tante para mapear a construção. A escolha de um mapeamento apropriado de população depende do tipo de sistemas marcadores empregados (Tanks- Iey e outros., Molecular mapping in plant chromosomes, chromosome struc- ture and function: Impact of new concepts J.P. Gustafson and R. Appels (eds ). Plenum Press, Nova York, pp. 157-173 (1988)). Deve ser dada consi- deração à fonte de parentais (adaptados vs. exóticos) usados no mapea- mento da população. O emparelhamento de cromossomo e as taxas de re- combinação podem ser gravemente perturbados (suprimidos) em cruzamen- tos amplos (adaptados vs. exóticos) geralmente fornece distâncias de liga- ção bastante reduzidas. Cruzamentos amplos irão habitualmente fornecer populações segregantes com um sistema relativamente grande de polimor- fismos quando comparado a progênie em um cruzamento limitado (adaptado χ adaptado).

Uma população F2 é a primeira geração de autocruzamentos depois de produzida a semente híbrida. Usualmente uma planta simples Fi é autocruzada para gerar uma população segregante para todos de maneira Mendeliana (1 : 2: 1). É obtida informação máxima genética de uma popula- ção classificada F2 que usa um sistema marcador codominante (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen and Co., (1938)). No caso de marcadores dominantes, são necessários testes de progênie (por exemplo, com F3, BCF2) para identificar os heterozigotos, tornando assim equivalente a uma população F2 completamente classificada. No entanto, este procedi- mento é muitas vezes proibitivo por causa do custo e do tempo envolvido na testagem da progênie. A testagem da progênie dos indivíduos F2 é freqüen- temente usada na construção de mapas em que os fenótipos não refletem coerentemente o genótipo (por exemplo, de resistência a doenças) ou em que a expressão das características é controlada por um QTL. Os dados de segregação da progênie das populações do teste (por exemplo, com F3 ou BCF2) podem ser usados na contrução do mapa. A seleção auxiliada pelo marcador pode então ser aplicada para cruzar a progênie baseada nas as- sociações de mapa de marcador-característica (F2, F3), qme que os grupos de ligação não foram completamente desassociados por eventos de recom- binação (isto é, desequilíbrio máximo).

As linhagens intracruzadas recombinantes (RIL) (linhagens ge- neticamente relacionadas; usualmente >F5, desenvolvidas partindo de linha- gens F2 de autocruzamento contínuo em direção à homozigosidade) podem ser usadas como uma população para mapeamento. A informação obtida de marcadores dominantes pode ser maximizada por utilização de RIL porque todos os Ioci são homozigóticos ou quase. Sob condições de ligação reígida (isto é, em torno de < 10% de recombinação), os marcadores dominantes e codominantes avaliados em populações de RIL fornecem mais informação por indivícuo do que algum tipo de marcador em populações de retrocruza- mento (Reiter e outros, 1992 Proc. Natl. Acad. Sei.(USA) 89: 1477-1481). Entretanto, como a distância entre os marcadores se tornam maiores (isto é, os Ioei se tornam mais independentes), a informação em populações RIL diminui drasticamente.

As populações de retrocruzamento (por exemplo, geradas de um cruzamento entre uma variedade bem sucedida (parente recorrente) e uma outra variedade (parente doador) que contém uma característica que não está presente no primeiro) pode utilizado como uma população para mape- amento.

Uma série de retrocruzamentos ao parente recorrente pode ser feita para recuperar a maioria de suas características desejáveis. Assim é criada uma população que consiste em indivíduos quase como o parente recorrente porém cada indivíduo contém quantidades variáveis de regiões mosáicas genômicas do parente doador. Populações de retrocruzamento podem ser úteis para mapeamento de marcadores dominantes se todos os Ioci no parente recorrente foram homozigóticos e o parente doador e recor- rente têm alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter e outros, 1992). A informação obtida pelos marcadores codominantes ou dominantes das populações de retrocruzamentos é menor do que aquela obtida pelas populações F2 porque um, em vez de dois, gametas recombinantes são mostrados por planta. As populações de retrocruzamento, no entanto, são mais informativas (a baixa saturação de marcador) quando comparadas a RILs pois a distância entre os Ioci ligados aumenta nas populações RIL (isto é, em torno de 15 % de recombinação). Uma maior recombinação pode ser vantajosa para resolução de

ligações rígidas, porém pode ser indesejáveis na construção de mapas com baixa saturação de marcador.

As linhagens quase isogênicas (NIL) criadas por muitos retrocru- zamentos para produzir um sistema de indivíduos que são quase idênticos em composição genética excesso pelo traço ou região genômica sob inter- rogação podem ser usadas como uma população para mapeamento. No mapeamento com NILs, é de se esperar apenas uma parate dos Ioci poli- mórficos para mapear uma região selecionada.

A análise de segregantes em grupos (BSA) é um método desen- volvido para a rápida identificação de ligação entre marcadores e traços de interesse (Michelmore e outros. 1991 Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 88: 9828-9832). Na BSA1 duas amostras volumosas de DNA são retiradas de uma população segregante que se origina de um único cruzamento. Estes grupos contêm indivíduos que são idênticos para uma característica em par- ticular (resistente ou suscetível a uma doença em particular) ou região ge- nômica porém arbitrária em regiões não-ligadas (isto é, heterozigóticas). As regiões não-ligadas à região-alvo não irão diferir entre as amostras agrupa- das volumosas de muitos indivíduos em BSA.

As plantas da presente invenção podem fazer parte de ou serem geradas de um programa de reprodução. A escolha do método de reprodu- ção depende do modo de reprodução da planta, da passagem por herança da (s) característica (s) que estão sendo melhoradas e do tipo de cultivar usado comercialmente (por exemplo, cultivar F1 híbrido, cultivar de linhagem pura etc). Um cultivar é uma raça ou uma variedade de uma espécie de planta que foi criada ou selecionada intencionalmente e mantida em um cul- tivo.

Abordagens selecionadas, não-limitativas (reprodução ou cru- zamento, dependendo do caso) para reprodução das plantas da presente invenção são apresentadas a seguir. Um programa de reprodução pode ser melhorado usando-se seleção auxiliada por marcador (MAS) na progênie de qualquer cruzamento. É entendido que marcadores de ácido nucléico da presente invenção podem ser usados em um programa (de reprodução) MAS. Também é entendido que quaisquer cultivares comerciais e não co- merciais podem ser utilizados em um programa de reprodução. Fatores tais como, por exemplo, vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância ao es- tresse, resistência a doenças, formação de galhos, floração, formação da semente, tamanho da semente, densidade da semente, capacidade de ficar em pé e capacidade de ser debulhado etc. geralmente irão ditar a escolha.

Para características que podem ser favoravelmente herdadas, uma escolha de plantas individuais superiores avaliadas a uma única loca- ção será eficaz, ao passo que para características com pouca chance de herança, a seleção devia ser baseada em valores médios obtidos de avalia- ções replicadas de famílias de plantas relacionadas. Métodos populares de seleção comumente incluem seleção de pedigree, seleção de pedigree mo- dificado, seleção de massa e seleção recorrente. Em um aspecto preferido, é empregado um programa de retrocruzamento ou de cruzamento recorren- te.

A complexidade de herança influencia a escolha do método de reprodução. Uma reprodução por retrocruzamento pode ser usada para transferir um ou alguns genes favoráveis para uma característica que pode ser favoravelmente herdada em um cultivar desejável. Esta abordagem tem sido usada extensivamente para a reprodução de cultivares resistentes a doenças. Várias técnicas de seleção recorrentes são usadas para melhorar quantitativamente as características controladas por numerosos genes. As linhagens de reprodução podem ser testadas e comparadas a padrões apropriados em ambientes representativos da (s) área (s) comer- cial (ais) alvo por duas ou mais gerações. As melhores linhagens são candi- datas para novos cultivares comerciais; aquelas ainda deficientes em carac- terísticas podem ser usadas como parentes para produzir novas populações para uma seleção posterior.

O desenvolvimento de novos híbridos de milho de elite requer o desenvolvimento e a seleção de linhagens de progênie de elite, o cruzamen- to destas linhagens e a seleção dos cruzamentos de híbrido superior. A se- mente do híbrido pode ser produzida por cruzamentos manuais entre paren- tais do sexo masculino férteis selecionados ou por utilização de sistemas de esterilidade masculina. Os dados adicionais sobre linhagens parentais, as- sim como o fenótipo do híbrido, influenciam a decisão do agricultor etc. se irá continuar com o cruzamento específico do híbrido. Métodos de cruzamento de pedigrees e de cruzamento com se-

leção recorrente podem ser usados para desenvolver cultivares partindo de reprodução de populações. Os programas de cruzamento combinam as ca- racterísticas desejáveis de dois ou mais cultivares ou de várias fontes de base ampla em grupos de cruzamento das quais são desenvolvidos cultiva- res por autocruzamento e seleção dos fenótipos desejados. Novos cultivares podem ser avaliados para determinar quais possuem potencial comercial.

O retrocruzamento tem sido usado para transferir genes de uma característica que pode ser herdada favoravelmente com herança simples para um cultivar homozigoto desejável ou uma linhagem intracruzada, que é o parental recorrente. A origem da característica que será transferida é de- nominada parental doador. Depois do cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do parental doador são selecionados e cruzados repeti- damente (retrocruzados) como parental recorrente. Espera-se que a planta resultante tenha a maior parte dos atributos do parental recorrente (por e- xemplo, cultivar) e, além disso, a característica desejável transferida do pa- rental doador.

O procedimento de herança de uma única semente no sentido restrito refere-se ao plantio de uma população segregante, colheita de uma amostra de uma semente por planta e utilização de uma amostra de semen- te para plantar a próxima geração. Quando a população foi adiantada do F2 para o nível desejado de intracruzamento, as plantas das quais são deriva- das as linhagens irão cada uma seguir diferentes indivíduos F2. O número de plantas em uma população diminui a cada geração em virtude da falha da germinação de algumas sementes ou de algumas plantas em produzir pelo menos uma semente. Como resultado, nem todas as plantas F2 originalmen- te mostradas na população serão representadas por uma progênie quando o avanço de geração for completado.

As descrições de outros métodos de reprodução que são usados comumente para diferentes características e plantas de cultivo podem ser encontradas em um ou em diversos livros de referência (Allard, "Principies of Plant Breeding," John Wiley & Sons, NY1 U. da CA1 Davis, CA, 50-98, 1960; Simmonds, "Principies of crop improvement," Longman, Inc., NY, 369-399, 1979; Sneep and Hendriksen, "Plant breeding perspectives," Wageningen (ed), CenterforAgricuIturaI Publishing and Documentation, 1979; Fehr, Em: Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a. Edição, Manograph., 16: 249, 1987; Fehr, "Principies of variety development," Theory and Technique, (Vol. 1) e Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376, 1987).

Uma alternativa a mapeamento tradicional de QTL envolve con- seguir maior resolução por mapeamento de haplótipos, versus marcadores individuais (Fan e outros. 2006 Genetics 172: 663-686). Esta abordagem rastreia blocos de DNA conhecidos como haplótipos, como definido por mar- cadores polimórficos, que se supõe sejam idênticos por descendência na população de mapeamento. Esta suposição resulta em um maior tamanho eficaz da amostra, que oferece maior resolução de QTL. Os métodos para determinar o significado estatístico de uma correlação entre um fenótipo e um genótipo, neste caso um haplótipo, podem ser determinados por qual- quer teste estatístico conhecido na arte e com qualquer limite aceito de signi- ficado estatístico sendo necessário. A aplicação de métodos e de limites sig- nificativos em particular se encontram bem na habilidade da pessoa perita na técnica.

Ainda é entendido, que a presente invenção fornece células bac- terianas, virais, microbianas, de insetos, de mamíferos e de planta que com- preendem as moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

Como usado neste caso, uma "molécula de ácido nucléico," seja ela uma molécula que ocorre naturalmente ou então que possa ser "subs- tancialmente purificada", se desejado, referindo-se a uma molécula separa- da de substancialmente todas as outras moléculas normalmente associadas com a mesma em seu estado nativo. Mais preferivelmente, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente na prepara- ção. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais do que 60% livre, de preferência 75% livre, mais preferivelmente 90% livre e mais preferi- velmente ainda 95% livre das outras moléculas (sem incluir o solvente) pre- sentes na mistura natural. O termo "substancialmente purificada" não pre- tende abranger moléculas presentes em seu estado nativo.

Os agentes da presente invenção serão de preferência "biologi- camente ativos" em relação a um atributo estrutural, tal como a capacidade de um ácido nucléico se hibridizar a uma outra molécula de ácido nucléico ou a capacidade de uma proteína estar ligada por um anticorpo (ou competir com uma outra molécula para tal ligação). Alternativamente, um tal atributo pode ser catalítico e assim envolver a capacidade de o agente mediar uma reação ou uma resposta química.

Os agentes da presente invenção também podem ser recombi- nantes. Como usado neste caso, o termo recombinante significa qualquer agente (por exemplo, DNA, peptídeo etc.), que seja ou resulte, entretanto indiretamente, de manipulação humana de uma molécula de ácido nucléico. Os agentes da presente invenção podem ser marcados com reagentes que facilitem a detecção do agente (por exemplo, marcas fluorescentes (Sondar e outros 1987 Science 238: 336-340; Albarella e outros, Patente Européia 144914), marcações químicas (Sheldon e outros, Patente U.S. 4.582.789; Albarella e outros, Patente U.S. 4.563.417), bases modificadas (Miyoshi e outros, Patente Européia 119448). Tendo agora descrito a invenção de ma- neira geral, a msma será mais facilmente entendida com referência aos e- xemplos a seguir que são fornecidos para fins de ilustração e não pretendem ser Iimitativos da presente invenção, a não ser se especificado.

Exemplos

Exemplo 1: estudos de mapeamento de GLS

Para mapear QTL putativo a GLS, uma linhagem resistente (SH4802; Número de Depósito pelo Tratado de Budapestes a PTA-8007) é cruzada com uma linhagem suscetível Iine (32843; Número de Depósito pelo Tratado de Budapeste PTA-8006). Para mapeamento, o fenótipo de resis- tência a GLS (Tabela 1) é avaliado em 4 ambientes: Irai de Minas-MG (Mi- nas Gerais, altitude: 951 m; 19°00'S e 47°05'W), que os dados são coletados nas duas estações diferentes de plantação no Brasil: plantação em outubro (safra) e plantação em março (safrinha) e em Montividiu-GO (altitude: 821 m; 17°04'S e 51°02'W) e em Jatai-GO (Goiás, altitude: 708 m; 17°52'S e 51°42'W) apenas para plantação em outubro (safra) em ambas as localiza- ções.

Tabela 1: descrição da escala de clasificação usada para fenoti-

pagem de GLS. ILA = área da folha infectada.

Classificação Sintomas Muito Resistente 1 0% da área da folha infectada, sem lesões visíveis Muito Resistente 2 ILA < 1%, algumas lesões, dispersas através das folhas inferiores Resistente 3 1% < ILA < 20%, Resistente 4 20% < ILA < 40% Medianamente Resistente 5 40% < ILA < 50%; lesões atingindo a folha da espiga, com lesões esparsas nas folhas acima da espiga Medianamente Suscetível 6 50% < ILA < 60%; lesões atingindo as folhas acima da espiga Suscetível 7 60% < ILA < 75% Suscetível 8 75% < ILA < 90% Suscetível 9 > 90% da área da folha infectada, com morte pre- matura da planta antes da formação a camada negra

Estes experimentos são plantados durante dois anos: em 2000

(safra) e 2001 (safrinha). Os lotes têm 2 fileiras de 5 metros de comprimento com 0,7 m entre as fileiras. A resistência à doença é avalida visualmente 90- 95 dias depois da plantação. A infecção em todos os experimentos é natural, em inoculação artificial.

Além da fenotipagem descrita acima, cada população é genoti- pada com uma combinação de 126 SNP polimórfico e marcadores SSR. As associações entre o genótipo de marcador SNP e o fenótipo de resistência a GLS (ESCORE 1-9) são avaliados e são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Validação de Ioci de resistência a GLS que usa linha- gens isogênicas próximas (NIL) de milho. O efeito em NIL é relatado como a

diminuição na classificação da doença, baseado na escala 1 - 9 na Tabela 1.

N°. do Variação Efeitos

Lócus Cromossomo Posição_Marcador_Explicada em NIL

1 1 61,5 Q-NC0018320 7,80% -2,9 1 1 66,3 Q-NC0105022 2 1 123,3 Q-NC0109328 2 1 133,9 Q-NC0016724 10,60% -2 2 1 164,2 Q-NC0031264 3 3 54,1 Q-NC0021154 3 3 64 Q-NC0022590 27,10% -1,2 3 3 99,7 Q-NC0071496 4 7 118,6 Q-NC0081460 4 7 124,5 Q-NC0015184 7,80% N/A

A Tabela 3 relaciona um conjunto de marcadores para diagnósti-

co para Ioci de resistência a GLS 1 a 4. Foi descoberto que os marcadores SNP que estão em grande desequilíbrio de ligação com o lócus de resistên- cia a GLS 1 são NCOO 18320 e NCO 105022, indicados como SEQ ID N°: 1 a 2 (Tabela 3). Foi descoberto que os marcadores SNP que estão em gran- de desequilíbrio de ligação com o lócus de resistência a GLS 2 são NCO 109328, NCOO 16724 e NC0031264, indicados como SEQ ID N°: 3 a 5 (Ta- bela 3). Foi descoberto que os marcadores SNP que estão em grande dese- quilíbrio de ligação com o lócus de resistência a GLS 3 são NC0021 154, NC0022590, NC0106769, NC0105291, NC0143268 e NC0071496, indicados como SEQ ID N°: 6 a 11 (Tabela 3). Foi descoberto que os marcadores SNP que estão em grande desequilíbrio de ligação com o lócus de resistência a GLS 4 são NC0081460 e NC0015184, indicados como SEQ ID N°: 12 a 13 (Tabela 3).

Além disso, a Tabela 3 relaciona seqüências para todos os inici- adores de amplificação de PCR1 indicados como SEQ ID N°: 14 a 39 e as sondas, indicadas como SEQ ID N°: 40 a 65, correspondentes a estes mar- cadores SNP1 assim como o alelo resistente e suscetível para cada um dos marcadores bi-alélicos descritos acima. Cada molécula de marcador contém um SNP que pode ser amplificado usandoo-se o par de iniciadores indicados e detectados usando-se o par de sondas correspondentes (Tabela 3). Além disso, os alelos resistentes e suscetíveis para cada marcador estão desig- nados na Tabela 3.

Todos os ensaios de TaqMan® com ponto final são fabricados pelo AB Biosystem. Os reagentes usados para validação do ensaio e genoti- pagem são adquiridos da AB Biosystem. A amplificação pela PCR e a busca pelo alelo foram feitas de acordo com a instrução da AB Biosystem. COI-^OOOTOT-CSJOO^-iocoi^OO

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Os resultados fornecem as estimativas para bO, bl e a estatística F para cada marcador. A eventualidade de um marcador estar ligado a um QTL é determinada pela avaliação se o bl é significativamente diferente de zero. O F estatístico compara a hipótese de HO: bl = O para uma alternativa Hl : bl diferente de 0. pr(F) é uma medida de quanto suporte há para HO. Um menor pr(F) indica menos suporte para HO e assim mais suporte para Hl. O significado nos níveis de 5 %, 1 %, 0,1 % e 0,01 % estão indicados por *, **, *** e ****, respectivamente. Adicionalmente os valores de LOD também são apresentados na Tabela 5. CΛ

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Claims (39)

1. Processo de introgressão de um alelo em uma planta de milho, caracterizado pelo fato de que compreende (A) cruzamento de pelo menos uma primeira planta de milho que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78 com pelo menos uma segunda planta de milho para formar uma população segregante, (B) separação da dita população segregante com um ou mais marcadores de ácido nucléico para determinar se uma ou mais plantas de milho da dita população segregante contém a dita seqüência de ácido nucléico, e (C) seleção da dita população segregante com uma ou mais plantas de milho que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N0: 66 a SEQ ID N°: 78.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais plantas de milho selecionadas também compreendem uma segunda seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais plantas de milho selecionadas também compreendem uma terceira seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais plantas de milho selecionadas também compreendem uma quarta seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais plantas de milho selecionadas também compreende uma quinta seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas plantas de milho selecionadas exibem pelo menos resistência parcial a um fungo que induz a mancha cinzenta da folha.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas plantas de milho selecionadas exibem pelo menos resistência substancial a um fungo que induz a mancha cinzenta da folha.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito fungo que induz a mancha cinzenta da folha é selecionado do grupo que consiste em C. zeea-maydis cepa do Tipo I e do Tipo II.

9. Processo de introgressão de um alelo em uma planta de milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (A) cruzamento de pelo menos uma planta de milho resistente à mancha cinzenta na folha com pelo menos uma planta de milho sensível à mancha cinzenta na folha para formar uma população segregante; (B) separação da dita população segregante com um ou mais marcadores de ácido nucléico para determinar se uma ou mais plantas de milho da dita população segregante contém um alelo resistente à mancha cinza na folha, em que o alelo resistente à mancha cinza na folha é um alelo selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3 ou 4 Ioci resistentes a GLS que um ou mais alelos em um ou mais de seus Ioci são selecionados do grupo que consiste em alelo resistente à GLS 1, alelo resistente à GLS 2, alelo resistente à GLS 3, alelo resistente à GLS 4, alelo resistente à GLS 5, alelo resistente à GLS 5, alelo resistente à GLS 6, alelo resistente à GLS 7, alelo resistente à GLS 8, alelo de resistência à GLS 9, alelo de resistência à GLS 10, alelo de resistência à GLS 11, alelo de resistência à GLS 12, alelo de resistência à GLS 13.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores estão localizado dentro de 10 cm do dito alelo resistente.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores estão localizado dentro de 5 cm do dito alelo resistente.

12. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores estão localizado dentro de 2 cm do dito alelo resistente.

13. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores está localizado dentro de 1 cm do dito alelo resistente.

14. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores exibem uma pontuação de LOD maior do que 2,0 com uma resistência à mancha cinzenta da folha.

15. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores exibem uma pontuação de LOD maior do que 2,5 com uma resistência à mancha cinzenta da folha.

16. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores exibem uma pontuação de LOD maior do que 3,0 com uma resistência à mancha cinzenta da folha.

17. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos um ou mais marcadores exibem uma pontuação de LOD maior do que 4,0 com uma resistência à mancha cinzenta da folha.

18. Planta de milho de elite, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste da SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

19. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite exibe uma característica transgênica.

20. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a dita característica transgênica é selecionada do grupo que consiste em tolerância a herbicida e resistência a pragas.

21. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a dita tolerância a herbicida é selecionada do grupo que consiste em herbicidas glifosato, dicamba, glufosinato, sulfoniluréia, bromoxinil e norflurazon.

22.Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência de ácido nucléico está presente como uma única cópia na dita planta de milho de elite.

23.Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência de ácido nucléico está presente em duas cópias na dita planta de milho de elite.

24. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite também compreende uma segunda seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

25. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite também compreende uma terceira seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

26. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite também compreende uma quarta seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

27. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite também compreende uma quinta seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 66 a SEQ ID N°: 78.

28. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite exibe pelo menos uma resistência parcial a um fungo que induz à mancha cinzenta da folha.

29. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita planta de milho de elite exibe pelo menos resistência substancial a um fungo que induz à mancha cinzenta da folha.

30. Planta de milho de elite de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o dito fungo que induz à mancha cinzenta da folha é selecionado do grupo que consiste C. zeea-maydis cepa do Tipo I e do Tipo II.

31. Molécula de ácido nucléico substancialmente purificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste da SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 78 e complementos das mesmas.

32. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende um lócus resistente a GLS 1.

33. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende um lócus resistente a GLS 4.

34. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende Ioci resistentes a GLS 2 e 1.

35. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende Ioci resistentes a GLS 3 e 1.

36. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende Ioci resistentes a GLS 4 e 2.

37. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende Ioci resistentes a GLS 3 e 4.

38. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende Ioei resistentes a GLS 1 e 4.

39. Planta de milho, caracterizada pelo fato de que compreende um lócus resistente a GLS 1 ou 4.