CN105705005B - 大斑病长蠕孢抗性植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了改良的大斑病长蠕孢抗性植物，特别是包含具有一个或多个抗性赋予基因(例如在来自Pepitilla种质的截短的染色体片段上)的多核苷酸的玉米植物，以及其细胞、组织、部分、谷粒和种子，包含一个或多个针对大斑病长蠕孢的抗性赋予基因的分离的多核苷酸，含有此多核苷酸的载体、转基因植物细胞和转基因植物。另外，本发明涵盖了适宜的标记以及其用于将抗性基因座或者转基因引入植物中的用途，以及涵盖了对包含截短的染色体片段的经改良玉米植物的鉴别。

Description

大斑病长蠕孢抗性植物
发明领域
本发明涉及使用分子生物学方法和标记技术、与遗传工程一起进行植物改造的领域。本发明涉及新型的大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum)抗性植物，特别是包含具有一个或多个抗性赋予基因(在来自种质Pepitilla的修饰的染色体片段上)的多核苷酸的玉米植物，以及其细胞、组织、部分、谷粒和种子，包含一个或多个针对大斑病长蠕孢的抗性赋予基因的分离的多核苷酸，含有此多核苷酸的载体、转基因植物细胞和转基因植物。本发明还涵盖了适宜的分子标记以及其用于将抗性基因座或者转基因引入植物中的用途，以及涵盖了对包含修饰的染色体片段的经改良玉米植物的鉴别。
发明背景
在玉米(Zea mays L.)中，有大量引起叶疾病的真菌病原体。目前能够在热带和温带气候条件下(如欧洲和北美的大部分以及非洲和印度)引起最多破坏的真菌，已知为大斑病长蠕孢或者也称作玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum(Pass.))Leonard和Suggs(有性型:Setosphaeria turcica(Luttrell)Leonard&Suggs)。大斑病长蠕孢(H.turcicum)是引起已知为“玉米大斑病”(NCLB)的叶斑病的起因，其在潮湿年份可以流行病的比例发生，攻击易受感染的玉米玉米品种并引起大量的破坏和30％的产量的可观损失以及同时影响更大的区域(Perkins&Pedersen,1987；Raymundo&Hooker,1981a；Ullstrup&Miles,1957)。继而从1970年代起，就已经在遗传材料中寻找天然的抗性。目前，已知有数量(quantitative)和质量(qualitative)抗性。寡基因或多基因数量抗性在表现型方面显得不完全并且对于小种没有特异性以及会受到额外的和部分显性的基因影响，而质量抗性通常是小种特异性的并且可以通过个体的、大多为显性的基因来遗传，如Ht1、Ht2、Ht3、Htm1或Htn1(Lipps et al.,1997；Welz&Geiger,2000)。在许多频繁使用的近交玉米品系如W22、A619、B37或B73中的回交(backcross)已经成功地实现了HT基因的渐渗(introgression)，其中它们呈现出部分显性和作为各自遗传背景的函数的表达(Welz,1998)。
虽然在玉米中对NCLB抗性有此种复杂的遗传结构，但是目前原则上在玉米中使用Ht1基因结合部分数量抗性已经足以控制长蠕孢疾病(helminthrosporiosis)(Welz,1998)。其基础在于，从全球来看，大斑病长蠕孢的小种0在使用方面占据优势(大约55％)(Lipps等,1997；Ferguson&Carson,2007)，而其它的小种如2N和23N仅仅在很少的情况下使用并且即时使用也是在地理上有限的区域(Moghaddam&Pataky,1994；Jordan等,1983；Lipps&Hite,1982；Thakur等,1989；Welz,1998)。此小种0对于具有Ht1的玉米植物而言是无毒性的，因而当具有适宜的数量抗性时，其呈现出对NCLB的足够的一般抗性。然而，许多研究已经报道了不太常见小种日益增加的散播(Jordan等,1983；Welz,1998；Pratt&Gordon,2006)。其原因与病原体的种群动态相关，种群动态使得病原体毒性可以通过无毒性基因的新突变以及可用毒性基因的新组合来发生变化。最终，这可以导致发生新的、适宜的、有时更有侵略性的病原体小种。例如在巴西，大斑病长蠕孢种群已经表现出在小种组成方面比起例如北美来说实质上更加多样化。Gianasi等(1996)报道了已经突破Ht1基因赋予的抗性的大斑病长蠕孢小种。另外，抗性基因对某些环境因素有不稳定性，如在一些气候区域的温度和光强度(Thakur等,1989)。这一进展的后果在于，全球来看，使用新型的HT抗性基因或者目前很少关注的基因用于商业玉米植物的生产在重要性上正在日益增加，以便在玉米中引导出针对大斑病长蠕孢的更广谱的且更长效的抗性。Pataky等早在1998年就在此方面尝试了最初的方法。通过使用Ht1和Htn1的组合在sh2良种玉米中改善了NCLB抗性。
单基因Htn1抗性的来源是墨西哥地方品种“Pepitilla”(Gevers,1975)。Htn1渐渗品系呈现定位在染色体8的长臂上距离Ht2大约10cM以及距离RFLP标记umc117(bin 8.06)大约8cM(Simcox&Bennetzen,1993)的基因。与通常的HT抗性基因相反，Htn1通过延缓孢子形成的发生而赋予抗性，并由此防止病斑的发展。结果，形成的病斑较少且较小以及孢子形成区域减少(Raymundo等,1981b,Simcox&Bennetzen,1993)。没有形成褪绿坏死病斑，如具有Ht1、Ht2或Ht3赋予的抗性所发生的那些(Gevers,1975)。然而，Htn1基因杂合状态下的抗性反应比纯合状态的有效性显著更低(Raymundo等,1981b)。
开发能够简化基因型测定的另外的特异性标记会改善Htn1基因的育种可控性。标记辅助筛选(MAS)技术因而使得若干抗性基因的有效堆叠或聚合成为可能(Min等,2012)。在许多研究中，使用了渐渗品系B37Htn1或W22Htn1来对抗性基因座进行定位以及鉴别抗性的来源(Raymundo等,1981a,b；Simcox&Bennetzen,1993,Bar-Zur等,1998；Coates&White,1998)。然而，可用于从Pepitilla种质筛选Htn1的抗性基因座的标记的有效信息依然很有限(Simsox&Bennetzen,1993)。在来自Pepitilla种质的抗性基因座旁侧并且对其有功用的针对Htn1的已知标记依然只定位在接近22.2cM的距离，其在最好的情形中允许筛选出大的染色体片段。然而，经常会有的风险是，在标记之间的此片段内，发生双遗传重组可导致Htn1抗性基因座的假阳性选择。另外，在一些情形中，不期望的遗传区域被带入到渐渗品系的可能性随着所渐渗的染色体片段的大小而增加并且可以在良种品系的代际之间传播。此类遗传区域已知为连锁累赘(linkage drag)，特别是当它们与Htn1基因座紧密偶联并明确导致一或多种农学特征的负面影响时。然而，从研究和使用了具有来自Pepitilla的Htn1的渐渗品系的研究可知，此类负面影响是未知的。即便是Welz(1998)同样在B37Htn1中所进行的非常详尽的研究，也认为是如此，例如，Htn1基因座的渐渗对产量和成熟未带来显著的劣势。因此，现有技术中尚未进行过严肃的努力来研讨如何缩短大染色体片段。
相反，WO 2011/163590公开了基因型PH99N作为染色体8bin 5上NCLB抗性的另外的来源，然而，其并不对应于Pepitilla种质。基本上，只有对于大斑病长蠕孢小种0和1的抗性已经在来自PH99N的回交群体中进行了鉴别。即便是抗性表现型也没有清楚地确定。尽管如此，作者们得到的结论是，该抗性是由于Htn1基因。但是PH99N中的抗性基因座被限制在仅仅～224kb长的染色体片段；然而，具有该224kb片段以及因而具有所述推断的Htn1的抗性玉米植物并未公开。另外，所述基因型PH99N未通过保藏而使公众可得。
使得所述Htn1基因有用的另外的方法是鉴别和克隆抗性基因并将其用于转基因策略。
为了鉴别NCLB的抗性基因，在2010年，Chung等2010发表了对bin 8.06抗性基因座进行精细定位的研究。然而，所研究的染色体片段，并非源自Pepitilla而是源自玉米杂交种DK888(其呈现出多种疾病抗性)。对长蠕孢属(Helminthosporium)小种特异性的研究开始弄清楚了DK888上的抗性基因座(命名为qNLB8.06DK888)与Ht2和Htn1基因紧密连锁或者功能上连锁，因为长蠕孢属菌株23和23N是有毒性的(Chung等,2008)。然而，在缺乏来自大斑病长蠕孢的纯N分离株时，对Htn1存在的阳性检测未能实现。另外，具有qNLB8.06DK888的抗性表现型也并未与预期的表现型(褪绿病斑的出现和病斑形成的延迟)对应。Chung等(2010)中进一步的详细补充研究最终显示出，qNLB8.06DK888与Ht2相同、是等位基因、紧密连锁、或者功能上连锁，而不是Htn1。所述抗性基因座qNLB8.06DK888可以被分配至0.46Mb的染色体片段。对此染色体片段的基因组标注提示有12个推定的开放阅读框，其中的三个可能分别是串联蛋白激酶样基因(GRMZM2G135202；GRMZM2G164612)或者蛋白磷酸酶样基因(GRMZM2G119720)，并且每个均同样地构成了抗性基因Ht2的有希望的候选基因(Chung等,2010)。并未描述功能性的验证。
另外，WO 2011/163590A1还将抗性来源PH99N中假定的Htn1基因标注为串联蛋白激酶样基因(GRMZM2G451147)并公开了其基因序列，但是也并未确定其功能(例如在转基因玉米植物中)。
发明概述
本发明源于上文所述的现有技术；本发明的目标是提供这样的玉米植物，其呈现出来自供体Pepitilla的对大斑病长蠕孢的抗性，并且其中已知玉米植物的农学特征可以与来自供体Pepitilla的抗性叠加。
该目标一方面通过提供这样的玉米植物来实现，其基因组中已整合了来自供体Pepitilla的染色片段，其中所述染色体片段包含所述供体的区间(下文称作第一区间或者区间1)，所述区间呈现依照表2的单倍型(haplotype)的供体等位基因以及在所述玉米植物中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，并且其中所述染色体片段在第一标记区(M1)(其旁侧为标记SYN14136和PZE-108076510)中的标记与第二标记区(M2)(其旁侧为标记SYN24931和PZE-108077560)中的标记之间不含有所述供体的另外的区间(下文称作第二区间或区间2)。对于该问题的这些以及其它的解决方案(下文中所述)，其可以是基于将来自Pepitilla的Htn1基因座整合至玉米品系中的育种程序。然而，也可以选择遗传工程方法，通过该方法可以产生依照本发明的植物。遗传工程策略的实例在下文中有更详细的描述。为了产生本发明的植物，可以使用来自现有技术的各种基因型。特别是将B37HTN1用作原始品系，其包含来自地方品种“Pepitilla”的抗性基因座。除了Pepitilla本身以及B37HTN1(在现有技术中也称为B37HtN)之外，几乎任何的玉米基因型均可以用于整合所述Htn1基因座，以便产生本发明的玉米植物(在其基因组中，特别是在染色体8bin 5或6上，插入了来自Pepitilla的Htn1抗性基因座的渐渗)。在此方面，许多基因型的实例是现有技术中已知的，例如：W22Htn(如Bar-Zur等,1998)；H6314Htn(如Bar-Zur等,1998)、B73HtN(e.g.Shimoni等,Journal of Phytopathology 131:4(1991),315-321)、B68HtN和A632HtN(如Carson,Plant Disease 79(1995),717-720)和A619HtN(如等,Genetika 39:2(2007),227-240)。在本发明的玉米植物中，所述染色体片段源自供体Pepitilla；在本发明的玉米植物优选的实施方案中，所述染色体片段源自供体B37HTN1或者源自上文引用的另外的玉米基因型。作为实例，B37HTN1可以使用存货ID 65749而从Maize Genetics COOP StockCenter订购。
整合至本发明玉米植物的基因组的所述染色体片段源自供体Pepitilla，其已知包含抗性基因座HTN1。此抗性基因座的渐渗位于染色体8的长臂(bin8.05–8.06)。所整合的染色体片段包含供体的第一区间，其包含在本发明的玉米植物中赋予针对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸。在此方面，所述多核苷酸包含来自Pepitilla的HTN1基因座的一个或多个抗性赋予基因(表1)或者其等位基因。在大斑病长蠕孢侵袭的情况下，所述基因或等位基因可以产生具有HTN1典型特征的抗性表现型。优选地，所述多核苷酸包含HTN1基因座(优选来自Pepitilla)的一个或多个抗性赋予基因，选自RLK1和EXT1(参见表1)或者其等位基因，其在大斑病长蠕孢侵袭的情况下产生具有HTN1典型特征的抗性表现型。特别优选地，所述多核苷酸包含核苷酸序列，其编码依照SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的多肽或者依照SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的多肽的同源物，其在大斑病长蠕孢侵袭的情况下产生具有HTN1典型特征的抗性表现型。这些HTN1典型特征的实例有孢子形成的延迟发生、减少的病斑发展、发展更小的病斑、缩小的孢子形成区域和/或没有或者仅有分离的褪绿坏死病斑。结构上来说，所述多核苷酸特征在于其包含这样的核酸分子:(a)所述核酸分子包含依照SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列；(b)所述核酸分子包含与依照SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的核苷酸序列，优选在该序列的全长上具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；(c)所述核酸分子在严格条件下与依照(a)或(b)的核酸分子的互补链杂交；(d)所述核酸分子编码多肽，该多肽具有依照SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列；(e)所述核酸分子编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与依照(d)的氨基酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；或者(f)所述核酸分子包含依照(a)至(e)的核酸的部分序列。在优选的实施方案中，所述多核苷酸特征在于其包含这样的核酸分子：(aa)所述核酸分子包含依照SEQ ID NO:1或5的核苷酸序列；(bb)所述核酸分子包含与依照SEQ ID NO:1或5的核苷酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的核苷酸序列，优选在该序列的全长上具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；(cc)所述核酸分子在严格条件下与依照(aa)或(bb)的核酸分子的互补链杂交；(dd)所述核酸分子编码多肽，该多肽具有依照SEQ ID NO:2或6的氨基酸序列；(ee)所述核酸分子编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与依照(dd)的氨基酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；或者(ff)所述核酸分子包含依照(aa)至(ee)的核酸的部分序列。如本发明中所用的表述“核酸分子的部分序列”可以是至少20、30、40、50、60、70、80、90或者至少100个连续核苷酸，另外至少150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。所述多核苷酸在本发明的玉米植物中可以是杂合的或者纯合的状态；优选地，所述多核苷酸是纯合状态。
表1:来自Pepitilla的HTN1基因座的潜在抗性赋予基因；基因名称(第1列)；在基因组外显子序列中的相应SEQ ID No编号(第2列)；在推测的氨基酸/蛋白序列中的相应SEQID No编号(第3列)；从来自B73的参照基因组中标注的同源基因(第4列)。
另外，呈现出依照表2中单倍型的供体等位基因的染色体片段中的第一区间特征在于表2的单倍型中的供体等位基因的序列，但是却并不局限于依照表2的供体等位基因的此序列。这意味着第一区间至少呈现出描述了表1的抗性赋予基因的供体等位基因，任选地伴随标记MA0008的供体等位基因。另外，第一区间优选呈现出至少依照表2的单倍型的供体等位基因，从MA0021至MA0022(也即MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022)或者从MA0005至MA0022(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012和MA0022)或者从MA0005至MA0013(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022和MA0013)或者从MA0005至MA0014(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013和MA0014)或者从MA0005至MA0015(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014和MA0015)或者从MA0005至MA0016(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015和MA0016)，特别优选的是从MA0005至MA0017(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016和MA0017)、MA0005至MA0018(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017和MA0018)、MA0005至PZE-108095998(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018和PZE-108095998)、MA0005至PZE-108096011(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998和PZE-108096011)或者MA0005至MA0019(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011和MA0019)，更特别优选的是从MA0005至PZE-108096610(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019和PZE-108096610)、MA0005至MA0020(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019、PZE-108096610和MA0020)、MA0005至PZE-108096791(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019、PZE-108096610、MA0020和PZE-108096791)或者MA0005至MA0006(也即MA0005、MA0021、MA0007、MA0008、MA0009、MA0010、MA0011、MA0012、MA0022、MA0013、MA0014、MA0015、MA0016、MA0017、MA0018、PZE-108095998、PZE-108096011、MA0019、PZE-108096610、MA0020、PZE-108096791和MA0006)。此抗性单倍型明确地指明和鉴别抗性来源Pepitilla。具体而言，第一区间位于标记MA0004和PZE-108097482之间、标记MA0004和MA0022之间、标记MA0005和PZE-108097482之间、或者标记MA0005和MA0022之间。优选地，第一区间描述了这样的染色体片段的区段，其可以赋予HTN1典型的抗性。因而其是上文所述多核苷酸的载体。
表2:来自B37HTN1的抗性单倍型；
在B73AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名
151831049 C MA0005
151907173 G MA0021
152045106 T MA0007
152045141 T MA0008
152045402 T MA0009
152045516 C MA0010
152045912 T MA0011
152046502 T MA0012
152046529 A MA0022
152133057 G MA0013
152133380 A MA0014
152144310 A MA0015
152250992 A MA0016
152301656 A MA0017
152304127 A MA0018
152433358 A PZE-108095998
152435855 A PZE-108096011
152630794 C MA0019
152703579 G PZE-108096610
152753635 A MA0020
152887338 G PZE-108096791
152888374 A MA0006
另外，每个本发明的玉米植物均为HT抗性玉米植物。由所述染色体片段的整合所赋予的HT抗性，可以通过在依照表3和实施例1.A)中方案的表现型分型实验中确定分类评分来进行定量；其中，所述抗性的水平从1降低至9。本发明的HT抗性玉米植物呈现出对大斑病长蠕孢的提高至少1个分类评分，优选至少2个分类评分或者至少3个分类评分，以及特别优选至少4个分类评分的抗性。优选地，本发明的玉米植物呈现出针对至少一种大斑病长蠕孢小种的抗性，不对应于现有技术中已知的小种特异性。在特别优选的实施方案中，本发明的玉米植物对所有已知的大斑病长蠕孢小种具有抗性，也即所赋予的抗性不是小种特异性的并且可在形成对大斑病长蠕孢的广谱抗性方面是特备有利的。
表3:在各种地点的田间试验中对表现型分型实验的分类评分方案，其中使用天然和人工大斑病长蠕孢接种(来自Deutsche Maiskomitee(DMK,德国玉米委员会)；AG品种27.02.02；(DMK J.Rath；RP Freiburg H.J.Imgraben)
分类评分 表现型
1 植物呈现出没有疾病症状，0％
2 侵袭开始，可见最初的小斑点(小于2cm)。低于5％的叶表面受影响。
3 在叶期已经发展一些斑点。介于5-10％之间的叶表面受到影响。
4 10-20％的叶表面受影响。在若干叶期有清晰可见的斑点。
5 20-40％的叶表面受影响。斑点开始合并。
6 40-60％的叶表面受影响。在叶子上可见系统性侵袭。
7 60-80％的叶表面受影响。大约一半的叶由于真菌侵袭而被破坏或者干枯。
8 80-90％的叶表面受影响。超过一半的叶由于真菌侵袭而被破坏或者干枯。
9 90-100％的叶表面受影响。植物几乎完全干枯。
本说明书通过提供单倍型、通过定位主要的标记、以及还通过鉴别赋予针对病原体大斑病长蠕孢的抗性的候选基因，公开了HTN1基因座的遗传和分子结构。
出乎意料地，在田间和在温室进行的表现型分型试验证明了本发明的玉米植物是符合农学的。这是因为，通过整合来自Pepitilla以及来自现有技术的经转化的品系如B37HTN1的HTN1基因座的育种程序而得到的其它经转化的品系，除了在非大斑病长蠕孢侵袭条件下和在相当的环境条件下(温度、营养供应、地点等)所赋予的HT抗性之外，与没有渐渗的对应品系相比(例如等基因品系或原始品系)呈现出雄性和/或雌性开花时间的显著延迟，但是在本发明的玉米植物中，开花时间与相当的等基因玉米植物(其基因组中没有整合来自供体Pepitilla的染色体片段)相对应。所述“开花时间”在其彼此差异少于两天时是对应的。此种情况中所观察到的延迟的幅度强烈取决于玉米的小种或者玉米的基因型、占优势的环境条件如土壤条件、湿度、降雨、温度等和/或生物胁迫如大斑病长蠕孢之外的病原体侵袭。所述延迟为至少2天、至少3天、至少5天、或至少7天。在开花时间上的这种差异是由于作为渐渗一部分的连锁累赘，这特别出乎意料因为此种类型的观察在现有技术中是未知的。开花时间是重要的农学特征。其可以直接并且实质上地影响玉米植物的产量潜力。延迟的开花时间常常会导致产量降低。
为了弄清楚此种不利的遗传学成因并鉴别连锁累赘，例如，进行了广泛的回交程序并伴有进行基因型分型和表现型分型。在携有HTN1的染色体片段上特异性标记的密集开发支持了此工作。标记辅助筛选(MAS)以及进行聚焦回交程序(例如“图位克隆”)的技术可以在现有技术中找到(Gupta&Varshney,2013)。在后代染色体8上(bin 8.06)标记MA0002(表4)和umc1287(表5)之间的23.1cM的区域内，借助SSR标记bnlg1067、umc1121、MA0002、MA0003、bnlg1782、umc1287、umc1960和bnlg240的辅助，对具有来自供体B37HTN1或Pepitilla的HTN1抗性的QTL进行了定位(参见图1)。在具有延迟的开花时间的玉米植物中，造成所鉴别的开花时间的连锁累赘基因组供体序列区段的基因座成功地被确定为位于染色体片段上供体的另外的第二区间(实施例3B；图3)。在本发明的玉米植物中，整合了不含有供体的第二区间的染色体片段。在本文中，第二区间例如是来自不携有开花时间连锁累赘的轮回亲本，或者来自位于适宜的靶向同源重组供体载体上的外源(exogenically)引入的同源DNA片段(其不是所述连锁累赘的载体)。所述第二区间位于抗性基因座HTN1或者第一区间近侧并与其紧密偶联。所述第二区间是在第一标记区(M1)中的标记和第二标记区(M2)中的标记之间的区间，所述第一标记区旁侧为标记SYN14136和PZE-108076510，而所述第二标记区旁侧为标记SYN24931和PZE-108077560。旁侧的标记可以从表4了解。标记SYN14136、PZE-108076510、SYN24931和PZE-108077560是用于KBioscience-KASP系统的SNP标记(www.lgcgenomics.com/genotyping/KASP-genotyping-reagents/KASP-overview/)。它们清楚地在供体B37HTN1或Pepitilla中携有所述开花时间连锁累赘的序列区段的两边定义了标记区M1和M2。另外，作为多态性标记，它们也能够区分Pepitilla供体等位基因和例如复发亲本的等位基因。关于使用这些标记作为KASP标记的所有细节都可以从表4获得。用于PCR的适宜的示例性引物杂交参数在实施例2中提供。另外，本领域技术人员也能够确定其它适宜的杂交参数。另外，对于具有所提到的标记外加所描述的标记区的知识的本领域技术人员而言，在M1和/或M2中开发另外的标记特别是多态性标记是常规工作。使用本文提到的标记，也即SYN14136、PZE-108076510、SYN24931和PZE-108077560或者在M1和/或M2中自行开发的标记，本领域技术人员将能够轻易地确定：玉米植物的基因组中是否已经整合了来自供体Pepitilla的具有HTN1抗性基因座的染色体片段，其中是否含有了上文所述的供体的第二区间。本领域技术人员也了解，例如，在育种程序中或者在靶向重组的遗传工程策略中，可以通过所整合染色体片段的遗传/同源重组从供体中去除所述染色体区间(其例如包含引起连锁累赘的基因组序列)。在此方面，可以用轮回亲本基因组的相应区间或者用外源引入的同源DNA片段来取代所述Pepitilla供体的区间。一般标记以及本文中特别公开的标记特意特别用于此方面的筛选。作为实例，给出标记用于检测等位基因的可能用途如下：检测等位基因可以，例如，通过如下来进行：(a)从植物或植物细胞/玉米植物或玉米植物细胞的基因组分离至少一个核酸分子，和(b)用至少一种标记检验所述分离的核酸分子，以及任选地(c)对一种和/或更多种基因型中的等位基因测序，(d)检测一种和/或多种多态性和/或(e)用可以在标记等位基因产生不同大小片段的限制性内切酶内切。
本发明的玉米植物的优选实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段不含有供体的第二区间，所述第二区间a)旁侧为标记SYN14136和PZE-108077560、b)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108077560、c)旁侧为标记SYN14136和SYN24931或者d)旁侧为标记PZE-108076510和SYN24931。
在优选的实施方案中，与Pepitilla转化的品系或Pepitilla转化的植物如B37HTN1(其在旁侧为标记SYN14136和PZE-108076510的第一标记区(M1)中的标记和旁侧为标记SYN24931和PZE-108077560的第二标记区(M2)中的标记之间含有区间2)相比，本发明的玉米植物呈现出异常的雄性和/或雌性开花时间，其中所述术语“异常的时间”是指经转化的品系或者经转化的植物呈现出至少2天、至少3天、至少5天或至少7天的延迟。
本发明玉米植物另外的优选实施方案是上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段还不含有在第二标记区M2中的标记和旁侧为标记PZE-108093423(表4)和PZE-108093748(表4)的第三标记区M3中的标记之间的供体区间(下文称作第三区间或区间3)。所述标记PZE-108093423和PZE-108093748是用于KBioscience-KASP系统的SNP标记(www.lgcgenomics.com/genotyping/KASP-genotyping-reagents/KASP-overview/)。它们清楚地限定了标记区M3。作为多态性标记，它们还适宜用于区分供体等位基因和例如轮回亲本的等位基因。关于使用这些标记作为KASP标记的所有细节都可以从表4获得。用于PCR的适宜的示例性引物杂交参数在实施例2中提供。本领域技术人员也能够确定其它适宜的杂交参数。另外，对于具有所提到的标记外加所描述的标记区的知识的本领域技术人员而言，在M3中开发另外的标记特别是多态性标记是常规工作。使用上文提到的M2的标记以及本文标注的标记PZE-108093423和PZE-108093748或者在M3中自行开发的标记，本领域技术人员可以容易地确定：玉米植物的基因组中是否已经整合了来自供体Pepitilla的具有HTN1抗性基因座的染色体片段，其中是否含有了上文所述的供体的第三区间。
本发明玉米植物另外的优选实施方案由上文所述的玉米植物所提供，其中所述染色体片段不含有遗传区段，所述遗传区段包含所述供体的第二区间和第三区间并且a)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093423、b)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093423、c)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093748或者d)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093748。
在另外的方面，在所述染色体片段上还能确定另外的遗传区段，其在非大斑病长蠕孢侵袭条件下，能够对玉米植物(其基因组中已整合了具有来自供体Pepitilla的HTN1抗性基因座的染色体片段)的产量潜力引起显著的负面影响。因此，独立于上文所述的开花时间延迟之外的是，与没有渐渗的相应品系(例如等基因品系或原始品系)相比，经转化的品系以及现有技术中已知的经转化的品系如B37HTN1，在所赋予的HT抗性之外，还呈现出产量的实质性降低，特别是青贮产量(silage yield)的实质性降低。对于基因组中不再存在区间2(来自M1和M2的标记之间)或者区间2和3(来自M1和M3的标记之间)所构成的供体的遗传区段的品系也是如此。此种类型的观察是本领域技术人员所不能预期到的，因为在现有技术中还没有显示出在HTN1渐渗品系中有此种类型的连锁累赘。为了弄清楚这种农学劣势的遗传成因，例如，进行了广泛的回交程序并伴有基因型确定和表现型确定。在携有HTN1的染色体片段上紧密开发更精确的和更特异的分子标记会支持此工作。在产量(青贮产量)降低的玉米植物中，造成青贮产量连锁累赘的基因组序列区段的位置成功地确定为位于Pepitilla染色体片段上两个另外的供体的区间(下文称为第四区间或区间4和第五区间或区间5)(实施例3C；图3)。本发明的玉米植物(包含相应无连锁累赘的区间例如来自轮回亲本，而不是携有所述连锁累赘的供体的第四和/或第五区间)，未呈现出降低的青贮产量，因而产量特别是青贮产量其与没有渐渗的品系(例如等基因品系或者原始品系)相同或者相当。本发明的玉米植物(没有供体的第四和/或第五区间)的青贮产量，可以比具有青贮产量连锁累赘的相当的玉米植物高超过2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。第四区间位于近侧并且与抗性基因座HTN1或第一区间紧密偶联。第五区间位于远侧并且与抗性基因座HTN1或第一区间紧密偶联。
因而，本发明的玉米植物特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段还不含有：i)在第三标记区M3中的标记与第四标记区M4(其旁侧为标记MA0004和MA0005)中的标记之间的供体第四区间，或者ii)具有在第三标记区M3中的标记与第七标记区M7(旁侧为标记MA0005和MA0021)中的标记之间的第四区间的遗传区段；和/或其中所述染色体片段还不含有：i)第五标记区M5(旁侧为标记MA0006和PZE-108097482)中的标记与第六标记区M6(旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196)中的标记之间的供体的第五区间，或者ii)具有在第八标记区M8(旁侧为标记MA0022和MA0013)中的标记与第六标记区M6(旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196)中的标记之间的第五区间的遗传区段。所述旁侧的标记可以得自表4。所述标记MA0004、MA0005、MA0006、MA0013、MA0021、MA0022、PZE-108097482、PZE-108107671和SYN4196是用于KBioscience-KASP系统的SNP标记(www.lgcgenomics.com/genotyping/KASP-genotyping-reagents/KASP-overview/)。它们清楚地限定了标记区M4、M5、M6、M7和M8，其与M3一起构成了携带有供体B37HTN1或Pepitilla中的青贮产量连锁累赘的序列区段。作为多态性标记，它们也适宜用于区分供体等位基因和例如轮回亲本的等位基因。关于使用这些标记作为KASP标记的所有细节都可以从表4获得。用于PCR的适宜的示例性引物杂交参数在实施例2中提供。本领域技术人员也能够确定其它适宜的杂交参数。另外，对于具有所提到的标记外加所描述的标记区的知识的本领域技术人员而言，在M4、M5、M6、M7和/或M8中开发另外的标记特别是多态性标记是常规工作。使用本文所描述的所述标记MA0004、MA0005、MA0006、MA0013、MA0021、MA0022、PZE-108097482、PZE-108107671和SYN4196或者在M4、M5、M6、M7和/或M8中自行开发的标记以及上文所述的M3中的标记，本领域技术人员将会容易地确定：玉米植物的基因组中是否已经整合了来自供体Pepitilla的具有HTN1抗性基因座的染色体片段，其中是否含有了上文所描述的供体的第四区间。
本发明玉米植物另外的特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段i)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段含有供体的第二区间、第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN14136和MA0004、b)旁侧为标记PZE-108076510和MA0004、c)旁侧为标记SYN14136和MA0005或d)旁侧为标记PZE-108076510和MA0005；或者(ii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段含有所述供体的第二区间和第三区间并且a)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093423、b)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093423、c)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093748或d)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093748，以及供体的第五区间；或者(iii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第二区间、第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN14136和MA0004、b)旁侧为标记PZE-108076510和MA0004、c)旁侧为标记SYN14136和MA0005或d)旁侧为标记PZE-108076510和MA0005，以及供体的第五区间。
本发明玉米植物特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段包括：(i)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第二区间、第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN14136和MA0021或b)旁侧为标记PZE-108076510和MA0021；或者(ii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第二区间、第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN14136和MA0021或b)旁侧为标记PZE-108076510和MA0021，以及供体的第五区间；或者(iii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第二区间、第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN14136和MA0021或b)旁侧为标记PZE-108076510和MA0021，以及第二遗传区段，其包含供体的第五区间并且a)旁侧为标记MA0022和PZE-108107671、b)旁侧为标记MA0022和SYN4196、c)旁侧为标记MA0013和PZE-108107671或者旁侧为标记MA0013和SYN4196；或者(iv)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段含有所述供体的第二区间和第三区间并且a)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093423、b)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093423、c)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093748或d)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093748，以及第二遗传区段，其包含供体的第五区间并且a)旁侧为标记MA0022和PZE-108107671、b)旁侧为标记MA0022和SYN4196、c)旁侧为标记MA0013和PZE-108107671或者旁侧为标记MA0013和SYN4196；或者(v)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第二区间、第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN14136和MA0021或b)旁侧为标记PZE-108076510和MA0021，以及第二遗传区段，其包含供体的第五区间并且a)旁侧为标记MA0022和PZE-108107671、b)旁侧为标记MA0022和SYN4196、c)旁侧为标记MA0013和PZE-108107671或旁侧为标记MA0013和SYN4196。
构成本发明的基础的目标可选地是通过这样玉米植物实现的，所述玉米植物其基因组中已整合了来自供体Pepitilla的染色片段，其中所述染色体片段包含供体的第一区间，所述供体的第一区间呈现出依照表2的单倍型的供体等位基因并且包含赋予针对大斑病长蠕孢的抗性的所述多核苷酸，并且其中所述染色体片段不含有i)在第三标记区(旁侧为标记PZE-108093423和PZE-108093748)中的标记与第四标记区(旁侧为标记MA0004和MA0005)中的标记之间的供体的第四区间，或ii)具有在第三标记区M3中的标记与第七标记区M7(旁侧为标记MA0005和MA0021)中的标记之间的第四区间的遗传区段。上述说明书中，例如，对于标记，所述多核苷酸或者表现型在此情况中以及对于每个另外的问题解决方案、以及公开的实施方案也是有效的。
本发明玉米植物的优选实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段i)不含有供体的第四区间，所述供体的第四区间a)旁侧为标记PZE-108093423和MA0004、b)旁侧为标记PZE-108093748和MA0004、c)旁侧为标记PZE-108093423和MA0005或d)旁侧为标记PZE-108093748和MA0005；或者ii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段含有供体的第四区间并且a)旁侧为标记PZE-108093423和MA0021或b)旁侧为标记PZE-108093748和MA0021。
本发明的玉米植物另外的优选实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段还不含有在第二标记区M2中的标记和第三标记区M3中的标记之间的所述供体的第三区间。
本发明的玉米植物另外的优选实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN24931和MA0004、b)旁侧为标记PZE-108077560和MA0004、c)旁侧为标记SYN24931和MA0005、d)旁侧为标记PZE-108077560和MA0005、e)旁侧为标记SYN24931和MA0021或f)旁侧为标记PZE-108077560和MA0021。
本发明的玉米植物另外的优选实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段i)还不含有在第五标记区M5中的标记与第六标记区M6中的标记之间的供体的第五区间，或者ii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段具有在第八标记区M8中的标记与第六标记区M6中的标记之间的第五区间。
本发明玉米植物特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段i)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN24931和MA0004、b)旁侧为标记PZE-108077560和MA0004、c)旁侧为标记SYN24931和MA0005或d)旁侧为标记PZE-108077560和MA0005，以及第五区间；或者ii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN24931和MA0004、b)旁侧为标记PZE-108077560和MA0004、c)旁侧为标记SYN24931和MA0005或d)旁侧为标记PZE-108077560和MA0005，以及第二遗传区段其包含第五区间并且a)旁侧为标记MA0022和SYN4196、b)旁侧为标记MA0022和PZE-108107671、c)旁侧为标记MA0013和SYN4196或旁侧为标记MA0013和PZE-108107671。
本发明玉米植物特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段i)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN24931和MA00021或b)旁侧为标记PZE-108077560和MA00021，以及第五区间；或者ii)不含有这样的遗传区段，所述遗传区段包含供体的第三区间和第四区间并且a)旁侧为标记SYN24931和MA00021或b)旁侧为标记PZE-108077560和MA00021，以及第二遗传区段其包含第五区间并且a)旁侧为标记MA0022和PZE-108107671、b)旁侧为标记MA0022和SYN4196、c)旁侧为标记MA0013和PZE-108107671或旁侧为标记MA0013和SYN4196。
或者，本发明的目标进一步由这样的玉米植物实现，所述玉米植物其基因组中已经整合了来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述染色体片段包含供体的第一区间，所述供体的第一区间呈现出依照表2的单倍型的供体等位基因并且其包含在所述玉米植物中赋予针对大斑病长蠕孢的抗性的所述多核苷酸，并且其中所述染色体片段不含有i)在第五标记区(旁侧为标记MA0006和PZE-108097482)中的标记与第六标记区(旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196)中的标记之间的供体的第五区间，或者ii)这样的遗传区段，其具有在第八标记区M8(两侧为标记MA0022和MA0013)中的标记与第六标记区M6(两侧为标记PZE-108107671和SYN4196)中的标记之间的第五区间。
本发明的玉米植物另外的优选实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段另外还不含有在第二标记区M2中的标记和第三标记区M3中的标记之间所述供体的第三区间。
本发明玉米植物特别优选的实施方案是上文所述的玉米植物、其中所述染色体片段a)旁侧为第二标记区M2中的标记和第六标记区M6中的标记、b)旁侧为第三标记区M3中的标记和第六标记区M6中的标记、c)旁侧为第四标记区M4中的标记和第六标记区M6中的标记、d)旁侧为第七标记区M7中的标记和第六标记区M6中的标记、e)旁侧为标记区M1中的标记和标记区M5中的标记、f)旁侧为第二标记区M2中的标记和第五标记区M5中的标记、g)旁侧为第三标记区M3中的标记和第五标记区M5中的标记、h)旁侧为第四标记区M4中的标记和第五标记区M5中的标记、i)旁侧为第七标记区M7中的标记和第五标记区M5中的标记、j)旁侧为标记区M1中的标记和标记区M8中的标记、k)旁侧为第二标记区M2中的标记和第八标记区M8中的标记、l)旁侧为第三标记区M3中的标记和第八标记区M8中的标记、m)旁侧为第四标记区M4中的标记和第八标记区M8中的标记、或者n)旁侧为第七标记区M7中的标记和第八标记区M8中的标记。
本发明玉米植物特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段a)旁侧为标记SYN24931和SYN4196、b)旁侧为标记PZE-108077560和SYN4196、c)旁侧为标记SYN24931和PZE-108107671、d)旁侧为标记PZE-108077560和PZE-108107671、e)旁侧为标记PZE-108093423和SYN4196、f)旁侧为标记PZE-108093748和SYN4196、g)旁侧为标记PZE-108093423和PZE-108107671、h)旁侧为标记PZE-108093748和PZE-108107671、i)旁侧为标记MA0004和SYN4196、j)旁侧为标记MA0005和SYN4196、k)旁侧为标记MA0004和PZE-108107671、l)旁侧为标记MA0005和PZE-108107671、m)旁侧为标记MA0021和SYN4196、n)旁侧为标记MA0021和PZE-108107671、o)旁侧为标记PZE-108076510和MA0006、p)旁侧为标记SYN14136和MA0006、q)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108097482、r)旁侧为标记SYN14136和PZE-108097482、s)旁侧为标记SYN24931和PZE-108097482、t)旁侧为标记PZE-108077560和PZE-108097482、u)旁侧为标记SYN24931和MA0006、v)旁侧为标记PZE-108077560和MA0006、w)旁侧为标记PZE-108093423和PZE-108097482、x)旁侧为标记PZE-108093748和PZE-108097482、y)旁侧为标记PZE-108093423和MA0006、z)旁侧为标记PZE-108093748和MA0006、aa)旁侧为标记MA0004和PZE-108097482、ab)旁侧为标记MA0005和PZE-108097482、ac)旁侧为标记MA0004和MA0006、ad)旁侧为标记MA0005和MA0006、ae)旁侧为标记MA0021和PZE-108097482、af)旁侧为标记MA0021和MA0006、ag)旁侧为标记PZE-108076510和MA0013、ah)旁侧为标记SYN14136和MA0013、ai)旁侧为标记PZE-108076510和MA0022、aj)旁侧为标记SYN14136和MA0022、ak)旁侧为标记SYN24931和MA0013、al)旁侧为标记PZE-108077560和MA0013、am)旁侧为标记SYN24931和MA0022、an)旁侧为标记PZE-108077560和MA0022、ao)旁侧为标记PZE-108093423和MA0013、ap)旁侧为标记PZE-108093748和MA0013、aq)旁侧为标记PZE-108093423和MA0022、ar)旁侧为标记PZE-108093748和MA0022、as)旁侧为标记MA0004和MA0013、at)旁侧为标记MA0005和MA0013、au)旁侧为标记MA0004和MA0022、av)旁侧为标记MA0005和MA0022、aw)旁侧为标记MA0021和MA0013、ax)旁侧为标记MA0021和MA0022。
本发明玉米植物特别优选的实施方案是如上文所述的玉米植物，其中所述染色体片段位于a)第二标记区M2中的标记和第六标记区M6中的标记之间、b)第三标记区M3中的标记和第六标记区M6中的标记之间、c)第四标记区M4中的标记和第六标记区M6中的标记之间、d)第七标记区M7中的标记和第六标记区M6中的标记之间、e)第一标记区M1中的标记和第五标记区M5中的标记之间、f)第二标记区M2中的标记和第五标记区M5中的标记之间、g)第三标记区M3中的标记和第五标记区M5中的标记之间、h)第四标记区M4中的标记和第五标记区M5中的标记之间、i)第七标记区M7中的标记和第五标记区M5中的标记之间、j)标记区M1中的标记和标记区M8中的标记之间、k)第二标记区M2中的标记和第八标记区M8中的标记之间、l)第三标记区M3中的标记和第八标记区M8中的标记之间、m)第四标记区M4中的标记和第八标记区M8中的标记之间、或者n)第七标记区M7中的标记和第八标记区M8中的标记之间。
表4:KASP标记引物序列和对衍生自地方品种Pepitilla的B37HTN1供体等位基因的命名(等位基因X和等位基因Y:描述了SNP的双等位基因值)
另外，本发明涉及上文所述的本发明玉米植物的种子或谷粒、组织、器官、部分以及细胞。在此方面，所述种子或谷粒是这样的种子或谷粒，其基因组中已经整合了上文所述的本发明实施方案的染色体片段。
在另外的方面，本发明用于鉴别大斑病长蠕孢抗性玉米植物的方法，所述大斑病长蠕孢抗性玉米植物其基因组中已经整合了来自供体Pepitilla的染色体片段，在所述植物的基因组中包含至少两个等位基因的后代，其中至少一个等位基因位于这样的基因组区段中，所述基因组区段旁侧为第一标记区M1、第二标记区M2、第三标记区M3、第四标记区M4或第七标记区M7的标记，以及旁侧为上文所述的多核苷酸(其在玉米植物中赋予针对大斑病长蠕孢的抗性)，并且其中至少一个等位基因位于这样的基因组区段中，所述基因组区段旁侧为第六标记区M6、第五标记区M5或第八标记区M8中的标记。所述标记区以及这些标记区中的示例性标记在上文中有描述。优选地，所鉴别的玉米植物是本发明的玉米植物。另外，本发明还涉及通过使用所提到的鉴别方法而鉴别出来的玉米植物。
在另外的方面，本发明涉及用于提高大斑病长蠕孢抗性玉米植物的产量的方法，其基因组中已经整合了来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述包括这样的步骤，所述步骤是去除供体的第二区间、供体的第四区间或供体的第五区间，并且其中所述染色体片段包含上文所述的供体的第一区间，其包含依照表2的单倍型的供体等位基因并且在玉米植物中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸。作为实例，可以在两个玉米植物之间的杂交程序中通过遗传重组来进行所述去除，其中亲本玉米植物携带有来自Pepitilla的HTN1-抗性基因座。除了使用常规的育种技术以产生遗传重组(其结果导致用轮回亲本的基因组序列(优选无不期望的基因)取代至少一个上文鉴别的具有连锁累赘的供体区间)之外，现代生物技术给于了本领域技术人员许多的工具使得能够进行精确的遗传工程。已知工具的实例有大范围核酸酶(Silva等,2011)、归巢核酸内切酶(Chevalier 2002)、锌指核酸酶、TALE核酸酶(WO 2010/079430；WO 2011/072246)或者CRISPR(Gaj等,2013)。这些是人工的核酸酶融合蛋白，其能够切割双链的核酸分子如植物DNA并因而能够在基因组的期望位置产生双链断裂。通过利用细胞自身对诱导的双链断裂的修复机制，可以进行同源重组或者“非同源末端接合”，这可以导致去除携带有连锁累赘的供体的区间。可以例如从SNP标记(表4)的序列信息或者其区间内获取基因组中适宜的靶标序列以用于核酸酶的识别结构域。然而，本领域技术人员也能够给鉴别出其它序列，优选在上文所述的6个标记区之内或者之间，其适宜用作靶标序列用于核酸酶的识别结构域。
我们将就此更详细地描述两种遗传工程手段，在其辅助之下可以支持或者直接将携带有连锁累赘的核苷酸序列从植物基因组中的消除。以下方法以及常规的育种方法可以用于产生本发明的玉米植物。
如前所述，目前的分子工具能够在植物DNA的基因组中指定位置诱导双链的断裂。在此方面，使用TALE核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)已经被证明是特别有利的。TALE或ZF识别结构域使得其能够特异性结合至基因组中的任何位置。已知靶标区的序列，TALE或ZF识别结构域可以进行定制从而使其专门只结合至基因组中的期望位置。假如识别序列与例如非特异性核酸内切酶如FokI融合，则可以在基因组中指定的位置诱导出双链断裂(DSB)，使得能够进行靶向基因组改造(Tzfira等,2012；Li等,2011；Puchta和Hohn 2010)。本领域技术人员熟悉如何操作FokI核酸内切酶以及现有技术中对适宜TALEN和ZFN的提供。
诱导的双链断裂例如可以刺激内源靶基因基因座(例如上述标记区之一)与外源引入的同源DNA片段(其例如并不是连锁累赘(如适宜的载体上)的载体)之间的同源重组。这种所谓的基因取代或者基因组编辑可以在体外进行且并不要求有两个植物间杂交的步骤。为此，要进行修饰的植物必需在一方面瞬时转化了编码指定的TALEN或ZFN的核酸，而在另一方面必需转化有外源DNA片段。此种情况的DNA片段可以源自相同物种的植物，并且例如对应于所要取代的染色体区段(但是没有连锁累赘)。在完成诱导同源重组之后，可以将具有修饰的基因组的细胞再生成植物，继而筛选是否已经成功去除连锁累赘以及此前转化的DNA元件在再生细胞分裂期间是否又一次失去。上文描述的标记也可以用于此目的。转化和再生的方法是现有技术中已知的并在下文中有进一步讨论。
另外，现有的TALEN和ZFN也可以在减数分裂期间进行转基因引入，其中在基因组预先选定的位置诱导了双链断裂，因而在交换步骤中在这些位置重组的可能性得到了提高。以此方式，可以显著促进连锁累赘的消除。本领域技术人员知晓，在减数分裂完成后，从单倍体细胞产生了无连锁累赘且无TALEN或ZFN的植物。在另外的方面，本发明涉及用于产生本发明的玉米植物的方法，其包括以下步骤：(A)制备第一玉米植物，其基因组中已经整合了来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述染色体片段包含供体的第一区间，该供体的第一区间呈现出依照表2的单倍型的供体等位基因并且包含在所述玉米植物中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，并且其中所述染色体片段含有供体的第二区间和/或供体的第四区间和/或供体的第五区间，(B)提供第二玉米植物，(C)将得自(A)的玉米植物与得自(B)的玉米植物杂交，以及(D)筛选本发明的玉米植物，优选使用上文所描述的至少一种标记。或者，本发明涉及产生本发明的玉米植物的方法，其包括以下步骤:(A)用第一核苷酸序列(编码第一蛋白)瞬时转化玉米植物细胞，所述第一蛋白具有核酸内切酶活性(例如TALE或ZF核酸内切酶融合蛋白)其能够在玉米植物细胞中诱导标记区M2与M4之间的DNA的双链断裂，以及用第二核苷酸序列(编码第二蛋白)瞬时转化玉米植物细胞，所述第二蛋白具有核酸内切酶活性(例如TALE或ZF核酸内切酶融合蛋白)其能够在玉米植物细胞中诱导标记区M5与M6之间的DNA的双链断裂；(B)将供体载体瞬时引入到所述第一玉米植物细胞中，其携带有来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述染色体片段包含供体的第一区间，该供体的第一区间呈现出依照表2的单倍型的供体等位基因并且包含在所述玉米植物中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，并且其中所述染色体片段还在来自(A)的双链断裂位点之间包含供体Pepitilla的染色体区段，从而在所述第一玉米植物细胞的基因组与供体载体的染色体片段之间会发生同源重组；(C)从所述玉米植物细胞再生玉米植物；(D)鉴别本发明的玉米植物，优选使用上文所描述的至少一种标记。特别优选地，瞬时引入的第一和第二核酸序列以及供体载体继而丢失。本领域技术人员会知晓如何进行并对其进行检测。
在另外的方面，本发明涵盖了上文所描述的标记作为寡核苷酸，特别是引物寡核苷酸。优选地，所述寡核苷酸是分离的寡核苷酸。寡核苷酸包含核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO:41-49、53-100和229-250之一的核苷酸序列。另外，本发明涉及寡核苷酸用于鉴别大斑病长蠕孢抗性玉米植物的用途，所述寡核苷酸包含具有选自SEQ ID NO:17-250之一的核苷酸序列的核酸分子。优选地，所述抗性源自供体Pepitilla并且是HTN1。
另外，本发明的问题可以另外通过转基因植物的手段来解决，特别是转基因玉米植物，其包含上文所描述的转基因植物细胞。另外，本发明还涉及本发明植物的部分，其中的部分可以是细胞、组织、器官或者若干细胞、组织或器官的融合。若干器官融合的实例是花或种子。在特别优选的实施方案中，本发明涉及来自转基因植物的种子，其中所述种子包含本发明的所述多核苷酸作为转基因，如下文所述。优选地，本发明的转基因植物，特别是玉米(Zea mays)物种的植物，呈现出对大斑病长蠕孢的更高的抗性(与相应的非转化植物(无转基因的等基因植物)相比)。本发明的转基因HT抗性植物呈现出对大斑病长蠕孢的提高至少1个分类评分、优选至少2个分类评分或至少3个分类评分、以及特别优选4个分类评分的抗性(参见表3中的分类评分方案)。
另外，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸或本发明所述的载体引入植物细胞的步骤，以及任选存在的筛选转基因植物细胞的步骤。另外，此类型用于产生转基因植物的方法特征在于随后的步骤，该随后的步骤包括从第一步产生的转基因植物细胞再生转基因植物。再生的方法是本领域技术人员从现有技术已知的。
在另外的方面，本发明公开了多核苷酸，其含有一个或多个来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因(表1)、或者选自RLK1和EXT1的抗性赋予基因(参见see表1)或其等位基因。基因或者等位基因可以带来具有HTN1典型特征的抗性表现型(在大斑病长蠕孢侵袭条件下)。结构上，所述多核苷酸特征在于其包含这样的核酸分子，(a)所述核酸分子包含依照SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列，(b)所述核酸分子包含与依照SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的核苷酸序列，优选在该序列的全长上，(c)所述核酸分子在严格条件下与依照(a)或(b)的核酸分子的互补链杂交，(d)所述核酸分子编码多肽，该多肽具有依照SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或者(e)所述核酸分子编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与依照(d)的氨基酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在优选的实施方案中，所述多核苷酸特征在于其包含这样的核酸分子，(aa)所述核酸分子包含依照SEQ ID NO:1或5的核苷酸序列，(bb)所述核酸分子包含与依照SEQ ID NO:1或5的核苷酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性的核苷酸序列，优选在该序列的全长上，(cc)所述核酸分子在严格条件下与依照(aa)或(bb)的核酸分子的互补链杂交，(dd)所述核酸分子编码多肽，该多肽具有依照SEQ ID NO:2或6的氨基酸序列，或者(ee)所述核酸分子编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与依照(dd)的氨基酸序列之一具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选地，所述多核苷酸能够从其天然遗传环境中分离和/或纯化，或者基本上以纯的或同质的形式存在。优选地，所述多核苷酸是DNA，且特别优选是cDNA，也即所述多核苷酸包含来自一个或多个抗性赋予基因的cDNA(表1)。然而，其也可以作为RNA存在。本领域技术人员将会知道如何从本文公开的序列信息推断基因组DNA序列。本发明的多核苷酸编码至少一种多肽，所述多肽能够在表达该多肽的植物中赋予针对病原体大斑病长蠕孢的抗性。优选地，由本发明的多核苷酸或其部分所编码的多肽，优选赋予针对病原体大斑病长蠕孢的抗性，特别是在玉蜀黍(Zea)属的植物中或者在玉米物种的植物中。
另外，本发明还涉及这样的多肽，其能够在其中表达所述多肽的植物中赋予针对大斑病长蠕孢的抗性，并且是由本发明的多核苷酸或其部分所编码。优选地，所述多肽包含依照SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列，或者特别优选地，其包含依照SEQID NO:2或6的核酸序列。所述多肽可以是分离的多肽。
在另外的方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。所述载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或者表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体，其可以是双链或者单链的，线形的或者环状的，或者其可以是原核的或者真核的宿主，是通过整合进入其基因组的或者通过染色体外转化。优选地，所述本发明的多核苷酸可操作地连接至表达载体(具有一个或多个调控序列使得可以在原核或真核宿主细胞中转录以及任选表达。作为实例，所述多核苷酸可以在适宜的启动子或终止子的控制之下。适宜的启动子可以是组成型诱导的启动子(实例:来自“花椰菜花叶病毒”的35S启动子(Odell等1985)；特别事宜的启动子是那些病原体可诱导的启动子(实例:来自西芹的PR1启动子(Rushton等,1996))。特别事宜的病原体可诱导启动子是自然界中不存在的合成或者嵌合启动子，其由若干元件组成并且含有最小启动子，以及在所述最小启动子上游的至少一种顺式调控元件(作为特定转录因子的结合位点)。嵌合启动子是客户定制的并且由各种因子所诱导或者重引导(re-prime)。此类启动子的实例可以在WO 2000/29592和WO 2007/147395中找到。适宜终止子的实例有nos-终止子(Depicker等,1982)。
在上文所述的载体之外，本发明还提供了包括将所描述的载体引入宿主细胞的方法。所述载体的引入可以通过，例如接合(conjugation)、迁移(mobilization)、基因枪转化、土壤杆菌赋予的转化、转染、转导、真空渗入或电穿孔。此类型的方法以及用于制备所述载体的方法是本领域技术人员熟悉的(Sambrook等2001)。
在另外的方面，本发明涉及宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或本发明的载体。在本发明的背景下，宿主细胞可以是原核细胞(例如细菌)或者真核细胞(例如植物细胞或酵母细胞)。优选地，宿主细胞是土壤杆菌(agrobacterium)如根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或者毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，或者是包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的植物细胞。本领域技术人员熟悉许多将本发明的多核苷酸或本发明的载体引入到土壤杆菌中的方法，如接合或电穿孔，以及可以将本发明的多核苷酸或本发明的载体引入到植物细胞的方法如各种转化的方法(基因枪转化、土壤杆菌赋予的转化)(Sambrook等2001)。
在另外的方面，本发明涉及转基因植物细胞，其包含本发明的多核苷酸作为转基因或者包含本发明的载体。此种类型的转基因植物细胞，例如是用本发明的多核苷酸或者用本发明的载体转化了的植物细胞(优选以稳定的方式)。在转基因植物细胞的优选实施方案中，所述多核苷酸可操作地与一个或多个调控序列连接，该调控序列在植物细胞中允许转录以及任选的表达。本发明的多核苷酸和所述调控序列的总构建体就可以构成转基因。此类型调控序列的实例为启动子或终止子。本领域技术人员会熟悉许多可用于植物的功能性启动子和终止子。优选地，本发明的转基因植物细胞，特别是玉米物种植物的细胞，呈现出比相应非转化的植物细胞(没有转基因的所述(等基因)植物细胞)更高的对大斑病长蠕孢的抗性。本发明的HT抗性玉米植物呈现出对大斑病长蠕孢的提高至少1个分类评分，优选至少2个分类评分或者至少3个分类评分，以及特别优选至少4个分类评分的抗性(参见表3中的分类方案)。另外，本发明还涉及用于产生本发明的转基因植物细胞的方法，其包括将本发明的多核苷酸或本发明的载体引入植物细胞的步骤。作为实例，可以通过转化来实现所述引入，优选通过稳定转化。用于引入的适宜的技术如基因枪转化、土壤杆菌赋予的转化或电穿孔是本领域技术人员熟知的(Sambrook等2001)。
在另外的方面，本发明还涉及在植物(优选玉米物种的植物)中赋予或提高针对大斑病长蠕孢的抗性的方法，其包括用本发明的多核苷酸或者用本发明的载体转化植物细胞的步骤。优选地，此方法导致对大斑病长蠕孢的增强至少1个分类评分，优选至少2个分类评分或者至少3个分类评分，以及特别优选至少4个分类评分的抗性(参见表3的分类方案)。
在另外的方面，本发明还涵盖了用于修饰植物(特别是玉米植物)对于病原体大斑病长蠕孢的抗性表现型的方法，其中包括对来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因或者其中所包含的等位基因进行突变的步骤。优选地，所述来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因编码依照SEQ ID NO:2的多肽或者依照SEQ ID NO:2的多肽的同源物(在大斑病长蠕孢侵袭条件下产生具有HTN1典型特征的抗性表现型)。所述来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因或者其等位基因在植物的基因组中可以是转基因的或者是内源的。抗性表现型的修饰可以意味着在病原体小种特异性方面的改变和/或抗性水平方面的改变，其是基于表现型特征如受损的叶表面而测定为分类评分(参见表3)或者是测定为AUDPC值(参见实施例1.C)。优选地，所述抗性表现型修饰之后的抗性水平介于表达非突变的来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的植物的抗性水平和不表达来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因等基因植物的抗性水平之间；然而，其也可以是高于表达非突变的来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的植物的抗性水平。特别优选地，所述抗性水平介于表达依照SEQ ID NO:2的多肽的植物中的抗性水平和不表达依照SEQ ID NO:2的多肽的等基因植物中的抗性水平之间；然而，其也可以是高于表达依照SEQ ID NO:2的多肽的植物中的抗性水平。表述“突变”如本文所用，可以是在遗传序列中所进行的改变(突变)。此方面的实例为，植物、植物细胞或者植物部分接受高剂量的化合物、放射性或其它突变剂并继而筛选突变体。或者，还可以借助例如TILLING核酸酶、TALE核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR/Cas系统来实现突变，或者在DNA序列或氨基酸序列中通过融合、插入、缺失、或更替来实现突变。对于进行突变步骤，本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的指引。优选地，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变导致至少一个氨基酸更替、至少两个氨基酸更替、至少三个氨基酸更替、或至少五个氨基酸更替。在由多个氨基酸更替的情形中，它们可以是在来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的等位基因上进行的，也即所述突变可以是纯合的或者其可以是杂合的。
在用于修饰植物的抗性表现型的方法优选的实施方案中，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变在依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列中导致点突变(在位置1365将碱基G更换为A或者在位置1490将碱基G更换为A)。另外，此实施方案还涉及这样的突变，其在依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列中导致氨基酸更替(在位置455从M(甲硫氨酸)更换为I(异亮氨酸)或者在位置497从G(甘氨酸)更换为E(谷氨酸))。在所述方法更优选的实施方案中，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变导致点突变，其导致在依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列中位置1365和位置1490之间的氨基酸更替，或者所述实施方案涉及这样的突变，该突变导致在依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列中在位置455和位置497之间的氨基酸更替。
在另外的方面，本发明涉及产生具有修饰的抗性表现型(针对病原体大斑病长蠕孢)的植物特别是玉米植物的方法，其包括在所述植物至少一个细胞中或者在再生出所述植物的细胞中对来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因或其等位基因中进行突变的步骤。另外，所述方法因而可以包括这样的步骤：从至少一个突变的细胞再生至少一株植物并基于修饰的抗性表现型(针对病原体大斑病长蠕孢)筛选再生的植物。优选地，所述来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因编码依照SEQ ID NO:2的多肽或依照SEQ ID NO:2的多肽同源物，其在大斑病长蠕孢的侵袭条件下产生具有HTN1典型特征的抗性表现型。所述来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因或者其等位基因可以是转基因地或者内源地存在于植物中。抗性表现型的修饰可意味着在病原体小种特异性方面的改变和/或抗性水平方面的改变，其是基于表现型特征如受损的叶表面而测定为分类评分(参见表3)或者是测定为AUDPC值(参见实施例1.C)。优选地，所述经修饰的抗性表现型的抗性水平介于表达非突变的来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的植物的抗性水平和不表达来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因等基因植物的抗性水平之间；然而，其也可以是高于表达非突变的来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的植物的抗性水平。特别优选地，所述抗性水平介于表达依照SEQ ID NO:2的多肽的植物中的抗性水平和不表达依照SEQ ID NO:2的多肽的等基因植物中的抗性水平之间；然而，其也可以是高于表达依照SEQID NO:2的多肽的植物中的抗性水平。表述“突变”在本文中可以理解为在遗传序列中所进行的改变(突变)。此方面的实例为，植物、植物细胞或者植物部分接受高剂量的化合物、放射性或其它突变剂并继而筛选突变体。或者，还可以借助例如TILLING核酸酶、TALE核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR/Cas系统来实现突变，或者在DNA序列或氨基酸序列中通过融合、插入、缺失、或更替来实现突变。对于进行突变步骤，本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的指引。优选地，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变导致至少一个氨基酸更替、至少两个氨基酸更替、至少三个氨基酸更替、或至少五个氨基酸更替。在由多个氨基酸更替的情形中，它们可以是在来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的等位基因上进行的，也即所述突变可以是纯合的或者其可以是杂合的。
在用于产生具有修饰的抗性表现型(针对病原体大斑病长蠕孢)的植物的方法优选的实施方案中，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变在依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列中导致点突变(在位置1365将碱基G更换为A或者在位置1490将碱基G更换为A)。另外，此实施方案还涉及这样的突变，其在依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列中导致氨基酸更替(在位置455从M(甲硫氨酸)更换为I(异亮氨酸)或者在位置497从G(甘氨酸)更换为E(谷氨酸))。在所述方法更优选的实施方案中，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变导致点突变，其导致在依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列中位置1365和位置1490之间的氨基酸更替，或者所述实施方案涉及这样的突变，该突变导致在依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列中在位置455和位置497之间的氨基酸更替。
本发明还涉及由用于产生具有修饰的抗性表现型(针对病原体大斑病长蠕孢)的植物的方法所产生的植物或者其部分。
另外，本发明涵盖了这样的植物或者其部分，其中包含了在来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因或其等位基因中的突变。优选地，所述突变导致上文所述的经修饰的抗性表现型。优选地，所述来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因编码依照SEQ IDNO:2的多肽或者依照SEQ ID NO:2的多肽同源物，其在大斑病长蠕孢的侵袭条件下产生具有HTN1典型特征的抗性表现型。所述来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因或者其等位基因可以转基因地或者内源地存在于植物中。在所述植物或其部分的优选实施方案中，所述突变是依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列中的点突变(在位置1365将碱基G更换为A或者在位置1490将碱基G更换为A)。另外，此实施方案还涉及这样的突变，其在依照SEQ IDNO:2的氨基酸序列中导致氨基酸更替(在位置1365将碱基G更换为A或者在位置1490将碱基G更换为A)。在所述植物或其部分的更优选实施方案中，来自Pepitilla的HTN1基因座的抗性赋予基因的突变是点突变，其导致在依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列中位置1365和位置1490之间的氨基酸更替，或者所述实施方案涉及这样的突变，该突变导致在依照SEQ IDNO:2的氨基酸序列中在位置455和位置497之间的氨基酸更替。
现在将更详细地解释本申请中所使用的一些术语:
术语“等位基因”是指在基因组中特定位置的一个或两个或更多个核苷酸序列。第一个等位基因在一染色体上，第二个在另一染色体上相同的位置。如果两个等位基因是不同的，则他们是杂合的，而如果他们是相同的则它们是纯合的。基因的各种等位基因(基因等位基因)至少在一个SNP上有差异。根据本说明书的上下文，等位基因也是指单一的SNP，其例如使得可以区分HTN1的供体(Pepitilla)和轮回亲本。
表述“染色体片段”是指特定染色体的特定染色体DNA区段，其包含至少一个基因。整合的染色体片段源自供体来源。在本发明的背景下，整合的染色体片段中基因的前后顺序对应于在供体来源的原始染色体片段中存在的那个序列。以此方式，所整合的染色体片段可以在全长上与供体来源中的相应染色体片段相比没有变化。染色体片段或其部分可以构成特定的“单倍型”，其中所述染色体片段可包含特定的SNP，通过该SNP也可以将所述单倍型清楚地限定和鉴别出来。
术语“远侧”和“近侧”是描述染色体区间或遗传区段在整个染色体相对于特定参照点(例如特定的多核苷酸、另外的染色体区间或基因)的位置；“远侧”是指所述区间或所述区段位于参照点远离染色体着丝点的一侧，而“近侧”是指所述区间或所述区段位于参照点靠近染色体着丝点的一侧。
“紧密偶联”或“紧密连锁”是指两个基因座、两个区间、两个遗传区段或两个标记(标记基因座)彼此之间距离小于15cM、小于12cM、小于10cM、小于8cM、小于7cM、小于6cM、小于5cM、小于4cM、小于3cM、小于2cM、小于1cM、小于0.5cM、小于0.2cM、小于0.1cM，这是通过公开可得自Maize GDB网站的IBM2Neighbors 4基因谱图确立的。
术语“产量”用于本发明的背景是指具有商业价值的特定植物产物的每单位面积生产力。作为实例，玉米的产量通常以每公顷(ha)和每季种子或谷粒的公吨来测量或者是以每公顷(ha)和每季干生物质的公吨来测量。除非另有明确说明，所述产量可以意味着绝对湿物质或干物质、相对湿物质或干物质、青贮产量(也已知为青贮玉米产量或者总干物质产量)或者谷粒产量。所述产量受到遗传和环境因素的影响，并且原则上是许多农学特征的组合，其是基于植物的遗传元件所构建的特征并且在生长季期间为最终产量做贡献。这些个体农学特征的实例有种子萌发、营养性生命力、胁迫耐受性、疾病抗性或耐受性、除草剂抗性、分枝倾向、开花时间、种子团簇(cluster)、种子密度、稳定性和可存储性(storeability)、脱粒能力(均匀成熟)等。
表述具有更精确地指定的区间的“遗传区段”应理解为是指容纳或者包含更精确指定的区间的遗传区段，也即并不局限于所述更精确指定的区间。作为实例，“具有在第八标记区M8(旁侧为标记MA0022和MA0013)中的标记与第六标记区M6(旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196)中的标记之间的第五区间的遗传区段”是指，所述遗传区段包含第五区间并且所述遗传区段位于第八标记区M8(旁侧为标记MA0022和MA0013)中的标记与第六标记区M6(旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196)中的标记之间。
术语“杂交”应理解为是指这样的过程，其中单链的核酸分子与尽可能互补的核酸链聚附(agglomerate)，也即与其碱基配对。用于杂交的标准方法的实例已经在2001由Sambrook等人描述，优选地，这应理解为是指核酸分子的至少60％、更优选至少65％、70％、75％、80％或85％特别优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的碱基与尽可能互补的核酸链进行碱基配对。此种附聚的可能性取决于杂交条件的严格性。术语“严格性”是指杂交条件。高严格性是碱基配对更难的时候，低严格性是碱基配对更简单的时候。杂交条件的严格性取决于，例如盐浓度或离子强度和温度。一般来说，可以通过提高温度和/或通过降低盐含量来提高严格性。术语“严格的杂交条件”应理解为是指这样的条件，在该条件下杂交主要仅在同源核酸分子之间发生。术语“杂交条件”在此方面不仅仅是指核酸的实际附聚过程中占优势的实际条件，还是指随后的洗涤步骤中占优势的条件。严格杂交条件的实例为，在该条件下主要仅有那些具有至少70％、优选至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列相同性的核酸分子才进行杂交。严格杂交条件例如是:于65℃ 4x SSC以及随后在65℃ 0.1x SSC多次洗涤大约1小时。术语“严格杂交条件”如本文所用可以指:于68℃在0.25M磷酸钠、pH7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时并随后用2x SSC和0.1％SDS于68℃洗涤两次。优选地，杂交在严格条件下进行。
术语“区间(interval)”或“染色体区间”是指基因组DNA上连续的线性区段，其通常存在于植物中的个体染色体中或者在染色体片段上，并且其通常由代表区间在远侧和近侧端点的两个标记所限定。在此方面，限定区间末端的标记其本身也可是所述区间的一部分。另外，两个不同的区间可重叠。在本说明书中，区间由表述“在标记A和标记B之间”来限定。区间的末端标记也可以位于区间一边的给定标记区内。继而可以通过提供两个旁侧的标记来限定标记区，并构成染色体区段(其上面在所述旁侧标记之外还可以有更多的标记)。旁侧标记确定标记区的端点且它们本身依然是标记区的一部分。如果区间两端的标记是区间两边不同标记区中的标记，则本说明书中通过如下来限定区间“在旁侧为标记C和D的标记区X中的标记与旁侧为标记E和F的标记区Y中的标记之间”。标记区可以长达500 000碱基对(bp)，且优选大小在100 000至400 000bp之间，或者特别优选大小可以在140 000至315 000bp之间。
术语“渐渗(introgression)”如本发明所用是指遗传背景的遗传基因座上至少一个期望的等位基因转移至另一个。作为实例，特定基因座处期望的等位基因的渐渗可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交来转移给后代。或者，例如，等位基因的转移也可以通过在融合的原生质中两个供体基因组之间的重组来发生，其中至少一个供体原生质在其基因组中携带有所期望的等位基因。在每种情形中，所述后代(其包含所期望的等位基因)可以再与包含优选遗传背景的品系回交并用于筛选期望的等位基因。结果是将期望的等位基因固定在选定的遗传背景中。
术语“分离的核酸分子”或“分离多核苷酸”应理解为是指将核酸分子或多核苷酸从其天然或者原始环境中移出。该术语还涵盖了合成产生的核酸分子。“分离的多肽”应理解为是指已经从其天然或者原始环境中移出的多肽。该术语还涵盖了合成产生的多肽。
术语“病原体感染”应理解为是指病原体与植物宿主组织相互作用的最早时间。在真菌如子囊菌(ascomycete)或卵菌(oomycete)中的实例为菌丝的生长或者特定感染结构如穿透菌丝和附着胞的形成。详细来说，可以使用各种染色技术来研究大斑病长蠕孢的感染(例如锥虫蓝)(Chung等,BMC Plant Biology 10(2010),103；Walsh等(2008),Posterpresentation P192，50th Maize Genetics Conference in Washington D.C.)。
“供体Pepitilla”、“Pepitilla种质”或“Pepitilla”是指，在地方品种Pepitilla本身之外，其它的玉米基因型，其基因组中(特别是染色体8bin 5或6)已经插入了HTN1抗性基因座的渐渗(优选是来自Pepitilla)。这些的实例有W22Htn(例如Bar-Zur等1998)、H6314Htn(例如Bar-Zur等1998)、B73HtN(例如Shimoni等,Journal of Phytopathology131:4(1991),315-321)、B68HtN和A632HtN(例如Carson,Plant Disease 79(1995),717-720)和A619HtN(例如等,Genetika 39:2(2007)，227-240)。另外，Pepitilla包括任何来源的抗性，其在渐渗到易受感染的玉米品系/玉米植物中之后会赋予具有HTN1典型特征的抗性表现型。这些HTN1特异性特征的实例有孢子形成的延迟发生、减少的病斑发展、发展更小的病斑、减小的孢子形成区和/或没有或者仅有隔离的褪绿坏死病斑。
“基因座”是染色体上发现抑或多个基因(其引起或影响农学特征)的位置。具体而言，“基因座”如本文所用是指HTN1-抗性基因座，其赋予针对病原体大斑病长蠕孢(或至少大斑病长蠕孢的一种)的抗性。
“玉米植物”应理解为是指来自玉米物种以及其亚物种的植物，例如，栽培玉米亚种(Zea mays ssp.Mays)、墨西哥类玉米亚种(Zea mays ssp.Mexicana)或者小颖类玉米亚种(Zea mays ssp.parviglumis)。
“标记”是用作参照或者定位点的核苷酸序列。用于识别重组事件的标记应当适宜用于监测植物群体中的差异或多态性。对于标记，这些差异是在DNA水平的，例如，是多核苷酸序列序列差异，如SSR(简单序列重复)、RFLP(限制片段长度多态性)、FLP(片段长度多态性)或者SNP(单核苷酸多态性)。所述标记可以源自基因组或者表达的核酸如经剪接的RNA、cDNA或EST，并且可以是基于用作探针或引物对的核酸，因而适宜于用基于PCR的方法来扩增序列片段。可以使用现有技术中已知的方法来检测涉及群体中不同部分之间遗传多态性的标记(An Introduction to Genetic Analysis.7th Edition,Griffiths,Miller,Suzuki等,2000)。这些包括例如：DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增、RFLP的测定、多核苷酸多态性的测定(使用等位基因特异性杂交(ASH))、检测SSR、SNP或AFLP。用于检测EST(表达序列标签)和RAPD(随机扩增多态性DNA)的方法也是已知的。根据上下文，说明书中的术语“标记”也可以是指物种基因组中可以发现特定标记(例如SNP)的特定染色体位置。可以使用此类型的标记位置，以便监测偶联基因座的存在，例如有助于特定表现型特征(例如HTN1或连锁累赘)的表达的偶联基因座。作为实例，所述标记基因座还可以用于观测基因座处等位基因的隔离(QTL或个体基因)，所述基因座遗传上或者物理上与标记部分紧密偶联。
“可操作的连接”是指在普通核酸分子中连接的方式，从而所连接的元件相对于彼此之间的位置和取向使得核酸分子的转录可以发生。与启动子可操作地连接的DNA处于此启动子的转录控制之下。
植物“器官”的实例有叶、植物茎、茎、根、营养性芽、分生组织、胚、花药、胚珠或果实。植物“部分”是指若干器官的融合，例如花或种子或器官的一部分，例如来自茎的横切段。植物“组织”的实例有愈伤组织、软组织、分生组织、叶组织、芽组织、根组织、植物肿瘤组织和繁殖组织。术语“细胞”应理解为是指例如具有细胞壁的分离的植物细胞或其聚集物(aggregate)或原生质体。
在本发明的背景下，除非另有表述，“植物”可以是双子叶、单子叶或裸子植物的任何物种。优选地，所述植物是单子叶植物并且有农业或园艺兴趣或者可用于产生生物能(生物乙醇、生物气等)。实例有棉属(Gossypium sp.)、玉米、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、小麦属(Triticum sp.)、大麦(Hordeum vulgare)、稻(Oryza sativa)、高粱属(Sorghum sp.)、芭蕉属(Musa sp.)、甘蔗(Saccharum officinarum)、黑麦(Secalecereale)、燕麦属(Avena sp.)、草坪草和饲料草。本发明优选的植物是来自玉蜀黍属的植物，特别是物种玉米，或者高粱。
与本发明相关联，术语“调控序列”是指影响表达特异性和/或强度的核苷酸序列，例如调控序列赋予特定的组织特异性。此类型的调控序列可位于最小启动子的转录起始点的上游，但也可以位于其下游，例如在转录的但却不翻译的前导序列中或者在内含子内。
针对病原体的表述“抗性”或“抗性的”应理解为是指植物或植物细胞抵抗病原体的破坏作用并从延迟疾病发展延伸至对疾病发展的完全阻抑的能力。与本发明相关联，植物/植物细胞是抗性的或者植物/植物细胞具有对病原体大斑病长蠕孢(大斑病长蠕孢或HT)的抗性，也即对叶疾病玉米大斑病(NCLB)有抗性。所述抗性是由一或多种蛋白所赋予的，所述蛋白是由来自Pepitilla种质的基因或多个基因(抗性赋予基因)所编码的。所述抗性可以是完全的或者是部分的并且可以对病原体小种是特异性的或者非特异性的。在病原体小种特异性抗性的情况中，大斑病长蠕孢的毒性小种可以例如，包括N、1N、2N、23N或123N；所述毒性小种可以，例如包括0、1、2、3、12、23或123。赋予的抗性可以是新遗传的抗性或者是已经存在的部分抗性的提升。
“转基因植物”是这样的植物，其基因组中已经整合了至少1个多核苷酸，优选是异源多核苷酸。优选地，所述多核苷酸已经以稳定的方式被整合，这意味着所整合的多核苷酸在植物中保持稳定、进行表达并且还可以稳定遗传至后代。将多核苷酸稳定引入至植物的基因组还包括整合至此前的亲代植物的基因组，其中所述多核苷酸可以稳定的方式进一步遗传。术语“异源”意思是，所引入的多核苷酸，源自例如具有相同物种的另一种遗传背景的细胞或者生物体或源自另一物种，或者是与原核的或真核的宿主细胞同源，但是却位于遗传环境中并因而与任何可能的相应天然发生的多核苷酸不同。在相应的内源基因之外还可以存在异源多核苷酸。
附图简述
本发明的实施方案和变化将参照所附的图和序列来进行描述，其中：
图1:在RP1x RP1HTN1杂交的528株F2个体中使用8个标记计算的在染色体8上23.11cM的QTL区。黑色柱(HtN)显示置信区间。标记的位置以cM计。
图2:在德国的五个地点一式两份的进行的青贮产量测试，其中使用轮回亲本RP3和来自B37HTN1的供体片段的A版本(RP3HTNA)以及来自B37HTN1的供体片段的K版本(RP3HTNK)。柱显示出使用t检验的显著差异，其中p＝0.05。
图3:标记区M1至M6的描述，它们定义了染色体区间(Int.1至Int.5)，所述染色体区间呈现出在渐渗品系中的抗性赋予多核苷酸并在源自供体的染色体片段中携带有连锁累赘。供体的染色体区段(Pepitilla显示为虚线区域，轮回亲本(无连锁累赘)的那些显示为斜条纹。区间1(Int.1)涵盖抗性基因座HTN1，区间2(Int.2)涵盖了在供体中对开花时间连锁累赘负责的序列区域，区间4和5(Int.4和Int.5)涵盖了涵盖了在供体中对青贮产量连锁累赘负责的序列区域。
图4:BAC重叠群，在其RP4HTN1BAC库上，具有相应的序列框架和基因标注。候选基因在方框中显示。黑色箭头代表进一步标注的基因(其不是HTN抗性的候选基因)。
实施例
1.表现型分型实验
A)进行田间试验以确定在天然和人工接种/感染条件下的HT抗性和开花时间：
在一个地点，每种要研究的玉米基因型至少20株个体被种植成一排。进行了天然或人工的接种。使用天然发生的大斑病长蠕孢的孢子进行了天然的接种/感染。使用感染的和碎的叶材料施用于要测试的植物从而进行了人工接种/感染。后者类型的接种使得可以在不同的测试年份和在不同的地点独立于该处占优势的天然侵袭条件而模拟出相当的大斑病长蠕孢侵袭。从供体B37HTN1培养易受感染的亲本和具有HTN1渐渗的亲本作为对照基因型(取决于测试杂交群体)。HT抗性特征的分类评分在营养生长期至少记录三次。仅使用了表3中所示的分类评分方案。
作为HT抗性来源的供体B37HTN1与来自良种品系(具有对大斑病长蠕孢不同水平的易感性)的各种遗传背景杂交，并开发了近等基因品系(其与易受感染的原始品系的不同基本上仅在于来自B37HTN1的渐渗)。在表现型分型实验中，上文所述的人工接种之后，通过引入来自B37HTN1的抗性赋予渐渗，而筛选了在HT抗性呈现出改良至少2-3(优选3-4)个分类评分的品系。本发明将在下文通过实例的方式更详细地描述(使用两个筛选的轮回亲本RP1和RP3)。所描述的表现型分型实验的结果总结在表5中。无渐渗的轮回亲本RP1呈现出7-9个平均分类评分，其通过来自B37HTN1的渐渗而改善了3-4个分类评分。轮回亲本RP3在无渐渗时呈现出4-6个分类评分，而通过渐渗改善了2-3个分类评分。轮回亲本RP4在无渐渗时呈现出6个分类评分，而通过渐渗改善了2-3个分类评分。
表5:基因型RP1、RP3、和RP4在有和没有来自B37HTN1的渐渗赋予的抗性时的HT抗性的表现型分型数据(分类评分根据表3中的方案确定)。
在HT抗性之外，对于每种基因型，将雄性和雌性的开花时间确定为“播种后天数”。雌性开花时间由出须(silk emergence)来确定；雄性的开花时间由圆锥花序的出现来确定。结果在实施例3.B中更详细的显示。
B)进行田间试验以确定谷粒和青贮产量：
在上述关于HT抗性和开花时间的数据之外，确定了含有不同长度的来自B37HTN1或Pepitilla的抗性赋予渐渗片段的RP3的产量数据以及相当的良种品系的产量数据。品系RP3、RP3HTNA和RP3HTNK用互补基因池(硬质玉米)的测验种(tester)授粉(硬质玉米，池间单交)以便产生用于测试杂交株的种子储备。这些测试杂交株每个一式双份在德国玉米作物的五个代表性地点于田间试验中生长。所述测试杂交株在成熟方面很适宜于这些生长区域。所述田间试验一式两份进行，在4排的地块长度6m且排间隔0.75m。在第一份中密度为每m2 9株植物而在第二份中为每m2 11株植物。在收获青贮玉米的时间，每个地块仅收获中间两排以便使竞争效应最小化。确定了所收获材料的每个地块的重量以及水含量，以便计算青贮玉米产量(也已知为青贮产量或者总干物质产量)和干物质含量(总干物质含量)。
C)进行温室试验以确定HT抗性：
每个基因型在盆中种植20株个体。对照是具有来自B37HTN1的抗性赋予渐渗的易受感染的亲本和近等基因亲本(NIL)的基因型(取决于杂交)。播种后14天，进行了人工感染(参见上文)。又过了2-3周之后，发展出了第一个疾病症状。从第一个症状出现的时间开始，每隔一天确定了HT抗性特征的分类评分以及有症状的植物的数目。由此，确定了AUDPC(疾病进展曲线下面积)。侵袭频率(为％/时间×周期)被用于将研究的植物进行归类；本文中，0–100的AUDPC是有抗性的、101–450是杂合的、而>450是易受感染的。
2.用于HTN1-靶标-区域的标记开发
在分类评分测试之外，还将许多基因型中染色体8(bin 8.06)上HTN1抗性基因座周围的靶标区域进行了更详细的检验，并使用新型的和/或最优化的分子标记进行精细地定位。本文中所用的分子标记是在单核苷酸多态性(SNP)或已经公开可用的简单序列重复标记(SSR)的基础上开发的：
来自用作标记的基因型的DNA是使用NucleoSpin 96Plant II方法依照厂商指引分离的(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG,Germany)或者使用Klear Gene DNA Extraction384方法分离的(LGC Genomics GmbH,Germany)。
用于SSR标记的引物序列是从公共数据库National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)已知的http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists；用于标记bnlg1782、umc1960、bnlg240、umc1121、bnlg1067和umc1287的引物序列，其用于检验靶标区域，在表6中总结(与所做的修饰一起)。
表6:用于SSR标记的引物序列(NED:2’-氯-5’-氟-7’,8’-融合的苯基-1.4-二氯-6-羧基荧光素；FAM:6-羧基荧光素；M13:噬菌体M13的核心序列)
bnlg1782、umc1960、bnlg240、umc1121和bnlg1067的PCR反应混合物的体积是10μl并且由以下所构成：单一浓度的4x缓冲液B(Solis BioDyne,Estonia)、0.5pmol的正向引物、0.5pmol的反向引物、10-30ng的DNA、0.25单位的HotFirepol TAQ-聚合酶(SolisBioDyne,Estonia)。umc1287的反应混合物体积为10μl并且由以下所构成：单一浓度的4x缓冲液B(Solis BioDyne，Estonia)、0.5pmol的正向引物、2,5pmol的反向引物、0.3pmol的额外引物M13、10-30ng的DNA、0.25单位的HotFirepol TAQ-聚合酶(Solis BioDyne，Estonia)。
PCR反应如下进行：900秒94℃的初始变性期，25-40个循环的15秒94℃、30秒50-55℃和120秒72℃的扩增循环，以及300秒72℃的最终步骤。接着，PCR反应在65℃温育2h。在ABI3730xl(Life TechnologiesTM,USA)上依照厂商分离50-400bp片段的指引而将PCR产物进行分离。
所述SNP标记是通过如下而开发和使用的：(a)从公开可用的来源、(b)从相当的扩增子序列或者(c)从来自RP4HTN1的BAC序列(参见分子分析部分)与B73参考基因组AGPv02(www.maizesequence.org)的序列比较。
(a)从公开可用的SNP来源Maize Community 50K-Illumina-Chip(Ganal等,2011)将SNP转化至KASP标记中(LGC Genomics GmbH，Germany)。为此，开发了新的引物，其确保了KASP标记测定中决定性等位基因的扩增(参见表4)。使用KrakenTM软件(LGC GenomicsGmbH，Germany)来进行整个操作。对于KASP标记测定，使用了用于1536平板的的5-20ng的DNA、0.02μl的寡测定混合物(12μM引物等位基因1(正向)；12μM的引物等位基因2(正向)；30μM的反向引物)和1.5μl的1xKASPar Reagent Kit。标准的PCR设置包括94℃进行15min，10个循环的94℃进行20秒、61-55℃降温进行1分钟，26循环的94℃进行20秒和55℃进行1分钟。使用KrakenTM软件(LGC Genomics GmbH，Germany)对每个基因型的等位基因进行了评估。
(b)用Sanger测序来对所述相当的扩增子进行测序。所述相当的序列中的基因型每个都包括供体B37HTN1以及B37、RP1、RP1HTN1、RP3、RP3HTN1(版本A、B、K)、RP4、RP4HTN1。使用CTAB方法从研碎的谷粒分离DNA(Maniatis等,1982)。用于扩增子测序的引物序列在表4中列出。用于扩增相应区域的标准的PCR方案包括在94℃变性5分钟，35循环的94℃进行1分钟、60℃进行1分钟和72℃进行2分钟，以及随后的72℃进行10分钟的步骤。用Sanger测序来对PCR产物进行测序(Sanger&Coulson,1975)。使用DNAStar Lasergene软件(DNASTARInc.,USA)来进行序列评估。如(a)中所述将检测到的多态性转化至KASP标记。
(c)使用Blast算法(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将BAC序列重叠群与B73参考基因组AGPv02进行比对以便检测单核苷酸多态性(SNP)。使用Lasergene软件(DNASTAR Inc.,USA)检测了多态性并与旁侧序列一起在表4中显示。开发了用于SNP的旁侧序列的引物并如(a)中所述将鉴别的SNP转化至KASP标记。
3.使用SSR标记定位HTN1抗性基因座在染色体8上
A)HTN1抗性基因座的定位：
如实施例1.A)中所述将来自B37HTN1供体的HTN1抗性基因座杂交至良种品系中，并借助来自实施例2的SSR和SNP标记定位在染色体8(bin8.06)上(参见图1)。将来自杂交株RP1x RP1HTN1和RP3x RP3HTN1的NIL在两个地点进行了几年的表现型确定(一式两份，在天然感染条件下，使用表3的分类评分方案)。所述NIL平均显示出了与原始品系相比改善了4个分类评分的抗性反应。叶上局部病斑的发展与易受感染的基因型相比推移了大约两周。使用528株F2个体(RP1x RP1HTN1杂交株)以及用8个标记(表4和6来自图1的QTL描绘标记)进行了QTL的定位。涵盖了HTN1抗性基因座的QTL区域定位于染色体8上标记MA0002和umc1287之间，23.1cM的区域。
B)将B37HTN1供体片段杂交至良种玉米品系并鉴别和消除延迟开花时间的连锁累赘：
供体B37HTN1与KWS.elite(来自KWS SAAT AG(Germany)的良种品系)杂交，并继而与KWS.elite回交5代。在每个回交代中，使用分子标记以筛选出HTN靶标区域杂合的植物。接着，从第5代回交中筛选的植物自体受精并用分子标记鉴别出HTN靶标区域纯合的植物。
在若干个地点的田间试验对这些品系进行了测试。在此方面，对于基因型B37HTN1、KWS.elite和KWS.elite.B37HTN1，如实施例1中所述确定了HT抗性和开花时间的表现型数据。具有HTN1渐渗的基因型呈现出预期的HT抗性(分类评分1-3)，而原始品系KWS.elite呈现出5-7的分类评分。另外，出乎意料地，与KWS.elite相比，所述KWS.elite.B37HTN1呈现出推移了至少2天的开花时间(雄性和雌性花都是如此)。这些推移的开花时间构成了玉米基于连锁累赘的负面农学特征，在来自B37HTN1的HT抗性的渐渗后还未有描述此种形式。标记分析发现了造成开花时间延迟的连锁累赘的位置，在来自B37HTN1的渐渗上两个标记区之间的区域(M1和M2之间)。在此方面，所述基因型B37HTN1、KWS.elite和KWS.elite.B37HTN1是用，例如KASP标记SYN14136、PZE-108076510、SYN24931和PZE-108077560进行了分析(参见图3和表4)。SYN14136和PZE-108076510用于标记区M1的特异性检测，SYN24931和PZE-108077560用于区域M2的特异性检测。基于此，标记区M1位于连锁累赘的基因座的5’侧而标记区M2在其3’侧。标记分析显示了B37HTN1和KWS.elite.B37HTN1(开花均延迟了2天)对于区域M1和M2以及这些区域之间的区间呈现出共同的等位基因，而KWS.elite有正常的开花时间并且对于区域M1和M2以及它们之间的区间具有其它的等位基因。
供体B37HTN1与RP3杂交并继而与RP3回交三代。在每代回交中使用了分子标记。初始，筛选出了对于HTN1靶标区是杂合的植物，继而使用均匀分布在基因组的标记研究了这些植物以便针对供体基因组进行筛选。接着，从第三代回交筛选的植物进行自体受精并用分子标记鉴别出HTN1靶标区纯合的植物。
另外，所述供体B37HTN1还与轮回亲本RP3和RP4杂交，并且经过若干回交步骤产生了RP3HTNA和RP4HTNA品系。对HT抗性的表现型确定显示出5-7的分类评分改善(对于原始品系RP3)至1-3的分类评分改善(对于RP3HTNA)，以及6分类评分改善(对于原始品系RP4)至2-3的分类评分改善(对于RP4HTNA)。对开花时间的表现型分型呈现出对于RP3和RP3HTNA以及RP4和RP4HTNA相当的开花时间。使用KASP标记SYN14136、PZE-108076510、SYN24931和PZE-108077560，显示出RP3和RP3HTNA对于区域M1和M2携带共同的等位基因。这些并未对应于供体B37HTN1。结果，来自B37HTN1的渐渗中的开花时间延迟的染色体区段位于标记区M1和M2之间的染色体区间。对于品系RP3HTNA，此连锁累赘则已成功去除。所使用的KASP标记，SYN14136、PZE-108076510、SYN24931和PZE-108077560，已被证明是“辅助筛选”的有效工具。
RP3和RP3HTNA的表现型分型还包括记录谷粒和青贮产量。虽然基因型的谷粒产量并无显著差异，但是RP3HTNA青贮产量特征呈现出明确的、统计学显著的降低(至少每公顷14分吨(dt/ha)相较于RP3，或者说超过5％的降低)。
借助于设计的KASP标记SYN14136、PZE-108076510、SYN24931和PZE-108077560，可以从B37HTN1和轮回亲本RP1的杂交中筛选出RP1HTN1品系，其未呈现出任何更多的开花时间延迟连锁累赘，但是呈现出青贮产量降低，如RP3HTNA所观察到的那样。为了进行更精确地分子表征，进一步开发了RP1HTN1，并用来自RP1x RP1HTN1杂交的724株个体设立了F2群体。接着，将F3代进行自体受精并且筛选出的F4植物进行了基因型确定和表现型确定。在检测出的23.1cM的QTL区域中用表6的标记进行了基因型分型。表现型分型在若干地点一式两份进行(参见实施例1)。筛选了QTL区重组的植物并与表现型数据进行了关联。该筛选包括了涵盖靶标区域不同区的植物以及杂合植物，目的在于获得新的重组植物。每年，与RP1进行了两次回交并筛选了个体植物，并由此产生了新的重组体。在田间和温室测试中对新的重组体进行了表现型分型(参见1.)以及基因型分型，用以开发新的分子标记(依照2)。
在RP3HTNA基因型使用这些新的标记使得可以鉴别标记区M3，其将渐渗限制在5’区并且可以用旁侧标记PZE-108093423和PZE-108093748来描述。在此方面，PZE-108093423应该呈现出轮回亲本RP3的等位基因以及PZE-108093748应呈现出供体B37HTN1的等位基因。在3’区域，描述了另一标记区M6中由标记PZE-108107671和SYN4196the的RP3HTNA渐渗(参见图3)。在此方面，PZE-108107671携带有供体B37HTN1的等位基因，而SYN4196携带有轮回亲本RP3的等位基因。来自RP3HTNA的渐渗(下文称作版本A)对应于(在标记区M3和M6之间)供体B37HTN1，但是在此区域外其对应于轮回亲本或者其它品系(其在供体B37HTN1的M1和M2之间不携带有等位基因)。将此版本A引入各种其它遗传背景并进行了新的田间测试、抗性表现型确定和开花时间确定。结果与RP3HTNA中所描述的相当。因而，开花时间与没有渐渗的相应品系相比没有推移，并且该品系呈现出与原始品系相比改善了的针对大斑病长蠕孢的抗性，或者至少是青贮产量的降低。
C)鉴别并消除减少青贮产量的连锁累赘：
所使用的供体是RP3HTNA品系。其与RP3杂交并再自交6代。在每代的自交中，在靶标区域使用分子标记以便减少供体片段。由于靶标区域之外的所有基因组区域已经在RP3HTNA品系中于RP3基因组上进行了筛选，仅仅使用标记研究了HTN靶标区域周围的区域。在此方面，对于减少的HTN靶标区域鉴别了纯合植物。同时，在靶标区域进行了密集的标记开发。在许多其它品系之外，鉴别了RP3HTNK品系，其描述了来自标记区M4(旁侧为标记MA0004和MA0005)的B37HTN1供体片段，其中在RP3HTNK中MA0004描述了轮回亲本RP3的等位基因而MA0005描述了供体B37HTN1的等位基因，乃至标记区M5(旁侧为标记MA0006和PZE-108097482)，其中MA0006描述了供体B37HTN1的等位基因而PZE-108097482描述了轮回亲本RP3的等位基因。在RP3HTNK，来自RP3HTNK的渐渗(下文称作版本K)引起了与RP3相比3-4分类评分的改善的HTN1抗性，与原始品系RP3相同的开花时间(开花未延迟)并且青贮产量中没有进一步降低(参见图2)。另外，借助于上述的标记，可以通过杂交从原始品系RP1产生无连锁累赘的品系，该品系呈现出渐渗的版本K。
D)来自B37HTN1或来自Pepitilla的抗性赋予单倍型
版本K具有来自B37HTN1或来自Pepitilla的单倍型，其携带有表4中所述的供体等位基因(位于相对于B73AGPv02的以bp计的物理位置)。作为实例，将描述位于标记MA0008的单倍型：使用标记MA0008并明确B37HTN1、RP3、RP3HTNA、RP3HTNK的等位基因，则等位基因“T”用于B37HTN1、RP3HTNA、RP3HTNK而等位基因“C”则用于RP3。对于此基因座，此标记还区分可能的HTN1抗性来源PH99N(WO2011/163590)，其也在此位置含有等位基因“C”，来自本文所使用的抗性来源。
4.精细定位区域的分子分析
另外，在分子水平上研究了已经被渐渗插入和截短的染色体片段。来自Pepitilla种质的抗性基因座Htn1因而被缩小至至一个独特的靶标区，700kb的染色体区间，并在基因型RP4HTN1中测序。如将要更详细地讨论的那样，分离了来自RP4HTN1的BAC克隆，将其进行了测序并组装至序列框架内。该序列框架进行了标注并且此区间中经标注的基因针对EST/cDNA序列信息设定。从多种经标注的基因进行了差异表达研究以鉴别出候选基因(参见表1)。
A)BAC库和池构建，BAC库筛选，BAC测序
从基因型RP4HTN1产生了BAC库。此后从叶材料以及通过筛选3D矩阵池构建了BAC库和3D矩阵池。用于筛选3D矩阵池的引物基于B73AGPv01序列(染色体8上从149957158bp至152977351bp)(www.maizesequence.org)以及引物程序3(http://simgene.com/primer3；Rozen&Skaletsky，2000)。引物筛选的参数为：平均GC含量50％、引物长度20-25bp、解链温度在70-90℃之间以及扩增子长度在70-80bp之间。使用表7中的引物对，通过RT-PCR筛选了3D池。提供了用于BAC克隆的两个参数的值，也即解链温度CP值。对于所筛选的区域可以鉴别出26个BAC克隆。所有BAC克隆分离子BAC库并用作大肠杆菌(E.coli)培养用以对DNA进行分离和测序。使用标准的GS-FLX Titanium试剂盒(454Life Sciences，USA)进行了测序。对于BAC克隆144N24、119F13、219G11、86N21、16B06、84L18、128D02、25M23、96H10、19J24、136A01、75H06、135F07所获得的序列信息在表8中总结。
表7:用于从RP4HTN BAC库检测BAC克隆的引物对
表8:13个经分析的BAC克隆的序列内容
B)BAC序列组装、标注和候选基因筛选：
序列框架的产生：使用454技术对BAC克隆144N24、119F13、219G11、86N21、16B06、84L18、128D02、25M23、19J24、96H10、136A01、75H06、137F07进行了测序(Margulies等,2005)。
使用“Newbler”软件(454Run Assembly软件，软件版本2.3)进行了BAC克隆的原序列的自动组装。以此方式产生的原BAC序列重叠群通过人工分析正确安置，其中应用了以下技术：
1.重叠BAC的序列可以大致分为重叠区和非重叠区。
2.在重叠区中将来自各个重叠BAC的序列重叠群进行了比较。大约20％的序列重叠群可以此方式安置并且它们之间的缺口可以被关闭(例如当一个BAC的重叠群涵盖其它BAC的重叠群或与其它BAC的重叠群连接时)。
3.所有的序列重叠群被手动标注。在此方面，初始仅标注了重复元件(转座子和逆转座子，缩写为“TE”)。由于序列缺口主要在TE中发生，所以对TE的标注有助于正确地安置序列重叠群。这意味着当TE的一个末端在一个序列重叠群上而另一末端在另一个上时，两个重叠群可以适当地排序。在此类情况中，100N的序列被分别插入以便填充序列重叠群之间的缺口。另外，使用了来自嵌套的TE(也即已经插入到其它TE中的TE)的信息以便安置序列重叠群。
4.在一些区域中，来自重叠BAC的信息和TE标注都无法使用(例如，在仅被一个BAC所涵盖的区域中就是这种情况)。本文中，序列重叠群任意安置并且用200N的序列来填充它们之间的缺口。
5.玉米基因组中的许多TE是“长末端重复序列”(LTR)逆转座子，其旁侧为长(1-2kb)LTR序列。这些LTR可以是高达100％相同的。那么在一些情况中，将两个LTR的原序列组装至共有序列中(也即LTR的一个拷贝没有出现在组装物中)。在这些情况中，序列缺口由这样数目的N填充，所述数目N可对应于第二个LTR的长度。
6.手动标注基因。为此，公开的B73玉米基因组的编码序列(CDS)被用作参照(http://www.maizegdb.org/gene_model.php)。使用DotPlot(http://www.dotplot.org/)将CDS与RP4HTN序列比对，并确定了内含子和外显子的位置。一方面通过描述其功能(如果公开已知)来确定候选基因。另一方面，将抗性RP4HTN的CDS与易受感染的B73AGPv02比较。如果出现差异，则相应基因被置入候选列表。所制备的序列具有1'328'253bp的长度。候选基因的列表在表1中给出。
5.候选基因的分子分析：
表达分析:各种候选基因的表达测试在21天龄(播种后)、未感染的植物中(感染天数＝0dpi)进行，以及在36天龄已经感染的植物和未感染大斑病长蠕孢的植物(感染后15＝15dpi inf/ni)中进行。
从测试玉米植物的第二片叶取RNA，逆转录成cDNA并使用qPCR测量了其表达。在每种情况中，收获第二片叶、冷冻并提取RNA、定量并测试质量和纯度(使用SV Total RNAIsolation System Kit(Z3100；Promega，Dübendorf，Switzerland))，完全按照(Brunner等,2011；Risk等,2012)中所述。
使用iScript RT Supermix(170-8841；Bio-Rad，Cressier，Switzerland)依照厂商指引，在20μl的反应体积中将1μg的RNA逆转录。为了排除基因组DNA污染的可能(RT减)，同时对每个样品温育了没有添加逆转录酶的反应。
在10μl的反应体积中，在C1000 Touch Cycler(Bio-Rad，Switzerland)中，技术上一式三份或一式两份的进行了定量实时PCR(RT-qPCR)，并且其中添加了4μl的1:10稀释的(10mM Tris HCL pH8，0.1mM EDTA)cDNA，5ul的SsoFastSupermix(172-5201；Bio-Rad，Switzerland)和400nM的引物浓度。为了扩增，使用了如下程序：95℃进行30秒，随后是40个循环的95℃进行3秒、在再60-63℃(参见表2)进行5秒。为分析解链曲线(排除引物二聚体)，以0.5℃的步骤将PCR产物从65℃加热至95℃。在CFX Manager V 3.0(Bio-Rad，Switzerland)程序中检查了扩增曲线和解链曲线，并将Cq值(定量循环)输出至qbasePLUSV 2.3(Biogazelle，Zwijnaarde，Belgium)程序以确定相对表达。
用于候选基因的引物借助于primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)而确定，以便尽可能地排除对已知转录物的非特异性扩增。为了评估适宜的扩增子，使用琼脂糖凝胶电泳来分离PCR产物并且使用分离的条带来检验其大小。另外，对表1中所列的来自RP1HtN以及NILHtN的扩增子进行了测序。为了将表达数据归一化，使用了1-3个参照基因(LUG、MEP、FPGS)(Manoli等,2012)。
所有的候选基因都在易受感染的基因型RP1和抗性基因型RP1HTN中表达。可以证明RLK1在RP1和RP1HTN之间的差异表达。在易受感染的植物中RLK1的表达比抗性植物中高4倍。
表9:用于候选基因的引物对，以bp计的其扩增子长度以及适宜的退火温度。
TILLING群体筛选和突变体的检测：对于候选基因(表1)，进行了10000株植物的TILLING群体的筛选，所述植物在染色体8(在151688552-153139596bp的区域，相较于B73参照AGPv02(www.maizesequence.org)(RP3HTN1))上携带有来自Pepitilla的渐渗，并且其呈现出针对大斑病长蠕孢的抗性。突变可以是沉默核苷酸更换、氨基酸更换或者终止密码子并且用于检测候选基因的功能。
转化：候选基因可以，例如，通过根瘤土壤杆菌-赋予的转化的手段而被引入到易受感染的基因型A188。此基因型特征在于GWH-测试(n＝18植物)中702的AUDPC值，从而用抗性基因的转化产生了清楚的抗性应答。
6.小种特异性的确定：HTN1也赋予小种非特异性抗性的证据
在欧洲所有侵袭地区的许多地点进行了对HtN基因的基因型筛选。到目前为止，此抗性尚未中断，因而我们假定到目前为止它们都不是小种特异性的(直至发现小种N)。小种1在欧洲占优势，但在一些个别地区，可以检测到小种2或3或其组合(Hanekamp等,2013)。
7.对其它重组植物的表现型分型测试
对新重组植物的QTL区域进行了测试并与表现型数据关联。筛选包括涵盖靶标区不同区域的植物。可以鉴别出这样的重组植物，其在RP1的遗传背景中，在标记MA0005和MA0021–标记区M7与标记MA0013和MA0022–标记区M8之间呈现出供体B37HTN1的渐渗。图4显示出此区域仅包含三个基因RLK4、EXT1和RLK1。这些重组植物(包含区域M7–M8)在人工接种的田间和在温室测试中都呈现出抗性表现型。
8.抗性赋予候选基因的鉴别
为了鉴别抗性赋予基因，对10000植物的TILLING群体进行了筛选，所述植物呈现出在染色体8(在151688552-153139596bp的区域，相较于B73参照AGPv02(www.maizesequence.org)(RP3HTN1))上的来自Pepitilla的渐渗，并且其呈现出针对大斑病长蠕孢的抗性。
对于基因RLK4和RLK1开发出了扩增子(表10)并且在TILLING群体中个体植物DNA的扩增之后，通过Sanger测序手段对它们进行了测序。
表10:用于扩增子的引物序列
使用DNASTAR Lasergene软件评估了所述扩增子序列并鉴别了碱基突变。表11列出了所发现的突变的选择。
表11:对RLK4和RLK1所鉴别的突变
所鉴别的突变在温室中进行了自交，并对表现型分型测试的每个突变事件都从具有野生型等位基因和等位基因的纯合植物收获了种子储备。
15个具有野生型等位基因和突变等位基因(突变体RLK1b、RLK1d、RLK4d和RLK4f以及对照RP1和RP1HTN1)的纯合个体植物如上所述在温室中接种了大斑病长蠕孢。在接种后从第11天到第25天的期间，每天都对侵袭进行确定。所有测试植物的AUDPC值总结在表12中。在RP3HTN1 TILLING群体的抗性亲本中更换氨基酸预期会使纯合的突变体易受感染。
表12:具有野生型等位基因和突变等位基因(基因RLK1和RLK4)的纯合植物的AUDPC值。在表现型列中，0–100意味着抗性的，101–450意味着纯合的，而>450意味着易受感染的。
突变体名称 等位基因 AUDPC 表现型
RLK4d 纯合突变型 33.3 有抗性
纯合野生型 0.0 有抗性
RLK4f 纯合突变型 46.7 有抗性
纯合野生型 96.7 有抗性
RLK1b 纯合突变型 346.7 纯合的
纯合野生型 46.4 有抗性
RLK1d 纯合突变型 406.7 纯合的
纯合野生型 83.3 有抗性
RP1 1030.0 易受感染的
RP1HTN1 0.0 有抗性
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Claims (17)

1.用于鉴别大斑病长蠕孢抗性玉米植物的方法，其中所述大斑病长蠕孢抗性玉米植物的基因组中整合有来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述玉米植物的开花时间和/或所述玉米植物的青贮产量对应于基因组中没有整合来自供体Pepitilla的染色体片段的对比玉米植物的开花时间和/或青贮产量，
所述方法包括在所述植物的基因组中检测至少两个等位基因，其中至少一个等位基因位于这样的基因组区段中，所述基因组区段旁侧为第一标记区、第二标记区、第三标记区或第四标记区中的标记以及旁侧为在所述玉米植物中赋予针对大斑病长蠕孢的抗性的多核苷酸，并且其中至少一个等位基因位于这样的基因组区段中，所述基因组区段旁侧为所述多核苷酸以及旁侧为第六标记区或第五标记区中的标记，所述第一标记区旁侧为标记SYN14136和PZE-108076510，所述第二标记区旁侧为标记SYN24931和PZE-108077560，所述第三标记区旁侧为标记PZE-108093423和PZE-108093748，所述第四标记区旁侧为标记MA0004和MA0005，所述第五标记区旁侧为标记MA0006和PZE-108097482，所述第六标记区旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196，
其中所述标记SYN14136、PZE-108076510、SYN24931、PZE-108077560、PZE-108093423、PZE-108093748、MA0004、MA0005、MA0006、PZE-108097482、PZE-108107671和SYN4196如下所示：
其中所述多核苷酸选自：
(a)依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其由依照(a)的核酸分子的互补链组成，或者
(c)核苷酸序列，其编码由依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述至少两个等位基因中的至少一个选自由以下组成的组：
在B73 AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名 151831049 C MA0005 151907173 G MA0021 152045106 T MA0007 152045141 T MA0008 152045402 T MA0009 152045516 C MA0010 152045912 T MA0011 152046502 T MA0012 152046529 A MA0022 152133057 G MA0013 152133380 A MA0014 152144310 A MA0015 152250992 A MA0016 152301656 A MA0017 152304127 A MA0018 152433358 A PZE-108095998 152435855 A PZE-108096011 152630794 C MA0019 152703579 G PZE-108096610 152753635 A MA0020 152887338 G PZE-108096791 152888374 A MA0006
或选自由以下组成的组：
3.权利要求1或2的方法，其中所述染色体片段不含有遗传区段，所述遗传区段a)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093423、b)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093423、c)旁侧为标记SYN14136和PZE-108093748或者d)旁侧为标记PZE-108076510和PZE-108093748。
4.权利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸是通过依照SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:250的核酸可检测的基因RLK1。
5.权利要求1或2的方法，其中所述染色体片段还在第二标记区中的标记和第三标记区中的标记之间不含有所述供体的区间。
6.用于提高大斑病长蠕孢抗性玉米植物的产量的方法，所述大斑病长蠕孢抗性玉米植物的基因组中已经整合了来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述染色体片段包含所述供体的区间，该区间呈现依照以下的单倍型的供体等位基因
在B73 AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名 151831049 C MA0005 151907173 G MA0021 152045106 T MA0007 152045141 T MA0008 152045402 T MA0009 152045516 C MA0010 152045912 T MA0011 152046502 T MA0012 152046529 A MA0022 152133057 G MA0013 152133380 A MA0014 152144310 A MA0015 152250992 A MA0016 152301656 A MA0017 152304127 A MA0018 152433358 A PZE-108095998 152435855 A PZE-108096011 152630794 C MA0019 152703579 G PZE-108096610 152753635 A MA0020 152887338 G PZE-108096791 152888374 A MA0006
并且包含在所述玉米植物中赋予针对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，所述方法包括这样的步骤，该步骤是去除：
a)在第一标记区中的标记和第二标记区中的标记之间的所述供体的区间，其中所述第一标记区旁侧为标记SYN14136和PZE-108076510，而所述第二标记区旁侧为SYN24931和PZE-108077560，和/或
b)在第三标记区中的标记与第四标记区中的标记之间的所述供体的区间，其中所述第三标记区旁侧为标记PZE-108093423和PZE-108093748，而所述第四标记区旁侧为标记MA0004和MA0005，和/或
c)在第五标记区中的标记与第六标记区中的标记之间的所述供体的区间，其中所述第五标记区旁侧为标记MA0006和PZE-108097482，而第六标记区旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196，
其中所述标记SYN14136、PZE-108076510、SYN24931、PZE-108077560、PZE-108093423、PZE-108093748、MA0004、MA0005、MA0006、PZE-108097482、PZE-108107671和SYN4196如下所示：
其中所述多核苷酸选自：
(a)依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列，
(b)核苷酸序列，其由与依照(a)的核酸分子的互补链组成，或者
(c)核苷酸序列，其编码由依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的多肽。
7.权利要求6的方法，其中进行遗传工程来取代来自供体的一或多个区间。
8.寡核苷酸，其由选自SEQ ID NO:41-49、53-100或229-250之一的核苷酸序列组成。
9.权利要求8的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是引物。
10.寡核苷酸用于在权利要求1-7中任一项的方法中鉴别大斑病长蠕孢抗性玉米植物的用途，其中所述寡核苷酸由选自SEQ ID NO:17-250之一的核苷酸序列组成。
11.权利要求10的用途，其中所述抗性是HTN1。
12.用于产生转基因植物的方法，所述方法包括将多核苷酸引入植物细胞的步骤，选择转基因植物细胞的步骤，以及从第一步产生的转基因植物细胞再生转基因植物的步骤，
其中所述多核苷酸由这样的核酸分子组成：
(a)所述核酸分子由依照SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成，
(b)所述核酸分子由与依照(a)的核酸分子的互补链组成，或者
(c)所述核酸分子编码多肽，该多肽具有依照SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
13.用于产生大斑病长蠕孢抗性玉米植物的方法，其包括以下步骤：
(A)制备第一玉米植物，其基因组中已经整合了来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述染色体片段包含供体的第一区间，该供体的第一区间呈现出依照以下的单倍型的供体等位基因
在B73 AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名 151831049 C MA0005 151907173 G MA0021 152045106 T MA0007 152045141 T MA0008 152045402 T MA0009 152045516 C MA0010 152045912 T MA0011 152046502 T MA0012 152046529 A MA0022 152133057 G MA0013 152133380 A MA0014 152144310 A MA0015 152250992 A MA0016 152301656 A MA0017 152304127 A MA0018 152433358 A PZE-108095998 152435855 A PZE-108096011 152630794 C MA0019 152703579 G PZE-108096610 152753635 A MA0020 152887338 G PZE-108096791 152888374 A MA0006
并且包含在所述玉米植物中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，并且其中所述染色体片段含有供体的第二区间和/或供体的第四区间和/或供体的第五区间，
(B)提供第二玉米植物，
(C)将得自(A)的玉米植物与得自(B)的玉米植物杂交，以及
(D)筛选大斑病长蠕孢抗性玉米植物。
14.权利要求13的方法，其中使用以下的至少一种标记进行步骤(D)：
在B73 AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名 151831049 C MA0005 151907173 G MA0021 152045106 T MA0007 152045141 T MA0008 152045402 T MA0009 152045516 C MA0010 152045912 T MA0011 152046502 T MA0012 152046529 A MA0022 152133057 G MA0013 152133380 A MA0014 152144310 A MA0015 152250992 A MA0016 152301656 A MA0017 152304127 A MA0018 152433358 A PZE-108095998 152435855 A PZE-108096011 152630794 C MA0019 152703579 G PZE-108096610 152753635 A MA0020 152887338 G PZE-108096791 152888374 A MA0006
或
15.用于产生大斑病长蠕孢抗性玉米植物的方法，其包括以下步骤：
(A)用第一核苷酸序列和第二核苷酸序列瞬时转化玉米植物细胞，所述第一核苷酸序列编码第一蛋白，所述第一蛋白具有能够在玉米植物细胞中诱导旁侧为标记SYN24931和PZE-108077560的标记区M2与旁侧为标记MA0004和MA0005的标记区M4之间的DNA的双链断裂的核酸内切酶活性，所述第二核苷酸序列编码第二蛋白，所述第二蛋白具有能够在玉米植物细胞中诱导旁侧为标记MA0006和PZE-108097482的标记区M5与旁侧为标记PZE-108107671和SYN4196的标记区M6之间的DNA的双链断裂的核酸内切酶活性；
其中所述标记SYN24931、PZE-108077560、MA0004、MA0005、MA0006、PZE-108097482、PZE-108107671和SYN4196如下所示：
(B)将供体载体瞬时引入到所述第一玉米植物细胞中，其携带有来自供体Pepitilla的染色体片段，其中所述染色体片段包含供体的第一区间，该供体的第一区间呈现出依照以下的单倍型的供体等位基因
在B73 AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名 151831049 C MA0005 151907173 G MA0021 152045106 T MA0007 152045141 T MA0008 152045402 T MA0009 152045516 C MA0010 152045912 T MA0011 152046502 T MA0012 152046529 A MA0022 152133057 G MA0013 152133380 A MA0014 152144310 A MA0015 152250992 A MA0016 152301656 A MA0017 152304127 A MA0018 152433358 A PZE-108095998 152435855 A PZE-108096011 152630794 C MA0019 152703579 G PZE-108096610 152753635 A MA0020 152887338 G PZE-108096791 152888374 A MA0006
并且包含在所述玉米植物中赋予对大斑病长蠕孢抗性的多核苷酸，并且其中所述染色体片段还在来自(A)的双链断裂位点之间包含供体Pepitilla的染色体区段，从而在所述第一玉米植物细胞的基因组与供体载体的染色体片段之间会发生同源重组；
(C)从所述玉米植物细胞再生玉米植物；
(D)鉴别大斑病长蠕孢抗性玉米植物。
16.权利要求15的方法，其中使用以下的至少一种标记进行步骤(D)：
在B73 AGPv02上的位置(bp) 等位基因供体B37HTN1 标记命名 151831049 C MA0005 151907173 G MA0021 152045106 T MA0007 152045141 T MA0008 152045402 T MA0009 152045516 C MA0010 152045912 T MA0011 152046502 T MA0012 152046529 A MA0022 152133057 G MA0013 152133380 A MA0014 152144310 A MA0015 152250992 A MA0016 152301656 A MA0017 152304127 A MA0018 152433358 A PZE-108095998 152435855 A PZE-108096011 152630794 C MA0019 152703579 G PZE-108096610 152753635 A MA0020 152887338 G PZE-108096791 152888374 A MA0006
或
17.权利要求15或16的方法，其中所述具有核酸内切酶活性的第一蛋白和/或所述具有核酸内切酶活性的第二蛋白是TALE或锌指核酸内切酶融合蛋白。
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