CN102958349A - 用于在玉米中增强玉米大斑病抗性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定和选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法和组合物。通过本发明的方法产生的玉米植株也是本发明的特征。

Description

用于在玉米中增强玉米大斑病抗性的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2010年6月25日的美国临时申请61/358,429的权益，其全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开涉及用于在玉米植株中增强玉米大斑病抗性的组合物和方法。

发明背景

由真菌病原体大斑突脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)(以前称为大斑长蠕孢菌(Helminthosporium turcicum))引起的玉米大斑病(NLB)是玉米在许多热带和温带环境中的严重的叶枯萎病害。症状能够从下部叶片上雪茄状的病变直到叶的完全破坏，从而减少了能够用于光合作用的叶片表面积。光合作用能力的降低导致灌浆所需的碳水化合物的不足，影响作物产量。由于露时长并且温度适中，热带地区大约海平面以上大约900-1600m的中等海拔高度地区具有尤其适合玉米大斑病的气候。然而，玉米大斑病在温带环境(例如在美国)中也能够在雨季导致30-50％的损失，尤其是当植株的上部叶片上在抽丝期已被感染时。

真菌大斑突脐蠕孢菌(Et)以菌丝和分生孢子的形式在留在土壤表面的玉米残留物上越冬。分生孢子转变成休眠孢子，在温暖潮湿的天气，产生新的分生孢子，然后由风或雨搬运至玉米幼苗的下部叶片上。感染需要水在叶片表面存在6-18小时以及介于66°F和80°F之间的温度。如果发生感染，病变会在7-12天内发展，并产生新的分生孢子，新的分生孢子将感染转播至次级位点。病害治理策略包括轮作、通过耕耘破坏旧的玉米残留物、以及施用杀真菌剂，所有这些策略均旨在减少真菌种菌。然而，控制玉米大斑病的最有效和最优选的方法是种植抗性杂交种。

自然中存在大斑突脐蠕孢菌的多个品种或小种，这留给了种植者两种杂交选择：部分抗性的杂交种，其提供针对多个小种的低水平、广谱的防护和小种特异性抗性杂交种，其针对特定小种进行防护。对大斑突脐蠕孢菌的抗性的遗传来源已被描述，并且四种大斑突脐蠕孢菌(以前称为大斑长蠕孢菌)抗性基因座已被鉴定：Ht1、Ht2、Ht3和Htn1。基因Ht1定位在2号染色体的长臂上，其与umc36(Coe，E.H.等人(1988)Corn and CornImprovement，第3版，第81-258页)、sgcr506(Gupta，M.等人(1989)Maize Genet.Coop.Newsl.63，112)、umc150B(Bentolila，S.等人(1991)Theor.Appl.Genet.，82：393-398)、以及pic18a(Collins等人(1998)Molecular Plant-Microbe Interactions，11：968-978)紧密连锁，并且其紧密两侧为umc22和umc122(Li等人(1998)Hereditas，129：101-106)。基因Ht2定位在8号染色体的长臂上，位于umc48-umc89区间(Zaitlin等人(1992)Maize Genet.Coop.Newsl.，66，69-70)，并且基因Ht3定位在7号染色体上，位于bnlg1666(Van Staden，D等人(2001)Maize GeneticsConferenceAbstracts43：第134页)附近。Htn1基因定位在8号染色体上，大约位于Ht2远端10cM和RFLP标记umc117(Simcox和Bennetzen(1993)Maize Genet.Coop.Newl.，67，118-119；Simcox和Bennetzen(1993)Phytopathology，83：1326-1330；Chung等人(2010)Theor AppGen Epub)远端0.8cM处。

通过减少真菌种菌控制玉米大斑病的方法需要农民付出额外的时间和物力，此外，还能够具有对环境的有害效应。这使得种植抗性杂交种对农民和公众甚至更加具有吸引力。因此，希望提供用于鉴定和选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的组合物和方法。这些植株能够被用于育种程序中以产生具有玉米大斑病抗性的高产杂交种。

发明概述

本发明提供了用于鉴定和选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的组合物和方法。

在一个实施方案中，介绍了选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。所述方法包括在所述玉米植株中检测一个或多个标记等位基因，所述标记等位基因与下列单倍型连锁并关联：在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。然后，具有与以上所列的任何单倍型连锁并关联的一个或多个标记等位基因的玉米植株被选择为具有增强的玉米大斑病抗性。

在另一个实施方案中，所述标记等位基因能够以30cM、25cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.9cM、0.8cM、0.7cM、0.6cM、0.5cM、0.4cM、0.3cM、0.2cM、或0.1cM的距离与下列任何单倍型连锁：在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。

在另一个实施方案中，介绍了选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。所述方法包括在所述玉米植株中检测单倍型，其中所述单倍型能够是下列中的任一个：在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。然后，具有所述单倍型的玉米植株被选择为具有增强的玉米大斑病抗性。

在另一个实施方案中，提供了通过在玉米植株的种质中检测与增强的抗性关联的至少一个标记等位基因来鉴定具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。所述标记基因座能够选自下列标记基因座中的任一个：PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9g13-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或NLB18_E；以及与这些标记连锁的任何其他标记。所述标记基因座包含与增强的玉米大斑病抗性关联的至少一个等位基因。用该方法鉴定的玉米植株也是受关注的。

在另一个实施方案中，提供了通过在玉米植株的种质中检测单倍型来鉴定具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，其中所述单倍型与增强的玉米大斑病抗性关联。所述单倍型在一个或多个标记基因座处包含等位基因，其中所述一个或多个标记基因座位于8号染色体区间内，所述染色体区间包含并且两侧为：

i.标记PHM4582和R，或

ii.标记6_8和R。

在另一个实施方案中，所述单倍型是在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。

在另一个实施方案中，提供了选择具有增强的玉米大斑病抗性的植株的方法。在一个方面，获得第一玉米植株，所述第一玉米植株具有在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。然后，所述第一玉米植株能够与第二玉米植株杂交，并且能够就所述单倍型的存在，对得自所述杂交的子代植株进行评估。具有所述第一玉米植株的单倍型的子代植株能够被选择为具有增强的玉米大斑病抗性。用该方法选择的子代植株也是受关注的。

在另一个实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：(a)编码能够赋予或增强玉米大斑病抗性的多肽的至少一种核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：93、95、或97进行比较时，所述多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或(b)所述核苷酸序列的全长互补序列，其中该全长互补序列与该核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。所述多肽可以包含SEQ ID NO：93、95、或97的氨基酸序列。所述核苷酸序列可以包含SEQ ID NO：92、94、或96的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及载体，所述载体包含受权利要求书保护的分离的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明涉及重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一种调控序列的本发明的分离的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明涉及玉米细胞，所述玉米细胞包含本发明的重组DNA构建体或分离的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于生产玉米植株的方法，所述方法包括用本发明的重组DNA构建体转化植株细胞以及从转化的植株细胞再生植株。

在另一个实施方案中，本发明涉及玉米植株，所述玉米植株包含本发明的重组DNA构建体。

在另一个实施方案中，本发明涉及玉米种子，所述玉米种子包含本发明的重组DNA构建体。

在另一个实施方案中，本发明涉及赋予或提高玉米大斑病抗性的方法，所述方法包括用本发明的重组DNA构建体转化植株，从而赋予或提高玉米大斑病抗性。

在另一个实施方案中，本发明涉及确定本发明的多核苷酸在玉米植株中是否存在的方法，所述方法包括下列中的至少一个：

(a)从所述玉米植株中分离核酸分子并扩增与本发明的多核苷酸同源的序列，或

(b)从所述玉米植株中分离核酸分子并进行DNA杂交，或

(c)从所述玉米植株中分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(d)从所述玉米植株中分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行ELISA测定，或

(e)证明来源于mRNA转录物、并且为玉米大斑病抗性基因座所特有的mRNA序列的存在，

从而确定本发明的多核苷酸在所述玉米植株中的存在。

在另一个实施方案中，本发明涉及确定玉米大斑病抗性基因座在玉米植株中是否存在的方法，所述方法包括下列中的至少一个：

(a)从所述玉米植株中分离核酸分子并扩增本发明的多核苷酸所特有的序列，或

(b)从所述玉米植株中分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(c)从所述玉米植株分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行ELISA测定，或

(d)证明来源于mRNA转录物、并且为玉米大斑病抗性基因座所特有的mRNA序列的存在，

从而确定所述玉米大斑病抗性基因座在所述玉米植株中的存在。

在另一个实施方案中，本发明涉及改变能赋予玉米细胞玉米大斑病抗性的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体转化玉米细胞；以及

(b)使所述转化的玉米细胞在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达引起能在所述转化的玉米细胞中赋予玉米大斑病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表达水平相比发生改变。

在另一个实施方案中，本发明涉及改变能赋予玉米细胞玉米大斑病抗性的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体转化玉米细胞；以及

(b)使所述转化的玉米细胞在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达引起能在所述转化的玉米细胞中赋予玉米大斑病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表达水平相比发生改变。

在另一个实施方案中，本发明涉及改变能赋予玉米植株玉米大斑病抗性的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体转化玉米植株细胞；以及

(b)从所述转化的玉米植株细胞再生转化的玉米植株；以及

(c)使所述转化的玉米植株在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达引起能在所述转化的玉米植株中赋予玉米大斑病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表达水平相比发生改变。

在另一个实施方案中，本发明涉及改变能赋予玉米植株玉米大斑病抗性的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体转化玉米植株细胞；以及

(b)从所述转化的玉米植株细胞再生转化的玉米植株；以及

(c)使所述转化的玉米植株在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达引起能在所述转化的玉米植株中赋予玉米大斑病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表达水平相比发生改变。

附图和序列表简述

根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三个字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

图1显示了测序的BAC(酵母人工染色体)(得自玉米基因组测序计划)在与玉米大斑病关联的QTL(数量性状基因座)所位于的8号染色体区域中的物理图谱排列方式。标示了能够被用于标记辅助的选择(MAS)的本文所述的标记的位置。

图2显示了mRNA和Fgenesh预测的开放阅读框在带注释的PH26NBAC中的排列方式。标示了代表推定的蛋白激酶的Fgenesh预测的NLB17和NLB18开放阅读框。

图3显示了被用作对玉米大斑病感染评分的指南的图表。

序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所示的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三个字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(2)：345-373(1984)所描述的，它们以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

SEQ ID NO：1是PHM2798正向引物的序列。

SEQ ID NO：2是PHM2798反向引物的序列。

SEQ ID NO：3是b0302H1正向引物的序列。

SEQ ID NO：4是b0302H1反向引物的序列。

SEQ ID NO：5是b0611N13正向引物的序列。

SEQ ID NO：6是b0611N13反向引物的序列。

SEQ ID NO：7是2717_3正向引物的序列。

SEQ ID NO：8是2717_3反向引物的序列。

SEQ ID NO：9是2717_4正向引物的序列。

SEQ ID NO：10是2717_4反向引物的序列。

SEQ ID NO：11是108f16_2正向引物的序列。

SEQ ID NO：12是108f16_2反向引物的序列。

SEQ ID NO：13是31004正向引物的序列。

SEQ ID NO：14是31004反向引物的序列。

SEQ ID NO：15是pco642297_3正向引物的序列。

SEQ ID NO：16是pco642297_3反向引物的序列。

SEQ ID NO：17是b109.m6正向引物的序列。

SEQ ID NO：18是b109.m6反向引物的序列。

SEQ ID NO：19是PHM18979正向引物的序列。

SEQ ID NO：20是PHM18979反向引物的序列。

SEQ ID NO：21是b0507L21正向引物的序列。

SEQ ID NO：22是b0507L21反向引物的序列。

SEQ ID NO：23是22正向引物的序列。

SEQ ID NO：24是2_2反向引物的序列。

SEQ ID NO：25是156K16正向引物的序列。

SEQ ID NO：26是156K16反向引物的序列。

SEQ ID NO：27是b0318i13正向引物的序列。

SEQ ID NO：28是b0318i13反向引物的序列。

SEQ ID NO：29是PHM4757正向引物的序列。

SEQ ID NO：30是PHM4757反向引物的序列。

SEQ ID NO：31是NLB5A正向引物的序列。

SEQ ID NO：32是NLB5A反向引物的序列。

SEQ ID NO：33是NLB5A探针的序列。

SEQ ID NO：34是NLB3A正向引物的序列。

SEQ ID NO：35是NLB3A反向引物的序列。

SEQ ID NO：36是NLB3A探针的序列。

SEQ ID NO：37是PHM2817-26正向引物的序列。

SEQ ID NO：38是PHM2817-26反向引物的序列。

SEQ ID NO：39是PHM7446-6正向引物的序列。

SEQ ID NO：40是PHM7446-6反向引物的序列。

SEQ ID NO：41是PHM4582正向引物的序列。

SEQ ID NO：42是PHM4582反向引物的序列。

SEQ ID NO：43是9g13-3正向引物的序列。

SEQ ID NO：44是9g13-3反向引物的序列。

SEQ ID NO：45是K正向引物的序列。

SEQ ID NO：46是K反向引物的序列。

SEQ ID NO：47是6_7正向引物的序列。

SEQ ID NO：48是6_7反向引物的序列。

SEQ ID NO：49是6_8正向引物的序列。

SEQ ID NO：50是6_8反向引物的序列。

SEQ ID NO：51是N正向引物的序列。

SEQ ID NO：52是N反向引物的序列。

SEQ ID NO：53是R正向引物的序列。

SEQ ID NO：54是R反向引物的序列。

SEQ ID NO：55是S正向引物的序列。

SEQ ID NO：56是S反向引物的序列。

SEQ ID NO：57是U正向引物的序列。

SEQ ID NO：58是U反向引物的序列。

SEQ ID NO：59是PHM13395-16正向引物的序列。

SEQ ID NO：60是PHM13395-16反向引物的序列。

SEQ ID NO：61是PHM3418-12正向引物的序列。

SEQ ID NO：62是PHM3418-12反向引物的序列。

SEQ ID NO：63是PHM13395-27正向引物的序列。

SEQ ID NO：64是PHM13395-27反向引物的序列。

SEQ ID NO：65是PHM4677-11正向引物的序列。

SEQ ID NO：66是PHM4677-11反向引物的序列。

SEQ ID NO：67是PHM15992-3正向引物的序列。

SEQ ID NO：68是PHM15992-3反向引物的序列。

SEQ ID NO：69是NLB17_A正向引物的序列。

SEQ ID NO：70是NLB17_A反向引物的序列。

SEQ ID NO：71是NLB17_E正向引物的序列。

SEQ ID NO：72是NLB17_E反向引物的序列。

SEQ ID NO：73是NLB17_3正向引物的序列。

SEQ ID NO：74是NLB17_3反向引物的序列。

SEQ ID NO：75是NLB18_A正向引物的序列。

SEQ ID NO：76是NLB18_A反向引物的序列。

SEQ ID NO：77是NLB18_E正向引物的序列。

SEQ ID NO：78是NLB18_E反向引物的序列。

SEQ ID NO：79是添加至NLB17和NLB18标记组的正向引物的尾巴的序列。

SEQ ID NO：80是添加至NLB17和NLB18标记组的反向引物的尾巴的序列。

SEQ ID NO：81是PHM13395参考序列。

SEQ ID NO：82是PHM4677参考序列。

SEQ ID NO：83是PHM3418参考序列。

SEQ ID NO：84是PHM15992参考序列。

SEQ ID NO：85是PHM2817参考序列。

SEQ ID NO：86是PHM7446参考序列。

SEQ ID NO：87是NLB17_A参考序列。

SEQ ID NO：88是NLB17_E参考序列。

SEQ ID NO：89是NLB17_3参考序列。

SEQ ID NO：90是NLB18_A参考序列。

SEQ ID NO：91是NLB18_E参考序列。

SEQ ID NO：92是来自PH26N的NLB17 cDNA序列。

SEQ ID NO：93是由SEQ ID NO：92编码的蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：94是来自PH99N的NLB18 cDNA序列。

SEQ ID NO：95是由SEQ ID NO：94编码的蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：96是来自PH26N的NLB18 cDNA序列。

SEQ ID NO：97是由SEQ ID NO：96编码的蛋白质的氨基酸序列。

发明详述

本发明提供了玉米中的等位基因组合物以及鉴定和选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。提供以下定义以利于理解本发明。

术语“等位基因”指在特定基因座处发生的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。

“等位基因频率”指等位基因存在于个体、品系、或一组品系中的基因座上的频率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5、或0.0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。同样地，人们能够通过平均化构成种群的品系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就一组限定数目的个体或品系而言，可将所有等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其他指定组)的计数。

“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸制备的核酸。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成邻接DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群，如果BAC进行测序，或者经由它的BAC指纹与其他BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的Maize Genome Browser找到所述装配。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。

“BAC”或细菌人工染色体是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)天然存在的F因子的克隆载体。BAC能够接受DNA序列的较大插入序列。在玉米中，已经将许多BAC或细菌人工染色体装配成重叠群(重叠的邻接基因片段，或“邻接DNA”)，它们每个包含玉米基因组DNA的较大插入序列。

“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。例如参见Ragot，M.等人(1995)Marker-assisted backcrossing：a practical example，Techniques et Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques，第72卷，第45-56页，以及Openshaw等人(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding，Analysis ofMolecular Marker Data，第41-43页。初始杂交产生F1代；然后，术语“BC1”指轮回亲本的第二次使用，“BC2”指轮回亲本的第三次使用等等。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

如本文所用，术语“染色体区间”指位于植株单个染色体上的基因组DNA的邻接线性区域。位于单染色体间隔上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不特别限定染色体区间的大小。在一些方面，位于单个染色体区间内的基因元件在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM。即，位于单个染色体区间内的两个基因元件以小于或等于20％或10％的频率进行重组。

“染色体”也可称为“连锁群”。

在本专利申请中，短语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。

术语“互补序列”指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列通过碱基配对原则连锁。

术语“邻接DNA”指重叠的邻接基因片段。

当涉及两个遗传因子间的关系时，例如有助于抗性的遗传因子和邻近的标记，“耦合”相连锁指示下述状态：其中在抗性基因座上的“有利”等位基因与相应连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理上关联在相同染色体链上。在耦合相中，两个有利等位基因被继承了该染色体链的子代一起继承。

术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

相对于具有单组染色体的“单倍体”，本文称为“二倍体”的植株具有成对的染色体的组。

本文称为“双单倍体”的植株通过倍增单倍体染色体组进行生长。认为双单倍体植株是纯合植株。

“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。

如本文所用，术语“编码”或“编码的”当用于特定的核酸时，意指该核酸包含用以指导从其核苷酸序列向特定蛋白质的翻译的必要信息。蛋白质被编码所用的信息通过密码子的使用而具体化。编码蛋白质的核酸可在所述核酸的翻译区之间包含非翻译序列(即内含子)，或者可没有此类居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。

“外来玉米品种”或“外来玉米种质”是来源于不属于可利用优良玉米品系或品种的种质的玉米的品种或种质。在杂交发生在两个玉米植株或品种的种质之间的情况下，外来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序。

“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米大斑病抗性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。

“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或染色体)上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。例如，在内部来源的基因图谱上(本文也将Pioneer Hi-Bred称为“PHB”)的10cM大概等同于在IBM22005邻接框图谱(在玉米GDB上可用的高分辨率图谱)上的25-30cM。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，如用作探针的核酸。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

“基因组”指总DNA或整套基因，由染色体或染色体组携带。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

称为“单倍体”的植株具有一组染色体(基因组)。

“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型，即等位基因组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指在特定基因座的多态性，如单标记基因座，或者在沿染色体片段的多个基因座上的多态性。前者也可被称为“标记单倍型”或“标记等位基因”，而后者能够被称为“远程单倍型”。

术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座上基因型不同。

“杂种优势群”包含一组基因型，它们当与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(Hallauer等人(1998)Corn breeding，第463-564页，G.F.Sprague和J.W.Dudley(编辑)，Corn and corn improvement)。将近交系归类为杂种优势群，并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于若干个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人(1990)Theor.Appl.Gen.80：833-840)。美国两个最广泛使用的杂种优势群称为“Iowa Stiff Stalk Synthetic”(BSSS)和“Lancaster”或“Lancaster Sure Crop”(有时称为NSS或非Stiff Stalk)。

术语“杂合子”指其中不同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。

术语“同质”指一组成员在一个或多个特定基因座上具有相同基因型。

术语“纯合子”指其中相同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。

术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。

“杂交”或“核酸杂交”指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。

术语“杂交”指核酸链的互补区域之间形成碱基对。

“IBM基因图谱”能够指任何下列图谱：IBM、IBM2、IBM2邻接、IBM2 FPC0507、IBM2 2004邻接、IBM2 2005邻接、IBM2 2005邻接框、IBM22008邻接、IBM22008邻接框、或maizeGDB网站的最新版本。IBM基因图谱基于B73×Mo17种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组近交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了遗传的或BAC作图的基因座的添加，以及由于从其他遗传或物理图谱、经过清理的数据、或用以从各个图谱产生综合图谱的新算法的使用获得的信息的整合而提高的图谱精度。

术语“近交”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。

术语“插入缺失(indel)”指插入或缺失，其中可将一个品系相对于第二品系称为插入，或者可将第二品系相对于第一品系称为具有缺失。

术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。例如，本文所述的2号染色体基因座可以被基因渗入至对Et和/或玉米大斑病无抗性或仅部分抗性的轮回亲本中。带有所渗入基因或基因座的轮回亲本品系于是具有增强的对Et和/或玉米大斑病的抗性。

当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。

“品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，它们一般是某种程度的近交体，并且一般在大多数基因座是纯合的和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的近交体亚群，它们与相同祖先来源的其他相似近交体亚群遗传上不同。

如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或一些其他基因座(例如，玉米大斑病抗性基因座)关联的程度。分子标记和表型之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可以用期望的限度或范围表达。例如在一些实施方案中，当标记分离距离为小于50、40、30、25、20、或15图谱单位(或cM)时，任何标记与任何其他标记连锁(基因上和物理上)。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如介于10cM和20cM之间，介于10cM和30cM之间，或者介于10cM和40cM之间。标记与第二基因座的连锁越紧密，标记对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”如标记基因座和第二基因座显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。因为1cM是显示出1％的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与接近的任何其他标记紧密连锁(基因上和物理上)，例如等于或小于10cM的距离。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可被彼此定位于9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更小。

术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或者两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以大于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离性状的情况下，产生该性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50％的情况下共分离，例如约51％至约100％的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同染色体上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记或者标记和表型之间。标记基因座可与性状，例如玉米大斑病抗性相“关联”(连锁)。测量分子标记与表型性状的连锁程度，例如分子标记与表型共分离的统计学概率。

连锁不平衡最常见地用量度r²测量，它通过Hill，W.G.和Robertson，A，Theor.Appl.Genet.38：226-231(1968)所述的公式计算。当r²＝1时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r²值大于1/3指示足够强的LD将被用于作图(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))。因此，当成对标记基因座间的r²值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。

如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。

“基因座”是基因或标记位于染色体上的位点。

“优势对数(LOD)值”或“LOD评分”(Risch，Science 255：803-804(1992))用于区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。

“玉米”指玉米属(Zea mays L.ssp.mays)植株，也称为“玉蜀黍”。

术语“玉米植株”包括：整个玉米植株、玉米植株细胞、玉米植株原生质体、可从其中再生玉米植株的玉米植株细胞或玉米组织培养物、玉米植株愈伤组织、玉米植株中的完整玉米植株细胞或玉米植株部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。

“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异、或多态性。对于分子标记，这意味着DNA水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP和SNP)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件、或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段。很多玉米分子标记是本领域已知的，并且被公布于或得自多个来源，例如Maize GDB因特网资源和University of Arizona运营的ArizonaGenomics Institute因特网资源。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。

“标记辅助的选择”(或MAS)是一种基于标记基因型进行表型选择的方法。

“标记辅助的反选择”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植株的方法，所述植株将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中去除。

“标记单倍型”是指在标记基因座的等位基因的组合。

“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位点，其中可存在特定标记。“标记基因座”可用于追踪存在的第二连接基因座，例如编码或有助于表达表型性状的连接基因座。例如标记基因座能够用于监控等位基因在某一基因座的分离，例如QTL或单基因，它们与标记基因座在遗传上或在物理上连锁。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或两侧为标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，根据定义，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如SNP技术用于本文提供的实例。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“负”相关。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它们由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。

术语“表型”或“表型性状”或“性状”指生物的一个或多个性状。表型可用肉眼或者本领域已知的任何其他评估手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、或电装置检测分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的或重叠的邻接基因片段)并且不基于基因重组。

“植株”可为整个植株、其任何部分、或来源于植株的细胞或组织培养物。因此，术语“植株”可指代以下任何一种材料：整个植株、植株部分或器官(例如叶、茎、根等)、植株组织、种子、植株细胞、和/或子代的相同材料。植株细胞是从植株中获取的细胞或来源于从植株中所获取细胞经培养出的细胞。

“多态性”是DNA中的变型，它过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在种群中必须具有至少1％的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性，所述插入/缺失多态性本文也称为“插入缺失”。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本发明实施方案的多肽既可从本文所公开的核酸产生，也可通过使用标准的分子生物学技术而产生。例如，本发明实施方案的截短的蛋白质可通过在适当的宿主细胞中表达本发明实施方案的重组核酸而产生，或者通过离体过程的组合，例如蛋白酶消化和纯化而产生。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“正”相关。

“概率值”或“P值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是共分离的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。

“生产标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标记被开发用于检测特异性多态性，并且被设计用于多种化学反应和平台。本文所使用的标记名称，以前缀PHM表示“先导杂交标记(Pioneer Hybrid Marker)”，然后是针对其所被设计针对的序列的数字，之后是“.”或“-”，然后是针对DNA多态性的后缀。标记的版本也能够按照(A、B、C等)表示针对该特异性多态性的标记的版本的方式。

术语“子代”指杂交产生的后代。

“子代植株”从两个植株间的杂交生成。

术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。

“参考序列”是用作序列比对基准的限定序列。参考序列通过基因分型在该基因座的多个品系、在序列比对程序(例如Sequencher)、然后获取比对的共有序列而获得。因此，参考序列鉴定在基因座等位基因中的多态性。参考序列可以不是实际DNA序列的拷贝；然而，设计引物和探针用于基因座中的实际多态性是有用的。

在“相斥”相连锁中，在受关注基因座上的“有利”等位基因与在邻近的标记基因座上的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。

“顶交测试”是通过将每一亲本与相同测试者(通常是纯合品系)杂交而进行的子代测试。测试亲本可为自由授粉的品种、杂交系或近交系。

序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于

生物信息计算包(

Inc.，Madison，WI)的

程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))采用默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTHPENALTY＝10)执行。用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4，以及DIAGONALSSAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。

标记的“不利等位基因”是与不利植株表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中移除的植株的有益效果。

术语“产量”指具有商业价值的特定植株产品每单位面积的产量。例如玉米产量一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每季每公顷种子公吨数来测量。产量受遗传和环境因素的影响。“农学”、“农学特性”和“农学性能”指给定植株品种的性状(以及产生性状的遗传因子)，所述性状有助于经过生长期的产量。单个农学特性包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草剂抗性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒率等等。因此产量是所有农学特性的最终结果。

序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于

生物信息计算包(

Inc.，Madison，WI)的

程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))采用默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTHPENALTY＝10)执行。用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4，以及DIAGONALSSAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPress：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“植株”也包括多个植株；取决于上下文，使用的术语“植株”也可包括该植株遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝。

现在来看实施方案：

玉米大斑病抗性

玉米大斑病(NLB)，有时被称为玉米叶枯病(NCLB)，是由病原体大斑突脐蠕孢菌导致的病害。这种以叶片组织上的雪茄状病变为特征的病害，能够对产量造成严重影响，尤其是在热带气候下或者是在温带气候的雨季。

本发明实施方案的核酸和多肽可用于赋予或增强植株真菌抗性的方法中。抗性的来源可以是天然存在的遗传的抗性基因座，所述基因座通过育种实现向缺少该抗性基因座的敏感型玉米种群的基因渗入，或者，赋予抗性的基因可作为转基因异位表达，所述转基因当在敏感型种群中表达时赋予抗性。因此，本文所公开的组合物和方法对于保护植株免受真菌病原体损害是有用的。“病原抗性”、“真菌抗性”和“疾病抗性”意指植株避免了作为植株-病原体相互作用结果的疾病症状。即，防止了病原体导致植株疾病和相关的疾病症状，或者，病原体导致的疾病症状被最小化或减弱了，例如压力和相关的产量损失的降低。本领域的技术人员将会知道，本文所公开的组合物和方法可与本领域中可用的其他组合物和方法一起被用于保护植株免受病原体攻击。

因此，本发明实施方案的方法可被用于保护植株免受疾病，尤其是由植株病原真菌导致的疾病的侵害。如本文所用，“真菌抗性”是指与野生型植株的对应性质相比，对真菌病原体增强的抗性或耐受性。效果可以从对病原真菌的影响的耐受性的略微增加(例如部分抑制)，直至使得植株不受病原真菌存在的影响这样的完全抗性。针对特定真菌病原体或者针对广谱的真菌病原体的提高水平的抗性构成了“增强的”或改善的真菌抗性。本发明的实施方案将增强或提高植株病原真菌抗性，使得植株对一种或多种真菌病原体的抗性增加，继而增加了对真菌病原体引起的病害的抗性。术语“增强”是指提高、增加、扩大、倍增、提升、上升等。本文中，本发明的植株被描述为由于本发明的抗性基因座而对大斑长蠕孢菌的感染具有抗性或对大斑长蠕孢菌的感染具有增强的抗性。相应地，与因缺少所述抗性基因座而对大斑长蠕孢菌的感染敏感的相应植株相比，它们通常表现出对该疾病(玉米大斑病)提高的抗性。

与玉米大斑病抗性关联的分子标记和分子标记的等位基因的鉴定允许抗性的正选择仅基于子代的遗传组成。本文提供了通过基因组成评估(如使用分子标记及其等位基因评估)来鉴定和选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。

在其他方面，赋予或增强植株真菌抗性的方法也能够被实施，所述方法包括将至少一种表达盒转入植株，其中所述表达盒包括编码本发明实施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接至在所述植株中驱动表达的启动子。在这些方法中，植株表达所述多肽，从而赋予了该植株真菌抗性，或提高了该植株抗性的固有水平。在特定实施方案中，所述基因或多种基因赋予对真菌病原体大斑长蠕孢菌的抗性。

所述实施方案的抗真菌多肽的表达可定位于对病原体的抗性在其处尤其重要的特定的植株组织，例如叶、根、茎或维管组织。此类组织优选的表达可通过根优选的、叶优选的、维管组织优选的、茎优选的或种子优选的启动子而实现。

基因作图-与增强的大斑长蠕孢菌抗性关联的基因座的鉴定

在很长一段时间里，人们已经认识到能够对与特定表型例如玉米大斑病抗性关联的特定基因座在生物的基因组中作图。有利的是，植物育种人员可使用分子标记通过检测标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注的性状共分离的分子标记或分子标记簇，植物育种人员能够对合适的分子标记等位基因进行正选择(该过程称为标记辅助选择或MAS)从而迅速选择期望表型。育种人员也可使用此类标记通过计算机设计基因型并实施全基因组选择。

本领域熟知的多种方法可用于检测与受关注的性状例如玉米大斑病抗性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记基因座之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。

两种用于检测所关注的性状基因座的此类方法是：1)基于种群的关联分析和2)传统的连锁分析。在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获取品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和以下观点：在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座上基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记基因座和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。

传统的连锁分析使用相同的原则；然而，LD通过从少量创始者产生种群生成。选择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein，Genetics121：185-199(1989)，其中测试沿基因图谱(1cM的区间)的许多位点中的每一个位点控制受关注性状的基因位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因位点位于基因图谱上的该位点上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。

本发明提供了展示出统计上显著的与玉米大斑病抗性的共分离的分子标记基因座，如通过传统的连锁作图技术所确定的。对这些标记基因座或附加的连锁的标记基因座的检测能够被用于标记辅助的玉米育种程序中，以产生具有增强的玉米大斑病抗性的植株或从育种程序或种植中排除不具有增强的玉米大斑病抗性的植株。

与玉米大斑病抗性关联的标记

本文中鉴定了与玉米大斑病抗性关联的标记。方法涉及检测玉米植株的种质中与增强的抗性关联的一个或多个标记等位基因的存在。玉米植株可以是杂交体或近交体。

标记基因座能够选自本文提供的任何标记基因座，包括但不限于：PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9g13-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或NLB18_E；以及与这些标记连锁的任何其他标记(连锁的标记能够从MaizeGDB资源确定)。

物理图谱位置

基因元件或位于单个染色体上的基因组DNA的邻接线性片段上的基因是物理上连锁的。

与玉米大斑病抗性关联的QTL区间能够见于图1中，并且包括BACc0435b18、c0009g13、c0043i10、c0108f16、c0117i01、c0010k12、c0125i21和c0064116。装配至BAC c0435b18和c0064116之间(包括c0435b18和c0064116)的连续DNA的任何多核苷酸(即，基于Clustal V比对方法，与BAC c0435b18和c0064116之间(包括c0435b18和c0064116)的连续DNA序列相比具有95％同一性)能够覆盖与玉米大斑病抗性性状关联的标记基因座。

连锁关系

连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示，或者以厘摩(cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。1cM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1％(意味着性状99％的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。

标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，1cM等于经过单代杂交的标记基因座将与另一个基因座分离的1％的概率。

标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有利。紧密连锁的基因座显示约10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座)显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选地约0.5％或更低，或更优选地约0.25％或更低的重组频率。因此，所述基因座分开距离为约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。

尽管特定标记等位基因能够表现出与玉米大斑病抗性表型共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定负责表达玉米大斑病抗性表型。例如，不要求标记多核苷酸序列是赋予增强的玉米大斑病抗性的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因与增强的玉米大斑病抗性表型的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先玉米品系中，标记等位基因和等位基因之间最初的“耦合”相连锁。最后通过反复重组，标记和基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可使用标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。

本文鉴定的能够被用于鉴定和选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的标记包括：PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9g13-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或NLB18_E。任何位于PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9g13-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或NLB18_E的50cM以内的标记也能够被用作针对玉米大斑病抗性的标记。

染色体区间

提供了与玉米大斑病抗性关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制受关注性状的基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)能够被用作玉米大斑病抗性标记。每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含多于一个的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与多于一个的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。

8号染色体上包含一个或多个与玉米大斑病抗性关联的QTL的区间能够被下列标记限定并包括下列标记：

a.PHM13395-27和PHM4677-11；

b.PHM13395-27和PHM3418-12；

c.2717_4和b0507L21；

d.108f16_2和pco642297_3；

e.PHM2817-26和PHM7446-6；

f.PHM4582和R；和

g.6_8和R。

位于任何这些区间内的任何标记在玉米中被用作玉米大斑病抗性的标记。

染色体区间也能够通过与所关注的标记连锁(表现出连锁不平衡)的标记限定，r²是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果本文鉴定的任何标记基因座和上述8号染色体区间中的另一个标记(也描述于本文中)之间LD的r²值大于1/3(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))，则所述基因座是连锁的。

标记等位基因和单倍型组合

本发明的标记也能够是一个或多个标记基因座上的等位基因的组合，或者称为单倍型。本文所述的任何标记等位基因能够被单独地或组合地用于鉴定或选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株。这包括表3和6中显示(条带大小)的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM4582、9g13-3、K、67、68、N、R、S和U以及它们预期的等位基因，以及单核苷酸多态性(SNP)标记等位基因：位于PHM13395-27的“G”、位于PHM4677-11的“T”、位于PHM3418-12的“A”、位于PHM15992-3的“T”、位于PHM2817-26的“C”、位于PHM7446-6的“A”和位于PHM13395-16的“G”(表4和7)。

有利的单倍型包括但不限于：在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型和在NLB18_E处的PH99N单倍型。

技术人员将期望可能存在附加的多态性位点，所述位点位于本文鉴定的8号染色体标记内部的以及周围的标记基因座上，其中一个或多个多态性位点与单倍型的一个或多个多态性位点上的等位基因连锁不平衡(LD)。在不同多态性位点上的两个特定等位基因据称是LD，如果在其中一个位点上存在等位基因，则易于推测在相同染色体上的其他位点上存在等位基因(Stevens，Mo1.Diag.4：309-17(1999))。

标记辅助的选择(MAS)

分子标记可用于多种植株育种应用(如参见Staub等人(1996)Hortscience 31：729-741；Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter.1：3-8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植株种群中选择性状的有用工具。当表型难以测定(例如很多病害抗性性状)，或表型发生在植株发育的晚期(例如籽粒特征)时，尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种群，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，两侧标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。

当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了两侧区域(Gepts.(2002)Crop Sci；42：1780-1790)。这称为“连锁累赘”。在供体植株与受体植株极不相关的情况下，这些两侧区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致产量减少或其他负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。这有时也称为“产量累赘”。两侧区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人(1998)Genetics 120：579-585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组(Tanksley等人(1989)Biotechnology7：257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植株中，至少一株植株经历交换有95％的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的1cM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植株的一次附加回交，在基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代(参见Tanksley等人，同上)。当基因的确切位置已知时，围绕基因的两侧标记可用于在不同的种群大小中对重组进行正选择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的两侧标记来检测重组。

包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。参见如IBM2邻接图谱，该图谱可在MaizeGDB网站上在线获取。

具体实施MAS的关键是：(i)限定标记-性状的关联在其中将被测定的群体，其能够是分离群体、或随机的或结构化的群体；(ii)监测多态性标记相对于性状的分离或关联，并使用统计学方法确定连锁或关联；(iii)基于统计学分析的结果限定一组所期望的标记，和(iv)运用和/或外推该信息至当前的育种种质，以使得能够作出基于标记的选择决定。本公开中描述的标记，以及其他标记类型例如SSR和FLP，可用于标记辅助的选择方案。

简单重复序列(SSR)能够被定义为相对少量的6bp或更短的DNA的串联重复(Tautz(1989)Nucleic Acid Research 17：6463-6471；Wang等人(1994)Theoretical and Applied Genetics，88：1-6)。多态性由于重复单元数量的变化而增加，这种变化很可能是由DNA复制过程中的滑移导致的(Levinson和Gutman(1987)Mol Biol Evol 4：203-221)。重复长度的变化可通过在保守的非重复两侧区域设计PCR引物来检测(Weber和May(1989)Am J Hum Genet.44：388-396)。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且适合高通量自动化(Rafalski等人(1996)Generating and using DNA markers in plants，Non-mammalian genomic analysis：a practical guide.Academic press，第75-135页)。

可生成各种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征图可通过扩增产物的凝胶电泳获取。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由位于Saint-Jean-sur-Richelieu，Quebec，Canada的DNA Landmarks依据合同规定向公众提供玉米的SSR服务。

也可生成各种类型的FLP标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。此类FLP标记在很多方面类似于SSR标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段能够在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失常常发生于玉米中(Bhattramakki等人(2002)Plant Mol Biol 48，539-547；Rafalski(2002b，同上))。

SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型当中，SNP是最多的，因此具有提供最高基因图谱分辨率的能力(Bhattramakki等人2002，Plant Molecular Biology 48：539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上进行检测，即以所谓的“超高通量”模式进行检测，因为它们不需要大量DNA，并且可直接进行自动化检测。SNP也具有成为相对低成本系统的前景。这三个因素一起使得SNP对在MAS中的应用具有高度吸引力。若干种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶酶解、微测序和编码球。此类方法已经被以下文献叙述：Gut(2001)Hum Mutat 17，第475-492页；Shi(2001)Clin Chem 47，第164-172页；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1，第95-100页；Bhattramakki和Rafalski(2001)Discovery and application of single nucleotidepolymorphism markers in plants，R.J.Henry编辑，Plant Genotyping：The DNAFingerprinting of Plants，CABI Publishing，Wallingford。多种可商购获得的技术利用这些方法和其他方法检查SNP，包括Masscode.TM.(Qiagen)，Invader.RTM.(Third Wave Technologies)，SnapShot.RTM.(AppliedBiosystems)，Taqman.RTM.(Applied Biosystems)，以及Beadarrays.TM.(Illumina)。

许多一起在单条序列内、或跨越连锁序列的SNP可用于描述任何特定基因型的单倍型(Ching等人(2002)BMC Genet.3：19；Gupta等人2001；Rafalski(2002b)Plant Science 162：329-333)。单倍型可比单个的SNP提供更多信息，并且可描述较多的任何特定基因型。例如，单个的SNP可以是具有玉米大斑病抗性的特定品系或品种的等位基因“T”，但是等位基因“T”也可发生在用于轮回亲本的玉米育种种群中。在这种情况下，单倍型例如在连锁SNP标记上的等位基因组合可提供较多的信息。一旦已经将唯一的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可用于种群或其任何亚群以确定是否个体具有特定基因。参见例如WO2003054229。使用本领域普通技术人员已知的那些自动化高通量标记检测平台使得这一方法高效和有效。

除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其他类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA(RAPD)、以及其他基于核酸的标记。

在一些情况下，同功酶特征图和连锁的形态学特征也可间接用作标记。尽管它们不直接检测DNA差异，它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测DNA变异的标记远远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性(Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1：3-8)。

序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新序列靠近本文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和/或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开中描述，但是位于相似区域内。这些图谱可在玉米物种中，或者甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的其他物种，如大米、小麦、大麦或高粱。

一般来讲，MAS使用的多态性标记是经鉴定具有与玉米大斑病抗性共分离的显著概率的那些。推测此类标记在图谱上接近赋予植株玉米大斑病抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示、或标记。测试植株是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座上包含期望基因型的植株将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。

PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9g13-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、和NLB18_E，以及其他遗传上或物理上被作图至相同染色体片段的标记，可以被用于选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株。然而，并非所有在遗传上和物理上作图至相同染色体片段的标记都可用于对具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株进行正选择，因为标记可能在特定种群内无法提供足够的信息。

本文提供的区间用于MAS中，以选择表现出增强的玉米大斑病抗性的植株。例如，被作图至8号染色体区间内的任何标记能够被用于此目的，所述区间由如下标记限定并且包括它们：

a.PHM13395-27和PHM4677-11；

b.PHM13395-27和PHM3418-12；

c.2717_4和b0507L21；

d.108f16_2和pco642297_3；

e.PHM2817-26和PHM7446-6；

f.PHM4582和R；以及

g.6_8和R。

用于选择的方法能够涉及检测与同增强的玉米大斑病抗性关联的标记等位基因或单倍型连锁并关联的一种或多种标记等位基因在玉米植株或种质中的存在，然后基于所检测的标记等位基因选择玉米植株或种质。所述单倍型能够是在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。

用于MAS的方法还能够包括获得第一玉米植株，所述第一玉米植株在其基因组中包含与增强的玉米大斑病抗性关联的单倍型，所述单倍型例如在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型；将所述第一玉米植株与具有较低水平抗性的第二玉米植株杂交；以及就所述第一玉米植株的单倍型的存在对子代进行基因分型。然后，具有所述第一玉米植株的单倍型(即与增强的玉米大斑病抗性关联的单倍型)的子代植株能够被选择为具有增强的玉米大斑病抗性。

通过转基因的异位表达的增强的抗性

本发明的实施方案还包括分离的或充分纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质，或其生物活性部分，是充分地或基本上不含那些在天然存在环境中伴随所述多核苷酸或蛋白质或与其相互作用的组分的。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当其是通过重组技术(例如PCR扩增)产生的时，基本上不含其他细胞物质，或者当其是化学合成的时，基本上不含化学前体或其他化学品。最理想的情况，“分离的”多核苷酸不含在该多核苷酸所来源于的生物的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两侧(即，位于所述多核苷酸的5′和3′端)的序列(例如，蛋白质编码序列)。例如，在不同的实施方案中，所述分离的多核苷酸可包含少于约5kb、约4kb、约3kb、约2kb、约1kb、约0.5kb、或约0.1kb的在该多核苷酸所来源于的细胞的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两侧的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的蛋白质包括制备含有少于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(以干重计)的杂蛋白的蛋白质。当所述实施方案的蛋白质或其生物活性部分为重组生产的时，最佳的培养基包含少于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(以干重计)的化学前体或非目标蛋白质的化学品。

所公开的核苷酸序列片段和突体，以及由此编码的蛋白质也包括在本发明的实施方案内。“片段”旨在表示核苷酸序列的部分或氨基酸序列的部分以及由此编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可编码保留了天然蛋白质的生物学活性的蛋白质片段，所述蛋白质片段因此具有赋予植株真菌抗性的能力。作为另外一种选择，作为杂交探针起作用的核苷酸序列的片段不必编码保留了生物学活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列片段的长度范围可以是至少约15个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、以及最多为编码本发明实施方案的多肽的全长核苷酸序列。

编码本发明实施方案的多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段，将编码至少约15个、约25个、约30个、约40个或约50个连续的氨基酸，或最多存在于本发明实施方案的全长多肽中的总的数量的氨基酸。用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列片段一般不需要编码蛋白质的生物活性部分。

如本文所用，就所指定的多核苷酸而言的“全长序列”意指具有天然序列的完整核酸序列。“天然序列”旨在表示内源性序列，即，存在于生物基因组中的非工程化的序列。

因此，本发明实施方案的核苷酸序列的片段可编码多肽的生物活性部分，或者它可以是能用作使用下文所公开方法的杂交探针或PCR引物的片段。抗病原体的多肽的生物活性部分，可通过分离本发明实施方案的核苷酸序列之一的一个部分、表达所述蛋白质的编码部分、以及评估所述蛋白质的编码部分赋予或增强植株的真菌抗性的能力进行制备。作为本发明实施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子，包含至少约15个、约20个、约50个、约75个、约100个或约150个核苷酸，或最多存在于本文所公开的全长核苷酸序列中的总的数量的核苷酸。

“变体”旨在表示基本上类似的序列。就多核苷酸而言，变体包括在天然多核苷酸的一个或多个内部位点有一个或多个核苷酸的缺失和/或插入，和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点有一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域的技术人员将认识到，本发明实施方案的核酸的变体将被构建为使得开放阅读框被保持。就多核苷酸而言，保守的变体包括那些由于遗传密码的简并性，编码本发明实施方案的多肽之一的氨基酸序列的序列。天然存在的等位变体如这些能通过使用熟知的分子生物学技术鉴定的变体，所述技术例如下文所列出的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成得到的多核苷酸，例如，那些通过利用例如定点诱变产生的多核苷酸，但其仍然编码本发明实施方案的蛋白质。一般来讲，如通过序列比对程序和本文其他地方所述的参数所测定的，本发明实施方案的特定多核苷酸的变体与该特定多核苷酸之间将至少具有约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的序列同一性。

本发明实施方案的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体，还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽和参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分比来加以评估。因此，例如，本文公开了所编码的多肽与SEQID NO：93、95、或97的多肽具有给定的序列同一性百分比的分离的多核苷酸。任何两种多肽之间的序列同一性百分比可利用序列比对程序和本文其他地方所述的参数计算出。当通过比较本发明实施方案的任何一对给定的多核苷酸所编码的两种多肽之间的序列同一性百分比，来评估所述任何一对给定的多核苷酸时，上述两种编码的多肽之间的序列同一性百分比为至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。

“变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白质的一个或多个内部位点有一个或多个氨基酸的缺失或插入，和/或在天然蛋白质的一个或多个位点有一个或多个氨基酸的取代而源自于所述天然蛋白质的蛋白质。本发明实施方案所包括的变体蛋白质是具有生物活性的，也就是说它们仍然拥有天然蛋白质所拥有的所期望的生物活性，即赋予或增强植株病原真菌抗性的能力，如本文所述。此类变体可得自例如遗传多态性或得自人工操纵。如通过序列比对程序和本文其他地方所述的参数所测定的，本发明实施方案的天然蛋白质的具生物活性的变体与该天然蛋白质的氨基酸序列之间将至少具有约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的序列同一性。本发明实施方案的蛋白质的具生物活性的变体与该蛋白质之间，可以在少至约1-15个氨基酸残基、少至约1-10个，例如约6-10个、少至约5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基上存在不同。

本发明实施方案的蛋白质可用多种方法进行改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。此类操纵方法是本领域一般已知的。例如，抗病蛋白质的氨基酸序列变体和片段能够通过DNA中的突变制备。用于突变生成和多核苷酸改变的方法是本领域中所熟知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)，以及它们引用的文献。关于不影响受关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可参见Dayhoff等人的模型(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，其以引用方式并入本文。可优选保守取代，如用一个具有相似性质的氨基酸取代另一个氨基酸。

因此，本发明实施方案的基因和多核苷酸既包括天然存在的序列也包括突变形式。同样的，本发明实施方案的蛋白质既包括天然存在的蛋白质也包括其变体和修饰形式。此类变体将继续拥有所期望的赋予或增强植株病原真菌抗性的能力。显然，在编码变体的DNA中制造的突变不应将所述序列置于阅读框之外，并且优选地将不产生能导致产生mRNA二级结构的互补区域。参见EP专利0075444。

不期望本文包括的蛋白质序列的缺失、插入和取代导致所述蛋白质的特性产生巨大的改变。然而，考虑到取代、缺失或插入的确切效果在进行这些操作之前难以预料，本领域的技术人员将会知道，将通过筛选用变体蛋白转化的转基因植株对所述效果进行评估，以确定对植株抵御病原真菌攻击的能力的影响。

变体多核苷酸和蛋白质也包括来源于诱变或重组过程(包括且不限于例如DNA改组这样的过程)的序列和蛋白质。本领域的技术人员能够设想那些将会改变蛋白质相应的病原体的范围的修饰。通过此类过程，一种或多种不同的蛋白质编码序列可被操作，以产生拥有所期望的性质的新蛋白质。如此，从一组包含具有基本的序列同一性、并且能在体外或体内进行同源重组的序列区域的相关多核苷酸序列，产生了重组多核苷酸文库。例如，采用这一途径，编码一个受关注的结构域的序列基序，可以在本发明实施方案的蛋白质基因和其他已知的蛋白质基因之间重排，以得到编码具有改良的受关注特性的蛋白质的新基因，所述特性例如提高的赋予或增强植株病原真菌抗性的能力。用于此类DNA改组的策略是本领域中已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利5,605,793和5,837,458。

本发明实施方案的多核苷酸可被用于从其他生物(尤其是其他植株)分离相应的序列。如此，能使用例如PCR、杂交等方法基于此类序列与本文所述序列的序列同源性鉴定此类序列。基于其与本文所述的完整序列之间或与它们的变体和片段之间的序列同一性而被分离的序列，被包括在本发明实施方案之内。此类序列包括公开序列的直系同源物。“直系同源物”旨在表示来源于共同的祖先基因并作为物种形成的结果存在于不同物种的基因。当存在于不同物种中的基因的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列至少具有约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或更高的序列同一性时，这些基因被认为是直系同源体。直系同源物的功能在物种之间经常是高度保守的。因此，编码赋予或增强真菌植株病原体抗性的蛋白质的、和在严格条件下与本文所公开的序列或其变体或片段杂交的分离的多核苷酸，均包括在本发明的实施方案内。

在一个PCR方法中，能设计寡核苷酸引物用于PCR反应以从提取自任何受关注生物的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域一般已知的，公开于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。也参见Innis等人编辑(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(AcademicPress，New York)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand编辑(1999)PCRMethods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括且不限于使用成对引物、巢式引物、单个特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知多核苷酸的全部或部分用作探针，探针选择性地杂交到来自所选择生物的存在于一组克隆基因组DNA片段或cDNA片段的其他对应多核苷酸上(即，基因组或cDNA文库)。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测的基团如³²P、或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，通过基于本发明实施方案的多核苷酸标记合成的寡核苷酸，可制得用于杂交的探针。用于制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域一般已知的，并且公开于Sambrook等人所著文献(1989，同上)中。

例如，本文所公开的完整的多核苷酸，或其一个或多个部分，可被用作能特异性地与相应的多核苷酸和信使RNA杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括特有的序列，并且所述序列的长度优选为至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸或至少约20个核苷酸。此类探针可被用于通过PCR从选定的生物扩增相应的多核苷酸。可使用此技术分离来自所期望生物的附加编码序列或作为诊断检测分析法测定编码序列在一种生物中的存在。杂交技术包括杂交筛选置于板上的DNA文库(噬菌斑或菌落；参见例如，Sambrook等人(1989，同上))。

可在严格条件下进行此类序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”是指在该条件下探针将以比其他序列更高的可检测程度杂交到其靶序列上(例如至少2倍于背景)。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，优选长度少于500个核苷酸。

通常，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01M至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10个至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含有30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50℃至55℃下用1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55℃至60℃下用0.5X至1XSSC洗涤。示例性的高度严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中杂交，以及最终在60℃至65℃下用0.1X SSC洗涤至少30分钟。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交时间一般小于约24小时，通常为约4小时至约12小时。洗涤时间为至少足够达到平衡状态的一段时间。

特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。就DNA-DNA杂交体而言，热力学熔点(T_m)可以估算自Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的公式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L为以碱基对表示的杂交体的长度。T_m指(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可调节T_m、杂交和/或洗涤条件以与具有所期望的同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的T_m低约5℃。然而，极严格条件可采用在T_m低1℃、2℃、3℃或4℃的温度下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的温度下的杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的温度下的杂交和/或洗涤。利用上述公式、杂交和洗涤组合物以及所需的T_m，一般技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上得以描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选提高SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的一个广泛适用的指导可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；以及Ausubel等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等人(1989，同上)。

有多种方法可被用于检测特定序列的DNA、RNA或蛋白质是否存在。这些方法包括例如，DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹和ELISA分析。诸如上述这些的技术为本领域的技术人员所熟知，并且有大量提供了详细操作规程的参考文献存在。此类参考文献包括Sambrook等人(1989，同上)，以及Crowther，J.R.(2001)The ELISA Guidebook，Humana Press，Totowa，NJ，USA。

以下术语被用于描述在两种或更多种多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比对窗口”，(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分比”。

(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比对基准的定义序列。参考序列可以是指定序列的一部分或全部；例如，全长cDNA或基因序列的一个片段，或全长cDNA或基因序列。

(b)如本文所用，“比对窗口”比较参考序列和多核苷酸序列的连续的指定片段，其中在所述比对窗口中的多核苷酸序列与参考序列(不包含插入或缺失)相比可以包含插入或缺失(即间隙)，以获得两段多核苷酸之间的最大匹配。一般来讲，比对窗口的长度为至少约20个连续的核苷酸，并且任选地可以为约30个、约40个、约50个、约100个或更长。本领域的技术人员懂得为了避免由于在多核苷酸序列中包含空位导致的它与参考序列的高度相似，通常导入空位罚分并从匹配数目中减去空位罚分。

用于比对的序列比对方法是本领域熟知的。因此，能使用数学算法测定任意两个序列之间的序列同一性百分比。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部搜寻比对方法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，由Karlin和Altschul改进(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。

能利用计算机实施这些数学算法，以比对序列、测定序列同一性。此类具体实施包括且不限于：在PC/Gene程序中的CLUSTAL(得自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(版本2.0)和GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10(可得自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。能够使用默认参数进行使用这些程序的比对。以下文献很好地描述了CLUSTAL程序：Higgins等人(1988)Gene73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS8：155-65；以及Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988，同上)的算法。当比对氨基酸序列时，PAM120权重残基表、gap length penalty 12、以及gap penalty 4能与ALIGN程序一起使用。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul的算法(1990，同上)。可使用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，score＝100，wordlength＝12，以获取与编码本发明实施方案的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可使用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索，score＝50，wordlength＝3，以获取与本发明实施方案的多肽同源的氨基酸序列。为了获取用于比对目的的空位比对，可利用Gapped BLAST(BLAST 2.0)，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述。作为另外一种选择，可使用PSI-BLAST(BLAST 2.0)进行重复搜索，它检测分子间的较远关系。参见Altschul等人(1997，同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用相应程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通过检查进行手动比对。

除非另作说明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10获得的值，使用以下参数：核苷酸序列的％同一性和％相似性使用GAPWeight 50和Length Weight 3，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性使用Gap Weight 8和Length Weight 2，以及BLOSUM62计分矩阵；或者它们的任何等效程序。“等效程序”是指满足下列条件的任何序列比对程序：就任何正被讨论的两个序列而言，与GAP版本10生成的对应比对相比，所述序列比对程序生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以找出两个完整序列之间使匹配数最大化和空位数最小化的比对结果。GAP考虑所有可能的比对和空位位点，并制备最大数目的匹配碱基和最少的空位。它允许以匹配碱基单位提供空位形成罚分和空位延伸罚分。GAP必须对它插入的每个空位形成空位形成罚分匹配数。如果选择空位延伸罚分大于零，GAP必须另外形成对每个空位延伸罚分的空位次数的插入长度的空位罚分。蛋白质序列的GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10默认的空位形成罚分值和空位延伸罚分值分别是8和2。核苷酸序列的默认空位形成罚分是50，而默认空位延伸罚分是3。空位形成罚分和空位延伸罚分能用选自0至200的整数表达。因此例如空位形成罚分和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP提供了比对家族中的其中一个最好的成员。此家族中可能有很多成员，并且其他成员没有更好的质量。GAP显示了用于比对的四个质量因数：质量、比率、同一性和相似性。质量是比对序列的最大量度。比率是质量除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似符号的百分比。忽略来自空位对面的符号。当一对符号的计分矩阵值大于或等于0.50时(相似性阈值)，对相似性打分。GCGWisconsin Genetics Software Package版本10中使用的计分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。

(c)如本文所用，涉及两种多核苷酸或多肽序列时的“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。已经认识到当序列同一性百分比用于蛋白质时，不同的残基位置常常存在保守氨基酸取代的差异，其中氨基酸残基被取代为具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并因此不改变该分子的功能特性。当序列出现保守取代差异时，可上调序列同一性百分比进行纠正以保持取代的保守性质。存在此类保守取代差异的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行此类调整的方法为本领域的技术人员所熟知。通常这涉及给一个保守取代评分为部分而不是完全错配，因此提高序列同一性百分比。因此例如其中一个相同氨基酸计分为1，而非保守取代计分为零，保守取代计分介于零和1之间。例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中进行保守取代的计分计算。

(d)如本文所用，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口中比较两个最优化比对的序列而测定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分与参考序列(参考序列不包括插入或缺失)相比可包括插入或缺失(即间隙)以达到两序列的最佳比对效果。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。

术语“多核苷酸”的使用并无将实施方案限制于包括DNA在内的多核苷酸之意。本领域的一般技术人员将认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明实施方案的多核苷酸还包括所有形式的序列，所述形式包括且不限于单链形式、双链形式等等。

可将本发明实施方案的分离的多核苷酸结合到能够导入并在宿主细胞中复制的重组DNA构建体中。“载体”可以是这样的一类构建体，其包括一套复制体系和能够在给定的宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。适用于稳定转染植株细胞或构建转基因植株的许多载体，已描述于，例如，Pouwels等人，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，1989；以及Flevin等人，Plant Molecular Biology Manual，KluwerAcademic Publishers，1990。通常，植株表达载体包括例如，一个或多个处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆的植株基因和显性选择性标记。这样的植株表达载体还可含有启动子调控区(例如控制着诱导型或组成型、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

术语“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”、“重组DNA构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换使用，并且均为核酸片段。重组构建体包括人造的核酸片段组合，包括且不限于天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如，重组DNA构建体可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源并以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明实施方案的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。为获得表现出所期望表达水平和模式的多核苷酸或抗性基因座的品系而进行的筛选，可通过扩增、DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白质表达的免疫印迹分析、表型分析等等完成。

术语“重组DNA构建体”是指从获得自不同来源的核酸片段组装而成的DNA构建体。所述核酸片段的类型和来源可以是大为不同的。

在一些实施方案中，进一步提供了表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至所述实施方案的异源核苷酸序列的启动子。所述实施方案的表达盒用于产生转化的植株、植株细胞和微生物，以及用于本文所公开的引起植株病原真菌抗性的方法的实施。所述表达盒将包括可操作地连接至本发明的实施方案的多核苷酸的5′和3调控序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。“调控序列”指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)，并且可以影响相关编码序列的转录、RNA加工、稳定性或者翻译的核苷酸。调控序列可包括且不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。例如，受关注的多核苷酸和调控序列(例如一个启动子)之间的可操作的连接，为允许该受关注的多核苷酸的表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当用于指两个蛋白质编码区的连接时，“可操作地连接”意指所述编码区处于同一阅读框。所述盒可附加地包含将被转化到生物体中的至少一个附加基因。作为另外一种选择，能通过多个表达盒提供附加基因。这样的表达框具有多个限制性位点和/或重组位点，用以将编码抗病原体的多肽的多核苷酸插入至使其处于所述调控区的转录调控之下的位置。所述表达盒可附加地包含选择性标记基因。

所述表达框将在5′-3′的转录方向上包括一个转录起始区(即，启动子)、翻译起始区、所述实施方案的多核苷酸、一个翻译终止区、以及任选地，一个在宿主生物中有功能的转录终止区。所述调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或所述实施方案的多核苷酸对宿主细胞而言或者对彼此而言可以是天然的/类似的。作为另外一种选择，所述调控区和/或所述实施方案的多核苷酸对宿主细胞而言或者对彼此而言可以是异源的。本文在序列方面所用的“异源”是指，源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，则为通过蓄意的人为干预而从其天然形式在组成和/或基因组基因座方面受到充分修饰的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的一个启动子所来自的物种，不同于所述多核苷酸所来源自的物种，或者，如果二者来自相同的/类似的物种，则二者之一或二者均为从其原始形式和/或基因组基因座经过充分修饰的，或者所述启动子并非针对可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

任选地包括的终止区就转录起始区而言可以是天然的、就受关注的可操作地连接的多核苷酸而言可以是天然的、就植株宿主而言可以是天然的，或者就启动子、受关注的所述多核苷酸、宿主或者它们的任意组合而言，可以是源自其他来源的(即，外来的或异源的)。使用方便的终止区得自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，例如真蛸碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic AcidsRes.17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic AcidsRes.15：9627-9639。在特定实施方案中，使用了马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(PinII)终止子。参见例如，Keil等人(1986)Nucl.AcidsRes.14：5641-5650；以及An等人(1989)Plant Cell 1：115-122，它们的全文以引用方式并入本文。

有多种启动子可用于本发明实施方案的实施中，包括所关注的多核苷酸序列的天然启动子。能基于所需结果选择启动子。Potenza等人最近的综述(2004)In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40：1-22中讨论了范围广泛的植株启动子，其以引用方式并入本文。例如，核酸可与组成型的、组织优选的、病原体诱导的或者其他的启动子相结合以在植株中表达。此类组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白启动子(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素启动子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.，18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如，美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。

由诱导型启动子，特别是由病原体诱导型启动子表达基因有时可以是有益的。这样的启动子包括源自发病机理相关蛋白(PR蛋白)的那些，其是在被病原体感染后诱导的，所述蛋白是例如，PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参见例如，Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell 4：645-656；以及Van Loon(1985)PlantMol.Virol.4：111-116。还参见WO 99/43819，其以引用方式并入本文。

受关注的是在病原体感染处或在其附近导致蛋白质局部表达的启动子。参见例如，Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。也参见Chen等人(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利5,750,386(线虫类-可诱导的)；以及其中所引用的参考文献。特别关注的是针对玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见例如Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。

此外，在病原体发现经由伤口或昆虫损害而进入植株的入口时，伤口诱导型启动子可用于本发明实施方案的构建。这样的伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等人(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利5,428,148；win1和win2(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(systemin)(McGurl等人(1992)Science225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok等人(1994)Plant J.6(2)：141-150)；等，其以引用方式并入本文。

化学调节的启动子可用于通过施用外来化学调节剂来调节基因在植株中的表达。根据这一目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括且不限于玉米In2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活的，玉米GST启动子，其是通过用作芽前除草剂的疏水亲电性化合物而激活的，以及烟草PR-1a启动子，其是通过水杨酸激活的。所关注的其他化学调节的启动子包括甾类化合物反应性启动子(参见例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)，以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet 227：229-237，以及美国专利5,814,618和5,789,156)，它们以引用方式并入本文。

组织优选的启动子可用于将本发明实施方案的多核苷酸增强的表达定位于特定植株组织内。例如，组织优选的启动子可被用于在一种植株组织中表达一种多肽，其中在所述组织处疾病抗性尤其重要，所述组织例如根、茎或叶。组织优选的启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人(1993)PlantMol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，可修饰这样的启动子以进行弱表达。

维管组织优选的启动子是本领域已知的，并且包括那些选择性地在例如木质部和韧皮部的组织中驱动蛋白质表达的启动子。维管组织优选的启动子包括且不限于，黑樱桃(Prunus serotina)野黑樱苷水解酶基因启动子(参见例如，国际公布WO 03/006651)，以及见于美国专利申请10/109,488中的那些启动子。

茎优选的启动子可用于驱动本发明实施方案的多肽的表达。示例性的茎优选的启动子包括玉米MS8-15基因启动子(参见例如，美国专利5,986,174和国际公布WO 98/00533)，以及见于Graham等人(1997)PlantMol Biol33(4)：729-735中的那些启动子。

叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。

根优选的启动子是已知的，并且可以选自文献中记载的很多启动子或者从不同相容物种中重新分离的启动子。参见例如Hire等人(1992)PlantMol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。也参见Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7)：633-641，其中描述了两种根特异性启动子，它们是从来自固氮非豆科(nonlegume)Parasponia andersonii以及相关非固氮非豆科(nonlegume)山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的。将这些基因的启动子与β-葡糖醛酸酶报道基因连接，并且导入非豆科的烟草(Nicotiana tabacum)和豆科的百脉根(Lotus corniculatus)内，在这两种情况下，都保持了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们推断，增强子和组织特异性DNA决定子在这些启动子中解离。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以表明编码章鱼碱合酶的农杆菌属(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特别活性，以及TR2′基因在完整植株中是根特异性的，并且受叶组织中的伤害的刺激，这是用来与杀虫或杀幼虫基因一起使用的特别期望的特征组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因表现出类似特征。另外的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；以及rolB启动子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。也参见美国专利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。

“种子优选的”启动子包括“种子特异性的”启动子(那些在种子发芽期间有活性的启动子，如种子贮藏蛋白启动子)以及“种子发芽”启动子(那些在种子发芽期间有活性的启动子)。参见Thompson等人(1989)BioEssays 10：108，该文献以引用方式并入本文。此类种子优选的启动子包括且不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信使)；cZ19B1(玉米19kDa蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶)(参见WO 00/11177和美国专利6,225,529；其以引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子(Gamma-zein)为优选的胚乳特异性启动子。Glob-1为优选的胚芽特异性启动子。就双子叶植株而言，种子特异性的启动子包括且不限于菜豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等的启动子。就双子叶植株而言，种子特异性的启动子包括且不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、糯质基因(waxy)、超甜基因1(shrunken 1)、超甜基因2(shrunken2)、球蛋白1等的启动子。另参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选的启动子；它们以引用方式并入本文。

在细胞宿主中促进基因表达的附加序列的修改形式是已知的。这些序列包括消除编码伪聚腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子接合位点信号的序列、转座子样重复序列、和其他此类对基因表达不利的特征明显的序列。就一个给定的细胞宿主而言，可以将所述序列的G-C含量调节至平均水平，所述平均水平通过参考宿主细胞中表达的已知基因进行计算。当可能的时候，修饰所述序列以避免经推测可能发生的mRNA发夹二级结构。

表达盒可附加地包含5′前导序列。此类前导序列能够促进翻译。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)、以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)；非翻译前导序列，来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA，编辑Cech(Liss，New York)，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。也参见Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.84：965-968。也能利用促进翻译的其他已知方法，例如内含子等。

在制备表达盒的过程中，可操作多个DNA片段以在正确方向上，以及，如果适当的话，在正确阅读框中提供DNA序列。为了这一目的，可使用衔接子或连接子以接合DNA片段，或者使用其他操作方法提供方便的限制性位点以移除冗余DNA、移除限制性位点等。为了这一目的，可使用体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再取代，例如转换和颠换。

表达盒也可包含选择性标记基因，用于选择转化过的细胞。利用选择性标记基因以选择转化过的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，除草化合物如草胺磷铵、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。附加的可选择的标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechno lBioeng 85：610-9和Fetter等人(2004)PlantCell 16：215-28)、蓝绿色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.CellScience 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol 129：913-42)、以及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP  ，参见Bolte等人(2004)J.CellScience 117：943-54)。关于附加的选择性标记，一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人(1980)The Operon，第177-220页；Hu等人(1987)Cell 48：555-566；Brown等人(1987)Cell49：603-612；Figge等人(1988)Cell52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)博士学位论文，University of Heidelberg；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acds Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)博士学位论文，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature 334：721-724。此类公开以引用方式并入本文。

上文的选择性标记基因列表并不意味着受限制。本发明实施方案中可使用任何选择性标记基因。

在某些实施方案中，该实施方案的核酸序列可以与受关注的多核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有所需表型的植株。可以通过基因在DNA构建体内的组合，或者通过将包含所述抗性基因座的品系与包含所述组合的另一品系杂交实现这种堆积。例如，所述实施方案的多核苷酸可以与该实施方案的任何其它多核苷酸或其它基因进行堆叠。生成的组合也可包括受关注的多核苷酸的多个拷贝中的任何一个。所述实施方案的多核苷酸也可与任何其它基因或基因组合发生堆叠以产生具有多种所期望的性状组合的植株，包括且不限于动物饲料所需的特性，如高油基因(例如美国专利6,232,529)；平衡氨基酸(例如硫素(hordothionins)(美国专利5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；提高的消化性(例如修饰的贮藏蛋白质(美国专利申请序列10/053,410，提交于2001年11月7日)；和硫氧还蛋白(美国专利申请序列10/005,429，提交于2001年12月3日))，上述公开以引用方式并入本文。本发明实施方案的多核苷酸也能够与关于昆虫、疾病或除草剂抗性的期望性状堆积(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美国专利5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser等人(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马菌素脱毒(fumonisin detoxification)基因(美国专利公开5,792,931)；无毒性和抗病性基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变体；谷氨酰胺合酶抑制剂，如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因、GAT基因如那些公开于美国专利申请公布US2004/0082770、WO02/36782和WO03/092360中的基因)；和产品的加工或处理所期望的性状，例如高油(例如，美国专利6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉支链化酶(SBE)和淀粉去支链化酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)，有利于表达聚羟基链烷酸酯(PHA))，其公开以引用方式并入本文。也可以将所述实施方案的多核苷酸与提供农学性状的多核苷酸组合，所述农学性状例如雄性不育(例如，参见美国专利5.583,210)、秸秆强度、开花时间、或转化技术性状如细胞周期调节或基因打靶(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO99/25821)，上述公开以引用方式并入本文。

可通过任何方法产生这些堆叠的组合，包括且不限于通过任何常规方法或

方法的杂交育种植株，或者基因转化。如果所述特性通过遗传转化植株堆叠，则受关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种所需特性的转基因植株用作靶，通过后续的转化导入更多特性。可以用共转化规程将特性与受关注的多核苷酸同时导入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，加入将导入两个序列，可将两个序列包含在分离的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子促进序列表达。在某些情况下，可能期望导入将抑制受关注的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或过表达盒的任何组合组合使用以在植株中生成所需特性组合。

本发明实施方案的方法可以涉及但不限于将多肽或多核苷酸引入植株。“引入”旨在表示使所述多核苷酸出现在所述植株中。在一些实施方案中，多核苷酸将以使所述序列能够进入植株的细胞内部的方式存在，包括其向植株基因组可能的插入。所述实施方案的方法不依赖于将序列导入植株的特定方法，只要使多核苷酸进入植株的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸导入植株的方法是本领域已知的，包括且不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“转化”是指将核酸片段转入宿主生物的基因组中，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物体。“宿主细胞”指重组DNA构建体转化至其中的细胞，可包括酵母细胞、细菌细胞和植株细胞。植株转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等人，1987，Meth.143：277)和微粒加速的或者“基因枪”转化技术(Klein等人，1987，Nature(London)327：70-73；美国专利4,945,050)，等等。

“稳定转化”旨在表示将核苷酸构建体导入植株并整合进植株基因组中，并且能够由其后代继承。“瞬时转化”或“瞬时表达”旨在表示多核苷酸被引入植株并且不整合进该植株的基因组中或者多肽被引入植株中。

转化规程以及用于将多肽或多核苷酸序列导入植株内的规程可以根据被作为转化目标的植株或植株细胞的类型，例如单子叶植株或双子叶植株而改变。将多肽和多核苷酸导入植株细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌属(Agrobacterium-)介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)、直接的基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)、以及微粒加速(参见例如Sanford等人，美国专利4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，编辑Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lecltransformation(WO 00/28058)。也参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science andTechnology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利5,736,369(谷物)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)The Experimental Manipulation of OvuleTissues，编辑Chapman等人(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports 12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(经由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉米)；所有这些文献以引用方式并入本文。

用于在植株基因组的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本领域中已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在所期望的基因组位置的插入利用位点特异性重组系统实现。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，它们均以引用方式并入本文。简而言之，所述实施方案的多核苷酸被包含在转移盒中，两侧与两个不同的重组位点相连。所述转移盒被导入植株中，所述植株的基因组中已稳定地整合了两侧与两个不同的重组位点相连的靶位点，所述重组位点对应于所述转移盒中的位点。提供了适当的重组酶，并且所述转移盒被整合至所述靶位点。受关注的多核苷酸从而被整合至所述植株基因组的特定染色体位置。

已经被转化的细胞可根据常规方法生长为植株。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5：81-84。然后可培养这些植株，并用相同的或不同的转化过的植株进行授粉，具有所期望表型特征的组成型表达的所得到的子代被鉴定。可以生长两代或多代以保证所希望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所希望的表型特征的表达已经实现。以这种方式，所述实施方案提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，所述转化的种子具有稳定地整合至其基因组中的所述实施方案的核苷酸构建体，例如所述实施方案的表达盒。

如本文所用，术语“植株”可以是整个植株、其任意的部分、或者来源于植株的细胞或组织培养物。因此，术语“植株”可指代以下任何一种材料：整个植株、植株的部分或器官(包括但不限于胚芽、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等等)、植株组织、植株细胞、植株原生质体、可从其再生出玉米植株的植株细胞组织培养物、植株愈伤组织、植株丛和植株种子。植株细胞是植株的细胞，其或者直接取自种子或植株，或者源自取自植株的细胞的培养物。谷物旨在表示商业化种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生植株的子代、变体和突变体也包括在本发明实施方案的范围内，前提条件是这些部分包含导入的多核苷酸。

本发明的实施方案可被用于赋予或增强植株病原真菌抗性，或者使植株免受病原真菌攻击伤害，所述植株尤其是玉米(Zea mays)。其将保护植株的不同部分免受病原体攻击伤害，所述部分包括且不限于茎、穗、叶、根和雄穗。

在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“植株”也包括多个植株；取决于上下文，使用的术语“植株”也可包括该植株遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝；

实施例

提供以下实施例以示出所述权利要求，但本发明不受以下实施例的限制。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实施例1

玉米大斑病感染的基因分型

能够以1至9分标度就玉米大斑病(NLB)对玉米植株进行评估，其中1-3的分数表示“易感的”，4-6的分数表示“中等的”，7-9的分数表示“抗性的”。图3中图示的评分能够被用作指南，重点是穗上方的病变。通过检查雪茄状或船形的侧面平滑的病变和/或通过将样品送至诊断实验室以确认病原体的身份，能够将病变确认为由玉米大斑病感染导致。

在开花后二至四周，能够从一些已知的易感品系获得分数，然后与它们历史记录的评分比较。如果已知的易感品系被评分为比它们历史记录的分数高至少两分，则将测试组中的品系的评分延迟，从而允许病害发展至感染的标准状态。评分期仅能被延长至植株衰老之前。因此，如果在4-5周后分数依然过高，则病害的压力不足以进行有效的评分。

如果在从开花后2-4周直到植株衰老之前期间，来自已知的易感品系的分数确与它们的历史记录分数关联，能够用图3中的评分图表作为指南试验性地对测试的品系评分。

实施例2

来自PH26N(HtBC)的8号染色体NLB抗性QTL的精细作图

群体发育和初始的QTL作图

非适应性的热带的专有玉米近交系PH26N被鉴定为玉米大斑病(NLB)抗性的来源。为了有利于与玉米大斑病抗性关联的一种或多种QTL的检测，以PH26N作为供体和以PH581作为轮回亲本，构建了228个品系的双单倍体BC3群体。如实施例1中所述进行了病害筛选，鉴定了对NLB小种0和1以及可能的其他的具有高水平抗性的多个品系。选择了一种表现出NLB抗性的双单倍体品系。将该品系再次与PH581回交，所得到的子代自交。然后就NLB抗性对所得到的730个品系的BC4S1群体进行基因分型。

本文中被称为HtBC的QTL被作图至染色体8上的区段5中的SNP标记PHM13395-27(129.7cM)和PHM4677-11(131.9cM)之间～2.2cM的区间(SNP标记的信息参见表4)。从上述BC4S1群体，对129株植株进行了选择、基因分型，然后通过子代测试就NLB抗性进行了表型分型。这导致了对以标记PHM13395-27(129.7cM)和PHM3418-12(130.6cM)限定的0.9cM区间内的13个重组体的鉴定(SNP标记的信息参见表4)。在获得附加的重组体以有利于精细作图的尝试中，所述QTL区间杂合的118个来自所述BC4S1群体的品系被选择并自交，并且种植了子代种子。从BC4S2群体，种植了2477株植株并进行了基因分型，372株植株被选择并自交。来自所选择的品系的种子被成排种植；对植株进行了基因分型；并就NLB抗性对各排进行了评分。结果是在相同的0.9cM QTL区间内鉴定了73个附加的重组体。总计鉴定了待用于附加的作图的86个重组品系。

CAPS标记的开发和精细作图

使用上述86个重组品系和一组新的标记进一步限定了HtBC QTL区间。由于缺少来自PH26N或PH581的基因组序列，B73被用作参考基因组以开发新的标记。从测序的该区域内的B73BAC和BAC末端鉴定了所述QTL区间内的低拷贝的和基因的序列，其得自玉米基因组测序计划，并被用作酶切扩增多态性位点(CAPS)标记开发的靶标。使用Primer3(Rozen和Skaletsky(2000)Primer3 on the WWW for general users and for biologistprogrammers.，Krawetz S，Misener S(编辑)Bioinformatics Methods andProtocols：Methods in Molecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ，第365-386页)从靶基因座设计了标记引物，并使用Gentra PUREGENE.RTM方法(Qiagen)从亲本品系PH26N和PH581提取了DNA样品。使用下文的设定和参数(表1A和1B)获得了PCR产物，并使用标准的ExoSAP-IT.RTM规程(USB-Cleveland，OH，USA)进行了纯化。在ABI 3730毛细管测序仪(Applied Biosystems)上使用ABI BigDye V3.1Terminator试剂进行了DNA测序。在Sequencher(GeneCodes)中比对了所得到的序列，并就产生易于辨识的CAPS标记的来源于SNP或插入/缺失(INDEL)的限制性位点多态性进行了分析。来自重组品系的DNA样品在PCR反应中被用作模板，PCR产物被用于CAPS标记测试(表2)使用标准的凝胶电泳，以溴化乙锭染色，对所得到的多态性片段进行了测定。总计开发了十四个能够区分PH581来源的基因型与PH26N来源的基因型的新的CAPS标记(表3)。

表1A：PCR设定

表1B：PCR参数

表2：CAPS标记测试

使用CAPS标记(描述于表3中)和上述86个重组品系进行的精细作图进一步将HtBC QTL区间限定至由标记2717_4和b0507L21限定并包括标记2717_4和b0507L21的区域。该区间跨越了五个B73BAC(c0043i10、c0108f16、c0117101、c0010k12和c0125i21；图1)，并在玉米基因组序列中表现为～552kb(玉米基因组测序计划)。

从上文所述的BC4S1和BC4S2品系产生了一组附加的重组品系。HtBC QTL区间杂合的品系被选择、自交、并批量收获，并且种植了子代种子。用两种可用的生产SNP标记PHM13395-27(129.7cM)和PHM15992-3(128.8cM)对上述植株进行了基因分型，以鉴定跨越所述区域的杂合重组体(SNP标记的信息参见表4)。使用此前被用于将所述QTL限定至五个BAC的区间的相同CAPS标记(2717_4和507L21)对三百九十个重组体进行了鉴定和基因分型，34个重组体跨越了缩小后的QTL区间。

十四个重组体被选择用于在温室中通过子代测试就NLB抗性接受测试。就温室测试而言，大斑突脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)被培养在人工培养基上，以产生用于人工接种的孢子。收集孢子并悬浮于无菌水中，悬浮液被稀释至1×10⁴孢子/ml。每一在温室中生长的V3期幼苗使用了一百微升(μl)的孢子悬浮液进行接种。第一次接种后二十四小时，植株被再次接种，并被置于潮湿房间内于室温过夜。将植株从潮湿房间内取出，并在整个测试期间置于温室工作台上，并且根据需要定期对植株浇水和施肥。在对每一植株第一次接种后9和12天，按照抗性(0)或易感(1)，进行对病害发生率的评分。

基于从上述十四个重组体(使用温室测试)获得的重组数据，将HtBCQTL区间进一步限定至跨越两个BAC(c0108f16、c0117101；图1)的区间，其被标记108f16_2和pco642297_3限定并包括标记108f16_2和pco642297_3，并且在玉米基因组序列(玉米基因组测序计划)中表现为～217kb。

表4：HtBC SNP标记

PH26NBAC文库的构建、筛选和组装

在表征HtBC QTL区间内的基因组区域的基因组成的尝试中，从PH26N构建了BAC文库。从约200个包埋在低熔点琼脂糖中并在凝胶中裂解细胞的PH26N黄化幼苗提取了核酸。用Hind III部分消化了包埋的高分子量DNA，并通过钳位均匀电场(CHEF)琼脂糖凝胶电泳分离了150-300kb片段两次。微洗脱的片段按照制造商的条件被连接至载体pCCBAC1(Epicentre)中，并被电穿孔导入Epi300细胞中。超过56,000个克隆(4X)被单个地网格状排列在尼龙膜上，并通过与邻近左侧标记108f16_2、NLB5A和NLB3A(表5)的两个探针的非放射性杂交进行了筛选。从上述筛选中鉴定了两个阳性的BAC(cbacPH26Nh.pk136.o20、cbacPH26N.pk016.p6)，并使用来自所述探针和两侧标记的引物通过PCR加以确认。这些BAC被测序并装配在一起，产生了215kb的序列重叠群。

表5：关于NLB5A和NLB3A的引物和探针信息

HtBC候选基因

上述缩小的HtBC QTL区间包含两个预测的串联的蛋白质激酶(PK)样候选基因，本文中称为NLB17和NLB18(图2)。这些候选基因的cDNA序列分别以SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：96表示，并且预测所编码的多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO：93和97表示。

实施例3

来自PH99N(Htn1)的8号染色体NLB抗性QTL的精细作图

初始的QTL作图

品系PH99N被鉴定为玉米大斑病(NLB)抗性的来源。在鉴定一种或多种在PH99N中与NLB抗性关联的QTL的尝试中，用PH581作为轮回(易感)亲本开发了BC4和BC4S1群体。从这些群体，分别对505和583株植株用SNP标记进行了基因分型和使用单个植株分析就NLB抗性进行了测试。本文中称为Htn1的QTL被作图至8号染色体上区段5中的SNP标记PHM2817-26(128.8)和PHM7446-6(129.4)(表7)之间的0.6cM区间。从这些实验，100个杂合重组品系被选择用于在温室中就NLB抗性进行子代测试分析(温室测试方法参见实施例2)。

CAPS标记的开发和精细作图

用上文所述的100个杂合重组体开始Htn1的精细作图。从参考基因组B73，将所述QTL区间内的低拷贝和基因的序列作为CAPS标记开发的靶标(方法参见实施例2)。开发了区分PH99N来源的基因型与PH581来源的基因型的新的CAPS标记(表6)，并用于进一步表征所述重组体的基因型。

重组作图将所述QTL区间限定至由标记PHM4582和R限定并包括标记PHM4582和R的区域。该区域跨越五个B73BAC(c0435b18、c0009g13、c0043i10、c0108f16、c0117L01；图1)，并在玉米基因组序列中表现为～475kb(玉米基因组测序计划)。

为了获得附加的重组体，对新的QTL区间杂合的BC4品系进行了选择、自交和批量收获。对所得到的4876个分离的BCS1品系进行玉米粒切片，并用所述Htn1 QTL附近的两个可用的生产SNP标记PHM13395-16(129.6cM)和PHM3418-12(130.6cM)(参见表7)进行了基因分型。从上述BCS1群体，932个重组品系被选择和自交，来自761个所选择的重组品系的子代种子被种植，并使用此前被用于将Htn1限定至五个BAC的区间的相同CAPS标记(PHM4582和R)进行了基因分型。十个附加的重组体被鉴定，随后通过温室测试中的子代测试就NLB抗性被评分(如实施例2中所述)，然后用所述Htn1区间中四种剩余的CAPS标记进行了基因分型。所述Htn1 QTL区间被进一步限定至由标记6_8和R限定并包括标记6_8和R的区间，其包括两个BAC(c0108f16，c0117L01；图1)，并在玉米基因组序列中表现为～224kb(玉米基因组测序计划)。

表7：Htn1 SNP标记

Htn1候选基因

基于来源于PH26N BAC序列组装(实施例2；图2)的基因组序列，Htn1 QTL区间跨越了82.9kb。所述HtBC QTL与所述Htn1 QTL区间相符。因此，被鉴定为就HtBC而言的候选基因的两个预测的串联的蛋白质激酶(PK)样基因(NLB17、NLB18)，如果存在于Htn1基因组的该区域中，很可能也是就Htn1而言的候选基因。然而，似乎Htn1没有NLB17。SEQID NO：94和95分别表示PH99N中的NLB18 cDNA的核苷酸序列和所编码的蛋白质产物的氨基酸序列。

实施例4

8号染色体NLB HtBC和Htn1候选基因的单倍型分析

单倍型可比单个的SNP提供更多信息，并且可描述较多的任何特定基因型。此外，一旦已经将唯一的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可用于种群或其任何亚群以确定是否个体具有特定基因和/或等位基因。(参见例如，WO2003054229)。

使用针对玉米大斑病进行表型分型的一组玉米品系，通过对针对HtBC和Htn1的两个蛋白质激酶(PK)样QTL候选基因(NLB17，NLB18)的再测序，进行了单倍型分析。这两种串联的PK样候选基因的激酶催化结构域高度保守的性质给PCR引物的设计带来了挑战。此外，针对这两个基因的EST的缺乏使得难以确定它们的确切结构。因此，为了有利于设计能够既区分这两个基因座又从一组各种不同的玉米品系进行扩增的特异性引物，使用ClustalW对B73和PH26N跨越NLB17和NLB18的PK结构域的基因组序列进行了多重序列比对。从这一比对，开发了三种特异性扩增NLB17的部分的引物，并针对NLB18设计了两种(表8)。短的测序尾巴被添加至这些引物上，以有利于测序。PCR和测序如上文所述进行(表1A和1B；实施例1)。

表8：针对NLB17和NLB18候选基因的标记设计

*添加至正向引物的测序尾巴：SEQ ID NO：79

∧添加至反向引物的测序尾巴：SEQ ID NO：80

标记被用于从一组190个玉米近交系对相应的五种扩增子进行再测序，包括PH26N和PH99N。SNP和INDEL被用于将上述组内的近交系分类为多个单倍型组(表9)。

表9：NLB17和NLB18扩增子信息

*共有长度可能包含来自测序尾巴的一些碱基。

就各种引物而言，扩增成功率在45-90％范围。扩增的不足可能是所述近交系的组之中候选基因区域的差异的附加的指示。考虑到玉米品系之间高度的基因非共线性，有可能这些基因不存在于所测试的品系中，或者所述基因差异过大，在引发位点中有SNP，导致引物未能正确退火。有趣的是，来自NLB17的三种引物均未在PH99N中产生产物，这说明该基因不存在，并因此不是Htn1 NLB抗性QTL的候选基因。表10显示了在每一NLB17标记就PH26N而言的单倍型信息。表11显示了在每一NLB18标记就PH26N和PH99N而言的单倍型信息。

表10：就PH26N而言的NLB17单倍型信息

表11：就PH26N和PH99N而言的NLB18单倍型信息

实施例5

用NLB17和NLB18作为转基因来产生抗性玉米植株

NLB17和NLB18基因也能够作为转基因单独地或组合地表达，允许在不同情况下对它们的表达的调节。下列实施例显示了NLB17和/或NLB18基因如何能够以不同的方式被表达，以抵抗不同的病害或保护植株的不同部分，或者简单地将NLB17和/或NLB18基因作为转基因转移至不同的玉米品系中。

实施例5a：

在本实施例中，候选基因使用其自身的启动子而被表达。

为了转化完整的基因，包括启动子和蛋白质编码区，将BAC克隆用作模板DNA，通过PCR扩增了包含完整的编码区和大约2kb上游区域的DNA片段。为了能够使用

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行克隆，在PCR引物中整合了attB位点，并通过

BP重组反应将扩增产物克隆至pDONR221载体。得到的片段两侧为attL位点，通过

LR重组反应将该片段转入了二元载体。然后用所述DNA构建体进行玉米转化，如实施例6中所述。

实施例5b：

为了在整个植株中以低水平表达候选基因，所述基因的编码区和其终止子被置于水稻肌动蛋白基因(美国专利5,641,876和5,684,239)或F3.7基因(美国专利5,850,018)的启动子之后。为了能够使用

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行克隆，在PCR引物中整合了attB位点，所述引物被用于从所述候选基因起始密码子上游35bp处扩增该基因。所述attB1引物中加入了NotI位点。扩增产物通过

BP重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被克隆至pDONR221载体。克隆之后，得到的基因两侧为attL位点，并且在其起始密码子上游35bp处有特有的NotI位点。然后，用包含NotI位点的引物扩增启动子片段。每一启动子与所述候选基因的NotI融合。在最终步骤中，嵌合基因构建体通过

LR重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被转入了二元载体PHP20622。其被用于玉米的转化，如实施例6中所述。

实施例5c：

为了在整个植株中以高水平表达候选基因，所述基因的编码区及其终止子被置于玉米泛素基因的启动子、5’非翻译区和内含子之后(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)。为了能够使用技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行克隆，在PCR引物中整合了attB位点，所述引物被用于从所述候选基因起始密码子上游142bp处扩增该基因。扩增产物通过

BP重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被克隆至pDONR221载体。克隆之后，得到的基因两侧为attL位点。在最终步骤中，上述克隆通过LR重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被转入了载体，所述载体包含玉米泛素启动子、所述泛素基因的5’非翻译区和第一内含子如Christensen等人所述(同上)，在所述泛素表达盒之后是用于插入所述候选基因的

ATTR1和R2位点。所述载体还包含适合玉米转化的标记基因，因此得到的携带着嵌合基因(玉米泛素启动子-泛素5′非翻译区-泛素内含子1-候选基因)的质粒适用于玉米转化，如实施例6中所述。

实施例5d：

为了以根优选的方式低水平地表达所述候选基因，所述基因的编码区及其终止子被置于根优选的启动子之后，所述根优选的启动子例如但不限于玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公布于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公布于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公布于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公布于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)。实施例5b中所述的包含两侧为attL位点的所述候选基因编码区并在起始密码子上游35bp处包含一个特有的NotI位点的片段，被用于使利用

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)的克隆成为可能。用包含NotI位点的引物扩增启动子片段。每一启动子与所述候选基因的NotI融合。在最终步骤中，嵌合基因构建体通过LR重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被转入了二元载体PHP20622。其被用于玉米的转化，如实施例6中所述。

实施例6

农杆菌介导的玉米的转化和转基因植株的再生

实施例5a-5d中所述的重组DNA构建体能够被用于制备转基因玉米植株如下。

使用Zhao(美国专利5,981,840，以及PCT专利公布WO98/32326)的方法，用如实施例5a和5c中所述的经选择的多核苷酸构建体转化玉米。简而言之，从玉米中分离未成熟胚芽并使胚芽接触农杆菌(Agrobacterium)悬浮液，其中所述细菌能够将多核苷酸构建体转移到至少一个未成熟胚芽的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在此步骤中将未成熟胚芽浸入农杆菌悬浮液中用于启动接种。胚芽与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，未成熟胚芽在固体培养基上培养。紧接着此共培养时期，进行任选的“休眠”步骤。在此休眠步骤中，胚芽培养在存在至少一种已知抗生素以抑制农杆菌生长，同时不加入植株转化体选择剂的环境中进行(步骤3：休眠步骤)。将未成熟胚芽培养在具有抗生素但无选择剂的固体培养基上，用于消除农杆菌和用于受感染细胞的休眠阶段。接下来，将接种的胚芽在包含选择剂的培养基中培养，并回收生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。然后将愈伤组织再生为植株(步骤5：再生步骤)，并且在固体培养基中对在选择培养基中生长的愈伤组织进行培养以再生所述植株。

实施例7

转基因植株评估

转基因植株能够用实施例5a至5d中所述的构建体制备，如实施例6中所述。能够使用实施例1中所述的规程就玉米大斑病抗性对它们进行评估。

Claims (10)

1.选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括：

a.在所述玉米植株中检测与单倍型连锁并关联的第一标记等位基因，所述单倍型选自：

i.在NLB17_A处的PH26N单倍型，

ii  在NLB17_E处的PH26N单倍型，

iii.在NLB17_3处的PH26N单倍型，

iv.在NLB18_A处的PH26N单倍型，

v.在NLB18_E处的PH26N单倍型，

vi.在NLB18_A处的PH99N单倍型，或

vii.在NLB18_E处的PH99N单倍型；以及

b.选择具有所述第一标记等位基因的所述玉米植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标记等位基因以20cM的距离与所述单倍型连锁。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标记等位基因以1cM的距离与所述单倍型连锁。

4.选择具有增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括：

a.在所述玉米植株中检测单倍型，所述单倍型选自：

i.在NLB17_A处的PH26N单倍型，

ii.在NLB17_E处的PH26N单倍型，

iii.在NLB17_3处的PH26N单倍型，

iv.在NLB18_A处的PH26N单倍型，

v.在NLB18_E处的PH26N单倍型，

vi.在NLB18_A处的PH99N单倍型，或

vii.在NLB18_E处的PH99N单倍型；以及

b.选择具有所述单倍型的所述玉米植株。

5.鉴定表现出增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的种质中检测标记基因座的等位基因，其中：

a.所述标记基因座是PHM2798、b0302H1、b0611N13、2717_3、2717_4、108f16_2、31004、pco642297_3、b109.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318i13、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9g13-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM4757、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或NLB18_E；并且

b.所述等位基因与增强的玉米大斑病抗性关联。

6.鉴定表现出增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的种质中检测在一个或多个标记基因座处包含等位基因的单倍型，其中：

a.所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并且两侧为：

i.标记PHM4582和R；或

ii.6_8和R；并且

b.所述单倍型与增强的玉米大斑病抗性关联。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述单倍型是：在NLB17_A处的PH26N单倍型，在NLB17_E处的PH26N单倍型，在NLB17_3处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH26N单倍型，在NLB18_E处的PH26N单倍型，在NLB18_A处的PH99N单倍型，或在NLB18_E处的PH99N单倍型。

8.选择表现出增强的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括：

a.获得第一玉米植株，所述第一玉米植株在其基因组内包含：

i.在NLB17_A处的PH26N单倍型，

ii.在NLB17_E处的PH26N单倍型，

iii.在NLB17_3处的PH26N单倍型，

iv.在NLB18_A处的PH26N单倍型，

v.在NLB18_E处的PH26N单倍型，

vi.在NLB18_A处的PH99N单倍型，或

vii.在NLB18_E处的PH99N单倍型；

b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交；

c.针对所述等位基因评估子代植株；以及

d.选择具有所述等位基因的子代植株。

9.通过权利要求5-7的方法中的任一种鉴定的玉米植株。

10.通过权利要求1-4和8的方法中的任一种选择的玉米植株。

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