CN108137658A - 产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于产生对北方叶枯病表现出抗性的玉蜀黍植物的组合物和方法。提供了编码赋予北方叶枯病抗性的多肽的分离的多核苷酸，包含此类多核苷酸的多核苷酸构建体，以及包含所述多核苷酸构建体的玉蜀黍植物。所述方法包括经由标准转化方法在玉蜀黍细胞中表达分离的多核苷酸并从所述玉蜀黍细胞获得玉蜀黍植物。

Description

产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月16日提交的美国临时申请号62/242,691的权益，将其全部内容通过引用特此结合。
技术领域
本披露涉及在产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物中有用的组合物和方法。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“20160928_BB2396PCT_SequenceListing.txt”，创建于2016年9月28日，且具有65千字节大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
背景技术
由真菌病原体玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)(以前称为大斑病长蠕孢(Helminthosporlum turcicum))诱导的北方叶枯病(northern leaf blight，NLB)在许多热带和温带环境中是一种严重的玉米叶枯萎病。症状可以从下部叶片上的雪茄形病变到叶子的完全破坏，从而降低可用于光合作用的叶表面积的量。光合能力的降低导致籽粒灌浆所需的碳水化合物缺乏，这会影响籽粒产量。因为露期很长且温度适中，热带的中海拔区域(海平面以上约900-1600m)存在对北方叶枯病尤其有利的气候。然而，在温带环境中(例如在美国)，在湿季期间，特别是如果在抽丝期在植物的上部叶上确定感染，则北方叶枯病还可能产生30％-50％的损失。
控制北方叶枯病的最有效和最优选的方法是种植抗性杂交种。自然界中存在几个玉米大斑病菌的品种或种族(race)，使种植者有两个杂交种选择：部分抗性杂交种，其提供针对多个种族的低水平的广谱保护，以及种族特异的抗性杂交种，其提供针对特定的种族的保护。已经描述了对玉米大斑病菌的抗性的遗传来源，并且已经鉴定了四个玉米大斑病菌抗性基因座：Ht1、Hr2、Ht3、和Htn1。基因Ht1定位于第2染色体的长臂上，其中基因Ht1与以下各项紧密连锁：umc36(Coe，E.H.等人(1988)，Corn and Corn Improvement[玉米和玉米的改良]，第3版，第81-258页)、sgcr506(Gupta，M.等人(1989)Maize Genet.Coop.Newsl.[玉蜀黍遗传学合作新闻通讯]63，112)、umc150B(Bentolila，S.等人(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]，82：393-398)、和pic18a(Collins等人(1998)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]，11：968-978)，并且其紧邻的两侧是umc22和umc122(Li等人(1998)Hereditas[遗传]，129：101-106)。基因Ht2定位于第8染色体的长臂上的umc48-umc89区间中(Zaitlin等人(1992)MaizeGenet.Coop.Newsl.[玉蜀黍遗传学合作新闻通讯]，66，69-70)，并且基因Ht3映射到第7染色体上的bnlg1666附近(Van Staden，D等人(2001)Maize Genetics ConferenceAbstracts[玉蜀黍遗传学会议摘要]43：P134)。Htn1基因定位于第8染色体上，与Ht2距离大约10cM，并且与RFLP标记umc117距离0.8cM(Simcox和Bennetzen(1993)MaizeGenet.Coop.Newl.[玉蜀黍遗传学合作新闻通讯]67，118-119；Simcox和Bennetzen(1993)Phytopathology[植物病理学]，83：1326-1330)。
通过减少真菌接种物来控制北方叶枯病的方法需要部分农民的额外的时间和资源，并且此外可能对环境具有不利影响。这使得抗性杂交种的种植对农民和公众更具吸引力。因此，令人希望的是提供用于产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物的组合物和方法。
发明内容
本文介绍了用于产生对北方叶枯病表现出抗性的玉蜀黍植物的组合物和方法，不管该抗性是新赋予的还是增强的。
本文介绍了分离的多核苷酸，其可以用于产生对北方叶枯病表现出抗性的玉蜀黍植物。分离的多核苷酸可以选自下组，该组由以下组成：(a)在SEQ ID NO：1(PH4GP c-DNA)、SEQ ID NO：3(PH1W2 cDNA)、或SEQ ID NO：9(PH4GP基因组序列)中列出的核苷酸序列；(b)编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTALW比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％的序列同一性；(c)编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列；以及(d)编码CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中列出的序列。
还提供了包含分离的多核苷酸的多核苷酸构建体，其中分离的多核苷酸有效地连接至启动子。多核苷酸构建体可以进一步包含编码选自下组的多肽的一个或多个异源核酸序列，该组由以下组成：赋予抗病性的多肽、赋予除草剂抗性的多肽、赋予昆虫抗性的多肽、涉及碳水化合物代谢的多肽、涉及脂肪酸代谢的多肽、涉及氨基酸代谢的多肽、涉及植物发育的多肽、涉及植物生长调节的多肽、涉及提高产量的多肽、涉及抗旱性的多肽、涉及抗寒性的多肽、涉及抗热性的多肽、和/或涉及抗盐性的多肽，其中所述一个或多个异源核酸序列有效地连接至启动子。例如，赋予抗病性的多肽可以是赋予北方叶枯病(NLB)抗性的多肽，所述多肽可以进一步具有基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法，与SEQ ID NO：11或12相比时，具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
还提供了包含这些多核苷酸构建体的玉蜀黍植物细胞和包含这些玉蜀黍植物细胞的玉蜀黍植物。
本文提供了用于产生对北方叶枯病表现出抗性的玉蜀黍植物的方法，其中包含本文提供的分离的多核苷酸的多核苷酸构建体(其中所述分离的多核苷酸与至少一种调节序列有效地连接)在可再生的玉蜀黍植物细胞中表达，并且从该玉蜀黍植物细胞产生对北方叶枯病表现出抗性的玉蜀黍植物。通过该方法产生的玉蜀黍植物在基因组中包含该多核苷酸构建体。该调节序列可以是启动子和/或终止子，并且对于玉蜀黍而言可以是天然的。在一些方面，该调节序列对于Ht1基因而言是天然的。在仍其他方面，该多核苷酸构建体包含编码选自下组的多肽的一个或多个另外的异源核酸序列，该组由以下组成：赋予抗病性的多肽、赋予除草剂抗性的多肽、赋予昆虫抗性的多肽、涉及碳水化合物代谢的多肽、涉及脂肪酸代谢的多肽、涉及氨基酸代谢的多肽、涉及植物发育的多肽、涉及植物生长调节的多肽、涉及提高产量的多肽、涉及抗旱性的多肽、涉及抗寒性的多肽、涉及抗热性的多肽、和/或涉及抗盐性的多肽，其中每个异源核酸序列有效地连接至启动子。该多肽可以是赋予北方叶枯病(NLB)抗性的多肽，例如像具有基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法与SEQ ID NO：11或12相比时具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。包含该多核苷酸构建体的后代植物还可以通过以下产生：将通过该方法产生的玉蜀黍植物与基因组中不包含该多核苷酸构建体的第二玉蜀黍植物进行杂交。
附图和序列表的说明
根据下列的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，所述详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。如遵循描述于以下文献中的IUPAC-IUBMB标准所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码：NucleicAcids Research[核酸研究]13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal[生物化学杂志]219(第2期)：345-373(1984)，以上文献通过引用以其全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中所述的条例。
图1A-1D显示来自PH4GP(SEQ ID NO：2)、PH1W2(SEQ ID NO：4)、和B73(SEQ ID NO：6和8)的CC-NB-LRR变体的比对。图1C中框出了B73等位基因中LRR区域的缺失。
SEQ ID NO：1是在近交系PH4GP中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是在近交系PH1W2中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是由SEQ ID NO：3编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是在近交系B73中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列，并且在本文中被称为“B73-高等位基因”。
SEQ ID NO：6是由SEQ ID NO：5编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是在近交系B73中发现的Ht1 cDNA的核苷酸序列，并且在本文中被称为“B73-低等位基因”。
SEQ ID NO：8是由SEQ ID NO：7编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是在近交系PH4GP中发现的Ht1基因组DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是在抗性等位基因的Ht1多肽中发现的一个区域的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是来自专利申请WO 2011163590中的品系PH99N的NLB18的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是来自专利申请WO 2011163590中的品系PH26N的NLB18的氨基酸序列。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不受特定实施例的限制，这些特定实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。当在本说明书和所附权利要求中使用时，单数和单数形式的术语例如“一个/一种(a/an)”以及“该(the)”包括复数指代物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，对“植物”、“该植物”或“一种植物”的提及也包括多个植物；另外，取决于上下文，术语“植物”的使用还可以包括该植物的遗传上相似或相同的后代；实际上，术语“核酸”的使用任选地包括该核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且典型地)涵盖许多相似或相同的探针分子。
除非另外指明，否则核酸从左向右以5′至3′方向书写。说明书中所述的数值范围包括限定范围的数字并且包括在限定范围内的每个整数或任何非整数的分数。除非另外指明，本文所使用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。虽然与本文所描述的方法和材料类似或等同的任何方法与材料均可以用于测试本发明的实践中，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将根据以下陈述的定义使用以下术语。
I.组合物
A.Ht1多核苷酸和多肽
在US 2010095395中描述了使用源自北方叶枯病抗性品系PH4GP和北方叶枯病易感品系PH5W4之间的杂交的群体，对与染色体2上与北方叶枯病抗性有关的QTL的定位。本文介绍了玉蜀黍中的Ht1基因的克隆以及推定的CC-NB-LRR(卷曲螺旋的、核苷酸结合的、富含亮氨酸的重复)基因作为致病基因的鉴定。来自US 2010095395中描述的两种抗性来源PH4GP和PH1W2的Ht1 cDNA序列分别由SEQ ID NO：1和3表示，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2和4表示。此外，产生了含有PH4GP(抗性)等位基因的基因组序列(SEQ IDNO：9)的构建体，并使用农杆菌介导的转化将其转化到易感转化品系中，从而产生对北方叶枯病具有抗性的玉蜀黍植物。
玉蜀黍(Zea mays)CC-NB-LRR(卷曲螺旋的、核苷酸结合的、富含亮氨酸的重复；也被称为Ht1)基因是抗病性基因的大型复杂家族的成员。在效应子触发的免疫中的NB-LRR蛋白激活和随后的信号传导的机制尚未完全了解(Eitas和Dangl.2010.Curr Opin PlantBiol[植物生物学新见]13(4)：472-477)。
因此，本文介绍了多核苷酸，其可以用于产生对北方叶枯病具有抗性的玉蜀黍植物。该多核苷酸可以是：(a)在SEQ ID NO：1(PH4GP c-DNA)、SEQ ID NO：3(PH1W2 cDNA)、或SEQ ID NO：9(PH4GP基因组序列)中列出的核苷酸序列；(b)编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；(c)编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQID NO：4相比时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述多肽包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列，其是B73中Ht1的缺失区域的序列；以及(d)编码CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4中列出的序列。
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本披露的多核苷酸限制为包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。本披露的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。
如本文所使用的，“分离的”或“纯化的”多核苷酸或多肽或其生物活性部分是基本上或本质上不含与如在其天然存在的环境中发现的多核苷酸或多肽正常相伴或相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在从其衍生出该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然地在该多核苷酸侧翼的序列(即，位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳地是蛋白质编码序列)。出于本披露的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时不包括分离的未改性的染色体。例如，在不同实施例中，该分离的多核苷酸可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，在该多核苷酸从其衍生出的细胞的基因组DNA中，该核苷酸序列天然地位于该多核苷酸的侧翼。基本上不含细胞物质的多肽包括具有小于约30％、20％、10％、5％、或1％(以干重计)的污染蛋白质的多肽的制剂。当重组产生本披露的多肽或其生物活性部分时，最佳地，培养基表示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白质化学品。
如本文所使用的，“重组”多核苷酸包含两种或更多种化学连接的核酸区段(其在自然界中未发现直接连接)的组合。“直接连接的”意在两个核酸区段紧密相邻并通过化学键彼此连接。在具体的实施例中，该重组多核苷酸包含目的多核苷酸，这样使得另外的化学连接的核酸区段位于该目的多核苷酸的5′、3′或内部。可替代地，该重组多核苷酸的化学连接的核酸区段可以通过缺失序列来形成。另外的化学连接的核酸区段或被缺失以连接所述连接的核酸区段的序列可以具有任何长度，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个核苷酸。本文披露了用于制造此类重组多核苷酸的各种方法，包括例如通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的多核苷酸区段。在具体的实施例中，该重组多核苷酸可以包含重组DNA序列或重组RNA序列。
“重组多肽”包含两种或更多种化学连接的氨基酸区段(其在自然界中未发现直接连接)的组合。在具体的实施例中，该重组多肽包含位于该重组多肽的N-末端、C-末端或内部的另外的化学连接的氨基酸区段。可替代地，该重组多肽的化学连接的氨基酸区段可以通过缺失至少一个氨基酸来形成。另外的化学连接的氨基酸区段或缺失的化学连接的氨基酸区段可以具有任何长度，包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸。
序列比对和同一性百分比计算可以使用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对使用CLUSTAL V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151153(1989))和默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行。使用CLUSTAL V方法进行逐对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、并且存储的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、并且存储的对角线＝4。使用CLUSTALW程序比对序列后，通过查看相同程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“散度”值是可能的。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和散度是以该方式计算的。
可替代地，可以使用Clustal W比对方法。该Clustal W比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]8：189-191(1992))可以在生物信息计算包(公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MegAlignTMv6.1程序中找到。用于多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergent Sequence)＝30％、DNA转换权重＝0.5、蛋白质权矩阵＝Gonnet系列、DNA权矩阵＝IUB。对于成对比对，默认参数为比对＝缓慢-精确(Slow-Accurate)、空位罚分＝10.0、空位长度＝0.10、蛋白质权矩阵＝Gonnet 250并且DNA权矩阵＝IUB。用Clustal W程序比对序列后，通过查看相同程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“散度”值是可能的。
B.多核苷酸构建体
本文披露的Ht1多核苷酸能以用于在目的植物或任何目的生物体中表达的表达盒(例如像以多核苷酸构建体的形式)提供。该盒可以包括有效地连接至Ht1多核苷酸的5′和3′调节序列。“有效地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的有效的连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。有效地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区域的连接时，有效地连接意在是这些编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以另外包含至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。可替代地，所述一个或多个另外的基因可以在多个表达盒上提供。这样的表达盒装备有多个限制性位点和/或重组位点，用于将该Ht1多核苷酸插入以便处于调节区域的转录调节之下。该表达盒可另外包含选择性标记基因。
该表达盒以5’-3’转录的方向包含转录和翻译起始区域(即启动子)、Ht1多核苷酸、和在植物中起作用的转录和翻译终止区域(即终止区域)。调节区域(即，启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或Ht1多核苷酸对于玉蜀黍植物细胞而言或彼此之间可以是天然的/类似的。可替代地，调节区域和/或Ht1多核苷酸对于玉蜀黍植物细胞而言或彼此之间可以是异源的。
如本文所使用的，关于序列的“异源性”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，有效地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被有效地连接的多核苷酸的天然启动子。
该终止区域可以与转录起始区域是天然的，可以与玉蜀黍植物是天然的，或者可以源自另一种来源(即，对于该启动子、Ht1多核苷酸、玉蜀黍植物、或其任何组合是外源的或异源的)。
该表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导子在本领域是已知的并且包括病毒翻译前导序列。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的DNA、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。
许多启动子可以用于表达本文所披露的各种Ht1序列，包括目的多核苷酸序列的天然启动子(例如像，Ht1基因的天然启动子)。可以基于所希望的结果选择这些启动子。此类启动子包括例如组成型启动子、诱导型启动子、组织偏好型启动子或用于在植物或任何目的生物体中表达的其他启动子。合成启动子也可用于表达Ht1序列。合成启动子包括例如一种或多种异源调节元件的组合。
多核苷酸构建体可以是重组DNA构建体。“重组DNA构建体”包含两个或更多个有效地连接的DNA区段，这些DNA区段在自然界中未发现有效地连接。重组DNA构建体的非限制性实例包括与异源序列有效地连接的目的多核苷酸，这些异源序列有助于目的序列的表达、自主复制和/或基因组插入。这样的异源且有效地连接的序列包括例如启动子、终止序列、增强子等、或表达盒的任何组分；质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体、或线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列；和/或编码异源多肽的序列。
C.玉蜀黍植物细胞和玉蜀黍植物
“玉蜀黍(maize)”是指玉蜀黍(Zea mays L.ssp.mays)植物，并且也被称为“玉米”。
还提供了具有本文披露的Ht1序列的玉蜀黍植物、玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物部分和种子、以及玉蜀黍籽粒。在具体的实施例中，植物和/或植物部分已稳定并入本文披露的至少一种异源Ht1多肽。另外，目的植物或生物体可以包含多个Ht1多核苷酸(即，至少1、2、3、4、5、6或更多个)。
如本文所使用的，术语玉蜀黍植物包括玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物原生质体、可以从其再生玉蜀黍植物的玉蜀黍植物细胞组织培养物、玉蜀黍植物愈伤组织、玉蜀黍植物块和在玉蜀黍植物或玉蜀黍植物部分(如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中完好的玉蜀黍植物细胞。籽粒意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。D.其他的目的性状
在一些实施例中，本文披露的Ht1多核苷酸可以被工程化为分子堆叠物。因此，本文披露的各种玉蜀黍植物、玉蜀黍植物细胞和玉蜀黍种子可以进一步包含一种或多种目的性状，并且在更特定的实施例中，该玉蜀黍植物、玉蜀黍植物部分或玉蜀黍植物细胞与目的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠以便产生具有所希望性状组合的植物。
如本文所使用的，术语“堆叠”包括具有存在于同一个目的植物或生物体中的多种性状。在一个非限制性实例中，“堆叠的性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠。如在此使用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。
本文所描述的多核苷酸DNA构建体还可以包含编码选自下组的多肽的一个或多个异源核酸序列，该组由以下组成：赋予抗病性的多肽、赋予除草剂抗性的多肽、赋予昆虫抗性的多肽、涉及碳水化合物代谢的多肽、涉及脂肪酸代谢的多肽、涉及氨基酸代谢的多肽、涉及植物发育的多肽、涉及植物生长调节的多肽、涉及提高产量的多肽、涉及抗旱性的多肽、涉及抗寒性的多肽、涉及抗热性的多肽、和/或涉及抗盐性的多肽，其中每个异源核酸序列有效地连接至启动子。
赋予抗病性的多肽可以是赋予北方叶枯病(NLB)抗性的另一种多肽。例如，多核苷酸DNA构建体可以包含Ht1的抗性等位基因和NLB18的抗性等位基因(在WO 2011163590中)。来自品系PH99N的NLB18多肽的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：11呈现；来自品系PH26N的NLB18多肽的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：12呈现。如申请WO 2011163590中所述，PH99N和PH26N两者都是对北方叶枯病显示出抗性的玉蜀黍品系，它们反映了关于第8染色体QTL的不同抗性来源。NLB18的抗性等位基因可以编码具有如下氨基酸序列多肽，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法与SEQ ID NO：11或12相比时具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的序列同一性。
II.产生具有北方叶枯病抗性的玉蜀黍植物的方法
“玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)”以前被称为大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum)，是诱导北方叶枯病感染的真菌病原体。该真菌病原体在本文中也被称为突脐蠕孢属(Exserohilum)或Et。
“抗病性”(例如像，北方叶枯病抗性)是植物的一种特征，其中所述植物避免作为植物-病原体相互作用(例如玉蜀黍-玉米大斑病菌相互作用)的结果的疾病症状。即，防止病原体导致植物疾病和相关的疾病症状，或可替代地，使由病原体引起的疾病症状最小化或减轻。本领域技术人员将会理解，本文所披露的组合物和方法可以与本领域可用的其他组合物和方法一起使用，用于保护植物免受病原体攻击。
“抗性”是一个相对的术语，其表明被感染的植物比另一个相似处理的、更易感的植物产生更好的玉蜀黍产量。即，当与易感的玉蜀黍植物相比，所述病症导致在耐受性玉蜀黍植物中玉蜀黍存活和/或产量的降低减少。技术人员将会理解，对北方叶枯病或引起这种疾病的病原体有抗性的玉蜀黍植物可以代表一系列更多抗性或更少抗性的表型，并且可以根据感染的严重程度而变化。然而，通过简单观察，技术人员可以确定不同植物、植物品系或植物家族对北方叶枯病的相对抗性或易感性，并且此外还将识别“抗性”的表型等级。例如，可以使用表示对北方叶枯病的抗性水平的1至9个视觉等级。分数越高表明抗性越高。只有在测量的实验中存在足够的选择压力时才应收集数据。术语“耐受性”和“抗性”在本文中可互换使用。
抗性可以是“新赋予的”或“增强的”。“新赋予的”或“增强的”抗性是指针对特定病原体、广谱病原体或由一种或多种病原体引起的感染的抗性水平增加。例如，针对特定真菌病原体(如Et)的增加的抗性水平构成“增强的”或改进的真菌抗性。本发明的实施例将增强或改进真菌植物病原体抗性，这样使得植物对一种真菌病原体或多种真菌病原体的抗性将增加，这又将增加对由真菌病原体引起的疾病的抗性。术语“增强”是指改进、增加、扩大、倍增、提升、提高等。
通过本文所述的方法产生的玉蜀黍植物可以为玉蜀黍植物提供持久和广谱抗性，并且可以协助繁育北方叶枯病抗性玉蜀黍植物。例如，如果将多个北方叶枯病抗性基因堆叠到一个单位中，则这减少了需要通过回交进行性状渐渗的特定基因座的数量，并且使来自非优良抗性供体的连锁累赘最小化。
可以使用各种方法来将目的序列引入玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物或玉蜀黍植物部分中。“引入”旨在表示以这样一种方式向玉蜀黍植物细胞、玉蜀黍植物或玉蜀黍植物部分提供多核苷酸，使得该序列进入玉蜀黍植物的细胞内部。本披露的方法不依赖于用于将序列引入生物体或玉蜀黍植物或玉蜀黍植物部分中的特定方法，只要该多核苷酸进入玉蜀黍植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸引入各种生物体(包括玉蜀黍植物)的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
“稳定转化”旨在表示将引入玉蜀黍植物中的多核苷酸构建体整合到该玉蜀黍植物的基因组中，并且能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入玉蜀黍植物中并且它不整合到该玉蜀黍植物的基因组中。
转化方案以及用于将多核苷酸序列引入植物(例如玉蜀黍)中的方案可以改变。将多核苷酸引入玉蜀黍植物细胞中的合适的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques[生物技术]4：320 334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83：5602 5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717 2722)、和弹道粒子加速法(参见例如美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)，Plant cell， Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版公司，柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923 926)；和Lec1转化法(WO 00/28058)。还参见Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85：4305 4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：559 563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783；和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440 444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833 839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷物)；DeWet等人(1985)在The Experimental Manipulation of OvuleTissues[胚珠组织的实验操作]中，Chapman等人编辑(纽约朗文出版社)，第197-209页(花粉)；D′Halluin等人(1992)Plant cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；以及Osjoda等人(1996)NatureBiotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化的玉蜀黍)；将其全部通过引用并入本文。
在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本文披露的Ht1多核苷酸引入植物中。通常，这类方法涉及将本披露的多核苷酸构建体并入DNA或RNA分子内。应当认识到，Ht1序列最初可以被合成为病毒多蛋白的一部分，然后可以通过体内或体外蛋白水解而被加工，以产生所希望的重组蛋白。此外，应当认识到，本文所披露的启动子也涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子、用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996)MolecularBiotechnology[分子生物技术]5：209-221；这些文献通过引用并入本文。
用于在植物基因组中的特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所希望的基因组位置处的插入。参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、以及WO 99/25853，将其全部通过引用并入本文。简言之，本文披露的多核苷酸可以包含在两侧为两个非引起重组的重组位点的转移盒中。将转移盒引入使如下靶位点稳定地并入其基因组中的植物中，该靶位点的侧翼为两个与该转移盒的这些位点相对应的非引起重组的重组位点。提供适当的重组酶，并将该转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。靶向多核苷酸的其他方法在WO 2009/114321(通过引用并入本文)中阐述，其描述了产生以修饰植物基因组(特别是玉蜀黍基因组)的“定制”大范围核酸酶。还参见Gao等人(2010)Plant Journal[植物杂志]1：176-187。
可以根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，McCormick等人(1986)Plant cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的组成型表达的所得后代。可以培育两代或更多代植株，确保所希望的表型特征的表达得到稳定保持和遗传，并且然后收获种子以确保已实现所希望的表型特征的表达。以这种方式，本披露提供了具有本文所披露的多核苷酸的转化种子(也称为“转基因种子”)，该多核苷酸例如作为表达盒的一部分稳定地并入其基因组中。
通过植物转化技术(包括以上讨论的那些)衍生的转化的玉蜀黍植物细胞可以被培养以再生拥有该转化的基因型(即，编码赋予北方叶枯病抗性的多肽的Ht1多核苷酸)以及从而拥有所希望的表型(例如对北方叶枯病有抗性，无论该抗性是新赋予的还是增强的)的完整植物。对于玉蜀黍的转化和再生，参见，Gordon-Kamm等人，The Plant Cell[植物细胞]，2：603-618(1990)。从培养的原生质体再生植物描述于Evans等人(1983)ProtoplastsIsolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture[原生质体分离和培养-植物细胞培养手册]，第124-176页，Macmillan Publishing Company，New York[麦克米兰出版公司，纽约]；和Binding(1985)Regeneration of Plants，Plant Protoplasts[植物再生-植物原生质体]第21-73页，CRC出版社，波卡拉顿。还可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分中获得再生。此类再生技术通常描述于Klee等人(1987)Ann Rev of Plant Phys[植物生理学年鉴]38：467中。还参见Payne和Gamborg。
技术人员将认识到，在将含有Ht1基因的表达盒稳定地并入转基因植物中并且证实是有效的之后，其可以通过有性杂交被引入其他植物中。可以使用许多标准繁育技术中的任何一种，这取决于要杂交的物种。
在一些实施例中，所述方法包括通过在可再生的玉蜀黍植物细胞中表达多核苷酸构建体而引入，该多核苷酸构建体包含与至少一种调节序列有效地连接的多核苷酸，其中该多核苷酸编码本文所介绍的Ht1基因的抗性等位基因，并且从该玉蜀黍植物细胞产生对北方叶枯病具有抗性的玉蜀黍植物。通过该方法产生的玉蜀黍植物在基因组中包含该多核苷酸构建体。该调节序列可以是启动子和/或终止子，并且对于玉蜀黍而言可以是天然的。在一些实施例中，该调节序列对Ht1基因而言是天然的。包含该多核苷酸构建体的后代植物还可以通过以下产生：将通过该方法产生的玉蜀黍植物与基因组中不包含该多核苷酸构建体的第二玉蜀黍植物进行杂交。在一些实施例中，Ht1基因过表达(作为基因组片段或cDNA)以给予比天然状态中的表达水平更高的抗性。
实例
提供以下实例以说明但不限制所附权利要求书。应当理解，本文所述实例和实施例仅用于说明目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求书的范围的情况下可以改变各种试剂或参数。
实例1
北方叶枯病抗性基因座的精细定位
为了对位于第2染色体上的北方叶枯病抗性QTL进行精细定位，创建了大型回交衍生群体。从抗性品系PH4GP(评分＝9)和易感品系PH5W4(评分＝1)之间的杂交种创建该群体，并且将易感品系用作轮回亲本。使用美国专利8,921,646中披露的表型方法对BC5个体进行北方叶枯病感染评分。来自群体2的大量个体的标记重组数据将基因置于B73基因组的18kb区域中，该区域包含推定的蛋白质磷酸酶2C、推定的PHD型锌指蛋白和推定的抗病性蛋白。对于该推定的抗病性蛋白没有已知的EST；此外，基于B73预测的基因序列，该推定的抗病性蛋白具有低的组成型表达。
实例2
Ht1的候选基因的鉴定以及等位基因变体的比较
构建来自抗性供体PH4GP的BAC文库，并对覆盖Ht1区间的BAC克隆进行鉴定和测序。PH4GP中的Ht1区间小于10kb，仅有一个编码推定的CC-NB-LRR(卷曲螺旋的、核苷酸结合的、富含亮氨酸的重复)基因的注释基因。来自PH4GP和来自PH1W2的Ht1 cDNA序列(Ht1的抗性等位基因的另一来源；US 2010095395)分别由SEQ ID NO：1和3表示，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：2和4表示。B73具有两种剪接变体，并且该新颖变体(本文称为B73-高)以比已知变体(本文称为B73-低)高得多的水平表达。SEQ ID NO：5是B73-高等位基因的cDNA序列，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：6表示。SEQ ID NO：7是B73-低等位基因的cDNA序列，而所编码的多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：8表示。
图1A-1D显示CC和NB结构域在易感等位基因(来自B73)和抗性等位基因(来自PH4GP和PH1W2)之间高度相似。然而，这两个B73等位基因在LRR中都具有缺失(图1C中加框所示的)。在Ht1抗性等位基因中的该区域的氨基酸序列由SEQ ID NO：10表示。
实例3
转基因验证
产生了含有PH4GP(抗性)等位基因的基因组序列(SEQ ID NO：9)的构建体，并使用农杆菌介导的转化将其转化到易感转化品系中。该基因组序列(SEQ ID NO：9)含有天然启动子、外显子、内含子和终止子区域。将再生的转基因植物种植在温室中，并进行定量PCR分析以确认含有PH4GP(抗性)等位基因的基因组序列的T-DNA盒的插入。许多事件具有单拷贝的T-DNA插入片段，其使用四个侧翼标记通过qPCR来确认。基于标记数据，在50个事件中，41个对该插入片段为阳性，并且9个为阴性(无效)。
在温室中测试所有事件针对北方叶枯病病原体(玉米大斑病菌)的功效。首先，所有事件都受到该病原体的种族0(已知Ht1基因对其提供抗性)的挑战；然后使这些事件经受种族1(Ht1不对其提供抗性)。如通过qPCR所确定的，所有阳性事件都对种族0具有抗性，并且所有阴性事件都对种族0易感。正如预期的，所有事件都对种族1易感。
实例4
表达玉蜀黍Ht1多肽的北方叶枯病抗性玉蜀黍植物的产生
例如，可以使用基于重组DNA的转化来产生表达玉蜀黍Ht1基因的北方叶枯病抗性玉蜀黍植物。基于重组DNA的转化方法是本领域熟知的，例如，根癌农杆菌介导的转化和基于粒子轰击的转化。关于基于根癌农杆菌的植物转化，根据本领域已知的方法构建载体。这些载体含有T-DNA插入片段，该T-DNA插入片段具有启动子、内含子、任选的增强子(如35S增强子元件)、赋予北方叶枯病抗性的Ht1变体DNA、以及植物终止子。切下玉蜀黍未成熟胚胎并用含有目的Ht1变体的根癌农杆菌载体进行感染。感染后，将胚胎转移并在共培养的培养基中培养。共培养后，将感染的未成熟胚胎转移到培养基上使转基因愈伤组织生长。使用PCR和任选的蛋白印迹法(Western assay)来取样推定的转基因愈伤组织以确认Ht1变体基因的存在。将推定的转基因愈伤组织保持在培养基上用于进一步生长并在植物再生之前进行选择。在再生时，将确认为转基因的愈伤组织转移到成熟培养基上并培养用于进行体细胞胚胎成熟。然后将成熟的胚胎转移到再生培养基上用于进行芽和根形成。在芽和根出现后，将单个小植物转移到具有生根培养基的管中。将具有建立的芽和根的小植物移植到温室中的盆中用于进一步生长并产生T1种子。
此外，含有赋予北方叶枯病抗性的Ht1变体DNA的DNA构建体还可以包括编码赋予北方叶枯病抗性的多肽的另一个基因，例如编码NLB18的基因(在WO 2011163590中)。如申请WO 2011163590中所述，PH99N和PH26N两者都是对北方叶枯病显示出抗性的玉蜀黍品系，它们反映了关于第8染色体QTL的不同抗性来源。来自品系PH99N的NLB18多肽的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO：11呈现；来自品系PH26N的NLB18多肽的氨基酸序列在本文中以SEQID NO：12呈现。在植物中引入Ht1和NLB18可能具有增加对玉米大斑病菌病原体的种族0的抗性的作用，和/或可能对另外的Ht1基因不对其提供抗性的一个种族或多个种族(例如种族1)提供抗性。
序列表
<110> EI内穆尔杜邦公司（EI DuPont de Nemours）
先锋良种国际有限公司（Pioneer Hi-Bred International）
Hou, Zhenglin
Leonard, April
Li, Bailin
Tabor, Girma
<120> 产生对北方叶枯病具有增强的抗性的玉蜀黍植物
<130> BB2396USPSP1
<150> US 62/242,691
<151> 2015-10-16
<160> 12
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 2658
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 1
atggagaacc cagacgcgca ggcgaaggcg tgggcggcgg agatgcgcga gctggcctac 60
gacatggagg acagcatcga tctcttcacc caccacgtcg accacgaacc ggccgacacc 120
gccaccaccg gcgtcaagag gttcttcctc cggatcatcc ggaagcttaa gaaactccac 180
taccgccaca ggtttgttca ggagatcaaa caactccacg accttgccaa cgaatcgtac 240
cggcgtagga agaggtacag gattgaggag ggcggttcaa gcctctcgca cgcggagatc 300
gatcctcggt tagaggcgct ctacgtggag gtggagaaac tcgtgggcat ccagggccca 360
agccaggaga tcattggaca gctcgtcggc gagaacgcag cggagcgacg gagggttgtc 420
gccgttgttg gatctggagg ttcaggcaag accacacttg ccaaacaggt gtacgagaaa 480
atcaggtgcc aattctcttg tgcagccttt gtgtctgtgt cgcaaaagcc caacatgaat 540
agcctcctgt gggagttgct atctcaaatc gggaaccatg gtggagattt aggaatgatg 600
gcagtaggat attgcagtga caaacaactg atcgacagac taagatcaca tcttgaaaag 660
cagaggtatc tcgttgtgat agatgatgtt tggacaaact cagcgtggga gaccatacaa 720
tgtgcgctcc ctaaaaatgc ccatgcaagt aaaataattc tgacaacacg aatcaacagt 780
gtaggccagt tctcctgcac tccagatgag ggttttatct atcagatgaa gcctctttgc 840
agaaacgatt ctgaaaatct gtttctgaaa aggacactat gtgataaaga taagtttcct 900
gctcagctgg aggggattaa aaacgagata atcgagaaat gcgatggttt gccactggct 960
attgttactc tagctagcat gttagctact aaacagagaa caagggaaga atgggagagg 1020
gcacttgatt caatccattc tatgcacaag aaagatagtg gcctggaagt gatggacaag 1080
atactgtctc tgagttacag ggatctacct cacaacatga gaaattgctt gctgtatctc 1140
agtacatttc cagaggacca cacgatttac aaagatgccc tagtatggag atggatggct 1200
gaagggttta tcgctgaaac acaaggcttt actttggagc aggttgccga gggctacttc 1260
tacgagtttg tgaacaggag tttggttcag cccataacct tgcgttcaag atatgaaatg 1320
cgtggagaag gaggttgccg agtccatgac attgtactga acttcctcat ctctcgtgca 1380
gctgaagaga actttttaac tacgctgtat ggcgcccagg gggttccatc ttcagaccga 1440
aggattcgcc ggctctctgt ctgggacagt ccagaacacg cactggcagt ctctagagcg 1500
accatgaatc tgtcccatct ccggtcagtt agaatatgca acgttggaga ctggcccgtg 1560
cctgctgttc tagacttacc tgtccttcga gtgttagatc tagagggatg ccgtgatctg 1620
aggatcgacg aacctgactg cattctaagc ttgtttcatc tgagatacct gggtttccgc 1680
agcgcaagtg gtgtcgtgct accggctcaa atcggaaatt tacaccatct gcagaccatc 1740
gatttaagcg ggactggagt gacacagctg ccagaaagca ttgtccagct caagcgactg 1800
atgcatcttg ttgggcaacg gctcatcatg ccagacgggt ttggtagcat ggaatccctt 1860
gaggagttag gtactatcga ctgctgcaag tgccccgtca gttttgggga agacctagca 1920
cttctgagca ggctgagggt gctccgagtg gctttcatcg gggtcgaaac aagtgacatg 1980
gaaaccagaa ggaaatcttt gatgtcatcc ctctgcaaac tcggaggaga caaccttcgg 2040
cgtgtcacta ttatcgacct cgctggcggt ggagattgct ttgtggagtc gtggcaccct 2100
cctcctcgtc tcctccagaa gttcatccat atcagtcagc aacagcactt ctccaggttt 2160
ccagaatgga tcagttcctg cctatgtgat ctcacccacc tggatataaa ggccgaaaag 2220
atggaaaggg agcatctaag tgttcttgaa cacctgcccg ccatccgttg cctatacctt 2280
ttcgtgaagc gagtctccga agacgggctc gccatcagcc acggcgcgtt ccgatgtcta 2340
cggcgtctcg agttctgcaa cgtagatgga cctggtttga tgtttgcagg aggcgttcca 2400
atgttggaat ggctgaggct cgggttcgac gcggatagag cgcaatcgac atacggcggt 2460
ctggaggttg gcatccagcg cctctcgtct ctcaaacatg tcgtgctcat tgtatggatg 2520
gtttctgaag gcggtgatga tccagcggag caagccgtct ggtctgccat caatggccaa 2580
gtagagatgc tccccaactc tccgacggtt gatatccggt ttcgtagacg gagtcagctg 2640
caggcaagct cagaataa 2658
<210> 2
<211> 885
<212> PRT
<213> 玉蜀黍
<400> 2
Met Glu Asn Pro Asp Ala Gln Ala Lys Ala Trp Ala Ala Glu Met Arg
1 5 10 15
Glu Leu Ala Tyr Asp Met Glu Asp Ser Ile Asp Leu Phe Thr His His
20 25 30
Val Asp His Glu Pro Ala Asp Thr Ala Thr Thr Gly Val Lys Arg Phe
35 40 45
Phe Leu Arg Ile Ile Arg Lys Leu Lys Lys Leu His Tyr Arg His Arg
50 55 60
Phe Val Gln Glu Ile Lys Gln Leu His Asp Leu Ala Asn Glu Ser Tyr
65 70 75 80
Arg Arg Arg Lys Arg Tyr Arg Ile Glu Glu Gly Gly Ser Ser Leu Ser
85 90 95
His Ala Glu Ile Asp Pro Arg Leu Glu Ala Leu Tyr Val Glu Val Glu
100 105 110
Lys Leu Val Gly Ile Gln Gly Pro Ser Gln Glu Ile Ile Gly Gln Leu
115 120 125
Val Gly Glu Asn Ala Ala Glu Arg Arg Arg Val Val Ala Val Val Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Gln Val Tyr Glu Lys
145 150 155 160
Ile Arg Cys Gln Phe Ser Cys Ala Ala Phe Val Ser Val Ser Gln Lys
165 170 175
Pro Asn Met Asn Ser Leu Leu Trp Glu Leu Leu Ser Gln Ile Gly Asn
180 185 190
His Gly Gly Asp Leu Gly Met Met Ala Val Gly Tyr Cys Ser Asp Lys
195 200 205
Gln Leu Ile Asp Arg Leu Arg Ser His Leu Glu Lys Gln Arg Tyr Leu
210 215 220
Val Val Ile Asp Asp Val Trp Thr Asn Ser Ala Trp Glu Thr Ile Gln
225 230 235 240
Cys Ala Leu Pro Lys Asn Ala His Ala Ser Lys Ile Ile Leu Thr Thr
245 250 255
Arg Ile Asn Ser Val Gly Gln Phe Ser Cys Thr Pro Asp Glu Gly Phe
260 265 270
Ile Tyr Gln Met Lys Pro Leu Cys Arg Asn Asp Ser Glu Asn Leu Phe
275 280 285
Leu Lys Arg Thr Leu Cys Asp Lys Asp Lys Phe Pro Ala Gln Leu Glu
290 295 300
Gly Ile Lys Asn Glu Ile Ile Glu Lys Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Ile Val Thr Leu Ala Ser Met Leu Ala Thr Lys Gln Arg Thr Arg Glu
325 330 335
Glu Trp Glu Arg Ala Leu Asp Ser Ile His Ser Met His Lys Lys Asp
340 345 350
Ser Gly Leu Glu Val Met Asp Lys Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Asp
355 360 365
Leu Pro His Asn Met Arg Asn Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Thr Phe Pro
370 375 380
Glu Asp His Thr Ile Tyr Lys Asp Ala Leu Val Trp Arg Trp Met Ala
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Glu Gly Phe Ile Ala Glu Thr Gln Gly Phe Thr Leu Glu Gln Val Ala
405 410 415
Glu Gly Tyr Phe Tyr Glu Phe Val Asn Arg Ser Leu Val Gln Pro Ile
420 425 430
Thr Leu Arg Ser Arg Tyr Glu Met Arg Gly Glu Gly Gly Cys Arg Val
435 440 445
His Asp Ile Val Leu Asn Phe Leu Ile Ser Arg Ala Ala Glu Glu Asn
450 455 460
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Arg Ile Arg Arg Leu Ser Val Trp Asp Ser Pro Glu His Ala Leu Ala
485 490 495
Val Ser Arg Ala Thr Met Asn Leu Ser His Leu Arg Ser Val Arg Ile
500 505 510
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515 520 525
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Pro Asp Cys Ile Leu Ser Leu Phe His Leu Arg Tyr Leu Gly Phe Arg
545 550 555 560
Ser Ala Ser Gly Val Val Leu Pro Ala Gln Ile Gly Asn Leu His His
565 570 575
Leu Gln Thr Ile Asp Leu Ser Gly Thr Gly Val Thr Gln Leu Pro Glu
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Ser Ile Val Gln Leu Lys Arg Leu Met His Leu Val Gly Gln Arg Leu
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610 615 620
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625 630 635 640
Leu Leu Ser Arg Leu Arg Val Leu Arg Val Ala Phe Ile Gly Val Glu
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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Pro Ala Gln Leu Glu Gly Ile Lys Asn Glu Ile Ile Glu Lys Cys Asp
300 305 310 315
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335 340 345
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Leu Ser Thr Phe Pro Glu Asp His Thr Ile Tyr Lys Asp Ala Leu Val
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Arg Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ser Ser Glu
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<210> 3
<211> 2652
<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 3
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gccaccaccg gcgtcaagag gttcttcctc cggatcatcc ggaagcttaa gaaactccac 180
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cggcgtagga agaggtacag gattgaggag ggcggttcaa gcctctcgca cgcggagatc 300
gatcctcggt tagaggcgct ctacgtggag gtggagaaac tcgtgggcat ccagggccca 360
agccaggaga tcattggaca gctcgtcggc gagaacgcag cggagcgacg gagggttgtc 420
gccgttgttg gatctggagg ttcaggcaag accacacttg ccaaacaggt gtacgagaaa 480
atcaggtgcc aattctcttg tgcagccttt gtgtctgtgt cgcaaaagcc caacatgaat 540
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attgttactc tagctagcat gttagctact aaacagagaa caagggaaga atgggagagg 1020
gcacttgatt caatccattc tatgcacaag aaagatagtg gcctggaagt gatggacaag 1080
atactgtctc tgagttacag ggatctacct cacaacatga gaaattgctt gctgtatctc 1140
agtacatttc cagaggacca cacgatttac aaagatgccc tagtatggag atggatggct 1200
gaagggttta tcgctgaaac acaaggcttt actttggagc aggttgccga gggctacttc 1260
tacgagtttg tgaacaggag tttggttcag cccataacct tgcgttcaag atatgaaatg 1320
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accatgaatc tgtcccatct ccggtcagtt agaatatgca acgttggaga ctggcccgtg 1560
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cttctgagca ggctgagggt gctccgagtg gctttcatcg gggtcgaaac aagtgacatg 1980
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<213> 玉蜀黍
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<213> 玉蜀黍
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<213> 玉蜀黍
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<212> DNA
<213> 玉蜀黍
<400> 7
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<213> 玉蜀黍
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Lys Leu Cys Leu Asn Lys Glu Ser Ala Ile Ser Ile Ala Gly Ala Arg
530 535 540
Gly Thr Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Val Tyr Ser Lys Gln Phe Gly
545 550 555 560
Ile Ile Ser Ser Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Met Met Val Leu
565 570 575
Glu Met Val Gly Ala Arg Asp Arg Asn Thr Ser Ala Asp Ser Asp His
580 585 590
Ser Ser Gln Tyr Phe Pro Gln Trp Leu Tyr Glu His Leu Asp Asp Tyr
595 600 605
Cys Val Gly Ala Ser Glu Ile Asn Gly Glu Thr Thr Glu Leu Val Arg
610 615 620
Lys Met Ile Val Val Gly Leu Trp Cys Ile Gln Val Ile Pro Thr Asp
625 630 635 640
Arg Pro Thr Met Thr Arg Val Val Glu Met Leu Glu Gly Ser Thr Ser
645 650 655
Asn Leu Glu Leu Pro Pro Arg Val Leu Leu Ser
660 665
<210> 12
<211> 666
<212> PRT
<213> 玉蜀黍
<400> 12
Met Ala Ala His Leu Pro Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala His Val Val Ser Thr Ser Ala His Ala Glu Pro Pro Leu Pro
20 25 30
Ser Pro Tyr Ser Thr Ser Ala His Gly Glu Pro Pro Leu Pro Ser Thr
35 40 45
Tyr Asn Val Ser Met Cys Ser Glu Ser Phe Trp Cys Gly Gly Val Glu
50 55 60
Ile Arg Tyr Pro Phe Tyr Leu Ala Asn Ala Thr Ala Asp Tyr Ser Gly
65 70 75 80
Ser Tyr Tyr Ser Cys Gly Tyr Thr Asp Leu Ser Val Ser Cys Lys Leu
85 90 95
Glu Val Glu Gly Pro Thr Thr Thr Trp Thr Pro Thr Ile Arg Leu Gly
100 105 110
Gly Asp Asn Tyr Thr Val Lys Asn Ile Leu Tyr Asp Tyr His Thr Ile
115 120 125
Ser Leu Ala Asp Ser Asp Val Leu Gly Gly Gly Glu Cys Pro Val Val
130 135 140
His His Asn Val Ser Phe Asp Glu Thr Trp Leu His Asn Pro Ser Ala
145 150 155 160
Phe Asp Asn Leu Thr Phe Phe Phe Gly Cys His Trp Gly Pro Arg Asp
165 170 175
Thr Leu Pro Glu Phe Ala Gly Asn Asn Ile Ser Cys Ala Gly Phe Ser
180 185 190
Thr Pro Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ser Phe Val Phe Lys Pro Glu Asp
195 200 205
Leu Asp Glu His Ala Glu Gln Glu Leu Ala Ser His Cys Asp Glu Val
210 215 220
Phe Ser Val Pro Val Arg Ser Glu Ala Leu Gln Gln Ala Ile Val Ser
225 230 235 240
Asn Leu Ser Leu Gly Asp Gly Tyr Gly Glu Leu Leu Arg Gln Gly Ile
245 250 255
Glu Leu Glu Trp Lys Arg Thr Ser Glu Asp Gln Cys Gly Gln Cys Glu
260 265 270
Glu Ser Gly Ser Gly Gly Arg Cys Ala Tyr Ser Gln Lys Arg Glu Phe
275 280 285
Leu Gly Cys Leu Cys Ser Gly Gly Lys Ala Gly Asn Pro Phe Cys Lys
290 295 300
Pro Ser Arg Ser Lys Arg Lys Glu Ala Ser Ile Val Gly Ala Val Ala
305 310 315 320
Val Ala Phe Leu Cys Leu Val Ile Leu Thr Cys Phe Leu Ala Cys Arg
325 330 335
His Gly Ser Leu Pro Phe Lys Ser Glu Asn Lys Pro Gly Thr Arg Ile
340 345 350
Glu Ser Phe Leu Gln Lys Asn Glu Ser Ile His Pro Lys Arg Tyr Thr
355 360 365
Tyr Thr Asp Val Lys Arg Met Thr Lys Ser Phe Ala Val Lys Leu Gly
370 375 380
Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu His Asp Gly Arg
385 390 395 400
Gln Val Ala Val Lys Met Leu Lys Asp Thr Gln Gly Asp Gly Glu Glu
405 410 415
Phe Met Asn Glu Val Ala Ser Ile Ser Arg Thr Ser His Val Asn Val
420 425 430
Val Thr Leu Leu Gly Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Arg Ala Leu Ile
435 440 445
Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Glu Arg Tyr Ala Phe Thr Gly
450 455 460
Asp Met Asn Ser Glu Asn Leu Leu Thr Trp Glu Arg Leu Phe Asp Ile
465 470 475 480
Ala Ile Gly Thr Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Leu His Arg Gly Cys Asn
485 490 495
Thr Arg Ile Val His Phe Asp Ile Lys Pro His Asn Ile Leu Leu Asp
500 505 510
Gln Asp Phe Cys Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Cys
515 520 525
Leu Asn Lys Glu Ser Ala Ile Ser Ile Val Gly Ala Arg Gly Thr Ile
530 535 540
Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Val Tyr Ser Lys Gln Phe Gly Thr Ile Ser
545 550 555 560
Ser Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Met Met Val Leu Glu Met Val
565 570 575
Gly Ala Arg Glu Arg Asn Thr Ser Ala Ser Ala Asp Ser Asp His Ser
580 585 590
Ser Gln Tyr Phe Pro Gln Trp Ile Tyr Glu His Leu Asp Asp Tyr Cys
595 600 605
Val Gly Ala Ser Glu Ile Asn Gly Glu Thr Thr Glu Leu Val Arg Lys
610 615 620
Met Ile Val Val Gly Leu Trp Cys Ile Gln Val Ile Pro Thr Asp Arg
625 630 635 640
Pro Thr Met Thr Arg Val Val Glu Met Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn
645 650 655
Leu Glu Leu Pro Pro Arg Val Leu Leu Ser
660 665

Claims (15)

1.一种多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含选自下组的分离的多核苷酸，该组由以下组成：
a.在SEQ ID NO：1(PH4GP c-DNA)、SEQ ID NO：3(PH1W2 cDNA)、或SEQ ID NO：9(PH4GP基因组序列)中列出的核苷酸序列；
b.编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTALW比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％的序列同一性；
c.编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTALW比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列；以及
d.编码CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中列出的序列，
其中所述分离的多核苷酸有效地连接至启动子。
2.如权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体进一步包含编码选自下组的多肽的一个或多个另外的异源核酸序列，该组由以下组成：赋予抗病性的多肽、赋予除草剂抗性的多肽、赋予昆虫抗性的多肽、涉及碳水化合物代谢的多肽、涉及脂肪酸代谢的多肽、涉及氨基酸代谢的多肽、涉及植物发育的多肽、涉及植物生长调节的多肽、涉及提高产量的多肽、涉及抗旱性的多肽、涉及抗寒性的多肽、涉及抗热性的多肽、和/或涉及抗盐性的多肽，其中每个异源核酸序列有效地连接至启动子。
3.如权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中赋予抗病性的多肽是赋予北方叶枯病(NLB)抗性的多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸构建体，其中所述赋予北方叶枯病抗性的多肽是基于使用默认参数进行的CLUSTALW比对方法，与SEQ ID NO：11或12相比时，具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
5.一种玉蜀黍植物细胞，其包含如权利要求1所述的多核苷酸构建体。
6.一种玉蜀黍植物，其包含如权利要求5所述的玉蜀黍植物细胞。
7.一种用于产生对北方叶枯病(NLB)表现出抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
a)在可再生的玉蜀黍植物细胞中表达多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含与至少一种调节序列有效地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自由以下组成的组：
i.在SEQ ID NO：1(PH4GP c-DNA)、SEQ ID NO：3(PH1W2 cDNA)、或SEQ ID NO：9(PH4GP基因组序列)中列出的核苷酸序列；
ii编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTALW比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％的序列同一性；
iii.编码具有如下氨基酸序列的CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列基于使用默认参数进行的CLUSTALW比对方法，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4相比时，具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽包含SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列；
iv编码CC-NB-LRR多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中列出的序列；或
v.与(i)、(ii)、(iii)或(iv)互补的核苷酸序列；以及
b)产生对北方叶枯病表现出抗性的玉蜀黍植物，其中所述玉蜀黍植物在其基因组中包含所述多核苷酸构建体。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述至少一种调节序列是启动子。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述至少一种调节序列是终止子。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述调节序列对于玉蜀黍而言是天然的。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述调节序列对于Ht1基因而言是天然的。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含编码选自下组的多肽的一个或多个另外的异源核酸序列，该组由以下组成：赋予抗病性的多肽、赋予除草剂抗性的多肽、赋予昆虫抗性的多肽、涉及碳水化合物代谢的多肽、涉及脂肪酸代谢的多肽、涉及氨基酸代谢的多肽、涉及植物发育的多肽、涉及植物生长调节的多肽、涉及提高产量的多肽、涉及抗旱性的多肽、涉及抗寒性的多肽、涉及抗热性的多肽、和/或涉及抗盐性的多肽，其中每个异源核酸序列有效地连接至启动子。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述赋予抗病性的多肽是赋予北方叶枯病(NLB)抗性的多肽。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述赋予北方叶枯病抗性的多肽是基于使用默认参数进行的CLUSTAL W比对方法，与SEQ ID NO：11或12相比时，具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列的多肽。
15.一种获得对北方叶枯病(NLB)表现出抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
a)将通过如权利要求7所述的方法产生的玉蜀黍植物与在其基因组中不包含所述多核苷酸构建体的玉蜀黍植物进行杂交；
b)获得对北方叶枯病表现出抗性的后代植物，其中所述后代植物在其基因组中包含所述多核苷酸构建体。
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