CN116254289B

CN116254289B - 拟南芥abapt3蛋白或其相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用

Info

Publication number: CN116254289B
Application number: CN202310540668.4A
Authority: CN
Inventors: 赖建彬; 阳成伟; 赵亚文; 黄丽婷
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2023-05-15
Filing date: 2023-05-15
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2043-05-15
Also published as: CN116254289A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了拟南芥ABAPT3蛋白或其相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用。ABAPT3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过过表达植物去棕榈酰化酶ABAPT3，该蛋白通过特异性抑制双生病毒C4蛋白的棕榈酰化修饰，从而抑制致病因子C4的功能和双生病毒侵染。由于双生病毒的C4蛋白具有蛋白序列和功能的保守性，且大多数的双生病毒的C4蛋白都具有棕榈酰化修饰位点，因此该技术可能可以广泛应用于其他双生病毒种类，以提高农作物抵抗双生病毒的能力。

Description

拟南芥ABAPT3蛋白或其相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及拟南芥ABAPT3蛋白或其相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用。

背景技术

双生病毒（Geminivirus）是一类单链DNA植物病毒，在自然界中具有广泛的宿主。双生病毒对农作物的生产造成巨大危害。近年来，双生病毒所造成的病害更为严重，因此，双生病毒的防治对保障农业安全具有至关重要的意义。双生病毒只编码少量蛋白，利用这些病毒蛋白与植物宿主中的因子相互作用，从而促进其自身的复制和移动，以完成其生活周期。甜菜严重曲顶病毒（Beet severe curly top virus，BSCTV）是双生病毒科曲顶病毒属的重要成员，对不同类型的植物宿主都具有很强的侵染性，包括模式植物本氏烟草和拟南芥，因此该种病毒常被用于研究植物与双生病毒的相互作用。

现有防治双生病毒的方法较为缺乏，多数通过敲减或过表达植物基因改变相关信号通路以提高植物抗病毒的能力，或者通过靶标病毒DNA的基因编辑技术以抑制侵染。其中，敲减和过表达植物基因主要通过激活水杨酸和茉莉酸等介导的免疫通路，对植物自身具有胁迫效应。对病毒DNA的基因编辑技术能够较特异地破坏病毒基因组的完整性，但目前该技术存在脱靶的现象，可能影响植物本身的基因组稳定性。

C4蛋白（(BSCTV编码的致病因子)）是多种双生病毒所编码的保守病症决定因子，其功能缺失抑制了双生病毒的侵染。C4蛋白通过诱导植物细胞分裂、介导病毒移动和抑制基因沉默等方式为双生病毒的侵染提供了有利的环境。前期的研究结果表明包括BSCTV在内的多个双生病毒所编码的C4蛋白在植物细胞内受到棕榈酰化（S-palmitoylation或S-acylation）修饰。生物信息学分析发现大多数的双生病毒C4蛋白的N端都具有潜在的棕榈酰化修饰位点，说明该修饰可能是双生病毒属的病毒中广泛存在的保守调控方式。棕榈酰化是指长链脂肪酸（如棕榈酸）共价结合在底物蛋白质的半胱氨酸残基上，以调控蛋白质的定位和功能。棕榈酰化介导了C4在植物细胞质膜的定位，而且该修饰是C4在植物细胞内行使致病功能以及双生病毒侵染所需要的。因此，如果能够通过某种方式降低C4蛋白在植物细胞内的棕榈酰化修饰，就有可能抑制双生病毒的侵染。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出拟南芥ABAPT3蛋白或其相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用。本发明利用过表达ABAPT3蛋白，干扰双生病毒的致病因子C4蛋白的棕榈酰化修饰，抑制双生病毒的侵染，从而培育出抗双生病毒的农作物。

本发明提供了拟南芥ABAPT3蛋白在提高植物抗病毒性能中的应用，所述ABAPT3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述病毒为双生病毒；更优先地，所述双生病毒为甜菜严重曲顶病毒（BSCTV）。

优选地，所属植物为农作物。

更优选地，所述植物包括但不限于番茄、烟草、棉花、玉米、小麦、豆类和木薯。

在本发明中，提高植物抗病毒性能是通过过表达ABAPT3蛋白，从而干扰双生病毒的致病因子-C4蛋白的棕榈酰化修饰而实现的。

本发明还提供了与拟南芥ABAPT3蛋白相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用，所述生物材料含有如下（1）-（4）的至少一种：

（1）编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子；

（2）含有（1）所述核酸分子的表达盒；

（3）含有（1）所述核酸分子的重组表达载体；

（4）含有（3）所述重组表达载体的转化子。

优选地，所述编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5’-ATGGGAGGTGTGACGTCATCAGTTGCGGCGAAGTTCGCTTTCTTCCCGCCGAGTCCGTCGTCTTACAAGCTGGTTTACGATGAACTGACCGGACTTCTTCTGATGAACCCATTTCCTCACCGTGAAAACGTTGAAATCCTTAAGCTTCCGACACGTAGAGGAACAGAGATCGTGGCTATGTACGTCAGACATCCGATGGCTACCTCTACTCTGCTTTATTCCCATGGAAACGCCGCCGATCTGGGCCAGATGTATGAGCTCTTCATCGAATTGAGCATCCATCTTAAGGTTAATCTCATGGGGTACGATTACTCCGGGTATGGACAATCTACTGGAAAGCCAAGTGAGCACCATACATATGCTGATATCGAAGCTGCTTATAAATGTCTTGAGGAAACCTATGGAGCAAAACAGGAAGACATAATCCTTTATGGCCAATCCGTTGGAAGTGGACCTACATTAGATCTTGCTGCTCGGTTGCCTCAATTAAGAGCTGCTGTTCTCCATAGCCCGATTCTTTCTGGTCTAAGAGTAATGTATCCAGTGAAGAAGACATACTGGTTCGACATCTTCAAGAATATCGACAAAATACCTCTTGTGAATTGCCCGGTTCTCGTCATTCACGGAACTTGTGATGAAGTTGTTGACTGTTCTCATGGAAAACAACTATGGGAACTCTCTAAAGAGAAATATGAACCGCTTTGGCTCGAAGGCGGTAACCACTGTGATCTAGAACACTATCCTGAATACATTAAACACCTTAAGAAGTTCATCACAACCGTAGAGAGAGATCTCTCCTCGAGGGCGAGCACGGCCCAATTAGAGAAACAGAGCAGCGATTTGGAAATGCCGAGGCAGAGCGTAGATAGAAGAGAGAAGCCGAGGCAAAGCGTTGATAAAAGGGAGAAAGAGAAACCTCCAAAGGGTCCTTCAAAGAAGAGTAAGCTGAGAATCACGTTCGAGCAGCACTTAGATCGGACTAGGAGAAGCGTTGACTTCCACGAAAAGGCAAGGAAGAGCGTTGACCATCATCAGCATCATCAGAATCATCATCAGATTGAGAGAGGAAGGAAGAGTGTTGATAGATTGGATAGAGTACGGTCTGAGTAA-3’（SEQ ID NO.2）。

本发明还提供了一种重组表达载体，由编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子和植物表达载体构建得到；所述编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于基因枪转化的载体；所述的双元农杆菌载体包括但不限于pBI121、pCAMBIA系列载体；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其他效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。

本发明还提供了一种培育抗病毒的转基因植物的方法，包括以下步骤：将上述重组表达载体转化植物组织，并将转化的植物组织进行培育，得到转基因植物。

优选地，所述转化的方法包括农杆菌转化法、基因枪转化法、电击法、PEG载体法、脂质体法。此外，本领域技术人员也可根据实际使用需要，合理选择其他的转化方式以用于重组表达载体的导入。

本发明还提供了一种提高植物对双生病毒抗性的方法，通过在植物中过表达ABAPT3蛋白，特异性干扰双生病毒的致病因子C4蛋白的棕榈酰化修饰，以提高植物对双生病毒抗性；所述ABAPT3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MGGVTSSVAAKFAFFPPSPSSYKLVYDELTGLLLMNPFPHRENVEILKLPTRRGTEIVAMYVRHPMATSTLLYSHGNAADLGQMYELFIELSIHLKVNLMGYDYSGYGQSTGKPSEHHTYADIEAAYKCLEETYGAKQEDIILYGQSVGSGPTLDLAARLPQLRAAVLHSPILSGLRVMYPVKKTYWFDIFKNIDKIPLVNCPVLVIHGTCDEVVDCSHGKQLWELSKEKYEPLWLEGGNHCDLEHYPEYIKHLKKFITTVERDLSSRASTAQLEKQSSDLEMPRQSVDRREKPRQSVDKREKEKPPKGPSKKSKLRITFEQHLDRTRRSVDFHEKARKSVDHHQHHQNHHQIERGRKSVDRLDRVRSE（SEQID NO.1）。

研究发现拟南芥ABAPT3蛋白可以降低BSCTV C4蛋白的棕榈酰化修饰水平，从而改变C4的亚细胞定位，进而抑制C4的致病功能和BSCTV的侵染。利用本发明的过表达ABAPT3蛋白提高植物对双生病毒抗性的方法有利于提高我国农业生产的安全性。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明通过过表达植物去棕榈酰化酶ABAPT3，该蛋白通过特异性抑制双生病毒C4蛋白的棕榈酰化修饰，从而抑制致病因子C4蛋白的功能和双生病毒侵染。由于双生病毒的C4蛋白具有蛋白序列和功能的保守性，而且已有的研究发现大多数的双生病毒的C4蛋白都具有棕榈酰化修饰位点。因此该技术可以广泛应用于其他双生病毒种类，以提高农作物抵抗双生病毒的能力。

附图说明

图1为实施例1中共聚焦显微荧光定位结果；

图2为实施例1中蛋白免疫印迹图；

图3为实施例2中经注射不同重组菌后叶片的病症情况；

图4为实施例2中不同组别拟南芥植物出现茎端扭曲病症的百分比。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

前期研究中已从拟南芥中鉴定得到一组去棕榈酰化酶，共有11个成员，并命名为ABAPTs（ABHD17-Like Acyl Protein Thioesterases）。现通过系统性筛选，将ABAPTs分别与带有红色荧光蛋白（RFP）的BSCTV C4蛋白在植物细胞中共表达，最终筛选得到其中仅有ABAPT3可作为BSCTV C4的去棕榈酰化酶。研究发现，过表达ABAPT3能够抑制BSCTV C4的棕榈酰化修饰，并干扰了BSCTV C4的质膜定位；进而发现过表达ABAPT3可以抑制BSCTV C4的致病功能和BSCTV的侵染。

实施例1

本实施例研究了过表达ABAPT3蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）对BSCTVC4的亚细胞定位和棕榈酰化修饰水平的影响。

由于多种双生病毒的C4蛋白已被报道在植物细胞中受到棕榈酰化修饰，而且该修饰是C4维持质膜定位和致病功能以及双生病毒侵染所需要的，因此，本发明通过将拟南芥去棕榈酰化酶ABAPT家族蛋白与BSCTV C4蛋白在植物细胞中共表达，筛选得到ABAPT3是BSCTV C4潜在的去棕榈酰化酶。以BSCTV的基因组（ATCC PVMC-6；以前称为BCTV-CFH株，这个菌株将用EcoRI线性化的BSCTV的双链DNA保存在质粒pCFH上）为模板，通过PCR扩增BSCTVC4基因（引物信息如下：BSCTV C4-GFP-F：5’-ACGGGGGACTCTTGACCATGAAAATGGGGAACCACAT-3’（SEQ ID NO.3）；BSCTV C4-GFP-R：5’-AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTATGCCTCTGCTGCAGCATCA-3’（SEQ ID NO.4）），构建到pCambia1302表达载体中，与载体上的GFP绿色荧光蛋白基因融合，得到pCambia1302-35S:C4-GFP质粒，用于表达BSCTV C4-GFP蛋白。在此基础上，以拟南芥cDNA为模板，通过PCR扩增ABAPT3基因（引物信息如下：ABAPT3-MYC-F：5’-TACAAATCTATCTCTCTCGAGATGGGAGGTGTGACGTCATC-3’（SEQ ID NO.5）；ABAPT3-MYC-R：5’-ATTATTATGGAGAAACTCGAGTTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCCTCAGACCGTACTCT-3’（SEQ ID NO.6）；C端加上MYC标签），将ABAPT3基因（如SEQ ID NO.2所示）构建到pCambia1302- 35S:C4-GFP质粒中，把其中的潮霉素抗性基因HYG替换掉，获得pCambia1302-35S:C4-GFP-35S:ABAPT3，用于同时过表达C4-GFP和ABAPT3。将pCambia1302-35S:C4-GFP与pCambia1302-35S:C4-GFP-35S:ABAPT3分别转化野生型拟南芥的原生质体，24小时之后通过激光共聚焦显微镜观察C4-GFP的亚细胞定位情况。结果如图1所示，BSCTV C4-GFP主要定位于植物细胞的质膜上；当ABAPT3过表达时，BSCTV C4-GFP的亚细胞定位发生变化，部分弥散到细胞质中。以上结果说明ABAPT3的过表达影响了BSCTV C4的亚细胞定位。同时，通过生物素转换（Biotinswitch）技术分析ABAPT3对BSCTV C4棕榈酰化水平的影响。后续的蛋白免疫印迹结果如图2所示，与单纯表达BSCTV C4-GFP相比，ABAPT3的过表达明显抑制了BSCTV C4-GFP的棕榈酰化修饰。以上结果说明ABAPT3的过表达降低了C4蛋白的棕榈酰化水平。

实施例2

本实施例研究了过表达ABAPT3蛋白对BSCTV C4的致病能力和BSCTV侵染能力的抑制作用。

由于C4蛋白是BSCTV的病症决定因子，而且棕榈酰化修饰是其行使致病功能以及双生病毒侵染所需要的，图1和图2的结果已表明ABAPT3是BSCTV C4的去棕榈酰化酶，因此进而分析在植物中过表达ABAPT3对C4功能和BSCTV侵染的影响。由于C4蛋白在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中的瞬时表达可以导致叶片出现病斑，因此，首先分析ABAPT3的过表达对BSCTV C4在烟草叶片中所引起的病症的影响。

以BSCTV的基因组作为模板，通过PCR扩增BSCTV C4基因（引物信息如下：BSCTVC4-F：5’-TTTTCTGATTAACAGGGATCCATGAAAATGGGGAACCACA-3’（SEQ ID NO.7）；BSCTV C4-R：5’-GCCCTTGCTCTCGAGACTAGTTTAATGCCTCTGCTGCAGCA-3’（SEQ ID NO.8）），构建到pCambia1300-UBQ载体中（以植物组成型过表达启动子UBQ作为启动子），获得pCambia1300-UBQ:C4质粒。以拟南芥cDNA为模板，通过PCR扩增ABAPT3基因（引物信息如下：ABAPT3-RFP-F：5’-TTTTCTGATTAACAGGGATCCATGGGAGGTGTGACG-3’（SEQ ID NO.9）；ABAPT3-RFP-R：5’-AGTGGTACCCCCGGGGGATCCCTCAGACCGTACTCT-3’（SEQ ID NO.10）），构建到pCambia1300-UBQ:RFP表达载体，获得pCambia1300-UBQ:ABAPT3-RFP。将上述重组质粒分别转化农杆菌EHA105，获得重组菌株。将培养的重组菌，利用叶片注射的方法，将pCambia1300-UBQ:ABAPT3-RFP或pCambia1300-UBQ:RFP（空载体对照）分别与pCambia 1300-UBQ:C4在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中共同表达，7天后观察注射叶片表型。研究结果如图3所示，与空载体共注射的叶片（C4+RFP组）中，pCambia 1300-UBQ:C4可诱导出现大量白色坏死的病斑；而与pCambia1300-UBQ:ABAPT3-RFP共注射的叶片（C4+ABAPT3-RFP组）生长正常，没有出现病斑。该结果说明ABAPT3的过表达抑制了BSCTV C4蛋白在植物中的致病功能。

其次，分析ABAPT3的过表达拟南芥植物对BSCTV的抗性。以拟南芥cDNA为模板，通过PCR扩增ABAPT3基因（引物信息如下：ABAPT3-GFP-F：5’-GGGGGACTCTTGACCATGGGAGGTGTGACGTCATC-3’（SEQ ID NO.11）；ABAPT3-GFP-R：5’-CGGGCCCGCGGTACCCTCAGACCGTACTCTATCCA-3’（SEQ ID NO.12）），构建到pCambia1300-35S:GFP表达载体，获得pCambia1300-35S:ABAPT3-GFP质粒，通过农杆菌介导的花滴染法转化野生型拟南芥，利用T3代纯合过表达株系进行侵染实验。将BSCTV的侵染性质粒（pCambia1300-BSCTV1.8copy；来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员实验室）转化农杆菌EHA105，获得EHA105-BSCTV菌株；将其培养之后悬浮到10 mM的MgCl₂溶液里，静置3小时之后，与金刚砂混匀，再以压力喷洒的方式侵染4周大小的野生型（WT）、空载体对照（Vector）和两个独立株系的ABAPT3-GFP过表达拟南芥植物（ABAPT3-OE），并在侵染后不同时间点记录出现茎端扭曲病症的植物百分比。研究结果如图4所示，在图4中，纵坐标为出现病症的拟南芥植物百分数，横坐标为病毒接种后的天数。图4中包含野生型（WT）组、空载体对照（Vector）组、1号ABAPT3-GFP过表达拟南芥植物（ABAPT3-OE #1）和2号ABAPT3-GFP过表达拟南芥植物（ABAPT3-OE #2）。由图4可知，与野生型（WT）和空载体对照（Vector）的植物相比，ABAPT3-GFP的过表达植物出现病症的百分比显著降低。该结果说明ABAPT3的过表达提高了植物抵抗BSCTV侵染的能力。

以上从各个层面证明拟南芥ABAPT3可以影响BSCTV C4的亚细胞定位和棕榈酰化修饰，进而抑制BSCTV C4的致病功能和BSCTV的侵染。由于ABAPT3的过表达并不引起植物产生异常表型，因此避免了其他抗病策略对植物自身发育产生影响的缺点。同时，ABAPT3特异性针对双生病毒编码的致病因子C4以抑制病毒侵染，具有清晰的作用机制，而以病毒因子为靶标，有利于避免对植物自身途径的干扰。由于C4蛋白是不同种类双生病毒所共有的重要因子（其N端的棕榈酰化位点也具有保守性），而且已有的报道表明多种双生病毒C4的棕榈酰化对其功能是必需的，因此本技术方案很可能对其他类型的双生病毒病害防治也具有效果。

Claims

1.拟南芥ABAPT3蛋白在提高植物抗病毒性能中的应用，其特征在于，所述ABAPT3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述病毒为甜菜严重曲顶病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为农作物。

3.与拟南芥ABAPT3蛋白相关的生物材料在提高植物抗病毒性能中的应用，其特征在于，所述生物材料选自如下（1）-（4）的至少一种：

（1）编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子；

（2）含有（1）所述核酸分子的表达盒；

（3）含有（1）所述核酸分子的重组表达载体；

（4）含有（3）所述重组表达载体的转化子；

所述ABAPT3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述病毒为甜菜严重曲顶病毒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种培育抗病毒的转基因植物的方法，包括以下步骤：将重组表达载体转化植物组织，并将转化的植物组织进行培育，得到转基因植物；

所述重组表达载体由编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子和植物表达载体构建得到，所述编码拟南芥ABAPT3蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述病毒为甜菜严重曲顶病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化的方法包括农杆菌转化法、基因枪转化法、电击法、PEG载体法、脂质体法。

7.一种提高植物对双生病毒抗性的方法，其特征在于，通过在植物中过表达ABAPT3蛋白，特异性干扰双生病毒的致病因子C4蛋白的棕榈酰化修饰，以提高植物对双生病毒抗性；所述ABAPT3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述双生病毒为甜菜严重曲顶病毒。