CN116515894A - 创制香味高粱的方法及其所用生物材料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术育种领域中创制香味高粱的方法及其所用生物材料。本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术创制香味高粱的方法，在高粱BADH2基因的第5外显子和第11外显子上设计特异靶点，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化高粱的受体材料Wheatland，获得转基因植株，在转基因后代中经过鉴定获得了无载体的纯合株系。在两个转基因株系的籽粒和嫩叶中，香味物质2‑乙酰‑1‑吡咯啉(2‑AP)积累，含量极显著高于野生型。本发明利用CRISPR/Cas9技术成功敲除高粱BADH2基因，操作简单，快速高效，创制了香味高粱，为香型高粱品种的培育提供了育种材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术育种领域中创制香味高粱的方法及其所用生物材料，具体是利用CRISPR/Cas9技术敲除高粱BADH2基因创制香味高粱的方法及其所用生物材料。
背景技术
香味是一种重要的品质性状，具有香味的作物具有更高的经济效益。印度和巴基斯坦的巴斯马蒂香米，东南亚的茉莉香米，我国的稻花香都是著名的香米品种，因其独特诱人的香味更受消费者的喜欢，产生更高的经济价值。高粱是全球第五大作物，用做主食、饲料作物、酿造业以及生物燃料产业。在我国高粱主要应用于食品、饲料及酿造产业。以高粱为原料制作的面包、饼干和高粱茶等能改善食品的质量，促进人体健康，因其口感略差降低了消费者接受度。国内许多名酒如茅台以及山西老陈醋等都是以高粱为主要原料酿造而成。基于高粱产业在我国的快速发展，已有的国外香味高粱材料难以获得，用基因编辑的方法创制香味高粱材料，改良高粱品质，对于生产应用具有十分重要的意义。
基因编辑技术主要包括类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)及CRISPR基因编辑系统。能够实现对目标基因的特定DNA片段进行删除、插入、定点突变等。其中CRISPR/Cas9基因编辑系统载体构建简单、编辑效率高，已经被广泛应用于植物的基因功能研究以及作物的遗传改良。极大地缩短了育种进程，实现目标性状的定向改造。李爱霞等利用CRISPR/Cas9载体系统对籽粒中的α-醇溶蛋白家族基因进行编辑，提高了高粱籽粒赖氨酸含量和谷物消化率。Char等利用CRISPR/Cas9技术对高粱成花编码基因SbFT进行靶向突变，使得高粱开花时间显著推迟。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何培育香味高粱。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供提高高粱香味的的方法，包括通过敲除高粱基因组中蛋白质的编码基因来提高高粱香味；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与高粱香味相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述的方法中，所述敲除可利用CRISPR/Cas9系统进行。
上述的方法中，所述CRISPR/Cas9系统可包括表达靶向上述的蛋白质的编码基因的sgRNA的载体。
上述方法中，所述sgRNA可包括sgRNA1和sgRNA2。
所述sgRNA1的靶标序列是SEQ ID No.3第4533-4552所示的DNA片段(即5'-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3')，所述sgRNA2的靶标序列是SEQ ID No.3第1905-1924位所示的DNA片段(即5'-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3')。
进一步地，上述的方法中，敲除高粱基因组中蛋白质的编码基因为将高粱基因组中的所述蛋白质的编码基因进行下述M1)或M2)突变：
M1)用5’-TCTCCTGATGGCTACATTGGA-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因(SbBADH2基因)中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.3第1905-1924位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGTTGAC-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因(SbBADH2基因)中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQ ID No.3第4533-4552位)；
M2)用5’-TCTCCTGATGGCTAGGA-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因(SbBADH2基因)中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.3第1905-1924位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGAC-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因(SbBADH2基因)中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQ ID No.3第4533-4552位)。
上述的方法中，所述提高高粱香味可为提高高粱种子和/或叶中的2-AP含量。
上述的方法中，所述高粱可包括高粱自交系。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述的方法在创制高粱突变体植株和/或高粱育种中的应用。
上述方法在高粱育种中的应用具体可为将所创制的香味高粱作为亲本材料进行育种。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物香味中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物香味的产品中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育香味植物中的应用；
D6)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育香味植物的产品中的应用；
D7)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与高粱香味相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
进一步地，上述的应用中，A2)所述的蛋白质为如下a1)、a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
a2)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
a3)在a1)或a2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制或降低A1)所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低A1)所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
进一步地，上述的应用中，
B1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的编码A1)所述蛋白质的核酸分子：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子或编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
或，
B1)所述核酸分子为Sbbadh2-1基因或Sbbadh2-2基因，Sbbadh2-1基因编码a1)所示的蛋白质，Sbbadh2-2基因编码a2)所示的蛋白质，
Sbbadh2-1基因为如下g1)、Sbbadh2-2基因为如下g2)：
g1)编码链的编码序列是在SEQ ID No.2所示DNA分子的第514位和第515位之间插入核苷酸T，并将SEQ ID No.2所示DNA分子的第1099位核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；
g2)编码链的编码序列是将SEQ ID No.2所示DNA分子的第512-514位和第1097-1100位的核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；
B8)所述核酸分子为表达靶向所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向所述蛋白编码基因的gRNA；
所述gRNA包括sgRNA1和sgRNA2，
所述sgRNA1的靶标序列是SEQ ID No.3第4533-4552所示的DNA片段(即5'-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3')，所述sgRNA2的靶标序列是SEQ ID No.3第1905-1924位所示的DNA片段(即5'-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3')。
进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为所述B8)或所述B9)所述的生物材料，所述调控植物香味为提高所述植物的香味。
进一步地，上述的应用中，所述植物为下述任一种：
P1)高粱属植物；
P2)高粱。
为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述的蛋白质或与蛋白质相关的生物材料。
本发明中，所述提高高粱的香味可通过提高高粱籽粒和高粱叶中2-乙酰-1-吡咯啉的含量实现。
本发明中，所述高粱叶可为高粱嫩叶。
本发明中，所述高粱嫩叶可为播种30天的高粱叶。
本发明中，SEQ ID No.1由505个氨基酸残基组成，SEQ ID No.4由189个氨基酸残基组成，SEQ ID No.5由424个氨基酸残基组成，SEQ ID No.6由171个氨基酸残基组成，SEQID No.7由184个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knock out)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。
本发明的有益效果为：
本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过对高粱BADH2基因设计特异性的靶点，获得了转基因植株。转基因植株的下一代经过PCR测序鉴定，得到了不同突变类型的纯合转基因突变植株。对两条无转基因标记的纯合株系测定结果显示，种子和叶子中2-AP含量积累，显著高于野生型，成功创制了香味高粱材料。
附图说明
图1为SbBADH2基因结构示意图、SbBADH2的sgRNA设计和CRISPR/Cas9载体结构示意图。
图2为野生型靶点及附近序列的转基因T1代植株SbBADH2基因敲除的碱基突变类型。
图3为野生型、SbBADH2基因敲除株系Sbbadh2-1及Sbbadh2-2的SbBADH2基因相对表达水平量分析。
图4为野生型、SbBADH2基因敲除株系Sbbadh2-1及Sbbadh2-2种子的2-AP含量分析(n＝3，平均数±标准差)
图5为受体材料、SbBADH2基因敲除株系Sbbadh2-1及Sbbadh2-2的30d植株叶子2-AP含量分析(n＝3，平均数±标准差)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中，构建基因敲除重组载体所用的载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-B及中间载体pYLsgRNA-OsU3，pYLsgRNA-OsU6a由华南农业大学刘耀光教授团队惠赠，在文献“Ma X，Zhang Q，Zhu Q，et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.MolecularPlant，2015，8(8)：1274-1284.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明中，高粱材料Wheatland由美国种质资源库USDA惠赠，在文献“Populationgenomic and genome-wide association studies of agroclimatic traits insorghum.(2013).Proceedings of the National Academy of Science of the UnitedStates of America 110:453-458.”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实验结果以平均值±标准偏差表示，采用T Tests检验，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例1、高粱SbBADH2基因敲除材料的获得
1.1、靶点设计
高粱SbBADH2基因的核苷酸序列是序列表中序列3，高粱SbBADH2基因具有15个外显子，其编码序列(CDS)的核苷酸序列是SEQ ID No.2，编码蛋白质的氨基酸序列是SEQ IDNo.1，SEQ ID No.1由505个氨基酸残基组成。在高粱SbBADH2基因的第5外显子和第11外显子处，各设计20bp碱基的特异序列，第5外显子靶点序列为5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.3第1905-1924位)，第11外显子靶点序列为5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQID No.3第4533-4552位)。
其中，SbBADH2基因结构示意图和靶点位置如图1所示。
1.2、CRISPR/Cas9载体构建
步骤1：靶点接头制备
将靶点接头引物BD2-U3-F、BD2-U3-R、BD2-U6a-F、BD2-U6a-R加ddH2O分别溶解配制成100μM引物母液。分别取1μl BD2-U3-F引物母液和1μl BD2-U3-R引物母液加入到98μlddH2O混合稀释、1μl BD2-U6a-F引物母液和1μl BD2-U6a-R引物母液加入到98μl ddH2O混合稀释。90℃30s后移至室温冷却完成退火，分别形成双链的靶点接头BD2-U3和BD2-U6a。
其中，引物序列的核苷酸序列如下：
BD2-U3-F：5’-ggcaTCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’；
BD2-U3-R：5’-aaacGTCTAACACCTCCGGTCAGA-3’；
BD2-U6a-F：5’-gccgTCTCCTGATGGCTACATGGA-3’；
BD2-U6a-R：5’-aaacTCCATGTAGCCATCAGGAGA -3’。
步骤2：sgRNA载体酶切
取pYLgRNA-OsU3，pYLgRNA-OsU6a质粒各1μg，在25μl反应体系中用10U BsaI酶切20min，冷冻保存。
步骤3：sgRNA表达盒的连接
取步骤2获得的酶切过的pYLgRNA-OsU3与步骤1获得的对应靶点接头BD2-U3进行连接，获得的连接产物命名为sgRNA1表达盒连接产物、步骤2获得的pYLgRNA-OsU6a质粒与与步骤1获得对应靶点接头BD2-U6a进行连接，获得的连接产物命名为sgRNA2表达盒连接产物。连接体系为在10μl反应体系中加入20ng酶切后质粒、0.5μl靶点接头、0.2μl T4 DNAligase及1μl 10×T4 DNA ligase，25℃连接15min。
步骤4：PCR扩增sgRNA表达盒。
第一轮PCR扩增
以正向引物U-F、反向引物gRNA-R为PCR扩增引物对，分别对步骤3获得的sgRNA1表达盒连接产物和sgRNA2表达盒连接产物进行第一轮PCR扩增得到的扩增产物分别命名为产物1和产物2。
其中，引物的核苷酸序列如下：
U-F：5’-CTCCGTTTTA CCTGTGGAAT CG-3’；
gRNA-R：5’-CGGAGGAAAA TTCCATCCAC-3’。
其中，PCR反应体系为：在15μl反应体系中，加入0.5μl步骤3所得连接产物、0.2μM引物U-F和gRNA-R，2×PCR buffer 7.5μl，2mM dNTPs 3μl，KOD FX Neo 0.3μl。
反应程序为：94℃10s，60℃15s，68℃20s共28个循环。
第二轮PCR反应：
以正向引物B1’、反向引物B2为PCR扩增引物对，对产物1进行第二轮PCR扩增，产物命名为sgRNA1表达盒；以正向引物B2’、反向引物BL为PCR扩增引物对，对产物2进行第二轮PCR扩增产物命名为sgRNA2表达盒。
其中，引物的核苷酸序列如下：
B1’：5’-TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；
B2：5’-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’；
B2’：5’-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；
BL：5’-AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’。
其中，PCR反应体系为：在15μl反应体系中，加入0.1μl步骤4第一轮PCR所得连接产物为模板，产物1以0.15μM B1’、B2为引物扩增，产物2以0.15μMB2’、BL为引物扩增,2×PCRbuffer 7.5μl，2mM dNTPs 3μl，KOD FX Neo 0.3μl。反应程序为：95℃10s，58℃15s，68℃20s，共20个循环。
步骤5：将sgRNA表达盒扩增产物连接到pYLCRISPR/Cas9 Pubi-B载体
采用边切边连方法将步骤4获得的PCR产物sgRNA1表达盒、sgRNA2表达盒连接到载体pYLCRISPR/Cas9 Pubi-B上，获得重组表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-B-SbBADH2。
反应体系为：在15μl反应体系中，加入sgRNA1表达盒、sgRNA2表达盒各15ng，pYLCRISPR/Cas9质粒80ng，10×Cut Smart Buffer 1.5μl，10mM ATP 1.5μl，BsaI-HF 0.2μl，T4 DNA ligase 0.2μl。反应程序为：37℃5min；10℃5min；20℃5min，共15个循坏，之后37℃5min。
步骤6：连接产物转化大肠杆菌XL1-blue
将步骤5获得的连接产物以热激法转化大肠杆菌之后，在含卡那霉素的LB平板上倒置培养。挑取平板上的单菌落，在含卡那霉素的LB液体中震荡培养。以SP1和SP2为引物进行PCR验证。
其中，引物SP1和SP2的核苷酸序列如下：
SP1：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’；
SP2：5’-GCGCGGTGTCATCTATGTTACT-3’。
反应体系为：在20μl反应体系中，加入2×Taq mix 10μl，10μM SP1、10μM SP2各0.4μl，2μl菌液。反应程序为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃45s，30个循坏；72℃5min，4℃保存。电泳鉴定有目的条带1.2kb的菌液提取质粒，测序鉴定正确的即为pYLCRISPR/Cas9Pubi-B-SbBADH2。
pYLCRISPR/Cas9Pubi-B-SbBADH2的物理图谱如图1所示。
1.3、T0转基因植株的获得、鉴定
将构建的pYLCRISPR/Cas9Pubi-B-SbBADH2转化到农杆菌感受态细胞EHA105后，对高粱Wheatland幼胚进行遗传转化。在含草甘膦抗性的培养基上筛选得到T0转基因植株。以SP1和SP2为引物进行鉴定，扩增出目的片段1.2kb的植株即为得到的T0转基因阳性植株。用SbBADH2基因序列扩增引物SbBD2-F和SbBD2-R对T0转基因阳性植株DNA进行PCR扩增和测序，检测靶点是否被编辑。
其中，引物的核苷酸序列如下：
SP1：5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’；
SP2：5’-GCGCGGTGTCATCTATGTTACT-3’；
SbBD2-F：5’-TGTTGGGTGGGCCATTTTAGT-3’；
SbBD2-R：5’-GTTGGCCAGTTCAATGGCTT-3’。
PCR反应体系为：在50μl反应体系中，加入KODPCR Master mix 25μl，10μMSbBD2-F、SbBD2-R各1.5μl，1μl DNA。反应程序为：94℃3min；98℃10s，54℃15s，68℃45s，30个循坏；68℃5min，4℃保存。
1.4、T1转基因纯合突变植株的获得、鉴定
1.4.1、T1转基因纯合突变植株的获得
T0阳性植株自交得到T1代种子，种植T1代转基因植株，用引物SbBD2-F和SbBD2-R进行PCR扩增和测序，挑选靶点为纯合突变的植株(Sbbadh2-1、Sbbadh2-2、Sbbadh2-3、Sbbadh2-4、Sbbadh2-5和Sbbadh2-6)。这些突变形式包括碱基的插入、替换和缺失，可将其分为六种突变类型。
突变类型如图2所示：
突变体Sbbadh2-1，与野生型高粱Wheatland相比，两条同源染色体中，高粱基因组中SbBADH2基因发生了如下突变：用5’-TCTCCTGATGGCTACATTGGA-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.3第1905-1924位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGTTGAC-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQ ID No.3第4533-4552位)。即在第5外显子有1bp碱基插入，在第11外显子有1bp碱基缺失，导致SbBADH2基因的CDS的第514位后和第1098位后发生移位，从而将SbBADH2基因(野生型)敲除。将该突变后的基因命名为Sbbadh2-1基因；Sbbadh2-1基因的编码序列(CDS)是在SEQ ID No.2所示DNA分子的第514位和第515位之间插入核苷酸T，并将SEQ ID No.2所示DNA分子的第1099位核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由189个氨基酸残基组成的蛋白质Sbbadh2-1，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
突变体Sbbadh2-2，与野生型高粱Wheatland相比，两条同源染色体中，高粱基因组中SbBADH2基因发生了如下突变：用5’-TCTCCTGATGGCTAGGA-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.3第1905-1924位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGAC-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQ ID No.3第4533-4552位)。即在第5外显子有3bp碱基缺失，在第11外显子有4bp碱基缺失，导致SbBADH2基因的CDS的第511位后和1096位后发生移位，从而将SbBADH2基因(野生型)敲除。将该突变后的基因命名为Sbbadh2-2基因；Sbbadh2-2基因的编码序列(CDS)是将SEQ ID No.2所示DNA分子的第512-514位和第1097-1100位的核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由424个氨基酸残基组成的蛋白质Sbbadh2-2，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示。
突变体Sbbadh2-3，与野生型高粱Wheatland相比，两条同源染色体中，高粱基因组中SbBADH2基因发生了如下突变：用5’-TCTCCTGATGGCTA-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGAA-3’(SEQ ID No.3第1905-1925位)，用5’-TCTGACCGG-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGACCGG-3’(SEQ ID No.3第4533-4555位)。即在第5外显子有7bp碱基缺失，在第11外显子有14bp碱基缺失，从而将SbBADH2基因(野生型)敲除。将该突变后的基因命名为Sbbadh2-3基因；Sbbadh2-3基因的编码序列(CDS)是将SEQ ID No.2所示DNA分子的第512-518位和第1092-1105位的核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由171个氨基酸残基组成的蛋白质Sbbadh2-3，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。
突变体Sbbadh2-4，与野生型高粱Wheatland相比，两条同源染色体中，高粱基因组中SbBADH2基因发生了如下突变：用5’-TCTCCTGATGGCAGTATTTAT-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGAAGGTA-3’(SEQ ID No.3第1905-1929位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGTTAAGAC-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQ ID No.3第4533-4552位)。即在第5外显子有13bp碱基替换为新的9bp碱基，在第11外显子有1bp碱基插入，从而将SbBADH2基因(野生型)敲除。将该突变后的基因命名为Sbbadh2-4基因；Sbbadh2-4基因的编码序列(CDS)是将SEQ ID No.2所示DNA分子的第510-522位所示的核苷酸分子替换为5’-TCTCCTGATGGCAGTATTTAT-3’并且在SEQ ID No.2所示DNA分子的第1099-1100位的核苷酸之间插入碱基A，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由184个氨基酸残基组成的蛋白质Sbbadh2-4，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示。
突变体Sbbadh2-5，与野生型高粱Wheatland相比，两条同源染色体中，高粱基因组中SbBADH2基因发生了如下突变：用5’-TCTCCTGATGGCTACATTGGA-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.2第SEQ ID No.3第1905-1924位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGTTGC-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGACCGGCGGTAAGGC-3’(SEQ ID No.3第4533-4564位)。即在第5外显子有1bp碱基插入，在第11外显子有14bp碱基缺失，导致移码突变从而将SbBADH2基因(野生型)敲除。将该突变后的基因命名为Sbbadh2-5基因；Sbbadh2-5基因的编码序列(CDS)是在SEQ IDNo.2所示DNA分子的第514位和第515位之间插入核苷酸T，并将SEQ ID No.2所示DNA分子的第XXXX-XXXX位核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由189个氨基酸残基组成的蛋白质Sbbadh2-5，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
突变体Sbbadh2-6，与野生型高粱Wheatland相比，两条同源染色体中，高粱基因组中SbBADH2基因发生了如下突变：用5’-TCTCCTGATGGCTACATTGGA-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’(SEQ ID No.3第1905-1924位)，用5’-TCTGACCGGAGGTGTTACGAC-3’替换高粱基因组DNA中的SbBADH2基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’(SEQ ID No.3第4533-4552位)。即在第5外显子有1bp碱基插入，在第11外显子有1bp碱基插入导致移码突变，从而将SbBADH2基因(野生型)敲除。将该突变后的基因命名为Sbbadh2-6基因；Sbbadh2-6基因的编码序列(CDS)是在SEQ ID No.2所示DNA分子的第514-515位的核苷酸之间插入碱基T，并且在SEQ ID No.2所示DNA分子的第1099-1100位的核苷酸之间插入碱基C，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；编码一个由189个氨基酸残基组成的蛋白质Sbbadh2-6，其氨基酸序列如序列表中SEQID No.4所示。
选取Sbbadh2-1和Sbbadh2-2这两种突变类型的株系，以sp1和sp2为引物未能扩增出目的片段1.2kb，草甘膦BAR快速检测试纸条检测为阴性，即表明这两个纯合编辑株系分离掉了载体序列。且碱基的变异均造成了氨基酸的变异和蛋白翻译序列提前终止。
1.4.2、T1转基因纯合突变植株的鉴定
对野生型和两个敲除株系进行SbBADH2基因相对表达水平分析。结果如图3所示，与野生型相比，Sbbadh2-1和Sbbadh2-2的SbBADH2基因表达水平极显著地降低。
具体操作为：取野生型，Sbbadh2-1和Sbbadh2-2的叶子提取RNA，进行RNA反转录。操作如下：在10μL体系中加入2μg RNA,5×gDNA Buffer 2μL，42℃3min，以去除基因组DNA。配置10μL反转录体系混合液，体系为10×Fast RT Buffer 2μL,RT Enzyme Mix 1μL，FQ-RTPrimer Mix 2μL，加到上述已去除DNA的10μL体系中，反应程序为42℃15min，95℃3min，即得到cDNA。
荧光定量PCR反应体系为：在20μL反应体系中，加入2×Talent qPCR PreMix 10μL，稀释20倍后的cDNA 2μL，引物SbBD2-RT-F和SbBD2-RT-R各0.6μL。以高粱SbEIF基因作为内参。反应程序为：95℃3min；95℃5s，60℃15s，40个循环，最后65-95℃制备溶解曲线。定量数据分析采用的是DDCT方法，计算其相对值。
SbBD2-qPCR-F：5’-TGAAGCCGTA TGGGACATGG-3’；
SbBD2-qPCR-R：5’-ACCCCAATAG GCTCTCTCCG-3’；
SbBD2-EIF-F：5’-CAACTTTGTC ACCCGCGATG A-3’；
SbBD2-EIF-F：5’-TCCAGAAACC TTAGCAGCCC A-3’。
实施例2、Sbbadh2-1和Sbbadh2-2株系香味物质2-AP含量的测定
取野生型Wheatland，Sbbadh2-1和Sbbadh2-2突变材料的成熟干燥种子(T2代)2g，研磨成粉，以及播种30天植株叶子(T2代)1g用液氮研磨成粉，用于测定2-AP含量。2-AP含量测定由中国科学院遗传与发育生物学研究所植物激素分析平台完成，采用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)外标法测定。测定结果如图4和图5所示，野生型种子、Sbbadh2-1种子及Sbbadh2-2种子2-AP含量分别为：0.012mg/kg，0.160mg/kg，0.177mg/kg；野生型叶子中未能检测到2-AP，Sbbadh2-1叶子及Sbbadh2-2叶子2-AP含量分别为：0.749mg/kg，0.801mg/kg。与野生型相比，突变体材料中种子和嫩叶的2-AP含量均极显著地升高，从而使高粱产生香味。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 创制香味高粱的方法及其所用生物材料
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 505
<212> PRT
<213> 高粱(Sorghum bicolor (L.) Moench)
<400> 1
Met Ala Thr Pro Ala Met Val Pro Leu Arg Gln Leu Phe Val Asp Gly
1 5 10 15
Glu Trp Arg Pro Pro Ala Gln Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro
20 25 30
Thr Thr Glu Ala His Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp
35 40 45
Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Lys Arg Asn Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Ala Ile Ala Ala Lys Val Ile Glu Arg Lys Pro Glu Leu Ala Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Leu Asp Cys Gly Lys Pro Tyr Asp Glu Ala Val Trp Asp
100 105 110
Met Asp Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Asp Lys Arg Gln Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr
130 135 140
Phe Lys Cys His Leu Arg Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile
145 150 155 160
Thr Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Val Ala Pro
165 170 175
Ala Leu Ala Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala
180 185 190
Ser Val Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Ile Cys Lys Glu Val Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Gly Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Pro Asp Ala Gly
210 215 220
Ala Pro Leu Ser Gly His Pro Asp Val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly
225 230 235 240
Ser Phe Glu Thr Gly Lys Lys Ile Met Ala Ala Ala Ala Pro Met Val
245 250 255
Lys Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe
260 265 270
Asp Asp Val Asp Ile Asp Lys Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys
275 280 285
Phe Trp Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Leu Ile
290 295 300
His Thr Lys Ile Ala Lys Glu Phe Asn Glu Arg Met Val Ala Trp Ala
305 310 315 320
Lys Asn Ile Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly
325 330 335
Pro Val Val Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Lys Lys Phe Ile Ser
340 345 350
Asn Ala Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Val Arg Pro
355 360 365
Ala His Leu Glu Lys Gly Phe Phe Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp
370 375 380
Ile Thr Thr Ser Met Glu Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val
385 390 395 400
Leu Cys Val Lys Glu Phe Ser Thr Glu Asp Glu Ala Ile Glu Leu Ala
405 410 415
Asn Asp Thr Gln Tyr Gly Leu Ala Gly Ala Val Ile Ser Gly Asp Arg
420 425 430
Glu Arg Cys Gln Arg Leu Ser Glu Glu Ile Asp Ala Gly Cys Ile Trp
435 440 445
Val Asn Cys Ser Gln Pro Cys Phe Cys Gln Ala Pro Trp Gly Gly Asn
450 455 460
Lys Arg Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Gly Gly Ile Asp Asn
465 470 475 480
Tyr Leu Ser Val Lys Gln Val Thr Glu Tyr Ile Ser Asp Glu Pro Trp
485 490 495
Gly Trp Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Leu
500 505
<210> 2
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccacgc cagcgatggt cccgctgcgg cagctcttcg tcgacggcga gtggcgcccg 60
cccgcgcagg gccgccgcct ccccgtcgtc aaccccacaa ccgaggccca catcggcgag 120
atcccggcgg gcaccgcgga ggatgtggac gccgcggtgg ctgcggcgcg ggcggcgctc 180
aagaggaacc gcggccgtga ctgggcgcgc gcgccggggg ccgtccgggc caagtacctg 240
cgcgccatcg ccgccaaggt aattgagagg aaacctgagc tggctaagct agaggcactt 300
gattgtggga agccttacga tgaagccgta tgggacatgg atgatgttgc tgggtgcttt 360
gagtactttg cggatcaggc agaagccttg gacaaaaggc aaaattcccc agtttctctt 420
ccaatggaaa cttttaaatg ccacctccgg agagagccta ttggggtagt tgggctgata 480
actccttgga actatcctct cctgatggct acatggaagg tagctcctgc tctggctgct 540
ggttgtacag ctgtgctaaa gccatctgaa ttggcttctg tgacttgctt agagcttgct 600
gatatctgta aagaagtcgg tcttccttcc ggtgtcttga acattgtgac aggattaggt 660
cctgatgctg gtgctccttt gtcagggcac ccagatgttg acaaggtcgc ttttactggg 720
agttttgaaa ctggaaagaa gattatggca gctgcagctc ctatggtcaa gcctgttaca 780
ctggaacttg gtggaaaaag tcctatagta gtatttgatg atgttgacat tgacaaagct 840
gttgagtgga ctctgtttgg gtgcttttgg accaatggtc agatttgcag cgcaacatct 900
cgtcttctta tccatacaaa aattgctaaa gaatttaatg agaggatggt tgcatgggcc 960
aaaaatatta aggtttcgga tccacttgaa gagggttgca gacttgggcc agttgttagt 1020
gaaggacagt atgagaagat taagaagttc atatcgaatg ccaaaagcga aggtgctact 1080
attctgaccg gaggtgttag accggcgcat cttgagaagg ggttctttat tgaaccaaca 1140
attattactg atatcaccac atcaatggaa atctggaggg aggaagtctt tggtccagtc 1200
ctgtgtgtta aagaatttag cactgaagat gaagccattg aactggccaa cgatacacag 1260
tatggtttgg ctggtgctgt aatttctggt gatcgtgagc gctgccagag attatctgag 1320
gagatcgatg ctggatgtat ctgggtaaac tgctcacaac cctgcttctg ccaagctccc 1380
tggggtggga acaagcgcag tggatttgga cgtgagcttg gagaaggggg cattgataac 1440
tacctgagcg tcaagcaagt cacggagtac atctctgatg agccgtgggg ttggtaccaa 1500
tccccctcca agctgtaa 1518
<210> 3
<211> 5601
<212> DNA
<213> 高粱(Sorghum bicolor (L.) Moench)
<400> 3
ccaccatctc cacttctcca ctctccagag tccagcccca gtcctagtcc tcaccgatgg 60
ccacgccagc gatggtcccg ctgcggcagc tcttcgtcga cggcgagtgg cgcccgcccg 120
cgcagggccg ccgcctcccc gtcgtcaacc ccacaaccga ggcccacatc ggtgagtgac 180
ctgacctccc cgatcgcacc catctctgtt tccttctgtt gtacgtacta ctagtttgtt 240
gcttggcctt ggcgtggcgc tgatgcgtgc gctgctcggg tttgcgtgct cgcgcgcgca 300
ggcgagatcc cggcgggcac cgcggaggat gtggacgccg cggtggctgc ggcgcgggcg 360
gcgctcaaga ggaaccgcgg ccgtgactgg gcgcgcgcgc cgggggccgt ccgggccaag 420
tacctgcgcg ccatcgccgc caaggtacgc tagccctctt tgctctagcc taatttaatt 480
gggcgaaaaa atactcgagt gctgtgcctc tgcttccaag cattggtacc taggagtgct 540
tcctaagtta ggaagtaatt cagagtggat tgagtgtgtg tggcaactca cttgtgtgtg 600
gtagctactt ttgtgctttg atgggggtac gatacggtga ctggatctgt accctcggga 660
tggtatcagt gaacttctca gtgcttgtgc tatgtgtatt cgcactgttt ctgtgttaca 720
tgaacaaagg cacagaaagt acaaattaaa ctcctccaac tgtacaccaa tctattcagg 780
ggaaatactg aggatctgct tttggcatga acaaactatt gctttccatc aatacagggt 840
gtgttaactt tatcatcaac tccagtttca aaacacctca aaagatcttt ctctttttaa 900
acttcaatcg ggaaagtctt gtaaaatttg gttgggtcgt caaagttctg ttggaaatat 960
attcacgcat accacatttt gcatgtaaaa atgtcttctt attcaggtaa ttgagaggaa 1020
acctgagctg gctaagctag aggcacttga ttgtgggaag ccttacgatg aagccgtatg 1080
ggacatggta tgtgacacac cttatggaag tgtgcagatt ttttcctcta gcttagcttg 1140
caatcacgat ctgtttggta ttccgtttat caggatgatg ttgctgggtg ctttgagtac 1200
tttgcggatc aggcagaagc cttggacaaa aggcaaaatt ccccagtttc tcttccaatg 1260
gaaactttta aatgccacct ccggagagag cctattgggg tagttgggct gataactcct 1320
tggtattttc atttctccct cactttgctg ttatttgtat ttatgatcaa aacacacagg 1380
ggagtggcct gtattgagta atacagcttc atttccccta agatctcagt tgtatagcaa 1440
aaaaactgct tattctctaa ccacagtctt ttaaacctaa ttttagataa ccttcctcat 1500
catcgtcctg aaatattgcc agtgttcata tttgtaattc atatccagtg ttgaacaatc 1560
tcacctatat atccaagtta atgtccaatt tattgtttgc ttgtgtcaat gtttggccaa 1620
tgtcaataaa tattcttgct atattgatag aacattgggc tttgtcctag tacaagtgtc 1680
gcttctgctc cataagccca ttattctgct actatccttg ttcatgtatt tgttgggtgg 1740
gccattttag tttattgtgt ctaactgtct atgtataaga tttgttgact aagtaactga 1800
tttacttata tttatgttcc ttcatatgtt cttgtttaac ttattctgat tctgactcta 1860
aagcattatt gtttgtactt gtatttgtgt tgcaggaact atcctctcct gatggctaca 1920
tggaaggtag ctcctgctct ggctgctggt tgtacagctg tgctaaagcc atctgaattg 1980
gcttctgtgt aagtattagc atgttgtaat gagttcgtgc tataagcaac agcatttaaa 2040
atgcctacct tttgaattac caggacttgc ttagagcttg ctgatatctg taaagaagtc 2100
ggtcttcctt ccggtgtctt gaacattgtg acaggattag gtcctgatgc tggtgctcct 2160
ttgtcagggc acccagatgt tgacaaggta aactgttctg catataatga cataatcatg 2220
catgagcatg acacataaat gaaaacatta ttcctcaaag catcggtttt ctgtgtattt 2280
aggtcgcttt tactgggagt tttgaaactg gaaagaagat tatggcagct gcagctccta 2340
tggtcaaggt ttgtctgtga atttatgttt tatttctagt aataatgcgc tgtgccgtgt 2400
tgtttttgct ctctttcagt tcataaaaat tatcagaagt atgatttgaa ttccctattt 2460
ttaagacgaa attctattgc attccttaac attgcatttt tcttgacagc ctgttacact 2520
ggaacttggt ggaaaaagtc ctatagtagt atttgatgat gttgacattg acaaaggtac 2580
gtgtatattc taaggcttac taaattccta aatttcattg gtatttgtgg attgttgcaa 2640
tttgcaaaga atttaactga tcagaatgct caacacctaa acccctcaaa gcccttcatt 2700
ggtatctggg atttcgatag aaatacttag ctgagcagtc tactacaaca agcgttactt 2760
taatattgaa aattgctact ttggatttgt aaaatacgtc cataaaattg cggggaaaaa 2820
accccacatg ctttgctatt gttttgacca cagtaccaga ctttgcattg gttgtgtgta 2880
tctgtcccac aatttagaga tgtggcatgc cagttgaata aaaagatgaa atgaaaagta 2940
tctgatgcac tatttttatg ttacatgatt tcatatttca tcattgatct tgagaaatat 3000
agggctgaat ttctgcggag aacataagtt ttagttccaa gaaagggaac ttctataaat 3060
tttctgactt tgactgactt atgctgatac tttgctcgat gtggaatcat ggattctgct 3120
atacttccat cattgattgt tccttttaaa tataaacagc tgttgagtgg actctgtttg 3180
ggtgcttttg gaccaatggt cagatttgca gcgcaacatc tcgtcttctt atccatgtaa 3240
gtgtcacatg tcgttgctgg tactgtgact tggaatgctt ttcacactta atagctgtca 3300
acaataatat atttccttga gtggtgttgc tttaactttt cttcgccctg ccgttaactt 3360
ctgatttgag aagattgtac gatttcaaaa tcgctccact gaacaaataa cagtatagta 3420
tgtgctttag acctgttttg cacaatatat gtgtcctatt gcttaaggtc taggtttgaa 3480
ctcttcaatt ctctgtggac tgtgtgcttt gatctggtag caaatgtata ttttcaatga 3540
cttgattgtt ttttactccc tctgatacca aatgtaggtt gtttaggaca ttgtcatggt 3600
ctccaatgtg acagtttgac tttagctttt tctgaaaaaa agtatactat ttaaattgga 3660
caaactacat attatgaaag attttgtcat gaggaactag taacatacta acatcaacca 3720
tgctttgcta atctatgtaa cttgacatat attgatgagt caagaaagaa gtttgaccaa 3780
cttgaatcca aaaatgacct acaattggga tcatcaggag tagattaaca atggctattt 3840
accactatat tactctttca aatcacatct tttttttgaa caaactggtg atagtgcctc 3900
tttcaaatca catctcagtt atgtacttct ggtattgttg tcagtaacat attaatcaag 3960
ttttgcctcc aacaaaactg tcgcagacaa aaattgctaa agaatttaat gagaggatgg 4020
ttgcatgggc caaaaatatt aaggtttcgg atccacttga agagggttgc agacttgggc 4080
cagttgttag tgaaggacag gtactacatg ttaactttgt ctaaatttaa caagtcacca 4140
ttgacaatgc tatgatttgt ggcttctttc tgatttgaca gtttggtact tccgacttag 4200
ttgctgtaca ctcttgttct tgctagtttc tacaggatgt agcttcctcc gattttgaga 4260
ggatctgtgt tcagatgtac tgattgacac caccttcttt agttttactt gttagagcaa 4320
gagacatggt ttaatgttta tggtcacata tatgacactg gactatgaga aaatgacacc 4380
ctaatcacca ccatcttggc aaccatatac ataatttcag attatcttgt tgttgtatag 4440
ttcttcatag gagtcttatt catatttttg cattctcagt atgagaagat taagaagttc 4500
atatcgaatg ccaaaagcga aggtgctact attctgaccg gaggtgttag accggcggta 4560
aggcctgcat ttggatttac aaggatccac atgctatagt gagatagaac taatgtttta 4620
tgttttacag catcttgaga aggggttctt tattgaacca acaattatta ctgatatcac 4680
cacatcaatg gaaatctgga gggaggaagt ctttggtcca gtcctgtgtg ttaaagaatt 4740
tagcactgaa gatgaagcca ttgaactggc caacgataca cagtgagcta cttcttttta 4800
gcactgtttc aacatccttt tgcaggcttt gcagttcatg cgtagtttat agcttatgaa 4860
tttacaacac tatccttttt ttataggtat ggtttggctg gtgctgtaat ttctggtgat 4920
cgtgagcgct gccagagatt atctgaggta tgtatacgtg aagaggttca caactttctc 4980
tggctgctta tcatatacct ctgcccatgt tatcactcat tcagtcattt gaagagttga 5040
agttgatatt cttgatacca tggcactaaa ttcgatttcc acttttgcaa cgtgcaattc 5100
atgcaattgc tctcagagct gtatttgtac tgcacatctc taatgaaaac ttgtgcaaca 5160
ggagatcgat gctggatgta tctgggtaaa ctgctcacaa ccctgcttct gccaagctcc 5220
ctggggtggg aacaagcgca gtggatttgg acgtgagctt ggagaagggt gggtaacatg 5280
gaacgacagc atttctaaga cctctagcag ctattttcat gggatctgac tgacactggc 5340
tgtttaactg taggggcatt gataactacc tgagcgtcaa gcaagtcacg gagtacatct 5400
ctgatgagcc gtggggttgg taccaatccc cctccaagct gtaaacgaga aaatggcacg 5460
aaaacttgtc tgtttcatta gaataaataa atcttggatg ccatacagaa cgaacccgtg 5520
tatcaaatcg aacatgagac actgaaagag gcacatctgc ggaataaaga tcagaattga 5580
gtgttttgag agaattcttt t 5601
<210> 4
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Thr Pro Ala Met Val Pro Leu Arg Gln Leu Phe Val Asp Gly
1 5 10 15
Glu Trp Arg Pro Pro Ala Gln Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro
20 25 30
Thr Thr Glu Ala His Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp
35 40 45
Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Lys Arg Asn Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Ala Ile Ala Ala Lys Val Ile Glu Arg Lys Pro Glu Leu Ala Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Leu Asp Cys Gly Lys Pro Tyr Asp Glu Ala Val Trp Asp
100 105 110
Met Asp Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Asp Lys Arg Gln Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr
130 135 140
Phe Lys Cys His Leu Arg Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile
145 150 155 160
Thr Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Thr Leu Glu Gly Ser Ser
165 170 175
Cys Ser Gly Cys Trp Leu Tyr Ser Cys Ala Lys Ala Ile
180 185
<210> 5
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Thr Pro Ala Met Val Pro Leu Arg Gln Leu Phe Val Asp Gly
1 5 10 15
Glu Trp Arg Pro Pro Ala Gln Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro
20 25 30
Thr Thr Glu Ala His Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp
35 40 45
Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Lys Arg Asn Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Ala Ile Ala Ala Lys Val Ile Glu Arg Lys Pro Glu Leu Ala Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Leu Asp Cys Gly Lys Pro Tyr Asp Glu Ala Val Trp Asp
100 105 110
Met Asp Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Asp Lys Arg Gln Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr
130 135 140
Phe Lys Cys His Leu Arg Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile
145 150 155 160
Thr Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Arg Lys Val Ala Pro Ala
165 170 175
Leu Ala Ala Gly Cys Thr Ala Val Leu Lys Pro Ser Glu Leu Ala Ser
180 185 190
Val Thr Cys Leu Glu Leu Ala Asp Ile Cys Lys Glu Val Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Gly Val Leu Asn Ile Val Thr Gly Leu Gly Pro Asp Ala Gly Ala
210 215 220
Pro Leu Ser Gly His Pro Asp Val Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser
225 230 235 240
Phe Glu Thr Gly Lys Lys Ile Met Ala Ala Ala Ala Pro Met Val Lys
245 250 255
Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Ile Val Val Phe Asp
260 265 270
Asp Val Asp Ile Asp Lys Ala Val Glu Trp Thr Leu Phe Gly Cys Phe
275 280 285
Trp Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Leu Ile His
290 295 300
Thr Lys Ile Ala Lys Glu Phe Asn Glu Arg Met Val Ala Trp Ala Lys
305 310 315 320
Asn Ile Lys Val Ser Asp Pro Leu Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro
325 330 335
Val Val Ser Glu Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Lys Lys Phe Ile Ser Asn
340 345 350
Ala Lys Ser Glu Gly Ala Thr Ile Leu Thr Gly Gly Asp Arg Arg Ile
355 360 365
Leu Arg Arg Gly Ser Leu Leu Asn Gln Gln Leu Leu Leu Ile Ser Pro
370 375 380
His Gln Trp Lys Ser Gly Gly Arg Lys Ser Leu Val Gln Ser Cys Val
385 390 395 400
Leu Lys Asn Leu Ala Leu Lys Met Lys Pro Leu Asn Trp Pro Thr Ile
405 410 415
His Ser Met Val Trp Leu Val Leu
420
<210> 6
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Thr Pro Ala Met Val Pro Leu Arg Gln Leu Phe Val Asp Gly
1 5 10 15
Glu Trp Arg Pro Pro Ala Gln Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro
20 25 30
Thr Thr Glu Ala His Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp
35 40 45
Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Lys Arg Asn Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Ala Ile Ala Ala Lys Val Ile Glu Arg Lys Pro Glu Leu Ala Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Leu Asp Cys Gly Lys Pro Tyr Asp Glu Ala Val Trp Asp
100 105 110
Met Asp Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Asp Lys Arg Gln Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr
130 135 140
Phe Lys Cys His Leu Arg Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile
145 150 155 160
Thr Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Arg
165 170
<210> 7
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Thr Pro Ala Met Val Pro Leu Arg Gln Leu Phe Val Asp Gly
1 5 10 15
Glu Trp Arg Pro Pro Ala Gln Gly Arg Arg Leu Pro Val Val Asn Pro
20 25 30
Thr Thr Glu Ala His Ile Gly Glu Ile Pro Ala Gly Thr Ala Glu Asp
35 40 45
Val Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Lys Arg Asn Arg
50 55 60
Gly Arg Asp Trp Ala Arg Ala Pro Gly Ala Val Arg Ala Lys Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Ala Ile Ala Ala Lys Val Ile Glu Arg Lys Pro Glu Leu Ala Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Leu Asp Cys Gly Lys Pro Tyr Asp Glu Ala Val Trp Asp
100 105 110
Met Asp Asp Val Ala Gly Cys Phe Glu Tyr Phe Ala Asp Gln Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Asp Lys Arg Gln Asn Ser Pro Val Ser Leu Pro Met Glu Thr
130 135 140
Phe Lys Cys His Leu Arg Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile
145 150 155 160
Thr Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Met Ala Val Phe Met Leu Leu Leu
165 170 175
Trp Leu Leu Val Val Gln Leu Cys
180
Claims (10)
1.一种提高高粱香味的方法，包括通过敲除高粱基因组中蛋白质的编码基因来提高高粱香味；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与高粱香味相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：敲除高粱基因组中蛋白质的编码基因为将高粱基因组中的所述蛋白质的编码基因进行下述M1)或M2)突变：
M1)用5’-TCTCCTGATGGCTACATTGGA-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’，用5’-TCTGACCGGAGGTGTTGAC-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’；
M2)用5’-TCTCCTGATGGCTAGGA-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-TCTCCTGATGGCTACATGGA-3’，用5’-TCTGACCGGAGGTGAC-3’替换高粱基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-TCTGACCGGAGGTGTTAGAC-3’。
3.权利要求1或2所述的方法在创制高粱突变体植株和/或高粱育种中的应用。
4.蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物香味中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物2-乙酰-1-吡咯啉含量中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物香味的产品中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物2-乙酰-1-吡咯啉含量的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育香味植物中的应用；
D6)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育香味植物的产品中的应用；
D7)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与高粱香味相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)所示蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：A2)所述的蛋白质为如下a1)、a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
a2)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；
a3)在a1)或a2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制或降低A1)所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低A1)所述蛋白质的活性的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
B1)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的编码A1)所述蛋白质的核酸分子：
b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子或编码链的核苷酸序列是SEQID No.3所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
或，
B1)所述核酸分子为Sbbadh2-1基因或Sbbadh2-2基因，Sbbadh2-1基因编码a1)所示的蛋白质，Sbbadh2-2基因编码a2)所示的蛋白质，
Sbbadh2-1基因为如下g1)、Sbbadh2-2基因为如下g2)：
g1)编码链的编码序列是在SEQ ID No.2所示DNA分子的第514位和第515位之间插入核苷酸T，并将SEQ ID No.2所示DNA分子的第1099位核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；
g2)编码链的编码序列是将SEQ ID No.2所示DNA分子的第512-514位和第1097-1100位的核苷酸缺失，保持SEQ ID No.2的其它核苷酸序列不变得到的DNA分子；
B8)所述核酸分子为表达靶向所述蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向所述蛋白编码基因的gRNA；
所述gRNA包括sgRNA1和sgRNA2，
所述sgRNA1的靶标序列是SEQ ID No.3第4533-4552所示的DNA片段，所述sgRNA2的靶标序列是SEQ ID No.3第1905-1924位所示的DNA片段。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为B8)或B9)所述的生物材料，所述调控植物香味为提高所述植物的香味。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：
P1)高粱属植物；
P2)高粱。
10.权利要求4-9中任一项中所述的蛋白质或与蛋白质相关的生物材料。
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