CN117660524A - 利用基因编辑技术创制甜玉米种质的方法 - Google Patents

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CN117660524A CN202311663304.1A CN202311663304A CN117660524A CN 117660524 A CN117660524 A CN 117660524A CN 202311663304 A CN202311663304 A CN 202311663304A CN 117660524 A CN117660524 A CN 117660524A
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Abstract

本发明公开了利用基因编辑技术创制甜玉米种质的方法。具体地公开了氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用。本发明利用ZmBT1基因调控玉米籽粒形态的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向编辑，通过设计sgRNA(SEQ ID No.4)及其CRISPR/Cas9基因编辑载体来敲除ZmBT1基因。实验证明，通过降低ZmBT1基因的表达量，可显著增加玉米籽粒的口感甜度，降低玉米籽粒黄色强度，增加玉米籽粒胚乳皱缩程度，使玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变，进而创制甜玉米种质。本发明对于培育甜玉米新品种、促进商业化甜玉米育种进程、具有重要意义。

Description

利用基因编辑技术创制甜玉米种质的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及利用基因编辑技术创制甜玉米种质的方法。
背景技术
基因组编辑是一种对基因组进行定向精确修饰的技术，主要包括锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复系统(CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas系统大致分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3类，其中II型CRISPR/Cas9系统的组成比较简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA三种成分即可发挥作用，且具有高效性和易操作性，成为目前应用最广泛的基因组编辑系统。II型CRISPR/Cas系统的特征蛋白为Cas9，Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个核酸酶结构域，该结构域负责切割靶DNA的两条链，从而造成靶DNA双链断裂。其中HNH结构域负责切割与crRNA互补的DNA链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif，PAM)上游3bp处，RuvC结构域则负责切割非互补链，切割位点位于PAM上游3–8bp处。Cas9蛋白同时具有加工产生crRNA以及切割外源核酸的功能。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，研究者可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者将两者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)。sgRNA能够与Cas9核酸内切酶结合并将Cas9引导至基因组上对靶位点进行切割。CRISPR/Cas9系统使目标基因DNA产生双链断裂，激活细胞内的DNA损伤修复机制，进而产生缺失、敲入或者在有供体模板时产生基因插入和特定碱基改变。目前，CRISPR/Cas9系统已被迅速地用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得了较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。
玉米(Zea mays L.)是主要的粮食作物和工业原料，对国民生产和稳定经济发展具有举足轻重的作用，随着人民生活水平的提高，玉米已经不单单作为粮食和饲料，多用途玉米品种的培育日益受到育种家的重视。甜玉米是玉米的一个亚种，由于其可溶性糖含量较高，甜味浓郁，并携带玉米特有的香味，深受消费者喜欢。我国甜玉米产业发展有利于农业产业结构调整，具有广阔发展前景，但是目前仍处于初级阶段，仍需要进一步开发新的品种创制方法以促进甜玉米的商业化育种进程。甜玉米的特点是口感鲜美、甜而不腻。它的甜度主要来源于玉米粒中的糖分，这些糖分在玉米的成熟过程中被合成并储存在玉米粒中。由于甜玉米含有大量的维生素C、维生素E和β-胡萝卜素等维生素，以及钾、钙、镁等矿物质，所以甜玉米具有丰富的营养价值。此外，甜玉米还富含膳食纤维和低聚糖等营养成分，有助于促进肠道健康和降低血糖。适量食用甜玉米可以起到抗氧化、抗炎、降血压等多种保健作用，因此甜玉米具有重要的育种及生产应用价值。
甜玉米是禾本科玉米属玉米的一个种。因为籽粒胚乳中蛋白质、脂肪和赖氨酸、色氨酸的含量比一般玉米更为丰富，并且其食用方法类似于果蔬，可直接食用，故被人们誉之为“水果玉米”。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何使玉米籽粒形态具有甜玉米籽粒形态进而创制甜玉米。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：
A1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；
A2)在制备甜玉米产品中的应用；
A3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；
A4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；
A5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；
A6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；
所述蛋白质名称为BT1，可为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述应用中，所述蛋白质BT1可来源于玉米(Zea mays)。
为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、GFP(绿色荧光蛋白)、CFP(青色荧光蛋白)、YFP(黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；
D2)在制备甜玉米产品中的应用；
D3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；
D4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；
D5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；
D6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；
所述生物材料可为下述任一种：
E1)编码所述蛋白质的核酸分子；
E2)抑制或降低所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
E3)含有E1)或E2)所述核酸分子的表达盒；
E4)含有E1)或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；
E5)含有E1)或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；
E6)含有E1)或E2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E4)所述重组载体的重组宿主细胞；
E7)含有E1)或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；
E8)含有E1)或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，E1)所述核酸分子可为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。
进一步地，E1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
进一步地，E1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本发明所述的蛋白质BT1的基因(ZmBT1基因)可以为任意能够编码蛋白质BT1的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质BT1。
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为蛋白质BT1编码基因(CDS)的核苷酸序列。
SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为ZmBT1基因的基因组核苷酸序列。
上述应用中，E2)所述核酸分子可为sgRNA，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.4。
本文所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白质BT1的核酸分子和终止子，所述启动子可为U6启动子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述重组载体可为CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体可包括所述sgRNA(靶序列为SEQ ID No.4)。
进一步地，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体还可包括U6-2启动子(SEQ ID No.6)。
进一步地，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体的核苷酸序列可为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。
本文所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9。
本文所述重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9是将所述CRISPR/Cas9基因编辑载体导入根癌农杆菌BMEHA105得到的重组菌。
本发明还提供了靶向ZmBT1基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.4。
本发明还提供了含有所述sgRNA的基因编辑载体，所述基因编辑载体的核苷酸序列可为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。
本发明还提供了一种培育转基因玉米的方法，所述方法包括利用基因编辑技术使目的玉米中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活，得到所述转基因玉米，所述转基因玉米可具有下述任一特性：
G1)所述转基因玉米的籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变；
G2)所述转基因玉米的口感甜度高于所述目的玉米；
G3)所述转基因玉米的籽粒黄色强度弱于所述目的玉米；
G4)所述转基因玉米的籽粒胚乳皱缩程度大于所述目的玉米。
上述方法中，所述利用基因编辑技术使目的玉米中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.4。
上述方法中，所述载体的核苷酸序列可为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。
本发明所述培育转基因玉米的方法可包括如下步骤：
(1)构建表达靶序列为SEQ ID No.4的sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体；
(2)将步骤(1)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入目的玉米中；
(3)经筛选和鉴定获得所述转基因玉米。
进一步地，本发明所述培育转基因玉米的方法可包括将所述CRISPR/Cas9基因编辑载体(核苷酸序列由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成)导入目的玉米，经筛选和鉴定获得所述转基因玉米。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、生物射弹(biolistic)方法、电穿孔或in planta技术。
本发明还提供了突变基因或所述突变基因的下述任一种应用：
H1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；
H2)在制备甜玉米产品中的应用；
H3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；
H4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；
H5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；
H6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；
所述突变基因可以是将SEQ ID No.3所示的ZmBT1基因的第475-476位之间插入一个核苷酸T、第472位和第474位缺失核苷酸G或第474-475位缺失2个核苷酸GG而得到。
本发明鉴定到的ZmBT1基因及其编码蛋白可以用于改变玉米籽粒形态，进而创制甜玉米种质。通过降低ZmBT1基因的表达量，如对ZmBT1基因进行敲除，可以显著增加玉米籽粒的口感甜度，降低玉米籽粒黄色强度，增加玉米籽粒胚乳皱缩程度，使玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变。本发明首次发现了ZmBT1基因及其编码蛋白在调控玉米籽粒形态中的应用，并基于CRISPR/Cas9技术，提供了一个新的sgRNA，基因编辑系统及其基因编辑方法，为创制玉米突变体植株和玉米育种提供了精准安全，无外源DNA插入的技术方法，对于培育甜玉米新品种、克服传统育种的短板、促进商业化甜玉米育种进程、具有重要意义。
附图说明
图1为构建的基因编辑载体构建及突变体类型。其中A为载体构建图谱，B为基因图谱以及设计的靶点，C为筛选的纯和突变体。
图2为筛选到的纯合突变体材料的籽粒表型结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的Zm00001d015746基因的核苷酸序列如序列表的SEQ ID No.3所示。
下述实施例中的基因编辑基础载体为CPB-Cas9(下文简称CPB载体)，以CPB载体为基础载体，在初始CPB载体的限制性内切酶HindIII的识别位点之间插入序列为SEQ IDNo.7的DNA片段，保持初始CPB载体其余序列不变得到的重组载体为CRISPR/Cas9基因编辑载体，该CRISPR/Cas9基因编辑载体的核苷酸序列为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。
下述实施例中的遗传转化受体为玉米自交系KN5585，该自交系已记载于：http://www.zeamap.com/organism/5095206，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的-BluntSimple Cloning Vector(CB111-01)，大肠杆菌菌株Trans1-T1(CD501-03)等购自北京全式金生物技术有限公司。
下述实施例中Hind III(R0104V)同源重组酶(NEB)、KOD Plus(KOC-401)和KOD FX(KFX-101)高保真PCR扩增酶购自北京百灵克生物科技有限责任公司。
实施例1、CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
ZmBT1基因在玉米品种KN5585的编码序列(CDS)是SEQ ID No.1，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的Adenine nucleotide transporter BT1 chloroplastic/mitochondrial蛋白(简称BT1蛋白)。玉米的基因组DNA中，编码BT1蛋白的基因组序列如序列表的SEQ IDNo.3所示。SEQ ID No.3的第183-804位为第一外显子，第923-1084位为第二外显子，第1206-1736位为第三外显子。根据参考基因组序列B73_RefGen_v5中ZmBT1(Zm00001d015746)基因设计sgRNA，sgRNA的靶点位于SEQ ID No.1的第276-295位(对应于SEQ ID No.3的第459-478位)。靶位点正反引物序列分别为：5’-ATTCCCTTGGAAGCCACGAG-3’，5’-TGGGTGGGTTGTACCTCGAT-3’。sgRNA的靶序列(SEQ ID No.4)在玉米自交系KN5585中经Sanger测序验证。
sgRNA的靶序列为：5’-GCAGGCCGCCTGGGAGGCGG-3’(SEQ ID No.4)。
本发明首先构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体，用于敲除玉米编码腺苷二磷酸葡萄糖转运蛋白的基因Zm00001d015746，具体步骤如下：
1、启动子及sgRNA序列的设计
1.1、启动子信息
启动子采用玉米(Zea Mays)的U6启动子。根据序列比对，U6启动子在玉米中有多个启动子，与其他物种中的U6启动子比对，采用其中一个保守性较高的一个启动子，并被命名为U6-2。U6-2启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
1.2、sgRNA序列
针对ZmBT1基因设计的sgRNA靶序列为：5’-GCAGGCCGCCTGGGAGGCGG-3’(SEQ IDNo.4)。
2、CPB载体的酶切体系及纯化回收
2.1、利用HindIII对CPB-Cas9载体(简称CPB载体)进行消化，其体系如表1。
表1、CPB载体消化体系
消化反应程序为37℃条件下金属浴3h，反应完成后进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，得到线性化CPB载体。
2.2、酶切载体的回收
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对线性化CPB载体进行回收，其操作步骤见试剂盒内操作手册，最后用40μl的ddH2O进行洗脱，-20℃保存备用。
3、引物设计
在构建载体的过程中，我们需要用到的引物主要有以下几种测序引物。
表2、引物序列
4、目的片段的获得与纯化
4.1、KOD Plus DNA聚合酶
KOD plus是以KOD DNA polymerase为基础开发的高效率·高保真性PCR用酶。通过Buffer的最优化和采用抗KOD DNA polymerase抗体的热启动法，与原来的KOD DNAPolymerase(Code No.:KOD-101)相比，PCR效率及保真性更高。保真性约为Taq DNApolymerase的80倍，最适用于基因克隆。由于PCR产物末端已被平滑化，用专用的TA克隆试剂盒Target Clone-Plus可进行高效率的TA克隆。由于KOD plus的高保真性，利用KOD plus对目的片段进行扩增，获得所需要的DNA片段。其反应体系如表3所示：
表3、KOD plus反应体系
表3中，以KN5585野生型基因组为模板，以5’-GTCATCTATGTTACTAGATCAAGCTCTAATTGGCCCTTACAAAATAG-3’和5’-GGAGCGGTGGTCGCAGCTG-3’为引物扩增得到U6启动子(U6-2启动子)。
华大公司基因序列合成得到sgRNA+scaffold的编码DNA片段。
KOD plus的反应程序如表4所示：
表4、KOD plus反应程序
PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，对目的片段进行切胶后用tiangen的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，最终用45μL的ddH2O溶解洗脱后，-20℃备用。
4.2、重叠PCR反应
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
根据重叠PCR的原理，将步骤4.1中获得的目的片段(U6启动子)和华大公司合成的sgRNA+scaffold的编码DNA片段进行连接，最终获得含有U6启动子、sgRNA和scaffold的一个片段，命名为DNA片段1，其核苷酸序列为SEQ ID No.7。重叠PCR反应体系如下：
表5、重叠PCR反应体系
表5中：DNA Template 1为步骤4.1中获得的U6启动子；DNA Template 2为步骤4.1中获得的sgRNA+scaffold的编码DNA片段；Primer为：5’-GTCATCTATGTTACTAGATC-3’和5’-CGACGGCCAGTGCCAAGCTT-3’。
重叠PCR反应程序如表6：
表6、重叠PCR反应程序
5、NEBuilder连接反应及转化
HiFi DNA Assembly Master Mix Sample Request利用特殊的重组酶和同源重组的原理，可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有15-25bp重叠区域的PCR片段定向重组，可以同时实现1-5个片段的高效无缝拼接。利用NEBuilder连接反应将步骤2中的线性化CPB载体与步骤4.2中的DNA片段1(SEQ ID No.7)连接，得到连接产物DNA。NEBuilder连接反应体系和连接反应程序分别如表7和表8所示。
表7、NEBuilder连接反应体系
表8、NEBuilder连接反应程序
上述连接产物DNA转化大肠杆菌菌株Trans1-T1，转化反应步骤如下：
(1)取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入连接产物DNA，轻轻混匀，冰浴30min；
(2)42℃水浴热激1min，然后快速将离心管转移到冰浴中2-5min；(冰浴过程不要晃动离心管)；
(3)向离心管中加入150μL的无菌SOC或者LB液体培养基(不含任何抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1h；
(4)吸取100μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布器将细胞均匀涂开至液体完全被吸收，倒置平板于37℃恒温培养箱中，培养10-14h。
6、PCR方法检测转化子
在灭菌的PCR管中加入LB液体培养基(含相应的抗生素100ng/μL)，每孔加入20μL，用灭菌的牙签或者10μL的枪尖从LB固体平板上挑取不同的单菌落，将挑取的单菌落充分接入LB液体培养基中。从20μL液体培养基中取出2.0μL液体，转移到另外一个PCR板中，用作PCR的DNA模板。用PCR板硅胶盖密封后置于37℃的恒温培养箱中培养8-10h。用于检测转化子的PCR体系和反应程序如表9和10所示：
表9、PCR检测体系(单位：μL)
表9中：Primer为5’-GGATGTGCGCTCCCTGAATA-3’和5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。DNAtemplate为挑取的单菌落作为模板。
表10、PCR检测反应程序
PCR反应结束后用1％的琼脂糖进行检测，对扩增出目的片段的菌落根据编号找到相应的菌落，扩大培养到含有4-6ml LB液体培养基(100ng/ml相应抗生素)的离心管中，37℃温度下200rpm培养过夜。
7、阳性转化子的验证
用质粒提取试剂盒从扩大培养的LB液体培养基(含100ng/mL相应抗生素)中提取质粒，再次用PCR方法进行检测，检测的体系和PCR程序见步骤6。然后用相应的限制性内切酶进行酶切检测，其体系和反应条件见步骤2。如果这两种检测均符合预期，送提取出的质粒或者菌液进行测序分析。测序分析方法如下：
首先，要对测序的质量进行确认。在返回的测序报告中，有两个文件，分别以.seq和.abi为文件后缀，用bioedit或者snapgene软件打开，测序质量好的序列，其峰比较单一，没有其他杂峰出现；测序质量差的序列，其峰比较混乱，伴随有杂峰出现，有时会有峰与序列不匹配的现象。对于一代测序来说，测序的前面20-40bp是不准确的，要删掉以保证测序质量。根据一代测序的原理，测序中用的DNA聚合酶的活性随着反应的进行其保真性也会下降，所以一个测序反应能获得的最大可靠序列为650-700bp，如果需要测序的部分超过1Kb，则建议用两端的引物同时进行测序，然后用Vector：：ContigExpress软件进行拼接，拼接前要对测序序列的质量进行确认。将可靠的测序序列与模板序列进行比对，再次验证转入的质粒是否是所期望的质粒。
8、阳性转化子菌种和质粒保存
将测序正确的阳性转化子接入到350μL LB液体培养基(含100ng/ml相应的抗生素)中，37℃条件下200rpm培养8-10h后，在超净工作台中加入350μL无菌的50％甘油(甘油和无菌水1:1混合)，混匀后保存于-80℃冰箱中备用；对于测序结果验证无误对应的质粒，写好相应的标签后直接保存于-20℃冰箱中。
上述构建时所用的基础CPB载体大小约为17.4Kb，是一个中度拷贝的载体。主要包含以下几个元件：Kan+抗生素抗性基因；复制元件；CaMV 35S启动子驱动的bar筛选基因；Ubi启动子驱动的编码Cas9蛋白的基因序列和玉米U6启动子驱动的sgRNA的DNA序列。其中，除kan+抗性基因和复制元件外，其余的都在T-DNA片段上，如图1。其上携带有Kan抗性基因，可以使菌株具有Kan+抗性，因此可以使用Kan抗生素进行筛选。唯一的HindIII限制性内切酶位点位于U6启动子和RB之间，酶切后可以使CPB成为线状，以用于载体构建。转基因的阳性植株中，CPB载体上的Ubi::Cas9::Nos表达的Cas9蛋白与U6::sgRNA::sca ffold转录的sgRNA结合后具有定向DNA切割活性；CaMV 35S::bar::CaMV poly(A)signal表达的bar蛋白具有除草剂抗性，可以用于阳性植株的筛选。
上述构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核苷酸序列为由SEQ ID No.5和SEQ IDNo.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。其结构描述如下：在初始CPB载体的限制性内切酶HindIII的识别位点之间插入序列为SEQ ID No.7的DNA片段，保持初始CPB载体其余序列不变得到的重组载体。上述构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体(也称为CRISPR/Cas9敲除载体)如图1A所示，在由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列中，第435-4535位为Cas9元件，第4658-6629位为Ubi启动子元件，第6658-8593位为3896启动子元件，第8594-9271位为DsRed2，第9272-9524位为NOS终止子元件，第9927-9946位为sgRNA的编码DNA序列。
实施例2、玉米的遗传转化
1、构建重组菌EHA105/CRISPR/Cas9
将实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入BMEHA105农杆菌感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC303-01)，得到重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9。
2、农杆菌侵染
1)采用N6液体培养基(硝酸钾2800mg/L，硫酸铵463mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，硫酸镁185mg/L，氯化钙165mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸1.6mg/L，一水合硫酸锰4.4mg/L，七水合硫酸锌1.5mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，七水硫酸亚铁27.85mg/L，甘氨酸2mg/L，维生素B1 1mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖20000mg/L。N6培养基配制方法：称取24.1g上述N6液体培养基各组分的混合物，于1000mL蒸馏水或去离子水中，加热搅拌溶解，调节pH至5.8±0.2(25℃)，115℃高压灭菌20分钟。)在28℃、200rpm条件下的农杆菌摇床中培养步骤1得到的重组农杆菌EHA105/CRISPR/Cas9，得到菌液OD600nm为0.8的重组农杆菌菌液，5000r/min离心10min，收集菌体，用配好的侵染buffer(1L侵染buffer是将4g含N6vitamin的N6培养基基础盐(Phytotech公司产品，货号C416-50L)，2mg 2,4-D，100mg肌醇，0.7g L-脯氨酸，68.4g蔗糖，36g葡萄糖，1mL AgNO3(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)和水混匀调pH至5.2得到的)悬浮菌体，使OD600nm值为0.5左右，然后28℃、150r/min震荡0.5h，得到侵染液。
2)将玉米自交系KN5585长势良好的愈伤组织在侵染buffer中浸泡1h，然后转移至步骤1)制备的侵染液中浸泡15min，晾干。
3)将步骤2)侵染后的愈伤组织放至共培养基(1L共培养基是将4g含N6 vitamin的N6盐，2mg2,4-D，30g蔗糖，8g琼脂，1mL AgNO3(10mg/mL)，1mL As(100mol/L)，3mL L-半胱氨酸(100mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)，20℃培养3天，转至恢复培养基(1L恢复培养基是将4g N6盐，1ml N6 vitamin 1000×，1.5mg 2,4-D，0.7g L-脯氨酸，30g蔗糖，5μM AgNO3，0.5g MES，100mg头孢噻肟，100mg万古霉素，8g琼脂和水混匀得到的，pH 5.8)，28℃培养10天，然后转至含有1.5mg/L草铵膦的恢复培养基，28℃暗培养7天，筛选阳性愈伤组织。
4)将步骤3)得到的阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基(1L诱导胚状体培养基是将4.43g含MS vitamin(含肌醇)的MS盐，0.25mg2,4-D，30g蔗糖，5mg 6-BA，4g植物凝胶，1mLCefo(头孢霉素)(250mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)，暗培养2周，然后转至分化培养基(1L分化培养基是将4.43g含MS vitamin(含肌醇)的MS盐，30g蔗糖，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)，待长出绿苗后转移至生根培养基(1L生根培养基是将2.215g 1/2MS，30g蔗糖，51.55mg MSvitamin，4g植物凝胶和水混匀得到的，pH5.8)生根，长到一定高度，暴露在空气中培养3天，移苗。
5)取植株叶片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer(来自bar基因检测试纸条)，插入bar基因检测试纸条(北京奥创金标生物技术有限公司，货号：A07-13-413)，出现阳性条带的植株就为T0代阳性植株。
实施例3、转基因植株的鉴定
1、转基因成分验证
利用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，China)提取和纯化DNA。通过Bar试纸条(Agdia，Cat.#STX14200/0012，US)和SpCas9基因的PCR检测T-DNA。SpCas9 PCR扩增使用正向引物(5'-CAACCGGAAAGTGACCGTGA-3')和反向引物(5'-CACCACCTTCA CTGTCTGCA-3')。PCR程序包括94℃3min；95℃30s，58℃30s，68℃20s，35个循环；最后68℃后延伸10min。PCR反应体系为：10x Buffer 5μL；2mM dNTP 5μL；25mM MgSO4 2μL；Primer(10μM)1.5μL；DNATemplate 2μL；KOD plus(1U/μL)1μL；ddH2O 32μL。
2、突变检测
根据CRISPR/Cas9基因编辑载体的靶标位置设计引物5'-ATTCCCTTGGAAGCCACGAG-3'和5'-TGGGTGGGTTGTACCTCGAT-3'，通过PCR对相应的植株进行靶基因扩增，测序后用DSDecode软件分析突变类型。PCR反应体系及反应程序同步骤1中的转基因成分验证。
通过农杆菌介导的遗传转化，获得了16个转化事件。通过PCR扩增和Sanger测序发现：在sgRNA结合的区域发生了突变(图1中C)，并且获得了移码突变。突变的类型包括ZmBT1-1：插入一个胸腺嘧啶；ZmBT1-2：减少两个碱基；ZmBT1-3：减少两个碱基等类型。具体突变类型如下：
ZmBT1-1与野生型相比，2条同源染色体中ZmBT1基因均发生了如下突变：ZmBT1基因中的“5’-GCAGCAGGCCGCCTGGGAGGCGGAGGAAG-3’(对应于SEQ ID No.1的第273-301位，SEQID No.3的第456-484位)”突变为“5’-GCAGCAGGCCGCCTGGGA GGTCGGAGGAAG-3’”。该突变使序列表中序列SEQ ID No.3的第475-476位之间插入核苷酸“T”，该核苷酸的插入引起了移码突变，导致翻译提前终止，造成BT1蛋白功能缺失，从而将ZmBT1基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中C。
ZmBT1-2与野生型相比，2条同源染色体中ZmBT1基因均发生了如下突变：ZmBT1基因中的“5’-GCAGCAGGCCGCCTGGGAGGCGGAGGAAG-3’(对应于SEQ ID No.1的第273-301位，SEQID No.3的第456-484位)”突变为“5’-GCAGCAGGCCGCCTGGAG CGGAGGAAG-3’”。该突变使序列表中序列SEQ ID No.3的第472位和第474位缺失核苷酸“G”，两个核苷酸的缺失引起了移码突变，导致翻译提前终止，造成BT1蛋白功能缺失，从而将ZmBT1基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中C。
ZmBT1-3与野生型相比，2条同源染色体中ZmBT1基因均发生了如下突变：ZmBT1基因中的“5’-GCAGCAGGCCGCCTGGGAGGCGGAGGAAG-3’(对应于SEQ ID No.1的第273-301位，SEQID No.3的第456-484位)”突变为“5’-GCAGCAGGCCGCCTGGGA GGCGGAGGAAG-3’”。该突变使序列表中序列SEQ ID No.3的第474-475位缺失两个核苷酸“GG”，两个核苷酸的缺失引起了移码突变，导致翻译提前终止，造成BT1蛋白功能缺失，从而将ZmBT1基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中C。
3、将遗传转化获得的T0代阳性植株自交或测交获得T0代种子，种植后从T1代阳性植株中筛选出ZmBT1基因敲除杂合突变体后，进行自交获得种子，T2代种植下去进行基因型检测和转基因成分检测。最终筛选出纯合阴性突变体进行自交繁种。
结果如图1所示，染色体1和染色体2分别代表检测植株的DNA双链。本发明成功构建了用于敲除腺苷二磷酸葡萄糖转运蛋白基因Zm00001d015746的CRISPR/Cas9基因编辑载体(即CRISPR/Cas9敲除载体)(图1A，B)。通过农杆菌介导的遗传转化，获得了16个转化事件。以sgRNA结合的位置为中心，设计该位点的上游引物和下游引物。通过PCR扩增和Sanger测序，发现在sgRNA结合的区域发生了突变(图1C)，并且获得了移码突变。最终，选择ZmBT1功能缺失纯合突变体材料用于甜玉米籽粒形态鉴定。
实施例4、转基因植株表型鉴定
籽粒形态鉴定：籽粒形态指标是描述籽粒大小、粒形的几何度量，玉米籽粒结构主要包括胚、胚乳和种皮三部分。种皮约占籽粒质量的6％～8％，保护籽粒免受非生物和生物胁迫。胚占籽粒质量的10％～15％，是种子萌发所必需的组织，含有籽粒中的大部分脂肪。胚乳位于胚的周围，占籽粒质量的80％～85％，含有供胚发育时所需要的营养物质。
突变体选取生长正常均匀一致的果穗，在果穗中随机选取籽粒进行拍照观察。结果如图2所示。突变体植株在授粉后30天口感明显比野生型甜。突变体籽粒较于野生型颜色较淡为淡黄色，其籽粒胚乳中淀粉含量严重下降，导致了籽粒皱缩，多棱。这些特征说明突变体符合甜玉米籽粒特点。以上试验结果表明，通过基因编辑手段，敲除玉米腺苷二磷酸葡萄糖转运蛋白基因Zm00001d015746，可以使籽粒具有甜玉米籽粒表型(例如：使籽粒颜色变淡；使籽粒胚乳中淀粉含量下降；使籽粒皱缩、多棱)，提高玉米甜度，快速创制甜玉米种质。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
A1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；
A2)在制备甜玉米产品中的应用；
A3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；
A4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；
A5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；
A6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；
D2)在制备甜玉米产品中的应用；
D3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；
D4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；
D5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；
D6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；
所述生物材料为下述任一种：
E1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
E2)抑制或降低权利要求1中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
E3)含有E1)或E2)所述核酸分子的表达盒；
E4)含有E1)或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；
E5)含有E1)或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；
E6)含有E1)或E2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有E3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有E4)所述重组载体的重组宿主细胞；
E7)含有E1)或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；
E8)含有E1)或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，E1)所述核酸分子为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，E2)所述核酸分子为sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.4。
5.靶向ZmBT1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.4。
6.含有权利要求5所述sgRNA的基因编辑载体，所述基因编辑载体的核苷酸序列为由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。
7.一种培育转基因玉米的方法，其特征在于，所述方法包括利用基因编辑技术使目的玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活，得到所述转基因玉米，所述转基因玉米具有下述任一特性：
G1)所述转基因玉米的籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变；
G2)所述转基因玉米的口感甜度高于所述目的玉米；
G3)所述转基因玉米的籽粒黄色强度弱于所述目的玉米；
G4)所述转基因玉米的籽粒胚乳皱缩程度大于所述目的玉米。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用基因编辑技术使目的玉米中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.4。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体的核苷酸序列为由SEQ IDNo.5和SEQ ID No.8从N端到C端依次直接相连组成的序列。
10.突变基因或所述突变基因的下述任一种应用：
H1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；
H2)在制备甜玉米产品中的应用；
H3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；
H4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；
H5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；
H6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；
所述突变基因是将SEQ ID No.3所示的ZmBT1基因的第475-476位之间插入一个核苷酸T、第472位和第474位缺失核苷酸G或第474-475位缺失2个核苷酸GG而得到。
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