NL8103680A - Eukaryotisch autonoom replicerend segment. - Google Patents

Description

5 $ -1- vo 2157

Eukaryotisch autonoom replicerend segment iïet vemogén van extrachrcmoscmale DNA-moleculen cm autonoom te repliceren is toegepast voor het isoleren van prokaryotische replicatieoorsprongen. DNA wordt het "beste in bacteriën ingevoerd via faag-infectie, conjugatie of door calcium-bemiddelde transformatie.

5 Een bepaald DNA-molecuul zal, onafhankelijk van integratie in het gastheergenocm alleen replicéren of copieën voimen wanneer het een initiëringsplaats bevat, die wordt herkend door de essentiële replicatie-enzymen en -factoren. Voortplanting van dergelijke extrachrcmoscmale DNA-moleculen kan worden verzekerd door voor de expressie een gekoppelde 10 marker, bijvoorbeeld een gen, dat geneesmiddelweerstaad incodeert of een gen dat in staat is een gastheeresie te complementeren, te kiezen. Deze rationeel is toegepast voor het isoleren en definiëren van de oorsprongen van replicatie van en R-factor plasmiden en de Salmonella typhimurium en E. Coli-chrcmoscmen.

15 Bakkersgist Saccharcmyces cerevisiae is de enige eukaryoot, waarin een soortgelijk selectieschema mcmenteel praktisch is.

Hoewel virionen de noodzakelijke replicatieplaats voor replicatie in eukaryoten kunnen leveren, zal de invoering van virionen, of delen daarvan, voor vele toepassingen, waarbij gébruik wordt gemaakt van 20 recombinant DNA-technieken ongewenst zijn. Het is derhalve van aanmerkelijk belang alternatieve methoden te vinden voor het invoeren van extrachraaosamaal DNA in een eukaryotische cel, waar het extrachrcmo-scmale DNA hetzij zelf-replicerend zal zijn en/of snel zal integreren in het chromosoom.

25 Struhl e.a. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039 beschrijven een gist DNA-fragment, dat in staat is giét met hoge doelmatigheid te transformeren en zich te gedragen als een mini-ehrcmosoom door autonoom te repliceren, zonder integratie in het genoom. Scherer & Davis (1979) ibid. 76, ^-951-^955 beschrijven een 30 methode voor het stabiel invoeren van vreemde sequenties of volgordes in S_. cerevisiae chromosomen. De methode omvat de toepassing van -vectoren die in chromosomaal DNA worden geïntegreerd. Zie tevens Stinchccmb e.a. (1979) Nature 2Ö2, 39-^3· 81 0 3 6 8 0

β *' A

-2—

Eukaryotische autonome replicerende segmenten worden bereid door gastheer chrcmoscmaal DM in fragmenten te splitsen en de fragmenten te koppelen aan een marker-gen, waardoor een hybride-DNA wordt gecreëerd., waarmee de selectie van transformahten mogelijk is.

5 Gist of een andere snel groeiende eukaryoot, in het bijzonder gist, wordt getransformeerd onder omstandigheden waarin expressie van het hybride DNA wordt geselecteerd. Het bybride-DNA wordt uit de transformanten geïsoleerd en de autonocm-replicerende segmenten kunnen verder worden gemodificeerd en toegepast als een vestor, gekoppeld met genen 10 van de gastheer of een andere bron. Het hybride zal autonoom repliceren, waardoor een expressie van genen ingevoerd met het autonome replicerende segment mogelijk is. Aansluitend kan stabiele integratie van êên of meer genen-in het gastchrcmosocm worden bereikt door een passende ophouw van het- hybride...

15 Methoden en samenstellingen worden voorzien voor het modificeren van eukaryotische cellen ter vorming van cellen met multiplicatieve kopieën van een endogeen gen, die niet-reverteerbare .mutaties dragen, die leiden tot het verlies van een fenotypische eigenschap of die tot expressie van exogene genen leiden, hetgeen resulteert in de ..... 20 vorming van een vreemd proteïne. De genetische verandering kan worden veroorzaakt door de stabiele aanwezigheid van een autonoom· replicerend hybride DNA-molecuul of door de integratie van êên of meer DNA-segmenten in het gastheer-chrcmosocm.

De hybridemoleculen van de uitvinding hebben een "autonocm 25' replicerend segment” van DNA, afgeleid uit een chromosoom van een eukaryoot (welke indien van gist afkomstig minder is dan 1 kb paar fragment). Het autonoom replicerende segment wordt verkregen door een chromosoom van een eukaryoot te splitsen en de verkregen segmenten te koppelen aan een DNA-segment, dat êén of meer geschikte markers' bevat, 30 die in staat - zijn tot expressie in een eukaryotische cel en/of een prokaryotische cel. Het hybride DNA wordt toegepast voor het transformeren van een geschikte eukaryotische gastheer-cel, onder selectie van transformanten toe te schrijven aan de feno-typische expressie van de marker. Waar een eukaryotische cel wordt getransformeerd, 35 zal de replicatieplaats, afgeleid van een eukaryoot-chrcmosoam voldoende zijn voor het repliceren van het hybride DNA in de eukaryoot-transf ormarnt, alsmede dienen als marker, .....“81 0 3 6 8 0 '

ι I

-3-

Het hybride-DHA kan verder worden geïsoleerd en het eukaryotische DHA-segment, waarmede autoncme replicatie mogelijk. is, kan worden geïsoleerd, naar wens gemodificeerd en daarna worden toegepast voor de transformatie van de gastheer- of enige analoge eukaryotische 5 cel. Indien een DKA-volgorde homoloog aan een segment van het gastheer-chrcmosocm en onderbroken door een of meer genen wordt opgencmen in het hybride-DHA, dat het autonoom replicerende segment (ars) bevat, kunnen de extra genen stabiel in het gastheer-chrcmosacm worden geïntegreerd.

10 De methode, waarmede autonoom replicerende segmenten (ars) worden verkregen, zal nu eerst worden bespreken.

Eukaryotisch DBA wordt in fragmenten verdeeld met een afmeting, die voldoende is cm een gehele ars pp te nemen, gewoonlijk ten minste ongeveer 0,1 kb, meestal ten minste ongeveer 0,2 kb paren, 15 bij voorkeur ten minste ongeveer 0,5 kb paren. De segmenten kunnen worden verkregen door een mechanische verbreking van het chromosoom of door enzymatische splitsing onder toepassing van één. of meer r-estrictie-enzymen. Bestrictie-enzymen dienen te worden gekozen die _ het ars niet splitsen, hoewel oligcmerisatie het ars gedurende de 20 bereiding van het hybride-DHA zal. herstellen. Segmenten, verkregen uit een eukaryoot anders dan een gist, kunnen zorgen voor replicatie in gist. Aldus behoeft het hybride-DHA dat is bereid geen gist-replicatorplaats te bezitten en in feite is het gewenst, dat een dergelijke plaats afwezig is, wanneer het van belang zijnde ars-gen 25 uit een organisme..anders dan gist afkomstig is. Voorzover mechanische afschuiving of breking van het eukaryotische chromosoom in het spel is, zullen de terminatieplaatsen van de DHA-segmenten worden gewijzigd volgens bekende technieken cm ligatie aan andere DHA-segmenten ter bereiding van het hybride-DHA mogelijk te maken. De modificatie kan 30 een exonuclease ontleding, additie van kleine DHA-reeksen, hetzij door additie van individuele basen of een voorgevormde volgorde en dergelijke betreffen. Waar restrictie-enzymen worden toegepast voor het splitsen van het chromosoom kan hetzelfde enzym cohesieve uiteinden of "blunt" ligateerbare uiteinden vormen, die gebruikt 35 kunnen worden voor het koppelen van de segmenten aan andere DHA-reeksen.

Tevens zal het hybride-DHA aan het ars-gen bevattende volgorde 8103680 &>> η . - ' ” -~£ ' ' ' : een marker dragen, die selectie van gist of andere eukaryoot-transfor-manten mogelijk maakt. Het. hybride mag tevens een replicon uit prokaryoten om-vatten αα vezmenigvuldiging in een prokaryoot-ga'stheer mogelijk te maken. De voor de selectie gekozen markers . 5 kunnen sterk variëren. Gebruikelijke markers omvatten die welke een anti-biotisehe resistentie aan-dergelijke antibiotica, als tetracycline, anticelline, penicilline,, kanamycine en dergelijke verlenen. Tevens kunnen de toegepaste markers prototrofie in een auxotroof leveren. Prototrofische capaciteiten cmvatten de expressie van enzymen, betrok-10 ken in biosynthetische routes, voor de bereiding van. nucleotiden of purine of pyrimidinevoorlopers, zoals uracil, adenylzuur, guanylzuur, citidylzuur, thymidylzuur; en dergelijke, voor de bereiding van aminozuren, zoals leucine,'tryptofaan en histidine, en dergelijke, voor de assimilatie van. vereiste voedingsstoffen \ of ter levering 15 van toxineresistentie.

Fanneer het gewenst is een bepaald gen in het chrcmosoam van het gastheer-eukaryoot te integreren, kunnen verschillende technieken worden toegepast. In-één methode omvat het hybride-DM een gewijzigde volgorde, van een gen, aanwezig in het gastheer— 20 chromosoom, welke wijziging de insertie van één of meer genen anvat. Krachtens de homologe volgordes tussen het gewijzigde gen en het gastheer-chroiLOsoom kunnen de geïnsereerde genen door; recambinatie stabiel in het gastheer-chrcmosocm worden ingevoerd. Er is verder gevonden- dat segreganten kunnen worden verkregen wanneer ten minste 25 een hoofddeel van het DM anders dan de gewijzigde reeks uit het chamosoom is verloren. Een andere weg is in het hybride-DM een transponeerbaar element aangrenzend aan het te integreren gen op te nemen. Het transponeerbare element zal in het gastheer-chraaosoom worden geïntegreerd en tegelijkertijd, het gen in het gastheer-30 chromosoom opnemen. Door het kreken van transformantcellen via een aantal generaties, kunnen segreganten met het gewenste gen dat stabiel is geïntegreerd in het gastheer-chrcmosocm worden geïsoleerd.

Autoncme replicatie kan worden bereikt met een DM-fragment met niet meer dan 10 baseparen, meestal ten minste ongeveer 50 base-35 paren en in het bijzonder ten minste ongeveer 100 baseparen. Het ars-gen zal in een DM-fragment van ten minste ongeveer 0,2 kb paar, gewoonlijk ten minste ongeveer 0,5 kb paar en in het bijzonder minder dan 81 0 3 6 8 0' : ................

- ..-5- ' £ ongeveer 2 kb paar worden opgenaaen. Voor gist zal het ars-gen een fragment zijn kleiner dan ongeveer 1 kb paar. Het ars-gen wordt daardoor gekarakteriseerd dat het in staat is tot hybridesatie met het euharyoot-chrcmosamale DNA, waaruit het was afgeleid en door-5 .dat het hoge transfozmatierendementen levert en vrij van een hoofddeel van de gastheer-chraaosoaa is. Gewoonlijk zal het DHA-fragment, dat het ars-gen bevat, dat andere genen die op natuurlijke wijze aan het ars-gen zijn gekoppeld, omvat kleinen dan ongeveer 20 kg paren, gewoonlijk onder 10 kb paren, en bij voorkeur onder 5 kb 10 paren zijnv

Afhankeli jk van de wijze van formatie van het fragment, dat het arsgen bevat, kunnen andere genen aan het ars worden gekoppeld.

' Vaar andere genen, in het bijzonder structurele genen aanwezig zijn, zal het ars-segment, dat dergelijke genen omvat, groter zijn dan 15 ongeveer 1 kb paar in aflaeting. Er zullen vele situaties zijn waarin de aanwezigheid van het gen anders dan het ars ongewenst zal zijn. De aanwezigheid van het andere gen met zijn genen expressie besturen kan in vele gevallen ongewenst zijn, d.w.z. expressie van een ongewenst proteïne, ongewenste plaatsen voor restrictie, insta-20 biele traasfoimaaten, ongewenste insertie of insertie op een ongewenste locus geven alsmede een toegencmen waarschijnlijkheid, dat de geien van belang van het ars worden gescheiden, door recombinatie-gebeurtenissen. Het zal derhalve wenselijk zijn de aanwezigheid van DNA-reeksen, anders Φ»* het ars-gen en koppelvolgordes minimaal te 25 maken. De verwijdering van de andere genen kan worden bereikt door restrietie-enzymen toe te passen, en fragmenten te kiezen, die de andere genen missen, basen door exonucleasevertering te verwijderen, en dergelijke. Het is gewenst, dat minder dan 50$, meestal minder dan ongeveer 20# van de baseparen van het gekoppelde gen een 30 deel zullen zijn van de ars-bevattende fragmenten.

In scamnige gevallen zullen multimeren van ars-genen aanwezig zijn. Het aantal eenheden kan lopen van ongeveer 2 tot/met

De bereiding van de ars-bevattende hybride DM's zal ruim variëren, afhankelijk van de toepassing van het hybride-DM, de 35 vorm waarin de BNA-volgordes beschikbaar zijn, bestaande restrictie- -plaatsen, alsmede restrictieplaatsen die worden ingevoerd en het deel van de transformatie bij voorbeeld chromosomale integratie.

8103680 V Ψ .

: ·; -6- • ^

Geschikt in kaart gebracht cirkeivomig DM uit een piasmi de, ; < faag, virus en chcmosocm, met ten minste één restrictieplaats, bij voorkeur twee of meer verschillende restrictieplaats en, kan worden toegepast. Het cirkelvormige DM kan één of meer markers hebben, 5 die-.in_.het bijzonder anti-biotische resistentie tot expressie brengen of een enzym, dat essentieel is voor een biosynthetische route, of dergelijke markers famnen in een restrictieplaats worden geïnsereerd. Afhankelijk van de aard. van de restrictieplaats kan deze plaats worden gemodificeerd door. verwijdering van basen met. exonueleasen 10 of additie van basen door DM-polymerases of ligases. Het hybride-DM kan reeksgewijze worden .qpgebouwd of door 2 DÏÏA-s egmenten, die' alle belangrijke genen bevatten samen te binden ("annealing"). De wijze waarop de ars-bevattende hybride DM warden gevormd is gebruikelijk en niet kritisch voor de uitvinding, hoewel men in veie gevallen 15 het ene schema boven het andere zal prefereren.

De verkregen hybride DM’ s worden daarna toegepast voor de transformatie yan een geschikte eukaryoot-gastheer, gewenst een zich snel vezmenigvuldigende eukaryoot zoals S. cerevisiae. De transformatie wordt uitgevoerd op een gebruikelijke wijze, dikwijls onder toe-20 passing, van een calciumshok. Het is geschikt sferoplasten voor de transformatie te gebruiken. Ha de transformatie van de cellen wordt de verkregen cultuur gekweekt in een voedingsmedium, waarbij keuze van transformant en mogelijk is. Het hybride-DM kan daarna uit verschillende koloniën worden geïsoleerd en onderzocht op hoog-frequente 25 transformatie, dat een eigenschap van het arsgen is. Het hybride-DM kan worden gedetecteerd volgens andere methoden, zoals hybridisatie en autoradiografie en dergelijke.

Wanneer eenmaal het ars-bevattende hyrbide is geïsoleerd, kan het volgens verschillende methoden worden gemodificeerd. Waar re-30 strictie-enzymen zijn toegepast ter bereiding van DHA-segmenten, en het hybride-DWA werd verkregen, kan het hybride-DÏÏA worden gesplitst en de het ars-bevattende segmenten worden geïsoleerd. Desgewenst kan het segment verder door restrictie worden verkort, zoals ter verwijdering van DHA, dat geen verband houdt met het ars-gen of worden 35 onderworpen aan exonuclease vertering ter verwijdering van uitwendige terminale basen. Het ars-gen kan daarna worden toegepast ter bereiding van hybridemoleculen voor de transfoimatie van de gastheer-eukaryoot, waarbij verbeterde of nieuwe genetische ^eigenschappen 8103680 -7- aan de gastheer worden gegeven.

Door passende manipulaties kan een hybride worden "bereid en dat zal leiden tot de stabiele invoering van één of meer genen in het gast-eukaryootchrcmosocm. De integratie van deze genen .in 5 het chrcmosocBi wordt bereikt door toepassing van een DNA-volgorde, die hcmoloqg is met een DBA-volgorde van het gastheer-chrcmosocm..

Door keuze van een geschikte restrictieplaats in de volgorde, kunnen de in het gastheer-chrcmosocm in te voeren genen worden gexnsereerd tussen de teiminatie plaatsen van .de homologe volg-10 orde. De gewijzigde volgorde wordt daarna ingevoegd in een passende ars-bevattende vector ter levering van het hybride-DBA.

Ba transformatie van het gastheer-eukaryoot met het hybride-DBA, zal de homologe volgorde worden geïntegreerd in het gastheer-chrcmosocm. Baar keuze zal het hybride-DBA wegens de aan-15 wezigheid van het ars in het hybride-DBA, in staat zijn tot replicatie in het gastheereukaryoot, dat werkt als een minochcmosocm, waardoor, de expressie van de in het hybride-DBA aanwezige genen mogelijk is. Wanneer het niet gewenst is de genen te integreren in het chromosoom, behoeft het hybride-DBA voor integratie geen homologe volgorde, met 20 het gastheer-chrcmosocm te bezitten. Een integratie kan echter plaatsvinden als resultaat van een mitotische reccmbinatie veroorzaakt door de ars-hcmolpgie.

De hcmologe volgorde dient ten minste ongeveer een 1 kb paar sectie aan elk uiteinde van het gewijzigde gen te zijn, gewoonlijk 25 ten minste ongeveer een 1,5 kb paar sectie, bij voorkeur ten minste ongeveer een 2,5 kb paar sectie.

Het is gewenst, dat de hcmologe volgorde genen of secties van een genocm met geen bekende functie cmvat αίί gewijzigde groei-eigenschappen of extra voedingseisen voor de gemuteerde transformant 30 te vermijden. Ba integratie van het gewijzigde gen in het chramosocm, met uitzondering van de expressie van de nieuwe genen, mag er geen verandering in de feno-typische eigenschappen of groeikarakteristieken van de gemuteerde trans formant zijn.

Het is gewenst dat de hcmologe volgorde een hoge waar-35 schijnlijkheid van reccmbinatie met het gastheer-chrcmosocm heeft. Derhalve zullen bepaalde volgordes de voorkeur blijken te hebben, afhankelijk van de doelmatigheid van de integratie. Integratie kan 8103680 I , -8- extra DNA-volgordes omvatten anders dan het gewijzigde gen. Dit tan een resultaat, zijn van de aanwezigheid van homologe volgordes anders 'dan het gewijzigde gen, die dienen als een locus voor reccmbinatie of de insertie met het gewijzigde gen van volgordes gekoppeld aan 5 het gewijzigde gen.

Ter vergroting van de waarschijnlijkheid van selectie van cellen, waarin de integratie heeft plaatsgevonden, kan een marker worden opgencmen in het hybride-DNA dat. tegelijkertijd wordt geïntegreerd met het gen, dat van belang is. Door keuze van de'marker TO kan de celpopulatie worden verminderd tot slechts die cellen, die zijn getransformeerd en waar de transformanten instabiel zijn, alleen die cellen, waar. de integratie heeft plaatsgevonden.

De marker zal instabiel tot expressie worden gebracht als niet-geïntegreerd, autonoom, replicerend DNA» Het selecteren op stabiele T5 expressie vermindert de celpopulatie tot slechts die cellen, waar integratie heeft plaatsgevonden.

Segreganten zullen ontstaan uit de transformant met chromosomen, waaruit beide delen van het. geïntegreerde DNA, anders dan het gewijzigde gen omvattende de complementaire markers of de DNA-volgorde, 20 die de reccmbinatieplaats levert, zijn uitgesneden.

De genen, die kunnen worden ingevoerd en tot expressie gebracht in de gastheer-eukaryoot kunnen voorzien in. de bereiding van een grote verscheidenheid, van proteïnen, die leiden tot gewenste feno-typische eigenschappen. De expressie van de genen kan 25 enzymen leveren voor de bereiding van een reeks voedingsstoffen, zoals aminozuren, vitaminen en dergelijke; voor het uitvoeren van een reeks chemische reacties, zoals oxydatie, nitrificering, reductie, hydrolyse, halogenering, en dergelijke, of de bereiding van een reeks niet-enzymatische proteïnen, zoals hormonen, globulinen, albuminen, 30 colageen, keratine, en dergelijke.

De eukaryotische gastheer kan elk van een veelvoud van gewervelde of ongewervelde dieren zijn, bij voorbeeld zoogdieren, insekten, gist, schimmel, en dergelijke of planten, zoals bomen, al of niet groenblijvend, planten, groenten, fruit en knollen.

35 De volgende voorbeelden worden ter illustratie gegeven en zijn niet beperkend bedoeld.

Experimenteel.

I. Bereiding van ars-genen.

8103680 4 Λ ' "

Verschillende concentraties van hyhridemoleculen werden gemaakt door restrictie endomielease-gevormde segmenten van verschillend eukaryotische chrcmoscmale DBA's te insereren in ÏX p5 (YIp5 heeft een 1,1 kb-fragment, dat het ura ^ gen bevat, geinsereerd 5 door dG/dC hcmopolymeeroitbreidingen in de Ava I-plaats van pBR 322.

Struhl e.a* (1979) PNAS U.S.A. 76, 1035-1039). EcoRi werd toegepast . ..... cm N. crassa, 1). discn-f dmim. elegans, D. melanogaster en Z. mays DBA te fragmenteren. D. melangcgaster DBA werd tevens gelijktijdig gesplitst met ffindTIT· en EcoRi. Voor gist werd Bant ΕΣ endonuclease 10 toegepast voor het uitsluiten van volgordes uit het endogene gist-plasmide, Scp1 en de gist-ribosamale gentros, waarvan bekend is, dat deze met hoge frequentie wordt getransformeerd. Ba vertering met het passende restrictie endonuclease (of endonudeasen) werden de YIp5 en chrcmoscmale DBA’s (elk met 15-20 microg DBA/ml) gemengd 15 en geligateerd met 0,1 micrcg DBA ligase in 200 m M BaCl, 50 mM Tris-HCl pH 10 mm M g SO^, 1 mm A!EP en 10 mm dTT bij h°C gedurende 1-2^ uur. Het ligatiemengsel werd rechtstreeks toegepast voor het transformeren van gist cellen.

BHY 27 gist (ct trpl-289 ura 3-52 gal2 gal10) werd getransfor-2Q meerd met elke afzonderlijke concentratie YI p5-eukaryotische DBA

hybriden. De procedure van Hinnen e.a. (1978) PBAS Ü.S.A. 75» 1929-1933 werd toegepast met de volgende modificaties. Sferoplasten werden bereid door 100 ml van een exponentieel groeiende kweek met 300 eenheden lyticase gedurende 30 minuten bij 30°C te behandelen. Ba behan- 2? deling met polyethyleenglycol weiden de cellen onmiddellijk op platen T 3 regeneratie-agar (10-10° levensvatbare sferoplast/plaat) aangebracht. Transformaties van BBY 27 met hybride-DNA's, die zowel de YIp5-factor als het ars-gen bevatten, resulteertde in Ura+-koloniën, die groeiden qp selectieve media. De frequentie waarmee BBY-27 werd getransformeerd 30 in Ura+ varieerde van bij benadering 50 koloniën/microg YIp5-B.crassa of YIp5-C elegans-hybriden tot 2000 koloniën/microg voor de concentratie van D. discoideum hybriden (alle waarden stellen üra+-transformanten per in een hybrideeoncentratie aanwezige massa YIp5 DBA voor en zijn gecorrigeerd voor de verschillende transformatie-35 rendementen, waargenomen met een verschillende vector YRp12). Twee afzonderlijke concentraties van YIp5-D. melanogaster hybriden, opgebouwd door EcoRi-splitsing van verschillende DBA-preparaten leverden 8103680.....

w m - 4» -10- : 800 en 1000 Ura -transfonnanten/microg DNA. Bovendien genereerden . YI-p6-D.melanogaster hybriden, opgedouwd met Hind III endonuclease, 600 Ura""-koloniën/microgram hybride DNA bij transformatie van ,MY27.

5 Groeisnelheden van gisttransformanten in het standaardgist- minimummedium werden gemeten met een Klett-Summerson-coloriemeter.

De stabiliteit van het getransformeerde feno-type werd beoordeeld door verzadigde cultures 1:1000 te verdunnen tot rijke media en daarna het percentage cellen dat Ura+ bleef, te bepalen door replicapla- .

‘10 ting op niet-selectieve en selectieve platen* E. colli-transformaties, snelle DNA-bereidingen, agarosegelektroforese, overdracht op nitro- 32 cellulosepapier en hybridisatie met F- gemerkt pBR 322 DNA werden uitgevoerd met ondergeschikte modificaties ten opzichte van de gepubliceerde procedures (Struhl. e.a. Supra; Davis et al., J. Advanced 15 Bacterial Genetics Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, New York;-Southern (1975) J· Mol. Biol., 98/ 503-517 en Rigby et al (1977) J. Mol. Biol. U3_9 237-251).

Voor snelle gist *DNA-bereidingen werd totaal gist-DNA bereid uit 5 ml kweken van cellen gegroeid tot de stationaire fase.

20 De gistcellèn-werden gewonnen en opnieuw gesuspendeerd in 0,k ml 0,9 M sorbitol/50 mM kaliumfosfaat, pH 7,5» 1^ mm 2-mercaptoëthanol. Lyticase (25 eenheden) werd toegevoegd en sferoplastvorming liet men gedurende 30 minuten bij 30°C voortgaan. In dit stadium werd de procedure voor snelle faag DNA-preparaten (Cameron en Davis (1977)-25 Nucleic Acids Res. 11+29-1 kk8) met twee veranderingen toegepast: de ethanolprecipitatie werd bij kamertemperatuur uitgevoerd en de verkregen pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 50-100 microliter 10 mm tris, pH 7*5/1 mm EDTA dat 0,5 microgram pancreatisch RN-ase bevatte. Deze bereidingen leverden bij benadering 1 microgram DNA 30 per ml oorspronkelijke kweek. Het DNA heeft een hoog molecuulgewicht, is betrekkelijk ongedraaid en splitsbaar door alle beproefde restrictie-enzymen.

* * * + * * .

Bij benadering 10 üra -transformanten werden willekeurig uit elke transformatie gencmen en hun feno-type bepaald. NNY27 heeft 35 een vormingstijd van 2,5 uur in een minimaal medium gesuppleerd met uracil. Verdubbelingstijden voor stammen die waren getransformeerd 4 # t ____ tot Ura door de YIp5-gist DNA-hybriden toonden een reeks van 8103680 τ j» __ ’ vormingstijden van k tot 8,5 uur. De N. crassa hybride-coneentratie leverde transformanten, die enigszins sneller groeiden bij vormingstijden van 3-^,2 uur. De verdubbeliügstijcL voor transf ormanten, die door de andere eukaryoten waren gevormd, varieerden van k35 tot· 62 uur.

5 -Alle Dra -transformanten waren instabiel. Na een groei van bij benadering 10 generaties onder niet-selectieve omstandigheden, verloor 95? of meer van elke getransformeerde stam. zijn Ura+-kakakter.

Er bleek een ruwe correlatie te bestaan tussen de relatieve instabiliteit en de groeisnelheid. De transf ormanten met langere verdubbèlings-10 tijden verloren het Ura+-fenotype sneller in een rijk medium.. Db toestand van DNA verantwoordelijk voor het URA+-fenotype van de transfor-manten werd bepaald. Gist-DMA werd gezuiverd van· Ura -transformanten.

*Het cirkelvarmige, extrachramosanale DNA werd van. het lineaire hoog-moleculaire chrcmoscmale DNA gescheiden door agarosegelelektroforese.

15 Elektroforese van het niet verteerde DNA werd uitgevoerd in 0,6? sggrose, ifO mm tris-OH, 20 mM azijnzuur, 2 mM EDTA gedurende 16 uur bij 1 Volt/cm. Eet gist/chrcmoscmaie DNA en het endogene plasmide DNA migreerden naar afzonderlijke gebieden. De gel werd overgebracht op nicrocellulose en daarna gehybridiseerd met bij benadering 5 x 10^ cpn 20 gemerkte pBR 322 DNA in 50? formamide, 0,9 M NaCl, 50 mM natrium-fosfaat, pH 7,5 mM EEEA» 0,2? SDS en 200 mierogrsm/ml gedenatureerde zalm sperma DNA. Eet gewassen en gedroogde ni troc ellulos efilt er werd toegepast cm een Kodak XR-5 rontgenfiim te belichten. Autoradio-grafie werd gedurende een paar dagen bij -70°C uitgevoerd onder 25 toepassing van een Dupont verlichtings- plus versterkingsscherm.

In elk van 65 transf ormanten, die alle bronnen van hybride-DNA's voorstellen, migreren de transformerende hybride-DNA-moleculen naar unieke plaatsen, onderscheiden van zowel het gist-chramoscmale DNA als het endogene gist-plasmide. De veelvoudige banden van hybriserend 30 DNA worden het eenvoudigst verklaard als super-gespiraliseerde en "nicked” cirkels van moncmeer-, dimeer- en (in sommige gevallen) trimeervormen van het transformerende DNA. Dergelijke multimeren worden dikwijls geproduceerd door het reccmbinatiebevorderende gist.

Opnieuw kon een correlatie worden gevonden tussen de intensiteit van 35 DNA-hybridisering en de groeisnelheid van elke transformant. Des te sneller de groeisnelheid, des te groter de hybridisatie hetgeen een aanwijzing i3, dat er meer kopieën van de hybridevolgorden zijn, 8103680

** V

; 1 ~ -is-· I · wanneer een grotere hybridisatie werd waargenomen.

II. Integratie van gewijzigde DNA-volg orden opgebouwd in vitro.

Een inwendige deletie van het His3 gen (Struhl et al (1976) PBNAS Ü.S.A. 73, 1^71-1^75) werd in vitro, opgebouwd door verwijdering ‘ . 5 van een 150-base-paar HindlII-fragment in YIp1 (Struhl et al, ibid 76, 1035-1039) YIpT bevat het gist his3-gen (dat E. coli hisB-mutaties compleaenteert) en het ampicillineresistente gen van pBH322..

; Het plasmide-DNA werd gesplitst met Hind-III en bij lage concentratie ' geligateerd. Een ampicilline-resistente transformant van E. coli TO hisBA63, die His” bleef en de gewenste structuur had, werd geïsoleerd en leverde DNA gemodificeerd tegen K-restrictie. De gistvolgordes van het verkregen plasmide .pBR322-Sc2903 geven geen selecteerbaar feno-type aan gistcellen. Het gist Ura3-gen werd geligateerd Mn de gewijzigde His3-volgordes, waardoor selectie van gist-• T5 transformanten mogelijk werd. YIp5 en pBR322-Sc2903 werden gesplitst met EcoRi en Sail. Het mengsel werd geligateerd en toegepast voor het transformeren van een pyrF~ E. coli MB1000. Door toepassing van de camplementering van pyrF-mutaties door de Ura3-voIgordes van YIp5, werden cellen, die de gewenste moleculen bevatten, ' 20 geïdentificeerd door een ampicilline-resistent tetracyclinegevoelige PyrF+-fenotype.

Het verkregen plasmide YIp5-Sc29Q3 werd toegepast voor het transformeren van een Ura3~-stam (SX1-2 a ura3 trpl galtO ga!2) -J» onder selectie van Ura . Dit plasmide werd geïntegreerd door reeam-25 binatie tussen de Se2903-DNA-volgordes in het plasmide en de: hcmologe . DNA-reeksen aan chromosoom XV. Er is niet waargenomen dat de vector alleen, zonder inserie DNA, een Ura3-52 bevattende stam transformeerde •fa in Ura (minder dan 1% van de frequentie, verkregen onder toepassing van een enigszins groter his3-fragment bij de transformatie in His').

30 De geïntegreerde structuur werd gedemonstreerd door hybridisatie tot elektroforetisch gescheiden· EcoRT-gesplitste totale gist-DNA volgens de methode van Southern, supra.

Stamduplicaties analoog aan de in deze transfommanten aanwezige blijken instabiel te zijn (Struhl e.a. supra) en segregeren cellen, 35 die de vector-volgordes missen en een kopie van de duplicatie. In dit geval is de gekozen marker, het üra3-gen buiten de homologe volgordes en wordt met de vectorvolgordes gesegregeerd. Derhalve missen 8103680 * » . — : :

Ura” segreganten de vector-volgordes. Selectie voor Ura+ werd gedurende 10 generaties verwijderd door kweek op een compleet medium (XED). 900 koloniën, afgeleid-uit deze kweek werden onderzocht pp Ura~-fenotype. Zeven van dergelijke geïsoleerde koloniën werden 5 geïdentificeerd. Elk werd onderzocht op de aanwezheid van vector-volgordes en de DNA-structuur van het his3-gehied.

Alle DBA-monsters werden gesplitst met BamHI» tezamen aan elektroforese. onderworpen in een 1j5’s agarose tris-acetaat-EDTA-gel' hij 0,6 Volt/cm gedurende 36 uur, overgehracht op nitrocellulose, 10 onderzocht met nick-getranslateerd pBR322-Sc2676 (het his3 BamHI-fragment) en hij -T0°C met Cronex-U film in een Dupont verlichtings-plus versterkingsschem gedurende enkele uren belicht. Het hybridi-satiespectrum toonde êên van de Ura+-transfoimanten met de verwachte samenstelling van het transformerende DBA (8,1 kb) en de his3.-deletie tj> (1,6 kb) en het wilde type his III DBA (1,75 kb). Een lïra”-isolaat toonde noch de vector-volgordes noch de wilde type hi§3-voigordes, maar bevatten de his3 deletie-volgordes, aanwezig in het transformerende DBA. Alle zeven Ura“-isolaten hadden alle vector-volgordes verloren en drie bleken een deletie bij de his3-locus te bevatten.

20 Zoals verwacht waren deze 3 stammen His” en werden ze -9 niet spontaan bij een detecteerbaar niveau (minder dan 10 ) voor die marker gereverteerd. Stammen die de his3 deletie bevatten zijn stabiel en kunnen op een wijze, soortgelijk aan elke conventioneel afgeleide his 3-mutatie worden gebruikt. Crndat deze stammen tevens ura3~ 25 zijn en geen vector-DBA-volgordes aanwezig zijn, kunnen zij voor extra modificaties opnieuw worden getransformeerd.

Als tweede proef op de onderhavige procedure werden galactose-induceerbare reeksen geïnsereerd in de plaats van van de his 3-deletie aan chromosoom XV. Een hybride-DBA-molecuul YIp5-Sc2911, dat een 30 2,55 kb Hind Ill-fragment homoloog aan galactose-indueeerbaar EBA, bevatte (St. John en Davis (1979) Cell 16, bk3-b52) werd opgebouwd door insertie in de enkele Eind III-plaats van YIp5-Sc2903. Dit DBA werd toegepast voor het transformeren van Sx2-2. Sx1-2 werd gekruist met Dl3-1H (een trol his3-532 gall2) ter vorming van een stam 35 van vergelijkbaar transformatierendement en een tegenovergesteld, passend type. Deze stam is Sx2-2 (een ura 3-trpl gal ). Een isolaat met het transformerende DBA geïntegreerd 'nabij his3 werd geïdentificeerd.

81 0 3 6 8 0 —1 U— -sA V' ' . Met het onderhavige hybride-DKA kon een integratie plaatsvinden. in elk van denier secties van gist-DKA. aanwezig in het transformerende DM.

Een groei gedurende tien generaties in een niet-selectief 5 medium was voldoende om Ura~-segreganten te leveren. Als verwacht **·- 4» Λ mm werden zowel Sis als Sis klonen aangetroffen. De Bis -isolaten - hebben de gal-volgordes geinsereerd in Chromosoom. XV, waarbij een klein deel van het his3-gen is vervangen.

Onder het volgen van de boven beschreven procedure voor 10 elektroforese, werden DNA-structureh van stammen toegepast voor het insereren van gal-volgordes in de his3-plaatsen onderzocht. Van de vijf bestudeerde stanmen, bevatte een Kis~-segregant geen vector-volgordes (8,1 kb) of wilde type his3-volgordes (1,75 kb) maar het bevatte wel de his3-deletie en de. gal insertievolgordes (k,2 kb).

15 Een 1 kb-paar fragment dat ars 1 bevatte werd geïsoleerd uit door restrictie endonuclease gevormde fragmenten van S. cerevisiae gistchramosomaal DBA. De fragmenten werden geinsereerd in ^vgt- λ b * door de Abacteriofaag.DNA te splitsen met EeoBi-endonuclease en covalent de gist en λ DM-segmenten met E. colie DKA-ligase te verbinden. 20 De verkregen collectie van hybridefagen werd aangebracht op agarplaten om te groeien op een veld van tiyptofaam auxotrofen (E. Coli W3110 trp C983O). De bacteriën werden gekweekt in M9+ 0,2% maltose (M9 = per liter: 6 g Sa^HPO^, 3 g KH^PO^, 1 g HH^Cl, 0,5 g NaCl met de volgende toevoegingen 1 m M MgSO^; 0,1 mM CaCl^; 25 0,2% glucose of maltose). Ka sedimentering (8 K tpm, 5 minuten) werden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 10 mM MgSO. en levérden ongeveer 10 ^6 10 cellen/ml. De >gt- 5vB-gisthybriden (2 x 10°) werden geadsorbeerd q o met 2 x 10 E. coli ¥3110 trp C9Ö30 gedurende 15 minuten bij 37 C en werden op platen gebracht door 2,5 ml M9 zachte agar toe te 30 voegen (ongeveer 0,6%) (M9 zachte agar-autoclaafagar in water en koelen tot 50°C. Voor 1 1 toevoegen 100 ml 10X M9-zouten, 0,1 ml 1M CaClg, 1 ml 1 M MgSO^, 10 ml 20$ glucose en voor niet-selecterende aminozuren zijnde eisen 10 ml van U mg/ml van elk aminozuur). De fagen werd geincubeerd gedurende 6-UO uur bij 3T°C. Plekken werden alleen 35 geproduceerd indien de hybride ^ laag de bacteriële mutatie kan complementeren. Bybriden die gist-DKA-fragmenten bevatten bleken de trpC1830 mutatie te complementeren. De hybriden werden verteerd " 8103680 • ^ .«* : -15- .met EcoRi-endonuelease en aan elektroforese onderworpen met agarosegel (0,7/0 ({Zie Thcrnas en Davis, J. Mol. Biol. £1_, 315, 197¾)}.

Een gemeenschappelijke hand 1 ,¾ kb paar fragment was in het complementerende faag aanwezig. Het 1 ,¾ kb paar fragment werd geïsoleerd 5 en hleek gist met hoge doelmatigheid te transformeren, hetgeen de aanwezigheid van het ar si gen demonstreert.

Het 1,¾ kb paar fragment (Sc4101) werd verder als volgt gesplitst. Beide PstI en Hind III-restrictie-endonucleasen hadden unieke splitsingsplaatsen in Sc^01 en de bacteriële vector. Ver-10 tering van YRp7 en YRp7' (pBE322 met Sc4101 in heide oriëntaties gelnsereerd) gevolgd door circularisatie en ligatie resulteerde in de deletie van een deel van de gist-volgordes, waarbij Yp4l1 en YpVl3 werden gevormd (Fstl-splitsing) en Yp4l2 en Yp4l4 (Hind III-splitsing). Fragmenten, die de ura 3 of his3-volgordes bevatten werden daarna 15 in elk van de vier deleties ingebracht onder toepassing van dezelfde restrictie-endonueleasen en het bleek dat Yp4l3/His3 en Yp4l 2/UEA3 in staat waren resp. his3~ en ura3~ giststammen re transformeren.

De ars1-volgorde is derhalve in de 850 basisparen tussen de EeoRi en Hind III splitsingsplaatsen en de deleties van de 200 baseparen tussen 20 de Hind III- en Pst-1-plaatsen is een ars-1 mutatie.

Volgens de uitvinding kunnen eukaryoten worden getransformeerd ter introductie van een verbeterde genetische capaciteit van een endogeen gen: gemuteerd voor het remmen van de expressie van een endogeen gen door homologe reccmbinatie met een alleel; of voorzien 25 met nieuwe of ingevoerde genetische capaciteiten. Een of meer van de bovengenoemde veranderingen kunnen worden bereikt door hetzij te voorzien in een autonoom replicerend hybride-DNA in de eukaryotisehe cel of door te voorzien in integratie van één of meer genen van het hybride-DHA in het aukaryoot-chrcmosocm.

30 De toepassing van het autonoom replicerende segment levert vele voordelen op. In de eerste plaats kan een hoog transfoxmatie-rendement worden bereikt door hybride-DHA's toe te passen, die ars-genen bevatten. In de tweede plaats kunnen, aangezien de ars kan worden afgeleid uit de gastheer of een andere eukaryoot die ver-35 enigbaar is met de gastheer, vreemde DHA-volgordes zoals virale reeksen, die werken als vectoren, worden vermeden.

• Het was verrassend dat werd gevonden dat chromo semen uit 8103680 — ; : ; r - /. A· ' eukaryoten konden worden gesegmenteerd en volgordes worden verkregen, . die effectief bleken bij bet -toëlaten van eutoncme replicatie in. een eukaryoot, onderscheiden van de gastheer-chrcmosamen.

V6or deze ontdekking was niet aangetoond dat eukaryoten anders dan 5 gist een arsgen. konden, leveren, waarmede replicatie van bet ars-gen en samenvoeging met andere DNA-segmenten mogelijk was. Zelfs met bet gist-segment werd bet ars echter- gekoppeld, aan een. structureel gen trp 1. Er werd tevens gevonden, dat de replicatiesignalen in andere . aukaryoten voldoende analoog aan de replicatiesignalen van S. cerevisiae ; TO waren cm een replicatie van hybride-DHA' s in gist mogelijk te maken.

Door toepassing van hybride-DHA dat bet ars-gen bevat, kan een sterk verbeterd, rendement van de integratie van genen worden bereikt. Aangestien bet bybride-DHA gedurende een aantal, generaties zal worden achtergehouden in de zicb vermenigvuldigende cellen t5 wordt de waarschijnlijkheid van de integratie sterk vermeerderd.

Aldus kan men door gezamenlijke toepassing, van de twee technieken - het toepassen van het ars-gen naast een gewijzigd gen met homologe volgordes voor integratie - voorzien in een verbeterde methode voor het integreren van DHA-segmenten in een eukaryoot-chramosoam, waardoor 20 een stabiele mutantstam wordt verkregen. Zelfs indien de integratie niet plaatsvindt, kan het hybride-DHA onder selectieve omstandigheden stabiel worden gehandhaafd wegens de aanwezigheid van het ars.

8103680

Claims (23)

1. Samenstelling, "bestaande uit een. DNA-volgorde van ten minste 10 /baseparen, die een autonoom replicerend segment (ars) van een eukaryoot definiëren, onder voorvaar de, dat, vanneer genoemd eukaryoot gist is, genoemd autonoom replicerend segment niet groter 5 is dan ongeveer 1 Kb paar segment en vrij van eventuele functionele structurele genen, die op natuurlijke vijze aan het ars-gen zijn gekoppeld.

2. Samenstelling volgens conclusie 1, met het· kenmerk, dat' het eukaryoot een gewervelde dier is.

3. Samenstelling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het eukaryoot een ongewervelde dier is. li-. Samenstelling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat. het eukaryoot een plant is.

5. Samenstelling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het 15 eukaryoot anders is dan een gist.

6. Autonoom replicerend segment (ars) uit een eukaryotische gastheer anders dan gist, met het kenaerk, dat dit wordt bereid' door (1) het fragmenteren van ten minste een deel van het een ars bevattende gastheereukaryoot-chrcmosocm, ter vorming van eerste

20 MA-segmenten; (2) het koppelen van de eerste DKA-segmenten aan tweede DHA-segmenten, met een gen dat in staat is een feno-typische eigenschap in gist tot expressie te brengen, ter vorming van hybride-DHA's; (3) het transformeren van de gistcellen met de hybride-DNA’ s 25 ter vorming van gist-transformanten en het kweken van de transformanten onder selectieve omstandigheden voor genoemde fenotypen ter vorming van een selectieve transformantkweek; (4) het isoleren van hybride-DNA uit de transf ormantkweek en (5) het segmenteren van de hybride-DNA’s ter vorming van 30 DNA-fragmenten die het ars bevatten.

7. Ars volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het fragmenteren wordt uitgevoerd onder omstandigheden, waarbij een ars worden gegenereerd dat DHA-fragmenten bevat die nagenoeg vrij zijn van functionele op natuurlijke vijze aanwezige structurele genen.

8. Eukaryotische cel, die hybride-DNA bevat, dat een ars bevat dat 81 03 6 80 ....................... ^ V , c . _-js_ - ~ endogeen is voor de eukaryotische cel, onder voorwaarde dat, wanneer de eukaryotische cel een gistcel is, het genoemde ars wordt gekoppeld aan andere dan structurele genen, die op natuurlijke wijze in vivo zijn gekoppeld aan het ars, zonder interventie van een 5 functioneel op natuurlijke wijze gekoppeld structureel gen..

9. Eukaryotische cel volgens Conclusie 8, met het kenmerk, dat het hybride-DNA een gen bevat, dat in staat is tot expressie van een feno-typische eigenschap in de cel, welke gen is afgeleid uit een gastheer-,· die niet op natuurlijke wijze genetische informatie mét 10 de cel uitwisselt.

10. Werkwijzévoor het doen ontstaan van een feno-typische eigenschap in een eukaryotische gastheer, met het kenmerk, dat cellen van de eukaryotische gastheer worden getransformeerd met hybride-DNA, omvattende een eukaryoot ars-gen en een gen, dat in staat is tot ex- 15 pressie in genoemde gastheer en genoemde feno-typische eigenschap tot expressie brengt j en het kweken van de cellen onder omstandigheden dat de feno-typische eigenschap tot. expressie kamt .

11. Werkwijse volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de feno-typische eigenschap de vorming van. een. enzym is.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het enzym in de biosynthetische route van de vorming van een metaboliet aanwezig id.

13. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de feno-typische eigenschap de vorming van een niet-enzymatisch proteïne is. 25 1U, Werkwijze voor het vormen van hybride-DNA, dat in staat is tot autonome replicatie in een eukaryotische gastheer, met het kenmerk, dat een ars met complementaire terminatie plaatsen wordt gekoppeld aan een DNA-segment met complementaire teiminatieplaatsen.

15. Werkwijze volgens conclusie 1U, met het kenmerk, dat de cample-30 mentaire terminatie plaatsen zijn verschoven en de werkwijze de extra trap van het ligateren van de complementaire terminatie plaatsen omvat.

16. Hybride-DNA-cmvattende een autonoom replicerend segment (ars) van een eukaryotische gastheer en een gen, dat in staat is tot 35 expressie in genoemde gastheer, afgeleid uit een bron, die normaal, geen genetische informatie uitwisselt met genoemde gastheer, onder voorwaarde, dat, wanneer de gastheer een gist is, het ars is gekoppeld 81 0 3 6 8 0 " ' _ ~· ' aan een ander dan een structureel gen, dat op natuurlijke wijze is gekoppeld aan genoemd ars-gen, zonder tussenkomst van eetffunctioneel op natuurlijke wijze gekoppeld structureel gen.

17. Hybride-DHA volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat de 5 eukaryotische gastheer een plant is.

18. Hybride-DHA volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat de plant mais is. T9. Hybride-DHA volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat de eukaryotische gastheer een ongewervelde dier is.

20. Hybride-DHA volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat'de eukaryotische gastheer een gewerveld dier is,

21. Hybride-DHA volgens conclusie 16» 17, 18, 19 of 20, bevattende een gen, dat een feno-typische eigenschap tot expressie brengt vatbaar voor selectie.

22. Werkwijze voor het verbeteren van de stabiele integratie van een specifiek gen, vatbaar voor expressie in cellen van een eukaryotische gastheer, in een chromosoom van de gastheer, welke werkwijze de volgende trappen cmvat: (1) het trans formeren van de cellen met een hybride-DHA amvat-20 tende het specifieke gen en een DNA-volgorde, die vatbaar is voor insertie in genoemd chrcmosocm gekoppeld aan genoemd specifiek gen; en (2) het kweken van de cellen, die het hybride-DHA bevatten onder omstandigheden die selectief zijn voor de expressie van genoemd 25 specifiek gen, dat stabiel is geïntegreerd in het chromosoom; waarbij in genoemd hybride-DHA een ars^gen wordt ppgencmen*

23. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de insertie-volgorde een DHA-volgorde is, homoloog met een DWA-volgorde van het chrcmosocm. 30 2k. Werkwijze volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat de insertievolgorde een transporteerbaar element is.

25. Eukaryotische gastheercellen, verkregen volgens de werkwijze volgens êên der conclusies 22, 23 of 2k.

26. Eukaryotische, hybride-DHA bevattende cel, die een ars, dat 35 vatbaar is voor replicatie in genoemde eukaryotische cel onder voorwaarde, dat wanneer genoemde eukaryotische cel een gistcel is, genoemd ars is gekoppeld aan andere dan structurele genen die op natuurlijke 8103680 •sit - “ ’ ' -20- Γ ' : wijze zijn gekoppeld aan het ars in vivo, zonder tussenkomst van een functioneel op natuurlijke wijze gekoppeld structureel gen. 8103680